KR20020093149A - 인체에서 성장 호르몬 변이, 이들의 용도 및 이를탐지하는 하는 방법 - Google Patents

인체에서 성장 호르몬 변이, 이들의 용도 및 이를탐지하는 하는 방법 Download PDF

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Abstract

개체에서 GH 기능이상의 지표로 효과적인GH1에서 변이를 탐지하는 탐지 방법은 개체로부터 얻은 사람GH1유전자의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 검사 시료를 사람 GH1 유전자에 공지된 기준 서열과 비교하는 것으로 구성된다. 검사 시료 서열과 기준 서열간의 차이는 개체에서 GH 기능이상의 지표로 효과적인GH1에서 변이(이후 "GH1 변이체")의 존재를 시사한다. 검사 시료는 다음의 기준을 보이는 개체로부터 얻는다: (i) 표준 신장 차트[Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762(1970)]로 플랏되는 경우 개체 부모의 신장에 기초한 개체의 예상 표적 성인 신장 범위를 벗어나는 개체의 성인 신장을 예시하는 성장 패턴[일련의 신장 측정값으로 기술됨; Brook CDG(Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141(1995, Blackwell Science)]으로 정의된 성장 부진. 또한, 이렇게 탐지된 돌연변이 및 성장 호르몬 비정상에 대하여 환자를 스크리닝하고 이런 비정상을 치료하는데 적합한 다양한 단백질을 생산하는데 있어 이들의 용도를 개시한다.

Description

인체에서 성장 호르몬 변이, 이들의 용도 및 이를 탐지하는 하는 방법{METHOD FOR DETECTING GROWTH HORMONE VARIATIONS IN HUMANS, THE VARIATIONS AND THEIR USES}
신장이 유전적 요인에 의해 영향을 받는다는 것은 1세기전에 이미 확인되었다. 가족성의 작은 신장이 열성 형질이라는 것은 1912년에 인정되었지만, 이런 가족성이 과학 학술지에 게재되기 시작한 것은 이보다 25년전의 일이었다. 열성 형질의 작은 신장이 분리된 성장 호르몬(GH) 결핍과 주로 연관한다는 것은 1966년에 밝혀졌다.
GH 결핍과 관련된 작은 신장은 4000 내지 6000명중 1명의 빈도로 발생하고 있다. 이들 사례의 대부분은 산발적이고 특발적이지만, 5 내지 30%는 상기 질환에 대한 유전적 병인과 일치하는 일차적인 상관관계를 보인다. GH 결핍의 유전적 병인의 확인은 가족성의 작은 신장 및 해당 피험자의 뇌하수체-발현된 성장 호르몬 유전자(GH1)의 돌연변이 병변의 초기 표출로 실현되었다. 가족성의 작은 신장은다수의 다른 유전자(예,POU1F1,PROP1,GHRHR)에서 돌연변이에 의해서도 유발될 수 있는데, 이는 상이한 형태의 질환을 구별하는데 중요하다.
성장 호르몬(GH)은 다양한 효과를 통하여 뼈와 연부조직의 산후 성장을 촉진하는 다기능성 호르몬이다. GH의 직접적 작용과 간접적 작용의 상대적 기여도는 아직 확립되지 않고 있다. 한편, GH의 직접적 효과는 다양한 조직과 장기에서 확인되었고, GH 수용체는 다수의 세포형에서 발견되었다. 다른 한편, GH 효과의 대부분이 GH-의존성 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I)의 작용을 통하여 매개된다는 것을 시사하는 데이터가 다수 존재한다. IGF-I는 다수의 조직, 특히 간에서 생산되고 자체 수용체를 통하여 뼈, 연골, 골격근을 비롯한 다수 조직의 증식과 성숙을 강화시키는 역할을 한다. 또한, GH는 조직의 성장을 촉진하는 이외에, 나트륨과 수분 지체를 비롯하여 최유성, 당뇨병유발성, 지질분해성, 단백질 동화작용 효과와 같은 다양한 생물학적 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다.
유아기동안 정상적인 성장을 유지하기 위하여 적량의 GH가 필요하다. GH 결핍증상을 보이는 신생아는 일반적으로 정상적인 신장과 체중을 갖는다. 일부 신생아는 낮은 선형적 산후 성장과 함께, 왜소음경 또는 공복시 저혈단증을 보일 수도 있다. 성장 호르몬 단독 결핍증 환자에서 신장 지체와 연관하여 뼈 성숙이 지체된다. 복부 비만, 실제 연령보다 어려보이는 외모, 지체된 2차 치아발생이 때때로 나타난다. 조기 노화에서 관찰되는 것과 유사한 피부 변화가 해당 성인에서 관찰될 수 있다.
가족성 IGHD는 특징적인 유전 형질을 갖는 수개의 상이한 질환으로 구성된다.GH1유전자 좌위에서 결함과 관련하여 공지된 IGHD는 지금까지 확인된 상이한 유형의 기본적 병변과 함께 표 1에 도시한다.
표 1:GH1유전자와 관련된 유전 질환의 분류
질환 유전 방식 관련된 유전 병변 GH 단백질 증상
IGHD IA 상염색체 열성 대규모 결실소규모 결실넌센스 돌연변이 부재 심하게 작은 신장, GH 치료 직후에 발생하여, 이에 대하여 불충분한 반응을 초래하는 안티-GH 항체
IGHD IB 상염색체 열성 접합부위 돌연변이 결핍 작은 신장. 환자는 일반적으로 외인적 GH에 잘 반응한다.
IGHD Ⅱ 상염색체 열성 접합부위와 인트론 돌연변이미스센스 돌연변이 결핍 작은 신장. 환자는 일반적으로 외인적 GH에 잘 반응한다.
이들 병변의 특성화는 상기 유형의 IGHD간에 임상적 심각도, 유전 방식, 외적으로 투여된 GH에 대한 항체 형성 경향의 차이를 설명할 수 있는 단서를 제공하였다. 대부분의 사례는 산발적이고, 대뇌 부종, 염색체 비정상, 조직구증식증, 감염, 방사선, 중격-시신경 형성장애, 외상, 또는 시상하부나 뇌하수체에 영향을 주는 종양을 비롯한 대뇌 손상 또는 결함에 기인하는 것으로 추정된다. 자기 공명 영상촬영 검사에서 IGHD 환자중 대략 12%에서 시상하부 또는 뇌하수체 비정상이 탐지된다.
작은 신장, 지체된 '신장 속도' 또는 성장 속도, 지체된 뼈 성숙이 GH 결핍증에서 관찰되긴 하지만, 이들 증상이 이런 질환에만 특이적인 것은 아니고 다른 전신 질환에서도 나타날 수 있다. 본원에서 '신장 속도'와 성장 속도는 ㎝/y 단위로 피험자 또는 환자 신장의 변화 속도를 의미한다.
GH 결핍을 확인하는 시뮬레이션 검사는 L-Dopa, 인슐린-유도된 저혈당증, 아르기닌, 인슐린-아르기닌, 클로니딘, 글루카곤 또는 프로프라놀롤을 이용한다. 부적절한 GH 피크 반응(일반적으로 <7-10 ng/㎖)은 검사에 따라 달라진다. LH, FSH, TSH, ACTH의 동시 결핍은 뇌하수체 장애의 정도를 확인하고 최적 치료를 계획하기 위하여 실시한다.
재조합-유도된 GH는 세계적으로 가용하고 피하 주사로 투여한다. 최적 결과를 수득하기 위하여, IGHD 어린이는 진단이후 가능한 빨리 대체 요법을 실시한다. 재조합 GH의 초기 투여량은 체중 또는 표면적에 기초하는데, 정확한 사용량과 투약빈도는 프로토콜간에 상이할 수 있다. 투여량은 사춘기동안 최대량까지 체중에 따라 증가시킨다. 이후, GH 치료는 잠시 중단하고 환자의 GH 분비 능력을 재-평가한다. GH 결핍이 확인된 환자는 성년동안 좀더 적은 용량의 외생적 GH를 섭취한다.
GH로 치료하는 질환에는 (i) 이의 효능이 이미 입증된 질환 및 (ii) 이의 효능이 보고되었으나 아직 표준 치료법으로 공인되지 않은 다양한 질환이 포함된다. GH 치료의 효능이 입증된 질환에는 복합 뇌하수체 호르몬 결핍(CPHD) 및 터너 증후군과 무관한 또는 이들과 관련된 GH 결핍이 포함된다. 앞선 두 질환을 보이는 환자의 GH 대체 요법에 대한 임상적 반응은 (i) GH 결핍의 심각도와 성장에 대한 이의 부작용, 치료를 시작하는 연령, 출생시 체중, 현재의 체중, GH 투여량; (ii) 갑상선 호르몬 결핍과 같은 연관된 결핍의 치료에 대한 용인과 반응; (iii) 치료가 안티-GH 항체의 발생으로 어려워지는 가의 여부에 따라 달라진다. 터너 증후군 환자에 대한 치료의 결과는 작은 신장의 심각도, 이들의 염색체 보체, 치료를 시작하는 연령에 따라 달라진다.
GH의 효능이 보고된 다른 질환에는 연골무형성증과 같은 특정 골형성장애, 프라더-월리 증후군, 외적 스테로이드에 대한 속발성 성장 억제, 류머티스 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 만성신부전, 극특발성의 작은 신장, 러셀-실버 증후군, 자궁내 성장장애가 포함된다.
분자 유전자 수준에서 가족성 IGHD의 특성화는 여러 가지 이유로 중요하다. 관련된 좌위의 확인은 성장 지체의 심각도뿐만 아니라, 더 중요하게는 현재 가용한 다양한 치료 섭생의 타당성을 시사한다. 게다가, 기본적인 유전자 병변의 탐지는 상기 질환의 유전적 병인 확인을 가능하게 한다. 이는 또한 (i) 성장 저해의 심각도 및 (ii) GH 치료이후의 안티-GH 항체 형성의 가능성을 예측하는데 있어 진단적 가치를 가진다. 일부 경우에, 병리학적 병변의 인식은 상기 질환의 특이적인 유전 방식을 설명하는데 도움을 주고, 따라서 해당 가족에 대한 상담은 필수적이다. 최종적으로, 기능이상(무-기능의 반대) GH 분자를 나타내는 IGHD를 유발하는 돌연변이 병변의 특성화는 GH 구조와 기능에 대한 새로운 인식을 결과할 수 있다.
세포 수준에서, 단일 GH 분자는 2개의 GH 수용체 분자(GHR)에 결합하여 이들 분자를 이합체화시킨다. 이들 GH-결합된 GHR 분자의 이합체화는 티로신 키나아제 JAK-2와 관련된 신호 전달에 필요한 것으로 생각된다. GH의 다양한 효과는 상이한 조직에 세포질 도메인 또는 인산화 부위를 보유할 수 있는 단일 유형의 GH 분자에 의해 매개되는 것으로 알려지고 있다. JAK-2에 의해 활성화된 이들 상이한 세포질 도메인은 별도의 인산화 경로, 다시 말하면 성장 효과의 경로와 다양한 대사 효과의 경로를 유도할 수 있다.
GH는 전 뇌하수체의 성장호르몬분비 세포에 의해 분비되는 22kDa 단백질이다. X-레이 결정 연구에서 GH는 업-업-다운-다운-방식으로 배열된 2쌍의 평행 알파 나선 코어로 구성되는 것으로 밝혀졌다. 이런 구조는 2개의 분자간 이황화 결합(Cys53-Cys165; Cys182-Cys189)에 의해 안정화된다. 2개의 성장 호르몬 수용체(GHR) 분자는 GH 분자에서 구조적으로 상이한 위치에 각각 결합하는데, 이런 GHR 결합은 제1위치에서 제2위치로 순차적으로 진행된다. GHR의 GH에 대한 결합은 GHR 분자의 이합체화를 가능하게 한다.
GH 분자의 스캐닝 돌연변이유발 연구는 GH와 이의 수용체간 결합 상호작용에 대한 이해를 제공하는데, 본원에서는 특정 잔기의 기능을 조사하기 위하여 특정 부위 돌연변이유발을 이용한다. 따라서, Gly120(사람 GH의 3번째 알파 나선에 위치)의 Arg로의 치환은 제2위치에 대한 GHR 결합의 상실을 초래하고, 따라서 GHR 이합체화를 차단한다. 유사하게, 사람 GH 단백질의 잔기 Phe44는 프롤락틴 수용체와의 결합에 중요하다. 최종적으로, 잔기 Asp115, Gly119, Ala122, Leu123이 뮤린 GH 분자의 성장 잠재력에 중요한 것으로 밝혀졌다.
이합체된 GHR과 분자내 티로신 단백질 키나아제 JAK2의 상호작용은 하류 신호 전달 분자의 티로신 인산화, 유사분열물질-활성화된 단백질(MAP) 키나아제, 신호 전달물질과 전사 활성화물질(STAT 단백질)의 유도를 결과한다. 이런 방식으로, GH는 다수의 상이한 신호 경로를 통하여 다중 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있다.
몇몇 상이한 GH 이형체는GH1유전자(GH1참고 서열은 도 5에 도시한다)의 발현으로 만들어진다. 9%의GH1전사체에서, 엑손 2는 엑손 3의 다른 수용체 접합부위 45bp에 접합되고, 아미노산 잔기 32 내지 46을 결실되어 정상적인 22 kDa 단백질 대신에 20 kDa 이형체가 만들어진다. 상기 20 kDa 이형체는 성장과 분화를 촉진할 수 있는 것으로 보인다. 대안적 수용체 접합부위를 선택하는데 관여하는 인자는 아직 특성화되지는 않았지만 분명하게 복합적인 특성을 보인다. 엑손 3에 의해 인코드되는 코돈 31 내지 71이 결실된 17.5 kDa 이형체 역시 뇌하수체 종양 조직에서 미량으로 탐지되었다. 엑손 3과 4 또는 엑손 2,3,4가 결실된 접합 산물이 뇌하수체 조직에서 보고되었긴 하지만, 이들은 불활성 단백질 산물을 인코드하는 것으로 보인다. GH의 24 kDa 글리코실화된 변이체 역시 기술되었다. 22 kDa 이형체의 아미노산 서열은 도 6에 도시하는데, 이는GH1유전자 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열 및 26개 아미노산 리더 펩티드를 포함하는 단백질의 아미노산 서열을 보여준다. 측면 숫자는 아미노산 잔기 번호를 의미한다. 수직 화살표에서 굵은 숫자는 엑손 경계를 명시한다. 종결 코돈은 *로 표시한다.
뇌하수체 성장 호르몬을 인코드하는 유전자(GH1)는 5개의 연관된 유전자의 클러스터에서 염색체 17q23에 위치한다(도 1). 상기 66.5 kb 클러스터의 서열은 완전히 분석되었다[Chen et al. Genomics 4 479-497(1989), 도 5]. 성장 호르몬 유전자 클러스터에 존재하는 다른 좌위는 2개의 소마토맘모트로핀 유전자(CSH1과CSH2), 소마토맘모트로핀 가유전자(CSHP1), 성장 호르몬 유전자(GH2)이다. 이들 유전자는 6 내지 13 kb 길이의 유전자간 영역에 의해 분리되고 동일 전사 방향으로 위치하며 태반에서 발현되고 하류 조직-특이적 인헨서의 조절을 받는다.GH2좌위는 13개의 아미노산 잔기에서GH1-유래된 성장 호르몬과 상이한 단백질을 인코드한다. 5개의 유전자 모두 짧은 인트론,GH1의 경우에는 260bp, 209bp, 92bp, 253bp 길이의 인트론에 의해 동일 위치에서 끊어지는 5개의 엑손을 보유하는 매우 유사한 구조를 공유한다(도 2).
GH1유전자의 엑손 1은 60bp의 5' 비번역 서열(대안적 전사 개시 부위가 -54에 존재하긴 하지만), 코돈 -26 내지 -24 및 26개 아미노산 리더 서열의 출발점에 상응하는 코돈 -23의 첫 뉴클레오티드를 보유한다. 엑손 2는 나머지 리더 서열 및 성숙 GH의 첫 31개 아미노산을 인코드한다. 엑손 3-5는 각각 아미노산 32-71, 72-126, 127-191을 인코드한다. 엑손 5는 폴리아데닐화 신호로 종결되는 112bp 3' 비번역 서열을 인코드한다.Alu반복 서열 요소는 100bp 3'GH1폴리아데닐화 부위에 존재한다. 이들 5개의 관련된 유전자는 5' 측부 영역과 코딩 영역에서는 매우 상동하지만, 3' 측부 영역에서는 상이하다.
GH1과GH2유전자는 mRNA 접합 패턴의 측면에서 상이하다. 전술한 바와 같이, 9%의GH1전사체에서 엑손 2는 엑손 3의 다른 45bp 수용체 접합부위에 접합되어, 정상적인 22 kDa 대신에 20 kDa 이형체가 만들어진다.GH2유전자는 이런 방식으로 대체 접합되지 않는다.GH1의 엑손 3에 의해 인코드되는 40개 아미노산이 결핍된 3번째 17.5 kDa 변이체가 또한 보고되었다.
CSH1과CSH2좌위는 동일한 서열의 단백질을 인코드하는데, DNA 수준에서GH1서열과 93% 상동하다.CSH유전자 서열과 비교하면,CSHP1가유전자는 "엑손"내에 25개의 뉴클레오티드 치환 및 인트론 2의 공여체 접합부위의 필수 +1 위치에서 1개의 G→A 전이를 보유하는데, 이런 전이는 발현을 부분적으로 불활화시킨다.
GH 유전자 영역에서 다수의 이중대립유전자 제한 단편 길이 다형성(RELP)이 보고되었다. 이들중 5개(2개의Bg/Ⅱ, 2개의MspI, 1개의HincI)는 백인과 흑인에서 발생하는 반면, 추가적인 BamhI 다형성은 주로 흑인에서 나타난다. 강한 연쇄 불평형(linkage disequilibrium)이 이들 다형성간에 관찰되었는데, 이는 유전자 클러스터의 상대적으로 최근의 진화적 기원과 일치한다.HincⅡ와BamHI 다형성은GH1유전자의 5'말단 직후에 나타난다.RsaI 다형성은 뉴클레오티드 -75에서 A/G 이상성으로 인해GH1프로모터 영역에서 발생하고, 상대적으로 자주 나타나는SphI다형성은 완전히 특성화되었다.
매우 유익한(83% 이형접합도) 가변단위 반복 다형성은GH1유전자 3'말단에서 대략 19kb에 위치한다; PCR되는 이들 다형성의 18개 상이한 대립유전자는 단편 크기(201 내지 253 bP)로 구별할 수 있다.
최종적으로,GH1유전자 프로모터/5'-비번역 영역은 매우 높은 수준의 서열 다형성을 보이는 것으로 밝혀졌는데, 570bp 범위에서 17개의 변이 뉴클레오티드가 존재한다.
표 2A: 사람GH1유전자 프로모터/5' 비번역 영역에서 공지된 다형성[Giordano et al Human Genetics 100:249-255(1997); Wagner et al Eur.J.Endocrinol. 137:474-481].(도 3).
뉴클레오티드 위치 다형성(대체 뉴클레오티드)
-476 G/A
-364 G/T
-339 △G
-308 T/G
-301 T/G
-278 T/G
-272 내지 -276 CCAGA/SMRRR
-168 T/C
-75 A/G
-57 G/T
-31 △G
-6 G/A
-1 T/A/C
+3 G/C
+16 A/G
+26 A/C
+59 T/G
-1, +3, +59 위치에서 다형성은GH1유전자 프로모터의 상기 영역에 의해 인코드된 것으로 추정되는 GHDT4 단백질에서 아미노산 치환을 유발할 것으로 예상된다(하기 참조). 일부 서열 변이체는GH1유전자가 다른 태반에서 발현되는 유전자와 상이한 동일 위치에서 발생하는데, 이는 기전이 유전자 전환이고 태반 유전자가 전환된 서열의 공여체 역할을 한다는 것을 암시한다.
GH 결핍증으로 인해 키가 작은 사춘기전 어린이의 연구에서, Hasegawa등[J. Clin. Endocrinol Metab 85: 1290-1295(2000)]은GH1유전자에서 3가지 다형성[IVS4 C→T 1101(표 7A와 7B), T/G-278, T/G-57] 및 GH 분비와 신장간의 연관관계를 보고하였다.
첫 번째GH1유전자 결실이 보고된 이후, 좀더 미세한 다수의 병변이 확인되고 있다. 일부 경우에, 이들 병변은 특이적인 유형의 GH 결핍증과 연관하고, GH 구조와 기능을 살펴볼 수 있는 수단으로서 유망하다.
성장 호르몬을 인코드하는 유전자(GH1)는 클론된 첫 번째 사람 유전자중 한가지인데, 이후 유전적인 성장 호르몬 결핍을 초래하는 첫 번째 육안적 유전자 결실(6.7kB 형)이 서던 블랏팅으로 탐지되었다.GH1유전자와 관련된 모든 육안적 결실은 GH의 완전 부재로 특징지어지는 중증(IA형) 결핍을 초래한다.GH1유전자의 특징적인 결실중 대략 70%는 6.7kb이고, 나머지 결실중 대부분은 7.6kb 또는 7.0kb이다(표 2B - GH 결핍과 작은 신장을 초래하는GH1이 포함된 또는GH1유전자의 주변에서 육안적 결실).
표 2B:GH1유전자와 관련된 또는 이의 주변에서 육안적 결실
결실 크기(kb) 관련된 좌위 설명 치료후항체 존재
6.7 GH1 스위스 민족 Yes
6.7 GH1 일본 민족 Yes
6.7 GH1 스페인 계통의 아르헨티나 민족.동형 접합. Yes
6.7 GH1 오스트리아 민족 Yes
6.7 GH1 브라질 민족 Yes
6.7 GH1 작은 신장의 낭포성 섬유증 환자 Yes
6.7 GH1 다양 No
7.6 GH1 이라크, 예멘, 이란 민족 No
7.6 GH1 이탈리아 민족. 동형접합인척 결혼 Yes
7.6 GH1 이탈리아와 터키 민족 Yes
7.6 GH1 스페인 민족 No
7.6 GH1 다양 Yes
7.0 GH1 캐나다 민족 Yes
7.0 GH1 멕시코 민족 Yes
7.0 GH1 한족. 동형 접합.
45 GH1 터키 민족. 동형 접합.인척 결혼 Yes
45 GH1, CSHP1, CSH1, GH2 이탈리아 민족, 동형 접합 Yes
45 GH1, CSHP1, CSH1, GH2 이탈리아 민족, 동형 접합인척 결혼 Yes
45 GH1, CSHP1, CSH1, GH2 "아시아" 민족 No
? CSH1, GH2, CSH2 이탈리아 민족. 동형 접합 No
? CSH1, GH2, CSH2 덴마크 민족. 비-동일성 결실에 대한 혼성 이형 접합 No
이중 (i)GH1(6.7 kb)(ii)CSH1, GH2, CSH2(~ 32 kb) 프랑스 기원(집시족).동형 접합.인척 결혼. Yes
이에 더하여, 빈도가 좀 덜한 결실의 몇몇 실례가 보고되었다. 최근에, 돌연변이 스크리닝 도구로 서던 블랏팅 대신에 PCR-기초한 방식이 시도되었다. 동형 접합의GH1유전자 결실은GH1유전자와 측부 영역의 PCR 증폭 및 이후 생성된 PCR 산물의 제한효소 절단으로 간편하게 탐지되었다. 이런 방식이 위험한 상태의 임신에서GH1유전자 결실에 대한 동형 접합성을 성공적으로 배제하긴 하지만, 야생형에 대한 동형 접합성과 유전자 결실에 대한 이형 접합성을 구별할 수는 없다. 또한, 이는GH1유전자만 제거된 상대적으로 짧은 6.7, 7.0, 7.6 kb 결실을 제외한 다른 결실을 탐지하지 못한다.
GH1유전자에 인접하고 대조군 DNA 시료로부터 790bp 단편을 생성하는 PCR 프라이머가 설계되었다. 이런 단편의 부재가GH1유전자의 결실을 시사하긴 하지만, PCR 증폭을 위한 내부 대조군으로 "비-특이적인 PCR 단편"의 이용은 이런 방법의 신뢰성을 다소 의심스럽게 한다.
육안적 결실뿐만 아니라,GH1유전자에서 3개의 미세-결실이 보고되었다; 이들 환자중 2명은 6.7 kbGH1유전자 결실에 대해서도 이형 접합성이었다(표 3).
표 3: GH 결핍과 작은 신장을 초래하는GH1유전자에서 미세-결실
결실 유형 결실(소문자는 결실된 염기를 나타낸다. ＾는 직하류 코돈 위치를 명시한다 코돈(번호는 -26에서 번역 개시 코돈 ATG에 상대적으로 부여한다) 치료후항체 존재
IA GCCTG＾CTCTGcCTGCCCTGGC -11 Yes
II CCCCAGGCGGggatgggggagacctgtaGTCAGAGCCC 인트론 3(+28 내지 +45 결실) No
IA TCTGT＾TTCTCagAGTCTATTCC 54 No
GH1유전자의 코딩 영역내에서는 단지 7개의 개별적인 단일 염기쌍 치환이보고되었다(표 4).
표 4: GH 결핍과 작은 신장을 초래하는GH1코딩 영역에서 단일 염기쌍 치환
결핍 유형 뉴클레오티드 치환 아미노산 치환 코돈(번호는 -26에서 번역 개시 코돈 ATG에 상대적으로 부여한다) 치료후항체 존재
IA ACA→GCA Thr-Ala -24 No
IA TGG→TAG Trp→Term -7 No
IA GAG→TAG Glu→Term -4 Yes
II CGC→TGC Arg→Cys 77 No
? CCC→CTC Pro→Leu 89 No
? GAC→GGC Asp→Gly 112 No
? CGC→CAC Arg→His 183 No
이들 단일 염기쌍 치환중 2개는 신호 펩티드에서 아미노산 잔기 Trp-7과 Glu-4를 종결 코돈으로 전환시키는 넌센스 돌연변이다. 이들 돌연변이는 유전자가 결실되지 않는 IA형 결핍을 초래하는 것으로 유일하게 공지된GH1유전자 병변이다. 이들 병변은 신호 펩티드에서 번역의 종결을 유발하기 때문에, 기능적 GH 분자의 생산과 공존할 수 없다. 다른 5개의 단일 염기쌍 치환(거인증의 치료와 관련하여 EPA 790 305에 개시된 코돈 77에서 R →C 포함)은 기능이상의 성장 호르몬 분자의 생산을 초래하는 미스센스 돌연변이다. 이런 자연-발생 돌연변이는 인위적으로 유도된 돌연변이보다 훨씬 많은 정보를 제공하는데, 그 이유는 전자가 원칙적으로 임상적 표현형, 다시 말하면 당해 환자의 신장과 직접적으로 연관될 수 있기 때문이다.
병리학적으로 중요한 프로모터 영역에서 단일 염기쌍 치환은 먼저, 3명의IGHD IA 중국인 환자와 2명의 대조군에서GH1유전자의 프로모터 영역(번역 개시 위치에서 -60 내지 +70)을 서열분석하여 조사하였다. 몇몇 차이가 관찰되긴 했지만, 이들은 다형성의 가능성이 높아 추가로 특성화하지는 않았다. 전술한 바와 같이,GH1유전자의 프로모터 영역은 매우 높은 수준의 서열 다형성을 보이는데, 570 bp 범위에서 17개의 변이 뉴클레오티드가 존재한다(도 3). 하지만, 이들 서열 변이체는 대조군과 비교하여 환자에서는 중복하여 나타나지 않는 것으로 밝혀졌다.
GH1프로모터 변이를 개별적으로 조사하여 총 22개의 변이체 다형성 부위가 탐지되었는데, 이들 대부분은 단일 염기쌍 치환이었다: 이들중 17개는 ATG 개시 코돈의 5' 550 bp 영역에서 발생하고, 3개는 ATG의 5' -1075 위치 주변에서 발생하며, 2개는 인트론 1(IVS1)에서 각각 76과 216 위치에 발생한다[Wagner et al., Eur J Endocrinol 137:474-81(1997)]. 4개를 제외한 이들 변이체 모두 대조군에서 확인되었는데, 이들 4개의 변이체는 성장 호르몬 결핍의 원인으로 간주되지 않았다. 변이 위치중 한 위치만 전사 인자 결합 부위와 상동한 서열내에 위치하였다: 잠재적(입증되지 않음) NF-1 결합 부위의 -333에서 CCAGA와 GAGAG의 대안적 존재.
따라서, 지금까지GH1유전자 프로모터에서 병리학적으로 중요한 돌연변이는 보고되지 않았다.
mRNA 접합에 영향을 주는 단일 염기쌍 치환 역시GH1유전자에서 보고되었다. 이들 대부분은 비교적 드문 우세형의 GH 결핍과 연관하였다(표 5).
표 5: mRNA 접합에 영향을 주고 GH 결핍과 작은 신장을 초래하는 단일 염기쌍 치환
결핍유형 뉴클레오티드 치환/위치 접합 부위 인종-지역적 기원/접합성
II G→A, +1 IVS3 공여체 스웨덴, 북미, 북유럽, 남아프리카, 칠레/이형 접합성
II G→C, +1 IVS3 공여체 터키/이형 접합성
II T→C, +2 IVS3 공여체 ?
II G→A, +5 IVS3 공여체 칠레/이형 접합성
II G→C, +5 IVS3 공여체 ?
II T→C, +6 IVS3 공여체 터키/이형 접합성아시아/이형 접합성
II G→A, +28 IVS3 공여체 ?/이형 접합성
IB G→C, +1 IVS4 공여체 사우디 아라비아/동형 접합성
IB G→T, +1 IVS4 공여체 사우디 아라비아/동형 접합성
IB G→C, +5 IVS4 공여체 ?
인트론 4 공여체 접합 부위에서 염기전환은 엑손 4내의 잠재적 접합 부위인 엑손 4에서 5' 73 bp 공여 접합 부위를 활성화하는 트랜스펙션된 세포의 mRNA 시험관내 발현 분석으로 확인하였다. 이는 엑손 4에 의해 인코드되는 아미노산 103-126이 결핍된 비정상적 접합산물의 발생을 시사하고, 해독틀에서 이동의 결과로GH1유전자의 정상적으로는 번역되지 않는 3' 비-코딩의 못읽음(read-through)으로 인한 29개의 아미노산을 포함한 94개의 새로운 아미노산의 통합을 시사한다.
엑손 4와 5에 의해 인코드되는 GH 단백질 영역이 분비 과립에 대한 상기 단백질의 정확한 표적화에 중요한 것으로 생각되기 때문에, 이런 비정상적 단백질은 정상적으로는 분비되지 않을 것으로 예상됐었다. 하지만, IB형 GH 결핍증 환자에서 외생적 GH에 대한 항체는 전혀 발견되지 않았다. 따라서, 면역 관용의 회피는 비정상적 단백질 산물의 적어도 일부가 분비되어 순환계에서 부분적으로 안정한 상태로 존재할 수 있다는 것을 시사한다. IVS3에서 몇몇 공지된 접합 돌연변이(표 5)는 해당 가계에서 상염색체 우성 유전되는 II형 결핍증 상태와 연관한다.
절두된GH1돌연변이 또는 동형접합성 유전자 결실을 갖는 GH 결핍증 환자는GH 치료시에 안티-GH 항체가 발생할 가능성이 상당히 높다. 대조적으로, 접합 부위에서 미스센스 돌연변이 또는 단일 염기쌍 치환을 갖는 환자에서 동종-항체 형성을 제시하는 보고서는 확인된 바 없다.
현재까지, 돌연변이 유전형과 임상적 표현형간 다른 상관관계는 보고된 바 없다. 간행된 문헌에서 필수적인 데이터가 드물고 질적인 면에서 편차가 심하긴 하지만, 육안적 유전자 결실 환자가 임상적ㆍ표현형적 후유증 측면에서 접합 부위 돌연변이 환자와 상이한 지를 평가하는 수단으로 조금속(crude metal)-분석을 시도하였다. GH 결핍증 환자의 신장은 연령-평균(n=29)보다 평균적으로 7.3 SD 낮은 반면,GH1접합 돌연변이 환자는 평균(n=17)보다 평균적으로 5.4 SD 낮다. 결실 환자에서 골연령(bone age) 지체가 더 크고 성장 속도가 더 느리긴 하지만, 실험적 확인의 편향으로 인하여 이런 발견 결과는 해석하기 매우 어렵다.
본원에서 대부분의 가족성 GH 결핍증은 성염색체 열성으로 유전되기 때문에, 일부 사례의 유전된 결핍 상태는 적은 가족 인원수로 인해 인식되지 않을 가능성이 있다. 유사하게,GH1유전자의de novo돌연변이에 기인한 GH 결핍증 사례는 산발적으로 분류되는데, 이런 질환에 대한 유전적 해석은 결코 쉽지 않다. 최종적으로, 결핍 상태를 정의하는데 활용된 기준에 따라, GH 결핍증의 전체 범위의 표현형적ㆍ유전적 스펙트럼이 임상적 주목을 받지 못할 수도 있다. 이런 이유로, 현재 GH 결핍증의 이환율 평가는 부정확할 수 있고, 따라서 개체군에서 실제적인 이환율을 심각하게 과소평가할 수 있다.
선호되는 IGHD 정의는 (a) 중증 성장 지체 - 신장에서 <-4.5 SD; (b) 자극/유인에 대한 감소된 GH 반응(즉, <4 ng/㎖의 혈청 GH 수준); (c) 성장 지체에 대한 다른 원인을 종합한다. 환자를 선별함에 있어 GH 결핍증의 공식적인 정의를 엄격하게 적용하고 이들 기준, 특히 기준(b)을 상당히 일관되게 적용하면[Shalet SM et al., Endrocrine Rev 19:203-223(1998)],GH1돌연변이 스펙트럼이 완벽하지 못하고 또한 좀더 야생형의 돌연변이 스펙트럼을 대표하지도 못하게 된다. 따라서, SD 스코어가 좀 덜하거나 또는 GH 수준이 좀 덜 감소하는 GH 결핍증을 유발하는 돌연변이(예, 유전자의 코딩 영역내에서 미스센스 돌연변이 또는 프로모터 돌연변이)는 임상적 주목을 받을 가능성이 적다. 실제로, 이는 거의 20년동안 분자 수준에서 연구된 질환에서는 전례없이 단지 5개의 상이한 미스센스 돌연변이만GH1유전자에서 보고되었던 원인중의 하나다[The Human Gene Mutation Database; Krawczak et al, Human Mutation 15, 45-51(2000)).
GH의 완전한 부재는 광범위하게 연구되고 있는 쉽게 인식가능하고 중증도의 임상적 표현형을 유발한다. 환자의 표현형이 덜 심각하고 환자 선별 기준이 실질적으로 확립된 연구에서, 환자 확인 전략은 일반적으로 연령 평균 신장과 개별 신장의 편차를 성장 부진의 진단 지표로 이용한다.
전술한 기준 (a)와 (b)를 이용한 환자의 선별은 중증도의 IGHD-관련된 성장 부진 환자를 정의하는데 활용한다. 본원에서는 환자 선별에 적용되는 기준의 완화를 통하여 성장 부진이 상이한 GH 결핍 스펙트럼에 기인하는 환자가 포함되고, 따라서 새로운 일단의 잠재적 돌연변이 병변이 확보될 수 있다는 것을 제안한다. 이들 새로운 병변중 일부는 안정하지만 기능이상의 GH 분자를 유발할 수 있는데, 이런 분자는 정상적인 면역활성을 보이긴 하지만 생물학적 활성이 거의 없다. 방사-면역분석 실험 결과에 기초하여, 기능이상 GH 분자가 착오로 정상으로 간주될 수도 있다. 이런 기능이상 변이체가 정상적으로 것으로 판단된다면, GH 결핍증은 방사면역분석-기초한 GH "기능 검사"에 대한 현재적 의존의 결과로 과소-진단될 수 있다. 따라서, 실제적인 기능 진단 분석의 개발이 절실히 필요하다.
신장 속도는 절대 신장 치수보다 좀더 고감도의 성장 부진 지표로 생각된다. 골연령 지체(GH 결핍으로 인한 지체된 골 성숙) 및 다른 정상적인 변수와 함께 신장 속도의 활용은 GH가 없는 고전적 IGHD 환자의 표현형보다는 증상이 조금 덜하지만 신장 측정에만 기초하여 선별된 사람보다 GH 유전자의 병변을 보유할 가능성이 더 높은 표현형을 갖는 환자군의 일관된 확인을 가능하게 한다. 다른 중요한 지표는 성장 부진인데, 이는 작은 신장, 감소된 신장 속도 또는 골연령 지체를 동반할 수도 있고, 동반하지 않을 수도 있다.
본 발명은 자연-발생적인 성장 호르몬 변이를 탐지하는 방법; 이렇게 탐지된 변이; 성장 호르몬 불규칙성에 대하여 환자를 스크리닝하거나 또는 이런 불규칙성을 치료하는데 적합한 변이 단백질을 생산하기 위한 이들의 용도에 관한다.
따라서, 본 발명은 환자에서 GH 기능이상의 지표로 효과적인 GH에서 변이를 탐지하는 탐지 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다:
(a) 환자로부터 유래된 사람GH1유전자의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
(b) 검사 시료로부터 수득된 서열과 사람GH1유전자의 공지된 표준 서열을 비교하고, 여기서 검사 시료 서열과 표준 서열간의 차이는 GH 기능이상의 지표로 효과적인 변이(이후, "GH1변이체")의 존재를 시사하고, 검사 시료는 다음의 기준을 보이는 환자로부터 수득된다:
(i) 표준 신장 차트[Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762(1970)]로 플랏되는 경우 개체 부모의 신장에 기초한 개체의 예상 표적 성인 신장 범위를 벗어나는 개체의 성인 신장을 예시하는 성장 패턴[일련의 신장 측정값으로 기술됨; Brook CDG(Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141(1995, Blackwell Science)]으로 정의된 성장 부진.
또한, 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 방법에 따라 탐지되는GH1변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은GH1변이체의 전사체, 예를 들면GH1변이체에 의해 인코드되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질(이후, 'GH 변이체')을 제공하는데, 여기서GH1의 변이체는 전술한 본 발명에 따른 방법에 따라 탐지된다.
본원에서 '환자', '피험자', '개체'는 동일한 의미로 사용한다.
기준(1)에 대한 참고자료로는 Tanner and Whitehouse Arch Dis Child 51, 170-179(1976)가 유용하다. 환자의 표적 성인 신장 범위는 10 내지 90 백분위수 (centile)범위에서 평균-부모 신장(MPH)으로 계산하는데, 이는 성별에 따라 상이하다:
남성에서 MPH = [아버지의 신장 +(어머니의 신장 + 13)]/2 ±6 - 8 ㎝, 일반적으로 7.5 ㎝
여성에서 MPH = [(아버지의 신장-13) +어머니의 신장]/2 ±6 - 8 ㎝, 일반적으로 6 ㎝.
이들은 사람 성장 분야에 이용되는 표준 검사와 측정법으로, 표적 신장 범위의 한계를 예시하는데 적용되는 공식과 관련된 Brook의 기술 사항(ibid, 1996) 및 표준 신장 차트와 관련된 Tanner의 기술 사항(ibid, 1970)에 기초한 전술한 방법이 본 발명에서 바람직하긴 하지만. 성장 부진을 측정하는데 있어 임의의 다른 계산 방법을 활용할 수 있다.
따라서, 이는 GH-기능이상 환자의 확인에서 이용된 기준과 실질적으로 상이한 기준으로, 부모의 신장에 기초한 환자의 성인 신장의 예측을 포함한다.
가급적, 본 발명의 탐지 방법에서 검사 시료는 기준 (i) 이외에 다음과 같은 하나 또는 복수의 기준을 보이는 개체로부터 수득한다:
(ii) 연령에 대하여 25 백분위수 미만의 신장 속도;
(iii) 역연령(chronological age)과 비교하여 Tanner-Whitehouse 스케일에 따른 적어도 2년간의 골연령 지체; 또는
(iv) 상기 기준 (i) 내지 (iii)에서 포함되지 않은 임의의 다른 질환.
가급적, 특정 개체/환자와 관련하여 기준 (ii), (iii), (iv)이 모두 충족될 수 있도록 이들을 누적 적용한다.
기준 (ii) 내지 (iv)와 관련하여, 각 기준은 공지된 방법 및 후술한 바와 같이 당분야에 공지된 매개변수에 따라 평가한다:
(ii) Tanner JM, Whitehouse RH Atlas of Children's Growth(1982, London: Academic Press); Butler et al Ann Hum Biol 17:177-198(1990)은 제 1 기준, 다시 말하면 환자의 신장 속도가 환자 연령의 25 백분위수 미만이라는 결정을 가능하게하는 통계 자료다.
(iii) 골연령 지체의 연수를 평가하는 Tanner-Whitehouse 스케일은 Tanner JM, Whitehouse RH, Cameron N et al in Assesment of Skeletal Maturity and Prediction of Adult Height(1983, London: Academic Press)에서 기술한다. 본 발명의 방법에서, 환자는 대략 3.5 내지 4년의 골연령 지체를 보인다(역연령과 비교하여). 환자에서 골연령 지체의 평가는 1회이상 실시하는 경우에 어릴수록 좀더 높은 수준을 변이를 보이는데, 예를 들면 2살의 어린이의 복합 평가에서는 골연령 지체가 ±6개월 정도 변동하는 반면 3살에서는 ±4개월 정도 변동한다.
(iv) 작은 신장이 GH 기능이상이 아닌 다른 질환에 기인할 수도 있기 때문에, 이런 질환으로 고생하는 환자로부터 유래된 검사 시료는 본 발명의 방법에서 배제한다. 환자가 GH 결핍증과 유사한 증상을 초래할 수 있는 다른 질환에 걸리지 않았다는 것은 기초수준 측정으로 결정한다. 따라서, "기초수준 조사"에는 특히 갑상선 기능저하증; 가성 부갑상선 기능저하증; 흡수장애 증후군, 예를 들면 복강 질환; 신장과 간 질환; 혈액학적 질환, 예를 들면 빈혈증; 터너 증후군과 같은 염색체 질환이 성장 부진의 원인이 아님을 확인하는 핵형을 배제하는 검사가 포함된다. 환자는 성장 부진의 다른 원인, 예를 들면 선천적 심장 질환을 비롯한 심장 질환; 만성 자가-면역 질환, 예를 들면 류머티스 관절염과 염증성 장 질환; 만성 호흡기 질환, 예를 들면 심한 천식 또는 낭포성 섬유증; 골격 문제, 예를 들면 연골 무형성증을 배제하기 위하여 철저한 임상 검사를 받을 수도 있다. 상기와 같이 확인된 신체 질환뿐만 아니라 유아기에 성장 부진의 다른 주 요인인 심리-사회적실조(deprivation)의 배제하기 위하여, 완벽한 의료 병력으로 의학적 검사를 보충한다.
선택적으로, (v) 환자는 하나 또는 복수의 성장 호르몬 기능 검사를 실시할 수도 있다. "성장 호르몬 기능 검사"는 본원에서 밝힌 촉진 검사, 특히 인슐린-유도된 저혈당성 검사(IST)와 같은 성장 호르몬 분비 검사를 의미한다.
GH 기능 검사는 일반적으로 작은 신장의 환자에서 실시하는데, 이들 환자는 1회 이상의 내분비 클리닉 방문동안 임상적인 평가 및 신장 모니터에서 성장 부진의 다른 원인이 탐지되지 않았고, 따라서 정맥내 인슐린 투여에 기인하는 혈당의 현저한 감소와 같은 적절한 자극이후 뇌하수체로부터 성장 호르몬 분비를 유인하는 능력에 대한 평가가 요구되었다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 환자의 성장 호르몬 기능 검사의 결과는 정상이다.
본 발명에 따른 탐지 방법에서 전술한 기준을 적용하기 위하여 현재의 신장을 측정할 수도 있지만, 현재의 신장 자체는 이런 방법에서 환자를 선별하는데 활용되는 기준이 아니다. 전술한 바와 같이, 선행 방법은 환자를 선별하기 위한 기준으로 '정상' 신장(즉, 절대 신장)으로 표준 편차에 의존한다. 본 발명은 이런 기준의 포함을 요구하지 않고, 따라서 본 발명은 선별 기준에서 절대 신장이 배제되는 탐지 방법을 제공한다.
GH1변이 스펙트럼의 폭을 넓히는 것은 분자 유전학적 측면에서 유전된 GH 결핍의 재정의를 결과한다. 게다가, 새로운 유형의 작은 신장에 대한 인식은 질환 실체로서 GH 결핍의 재분류를 요구하고 있다. 이는 성장 호르몬 치료의 활용이 유익할 수 있는 작은 신장을 갖는 환자의 선별 및 확인과 밀접하게 연관한다.
본 발명의 탐지 방법에서 환자로부터 얻은 검사 시료는 가급적, 표준 과정에 의해 예로써 협측 표본, 혈액 시료 또는 머리카락의 환자 림프구부터 추출된 게놈 DNA로 구성된다. 이후,GH1유전자 분석은 겔이나 모세관 전기영동 및 피로시퀀싱(pyrosequencing)을 포함하나 이에 국한되지 않는 유전자 서열분석 또는 다형성 탐지에 적합한 방법으로 실시한다. 바람직하게는, 다음의 단계로 실시한다: 1(a) 완전한GH1유전자(프로모터, 5개의 코딩 영역 엑손, 인트론, 비번역 영역)를 포함하는 3.2 kb 단편의 증폭(가급적, PCR 증폭) 및 이후GH1유전자 특이성을 확보하기 위하여 설계된 프라이머를 이용한 좀더 작고 중복된 구성 단편의 PCR. 6개의 공지된 프라이머뿐만 아니라, 새로운GH1-특이적 프라이머의 설계는 밀접하게 관련되고 고도로 상동한 파라로거스(paralogous)GH2,CSH1,CSH2유전자,CSHP1가-유전자의 원치않는 PCR 증폭으로 인한 교차-오염을 회피하는데 필수적인 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 서열이 GH 클러스터상의 다른 4가지의 파라로거스(비-GH1) 유전자에서 발견되지 않는GH1유전자에 독특한GH1유전자-특이적 단편 및 GH 클러스터상의 다른 4가지의 파라로거스(비-GH1) 유전자에서 상동성 측면 영역에 결합할 수 없는 하나 또는 복수의GH1유전자-특이적 프라이머를 이용하여 기능이상의 GH를 가진 것으로 의심되는 환자의GH1유전자의 PCR 증폭으로 구성된다. 바람직하게는, 전체GH1유전자는 증폭된다;
1(b). 환자의GH1유전자의 대략 15 kb 상류의 좌위 조절 영역(과민감성 부위 I과 II)에 걸쳐있는 게놈 DNA의 전체 또는 일부 단편의 증폭(가급적, PCR증폭)[Jones et al Mol Cell Biol 15 7010-21(1995)]. 좌위 조절 영역(LCR)은GH1전사의 수준과 시간에 영향을 주는 인헤서 영역이다. LCR은GH1유전자 5'에서 ~14kb에 위치하고 GH 유전자 클러스터에서 유전자의 공동-좌표 발현을 담당한다. PCR 증폭은 일부 환자에서 새로운 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 2개의 중복 단편(254 bp와 258 bp)에서 실시하였다(실시예 5); 1.9kb LCR 단편은 모든 환자에서 증폭되었다(실시예 5A);
2. 선택적으로, Transgenomic WAVETMSystem을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피로 전체GH1유전자 또는 이의 단편의 변이 스크리닝[O'Donovan et al Genomics 52 44-49(1998)]. 상기 스크리닝 방법은 매우 신속하고 저렴하고 민감하고 반복재현가능하고 적어도 >95% 탐지 효율을 보이기 때문에 선택하였다. DHPLC에 의해 탐지된 "밴드이동"은 잠재적인 DNA 서열 변이체를 나타낸다(다시 말하면, DHPLC 단계없이 3.2 kbGH1유전자-오염된 PCR 단편의 직접적인 DNA 서열분석을 이용할 수도 있다);
3. DNA 서열분석(자동화 또는 수동)에 의한 이런 변이체의 특성화;
4. 선택적으로, 병변의 위치 또는 기능이상의 추정 기전에 적합한 방법을 이용한GH1유전자 병소의 기능적 특성.
따라서, 본 발명은 전술한 바와 같이GH1분석에 사용되는 새로운GH1-특이적 프라이머를 제공하는데, 여기에는 다음과 같은 프라이머가 포함된다:
DHPLC 단계에 사용하기 적합한 새로운 프라이머(실시예 3, 표 6):
CTC CGC GTT CAG GTT GGC(GHD1F);
AGG TGA GCT GTC CAC AGG(GHD1R);
CCT CCA GGG ACC AGG AGC(GHD2R);
CAT GTA AGC CCA GTA TTT GGC C(GHD3F);
GGA GAA GGC ATC CAC TCA CGG(GHD4R);
TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC(GHD5F);
CGT AGT TCT TGA GTA GTG CGT CAT CG(GHD6R);
TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC G(GHD7F);
LCR 단계에 사용하기 적합한 프라이머(모두 5'→3')(실시예 5와 5A):
GTGCCCCAAGCCTTTCCC(LCR15: 1159-1177);
TGTCAGATGTTCAGTTCATGG(LCR13: 1391-1412);
CCTCAAGCTGACCTCAGG(LCR25: 1346-1363);
GATCTTGGCCTAGGCCTCG(LCR23: 1584-1602);
LCR 5A(5' CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3');
LCR 3.0(5' CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3'); 및
LCR 5.0(5' CCTGTCACCTGAGGATGGG 3');
LCR 3.1(5' TGTGTTGCCTGGACCCTG 3');
LCR 3.2(5' CAGGAGGCCTCACAAGCC 3');
LCR 3.3(5' ATGCATCAGGGCAATCGC 3')은 1.9kb 단편을 서열분석하는데 적합하다.
전체GH1유전자의 PCT-증폭에 사용되는 다른 새로운 프라이머(실시예 5D)는 다음과 같다:
GH1G5(5' GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3');
GH1G3(5' CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3');
BGH3(5' TAGAAGGCACAGTCGAGG 3');
GH1R5(5' ATGGCTACAGGCTCCCGG 3');
GH1R3(5' CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3').
본 발명의 결실 방법 및 동정가능한 또는 탐지가능한GH1변이체는 다음과 같은 추가적인 장점을 제공할 수 있다:
1. 새로운 병변의 확인 및 특성화로GH1유전자 돌연변이의 공지된 스펙트럼 확대.
2. 작은 신장의 병인에서GH1유전자 돌연변이 역할의 평가.
3. 새로운GH1유전자 병변의 유전 모드 확인
4. 변이 유전형과 임상적 표현형간 상관관계의 설명. 이는 GH 결핍의 조기 탐지와 적절한 임상적 관리에 필수적인 것으로 보인다.
5. GH 분자의 구조와 기능에 대한GH1돌연변이의 효과 평가. 이는 작은 신장의 임상적 스펙트럼의 경계부분에서 임상적 표현형을 갖는 어린이의 평가에 특히 중요하다. 이런 환자군에서, 면역학적으로 활성을 보여 GH 기능 검사에서 정상으로 분류되는 기능이상 GH가 초래될 수 있다.
6. 유전된 GH 결핍에 대한 신속한 DNA 진단 검사의 개발.
7. GH 결핍이 개체군에서 현재 진단불량이고 과소평가되고 있다는 가설의 평가.
따라서, 추가적인 자연발생GH1병변의 특성화는 GH 구조, 기능, 발현에 상당히 중요하다. 신규한 코딩서열 변이체의 연구는 GH 기능, GH와 이의 수용체(GHR)간 상호작용, GHR-매기된 신호 전달 과정에 대한 이해를 증진시킬 것이다. 이렇게 얻어진 직관력은 신세대 치료 약물의 합리적인 설계에 유용할 수 있다. 유사하게, 프로모터 영역에서 자연발생GH1병변의 연구는GH1유전자 발현의 조절에 대한 새로운 직관력을 제공할 수 있다. 따라서, 광범위한 스펙트럼의 돌연변이된 병변은 유전형의 GH 결핍에서 변이 유전형과 임상적 표현형간 상관관계의 이해를 증진시킬 것이다. 분명하게, 이들 연구는 가족성 GH 결핍의 조기 탐지와 적절한 임상적 관리에 필수적이다.
또한, 본 발명은GH1과 구별되는GH1변이체를 제공하는데, 이는 본 발명에 따른 방법으로는 탐지되지만 신장이나 다른 기준 또는 이들의 조합에 기초한 환자에 선별 기준에 의존하는 방법과 같은 기존의 방법으로는 탐지되지 않는다. 본 발명에 따른 이런GH1변이체에는 실시예 7과 특히 표 7B에 명시된 것들이 포함된다.
후술한 바와 같이, GH 분비를 평가하는 검사방법이 다양하긴 하지만, 현재 가용한 단독 조사 방법은 바람직하지 않다. 사람 GH의 분비가 박동성이고 GH 펄스의 진폭과 빈도가 극도로 다변하기 때문에(수면, 운동, 스트레스, 개별 환자의 사춘기를 비롯한 복합적인 내부와 외부 인자에 의해 영향을 받기 때문에), 최적의 정보를 제공하는 검사는 지정된 조사 장소에서 환자의 엄밀한 감독을 필요로 한다.따라서, 이들 검사는 많은 시간이 소요되고 가격이 비싸며 환자와 이들의 가족에게 심한 스트레스와 고통을 초래한다. 인슐린-유도된 저혈당성 검사(IST)가 특히 그러하다; 이는 전술한 바와 같이 GH 분비를 평가하기 위하여 다수의 의사들에 의해 활용되고 있긴 하지만, 이의 성공적인 실행의 필수 요건으로 요구되는 저혈당증 치료로 인해 환자가 사망할 수 있다. 따라서, 키가 작은 어린이의 평가에서 IST와 같은 조사를 실시하기에 앞서, 이를 실시할 지의 결정은 극히 신중하게 고려해야 한다. 키가 작은 환자의 스크리닝에 사용하기 적합한 DNA 검사방법의 개발은 현재 가용한 다른 검사방법보다 다양한 이점을 갖는다.
따라서, 본 발명은 GH 기능이상이 의심되는 환자를 스크리닝하는 스크리닝 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
(a) 환자로부터 사람GH1유전자의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
(b) 검사 시료로부터 수득된 서열의 영역을 사전 결정된 서열의 상응하는 영역과 비교하고, 여기서 사전결정된 서열은 본 발명의 전술한 방법에 따라 탐지가능한GH1변이체로부터 선별된다.
좀더 구체적으로, 본 발명의 스크리닝 방법에서 사전결정된 서열은 야생형 서열의 상응하는 영역과 비교하여 적어도 한가지의 변이를 포함하는 변이체GH1유전자 영역에 상응하는 핵산 서열을 갖는 뉴클레오티드이다.
실시예 6과 표 7에서 확인된 것과 같이, 변이가 본 발명의 탐지 방법에 의해 탐지가능한 서열이 특히 선호된다.
바람직하게는, 검사 시료는 통상적인 방법으로 추출할 수 있는 게놈 DNA로 구성된다.
따라서, 본 발명은 GH 기능이상을 결정하기 위한 스크리닝 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
(a) GH 기능이상이 의심되는 환자로부터 제 1 검사 시료를 수득하고;
(b) 제 1 검사 시료에서GH1유전자나GH1전사체 또는 이들의 단편(예, cDNA)을 다음과 같은 기준을 보이는 환자로부터 유래된 제 2 검사 시료로부터 수득가능한GH1변이체의 상응하는 유전자, 전사체 또는 단편과 비교한다:
(i) 표준 신장 차트[Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762(1970)]로 플랏되는 경우 개체 부모의 신장에 기초한 개체의 예상 표적 성인 신장 범위를 벗어나는 개체의 성인 신장을 예시하는 성장 패턴[일련의 신장 측정값으로 기술됨; Brook CDG(Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141(1995, Blackwell Science)]으로 정의된 성장 부진;
(ii) 연령에 대하여 25 백분위수 미만의 신장 속도;
(iii) 역연령과 비교하여 Tanner-Whitehouse 스케일에 따른 적어도 2년간의 골연령 지체; 또는
(iv) 상기 기준 (i) 내지 (iii)에서 포함되지 않은 임의의 다른 질환.
본 발명은 GH 기능이상이 의심되는 환자를 간편하게 스크리닝하는 스크리닝 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
(a) 환자로부터 유래된 사람GH1유전자의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
(b) 검사 시료로부터 수득된 서열의 영역과 사전결정된 서열의 상응하는 영역을 비교하고, 여기서 사전결정된 서열은 본 발명에 따른 탐지방법으로 확인된 또는 확인가능한GH1변이체로부터 선별된다.
바람직하게는, 사전결정된 서열은 야생형 서열의 상응하는 영역과 비교하여 적어도 한가지의 변이를 포함하는 변이체GH1유전자 영역에 상응하는 핵산 서열을 갖는 뉴클레오티드이다.
바람직하게는, 본 발명의 스크리닝 방법에서 검사 시료의 제 1 검사 시료는 게놈 DNA로 구성된다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 비교 단계는 통상적인 방법, 예를 들면 상대적으로 적은 수의 변이체가 탐지/비교되는 경우에GH1유전자의 적절한 영역을 서열분석하여 실시할 수 있다. 상대적으로 많은 수의 변이체를 비교하는 경우에 DNA 칩 기술을 활용할 수 있는데, 예로써 칩은 라벨된 시료 DNA(환자로부터 유래된 cDNA 또는 게놈 DNA)를 고형 지지체에 고정된 돌연변이-특이적 올리고뉴클레티드 프로브의 마이크로-어레이에 혼성화시킴으로써 다중의 공지된 돌연변이 또는 모든 가능한 돌연변이를 동시에 스크리닝하는 소형 병렬 분석 장치이다[Southern, Trends Genet 12 110-115(1996)].
기존의 검사방법에 비하여 본 발명에 따른 DNA 스크리닝 방법의 이점은 다음과 같다:
1. 클리닉에서 실시할 수 있는 환자의 단일 혈액 검사만 필요하다. 대부분의 현재-가용한 검사방법에서 필요로 하는 입원, 장기간의 치료, 반복적인 혈액 채혈이 필요없다. 따라서, 관련된 비용, 특진의 이용, 각 검사 환자의 고통이 감소된다.
2. 환자에서 기능적 GH 기능이상의 조기 진단이 가능하다. DNA 스크리닝을 간편하게 실시할 수 있기 때문에, 의사는 환자의 관리에서 이전보다 좀더 초기에 이런 조사방법을 고려할 수 있게 된다. 현재는 GH 분비에 내재된 문제점으로 인하여, 의사는 어린이에게 IST를 적용하기에 앞서 장기간동안, 때때로 수년동안 외래 클릭에서 환자를 평가해야 한다. GH 기능이상에 대한 유전적 병인의 조기 진단은 조기 GH 치료를 가능하게 하고, 따라서 질병이 조금 덜한 상태에서 수개월 또는 심지어 수년 더 일찍 치료를 제공할 수 있다.
3. 좀더 많은 환자에서 GH 기능이상을 검사할 수 있다. 간편한 DNA 검사는 의사가 내분비 클리닉에 대한 일차 방문시점에서 키가 작은 환자의 초기 평가의 일환으로 이를 실시하는 것을 가능하게 한다. 이는 중증도의 성장 문제를 초래하는GH1유전자 병변을 갖는 환자 및 좀더 경미한 병변(예, 코딩영역에서 미스센스 돌연변이)을 갖는 환자를 노출시킬 가능성이 높다. 임상적/표현형적 문제가 IST를 담보할 만큼 충분히 심각하지 않아 이전에는 의학적 관심을 받지 못했을 수도 있는 이들 환자들이 GH 치료 혜택을 얻을 수 있게 된다.
4. 장기적인 GH 치료를 필요로 하는 환자의 조기 확인이 가능하다. 이들 환자는 GH 분비에 대한 초기 검사나 재-검사의 의뢰, 또는 GH가 없이 이들의 진행만을 평가하는 기간("치료없는 시험")없이 확인 및 치료할 수 있다.
5. GH 기능이상을 갖는 가족 구성원의 간편한 확인이 가능하다. 성장 문제를 유발하는 유전적 병변이 환자로부터 확인되면, 동일 유전자 병변에 대하여 다른 가족 구성원을 평가하여 이들이 GH 치료로부터 혜택을 입을 수 있는 지를 상대적으로 용이하게 확정할 수 있다.
6. 진단의 정확도가 증진된다. GH 분비에 대한 검사방법은 실험실내와 실험실간에 분석 결과의 반복재현 측면에서 변이성으로 악명이 높다. DNA 스크리닝은 이런 문제를 해결한다. 이에 더하여, GH 분비 실험 결과는 특수한 상황, 예를 들면 환자가 갑상선 기능저하 또는 사춘기 지연을 보이는 경우에 해석하는 것이 극히 힘들다. DNA 스크리닝은 이런 문제를 해결하고 GH 치료가 도움이 되는 환자에서 이런 치료 개시의 지연을 예방한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 스크리닝 방법을 실행하는데 사용하기 적합한 키트를 제공하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:
(a) 상응하는 야생형 서열로부터 적어도 한가지의 변이를 포함하는GH1유전자의 변이체 영역에 상응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드;
(b) (a)에 특정된 영역에서 야생형 서열에 상응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드;
(c) 환자 DNA의 소요 영역을 증폭하기 위한 PCR을 실시하는데 적합한 하나 또는 복수의 시약.
이런 시약에는 예로써,GH1유전자의 엑손에 상응하는 PCR 프라이머 및/또는 본원에서 밝힌 프라이머, 특히 전술한 신규한 프라이머; 및/또는 PCR에 사용되는다른 시약(예,TaqDNA 중합효소)이 포함된다.
바람직하게는, 상기 키트에서 올리고뉴클레오티드는 20 내지 25개의 염기쌍, 예를 들면 변이체 서열에서는 20개 염기쌍 및 야생형 서열에서는 변이체가 단일 염기쌍 치환인 경우에 야생형에 대하여 20개 염기쌍 또는 변이체가 5개 염기쌍 결실인 경우에 25개 염기쌍으로 구성된다. 어떤 경우든, 선택된 영역에서 유일하고 게놈의 다른 영역에서는 반복되지 않는 올리고뉴클레오티드를 선택해야 한다.
15개 내지 20개 또는 그 이상의 범위에서와 같이 복합적인 변이를 스크리닝해야 하는 경우에, 키트는 최대 40개이상의 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 따라서, DNA 칩 기술을 활용한 대안적 스크리닝 방법에서 본 발명은 고형 지지체에 고정되고 키트 성분에서 (a)로 정의되는 복수의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 뉴클레오티드 탐지 방법, 예를 들면 나노테크놀러지(예, Q-Dots)에서 개발된 신호 증폭 방법을 활용할 수도 있다. 또한, 단일 분자 탐지 방법을 활용할 수 있다(예, STM). 이런 경우에, 본 발명에 따른 키트는 이런 대안적 방법에 사용되는 하나 또는 복수의 시약을 포함할 수 있다.
대안으로, 본 발명에 따른 스크리닝 방법 및 상응하는 키트는GH1변이체 또는 GH 변이체의 존재를 지시하는 또는 이와 관련된 하나 또는 복수의 '대체 표적', 예를 들면GH1변이체 또는 GH 변이체에 특이적인 항체와 같은 단백질/아미노산 서열에 기초할 수 있다. 이런 "대체 표적"은 다음과 같이 구성된다:
(a) 임의의 생물분자(뉴클레오티드, 단백질, 당, 지질이 포함되나 이들에 국한되지 않음);
(b) 화학적 화합물(약물, 이들의 대사물질, 다른 화학적 화합물이 포함되나 이들에 국한되지 않음);
(c) 물리적 특성,
환자에서 이의 존재, 부재 또는 정도가 측정가능하고,GH1변이체 또는 GH 변이체의 존재와 상관한다.
본 발명에 따른 또 다른 적절한 스크리닝 방법은 통상적인 단백질 서열분석 방법(질량 분석법, 마이크로-어레이 분석, 피로시퀀싱 등) 및/또는 항체-기초한 탐지 방법(예, EISA)으로 확인가능한 GH 변이체(즉, 본 발명의 방법에 의해 탐지되는GH1변이체에 의해 인코드되는 것과 같은 hGH 변이를 포함하는 단백질/펩티드 서열)로 구성되는 검사 시료를 수득하고; 하나 또는 복수의 이런 단백질 서열분석 방법을 실행하는 것으로 구성된다.
이런 경우에, 본 발명에 따른 키트는 이런 대안적 방법에 사용되는 하나 또는 복수의 시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 탐지 방법으로 탐지가능한GH1변이체는 GH 기능이상에 대한 스크리닝 검사에서 기준이상으로 활용할 수 있다. 가령,GH1유전자의 프로모터 영역에 변이가 존재하는 변이체를 제외한 변이체는 GH 생산이 과다 촉진되는 환자, 예를 들면 뇌하수체 거인증 또는 말단 거대증 환자를 치료하는데 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 다음과 같이 제공한다:
(a) 성장 호르몬을 전혀 만들지 못하거나 또는 통상적인 진단 기술에 의해 고전적 GHD로 분류되는 환자의 확인을 위한 2개의 종결 돌연변이를 포함하는 하나또는 복수의 GH 변이체 또는GH1변이체;
(b) 결합단백질에 대한 결합으로 뇌하수체로부터 변이 GH의 전달을 손상 또는 저해하고 조직 수용체에 결합되지 않은 단백질의 파괴를 유발하여 성장 호르몬 수용체 또는 이의 결합 단백질(즉, 생체내에서 GH의 담체)에 대한 GH의 변형된 결합을 초래하는 GH 변이체 또는GH1변이체;
(c) 뇌하수체에서 GH 단백질의 아연 이합체 저장 형태의 형성을 교란할 수 있는 GH 변이체 또는GH1변이체;
(d)GH1변이체에 의해 발현되는 GH 변이체 또는 단백질, 이는 GH 수용체에 대하여 길항 특성을 보유하고 수용체 결합상수에 의해 변이 단백질의 효과와 저해 작용을 극복하고 환자를 치료하는데 필요한 외생적 GH의 함량(투여량)이 결정되는 단백질이다; 즉, 변이 단백질은 수용체와의 결합에서 야생형과 경합한다
(e) 치료, 진단 또는 탐지 방법에서 본 발명에 따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도;
(f) 환자에서 질병에 대한 취약성을 측정하기 위한 본 발명에 따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도;
(g) 당뇨, 비만 또는 감염에 대한 취약성을 측정하기 위한 본 발명에 따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도;
(h) 결합 결함 및/또는 뇌하수체 저장 결함을 측정하기 위한 본 발명에 따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도;
(i) 말단 거대증에서 길항제 치료의 진단 용량을 측정하기 위한 본 발명에따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도;
(j) 의료 치료에서 본 발명에 따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도;
(k) 유전자 요법에서 본 발명에 따른GH1변이체의 용도;
(l) 질병 상태와 관련된 하나 또는 복수의 다형성을 측정하기 위한 본 발명에 따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도;
(m) 치료요법적 조성물, 진단 조성물이나 키트 또는 탐지 키트의 제조에서 본 발명에 따른 GH 변이체 또는GH1변이체의 용도.
따라서, 본 발명은 GH 변이체, 특히 본 발명의 방법으로 탐지되고 동정된 변이체 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 다음과 같이 제공한다:
(a) GH 변이체를 인코드하는 핵산 서열;
(b) (a) 서열과 실질적으로 상동한 또는 엄격한 조건하에 (a) 서열과 혼성화되는 서열;
(c) 유전자 코드의 축중성을 제외하고 실질적으로 상동한 또는 엄격한 조건하에 (a)와 (b) 서열과 혼성화되는 서열;
(d) (a), (b) 또는 (c) 서열중 임의 한가지에 특이적인 올리고뉴클레오티드.
이에 더하여, 다음과 같이 제공한다:
(a) 전술한 핵산 서열을 포함하는 벡터;
(b) 박테리아 숙주 세포와 같은 상기 벡터(a)를 포함하는 숙주 세포;
(c) GH1 변이체를 만드는 공정, 상기 공정은 다음과 같이 구성된다:
(i) 숙주 세포(b)를 배양하고;
(ii) 생산된GH1변이체를 배양 배지로부터 회수한다.
(d) 배양 배지에서 전술한 서열, 벡터 또는 세포에 의해 인코드되는 또는 발현되는 단백질이나 아미노산 서열.
본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 상세하게 설명한다.
실시예 1 - 환자 선별
환자 출처
작은 신장의 어린이들은 카티프에 위치한 University of Wales College of Medicine의 Regional Peadiatric Growth, Endocrine and Diabetes의 소개를 받고 다른 유사한 UK 중심지(즉, 뉴포트, 버밍험, 브리스톨, 헥스햄, 리버풀, 스토크-온-트렌트, 포츠마우스, 사우스앰프톤)의 협조를 얻어 확인하였다. 가족력, 가계, 성장 파라미터의 증거 서류, 이전에 실시된 내분비 조사결과를 비롯한 모든 병력을 확보하였다. 지표증례(index case), 부모, 형제 자매에 대한 가능한 정확한 옥솔로지(auxology)를 기록하였다. 분자 유전학적 분석을 위한 혈액 시료는 지표증례 및 적합한 인척으로부터 취하였다. 다른 가족들은 John A. Phillips III 박사(Nashville, TN, USA), Mohamad Maghnie 박사(Pavia, Italy), Tamas Niederland 박사(Gyor, Hungary)의 소개를 받았다. 지금까지, GH-결핍된 69 가족으로부터 시료를 구하였다.
활용된 기준
ALL 환자의 선별에 활용된 기준은 다음과 같다:
(i) 본 발명에 따라 기준(i)으로 전술한 바와 같이 표적 신장 범위% 의 하한선 미만의 성장;
(ii) 25 백분위수 미만의 신장 속도;
(iii) 역연령과 비교하여 적어도 2년, 예를 들면 환자 1의 경우에 3.5-4년의 골연령 지체;
(iv) 모든 다른 조사 기준;
(v) 성장 호르몬 분비 검사 기준
표 5B에서, *GH FT: 피크:는 하나 또는 복수의 표준 성장 호르몬 기능 검사에서 활성의 단위(IU/L)를 나타낸다. '무작위'는 임의로 취한 GH 측정값을 의미한다. ND는 "테스트 실시하지 않음"을 의미한다. 신장 백분위수는 하기 표 7B에 제시된 데이터와 함께, 백분위수 미만의 신장을 갖는 것이 실질적으로 필수 선별 기준이 아니라는 것을 증명하기 위하여 포함시켰다; 실질적으로 감소된 신장을 갖지 않는 환자에서도 GH/GH1변이가 발생한다는 것이 확인되었다.
표 5B: 조사한 환자 및 활용된 기준의 결과
실시예 2 - GH1 -특이적 단편의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭
3.2 kbGH1-특이적 단편의 PCR 증폭은 65명의 관련없는 환자에서 실시하였다. 게놈 DNA는 표준 과정으로 환자 림프구로부터 추출한다.
ExpandTM고성능 시스템(Roche)으로 사람 GH1 유전자를 포함하는 3.2 kb 단일 게놈 DNA 단편을 PCR 증폭하기 위하여GH1-특이적 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 GH1F(5' GGGAGCCCCAGCAATGC 3'; -615 내지 -599)와 GH1R(5'TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3'; +2598 내지 +2616)을 설계하였다.
각 반응에서 2개의 분리된 박막 0.65㎖ PCR 튜브를 사용한다. 제 1 튜브는 500 ng 각 프라이머(GH1F와 GH1R), 200 μM dATP, dTTP, dCTP, GTP 및 멸균수로 25 ㎕ 최종 부피로 만들어진 200 ng 환자 게놈 DNA를 포함한다. 제 2 튜브는 멸균수로 24.25 ㎕ 최종 부피로 만들어진 5 ㎕ 10x 반응 완충액을 포함한다. 양 튜브는 5분동안 얼음에 위치시킨다. 이후, 0.75 ㎕ ExpandTM중합효소 혼합물을 제 2 튜브에 첨가하고, 내용물은 혼합하고 제 1 튜브에 옮긴다. 튜브는 30초동안 원심분리하고, 반응 혼합물에 30 ㎕ 경광유(light mineral oil)(Sigma)를 바른다. 반응 혼합물은 95℃로 설정된 480 또는 9700 PCR 프로그램가능 유전자 증폭기(Perkin Elmer)에 넣는다.
이후, 반응 혼합물은 다음의 조건하에 증폭시킨다: 95℃에서 2분; 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 68℃에서 2분 30회 사이클. 최종 20회 사이클에서, 68℃에서 신장 단계는 사이클당 5초씩 증가시킨다. 이후, 7분동안 68℃에서 추가로 배양하고, 반응물은 추가 분석에 앞서 4℃로 냉각한다. 각 반응 세트에서, 블랭크(네거티브 대조군)를 배치한다. 블랭크 반응물은 게놈 DNA를 제외한 모든 반응물을 함유하는데, 이는 반응물이 오염되지 않도록 담보하는데 사용된다. 1/10 부피(5 ㎕)를 1.5% 아가로즈 겔에서 분석하여 이중(nested) PCR을 실시하기에 앞서 PCR 증폭이 성공적으로 진행되었는 지를 평가한다. 성공적으로 PCR-증폭된 시료들은 이중 PCR에 사용하기에 앞서 1:100으로 희석한다.
실시예 3: 이중 PCR
실시예 2에서 만들어진 단편에 이중 PCR을 실시하여, 각 경우에 전체GH1유전자에 조합하여 걸쳐있는 7개 중복되는 아-단위를 만든다. 이에 더하여, 좌위 조절 영역은 3명의 환자를 제외한 모든 환자에서 PCR-증폭되었다(실시예 5 참조).
초기 3.2 kb PCR 산물의 7개 중복되는 아-단위는TaqGold DNA 중합효소(Perkin-Elmer)를 이용하여 증폭한다. 이들 반응에 사용되는 올리고뉴클레오티드는GH1유전자 참고 서열로부터 확인된 서열 위치와 함께 표 6에 기재한다.
희석된 긴(3.2 kb) PCR 산물의 1㎕ 분취량은 박막 0.2 ㎖ PCR 튜브 또는 96-웰 마이크로역가 평판의 한 웰에 넣는다. 여기에 5 ㎕ 10x 반응 완충액, 200 μM 최종 농도의 500 ng 프라이머 쌍(예, GH1DF와 GH1DR), dATP, dTTP, dCTP, dGTP 및 49.8 ㎕ 부피의 멸균수를 첨가하고, 이후 0.2 ㎕TaqGold DNA 중합효소를 첨가한다. 그 다음, 튜브 또는 마이크로역가 평판은 Primus 96 유전자 증폭기(MWG Biotech)에 넣고 다음과 같이 순환시킨다: 95℃에서 12분; 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분 32회 사이클. 이후, 72℃에서 10분동안 추가로 배양하고, 반응물은 추가 분석에 앞서 4℃로 냉각한다. 반응 혼합물의 1/10 부피(5 ㎕)를 0.8% 아가로즈 겔에서 분석하여, WAVETMDNA 단편 분석 시스템(Transgenomic Inc. Crewe, Cheshire, UK)에서 변성 고압 액체 크로마토그래피(DHPLC)를 실시하기에 앞서 반응이 진행되었는 지를 확인한다. 이형이중나선 생성을 강화시키기 위하여,PCR 산물은 95℃에서 5분동안 변성시키고 45분동안 50℃로 원형-재현시킨다. 산물은 DNAsep 칼럼(Transgenic Inc.)에 적하하고 0.9 ㎖/분의 일정한 유속으로 0.1M 트리에틸아민 아세테이트 완충액(TEAA pH 7.0)에서 2%/분의 아세토니트릴(BDH Merck) 선형 구배로 용리시킨다. 구배의 시작시점과 종결시점은 PCR 산물의 크기에 따라 조정한다. 분석에는 칼럼 재생 및 평형화에 필요한 시간을 비롯하여 증폭된 시료당 6.5-8.5분이 소요된다. 시료는 DHPLCMelt 소프트웨어(http:// insertion.stanford.edu/melt.html)를 이용하여 측정하여 표 6에 기재한 용해온도(TM)에서 분석한다. 용리된 DNA 단편은 UV-C 탐지기(Transgenic Inc.)로 탐지한다.
표 6: DHPLC 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 DNA 서열분석
실시예 4: GH1 -특이적 긴 PCR 단편의 클로닝과 DNA-서열분석
클로닝
DHPLC 분석은 추정 DNA 서열 변화를 보유하는 DNA 단편의 동정을 가능하게 한다. 어떤 대립유전자가 추정 서열 변화를 보유하는 지를 확인하기 위하여,GH1-특이적 긴(3.2 kb) PCR 단편은 PCR 플라스미드 클로닝 벡터 pGEM-T(Promega)에 클론시킨다. 클로닝은 1x 반응 완충액 및 10㎕ 최종 부피의 1㎕(3 unit) T4 DNA 리가아제의 존재하에 50 ngGH1-특이적 긴 PCR 단편을 10 ng pGEM-T에 추가하여 달성한다. 반응물은 10℃에서 16시간동안 배양한다. 전체 반응 혼합물은 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 얼음에서 냉각한다. 50 ㎕ DH5α콤피던트 세포(Life Technologies)를 첨가하고, 튜브는 30분동안 얼음에 둔다. 이후, 혼합물은 37℃에서 20초동안 열-충격시키고 2분동안 얼음에 다시 위치시킨다. 그 다음, 0.95 ㎖ YTx2 배지(16g 트립톤, 10g 효모 추출물, 물 ℓ당 5g NaCl)를 첨가하고, 혼합물은 진탕하면서 37℃에서 1시간동안 배양한다. 이후, 혼합물은 50 ㎍/㎖ 앰피실린, IPTG, X-gal를 함유하는 사전-데워진 아가 평판에 도말하고 37℃에서 16시간동안 배양하여 단일 콜로니가 성장하도록 한다.
각 평판으로부터 8개의 백색 콜로니를 선택하고 2번째 평판(gridded plate)에 옮긴다. 소량의 각 박테리아 콜로니는 프라이머 GH1DF와 GH1DR(실시예 3, 표 6) 및 전술한 조건을 이용하여 PCR-증폭하고,GH1-특이적 긴 PCR 산물이 성공적으로 클론되었는 지를 확인한다.
GH1-특이적 긴 PCR 단편을 포함하는 클론은 2 ㎖ YTx2 배지에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA는 제조업자의 지시에 따라 Qiagen 스핀 miniprep 키트를 이용하여 박테리아로부터 추출한다. 이렇게 추출된 DNA는 260nm에서 광학적 밀도를 측정하여 정량하고 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 클론의 크기가 정확한 지를 확인한다. 이후, 이들 클론중 4개를 염기서열분석한다.
자동화된 DNA 서열분석
GH1-특이적 긴 PCR 산물을 포함하는 클론은 Primus 96(MWG) 또는 9700(Perkin Elmer) PCR 유전자 증폭기상의 0.2 ㎖ 튜브 또는 96-웰 마이크로역가 평판에서 BigDye 서열분석 키트(Perkin Elmer)로 염기서열분석한다. 염기서열분석에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다:
GH1S1(5' GTGGTCAGTGTTGGAACTGC 3': -556 내지 -537);
GH3DF(5' CATGTAAGCCAAGTATTTGGCC 3': +189 내지 +210);
GH4DF(5' GACTTTCCCCCGCTGTAAATAAG 3': +541 내지 +560;
GH6DF(5' TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA 3': +1099 내지 +1122).
1㎍ 클론된 DNA는 3.2pmol의 적합한 프라이머 및 20 ㎕ 최종 부피의 4 ㎕ BigDye 서열분석 혼합물로 염기서열분석한다. 이후, 튜브 또는 마이크로역가 평판은 유전자 증폭기에 넣고 다음과 같이 순환시킨다: 96℃에서 2분; 96℃에서 30초, 50℃에서 15초, 60℃에서 4분 30회 사이클. 반응물은 정제에 앞서 4℃로 냉각시킨다.
정제는 완전 염기서열분석된 반응물에 80 ㎕ 75% 이소프로판올을 첨가하여 실시한다. 이후, 혼합하고 30분동안 실온에 방치한다. 그 다음, 반응물은 실온에서 20분동안 14,000 rpm에서 원심분리한다. 이후, 상층액은 제거하고, 침전물에 250 ㎕ 75% 이소프로판올을 첨가한다. 시료는 혼합하고 실온에서 5분동안 14,000 rpm으로 원심분리한다. 상층액은 제거하고, 펠렛은 75℃에서 2분동안 건조시킨다. 이후, 시료는 ABI Prism 377 또는 3100 DNA 서열분석기에서 분석한다.
실시예 5: 성장 호르몬 좌위 조절 영역의 분석
사람GH1유전자의 대략 14.5 kb 상류의 DNA 영역은GH1유전자 전사의 조직-특이적인 발생 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다[Jin et al Mol Endocrinol 13 1249-1266(1999)]. 이는 좌위 조절 영역(LCR)으로 알려져 있는데, 이의 서열은 GenBank(기탁 번호: AF010280)로부터 얻었다. 뉴클레오티드 번호지정은 GH LCR 참고 서열(도 4)에 기초한다.
1192 위치에서 다형성 부위는 굵은 글씨로 나타내고 밑줄로 표시한다. 이 영역의 일부를 PCR과 DHPLC로 분석하였다.
대략 400bp에 이르는 2개의 중복되는 PCR 단편은 가용한 DNA 서열을 참고로 하여 설계된 신규한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 만들었다:
단편 1 프라이머는 LCR15(5' GTGCCCCAAGCCTTTCCC 3': 1159-1177)과 LCR13(5' TGTCAGATGTTCAGTTCATGG 3': 1391-1412)이고, 단편 2 프라이머는 LCR25(5' CCTCAAGCTGACCTCAGG 3': 1346-1363)와 LCR23(5' GATCTTGGCCTAGGCCTCG 3': 1584-1602)이다.
PCR은TaqGold 중합효소를 이용하여 실시한다: 1 ㎕ 환자 게놈 DNA는 박막 0.2 ㎖ PCR 튜브 또는 96-웰 마이크로역가 평판의 한 웰에 넣는다. 여기에 5 ㎕ 10x 반응 완충액, 200 μM 최종 농도의 500 ng 프라이머 쌍(예, GH1DF와 GH1DR), dATP, dTTP, dCTP, dGTP 및 49.8 ㎕ 부피의 멸균수를 첨가하고, 이후 0.2 ㎕TaqGold DNA 중합효소를 첨가한다. 그 다음, 튜브 또는 마이크로역가 평판은 Primus 96 유전자 증폭기(MWG Biotech)에 넣고 다음과 같이 순환시킨다: 95℃에서 12분; 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분 32회 사이클. 이후, 72℃에서 10분동안 추가로 배양하고, 반응물은 추가 분석에 앞서 4℃로 냉각한다.
1/10 부피(5 ㎕)를 1.5% 아가로즈 겔에서 분석하여, 변성 고압 액체 크로마토그래피(DHPLC)를 실시하기에 앞서 반응이 진행되었는 지를 확인한다. DHPLC에 의한 분석은 61℃ 용해온도에서 실시예 3에서 밝힌 바와 같이 실시한다.
실시예 5A: 성장 호르몬 좌위 조절 영역의 추가 분석
40개의 대조군 환자와 40명의 유전성 GH 결핍 환자로부터 얻은 600 ng DNA는 다음의 신규한 프라이머를 이용하여 1.9kb LCR 단편을 PCR-증폭하는데 사용한다:
LCR 5A(5' CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3');
LCR 3.0(5' CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3'; 도 4 참조),
5 mM dNTP와 Roche 고성능 DNA 중합효소. 반응 조건은 98℃ x 2 분, 94℃ x 15초, 58℃ x 30초, 72℃ x 1 분 x 10회 사이클, 58℃ x 30초, 72℃ x 1 분 + 각 연속 사이클 x 20회 사이클에 5초 추가이다. PCR 반응 산물은 2% 아가로즈 겔에서 분리하고, LCR 단편에 상응하는 밴드는 절제장치로 절제한다. 아가로즈는 겔 추출로 제거하고, DNA는 서열분석을 위하여 용리시킨다. 1.9kb LCR 단편은 다음의 신규한 프라이머를 이용하여 ABI 3100 자동화 서열분석기에서 염기서열분석한다:
LCR 5.0(5' CCTGTCACCTGAGGATGGG 3');
LCR 3.1(5' TGTGTTGCCTGGACCCTG 3');
LCR 3.2(5' CAGGAGGCCTCACAAGCC 3');
LCR 3.3(5' ATGCATCAGGGCAATCGC 3')은 전체 영역에 걸쳐있다.
실시예 5B: 루시페라제 리포터 유전자 분석에 의한 GH1 프로모터 일배체형과 추정 프로모터 돌연변이의 특성화
QuikChangeTM특정부위-돌연변이유발 키트를 이용하여, 특이적인 서열 변이체를 pGL3-GH1 구조체에 통합시킨다. 전략에는 소요의 돌연변이를 보유하는 2개의상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 야생형 구조체의 반대 가닥에 원형-재현하는 것이 포함된다. 이후, 프라이머는 고성능PfuDNA 중합효소로 신장시키는데, 이는 무작위 돌연변이의 수준이 낮고 특이적 돌연변이 효율이 높다. 최종적으로,dam메틸화된 모 DNA는 메틸화된 또는 반-메틸화된 DNA에 특이적인 제한효소인DpnI으로 절단하여 돌연변이-보유 플라스미드를 선별한다.
쥐 GH3과 사람 HeLa 세포로의 DNA 전달에는 간편하고 효율적인 리포좀-매개된 트랜스펙션을 활용한다. GH3 세포의 일시적 트랜스펙션에 사용되는 시약은 TfxTM-50이다. 이는 합성 양이온 지질 분자(N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3-디(올레일옥시)-1,4-부탄디암모늄 요오드)와 L-디올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 구성되는 혼합물을 함유한다. 물로 수화된 직후, 이들 지질은 다중라멜라 소포를 형성하는데, 이는 핵산과 결합하고 이들의 세포로의 전달을 용이하게 한다. 세포는 96 웰 평판에 도말한다. 융합성 세포는 배양 플라스크에서 제거하고 새 배지로 희석하고 웰당 160% 합류의 세포 밀도로 계산한다. 200 ㎕ 부피의 희석된 세포는 각 웰에 분량하고, 평판은 습지를 포함하는 박스의 존재하에 37℃에서 하룻밤동안 배양한다. 이는 다음날 트랜스펙션될 때, 대략 80% 융합되는 세포를 결과한다.
트랜스펙션 혼합물은 무-혈청 배지, DNA(pGL3-GH1과 pRL-CMV), TfxTM-50 시약을 함유한다. 0.25 ㎍ pGL3 구조체, 2 ng pRL-CMV, 0.5 ㎕ TfxTM-50 시약을 함유하는 웰당 90 ㎕ 전체 용량을 준비한다(이는 최적화된 3:1 TfxTM-50 시약:DNA 비율을 제공한다). 배지와 DNA는 먼저 혼합하고, 이후 TfxTM-50 시약을 혼합한다. 용액은 즉시 볼텍스하고 실온에서 20분동안 배양한다. 15분 시점에서, 배양된 웰은 배양기로부터 꺼내고, 성장 배지를 제거한다. TfxTM-50 시약/DNA 혼합물은 90 ㎕를 각 웰에 첨가하기에 앞서 잠시 볼텍스한다. 평판은 1시간동안 배양기에서 다시 넣고, 이후 200 ㎕의 사전-데워진(37℃) 완전 배지를 각 웰에 첨가한다. 세포는 추가로 24시간동안 배양기에 넣고, 이후 리포터 분석을 위하여 용해시킨다. HeLa 세포의 트랜스펙션은 GH3 세포와 동일한 과정을 따른다. 차이점은 TfxTM-50 대신에 TfxTM-20 시약을 사용하고, 1 ng pRL-CMV가 동시-트랜스펙션되며, 세포가 웰당 60% 융합의 세포 밀도로 계산된다는 점이다.
트랜스펙션된 배양 세포는 37℃ 배양기로부터 취하고, 성장 배지는 제거하고 이후 50 ㎕ 인산염 완충 용액(PBS)을 첨가한다. 평판은 부드럽게 돌리고, 이후 세척 용액을 제거한다. 20 ㎕ 부피의 부동성 세포용해 완충액을 각 배양 웰에 첨가하여, 세포 단층이 완전히 덮이도록 담보한다. 평판은 회전 테이블에 위치시키고 실온에서 30분동안 방치하고, 이후 -70℃로 저장한다. 평판은 해동시키고 20초동안 600 rpm으로 회전시킨다. 마이크로평판 발광분석기는 각 리포터 분석에 대하여 2초간의 측정전 지연과 이후 10초간의 측정을 실행하도록 프로그램한다. 50 ㎕ 부피의 루시페라제 분석 시약 Ⅱ(Dual Luciferase Reporter Assay System, Promeaga,UK)을 제 1 웰에 직접 주사하고, 개똥벌레 루시페라제 활성을 측정하고 기록한다. 이후, 50 ㎕ 부피의 Stop&GloTM시약을 주사하고,Renilla활성을 기록한다. 이런 과정은 각 세포 용해질에 대하여 반복한다.
실시예 5C: GH 변이체의 신호 전달 활성의 분석
본 생물분석에서 GH 변이체에 대한 표적으로 HK293 세포 클론을 선택하는데, 그 이유는 이들 세포가 GH 수용체의 증가된 발현을 보이기 때문이다. 분석에 앞서, 세포는 24시간동안 24-웰 평판(웰당 100,000 세포)에 위치시키고, 이후 STAT 5-반응성 루시페라제 리포터 유전자 구조체 및 구조적으로 발현되는 β-Gal 플라스미드(CMV 프로모터)로 공동-트랜스펙션시켜 트랜스펙션 효율을 교정한다. 하룻밤동안 트랜스펙션한 이후, 세포는 세척하고 공지된 표준 농도 범위로 희석된 변이체 및 야생형 GH와 함께 6시간동안 배양한다. 이 기간동안, GH 수용체의 활성화는 STAT 5 활성화와 루시페라제 발현을 유인한다. 따라서, 이런 분석에서 루시페라제 발현은 GH 수용체 활성화의 정도, 다시 말하면 세포에 적용된 GH의 생물학적 활성의 척도를 제공한다. 6시간 배양이후, 세포는 용해시키고, 루시페라제는 표준 방법[Ross RJM et al in Molec Endocrin 11 265-73(1997)] 및 Promega UK Ltd에서 제공한 키트를 활용하여 평판 판독 발광분석기에서 측정한다
실시예 5D: 시험관내 접합 분석
전체 사람GH1유전자는 적합한 프라이머의 5' 말단에 부가되는KpnI(GH1G5) 또는XhoI(GH1G3)에 대한 제한효소 인식 부위를 보유하는 1467bp 단편을 증폭하기위하여 다음의 신규한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 PCR-증폭하였다:
GH1G5(5'GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3');
GH1G3(5'CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3').
이들 부위는 밑줄로 표시한다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 95℃에서 45초, 58℃에서 45초, 68℃에서 2분 10회 사이클; 95℃에서 45초 20회 사이클; 68℃에서 2분 + 매 사이클마다 5초씩 추가.
이후, 증폭된 단편은 제한효소KpnI또는XhoI로 절단하고, 동일 제한효소로 절단된 플라스미드 벡터 pCDN3.1(Invitrogen)로 클론시킨다. 일단 클론된 단편은 서열분석하여 오류를 검사한다. 이후, 재조합 플라스미드는 쥐 전방 뇌하수체 GH3 세포에 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션이후, 세포는 24시간동안 방치한다. 그 다음, RAN는 RNAzol B(Biogenesis)로 추출한다.
상기 RNA는 다음의 신규한 프라이머 BGH3(5' TAGAAGGCACAGTCGAGG 3')과 Superscript Ⅱ(Life Technologies)를 활용한 역전사에 이용한다. 5 ㎍ 전체 RNA는 12 ㎕ 최종 부피의 500 ng BGH3에 첨가하고 15분동안 70℃로 가열한다. 이후, 시료는 얼음위에서 냉각하고, 4 ㎕ 5x 완충액, 2 ㎕ 0.1M DTT, 1 ㎕ 10mM dNTP를 첨가한다. 시료는 42℃로 가열하고 200U(1 ㎕) Superscripr Ⅱ를 첨가하고 상기 온도에서 50분동안 방치한다. 그 다음, Superscripr Ⅱ는 15분동안 70℃로 가열하여 불활성화시킨다.
이후, 역전사된 RNA는 PCR에 사용한다. 4 ㎕ 역전사 혼합물은 654bp 단편을 증폭하기 위한 다음과 같은 신규한 올리고뉴클레오티드와의 PCR 반응에 사용한다:
GH1R5(5' ATGGCTACAGGCTCCCGG 3');
GH1R3(5' CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3').
PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 95℃에서 45초, 58℃에서 45초, 68℃에서 2분 10회 사이클; 95℃에서 45초 20회 사이클; 68℃에서 2분 + 매 사이클마다 5초씩 추가. 그 다음, PCR 산물은 1,5% 아가로즈 겔에서 전기영동하고 정제하며 서열분석한다.
실시예 6: GH1 유전자 돌연변이와 다형성
본 발명에 따른 선별 특성은 하기에 제시된 상이한 유형의 증거에 기초하여 작은 신장의 병인에 관여하는 것으로 생각되는GH1유전자에서 대략 54개의 상이하고 새로운 변이체("돌연변이"-표 7B)의 특성화와 동정을 결과하였다. 이들 새로운 병변은 31개의 상이한 미스센스 돌연변이, 프로모터/5'-비번역 영역에서 21개의 상이한 돌연변이, 2개의 접합 부위 돌연변이로 구성된다. 이에 더하여,GH1유전자 영역내에서 71개의 다형성이 확인되었다.
표 7A: 환자의 사람GH1유전자에서 발견된 다형성. 비교를 위하여 파라로거스GH2,CSH1,CSH2유전자와CSHP가유전자의 유사한 위치에서 뉴클레오티드를 제시한다.
*IVS4 1101은 Hasegawa, ibid로부터 공지됨.
표 7B에서, 뉴클레오티드 번호지정은 도 5에 도시된GH1참고 서열에 기초하는데, 상기 도 5에서 사람GH1코딩 서열의 5개 엑손은 어퍼 케이스에 도시한다; 번역 개시 코돈(ATG)과 종결 코돈(TAG)은 밑줄로 표시한다; 폴리(아데닐화)신호는 굵은 글씨로 나타내고 밑줄로 표시한다; 3' UTR 경계는 +1642에 위치한다; +1=전사 개시 위치. 본원에서 언급된 돌연변이 병변, 다형성, 올리고뉴클레오티드의 모든 번호지정(좌위 조절 영역 제외, 도 4 참조)은GH1참고 서열과 관련될 수 있다.
도 7B: 성장 호르몬 결핍:GH1유전자 돌연변이와 다형성
기호:
IVS: 개재 서열(인트론)
ND: 돌연변이 및 다형성 탐지되지 않음
UTR: 비번역 영역
a 환자(클론 번호)
bGH1참고 서열에 기초한 뉴클레오티드 번호지정. -31에서, 선택적 대립형질은 G의 존재 또는 부재다.
c 아미노산 잔기 번호와 치환, (뉴클레오티드 치환 및GH1참고 서열에 기초한 번호).
d IVS 번호, 뉴클레오티드 변화, 염기 번호.
e Miyata I, Cogan J, Prince MA, Kamijo T, Ogawa M, Phillips JA, Detection of growth hormone defects by dideoxy fingerprinting(ddF) Endocrinol J. 44 149.
* 처음으로 이 돌연변이가 생체내에서 확인되었다; 알라닌 스캐닝 돌연변이유발의 결과로 시험관내에서 먼저 확인되었다(Cunningham et al USP 5 849 535(1998)).
GH1참고 서열은 GenBank(기탁 번호: J03071)를 통하여 입수한 Chen et al(1989)로부터 추론한다. 지금까지 분석한 68명의 환자중 47명에서 돌연변이가 확인되었다. 탐지된 모든 돌연변이는 30, 37, 50, 52번 환자(동형접합성)를 제외하고, 30, 31, 44, 50, 52, 55, 57, 60, 66, 67번 환자[in trans(즉, 상이한 대립유전자에서) 비-상동한 병변에 대하여 복합 이형접합성] 및 2개이상의in cis(즉,동일 대립유전자에서) 돌연변이를 보유하는 7, 23, 30, 31, 32, 36, 47, 48, 50, 52, 70번 환자에서 이형접합성 상태로 발견되었다.
(a) 미스센스 돌연변이
GH1유전자의 코딩 영역에서 총 31개의 새로운 단일 염기쌍 치환이 확인되었는데, 이들은 인코드된 아미노산을 변화시킨다. 이들 미스센스 돌연변이의 병리학적 관여는 다음의 4가지 근거로부터 증거된다: (i) 대조군 개체군의 연구; (ii) 조사중인 잔기의 아미노산 치환의 성격 및 진화적 보존 정도; (iii) 분자 모델링; (iv) 신호 전달 활성의 시험관내 분석.
(i) 대조군에서GH1코딩 서열 변이의 연구
총 80명의 건강한 영국 백인 대조군은GH1유전자의 코딩 영역에서 변이체를 스크리닝하였다. 단일 환자에서 발견된 침묵 치환의 5가지 예는 [Asp26에서 GAC →GAT, Ser85에서 TCG →TCC, Ser85에서 TCG →TCA, Thr123에서 ACG →ACA, Asn109에서 AAC →AAT]이다. 이에 더하여, 2개의 미스센스 치환[AAC →GAC, Asn47 →Asp; FTC →ATC, Val110 →Ile, 4/160 대립유전자]이 확인되었다; Val110 →Ile 치환은 66번 환자에서만 발견되었다. 분자 모델링은 이런 치환이 GH 구조에 유해한 효과를 발휘한다는 것을 시사한다; Val110은 나선 3의 N-말단에서 소수성 코어의 일부를 구성하는데, 이것이 좀더 긴 측쇄를 갖는 Ile로 치환되면 공간적 장애가 발생한다. 따라서, 대조군과 환자 개체군 모두에서 상대적으로 빈번하게 발생하는Val110 →Ile 치환이 신장에 영향을 줄 가능성이 높다. 그럼에도 불구하고, 대조군 개체군에서 미스센스 돌연변이의 상대적인 부재는 환자에서 발견되는병변의 확실성을 뒷받침한다.
(ii) 관련된 잔기의 아미노산 치환의 성격 및 진화적 보존
미스센스 돌연변이 임상적인 주목을 받을 가능성은 조사중인 유전자의 서열 구조, 아미노산 치환의 중요도, 단백질 분자내에서 치환된 잔기의 정확한 위치와 주변 환경, 단백질의 구조와 기능에 대한 이의 효과를 비롯한 다수의 인자에 의존한다(Wacey et al Hum Genet 94 594-608(1994)). 탐지된 미스센스 돌연변이가 병리학적으로 중요한 지를 평가하기 위하여, 개별적으로 이런 변화의 생물물리학적 특성을 조사하였다(표 7C). 대부분의 경우에, 이런 변화는 치환 아미노산이 치환되는 아미노산과 현저하게 상이한 비-보존성 변화인데, 이는 이들이 병리학적으로 중요하다는 주장을 뒷받침한다.
병리에서 미스센스 돌연변이의 관여 증거는 진화적 보존 데이터로부터 추론할 수 있는데, 그 이유는 진화적으로 보존된 아미노산 잔기가 생물학적 기능을 보유할 가능성이 높기 때문이다. 반대로, 진화적으로 보존되지 않는 잔기는 기능적으로 중요할 가능성이 낮다. 따라서, 병리학적 병변은 진화적으로 보전된 영역에서 발생하는 경향이 있고, 반면 중성 다형성 또는 특이한 변이체는 그렇지 않다(Wacey et al, ibid). 이런 이유로, 미스센스 돌연변이에 관여하는 것으로 확인된 사람 GH 잔기 각각은 19종의 다른 척추동물의 오르토로거스(orthologous) GH 단백질 서열과의 비교를 통하여 진화적 보존 측면에서 조사하였다. 미스센스 돌연변이의 영향을 받는 대부분의 잔기는 고도로, 때로는 엄격하게 보존되는 것으로 확인되었는데, 이는 이들 병변이 병리학적으로 중요하다는 견해를 더욱 뒷받침한다.
비교된 오르토로거스 GH 단백질
(둥근 괄호에서 사람에 대한 동일% vs 보존적 변화%)
생쥐(66,77), 쥐(64,75), 토끼(66,77), 고래, 개(67,78), 돼지(67,78), 양(66,76), 소(66,76), 칠면조(55,74), 닭(56,73), 오리(55,72), 거북, 개구리(45,68), 상어, 감성돔, 별우럭, 연어, 잉어(38,57), 금붕어(37,57).
(iii) 분자 모델링으로 예증된 추정 기능성 서열에서 미스센스 돌연변이
분자 모델링 연구는 미스센스 돌연변이가 GH 수용체와 상호작용하거나 또는 GH-GH 수용체 상호작용에 영향을 줄 수 있는 GH 분자의 영역에 위치한다는 것을 시사하였다. 미스센스 돌연변이는 사람 성장 호르몬의 X-레이 결정 구조에서 적합한 아미노산 잔기의 단순 치환으로 설계하였다. 이후 야생형과 변이 "구조"는 정전 상호작용, 수소결합, 소수성 상호작용, 표면 노출과 관련하여 비교하였다. 대부분의 미스센스 돌연변이는 기능적 동요보다는 GH 분자의 구조적 변형에 기인하는 것으로 보인다. 이런 아미노산 치환은 분자의 부적절한 접힘 또는 불안정성을 초래할 수도 있다. 하지만, 다음의 8가지 돌연변이는 순전한 구조적 결과와는 반대로 기능적 결과를 보이는 아미노산 치환에 대한 유력한 후보다:
Ile4Val: 부위 2에서 N-말단. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(ASM)에서 Ile4의 치환이 GHR 이합체화에 영향을 준다는 것이 이미 확인되었다.
Gln22Arg: 나선 1. Arg의 도입은 Asp26과의 H-결합을 소멸시킨다. 이는 또한, 나선의 동일 측부에 2개의 양전하를 도입하고, 나선 형성을 불안정화시키거나또는 GHR의 Arg217과의 부정적인 상호작용을 초래할 수 있다.
Lys41Arg: 루프 1. Lys41은 용제 접근가능. 오르토로거스 유전자들은 유사한 위치에서 Arg를 보유한다. Lys41 Nζ는 GH 잔기 Tyr28 및 Glu32와 H-결합을 형성하고 GHR Glu127 Oε2와 이온 상호작용을 보인다. Lys41은 ASM에 의해 GHR 결합에 관여하는 것으로 확인됨. Arg 도입은 GHR에 대한 GH의 친화성을 증가시키지 않는다. 미세한 변화가 있지만, 병리학적 변화는 없다. 환자에서 정상적인 GH 수준.
Glu56Gly: Glu56은 나선 1과 2간 루프 영역에 위치하고 결합 부위 1의 일부를 구성한다. Glu56은 GHR의 Ag71과 상호작용한다. Glu56은 또한, GH-GHR 복합체에서 결합 에너지 핫스팟의 일부를 구성하는 Lys168과 내적으로 상호작용한다.
Arg64Gly: 루프 2. Arg64는 용제 접근가능. 이 위치에서 Arg 또는 Lys 보존. Arg64는 ASM에 의해 GHR 결합에 관여하는 것으로 확인됨. 염기성 Arg 측쇄는 GHR Asp164와 염다리 및 H-결합을 형성한다. Arg64는 또한, GHR의 Trp169와 소수성 상호작용을 보인다. Gly에 의한 치환은 GHR 결합을 약화시키고 나선을 불안정화시킬 수 있다. 환자에서 정상적인 GH 수준.
Lys168Arg: 나선 4. GHR의 Lys168과 Trp104간 소수성 상호작용. 부정적인 상호작용은 예상되지 않음. 환자에서 높은 정상적인 GH.
Lys168Glu: Lys168은 GHR의 Trp104와 광범위한 소수성 상호작용을 보인다. 변화는 유익한 분자간 정전 상호작용을 유도하여 GH 활성형을 안정화시킬 수 있다. Glu에 의한 치환은 활성에 부정적인 영향을 주지 않을 수도 있다.
Thr175Ala: 나선 4. Thr175는 ASM에 의해 GHR 결합에 관여하는 것으로 확인됨; Thr175는 GH의 Asp171 및 GHR의 Trp169와 Arg143과 H-결합을 형성한다. Ala 도입은 나선을 불안정화시켜 수용체 결합을 감소시킬 수 있다.
전술한 미스센스 돌연변이는 자연발생 성장 호르몬 저해물질의 존재를 표시하는데, 이는 본 발명에 따라 적용된 선별 기준을 제외하고 확인된 적이 없었다.
(iv) GH 변이체의 신호 전달 활성의 분석
루시페라제 리포터 유전자 분석 시스템(Ross RJM et al, Molec Endocrine 11 265-73(1997))을 활용하여, GH 변이체의 신호 전달 활성(생물학적 활성)을 분석하였다. 생물학적 활성 성장 호르몬은 2개의 GH 수용체와 결합하여 수용체 이합체화를 유도한다. 이후, 이는 JAK2로 알려진 세포내 티로신 키나아제의 활성을 유인한다. 뒤이어, JAK2는 인산화되고 전사 인자 STAT 5를 활성화시킨다. 인산화된 STAT 5 이합체화되고 핵으로 전위되며 STAT 5-반응성 프로모터와 결합하여, GH-반응성 유전자의 발현을 작동시킨다. 본 발명에 활용된 GH 생물학적 활성 분석에서 이런 경로의 모든 단계는 기능적이어야 한다. 표 7D에서 일부 변이체, 예를 들면 Q22R, K41R, W86R, S108R이 JAK/STAT 신호 전달 경로를 활성화시키는 능력의 급격한 감소와 연관한다는 것을 알 수 있다. 변이체 E30G(69번 환자)는 JAK/STAT 신호 전달 경로를 활성화시키는 능력을 현저하게 강화시키고, 따라서 초-작용물질로 작용한다(도 8에 도시된 데이터, 여기서 RLU는 상대적 발광 단위를 의미한다).
표 7D: GH 변이체의 신호 전달 활성의 분석
루시페라제 리포터 유전자 분석에서 결과는 1nM 용량에서 야생형과 비교하여 활성%로 표시한다(1nM = 상기 분석에서 야생형 GH의 대략 ED50).
p는 관찰된 결과와 야생형에서 나타나는 결과간의 차이가 유의할 가능성을 표시한다. NS는 '유의하지 않음'을 표시한다.
4명의 관련없는 환자에서 한 개의 미스센스 돌연변이(Lys41Arg)가 확인되었는데, 이들중 3명은 상이한 일배체형 배경을 보였다. 이는 상기 부위에서 재발성돌연변이(즉, 독립된 돌연변이 현상)와 일치한다. -1 위치 돌연변이에서 IVS2 G →A 변이는 8명의 관련없는 환자에서 총 8개의 대립유전자에서 발견되었다; 2개의 분명한 일배체형이 나타나기 때문에, 이런 병변의 적어도 2가지 실례는 재발성일 가능성이 높고 나머지는 계통적으로 동일(identical-by-descent)할 수 있다. 프로모터 유전자 전환 현상의 3가지 실례가 이들 시료에서 확인되었다. 다양한 다른 병변의 다양한 실례는 [A →G -177(3), A →G -248(2), Leu11Pro(4), Ser108Arg(2), Lys168Glu(2), Phe176Ser(2), Leu163Pro(2)]이다. 전체적으로, 10가지의 재발성 돌연변이는 환자 시료에서 발견되는 변이 대립유전자의 32/75(43%)에 상응한다. 이는GH1유전자에서 빈번한 병리학적 병변의 신속한 탐지의 측면에서 고무적이다.
(b) 프로모터 일배체형
본 임상연구에서,GH1유전자 프로모터에서 공지된 다형성 뉴클레오티드의 15/17은 변하는 것으로 밝혀졌다. 이들 15개 뉴클레오티드 위치에서 변이는 환자 및 대조군(157명의 영국군 백인 신병)에서 총 40개의 상이한 일배체형에 따른 것이다. 이들 일배체형은 0.339(일배체형 1)에서 0.0033(일배체형 25-36), 0(일배체형 37-40)까지 발생 빈도(표 7F)가 상이하고, 이들이 환자에서는 발견되지만 대조군 개체군에서는 발견되지 않는다는 점에서 환자-특이적이다.
이들 프로모터 일배체형은 리포터 유전자 분석에서 루시페라제 유전자 발현을 작동시키는 능력의 측면에서 상이한 것으로 밝혀졌다. 지금까지, 40개중 27개의 일배체형이 쥐 뇌하수체 GH3 세포에서 조사되었다. 각 일배체형에 대하여, 3가지 상이한 실험에서 6번의 복제를 실시한다(즉, 총 18번의 복제). 현저하게 감소된 수준[가장 일반적인 일배체형(No. 1)의 <62%]의 루시페라제 리포터 유전자 발현(따라서, 생체내에서 감소된 수준의 GH1 유전자 발현)과 관련된 일배체형 및 환자와 대조군 개체군에서 각각의 발생 빈도는 표 7E에 기재한다.
이들 발견은 정상 개체군에서 환자의 ~15%가 가장 일반적인 일배체형의 보유와 관련된 GH 합성 수준보다 >40% 더 낮은 GH 합성 수준과 연관하는(적어도 시험관내에서) GH1 프로모터 일배체형에 대하여 이형접합성임을 시사한다. 게다가, 정상 개체군의 대략 20%는 2종류의 저발현 일배체형(동일한 또는 상이한)을 보유하고, 이의 결과로 평균보다 현저하게 낮은 GH 수준을 보일 수 있다. 시험관내 연구가 이런 주장을 뒷받침한다면, 진단적 스크리닝 전략에는 돌연변이 탐색 및 프로모터 일배체형 결정이 통합될 수 있다.
표 7E: 프로모터 일배체형; 루시페라제 리포터 유전자 분석에서 측정된 이들의 빈도와 상대적 강도
일배체형루시페라제 활성 ±SEM일배체형의 빈도(%)
대조군 환자
1100 ±1833.926.4
359 ±159.28.5
557 ±134.35.4
1061 ±182.00.0
2328 ±151.00.0
2655 ±260.30.8
29 62 ±150.30.0
표 7F: 본 임상연구동안GH1조절 유전자에서 발견된 상이한 프로모터 일배체형의 요약
제시된 발생 빈도는 대조군(157명의 영국군 백인 신병) 개체군으로부터 추론한다.
(c) 프로모터 돌연변이
다양한 신규한 프로모터 변이체(8개의 단일 염기쌍 치환, 2개의 마이크로결실, 광범위한 유전자 전환)가 환자 개체군에서 탐지되었다. 이들 병변의 확실성은 (i) 건강한 대조군에서GH1프로모터 영역을 조사하고, (ii) 상이한 포유동물 종에서 영향을 받는 뉴클레오티드의 진화적 보존 정도를 조사하고, (iii) 루시페라제 리포터 유전자 분석으로 시험관내에서GH1프로모터 기능에 대한 이들의 효과를 측정하여 증거하였다.
(i) 대조군에서 GH1 프로모터 변이체
GH1 프로모터 영역은 157명의 영국 백인 대조군에서 돌연변이를 스크리닝하였다. 환자 시료에서 발견된 돌연변이에 상응하는 유일한 서열 변화는 2명의 환자에서 발견된 -48에서 G →A 변이이었다. 대조군 시료에 특이적인 3개의 추가적인 치환은 단일 환자에서 발견되었다(+62 A →G, -123 T →C, -373 G →A). 최종적으로, 대조군 시료에 특이적인 유전자 전환(최소 -57 내지 -31, 최대 -168 내지 -6)은 1명의 환자에서 확인되었다. 따라서, 환자에서보다 대조군에서 탐지되는 변화가 훨씬 적은데, 이런 발견 결과는 환자 돌연변이의 병리학적 유의성과 일치한다.
(ii) 진화적 보존
GH1 유전자의 전사 개시 위치의 130bp 상류에 해당하는 DNA 서열은 10종류의 포유동물 종으로부터 구할 수 있었다. 확인이 가능한 경우에, 환자에서 돌연변이되는 뉴클레오티드는 7/10 경우에 진화적으로 보존되었다(+31 T →C, -18 C →T, -24 A →G, -30 T →C, △5G -57 내지 -61, △G -57 내지 -61, -108 C →T). 이런 발견 결과는 환자 개체군에서 돌연변이되는 뉴클레오티드의 기능적 중요성과 일치한다.
(iii) GH1 프로모터 돌연변이의 루시페라제 리포터 유전자 분석
리포터 유전자 분석에서 다양한 추정 프로모터 돌연변이는 루시페라제 유전자 발현을 작동시키는 능력의 측면에서 비교하였다(표 7G). 각 일배체형에 대하여, 쥐 뇌하수체 GH3 세포와 사람 HeLa 세포에서 3가지 상이한 실험동안 6번의 복제를 실시한다(즉, 총 18번의 복제). 정상보다 현저하게 감소된 발현 수준은 HeLa 세포에서 T →C -30 변이 및 △5G -57 내지 -61 결실에서 확인되었다(이런 경향은 GH3 세포에서도 관찰된다). 따라서, 리포터 유전자 발현 분석은 이들 두 병변의 병리학적 관여를 뒷받침한다.
표 7G: 추정 프로모터 돌연변이 v 리포터 유전자 발현
프로모터 돌연변이 관련된일배체형 정규화된 루시페라제 활성 정규화된 일배체형±SEM
GH3 HeLa
A →G -248 1 115 ±16 105 ±18
T →C -495 1 127 ±11 106 ±15
A →G -177 1 98 ±13 166 ±10
T →C -30(TATA) 1 86 ±16 57 ±19
A →G -24 1 117 ±19 113 ±13
C →T -347, A →G -44 1 166 ±20 144 ±12
A →G +62 1 130 ±10 112 ±15
G →A -48, A →G -498 2 90 ±16 107 ±18
T →C -508 2 117 ±17 99 ±11
△GGGGG -57 내지 -61 2 91 ±16 48 ±14
△G -57 2 106 ±19 96 ±16
(d) mRNA 접합에 영향을 주는 돌연변이
접합 부위에서 2개의 새로운 변이체가 확인되었는데, 하나는 엑손 3의 공여 접합 부위에서 T →C 변이이고, 다른 변이체는 엑손 2 수용 접합 부위의 필수 AG 디뉴클레오티드에서 공통적인 단일 염기쌍 치환이다. 후자 돌연변이는 시험관내 접합 분석으로 추가로 특성화하였다; 이런 돌연변이의 병원성은 분석 조건하에 상기 돌연변이가GH1mRNA 전사체로부터 엑손 3의 "빠뜨림"(배제)을 초래한다는 관찰 결과로부터 증거된다.
(e) 사람GH1유전자에서 다형성
본 임상연구동안 GH1 유전자의 엑손, 인트론, 3' 비번역 영역(3'UTR)에서 대략 71개의 상이한 추정 다형성이 확인되었다. 대부분은 1회 미만의 변이체이다. Hasegawa et al(ibid)에 의해 보고된 IVS4 T →A 1169를 제외하고 모두 알려지지 않은 것이다. IVS1-4는 인트론 부위를 표시한다.
(f) 좌위 조절 영역 다형성
좌위 조절 영역에서 총 11개의 추정 다형성이 발견되었다. 이들은 154 G →A, 154 G →C, 457 G →A, 505 G →T, 507 T →G, 661 C →T, 1055 C →T, 1429 C →G, 1568 T →G, 1615-1620 △GGTGGT, 1934 T →C이다. 번호지정은 도 4에서 도시된 참고 서열을 따른다. 종합하면, 환자와 대조군간 대립유전자 발생 빈도에서 현저한 차이는 없었다. 하지만, 505 G →T, 1055 C →T, 1934 T →C 치환은 환자-특이적이고, 따라서 이들 개체에서GH1유전자의 발현에 영향을 줄 수 있다.

Claims (44)

  1. 개체에서 GH 기능이상의 지표로서 효과적인GH1에서 변이를 탐지하는 탐지 방법에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 탐지 방법:
    (a) 개체로부터 유래된 사람GH1유전자의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
    (b) 검사 시료로부터 수득된 서열과 사람GH1유전자의 공지된 표준 서열을 비교하고, 여기서 검사 시료 서열과 표준 서열간의 차이는 GH 기능이상의 지표로 효과적인 변이(이후, "GH1변이체")의 존재를 시사하고, 검사 시료는 다음과 같은 기준을 보이는 개체로부터 수득된다:
    (i) 표준 신장 차트[Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762(1970)]로 플랏되는 경우 개체 부모의 신장에 기초한 개체의 예상 표적 성인 신장 범위를 벗어나는 개체의 성인 신장을 예시하는 성장 패턴[일련의 신장 측정값으로 기술됨; Brook CDG(Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141(1995, Blackwell Science)]으로 정의된 성장 부진.
  2. 제 1 항에 있어서, 검사 시료는 다음과 같은 추가적인 기준중 적어도 한가지를 보이는 개체로부터 수득하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법:
    (ii) 연령에 대하여 25 백분위수 미만의 신장 속도;
    (iii) 역연령(chronological age)과 비교하여 Tanner-Whitehouse 스케일에따른 적어도 2년간의 골연령 지체; 또는
    (iv) 상기 기준 (i) 내지 (iii)에서 포함되지 않은 임의의 다른 질환.
  3. 제 2 항에 있어서, 골연령 지체는 역연령과 비교하여 2년 내지 4년인 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
  4. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 개체는 기준 성장 호르몬 기능 검사에서 정상적인 결과를 보이는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
  5. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 개체의GH1유전자의 서열을 측정하기 위한 임의의 서열분석 방법을 포함하는 특징으로 하는 탐지 방법.
  6. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열이 GH 클러스터에서 다른 4가지의 파라로거스(비-GH1) 유전자에서 발견되지 않는GH1유전자에 독특한GH1유전자-특이적 단편 및 (b) GH 클러스터에서 다른 4가지의 파라로거스(비-GH1) 유전자에서 상동성 측면 영역에 결합할 수 없는 하나 또는 복수의GH1유전자-특이적 프라이머를 이용하여 개체의GH1유전자를 PCR 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
  7. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 탐지 방법은 개체의 전체GH1유전자의PCR 증폭 및 개체의GH1유전자의 중복 구성 단편의 이중 PCR을 포함하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
  8. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서,GH1유전자의 좌위 조절 영역에 걸쳐있는 게놈 DNA의 전체 또는 단편의 PCR 증폭을 포함하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
  9. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, DHPLC에 의한 개체의GH1유전자의 전체 또는 단편의 돌연변이 스크리닝을 포함하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
  10. 개체에서 GH 기능이상의 지표로서 효과적인GH1에서 변이를 탐지하는 탐지 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 탐지 방법:
    (a) 개체로부터 유래된 사람GH1유전자의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
    (b) 검사 시료로부터 수득된 서열과 사람GH1유전자의 공지된 표준 서열을 비교하고, 여기서 검사 시료 서열과 표준 서열간의 차이는 GH 기능이상의 지표로 효과적인 변이(이후, "GH1변이체")의 존재를 시사하고,
    (c) (i) 서열이 GH 클러스터에서 다른 4가지의 파라로거스(비-GH1) 유전자에서 발견되지 않는GH1유전자에 독특한GH1유전자-특이적 단편 및 (ii) GH 클러스터에서 다른 4가지의 파라로거스(비-GH1) 유전자에서 상동성 측면 영역에 결합할 수 없는 하나 또는 복수의GH1유전자-특이적 프라이머를 이용하여 개체의GH1유전자를 PCR 증폭한다.
  11. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 다음에서 선택되는 하나 또는 복수의 프라이머를 추가로 사용하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법:
    CTC CGC GTT CAG GTT GGC(GH1DF);
    AGG TGA GCT GTC CAC AGG(GH1DR);
    GGG CAA CAG TGG GAG AGA AG(GH2DF);
    CCT CCA GGG ACC AGG AGC(GH2DR);
    CAT GTA AGC CCA GTA TTT GGC C(GH3DF);
    CTG AGC TCC TTA GTC TCC TCC TCT(GH3DR);
    GAC TTT CCC CCG CTG GGA AA(GH4DF);
    GGA GAA GGC ATC CAC TCA CGG(GH4DR);
    TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC(GH5DF);
    GTG TTT CTC TAA CAC AGC TCT C(GH5DR);
    TCC CCA ATC CTG GAG CCC CAC TGA(GH6DF);
    CGT AGT TCT TGA GTA GTG CGT CAT CG(GH6DR);
    TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC G(GHD7F);
    CTT GCT TCC CGA ATA GAC CCC G(GH7DR);
    GTGCCCCAAGCCTTTCCC(LCR15: 1159-1177);
    TGTCAGATGTTCAGTTCATGG(LCR13: 1391-1412);
    CCTCAAGCTGACCTCAGG(LCR25: 1346-1363);
    GATCTTGGCCTAGGCCTCG(LCR23: 1584-1602);
    LCR 5A(5' CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3');
    LCR 3.0(5' CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3');
    LCR 5.0(5' CCTGTCACCTGAGGATGGG 3');
    LCR 3.1(5' TGTGTTGCCTGGACCCTG 3');
    LCR 3.2(5' CAGGAGGCCTCACAAGCC 3');
    LCR 3.3(5' ATGCATCAGGGCAATCGC 3');
    GH1G5(5' GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3');
    GH1G3(5' CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3');
    BGH3(5' TAGAAGGCACAGTCGAGG 3');
    GH1R5(5' ATGGCTACAGGCTCCCGG 3');
    GH1R3(5' CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3').
  12. GH1과 상이하고 전술한 항중 어느 한 항에 따른 방법으로 탐지되거나 탐지가능하지만 절대 신장에 기초한 개체 선별 기준에 따른 방법과 같은 기존의 방법으로는 탐지되지 않는 것을 특징으로 하는GH1변이체.
  13. 도 7B "성장 호르몬 결핍:GH1유전자 돌연변이와 다형성"에서 제시된 아직 공개되지 않은 것을 특징으로 하는GH1변이체.
  14. 미스센스 돌연변이를 포함하는 전술한 항중 어느 한 항에 따른GH1변이체.
  15. 단일 펩티드의 활성에 영향을 주는 침묵 돌연변이를 포함하는 전술한 항중 어느 한 항에 따른GH1변이체.
  16. 하나 또는 복수의 다음의GH1프로모터 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는GH1변이체:
    프로모터 돌연변이 관련된 일배체형(haplotype) A →G -248 1 T →C -495 1 A →G -177 1 T →C -30(TATA) 1 A →G -24 1 C →T -347, A →G -44 1 A →G +62 1 G →A -48, A →G -498 2 T →C -508 2 △GGGGG -57 내지 -61 2 △G -57 2
  17. 제 12 항 내지 16 항중 어느 한 항에 따른GH1변이체에 의해 인코드되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 아미노산.
  18. 야생형/GH와 관련하여 변형이 다음의 아미노산 치환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사람 GH 변이체:
    Mer →Val -26; Thr →Ala -20; Leu →Pro -12; Leu →Pro -11; Phe →Leu 1; Ile →Val 4; Asp →Asn 11; Gln →Arg 22; Asp →Val 26; Glu →Gly 30; Lys →Arg 41; Ser →Leu 43; Glu →Gly 56; Arg →Gly 64; Ser →Phe 71; Glu →Lys 74; Ser →pro 85; Trp →Arg 86; Gln →Leu 91; Asp →Gly 107; Ser →Cys 108; Ser →Arg 108; Val →Ile 110; Tyr →His 143; Ala →Val 155; Leu →Pro 163; Lys →Pro 163; Lys →Arg 168; Lys →Glu 168; Thr →Ala 175; Phe →Ser 176.
  19. 야생형 hGH와 관련하여 정의된 바와 같이
    Ile4Val:(부위 2에서 N-말단);
    Gln22Arg:(나선 1);
    Lys41Arg:(루프 1);
    Glu56Gly:(나선 1과 2간의 루프 영역, 결합 부위 1의 일부)
    Arg64Gly:(루프 2)
    Lys168Arg:(나선 4)
    Lys168Glu와 Thr175Ala(나선 4)중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사람 GH 변이체(둥근 괄호는 hGH에서 좌위).
  20. 야생형 hGH와 관련하여 아미노산 치환: Glu →Gly 30[도 7]을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 GH 변이체.
  21. GH 기능이상이 의심되는 개체를 스크리닝하는 스크리닝 방법에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법:
    (a) 개체로부터 유래된 사람GH1유전자의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
    (b) 검사 시료로부터 수득된 서열과 사전결정된 서열의 상응하는 서열을 비교하고, 여기서 사전결정된 서열은 본 발명의 전술한 방법에 따라 탐지가능한GH1변이체로부터 선별된다.
  22. 제 21 항에 있어서, 검사 시료는 게놈 DNA로 구성되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  23. GH 기능이상이 의심되는 개체를 스크리닝하는 스크리닝 방법에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법:
    (a) 개체로부터 유래된 사람 GH1 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 의해 인코드되는 아미노산 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
    (b)GH1변이체나 GH 변이체의 존재 또는GH1변이체나 GH 변이체의 존재를 표시하거나 이와 관련된 하나 또는 복수의 대체 표적의 존재에 대하여 검사 시료를 분석하고, 여기서GH1변이체나 GH 변이체는 야생형 hGH 서열과 비교하여 적어도 한 개의 변이를 보유하고 다음의 기준을 보이는 개체로부터 유래된 제 2 검사 시료로부터 수득가능하다:
    (i) 표준 신장 차트[Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762(1970)]로 플랏되는 경우 개체 부모의 신장에 기초한 개체의 예상 표적 성인 신장 범위를 벗어나는 개체의 성인 신장을 예시하는 성장 패턴[일련의 신장 측정값으로 기술됨; Brook CDG(Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141(1995, Blackwell Science)]으로 정의된 성장 부진.
  24. 제 21 항 내지 23 항중 어느 한 항에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법:
    (a) 개체로부터 제 1 검사 시료를 수득하고;
    (b) 제 1 검사 시료에서GH1유전자나GH1전사체 또는 이들의 단편(예, cDNA)을 다음과 같은 기준을 보이는 개체로부터 유래된 제 2 검사 시료로부터 수득가능한GH1변이체의 상응하는 유전자, 전사체 또는 단편과 비교한다:
    (i) 표준 신장 차트[Tanner et al Arch Dis Child 45 755-762(1970)]로 플랏되는 경우 개체 부모의 신장에 기초한 개체의 예상 표적 성인 신장 범위를 벗어나는 개체의 성인 신장을 예시하는 성장 패턴[일련의 신장 측정값으로 기술됨; Brook CDG(Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3rd Ed, Chapter 9, p141(1995, Blackwell Science)]으로 정의된 성장 부진.
  25. 제 24 항에 있어서, 제 2 검사 시료는 다음의 추가적인 기준중 적어도 한가지를 보이는 개체로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법:
    (ii) 연령에 대하여 25 백분위수 미만의 신장 속도;
    (iii) 역연령과 비교하여 Tanner-Whitehouse 스케일에 따른 적어도 2년간의 골연령 지체; 또는
    (iv) 상기 기준 (i) 내지 (iii)에서 포함되지 않은 임의의 다른 질환
  26. 제 21 항 내지 25 항중 어느 한 항에 있어서, 동시 스크리닝은 고형 지지체에 고정된 돌연변이-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브의 마이크로-어레이에 대한 라벨된 DNA 시료(개체로부터 유래된 cDNA 또는 게놈 DNA)의 혼성화로 다중의 공지된 돌연변이 또는 모든 가능한 돌연변이에 활용되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 칩 기술을 활용하고, 상기 칩은 소형 병렬 분석 장치인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  28. 제 21 항 내지 27 항에 따른 스크리닝 방법을 실행하는데 사용하기 적합한 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 키트:
    (a) 상응하는 야생형 hGH 유전자 서열로부터 적어도 한가지의 변이를 포함하는GH1변이체 영역에 상응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    (b) (a)에 특정된 영역에서 야생형 hGH 유전자 서열에 상응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    (c) 개체 DNA의 소요 영역을 증폭하기 위한 PCR을 실시하는데 적합한 하나 또는 복수의 시약.
  29. 제 28 항에 있어서, GH1 변이체에는 제 12 항 내지 16 항에 청구된 변이체중 적어도 한가지가 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  30. 제 28 항 또는 29 항에 있어서, 키트 구성성분에는 고형 지지체에 고정된 복수의 올리고뉴클레오티드가 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  31. 탐지 방법을 실행하는데 사용하기 적합한 키트에 있어서, 변이체에는 제 12 항 내지 16항에 청구된 변이체중 적어도 한가지가 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  32. GH 기능이상이 의심되는 개체를 스크리닝하는 스크리닝 방법에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법:
    개체의 사람GH1유전자에 의해 인코드되는 아미노산 서열로 구성되는 검사 시료를 수득하고;
    (b) GH 변이체에 대하여 상기 검사 시료를 분석하고;
    여기서, GH 변이체는 제 17 항 내지 20 항중 어느 한 항에 따른 변이체로부터 선택된다.
  33. 제 32 항에 있어서, 분석 단계(b)는 통상적인 단백질 서열분석 방법(질량 분석법, 마이크로-어레이 분석, 피로시퀀싱 등) 또는 항체-기초한 탐지 방법(예, EISA)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  34. 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된, 정제된 또는 재조합 핵산:
    (a) 제 12 항 내지 16 항중 어느 한 항에 따른GH1변이체로 구성되는 또는 제 17 항 내지 20 항중 어느 한 항에 따른 GH 변이체를 인코드하는 핵산 서열;
    (b) (a) 서열과 실질적으로 상동한 또는 엄격한 조건하에 (a) 서열과 혼성화되는 서열;
    (c) 유전자 코드의 축중성을 제외하고 실질적으로 상동한 또는 엄격한 조건하에 (a)와 (b) 서열과 혼성화되는 서열;
    (d) (a), (b) 또는 (c) 서열중 임의 한가지에 특이적인 올리고뉴클레오티드.
  35. 제 34 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  36. 박테리아 숙주 세포와 같은 제 35 항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  37. 제 12 항 내지 16 항에 따른GH1변이체를 제조하는 공정에 있어서, 다음과같이 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 제 36항에 따른 숙주 세포를 배양하고;
    (ii) 숙주 세포에 의해 만들어진GH1변이체를 배양 배지로부터 회수한다.
  38. 제 34 항 내지 37 항중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 배양 배지에서 서열, 벡터 또는 세포에 의해 인코드되거나 또는 발현되는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
  39. 제 12 항 내지 16 항 또는 17 항 내지 20 항중 어느 한 항에 따른GH1변이체 또는 GH 변이체 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 치료, 진단 또는 탐지 방법에 사용되는 제 12 항 내지 16 항 또는 17 항 내지 20 항중 어느 한 항에 따른GH1변이체 또는 GH 변이체의 용도.
  41. 제 40 항에 있어서, 결합 결함을 측정하고; 뇌하수체 저장 결함을 측정하고; 당뇨, 비만 또는 감염과 같은 질병에 대한 감수성을 결정하고; 최유성, 당뇨병유발성, 지질분해성, 단백질 동화 효과와 관련된 거인증이나 말단 거대증, 나트륨과 수분 저류에 기인한 이상, 대사 증상, 수면 장애를 치료하고; 또는 GH 기능이상을 진단하는데 사용되는 것을 특징으로GH1변이체 또는 GH 변이체의 용도.
  42. 제 40 항에 있어서, 유전자 요법에 사용되는 제 12 항 내지 16 항중 어느 한 항에 따른 하나 또는 복수 변이체의 용도.
  43. 제 40 항에 있어서, 단백질 요법에 사용되는 제 17 항 내지 20 항중 어느 한 항에 따른 하나 또는 복수 변이체의 용도.
  44. 약물, 진단 조성물이나 키트, 또는 진단 키트의 제조에 사용되는 제 12 항 내지 16 항 또는 17 항 내지 20 항중 어느 한 항에 따른GH1변이체 또는 GH 변이체의 용도.
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