KR20020094087A - 구아바로부터 얻은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 １ｂ저해용 활성분획 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구아바로부터 얻은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해용 활성분획 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 열대 식물인 구아바(guava,Psidium guajavaLinn)의 잎 또는 열매로부터 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)를 저해하여 인슐린의 작용을 촉진시킴으로써 당뇨병의 증상인 혈당상승에 대한 혈당강하 효과를 갖는 활성분획 조성물과 이를 효율적으로 추출, 정제하는 방법 그리고 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방과 치료, 혈당강하 및 지방간 억제용 생약제에 관한 것이다.

Description

구아바로부터 얻은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 １Ｂ 저해용 활성분획 조성물{Active fractions having inhibitory effect on protein tyrosine phosphatase 1B isolated from Psidium guajava}
본 발명은 구아바로부터 얻은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B) 저해용 활성분획 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 구아바(guava,Psidium guajavaLinn)의 잎 또는 열매로부터 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B를 저해하여 인슐린의 작용을 촉진시킴으로써 당뇨병의 증상인 혈당상승에 대한 혈당강하 효과를 갖는 활성분획 조성물과 이를 효율적으로 추출, 정제하는 방법 그리고 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방과 치료, 혈당강하 및 지방간 억제용 생약제에 관한 것이다.
음식물의 섭취와 소화에 의해서 생성된 포도당이 근육이나 간 등의 세포에서 흡수되어 저장되거나 에너지대사로 사용되어 혈액 내에서 적절한 농도로 유지되고 있다. 이때 세포에서 포도당을 흡수하게 하는 작용을 하는 것이 인슐린으로 혈중의 포도당(혈당)의 농도가 증가하면 인슐린이 췌장에서 분비되어 세포가 포도당을 흡수하도록 한다. 당뇨병은 이러한 혈액 중의 포도당(혈당)의 농도가 상승되도 세포로 흡수되지 않아 혈당이 과도하게 높아 소변으로 포도당이 빠져나가게되는 질병으로 음식물 섭취 후에도 세포로 포도당이 흡수되지 않아 에너지대사의 불균형이 초래되어 체중이 감소하고 소변으로 포도당이 빠져나가기 위해서 동시에 많은 양의 물이 배뇨되므로 물의 섭취량이 늘어나면서 신장 기능의 이상 등 다양한 합병증이 유발되거나 혈당의 과도한 상승이 심하면 쇼크나 혼수상태에 빠져서 생명이 위험하게 되는 대사성 질환이다. 당뇨병은 췌장에서 인슐린의 생성이 안돼서 생기는 제1형 당뇨병인 인슐린 의존형 당뇨병과 인슐린은 생성되나, 인슐린의 활성이 떨어지거나 또는 말초조직세포에서 작용감도가 약해져서 인슐린 내성(insulin resistance)이 생겨서 혈당조절에 문제가 되는 제2형 당뇨병인 인슐린 비의존형 당뇨병으로 나뉘어 진다. 제1형 당뇨병은 인슐린을 주사해서 공급해 주어야 혈당이 조절되기 때문에 인슐린 의존형 당뇨병이라고 한다. 그리고, 이러한 당뇨병은 소아에게서 주로 발병하고 선천적인 경우가 많고 드물게는 성인의 경우도 발병하는 경우가 있으며 전체 당뇨병환자의 5% 미만이 제1형 당뇨병환자이다. 한편, 제2형 당뇨병은 인슐린 주사에 의해서는 혈당의 조절되지 않고 혈당강하제나 식이요법 등에 의해서 혈당을 조절해야하기 때문에 인슐린 비의존형 당뇨병이라고 하며 당뇨병환자 중 95% 이상 대부분의 환자가 인슐린 비의존형 당뇨병환자의 경우에 해당한다.
생활 수준의 향상으로 인하여 생활 여건이 향상되면서 전반적인 식생활의 향상으로 섭취 열량이 크게 증가하고 운동부족 현상을 초래하며 과도한 스트레스에 노출되는 생활이 지속되면서 인슐린의 성능이 떨어져서 야기되는 제2형의 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병)이 증가하고 있다. 또한, 이러한 생활방식에 의한 심각한 비만이 발생하며 이에 따라 야기되는 제2형 당뇨병이 증가하고 있다. 따라서, 우리 나라 당뇨병 환자의 대부분은 이러한 제2형 당뇨병 환자로 당뇨병이 오래 지속되면 혈당의 증가 이외에도 혈중 지질 농도가 증가하여 지방간, 동맥경화, 관상 심장질환 등의 심혈관 질환, 당뇨병성 신장 및 망막질환 등의 합병증을 유발하므로 이의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
현재, 제2형 당뇨병은 치료제로 많이 사용하는 약물로는 인슐린 생성이 부족하거나 인슐린이 충분하다해도 활성이 낮아 인슐린작용이 미약하게 되는 인슐린 내성(insulin resistance)이 생겨 인슐린작용에 의한 혈액내의 당을 제대로 조절하지 못하여 혈액내의 당의 농도가 정상보다 과도하게 높아지는 것을 치료하기 위하여 혈당강하제를 사용한다. 혈당강하제는 치료기전 및 작용 약물의 작용점에 따라 나눌 수 있는데, 설포닐우레아 계통은 주로 췌장의 베타 세포 안에 있는 인슐린을 함유한 과립포의 이동을 촉진하여 간접적으로 인슐린을 분비시키는 약물로 저혈당 유발 등의 심각한 부작용이 보고되고 있으나, 최근에는 부작용을 최소화한 약물이 개발되어지고 있다. 비구아나이드 계통 약물은 근육세포로 당을 이동시키고 간에서 당이 만들어지지 못하게 하는 약물로 비만인 당뇨 환자에게 사용하며 저혈당을 일으키지 않는 장점을 갖고 있으나, 고령자와 심혈관 질환 환자에게는 주의해야 한다. 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해제는 소장에서 포도당을 만드는 효소 활동을 억제시켜 식후에 일시적으로 혈당이 급상승하는 것을 막아주고, 부작용이 심하지 않은 편이어서 경증 당뇨병 치료에 이용된다. 최근에는 핵막 수용체이면서 유전자 전사 촉진인자인 피피에알 감마(PPAR-γ, Peroxisomeproliferator activated receptor γ)를 활성화하는 티아졸리디네이온(thiazolidinedione, TZD)계 약물도 개발되고 있다. 그러나, 경구용 혈당강하제 만으로는 혈당이 효과적으로 떨어지지 않고 이미 알려진 대부분의 약물에서 부작용이 나타나므로, 보다 안전한 당뇨병 치료제나 당뇨병 예방제의 개발이 시급한 실정이다.
최근에는 제2형 당뇨병과 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B(protein tyrosin phosphatase 1B, PTP1B)와의 관련성이 밝혀지며 이의 저해물질이 당뇨병 치료제로서의 개발 가능성이 대두되고 있다[Exp. Opin. Invest. Drugs,8, 139 ~ 160, 1999]. 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 유전자를 제거한 쥐의 경우 인슐린 내성이 제거되어 제2형의 당뇨병이 유발되지 않거나 비만이 억제되는 현상이 관찰되었으며[Science,283, 1544 ~ 1548, 1999], 또한 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해물질이 제2형 당뇨병 질환모델 쥐에서 혈당강하나 인슐린내성의 극복등 제2형 당뇨병에 효과가 있음이 보고되었다[J.Med. Chem.42,3199-3202, 1999; J. Biol. Chem.275, 10300 ~ 10307, 2000].
일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 기존약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성 염려가 적은 장점이 있다. 그러나, 지금까지 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해제로서 당뇨병 실험동물에 대하여 현저히 혈당을 감소시키는 천연물 약제에 대한 보고는 미비하다.
구아바는 열대 및 아열대지방에 서식하거나 재배하는 목본류의 식물로 그 열매나 잎이 항염, 항균, 항암, 고지혈증이나 혈압강하 활성 등의 다양한 약리활성[유럽특허공개 제 0 154 53 호; Phytother. Res.14, 388 ~ 391, 2000; J. Hum. Hypertens.7, 33 ~ 38. 1993]이 밝혀졌으며, 또한 구아바가 알록산 처리에 의해 유도된 제1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병) 모델 동물에서 혈당강하 효과가 있다고 알려진 바가 있다[Am. J. Chin. Med.11, 74 ~ 76. 1983; Shoyakugaku Zasshi.39, 261 ~ 269. 1985].
한편, 구아바가 혈당강하 효과가 있다고 보고한 논문들에서도 단순히 구아바 과일의 쥬스가 알록산에 의해 유도된 제1형의 당뇨병 모델 마우스에 대한 미약한 혈당강하 효과가 있음을 제시하였다. 그리고, 구아바 잎을 열수 추출한 후 용매분획해서 얻은 시료를 알록산에 의해 유도된 제1형의 당뇨병 모델 랫트에 투여하여 미약한 혈당강하 효과가 있음을 보고하고 이들의 활성성분은 가수분해형 탄닌들로 작용기작을 지방세포에서 아드레날린에 의해 유도되는 유리지방산의 방출이 억제되는 것으로 설명한 정도이다.
그러나, 본 발명자들은 당뇨병 환자의 대부분을 차지하는 제2형 당뇨병의 치료효과를 목표로 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 활성을 억제하는 물질을 개발하는 것에 착안하여 여러 가지 식물을 탐색하던 중 구아바의 추출물이 이 효소의 활성을 억제할 수 있음을 발견하였다. 이에, 구아바 알콜 추출물로부터 용매분획, 실리카겔 컬럼 크로마토그라피 및 알피-18 컬럼 크로마토그라피에 의해 보다 정제한 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 활성을 억제하는 활성분획물을 얻고 이 활성분획물을 제2형 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병)모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 혈당강하 효과와 당뇨병 진행에 대한 억제효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 효소활성을 저해하고, 당뇨병 예방과 치료, 혈당강하 및 지방간 억제 등에 뚜렷한 효과가 있는 약제조성물을 구아바(Psidium guajavaLinn)로부터 활성이 가장 우수한 조성으로 추출 분리하는 방법과 그 활성분획 조성물을 유효성분으로 함유한 약제조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 구아바로부터 추출 분리된 활성분획물을 고성능 액체 크로마토그래피법(HPLC)으로 확인한 HPLC분석 스펙트럼이다.
도 2는 구아바로부터 추출 분리된 활성분획물을 당뇨병 모델동물인 1개월령의Lepr db /Lepr db 마우스에 4주간 투여하여 혈당증가가 억제되는(당뇨병 예방) 실험군과 대조군의 차이를 비교한 막대그래프이다.
도 3은 구아바로부터 추출 분리된 활성분획물을 당뇨병 모델동물인 3개월령된 성숙한Lepr db /Lepr db 마우스에 4주간 투여한 후 혈당감소(당뇨병 치료)시킨 실험군과 대조군의 차이를 비교한 막대그래프이다.
도 4는 구아바로부터 추출 분리된 활성분획물을 투여하지 않은 대조군 당뇨병 모델동물인 3개월령의Lepr db /Lepr db 마우스의 간조직으로 지방간화된 상태를 나타낸 현미경사진이다.
도 5는 구아바로부터 추출 분리된 활성분획물을 당뇨병 모델동물인 1개월령의Lepr db /Lepr db 마우스에 8주간 투여한 후 지방간이 억제되어 거의 정상적인 소견을 나타내는 실험군 마우스의 간조직을 나타낸 현미경사진이다.
본 발명은 구아바로부터 얻은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해용 활성분획 조성물과 이 조성물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방과 치료, 혈당강하 및 지방간 등에 뚜렷한 효과가 있는 약제조성물을 그 특징으로 한다.
본 발명은 구아바를 분쇄한 후 알콜 수용액을 함량대비 3 ∼ 10배를 넣어 용매 추출하는 단계, 상기 추출단계에서 얻어진 여액을 감압 농축한 후, 농축액을 10 ∼ 50배 부피의 증류수에 현탁하고, 클로로포름, 핵산 등의 용매를 사용하여 비활성분획을 용출 제거하는 단계, 상기 수용액에 부탄올 등의 알코올 용매를 사용하여활성물질을 추출한 후, 농축액을 얻는 단계, 상기 농축액을 농축액 총량의 10 ∼ 50 배의 실리카겔에 로딩한 후 클로로포름/메탄올(10/1) 혼합용매를 사용하여 비활성 부분을 제거한 후 메탄올을 사용하여 활성물질을 용출하는 단계, 상기 용출액을 농축한 후 농축액 총량의 10 ∼ 50 배의 알피-18(RP-18)레진에 로딩한 다음 40% 아세토나이트릴을 사용하여 활성물질을 용출, 농축하여 엑기스를 얻는 단계, 및 상기 엑기스를 엑기스 총량의 1 ∼ 2 배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 후 동결 건조시켜 활성분획을 분리하는 단계를 포함하는 구아바로부터 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해용 활성분획 조성물을 분리 정제하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해 및 렙틴 수용체(leptin receptor) 이상으로 당뇨병 및 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 혈당강하, 당뇨병 예방과 치료 및 지방간 억제 효과를 보이는 구아바의 활성분획 조성물에 관한 것이다.
즉, 구아바(Psidum guajava)로부터 분획하여 얻은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B를 저해하는 활성분획 조성물이 렙틴 수용체(leptin receptor) 이상으로 비만 및 당뇨를 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 혈당강하, 당뇨병 예방과 치료 및 지방간 억제 효과를 갖고 있는 것을 처음으로 관찰하여, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하, 당뇨병 예방과 치료 및 지방간 억제 효과 등을 지닌 활성 조성물을 개발하였다.
본 발명에 따른 활성 조성물 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화 하여 사용할 수 있다.
상기 활성 분획물로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎／㎏(몸무게)／1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 구아바로부터 활성 분획물의 제조
분쇄한 구아바(Psidum guajava)를 함량대비 10 배량의 알코올성 용매를 사용하여 활성물질이 용출될 수 있도록 5시간 동안 환류 추출한 후 상기 알코올성 용매 추출액을 감압 농축하였다. 그런 다음, 활성 농축액을 50 배량의 증류수에 현탁하고 동일 량의 클로로포름 용매를 사용하여 3회 추출하여 비활성 부분을 제거하였다. 이후, 동일 량의 부탄올 용매를 사용하여 3회 활성물질을 추출하여 부탄올 분획을 감압 농축하였다. 농축된 활성분획을 50배 량의 실리카겔에 로딩한 후 클로로포름/메탄올(10/1) 혼합용매를 사용하여 비활성 부분을 제거한 다음 메탄올을사용하여 활성부분을 유출시켜 농축하였다. 농축된 활성분획으로부터 비활성분획을 제거하기 위하여 30배량의 알피-18(RP-18) 레진을 사용하였다. 활성분획을 알피-18상에 로딩한 후 40% 아세토나이트릴 용매를 사용하여 활성물질의 함량을 최대로 한 조 추출물을 얻었다. 상기에서 얻어진 조 추출물 제조시 사용한 용매 중 제거되지 않은 미량의 용매를 제거하기 위하여 조 추출물 총량의 1 배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 후 동결건조시켜 분말상태의 활성분획을 분리, 정제하였으며 얻어진 활성분획물을 고압액체 크로마토그래피법(HPLC)으로 확인하였다.
컬럼 ; YMC ODS-18 (20 ×250 mm, S-4 ㎛)
용매 ; 20 % 아세토나이트릴
유속 ; 4 ㎖/분
검출 ; UV 254 nm
분석한 결과는 도 1의 크로마토그램과 같으며, 17분대에서 나타나는 피크가 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B에 대하여 가장 강한 저해활성을 나타내며, 9.83분대의 피크도 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B에 대하여 미약한 저해 활성을 보여 주었다.
실시예 2 : 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해활성 측정
단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 는 BIOMOL에서 제조한 제품을 구입하여 실험에 사용하였다. 분광학적으로 효소 활성을 측정하기 위하여 0.5 ㎍/㎖ 농도의 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B, 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 완충용액(50 mM citrate, pH 6.0, 0.1M NaCl, 1 mM EDTA, 1mM DTT), 저해제, 20 mM pNPP를 첨가하고 가볍게 흔들어 준 다음 1시간동안 30 ℃에서 반응시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 저해율은 다음 수학식 1과 같이 계산하였으며, IC50값은 효소 활성의 저해율이 50 %에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다. 얻어진 활성분획물은 단백질 타이로신 탈인산효소 1B의 활성을 50％ 저해하는 농도(IC50)를 측정한 결과 구아바 메탄올 추출분획은 60 ㎍/㎖, 부탄올 용매분획은 30 ㎍/㎖, 칼럼 크로마토그래피 후 분획은 2 ㎍/㎖의 저해 활성을 나타내었다. 따라서, 동물 실험에 사용한 활성분획물은 구아바의 메탄올 추출분획물에 대해서 단백질 타이로신 탈인산효소 1B에 대한 저해활성이 30배 증진된 활성을 보여주었다.
A : 효소를 넣은 것의 반응 후 흡광도
B : 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도
C : 저해제와 효소를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도
실시예 3 : 당뇨 모델동물인 Lepr db /Lepr db 마우스에서 당뇨병 예방효과 측정
Lepr db /Lepr db 마우스는 식욕과 지방세포의 분화와 축적에 중요한 조절호르몬인 렙틴(leptin)의 수용체(leptin receptor)가 비정상적으로 발현되어 성장할수록 비만이 유발되고 더불어 매우 높은 고혈당과 이에 따른 당뇨병을 동반한다. 따라서, 구아바로부터 분리된 활성분획이 혈당증가를 억제시켜 당뇨병을 예방하는 효과를 알아보기 위하여 아직 미성숙하여 당뇨병이 충분히 발병되지 않은 1개월령의Lepr db /Lepr db 마우스 16마리를 대상으로 실험을 실시하였다. 실험군 8마리에는 구아바로부터 분리된 활성분획을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 희석하여 10 ㎎/㎏ 농도로 1일 1회씩 경구 및 복강으로 투여하였으며, 대조군 8마리의 경우에는 동일 량의 DMSO만을 투여하였다. 투여 4주 후에 헤파린으로 처리한 모세유리관(carpillary tube)을 이용하여 후안와 정맥총(retro-orbital sinus)으로부터 혈액을 채취하여 원심분리 후 혈장(plasma)을 분리한 다음 혈액화학분석기[CIBA Corning 550 Express, USA]로 혈당(blood glucose)을 측정하여 대조군과 실험군의 차이를 분석하였다. 그 결과, 대조군의 경우에는 혈당치가 꾸준하게 증가하여 412 ±45 ㎎/㎗을 나타내는 반면, 구아바로부터 분리한 활성분획을 투여한 실험군은 대조군 혈당치의 30.8% 수준인 127 ±29 ㎎/㎗을 나타내어 혈당증가가 현저하게 억제되는 효과를 관찰할 수 있었다[도 2]. 따라서, 구아바의 활성분획물이 당뇨병의 발병과 진행을 억제하는 예방효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 4 : 당뇨 모델동물인 Lepr db /Lepr db 마우스에서 당뇨병 치료효과 측정
Lepr db /Lepr db 마우스는 8주령 이후에는 비만과 더불어 매우 높은 고혈당과 이에 따른 당뇨증상을 동반한다. 따라서, 구아바로부터 분리된 활성분획의 혈당강하 효과를 알아보기 위하여 3개월령의 성숙한Lepr db /Lepr db 마우스 16마리를 대상으로 실험을 실시하였다. 실험군 8마리에는 구아바로부터 분리된 활성분획을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 희석하여 10 ㎎/㎏ 농도로 1일 1회씩 경구 및 복강으로 투여하였으며, 대조군 8마리의 경우에는 동일량의 DMSO만을 투여하였다. 투여 4주 후에 헤파린으로 처리한 모세유리관(carpillary tube)을 이용하여 후안와 정맥총(retro-orbital sinus)으로부터 혈액을 채취하여 원심분리 후 혈장(plasma)을 분리한 다음 혈액화학분석기[CIBA Corning 550 Express, USA]로 혈당(blood glucose)을 측정하여 대조군과 실험군의 차이를 분석하였다. 그 결과, 대조군의 혈당치(587 ±39 ㎎/㎗)와 비교하여 약 41.9% 에 해당하는 낮은 수준(246 ±35 ㎎/㎗)을 나타내어 현저하게 혈당이 강하(당뇨병 치료)되는 효과를 관찰할 수 있었다[도 3].
실시예 5 : 당뇨 모델동물인 Lepr db /Lepr db 마우스에서 지방간 억제효과 측정
Lepr db /Lepr db 마우스는 지속적인 음식물 섭취에 따른 과도한 영양분의 유입으로 인하여 비만과 당뇨병 발병 외에 간세포 내에 지방침착이 일어나 지방간을 야기한다. 따라서, 구아바로부터 분리한 활성분획이 이와 같은 지방간에 어떠한 영향을 미치는 가를 알아보고자 1개월령의Lepr db /Lepr db 마우스를 10 마리를 대상으로 8주 동안 구아바로부터 분리한 활성분획을 복강 및 구강으로 투여한 다음, 실험군(6 마리)과 대조군(4 마리)의 동물을 희생하여 간을 절취하여 10% 중성 포르말린에 넣어 24시간 고정(fixation)하고 수세한 후, 70%, 80%, 90% 및 100% 알콜을 이용하여 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 조직절편기[LEICA, RM2045, Germany]로 약 4 ㎛의 두께로 조직절편을 제작하였다. 이어서, 헤마토실린 및 에오신(hematoxylin & eosin)염색을 시행하여 간조직을 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 대조군의 경우에는 전반적으로 간조직의 세포질 내에 비정상적으로 과도한 지방과립을 함유하고 있는 간세포들과 다양한 크기의 공포형태로 관찰되는 지방변성 소견을 흔히 관찰할 수 있었다. 그러나, 실험군은 이와 같은 지방변성 소견을 거의 관찰할 수 없었을 뿐만 아니라 대부분이 정상적인 형태로 회복되어 지방간이 억제됨을 알 수 있었다[도 4 및 도 5].
실시예 6 : 정제의 제조
유효성분 10 g
락토스 70 g
결정성 셀룰로오스 15 g
마그네슘 스테아레이트 5 g
총 량 100 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.
실시예 7 : 분말제의 제조
유효성분 10 g
옥수수 전분 50 g
카르복시 셀룰로오스 40 g
총 량 100 g
상기에 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 6 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
실시예 8 : 독성실험
1. 급성독성
구아바로부터 분리된 활성분획을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다.
일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 50 마리를 대조군은 10 마리, 실험군은20 마리씩 배정하였다. 대조군에는 DMSO만을 투여하고, 실험군은 구아바로부터 분리된 활성분획을 상기한 실시예에서 이용된 투여농도인 10 ㎎/㎏의 2,000배(20 g/㎏) 및 5,000 배(100 g/㎏)의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 20 g/㎏ 농도의 구아바 분획물을 투여한 실험군에서는 모두 생존하였으나, 100 g/㎏ 농도의 구아바 분획물을 투여한 실험군에서는 12 마리의 치사율을 보였다.
이와 같은 실험 결과로부터 구아바 분획물은 1회 동물 치사량이 100 g/㎏(100,000 ㎎/㎏) 정도로서 일반적인 효능을 보이는 농도(10 ㎎/㎏)의 약 10,000배 정도로서 독성이 거의 없는 매우 안전한 물질임을 알 수 있었다.
2. 장기 및 조직독성
구아바로부터 분리된 활성분획을 10 ㎎/㎏의 농도로 4주 동안 투여하여 혈당강하, 당뇨예방과 치료 및 지방간 억제 효과 등의 관찰시험에 이용된Lepr db /Lepr db 마우스를 대상으로 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 구아바 분획물을 투여한 실험군과 DMSO만을 투여한 대조군의 각 동물로부터 4주 후 심장, 폐, 췌장, 부신, 간, 신장 및 근육 등을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였다. 그 결과, 간조직의 경우 대조군은 심한 지방변성을 나타낸 반면, 실험군은 거의 정상적인 상태를 보여 간에 대한 보호작용이 있음을 알 수 있었으며, 그 외 장기에 대한조직학적 관찰에서는 특이한 이상은 관찰되지 않아 구아바 분획물의 동물장기에 대한 독성은 발견되지 않았다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 구아바로부터 얻은 활성분획 조성물은 타이로신 탈인산 효소 1B 저해, 혈당강하, 당뇨병 예방과 치료 및 지방간 억제 효과가 우수하므로 이를 유효성분으로 함유하는 생약제로 사용할 수 있다.

Claims (5)

  1. 구아바(Psidium guajava)로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해용 활성분획 조성물.
  2. (1) 구아바(Psidum guajava) 분쇄물에 알콜 수용액을 넣어 용매 추출하는 단계;
    (2) 상기 추출단계에서 얻어진 여액을 감압 농축한 후, 농축액을 증류수에 현탁하고 클로로포름 또는 핵산 용매를 사용하여 비활성 분획을 용출 제거하는 단계;
    (3) 상기 비활성 분획이 제거된 수용액에 알코올 용매를 사용하여 활성물질을 추출한 후, 농축액을 얻는 단계;
    (4) 상기 농축액을 실리카겔에 로딩한 후 클로로포름/메탄올(10/1) 혼합용매를 사용하여 비활성 부분을 제거한 다음 메탄올을 사용하여 활성물질을 용출하는 단계;
    (5) 상기 메탄올 용출액을 농축하여 알피-18(RP-18)레진에 로딩한 다음 40% 아세토나이트릴을 사용하여 활성물질을 용출 및 농축하여 엑기스를 얻는 단계; 및
    (6) 상기 엑기스에 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 후 동결 건조시켜 활성분획을 분리하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 구아바로부터 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해용 활성분획 조성물을 분리 정제하는 방법.
  3. 구아바로부터 얻은 활성분획 조성물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해 약제조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 약제조성물이 혈당강하, 당뇨병 예방 및 치료에 유효한 것임을 특징으로 하는 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해 약제조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 약제조성물이 지방간 억제에 유효한 것임을 특징으로 하는 것임을 특징으로 하는 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해 약제조성물.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7247324B1 (en) 2006-01-06 2007-07-24 Amerilabtechnologies, Inc. Method of using guava extract and composition including guava extract
US20090186110A1 (en) * 2005-11-09 2009-07-23 Thomas Eidenberger Guava extract
KR100957205B1 (ko) * 2007-11-14 2010-05-11 한국해양연구원 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1ｂ를 저해하는벤조나프토크산테논계 화합물 및 그 용도
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Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6137731A (ja) * 1984-07-31 1986-02-22 Bizen Kasei Kk グアバ葉エキスを有効成分とする経口糖尿病薬
JPS6456619A (en) * 1987-08-25 1989-03-03 Nobuyasu Muranaka Chinese medicinal beverage
KR19990034285A (ko) * 1997-10-29 1999-05-15 양철학 항암활성을 갖는 육두구 추출물
US8706123B2 (en) * 2008-03-24 2014-04-22 Qualcomm Incorporated Common data channel resource usage report

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090186110A1 (en) * 2005-11-09 2009-07-23 Thomas Eidenberger Guava extract
US7247324B1 (en) 2006-01-06 2007-07-24 Amerilabtechnologies, Inc. Method of using guava extract and composition including guava extract
US7611739B2 (en) 2006-01-06 2009-11-03 Amerilab Technologies, Inc. Method of using guava extract and composition including guava extract
US8313784B2 (en) 2006-01-06 2012-11-20 Amerilab Technologies, Inc. Method of using guava extract
KR100957205B1 (ko) * 2007-11-14 2010-05-11 한국해양연구원 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1ｂ를 저해하는벤조나프토크산테논계 화합물 및 그 용도

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