KR20020067508A - 암 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양의 체료를 필요로 하는 대상에게 EGR(Early growth response factor; 초기 성장반응 인자)의 유도를 억제하는 제제, EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 종양의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 혈관형성을 억제하는 제제의 선별 방법에 관한 것이다.

Description

암 치료 {TREATMENT OF CANCER}

암

암은 1998년 한 해에만 미국에서 50만명이 넘는 사람들을 사망으로 몰고 갔으며, 이는 전체 사망자 수의 대략 23%에 해당한다(Landis 외, 1998). 여전히 암보다 더 많은 사망자의 사망원인은 심혈관 질화뿐이다(Cotran 외, 1999).

세포 성장의 기초가 되는 세포 및 분자 메커니즘에는 종양 증식 및 이동 이상의 것이 내포되는 증거가 늘고 있다. 중요한 것은 종양 성장 및 전이는 결정적으로 새로운 혈관 형성 과정인 진행중의 혈관형성에 따라 좌우된다는 것이다(Crydtal, 1990). 혈관형성(혈관신생이라고도 알려짐)은 기존의 혈관으로부터 발생하여 성장하는 종양에 생명 유지에 필요한 영양분을 공급하는 미세혈관의 성장하는 네트워크를 형성하는 혈관 내피세포의 이동 및 증식에 의해 매개된다. 원발성 고형 종양은 능동적인 혈관형성 없이는 1-2 mm 직경 이상으로 성장할 수 없다(Harris, 1998).

인간 HepG2 간세포 암종 세포는 항-신생 약물의 평가를 위한 모델 암세포주로서 사용되어 왔다(Yang 외, 1997). 이들 세포는 기본적으로 유도적으로 직접적인-초기 유전자 및 전사 조절인자인 초기 성장반응 인자-1(EGR-1)을 발현시킨다(Kosaki 되, 1995).

초기 성장반응 단백질(EGR-1)

초기 성장 반응 인자-1(EGR-1; Egr-1, NGFI-A, zif268, krox24 및 TIS8이라고도 알려짐)은 전사 조절인자의 아연 핑거(zinc finger) 부류의 원형(prototypical) 일원 및 직접적인-초기 유전자의 산물이다(Gashler 외, 1995). Egr-1은 아테롬성 동맥경화증 및 재발 협착증의 발병과 연관된 광범위한 유전자의 프로모터에 결합한다. 이들은 혈소판-유래의 성장인자(PDGF) A사슬(Khachigian 외, 1995), PDGF-B(Khachigian 외, 1996), 형질전환 성장인자-β₁(Liu 외, 1996, 1998), 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2)(Hu 외, 1994; Biesiada 외, 1996), 막형 1 매트릭스 금속 단백질 분해효소(membrane type 1 matrix metalloproteinase)(Hass 외, 1999), 조직 인자(Cui 외, 1996) 및 세포내 부착 분자-1(Malzman 외, 1996)을 포함한다. EGR-1은 인간 아테롬성 경화증 병반 내의 내생 세포 및 평활근 세포로 편재되어 있었다(McCaffrey 외, 2000). 서열-특이성 촉매 DNA를 이용한 Egr-1 또한 유전자 유도의 억제는 풍선 혈관성형술 후 래트 경동맥 내에서 내막이 두꺼워지는 것을 억제한다(Santiago 외, 1999a).

DNA자임

인간 유전자의 치료에 있어, 안티센스 핵산법은 발현에 의해 질병을 초래하기 때문에 바람직하지 못한 유전자를 불활성화시키기 위한 중요한 선택 수단 중 하나이다. 안티센스 방법은 바람직하지 못한 유전자를 코딩하는 mRNA 분자와 상보적이고, 따라서 mRNA 분자와 혼성화하는 핵산 분자를 사용한다. 이러한 혼성화는 유전자 발현을 억제한다.

안티센스 방법에는 몇 가지 결점이 있다. 안티센스 혼성화는 DNA/표적 mRNA의 이종 2중쇄(heteroduplex)를 형성시킨다. 이러한 이종 2중쇄는 RNA 분해효소(RNAse) H에 의해 매개되는 표적 mRNA 성분의 분해에 대한 기질로서 제공된다. 여기서, DNA 안티센스 분자는 단지 내생의 RNA 분해효소 H에 의해 요구되는 절단을 용이하게 하는 수동 방식으로 제공된다. RNA 분해효소 H에 대한 이러한 의존성은 그들의 화학적 특성과 관련된 안티센스 분자의 설계 및 그들의 표적 mRNA와 함께 안정된 이종 2중쇄를 형성하는 능력을 제한한다. 또한, 안티센스 DNA 분자는 비특이적 활성 및 심지어 고농도에서는 독성과 관련된 문제를 안고 있다. 표적 mRNA 발현의 안티센스 억제의 대안적인 메커니즘의 예는 mRNA를 따라 전사 기구의 이동을 입체적으로 억제하는 것이다.

안티센스 분자에 대한 대안으로서, 촉매성 핵산 분자가 유전자 발현을 억제하기 위한 치료제로서의 장래성을 보여주고 있으며, 이는 다양한 문헌에 제시되어 있다(Haseloff, 1988; Breaker, 1994; Koizumi, 1989; Otsuka; Kashani-Sabet, 1992; Raillard(1996); Raillard, 1996; 및 Carmi, 1991). 따라서, 종래의 안티센스 분자와는 달리, 촉매성 핵산 분자는 단순히 그들의 표적 mRNA 분자에 결합하는 대신, 실제로 그들의 표적 mRNA 분자를 절단하는 작용을 한다. 촉매성 핵산 분자는 표적 서열이 최소한의 몇 가지 요구조건을 충족하는 경우에만 표적 핵산 서열을절단할 수 있다. 표적 서열은 촉매성 핵산의 혼성화 부위와 상보적이어야 하고, 표적은 절단 자리에 특정 서열을 함유해야 한다.

촉매성 RNA 분자("리보자임")는 상세히 보고되어 있으며(Haseloff, 1988; Symonds, 1992; 및 Sun, 1997), RNA 분자(Haseloff, 1988)와 DNA 분자(Raillard, 1996) 모두를 절단할 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 실제로, 시험관내 선별법 및 전개법의 개발은 개시점으로서 공지된 리보자임의 무작위 변이체 또는 무작위 서열의 RNA를 사용함으로써 공지된 기질에 대한 신규한 리보자임의 획득을 가능하게 하였다(Pan, 1992; Tsang, 1994; 및 Breaker, 1994).

그러나, 리보자임은 그들의 기능을 수행하고자 하는 세포 내에서 효소적 가수분해에 대하여 감수성이 매우 크고, 이는 그들의 제약학적 용도를 제한한다.

최근, 소위 "DNA자임"이라 불리는 새로운 부류의 촉매성 분자가 창출되었다(Breaker 및 Joyce, 1995; Santoro, 1997). DNA자임은 단일 가닥으로서, RNA 분자(Breaker, 1994; Santoro, 1997)와 DNA 분자(Carmi, 1996) 모두를 절단한다. DNA자임에 대한 일반적인 모델이 제안되었으며, 이는 "10-23" 모델이라 알려져 있다. 간단히 "10-23 DNA자임"이라 일컬어지기도 하는 "10-23" 모델 다음의 DNA자임은 측면에 각각 7개 내지 9개의 데옥시리보뉴클레오타이드로 이루어진 2개의 기질 인식 도메인이 결합된 15개의 데옥시리보뉴클레오타이드로 이루어지는 촉매 도메인을 갖는다. 시험관내 분석 결과, 이러한 유형의 DNA자임이 생리 조건 하에서 퓨린:피리미딘 접합점에서 그들의 기질 RNA를 효과적으로 절단할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Santoro, 1997).

DNA자임은 치료제로서의 가능성을 보여준다. 그러나, 공지된 mRNA 분자의 존재에 의해 유발되는 질환에 대한 DNA자임의 성과는 예측 불가능하다. 이러한 예측 불가능성은 부분적으로 두 가지 인자에서 기인한다. 첫째, 몇몇 mRNA의 2차 구조는 그들의 표적 mRNA에 결합하여 그 mRNA 분자를 절단하는 DNA자임의 능력을 저해할 수 있다. 둘째, 표적 mRNA를 발현하는 세포에 의한 DNA자임의 흡수가 치료상 유의한 결과를 허용할 정도로 충분하지 않을 수 있다.

본 발명은 암 치료용 조성물 및 암 치료 방법에 관한 것이다.

도 1:인슐린은 혈관 내피세포에서 Egr-1 의존성 유전자 발현을 자극한다. FuGENE6를 이용하여 pEBS1³foscat을 미리 트랜스펙션시킨 성장-정지된 소의 대동맥 내피세포를 세포 용균물을 제조하기 전에 24시간 동안 지정된 바와 같이 D-글루코스(5-30 mM), 인슐린(100 nM) 또는 FGF-2(25 ng/㎖)와 함께 배양하였다. CAT 활성을 용균물 중의 단백질의 농도로 표준화하였다.

도 2:대동맥 내피세포에서 인슐린에 의해 유도되는 DNA 합성은 Egr-1을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의하여 차단된다.

A. 인슐린은 DNA 합성을 자극한다. 성장-정지된 내피세포를 인슐린(100 nM 또는 500 nM) 또는 FBS(2.5%)와 함께 18시간 동안 배양한 뒤,³H-티미딘를 추가하여 6시간 동안 배양하였다.

B. 안티센스 Egr-1 올리고뉴클레오타이드는 인슐린-유도성 DNA 합성을 억제한다. 내피세포를 0.8 μM의 AS2, AS2C 또는 E3 중 하나와 함께 배양한 뒤, 18시간 동안 인슐린(500 nM 또는 1000 nM)에 노출시키고³H-티미딘를 추가하여 6시간 동안 배양하였다.

C. 인슐린-유도성 DNA 합성의 용량-의존성 억제. 인슐린(500 nM)에 의해 자극된 DNA 합성을 0.4 μM 또는0.8 μM의 AS2 또는 AS2C와 함께 배양한 내피세포에서 평가하였다. β-섬광 계수기를 이용하여 DNA로의 TCA-침전성³H-티미딘 혼입을 평가하였다.

도 3:배양된 대동맥 내피 세포 내에서의 인슐린-유도성 DNA 합성은 MEK/ERK-의존성이다. 성장이 정지된 내피세포를 PD98059(10 μM 또는 30 μM), SD202190(100 nM 또는 500 nM) 또는 워트마닌(300 nM 또는 1000 nM) 중 하나와 함께 2시간 동안 사전 배양한 뒤, 인슐린(500 nM)을 첨가하여 18시간 동안 배양하고³H-티미딘을 부가하였다. β-섬광 계수기를 이용하여 DNA로의 TCA-침전성³H-티미딘 혼입을 평가하였다.

도 4:내피 손상 후 상처 치유는 인슐린에 의하여 Egr-1 의존적 방식으로 강화된다. 다양한 그룹에서 손상 후 3일 뒤에 노출된 영역의 세포군을 정량하고 히스토다이아그램으로 나타내었다.

도 5:인간 미세혈관 내피세포 증식은 인간 EGR-1을 표적화하는 DNA 효소에 의해 억제된다. SV40-형질전환 HMEC-1 세포를 EGF(10 ng/㎖) 및 하이드로코르티손(1 ㎍/㎖) 보강물 및 10% FBS를 함유하는 MCDB 131 배지에서 배양하였다. 보강물을 함유하지 않는 무혈청 배지에서 48시간 배양한 뒤, 세포에 DNA 효소(0.4 μM)를 트랜스펙션시키고, 배지를 교체하고 72시간 뒤에 다시 트랜스펙션시키고 10% 혈청을 첨가하였다. 혈청을 첨가하고 24시간 후에 Coulter 계수기를 이용하여 세포를 정량하였다.

도 6:NGFI-A DNA자임(ED5), 이것의 스크램블드 대조군(ED5SCR) 및 23nt 합성 래트 기질의 서열. 번역 시작 자리는 밑줄 그어져 있다.

도 7:NGFI-A DNA자임은 혈청(FBS)에 의한 NGFI-A 단백질의 유도를 억제한다. NGFI-A, Sp1 또는 c-Fos에 대한 항체를 사용하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. 쿠마시 블루로 염색된 겔에는 레인마다 일정양의 단백질이 로딩되어 있는 것으로 나타났다. EDC의 서열은 5'-CGC CAT TAG GCT AGC TAC AAC GAC CTA GTG AT-3'(SEQ ID NO: 1)이며, 3'T는 역위되어 있다. SFM은 무혈청 배지를 의미한다.

도 8:SMC의 증식은 NGFI-A DNA자임에 의해 억제된다. 도 8a는 Coulter 계수기에 의한 총 세포 개수를 평가한 것으로서, 3일 동안 혈청 및/또는 DNA자임에 노출시킨 성장 정지된 SMC에 트립신을 처리한 뒤, 현탁물을 정량하였다. AS2의 서열은 5'-CTT GGC CGC TGC CAT-3'(SEQ ID NO: 2)이다. 도 8b는 혈청 및/또는 DNA자임에 노출시킨 후 Trypan Blue가 혼입된 세포의 비율을 나타낸 것이다. 정량하기 전, 블라인드 방식의 혈구계를 사용하여 세포를 22℃하에 0.2%(w.v)의 Trypan Blue에서 5분간 배양하여 염색하였다. 도 8c는 pup SMC 증식에 대한 ED5의 효과를 나타낸 것으로서, 혈청 및/또는 DNA자임에 3일간 노출시킨 성장-정지된 WKY12-22 세포를 재현탁하고, Coulter 계수기를 이용하여 개수를 정량하였다. 데이터는 3회씩 수행된 독립된 두 실험의 대표값이다. "*"는 대조군(FBS 단독)과 비교하여 P < 0.05(짝지어진 t-테스트)임을 의미한다.

도 9:래트의 경동맥 내에서 신생 혈관내막 형성의 NGFI-A DNA자임의 억제. 우측 심장대동맥의 영구 결찰시키고 18일 뒤에 신생 혈관내막(neointima)이 얻어졌다. DNA자임(500 ㎍) 또는 비히클 단독을 결찰 시 및 3일 후에 부정기적으로 적용하였다. 신생 혈관내막 형성의 서열-특이성 억제. 래트(그룹당 5마리) 마다 결찰 지점으로부터 250 ㎛ 간격의 5개 연속 구획의 신생 혈관내막 및 중앙 영역을 디지털 방식으로 결정하고, 그룹당 비율로 나타내었다. 평균 및 그 평균의 표준 오차를 세로좌표에 나타내었다. "*"는 짝지어지지 않은 데이터에 대한 Wilcoxen 등급 총계 테스트를 이용하여 Lig, Lig+Veh 또는 Lig+Veh+ED5SCR 그룹과 비교하여 P < 0.05 짝지어진 학생 t-테스트임을 의미한다. Lig는 결찰을 의미하고, Veh는 비히클을 의미한다.

도 10:HepG2 세포 증식은 0.75 μM의 DNA자임 DzA에 의해 억제된다. Coulter 계수기에 의한 총 세포 개수의 평가. 3일 동안 혈청 및/또는 DNA자임에노출된 성장-정지된 세포에 트립신을 처리한 뒤, 현탁물을 정량하였다. DzA의 서열은 5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO: 3)이다.

본 발명자들은 EGR-1이 혈관 내피세포의 복제 및 이동(migration)에 중요하며, EGR-1을 표적화하는 DNA를 기본으로 하는 서열-특이성 촉매 분자가 배지에서 악성 세포의 성장을 억제한다는 사실을 발견하였다. 이러한 발견은 EGR 또는 관련된 EGR 부류의 억제인자가 종양의 치료에 유용하며, 개별적인 2개의 작용 메커니즘이 관련될 수 있음을 밝혀 주었다. 특히, EGR 부류의 억제인자는 종양 세포 내에서 혈관형성에 의해 간접적으로 및/또는 EGR 부류의 차단에 의해 직접적으로 종양 성장을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 경우, "EGR"이란 용어는 EGR 부류의 일원을 의미한다. EGR 부류의 일원들은 Gashler 등에 의해 1995년에 보고되었으며, EGR-1 내지 EGR-4가 포함된다. 본 발명에서 EGR 부류의 일원은 EGR-1이 바람직하다.

따라서, 제1 양태에서 본 발명은 종양의 체료를 필요로 하는 대상에게 EGR의 유도를 억제하는 제제, EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 종양의 치료 방법을 제공한다.

제2 양태에서, 본 발명은 EGR의 유도를 억제하는 제제, EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제와 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 종양 세포의 성장 또는 증식 억제 방법을 제공한다.

제3 양태에서, 본 발명은 (ⅰ) EGR의 유도를 억제하는 제제, (ⅱ) EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 (ⅲ) EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제를 포함하거나 코딩하는 핵산 분자를 도입하여 형질전환시킨 종양 세포를 제공한다.

제4 양태에서, 본 발명은 EGR의 유발을 억제하거나, EGR의 발현을 감소시키거나, EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 능력에 대해 추정되는 제제를 테스트하는 단계를 포함하는 혈관형성 억제제의 선별 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이러한 제제는 EGR 안티센스 올리고뉴클레오타이드, EGR에 대항해 표적화되는 리보자임, EGR dsDNA에 대항해 표적화되어 EGR-1 dsDNA와 3중쇄를 형성하는 ssDNA, 그리고 EGR에 대항해 표적화되는 DNA자임으로 이루어지는 군에서 선택된다.

제1 양태에서, 본 발명은 종양의 체료를 필요로 하는 대상에게 EGR의 유도를 억제하는 제제, EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 종양의 치료 방법을 제공한다.

제1 양태의 방법에는 종양 세포 내에서 EGR 차단을 통해 종양 성장을 직접적으로 억제하고/억제하거나 혈관형성 억제를 통해 종양 성장을 간접적으로 억제하는 단계가 수반될 수 있다.

제1 양태의 바람직한 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 종양은 비제한적으로 전립선 종양, 간세포 암종, 피부 암종 및 유방암으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

당업자들은 본 발명의 방법을 달성할 수 있는 다양한 수단이 존재한다는 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, EGR은 EGR-1이다.

한 구현예에서, 상기 방법은 ssDNA 분자가 dsDNA에 결합하여 전사를 방해하는 3중 나선(3중쇄) 방법을 이용하여 EGR 유전자를 직접적으로 표적화함으로써 달성된다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 핵산 전사 유인체(decoy)를 이용하여 EGR 유전자의 전사를 억제함으로써 달성된다. 규정된 전사 인자에 대한 결합 자리를 코딩하는 부분적인 분자내 이중쇄를 형성하는 선형 서열을 설계할 수 있다. EGR 전사는 프로모터 부위에 대한 Sp1, AP1 또는 혈청 반응 인자의 결합에 따라 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 하나 이상의 이들 전사 인자의 이러한 결합을 억제하면 EGR 유전자의 전사가 억제될 것으로 여겨진다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 RNA 분해효소 H에 대한 기질로서 작용하지 않고 유전자 발현의 입체적 차단을 통해 작용하는 합성 안티센스 DNA 분자를 이용하여 EGR mRNA의 전사를 억제함으로써 달성된다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 안티센스 DNA와 mRNA 사이에서 형성되는 이종 2중쇄 내에 존재하는 EGR mRNA의 RNA 분해효소 H-매개의 분해를 지시함으로써 작용하는 합성 안티센스 DNA 분자를 이용하여 mRNA를 불안정하게 만들어 EGR mRNA의 전사를 억제함으로써 달성된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다:

(i) ACA CTT TTG TCT GCT(SEQ ID NO: 4) 및

(ⅱ) CTT GGC CGC TGC CAT(SEQ ID NO: 2).

다른 구현예에서, 상기 방법은 서열-특이성 해머헤드(hammerhead) 리보자임 및 미니자임 또는 미니-리보자임과 같은 해머헤드 리보자임의 유도체에 의한 mRNA의 절단에 의하여 EGR mRNA의 전사를 억제함으로써 달성되며, 여기서 리보자임은 다음 중에서 유래된다:

(i) 헤어핀 리보자임,

(ⅱ) 테트라하이메나 그룹 I 인트론,

(ⅲ) 간염 델타 비로이드 리보자임, 또는

(ⅳ) 뉴로스페라(neurospera) 리보자임.

당업자는 리보자임의 조성이 다음과 같이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다:

(i) 전적으로 RNA,

(ⅱ) RNA 및 DNA 염기, 또는

(ⅲ) RNA 또는 DNA 및 변형 염기, 당 및 골격.

본 발명의 범위 내에서 리보자임은 또한

(i) 전적으로 합성되거나, 또는

(ⅱ) 상기 방법 중 하나를 이용하여 환자의 세포를 재도입하기 전에 환자의 게놈으로 상동 또는 이종 삽입되거나 생체외 세포로 전달되는 바이러스-유래의 벡터인 발현 플라스미드 내에서 전달된 유전자인 합성 유전자 유래의 전사체 내에 함유될 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 안티센스 EGR-1 mRNA의 발현에 의하여 표적 DNA에 결합하는 EGR 유전자의 능력을 억제함으로써 달성된다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 전사 유인 방법을 이용하여 전사 인자로서 EGR 활성을 억제함으로써 달성된다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 GC 풍부 서열을 선호하는 약물에 의하여 그의 표적 DNA에 결합하는 EGR 유전자의 능력을 억제함으로써 달성된다. 이러한 약물로는 노갈라마이신, 헤다마이신 및 크로모마이신 A3가 포함된다(Chiang 외, J. Biol. Chem. 1996; 271: 23999).

바람직한 구현예에서, 상기 방법은 서열-특이성 DNA자임에 의한 EGR mRNA의 절단에 의해 달성된다. 다른 바람직한 구현예에서, DNA자임은 다음과 같은 도메인을 포함한다:

(ⅰ) 퓨린:피리미딘 절단 자리에서 mRNA를 절단하는 촉매 도메인;

(ⅱ) 상기 촉매 도메인의 5' 말단과 인접한 제1 결합 도메인; 및

(ⅲ) 상기 촉매 도메인의 3' 말단과 인접한 제2 결합 도메인

―여기서 결합 도메인은 DNA자임이 EGR-1 mRNA를 절단하는, SEQ ID NO: 15에나타낸 뉴클레오타이드 168-332에 해당하는 EGR-1 mRNA 부위 내의 퓨린:피리미딘 절단 자리의 바로 옆에 위치하는 두 부위와 충분히 상보적임―.

본 명세서에서 "DNA자임"은 DNA 또는 RNA 중 하나일 수 있는 별개의 표적 핵산 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 결합 도메인은 절단 자리의 바로 옆에 위치하는 부위와 상보적이다. 그러나, 당업자는 EGR mRNA에 결합하여 그 mRNA를 절단하는 DNA자임에 대해 엄격한 상보성이 요구되지 않을 수 있다는 점을 인지할 것이다.

본 발명의 범위 내에서, 결합 도메인의 길이(본 명세서에서 "아암 길이(arm length)"라 일컬어지기도 함)는 임의의 순열일 수 있으며, 동일 또는 상이할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 결합 도메인의 길이는 적어도 6개 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는 두 결합 도메인 모두 적어도 14개 뉴클레오타이드의 총 결합 길이를 갖는다. 두 결합 도메인의 길이에 있어서는 7+7, 8+8 및 9+9와 같은 다양한 순열이 구상된다.

본 발명의 DNA자임의 촉매 도메인은 임의의 안정된 촉매 도메인일 수 있다. 안정된 촉매 도메인의 예는 Santoro와 Joyce(1997) 및 미국특허 제5,807,718호에 제시되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본 발명에 참고로 인용되었다. 바람직한 구현예에서, 촉매 도메인은 뉴클레오타이드 서열 GGCTAGCTACAACGA(SEQ ID NO: 5)을 갖는다.

본 발명의 범위 내에서, 뉴클레오타이드 168-332에 해당하는 EGR mRNA 부위내의 바람직한 절단 자리는 다음과 같다:

(ⅰ) 뉴클레오타이드 198-199에 해당하는 GU 자리;

(ⅱ) 뉴클레오타이드 200-201에 해당하는 GU 자리;

(ⅲ) 뉴클레오타이드 264-265에 해당하는 GU 자리;

(ⅳ) 뉴클레오타이드 271-272에 해당하는 AU 자리;

(ⅴ) 뉴클레오타이드 292-293에 해당하는 AU 자리;

(ⅵ) 뉴클레오타이드 301-302에 해당하는 AU 자리;

(ⅶ) 뉴클레오타이드 303-304에 해당하는 GU 자리; 및

(ⅷ) 뉴클레오타이드 316-317에 해당하는 AU 자리.

보다 바람직한 구현예에서, DNA자임은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:

(i) 5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO: 3)는 GU(bp 198, 199)를 표적화하고; 아암은 bp 189-207로 혼성화된다.

(ⅱ) 5'-tgcaggggaGGCTAGCTACAACGAaccgttgcg(SEQ ID NO: 6)는 GU(bp 200, 201)를 표적화하고; 아암은 bp 191-209로 혼성화된다.

(ⅲ) 5'-catcctggaGGCTAGCTACAACGAgagcaggct(SEQ ED NO: 7)는 GU(bp 264, 265)를 표적화하고; 아암은 bp 255-273으로 혼성화된다.

(ⅳ) 5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO: 8)는 AU(bp 271, 272)를 표적화하고; 아암은 bp 262-280으로 혼성화된다.

(v) 5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt(SEQ ID NO: 9)는 AU(bp 271,272)를 표적화하고; 아암은 bp 262-280으로 혼성화된다.

(ⅵ) 5'-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat(SEQ ID NO: 10)는 AU(bp 301, 302)를 표적화하고; 아암은 bp 292-310으로 혼성화된다.

(ⅶ) 5'-cagcggggaGGCTAGCTACAACGAatcagctgc(SEQ ID NO: 11)는 GU(bp 303, 304)를 표적화하고; 아암은 bp 294-312로 혼성화된다.

(ⅷ) 5'-ggtcagagaGGCTAGCTACAACGActgcagcgg(SEQ ID NO: 12)는 AU(bp 316, 317)를 표적화하고; 아암은 bp 307-325로 혼성화된다.

특히 바람직한 구현예에서, DNA자임은 뉴클레오타이드 198-199에 해당하는 GU 자리, 뉴클레오타이드 271-272에 해당하는 AU 자리, 또는 뉴클레오타이드 301-302에 해당하는 AU 자리를 표적화한다.

다른 바람직한 구현예에서, DNA자임은 다음과 같은 서열을 갖는다:

5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO: 3),

5'-gcggggacaGGCTAGCTACAAGGAcagctgcat(SEQ ID NO: 10),

5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO: 8), 또는

5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt(SEQ ID NO: 9).

DNA자임계 치료제를 적용함에 있어, DNA자임은 세포 내 환경에서 분해에 대하여 가능한 한 안정한 것이 바람직하다. 이를 달성하는 한 가지 수단이 DNA자임의 하나 이상의 말단에 3'-3' 역위(inversion)를 혼입하는 것이다. 보다 구체적으로, 3'-3' 역위(본 명세서에는 간단히 "역위"라고도 일컬어짐)는 말단 뉴클레오타이드의 3' 탄소와 그 말단 뉴클레오타이드와 접한 뉴클레오타이드 사이에 결합한공유결합 포스페이트 결합을 의미한다. 이러한 유형의 결합은 인접 뉴클레오타이드의 3' 탄소와 5' 탄소 사이에 형성된 정규의 포스페이트 결합과 반대이기 때문에 "역위"라 한다. 따라서, 바람직한 구현예에서 3' 말단 뉴클레오타이드 잔기는 촉매 도메인의 3' 말단과 인접한 결합 도메인 내에서 역위된다. 역위 외에도, 본 발명의 DNA자임은 변형 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 변형 뉴클레오타이드는 예를 들면 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합 및 펩타이드-핵산 결합을 포함한다. 이들은 당 기술분야에 공지되어 있다.

특히 바람직한 구현예에서, DNA자임은 3' 위치에 역위된 T를 포함한다.

대상은 임의의 동물 또는 사람일 수 있으나, 인간이 바람직하다.

본 발명의 범위 내에서, EGR 억제제는 단독으로, 또는 당업자에게 공지될 하나 이상의 부가의 항암제와 함께 투여될 수 있다.

억제제의 투여는 당 기술분야에 공지된 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 이용하여 달성 또는 수행될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 경구, 임플란트, 경점막(transmucosally), 경피, 국부적, 근육내, 피하내 또는 체외 경로를 통해 수행될 있다. 또한, 본 발명의 제약학적 조성물은 일상적으로 사용되는 하나 이상의 제약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 것이 이상적이다. 이러한 담체는 당 기술분야에 공지되어 있다. 일상적으로 사용되는 다양한 담체를 사용하는 하기의 전달 시스템들은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 많은 구현예의 대표적인 실례일뿐이다. 한 구현예에서, 전달 비히클은 유효한 DNA자임 생활성에 대한보조 인자(들)로서 제공되는 Mg²⁺또는 기타 양이온(들)을 함유한다.

경피 전달 시스템은 패치, 겔, 테이프 및 크림을 포함하며, 가용화제, 투과 촉진제(예를 들면, 지방산, 지방산 에스테르, 지방산 알콜 및 아미노산), 친수성 폴리머(예를 들면, 폴리카보필 및 폴리비닐피롤리돈), 그리고 접착제 및 증점제(예를 들면, 폴리이소부틸렌, 실리콘계 접착제, 아크릴레이트 및 폴리부텐)와 같은 부형제를 함유할 수 있다.

경점막 전달 시스템은 패치, 정제, 좌약, 페서리, 겔 및 크림을 포함하며, 가용화제 및 촉진제(예를 들면, 프로필렌 글리콜, 담즙염 및 아미노산)와 같은 가용화제, 그리고 기타 비히클(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 지방산 에스테르 및 유도체, 그리고 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 및 하이알루론산과 같은 친수성 폴리머)을 함유할 수 있다.

경구 전달 시스템은 정제 및 캡슐을 포함한다. 이들은 결합제(예를 들면, 하이드록시프로필메틸셀룰로오소스, 폴리비닐 피롤리돈, 기타 셀룰로오스 물질 및 전분), 희석제(예를 들면, 락토오스 및 기타 설탕, 전분, 인산이칼슘 및 셀룰로오스 물질), 분해제(예를 들면, 전분 폴리머 및 셀룰로오스 물질), 그리고 윤활제(예를 들면, 스테아레이트 및 탈크)와 같은 부형제를 함유할 수 있다.

재구성 가능한 전달 시스템용 용액, 현탁액 및 분말은 현탁제(예를 들면, 검, 잔탄, 셀룰로오스 및 설탕), 습윤제(예를 들면, 소르비톨), 가용화제(예를 들면, 에탄올, 물, PEG 및 프로필렌 글리콜), 계면활성제(예를 들면, 소듐 라우릴 설페이트, Spans, Tweens 및 세틸 피리딘), 보존제 및 항산화제(예를 들면, 파라벤, 비타민 E 및 C, 그리고 아스코르브산), 항-점결제(anti-caking agent), 코팅제, 그리고 킬레이트제(예를 들면, EDTA)와 같은 비히클을 포함한다.

국부 전달 시스템은 예를 들면, 겔 및 용액을 포함하며, 가용화제, 투과 촉진제(예를 들면, 지방산, 지방산 에스테르, 지방산 알콜 및 아미노산) 및 친수성 폴리머(예를 들면, 폴리카보필 및 폴리비닐피롤리돈)와 같은 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제약학적으로 허용 가능한 담체는 리포좀 또는 생분해성 폴리머이다. 본 발명에 사용될 수 있는 담체의 예로는 다음과 같은 것들이 있다:

(1) FuGene^(R)(Roche);

(2) SUPERFECT^(R)(Qiagen);

(3) Lipofectamine 2000^(R)(GIBCO BRL);

(4) CellFectin, 양이온성 지질 N,NI,NⅡ,NⅢ-테트라메틸-N,NI,NⅡ,NⅢ-테트라팔미틸스퍼민과 디올레오일 포스파티딜-에탄올아민의 1:1.5(M/M) 리포좀 제형(DOPE)(GIBCO BRL);

(5) Cytofection GSV, 양이온성 지질과 DOPE(Glen Research)의 2:1(M/M) 리포좀 제형(Glen Research);

(6) DOTAP(N-[1-(2,3-디올레오일옥시)-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸설페이트]) (Boehringer Manheim); 및

(7) Lipofectamine, 다가 양이온성 지질 DOSPA와 중성 지질 DOPE의 3:1(M/M) 리포좀 제형(GIBCO BRL);

바람직한 구현예에서, 상기 제제는 고형 종양 내부 또는 고형 종양 인근에 주사될 수 있다. 주사 가능한 약물 전달 시스템은 용액, 현탁액, 겔, 미세구 및 폴리머 주사액을 포함하며, 용해도 변화제(예를 들면, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 수크로오스) 및 폴리머(예를 들면, 폴리카프릴락톤 및 PLGA)와 같은 부형제를 포함할 수 있다. 이식 가능한 시스템은 로드 및 디스크를 포함하며, PLGA 및 폴리카프릴락톤과 같은 부형제를 함유할 수 있다.

상기에 기재된 핵산 제제의 전달은 다음과 같은 비제한적인 비히클 예 중 하나 이상의 비히클에 의해 달성될 수 있다:

(a) 리포좀과 리포좀 단백질 접합체 및 혼합물;

(b) 비리포좀성 지질 및 양이온성 지질 제형;

(c) 활성화된 덴드리머(dendrimer) 제형;

(d) 내강을 통해 전달되는 것이 바람직한 풀루론 겔(pluronic gel)과 같은 폴리머 제형 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 코폴리머(EVAc);

(e) Sendai 바이러스와 같은 바이러스-리포좀 복합체; 또는

(f) 펩타이드-DNA 접합체.

본 발명의 제약학적 조성물의 예방 유효량은 일상적인 계량 방법을 이용하여 동물 데이터를 기준으로 결정될 수 있다. 한 구현예에서, 예방 유효량은 약 0.1 mg 내지 약 1 g의 본 발명의 DNA자임을 함유한다. 다른 구현예에서, 예방 유효량은 약 1 mg 내지 약 100 mg의 본 발명의 DNA자임을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 예방 유효량은 약 10 mg 내지 약 50 mg의 본 발명의 DNA자임을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 예방 유효량은 약 25 mg의 본 발명의 DNA자임을 함유한다.

EGR을 표적화하는 핵산 제제는 세포 현탁액의 생체외 트랜스펙션에 의해 투여하여 종양의 성장, 분화 및/또는 전이를 억제할 수 있다.

제2 양태에서, 본 발명은 EGR의 유도를 억제하는 제제, EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제와 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 종양 세포의 성장 또는 증식 억제 방법을 제공한다.

제3 양태에서, 본 발명은 (ⅰ) EGR의 유도를 억제하는 제제, (ⅱ) EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 (ⅲ) EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제를 포함하거나 코딩하는 핵산 분자를 도입하여 형질전환시킨 종양 세포를 제공한다.

제4 양태에서, 본 발명은 EGR의 유발을 억제하거나, EGR의 발현을 감소시키거나, EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 능력에 대해 추정되는 제제를 테스트하는 단계를 포함하는 혈관형성 억제제의 선별 방법을 제공한다.

제3 및 제4 양태의 바람직한 구현예에서, 제제는 EGR 안티센스 올리고뉴클레오타이드, EGR에 대항해 표적화되는 서열-특이성 리보자임, EGR dsDNA에 대항해 표적화되는 ssDNA, 그리고 EGR에 대항해 표적화되는 서열-특이성 DNA자임으로 이루어지는 군에서 선택된다.

임의의 적합한 수단을 통해 EGR을 억제하는 능력에 대해 추정되는 제제를 테스트할 수 있다. 예를 들면, 이러한 테스트에는 EGR을 발현시키는 세포를 추정되는 제제와 접촉시키는 단계, 그리고 (예를 들면, 노던 블롯 분석에 의해) EGR mRNA 또는 (예를 들면, 면역조직화학적 분석에 의해) EGR 단백질의 생산을 관찰하는 단계가 수반된다. 당업자들은 그 밖의 적합한 테스트를 알고 있을 것이다.

참고로, 하기 표 1에서 마우스, 래트 및 인간 EGR-1의 DNA 서열을 비교한다.

실시예 1

내피세포 증식 및 이동에서 EGR-1의 역할

재료 및 방법

올리고뉴크레오타이드 및 화학물질:Egr-1 mRNA의 전사 시작자리를 포함하는 부위에 대해 유도되는 포스포로티오에이트-연결 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 합성되었으며(Genset Pacific), 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 정제하였다. AS2(5'-CsTsTsGsGsCsCsGsCsTsGsCsCsAsTs-3')(SEQ ID NO: 16)의 표적서열은 마우스, 래트 및 인간 Egr-1 mRNA에서 보존되어 있다. 대조 목적으로, 유사한 염기 조성을 가지는 AS2의 크기-일치된 포스포로티오에이트-연결 대응체인 AS2C(5'-GsCsAsCsTsTsCsTsGsCsTsGsTsCsCs-3')(SEQ ID NO: 17)를 사용하였다. 포볼-12-미리스트레이트 13-아세테이트(PMA) 및 섬유아세포 성장인자-2는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다.

세포 배양:소의 동맥 내피세포는 Cell Applications, Inc.사로부터 얻었으며, 5-9회 통과된 것을 사용하였다. 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 50 IU/㎖의 페니실린이 강화된 10%의 태아 소 혈청을 함유하는 pH 7.4의 둘베코의 변형 이글 배지(Life Technologies) 내에서 내피세포를 배양하였다. 세포를 일상적으로트립신/EDTA로 통과시키고 CO₂5%/공기 95%의 습한 대기 중에서 37℃에 보관하였다.

순간 트렌스펙션 분석 및 CAT 분석:내피세포를 100 mm 디쉬에서 60-70%가 융합될 때까지 배양하고, FuGENE6(Roche)을 이용하여 지정된 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)-계 프로모터 구조체 10 ㎍을 트랜스펙션시켰다. 0.25%의 FBS 내에서 48시간 동안 배양하여 세포의 성장을 정지시키고, 24시간 동안 다양한 길항제로 자극하여 수확해서 CAT 활성을 평가하였다. 상기에 기재된 바와 같이(Khachigian 외, 1999) CAT 활성을 측정하고 용균물 중의 단백질의 농도로 표준화하였다(Bioral Protein Assay에 의해 측정).

노던 블롯 분석:다양한 길항제에 1시간 동안 사전 노출시킨 (제조자의 지침에 따라 TRIzol 시약(Life Technologies)을 이용해 제조한) 성장-정지된 내피세포의 총 RNA(12 ㎍/㎖)를 변성 1% 아가로스-포름알데하이드 겔 상에서 전기영동시켜 분리하였다. Hybond- N+ 나일론막(Amersham)으로 하룻밤 동안 옮긴 다음, Nick Translation Kit 오버나이트(Roche)를 이용해 제조한³²P-표지된 Egr-1 cDNA와 혼성화시켰다. 막을 세척하고 상기에 기재된 바와 같이(Khachigian 외, 1995) 자동방사능 사진을 이용해 방사능을 가시화하였다.

RT-PCR:총 RNA 8 ㎍으로 M-MLV 역전사효소를 이용하여 역전사를 수행하였다. Taq 폴리머라아제를 이용하여 94℃에서 1분간 가열하고, 94℃에 1분, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분 동안 사이클링하여 Egr-1 cDNA를 증폭시켰다[334 bp 산물(Delbridge 외, 1997)]. 30 사이클 후, 72℃에서 5분간 연장하였다. 샘플을 에티듐 브로마이드를 함유하는 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 자외선 조사 하에서 촬영하였다. β-액틴 증폭(690 bp 산물)을 상기와 같이 본질적으로 수행하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다: Egr-1 정방향 프라이머(5'-GCA CCC AAC AGT GGC AAC-3')(SEQ ID NO: 18), Egr-1 역방향 프라이머(5'-GGG ATC ATG GGA ACC TGG-3')(SEQ ID NO: 19), β-액틴 정방향 프라이머(5'-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3')(SEQ ID NO: 20) 및 β-액틴 역방향 프라이머(5'-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG-3')(SEQ ID NO: 21).

안티센스 올리고뉴클레오타이드 전달 및 웨스턴 블롯 분석:배지를 처음 교체하고 24시간 및 48시간 후에 100 mm 디쉬 내의 성장-정지된 세포를 지정된 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양하였다. 올리고뉴클레오타이드를 2차 첨가하고, 세포를 다양한 농도의 인슐린과 함께 배양하여 1시간 후에 수확하였다. 세포를 pH 7.4의 차가운 인산염-완충 염수(PBS) 내에서 세척하고, RIPA 완충액(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 1% 트라실롤, 10 ㎍/㎖ 류펩틴, 1% 아프로티닌, 2 μM PMSF) 중에 용해시켰다. 용균물을 8% 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시켜 분리하고, PDVF 나일론막(NEN-DuPont)으로 옮겨 탈지분유로 차단한 뒤, Egr-1에 대한 다중 클론성 항체(Santa Cruz Biotechology, Inc.) 및 단일 클론성 호스래디쉬 퍼옥시다아제-연결 마우스의 항-토끼 Ig 2차 항체와 함께 배양한 다음, 화학발광을 검출하였다(NEN-DupPont).

DNA로의 ³ H-티미딘 혼입:성장-정지된 내피세포를 96웰 플레이트 내에서 90% 농도로 올리고뉴크레오타이드와 함께 2회 배양하고 인슐린을 첨가하였다. 신호(signaling) 억제인자(PD98059, SB202190, 워트마닌)를 실험에 사용한 경우, 이들 제제는 인슐린을 첨가하기 2시간 전에 첨가하였다. 인슐린에 18시간 동안 노출시킨 후, 세포에 메틸-³H 티미딘(NEN-DuPont)을 웰당 200,000 cpm의 비율로 6시간 동안 첨가하였다. 용균물을 먼저 차가운 PBS(pH 7.4) 내에서 세척하고, 차가운 10% 트리클로로아세트산으로 고정한 뒤, 차가운 에탄올로 세척하여 0.1 M NaOH에 용해시켜 준비하였다. 용균물 중의³H 티미딘을 β-섬광 계수기(Packard)를 이용하여 ACSⅡ 섬광제로 정량하였다.

시험관내 손상:성장-정지된 세포를 90% 농도로 상기에 기재된 바와 같이 다양한 농도에서 안티센스 올리고뉴크레오타이드 및 인슐린과 함께 배양한 뒤, 살균된 나무 이쑤시개를 단층으로 끌어넣어 스크랩하였다(Khachigian 외, 1996). 48-72시간 뒤, 세포를 4% 포르말린 내에서 고정하고 헤마톡실린/에오신으로 염색한 뒤, 촬영하였다.

HMEC-1 배양 및 증식 분석:SV40-형질전환된 HMEC-1 세포를 EGF(10 ng/㎖) 및 하이드로코르티손(1 ㎍/㎖) 보강물 및 10% FBS를 함유하는 MCDB 131 배지에서 배양하였다. 보강물을 함유하지 않는 무혈청 배지에서 48시간 동안 배양한 후, 세포에 지정된 DNA 효소(0.4 μM)를 트랜스펙션시키고, 배지를 교체하고 72시간 뒤에 다시 트랜스펙션시키고, 10% 혈청을 첨가하였다. 혈청을 첨가하고 24시간 후,Coulter 계수기를 이용해 세포를 정량하였다.

안티센스 Egr-1 mRNA 과대발현:소의 대동맥 내피세포 또는 래트의 혈관 평활근 세포를 96웰 플레이트에서 60% 농도로 배양한 뒤, (Egr-1 cDNA(732-869)의 137 bp 단편을 pcDNA3의 BamHI/EcoRI 자리에 안티센스 방향으로 클로닝한) pcDNA3-A/SEgr-1 구조체 3 ㎍ 또는 pcDNA3 단독을 제조자의 지침에 따라 Fugene6을 이용하여 트랜스펙션시켰다. 성장이 정지된 세포를 Waymouth 배지(SMC) 또는 DMEM(EC) 내에서 5% FBS와 함께 배양하고, 3일 후 트립신을 처리한 뒤, Coulter 계측을 통해 세포군을 정량하였다.

결과 및 결론

글루코스가 아닌 인슐린이 혈관 내피세포 내에서 Egr-1 활성을 자극한다.고농도의 글루코스는 바로-초기 유전자의 발현 및 미토겐-활성화된 단백질(MAP) 키나아제 활성을 자극함으로써 정상적으로 정지된 혈관 내피를 활성화할 수 있다(Frodin 외, 1995; Kang 외, 1999). 이들 신호 및 전사 과정은 교대로 그 산물이 내피 표현형질을 변경시키고 병변의 발생을 촉진하는 기타 유전자의 발현을 유도한다. 혈관 내피세포에서 Egr-1 활성에 대한 글루코스의 효과를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 c-fos TATA 박스의 상류에 위치하는 3개의 고친화성 Egr-1 결합 자리에 의해 조종되는 클로르암페니칼 아세틸트랜스퍼라아제(CAT)계 수용체 벡터인 pEBS1³foscat을 트랜스펙션시킨 내피세포 내에서 순간 트랜스펙션 분석을 수행하였다(Gashler 외, 1993). 성장-정지된 내피세포를 다양한 농도의 글루코스(5내지 30 mM)에 24시간 이상 노출시켜도 Egr-1 결합 활성은 증가하지 않았다(도 1). 그러나, Egr-1 결합 활성은 세포를 인슐린(100 nM)에 노출시킨 경우에 증가하였다(도 1). 리포터 활성 또한 혈관 내피세포에서 Egr-1 전사 및 결합 활성의 공지된 유도인자인 FGF-2와 함께 배양한 경우에 증가하였다(Santiago 외, 1999b)(도 1).

인슐린 및 FGF-2는 혈관 내피세포 내에서 Egr-1 mRNA 발현을 유도한다.리포터 유전자 분석을 이용하여 얻은 상기의 연구 결과는 인슐린에 노출된 내피세포 내에서 증가된 Egr-1 발현에 대한 증거를 제공하였다. 이어서, 본 발명자들은 역전사-폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR) 및 노던 블롯 분석을 사용하여 Egr-1 mRNA의 수준을 증가시키는 인슐린의 능력을 직접적으로 확인하였다. RT-PCR을 통해 Egr-1이 성장-정지된 내피세포에서 약하게 발현된다는 사실이 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 인슐린은 FGF-2와 같이 길항제에 노출되고 1시간 이내에 Egr-1의 발현을 증가시켰다. 반면, β-액틴 mRNA의 수준은 변하지 않았다. 노던 블롯 분석 결과, 인슐린, FGF-2, 그리고 Egr-1 발현의 제2 단백질 유도인자(Khachigian 외, 1995)인 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)가 리보좀의 28S 및 18S mRMA의 수준을 증가시키지 않고 평형 상태의 Egr-1 mRNA 수준을 증가시킨다는 사실이 입증됨으로써 이러한 정량 데이터가 확인되었다(데이터는 나타내지 않음).

내피세포 내에서의 인슐린-자극된 Egr-1 단백질 합성은 Egr-1 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다.전사 인자의 결합 활성(도 1)과 인슐린에 의해 유도되는 Egr-1 mRMA 발현에 대한 본 발명자들의 주장을 일치시키기 위하여, 본 발명자들은 Egr-1 단백질에 대항해 유도된 다중 클론성 항체를이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 인슐린(100 nM 내지 500 nM)은 1시간 이내에 성장-정지된 내피세포 내에서 Egr-1 단백질의 합성을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 연구 결과들은 종합해 볼 때 인슐린이 혈관 내피세포 내에서 Egr-1 mRNA, 단백질 및 결합 활성을 증대시킨다는 사실을 입증한다.

본 발명자들은 최근 Egr-1 mRNA 내의 전사 시작자리를 표적화하는 포스포로티오에이트계 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 개발하였다(Santiago 외, 1999c). 이들 올리고뉴클레오타이드에는 비특이적인 생물학적 활성과 관련된 포스포로티오에이트 G-4중 서열이 결여되어 있다(Stein, 1997). 웨스턴 블롯 분석 결과, 성장-정지된 내피세포를 0.8 μM의 안티센스 Egr-1 올리고뉴클레오타이드(AS2)와 함께 배양하면 단백질의 동등한 로딩에도 불구하고 인슐린-유도성 Egr-1 단백질 합성이 억제된다는 사실이 밝혀졌다. 인슐린-유도성 Egr-1 단백질에 약화시키지 않고 세포를 동일한 농도의 As2C에 노출시키면 안티센스 Egr-1 올리고뉴클레오타이드의 서열-특이성 억제 효과가 나타난다.

인슐린은 Egr-1 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제되는 내피세포의 DNA 합성을 자극한다.Egr-1 단백질의 유도를 약화시키는 이러한 올리고뉴클레오타드를³H-티미딘 혼입 분석에 사용하여 인슐린-유도성 DNA 합성에서 Egr-1의 연관성을 결정하였다. 이러한 분석은 트리클로로아세트산(TCA)을 이용하여 DNA 침전성으로³H-티미딘 전환을 평가한다(Khachigian 외, 1992). 초기 실험에서, 인슐린(100 nM)에 노출된 성장-정지된 내피세포는 DNA의 합성을 100%가지 증가시킨 반면, 500 nM의 인슐린은 DNA 합성을 200% 증가시켰다(도 2a).

다음으로, 본 발명자들은 인슐린-유도성 내피세포 DNA 합성에 대한 AS2 및 AS2C의 효과를 결정하였다. 첨가된 인슐린이 존재하지 않은 경우, AS2(0.8 μM)는 저농도의 혈청에 의해 촉진되는 기본적인 내피 DNA 합성을 억제하였다(도 2b). 반면, 스크램블드 대조군(0.8 μM) 또는 제3 올리고뉴클레오타이드, E3(0.8 μM), Egr-1 mRNA의 다른 부위를 향하는 크기-일치된 포스포로티오에이트(Santiago 외, 1999c)는 기본적인 DNA 합성에 거의 영향을 주지 않았다(도 2b). 나아가, AS2 및 E3와는 달리, AS2는 인슐린(500 nM 및 1000 nM)에 의해 유도 가능한 DNA 합성을 현저히 억제하였다(도 2b). DNA 합성의 농도-의존성 억제를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 내피세포를 0.4 μM 및 0.8 μM의 Egr-1 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양하였다. 이러한 저농도의 AS2는 (AS2C에 비해)³H-티미딘 혼입을 덜 효과적으로 억제하였기 때문에, 이는 안티센스 Egr-1 올리고뉴클레오타이드(도 2c)에 의한 용량-의존성 및 서열-특이성 억제를 나타낸다. 따라서, 이러한 연구 결과는 인슐린에 의해 유도 가능한 내피세포 DNA 합성에 Egr-1 단백질이 요구됨을 입증한다.

내피세포 내에서의 인슐린-자극된 DNA 합성은 PD98059 및 워트마닌에 의해 억제되나, SB202190에 의해서는 억제되지 않는다.유도성 Egr-1 전사는 Egr-1 프로모터 내의 혈청 반응 요소에서 인자를 인산화시키는(Gashler 외, 1995) 세포외 신호에 의해 조절되는 키나아제(ERK)의 활성에 의해 통제된다(Santiago 외, 1999b). 혈관 내피세포의 인슐린-유도성 증식을 매개하는 신호전달 경로에 대해서는 밝혀진 것이 거의 없기 때문에, 본 발명자들은 특정한 MEK/ERK 억제인자인 PD98059를 이용하여 이 과정에서 MEK/ERK의 관련성을 측정하였다. 이 화합물(10 및 30 μM)은 용량-의존적 방식으로 인슐린-유도성 DNA 합성을 억제하였다(도 3). 마찬가지로, 워트마닌(0.3 및 1 μM), c-Jun N-말단 키나아제(JNK)도 억제하는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 억제인자(Ishizuka 외, 1999; Day 외, 1999; Kumahara 외, 1999), ERK(Barry 외, 1999), 그리고 p38 키나아제(Barry 외, 1999)는 용량-의존적 방식으로 DNA 합성을 억제하였다(도 3). 반면, 특정한 p38 키나아제 억제인자인 SB202190(100 및 500 nM)는 DNA 합성에 영향을 주지 못했다(도 3). 이러한 결과는 인슐린-유도성 내피세포 증식에 있어 MEK/ERK에 대한 중요한 역할 및 가능한 JNK, 그리고 이 과정에서 p38 키나아제의 무관성을 밝혀준다.

인슐린은 Egr-1 의존적 방식으로 시험관내 기계적 손상 후 내피세포의 재성장(regrowth)을 자극한다.배양 시 혈관 내피세포를 기계적으로 손상시킨 결과, 손상된 주변에서 이동 및 증식이 초래되었으며, 노출된 영역이 회복되었다. 본 발명자들은 인슐린이 기계적 손상에 대한 이러한 세포 반응을 촉진하는 것으로 가정하였다. (0.25%의 혈청 내에서 48시간 배양함으로써) 성장-정지된 내피 단일층은 격렬하게 스크랩하여 독특한 상처 가장자리를 만들었다(데이터는 나타내지 않음). 혈청을 저농도로 함유하는 배지 내에서 추가 3일 동안 배양주들을 연속 배양한 결과, 노출된 영역에서는 재성장이 미약했으나, 최적량의 혈청(10%)의 존재 하에서는 활발한 재성장이 나타났다. 손상 시 인슐린(500 nM)을 성장-정지된 배양주에 첨가한 경우, 노출된 영역에서의 세포 개체군은 현저히 증가하였으나, 예상한 바와 같이 10% 혈청 대조군보다는 덜 효과적이었다.

손상 후 인슐린에 의해 강화되는 내피 재성장에 있어서의 Egr-1의 연관성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 배양주를 안티센스 Egr-1 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양하여 스크랩하고 손상과 동시에 인슐린을 첨가하였다. AS2(0.8 μM)는 인슐린에 의해 자극되는 내피 재성장을 현저히 억제하였다. 반면, AS2C(0.8 μM)의 존재 하에서의 재성장은 올리고뉴클레오타이드가 생략된 배지와 크게 상이하지 않았다. 고농도(1.2 μM)의 AS2 및 AS2C가 사용된 경우에도 유사한 결과가 관찰되었다. 따라서, 인슐린에 의해 자극되는 손상 후의 내피 재성장은 Egr-1 의존적 방식으로 진행된다. 이러한 연구 결과는 도 4에 정량적으로 나타내었다.

이런 결과는 손상 후 인슐린에 의해 유도되는 증식 및 재성장이 Egr-1의 활성화에 따라 결정적으로 좌우됨을 시사한다. 노던 블롯, RT-PCR 및 웨스턴 임뮤노블롯 분석을 통해 인슐린이 Egr-1 mRNA 및 단백질 발현을 유도한다는 사실이 밝혀졌다. 인슐린에 의해 유도되는 Egr-1 단백질의 합성을 서열-특이적 방식 및 용량-의존적 방식으로 차단하는 안티센스 올리고뉴크레오타이드도 기계적 손상 후의 증식 및 재성장을 억제하였다. Egr-1을 특이적으로 표적화하는 핵산을 이용하여 얻은 이러한 연구 결과들은 내피 성장에 있어 이 전사 인자의 기능적 연관성을 입증한다.

인슐린 신호전달에는 다양한 직접적인-초기의 유전자 및 전사 인자의 활성화가 수반된다. 이들은 c-fos(Mohn 외, 1990; Jhun 외, 1995; Harada 외, 1996), c-jun(Mohn 외, 1990), 핵 인자-κB(Bertrand 외, 1998), SOCS3(Emanuelli 외, 2000)및 포크헤드 전사인자 FKHR(Nakae 외, 1999)를 포함한다. 인슐린은 혈관사이 세포 내에서 Egr-1(Solow 외, 1999), 섬유아세포(Jhun 외, 1995), 지방세포(ALexander-Bridges 외, 1992) 및 중국 햄스터 난소세포(Harada 외, 1996)의 발현을 유도한다. 이러한 연구는 최초로 혈관 내피세포 내에서 인슐린에 의한 Egr-의 유도를 설명하는 것이다.

인슐린은 MAP 키나아제 상과 내에서 ERK, JNK 및 p38 키나아제를 포함하는 여러 하위 부류들을 활성화한다(Guo 외, 1998). 본 발명자들의 이러한 연구 결과는 MEK에 결합하고 Raf에 의한 인산화를 방지하는 특정한 ERK 억제인자 PD98059가 인슐린-유도성 내피세포 증식을 억제함을 시사한다. Egr-1 전사는 Egr-1 프로모터 내의 혈청 반응 요소(SRE)에서 (Elk-1과 같은) 3원 복합 인자의 자체 활성화를 통한 ERK의 인산화 활성에 따라 결정된다. Egr-1 프로모터에서는 6개의 SRE가 나타나는 반면, c-fos 프로모터에서는 단지 1개만이 존재한다(Gashler 외, 1995). PD98059는 혈관 세포 내의 c-fos SRE에서 인슐린-유도성 Elk-1 전사 활성을 차단한다(Xi 외, 1997). 공개된 이런 연구 결과는 인슐린-유도성 증식에 있어 Egr-1의 연관성에 대한 본 발명이 주장하는 바와 일치한다.

내피 증식이 Egr-1 의존성 과정이라는 인슐린 의존성을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 인간 미세혈관 내피세포(HMEC-1)를 각각 인간 EGR-1 mRNA 내의 상이한 자리를 표적화하는 2개의 DNA 효소(DzA 및 DzF)와 함께 개별적으로 0.4 μM의 최종 농도로 배양하였다. DzA 및 DzF 모두 5% 혈청의 존재 하에서 HMEC-1 복제를 억제하였다(도 5). 반면, DzFscr은 동일한 농도에서 증식을 조절하지 못했다(도 5).DzFscr은 DzF와 동일한 활성의 15nt 촉매 도메인을 함유하며, 동일한 알짜 전하를 가지나 스크램블드 혼성화 아암을 갖지는 않는다. 제2 내피세포 유형을 이용하여 얻은 이러한 데이터는 인간 EGR-1을 표적화하는 서열-특이적 방식을 이용한 내피 증식의 억제를 입증한다.

끝으로, 본 발명자들은 CMV-매개의 안티센스 Egr-1 mRNA의 과대발현은 내피세포 및 평활근 세포 모두의 증식을 억제한다는 사실을 발견하였다. 내피세포 및 평활근 세포 pcDNA3-A/SEgr-1 트랜스펙션체 모두의 복제가 골격 벡터 pcDNA3 단독을 트랜스펙션시킨 것들보다 현저히 낮았다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 연구 결과는 안티센스 EGR mRNA가 동맥의 내피세포 및 적어도 하나의 다른 혈관세포 유형의 증식을 억제할 수 있음을 시사한다.

신생물의 임상 처치를 위한 다양한 화학치료제의 활용 및 임상적 사용에도 불구하고, 고형 종양은 서구 사회에서 사망의 주된 원인으로 남아있다. 이러한 종양을 치료하기 위하여 현재 사용되는 약물은 일반적으로 암에 걸리지 않은 조직에 대해서도 독성일 수 있는 비특이적 독성을 가지며, 효능를 위해서는 고용량이 요구된다. 세포 성장의 기초가 되는 세포 및 분자 메커니즘에는 종양 증식 및 이동 이상의 과정이 수반된다는 증거들이 밝혀지고 있다. 중요한 것은 종양 성장 및 전이는 새로운 혈관 형성 과정인 진행중의 혈관형성에 따라 결정적으로 좌우된다는 것이다(Crydtal, 1990). Egr-1이 혈관 내피세포의 복제 및 이동에 결정적임을 입증하는 본 발명의 연구 결과는 혈관형성 및 종양형성에 있어서의 중요한 조절인자로서 이러한 전사 인자를 강하게 함축한다.

실시예 2

래트의 Egr-1을 표적화하는 DNA자임(NGFI-A)의 특정화

재료 및 방법

ODN 합성:DNA자임은 달리 지정하지 않는 한, 3' 위치에 역위 T를 가지도록 상업적으로 합성하였다(Oligos Etc., Inc). 절단 반응의 기질을 이러한 변형을 갖지 않도록 합성되었다. 지정된 ODN의 5' 말단은 γ³²P-dATP 및 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(New England Biolabs)로 표지하였다. Chromaspin-10 칼럼(Clontech) 상에서 원심분리하여 방사선 표지된 종들로부터 혼입되지 않은 표지를 분리하였다.

시험관내 전사체 및 절단 실험: BglⅡ를 이용해 미리 절단된, 플라스미드 구조체 pJDM8[Milbrandt(1987)에 기재되어 있고, 이 문헌의 내용은 본 발명에 참고로 인용됨]의 시험관내 전사(T3 폴리머라아제)를 통해³²P 표지된 206개의 뉴클레오타이드로 이루어진 NGFI-A RNA 전사체를 제조하였다. 달리 지정하지 않는 한, 10 mM의 MgCl₂, 5 mM의 트리스(pH 7.5), 150 mM의 NaCl, 4.8 pmol의 시험관내 전사 또는 합성된 RNA 기질 및 60 pmol의 DNA자임(기질 대 DNA자임 비율은 1:12.5)을 함유하는 총 20 ㎖의 부피로 반응을 수행하였다. 37℃에서 지정된 시간 동안 반응을 진행하고, 포름아미드 로딩 완충용액을 함유하는 시험관으로 분액을 옮김으로써 반응을 중단시켰다(Sambrook 외, 1989). 12%의 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 샘플을 전개시키고 -80℃에서 하룻밤 동안 자동 방사선 사진 촬영하였다.

배양 조건 및 DNA자임 트랜스펙션:Cell Applications, Inc.사로부터 래트의 원발성 대동맥 SMC를 구입하여, 37℃ 하의 5% CO₂가습 대기 중에서 10%의 태아 소의 혈청(FBS), 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 50 IU/㎖의 페니실린을 함유하는 Waymouth 배지(pH 7.4) 내에서 배양하였다. 실험에는 3-7회 통과된 SMC를 사용하였다. 새끼 래트의 SMC[WKY 12-22(Lemire 등(1994)에 기재됨, 이 문헌의 내용은 본 발명에 참고로 인용됨)를 유사한 조건 하에서 배양하였다. 제조자의 지시(Qiagen)에 따라 Superfect를 사용하여 DNA자임(또는 지정된 안티센스 ODN)을 트랜스펙션(0.1 μM)시키기 전에 아융합성(subconfluent) (60-70%) SMC를 무혈청 배지(SFM) 내에서 6시간 동안 배양하였다. 18시간 후, 5%의 FBS 내에서 2차 트랜스펙션시키기 전에 pH 7.4의 인산염 완충 염수(PBS)를 사용하여 세포를 세척하였다.

노던 블롯 분석:TRIzol 반응제(Life Technologies)를 사용하여 전체 RNA를 분리하고, Hybond-N + 막(NEN-DuPont)으로 옮기기 전에 전기영동에 의해 25 ㎍을 재분리하였다. 본질적으로, 상기에 기재된 바와 같이(Khachigian 외, 1995) α³²P-dCTP 표지된 Egr-1 또는 β-액틴 cDNA를 사용하여 사전 혼성화, 혼성화한 뒤 세척을 수행하였다.

웨스턴 블롯 분석:100 mm 플레이트(Nunc-InterMed) 내의 성장 정지된 SMC에 상기 ED5 또는 ED5SCR을 트랜스펙션시키고, 5%의 FBS 내에서 1시간 동안 배양하였다. pH 7.4의 차가운 PBS 내에서 세포를 세척하고, 150 mM의 NaCl, 50 mM의 트리스-HCl(pH 7.5), 1%의 소듐 데옥시콜레이트, 0.1%의 SDS, 1%의 Triton X-100, 5 mM의 EDTA, 1%의 트래실올, 10 ㎍/㎖의 류펩틴, 1%의 아프로티닌 및 2 mM의 PMSF로 추출하였다. 24 ㎍의 단백질 샘플을 10%의 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, PVDF 나일론막(NRN-DuPont) 상에 일렉트로블로팅하였다. 0.05%(w:v)의 Tween 20을 함유하는 PBS 내의 무지방 탈지 분유로 차단하기 전에 막을 건조하였다. 막을 Egr-1 또는 Sp1에 대한 토끼 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)(1:1000)와 함께 배양한 뒤, HRP에 연결된 마우스의 항-토끼 Ig 2차 항혈청(1:2000)과 함께 배양하였다. 마우스의 단일 클론성 c-Fos(Santa Cruz Biotechnologiy, Inc.)가 사용된 경우에는 HRP에 연결된 토끼의 항-마우스 Ig를 사용하여 검출을 행하였다. 화학발광 검출법(NEN-DuPont)을 이용해 단백질을 가시화하였다.

세포 증식의 분석:96개의 웰로 이루어진 역가 플레이트(Nunc-InterMed) 내의 성장-정지된 SMC에 상기 ED5 또는 ED3SCR을 트랜스펙션시킨 후, 37℃에서 72시간 동안 5%의 FBS에 노출시켰다. 세포를 PBS(pH 7.4)로 헹구고, 트립신 처리한 뒤, 자동 Coulter 계수기를 사용하여 현탁물을 정량하였다.

DNA자임의 안정성 평가:DNA자임의 5'-말단을 γ³²P-dATP로 표지하고, 원심분리를 통해 유리된 표지를 분리하였다. 방사선 표지된 DNA자임을 37℃ 하의 5% FBS 또는 무혈청 배지 내에서 지정된 시간 동안 배양하였다. 반응물의 분액을 포름아미드 로딩 완충용액이 함유된 시험관으로 옮겨 반응을 중지시켰다(Sambrook외, 1989). 샘플을 12%의 변성 폴리아크릴아미드 겔에 가하고, -80℃에서 하룻밤 동안 자동 방사능 사진을 촬영하였다.

SMC 상처 분석:살균 이쑤시개를 이용하여 1회 스크랩하기 전, 챔버 슬라이드(Nunc-InterMed) 내의 성장 정지된 융합성 SMC를 18시간 동안 ED5 또는 ED5SCR에 노출시켰다. 손상시키기 전, 세포에 미토마이신 C(Sigma)(20 μM)를 2시간 동안 처리하였다(Pitsch 외, 1996, Horodyski & Powell, 1996). 손상 뒤 72시간 후, 세포를 PBS(pH 7.4)로 세척하고 포름알데하이드로 고정시킨 뒤, 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다.

래트의 동맥 결찰 모델 및 분석:300 내지 350 g 중량의 Sprague Dawley 래트 어른 수컷을 케타민(60 mg/kg, i.p.) 및 자일라진(8 mg/kg, i.p.)을 사용해 마취시켰다. 오른쪽 총경동맥을 중앙 목 절개를 통해 경동맥 분기에 노출시켰다. 6/0 크기의 비흡수성 구조를 분기에 가까운 총경동맥 둘레에 매고, 디지털 방식으로 혈류를 중단시켰다. (DEPC 처리된 H₂O 내) 500 ㎍의 DNA자임, 30 ㎕의 트랜스펙션제 및 플루론계 겔 P127(BASF)을 함유하는 4℃의 용액 200 ㎕를 5마리로 구성된 각 그룹의 래트의 혈관 주변에 가하고, 12 - 15 mm에 대한 결찰으로부터 가까운 쪽으로부터 연장하였다. 이들 제제는 37℃에서 겔의 고형화를 억제하지 않았다. 3일 후, 500 ㎍의 DNA자임을 함유하거나 함유하지 않는 부형제를 2차 투여하였다. 결찰 뒤 18일 후, 치사량의 페노바비톤을 주사하여 동물을 희생시키고, 120 mmHg로 살포된 10%(v/v)의 포름알데하이드를 사용하여 살포 고정시켰다. 이어서 파라핀으로 고정하기 전, 두 경동맥을 유리되게 절개하여 10%의 포름알데하이드에 넣은 뒤, 2 mm 길이로 절단하여 3%(w/v)의 아가로스에 넣었다. 결찰 지점으로부터 혈관을 따라 250 ㎛ 간격으로 5 ㎛의 절편을 만들고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 주문 제작된 소프트웨어 패키지(Magellan)(Halasz & Martin, 1984)를 사용하여 래트 한 마리당 신생 혈관내막 및 5개의 연속 절편의 중심 영역을 디지털 방식으로 결정하고, 5마리의 래트로 구성된 그룹당 평균비율로 나타내었다.

결과 및 결론

개선된 특이성을 위하여 원형 DNA자임 디자인 7 내의 15 nt DNA자임의 촉매 도메인의 측면에 연결된 7×7 nt 이암 하나당 2개씩의 뉴클레오타이드를 연장하였다(L.-Q. Sun, 데이터는 나타내지 않음)(도 6). 분자의 3' 말단을 역위된 3'-3' 연결 티미딘(T)으로 캡핑하여 3' → 5' 엑소뉴클리아제의 분해에 대한 내성을 부여하였다. 촉매 도메인을 변화시키지 않고 ED5의 두 아암 내의 서열을 스크램블링하여 DNA자임 ED5SCR을 제조하였다(도 6).

NGFI-A mRNA의 뉴클레오타이드 805 - 827(도 6)에 대응하는 23nt 합성 RNA 기질을 사용하여 ED5가 표적 RNA를 절단하는 능력을 가졌는지의 여부를 결정하였다. ED5는 5' 말단이³²P로 표지된 23량체를 10분 이내에 절단하였다. 12량체 산물은 기질의 A(816)-U(817) 접합점과 5'-말단 사이의 길이에 해당한다(도 6). 반면, ED5SCR은 이러한 합성 기질에 대해 명백한 효과를 나타내지 않았다. 광범위한 화학량론적 비율에 걸쳐 이러한 DNA자임의 인간 ED5(hED5)이 래트 기질을 절단하지못하는 사실에 의하여 특이적인 ED5의 촉매작용이 입증되었다(데이터는 나타내지 않음). ED5SCR을 사용한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다(데이터는 나타내지 않음). hED5는 이것의 혼성화 암 내에 18nt를 3개 갖는다는 점에서 래트의 ED5 서열과 상이하다(표 2). 이어서, 시험관내 전사에 의해 제조된 천연 NGFI-A mRNA의³²P-표지된 206 nt 단편에 대한 ED5의 촉매 효과를 측정하였다. 절단 반응으로부터 A(816)-U(817) 접합점에서의 DNA자임의 절단과 일치하는 163 및 43 nt 길이의 2개의 방사선 표지된 종이 얻어졌다. 다른 실험에서도 ED5는³²P로 표지된 1960 nt 길이의 NGFI-A 전사체를 시간-의존적 방식으로 특이적으로 절단하였다(데이터는 나타내지 않음).

< 표 2 > mRNA 내의 DNA자임 표적 자리

(다른 전사 인자 중) 래트 NGFI-A 또는 인간 EGR-1의 mRNA 및 ED5 또는 hED5와 mRNA의 18nt 아암 사이의 유사성을 퍼센티지로 나타내었다. NGFI-A mRNA 내 ED5의 표적 서열은 5'-807-ACGU CCGGGA UGG CAG CGG-825-3'(SEQ ID NO:22)(래트 NGFI-A 서열)이고, EGR-1 내의 hED5의 표적 서열은 5'-262-UCGU CCAGGA UGG CCG CGG-280-3'(SEQ ID NO: 23)(인간 EGR-1 서열)이다. 굵은 글자체의 뉴클레오타이드는 래트와 인간 서열 사이의 불일치를 의미한다. Genbank 및 EMBL 유래의 서열을 사용한 ANGIS 내에서의 갭 베스트 피트(gap best fit) 연구에 의해 데이터가 얻어졌다. Sp1 및 c-Fos에 대한 래트 서열은 보고되지 않았다.

유전자	획득물 번호	18 nt에 걸친 최대 상동율(%)
		ED5	hED5
래트 NGFI-A	M18416	100	84.2
인간 EGR-1	X52541	84.2	100
설치류 Sp1	AF022363	66.7	66.7
인간 c-Fos	K00650	66.7	66.7
설치류 c-Fos	X06769	61.1	66.7
인간 Sp1	AF044026	38.9	28.9

NGFI-A mRNA의 내생 수준에 대한 DNA자임의 효과를 측정하기 위하여, 성장-정지된 SMC를 혈청으로 자극하기 전에 ED5에 노출시켰다. 노던 블롯 및 밀도 측정 분석 결과, ED5(0.1 μM)는 정상 상태의 혈청-유도성 NGFI-A mRNA의 수준을 55% 억제한 것으로 나타난 반면(데이터는 나타내지 않음), ED5SCR은 효과가 전혀 없었다(데이터는 나타내지 않음). 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 NGFI-A의 합성을 단백질 수준에서 억제하는 ED5의 능력을 평가하였다. NGFI-A 단백질의 혈청 유도는 ED5에 의해 억제되었다. 반면, 측면에 넌센스 아암이 연결되지 않은 ED5 및 ED5SCR와 동일한 촉매 도메인을 함유하는 DNA자임 ED5SCR과 EDC 중 어느 것도 NGFI-A의 유도에 어떠한 영향도 주지 않았다(도 7). ED5는 구성적인 면에서 발현되고 구조적으로 관련된 아연 핑거 단백질인 Sp1의 수준에 영향을 주지 못했다. 또한 NGFI-A와 같이, 유도가 그것의 프로모터 내의 혈청 반응요소 및 세포외 신호에 의해 조절되는 키나아제에 의해 매개되는 인산화에 따라 좌우되는, 직접적인-초기 유전자 산물인 c-Foc의 혈청 유도를 차단하지 못했다(Treisman, 1990, 1994 및 1995; Gashler & Sukhatme, 1995). 이러한 연구 결과들은 종합해 볼때 유전자 특이적 방식 및 서열-특이적 방식으로 NGFI-A mRNA 및 단백질의 생산을 억제하는 ED5의 능력을 입증함과 동시에, NGFI-A mRNA와 기타 mRNA 내의 이것의 표적 자리간의 유의한 상동성 결여와 일치한다(표 2).

이어서, SMC 복제에 대한 ED5의 효과를 결정하였다. 혈청에 노출시키기 전, 성장-정지된 SMC를 DNA자임과 함께 배양하고, 3일 후에 세포수를 평가하였다. ED5(0.1 μM)는 혈청에 의해 촉진되는 SMC의 증식을 70% 억제하였다(도 8a). 반면, ED5SCR은 SMC의 성장에 영향을 주지 못했다(도 8a). 1 μM 농도에서 SMC의 성장을 억제할 수 있는 안티센스 NGFI-A ODN인 AS2는 저농도에서는 증식을 억제하지 못하였다(도 8a). 추가 실험 결과, ED5는 DNA로의 혈청-유도성³H-티미딘 혼입을 차단하였다(데이터는 나타내지 않음). 형태상의 변화가 관찰되지 않았기 때문에 ED5 억제는 세포 사망으로 귀결되지 않았고, 혈청의 존재 하에서 Trypan Blue가 혼입된 세포의 비율이 어떠한 DNA자임에 의해서도 영향을 받지 않았다(도 8b).

2주된 래트의 대동맥에서 유래된 배양된 SMC는 풍선에 의해 손상된 래트 동맥의 신생 혈관내막 유래의 SMC와 형태 및 표현형질 면에서 유사하다(Seifert 외, 1984; Majesky 외, 1992). WKY12-22 세포와 신생 혈관내막 세포의 상피 외관은 정상의 정지 배지로부터 유래된 SMC의 연장된 쌍극성과 대비된다(Majesky 외, 1988). WKY12-22 세포는 중앙의 SMC보다 빠르게 성장하고, "합성" 표현형질과 일치하는(Majesky 외, 1992; Campbell & Campbell, 1985) NGFI-A(Rafty & Khachigian, 1998)와 같은 다수의 성장 조절 분자를 과대 발현시킨다(Lemire 외, 1994). ED5는 혈청-유도성 WKY12-22의 증식을 대략 75% 감소시켰다(도 8c). ED5SCR은 억제 효과가 없었으며, 놀랍게도 성장을 촉진하는 것으로 나타났다(도8c). Trypan Blue가 배제된 것으로 보아, DNA자임의 억제는 세포 독성의 결과가 아닌 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음).

ED5 및 ED5SCR의 생물학적 작용에 있어서의 차이가 유사하지 않은 세포내 편재의 결과가 아님을 입증하기 위하여, 두 DNA자임의 5'-말단을 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지하고 SMC와 함께 배양하였다. 형광 현미경으로 관찰한 결과, FITC-ED5와 FITC-ED5SCR 모두 주로 핵 내에 편재된 것으로 나타났다. 이러한 세포 구획 내 작은 반점 형태의 형광은 DNA자임의 서열과 무관하였다. 형광은 비록 낮은 강도이기는 하지만 세포질 내에서도 관찰되었다. DNA자임에 노출되지 않은 배양물은 자가형광을 나타내지 않았다.

두 분자의 5'-말단을 γ³²P-αATP로 표지하고, 배양배지 내에서 배양하여 ED5 및 ED5SCR에 대한 세포의 반응성이 DNA자임의 안정성에 있어서의 차이에 의한 것인지의 여부를 확인하였다.³²P-ED5와³²P-ED5SCR 모두 48시간 후에도 온전한 상태로 남아있었다. 3' 역위 T를 함유하는³²P-ED5와는 달리, 정방향의 3' T를 함유하는³²P-ED5의 변성은 1시간 일찍 관찰되었다. 무혈청 배지에 노출시켰음에도, 심지어 48시간 후에도 분자가 분해되지 않았다. 이러한 결과는 DNA자임 내의 3' 염기의 역방향 배향이 혈청 내 성분에 의한 핵산 가수분해성 절단으로부터 분자를 보호함을 시사한다.

배양물 내 SMC에 가해진 물리적 외상은 상처 가장자리로부터 바깥쪽으로 전이되었으며 노출된 영역에서의 증식으로 이어졌다. 본 발명자들은 스크랩핑 전, 증식 억제인자인 DNA자임 또는 미토마이신 C에 성장-정지된 SMC를 노출시킴으로써 ED5가 손상에 대한 이러한 반응을 조절할 수 있는지의 여부를 확인하였다(Pitsch 외, 1996; Horodyski & Powell, 1996). DNA자임이 존재하지 않는 배양주는 3일 이내에 노출된 전영역을 재증식시켰다. ED5는 6일 후에도 이 영역 내에서 손상에 대한 이러한 회복 반응을 억제하고 부가의 성장을 방해하였다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 시스템 내에서 ED5SCR의 효과가 전혀 업었다는 사실은 ED5에 의한 서열 특이적 억제를 한층 더 입증한다.

신생 혈관내막 형성에 대한 ED5의 효과를 래트 모델에서 조사하였다. 분기에 가까운 오른쪽 총경동맥을 완전 결찰한 결과, 배지 유래의 SMC가 혈관내막으로 전이되어, 그 곳에서 증식해 신생 혈관내막을 형성하였다(Kumar & Lindner, 1997; Bhawan 외, 1977; Buck, 1961). 결찰 뒤 18일 후, ED5에 의해 혈관내막의 두터워짐이 50% 억제되었다(도 9). 반면, 스크램블드 대응물(도 9)과 부형제 대조군(도 9) 중 어느 것도 신생 혈관내막의 형성에 영향을 주지 않았다. 이러한 결과는 혈관 내강 내 SMC의 축적을 특정한 방식으로 억제하는 ED5의 능력을 입증하고, "질량 효과"에 대한 단순한 결과로서 억제를 반증한다(Kitze 외, 1998; Tharlow 외, 1996). ED5에 의한 혈관내막의 두꺼워짐 및 유도성 NGFI-A 단백질 발현의 서열 특이성 억제는 래트의 대동맥 풍선 손상 모델에서도 관찰되었다(Santiago 외, 1999a).

추가의 실험을 통해 (인간) EGR-1 RNA를 절단하는 hED5의 능력을 확인하였다. hED5는 광범위한 화학량론적 비율에 걸쳐 용량-의존적 방식으로 그들의 기질을 절단하였다. 또한, hED5는 시간-의존적 방식으로 절단하는 반면, 이것의 스크램블드 대응물인 hED5SCR은 이러한 촉매성을 갖지 못했다(데이터는 나타내지 않음).

본 명세서에 제시된 안티센스 EGR-1의 특이적인 성장 억제 특성은 EGR-1 억제인자가 부적합한 SMC 성장(과 관련된 혈관 질환의 치료에 있어 치료 도구로서 유용할 수 있음을 시사한다.

실시예 3

악성 세포의 억장을 억제하는 DNA자임의 용도

재료 및 방법

HepG2 세포를 항생체가 강화된 10%의 태아 소의 혈청을 함유하는 DMEN(pH 7.4) 내에서 일상적으로 배양하였다. 세포에 트립신을 처리하고, 성장 배지 내에서 (10,000 세포/200 ㎕로) 재현탁하고, 200 ㎕를 살균된 96웰 적정 플레이트로 옮겼다. 2일 후, 180 ㎕의 배양 상청액을 제거하고, 세포를 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 180 ㎕의 무혈청 배지를 재공급하였다. 6시간 뒤, 1:3(㎍/㎕)의 비율로 FuGENE6을 이용하여 무혈청 배지를 함유하는 시험관 내에서 DNA자임을 1차 트랜스펙션시켰다(2 ㎍/200 ㎕ 월, 0.75 μM 최종 농도). 실온에서 15분간 배양한 후, 180 ㎕의 배지 상청액을 180 ㎕의 트랜스펙션 혼합물로 교체하였다. 24시간 후, 180 ㎕의 배지 상청액을 5% FBS 배지 내의 180 ㎕의 새로운 트랜스펙션 혼합물로 교체하였다. 3일 후, 세포를 PBS(poH 7.4)로 세척하고 100 ㎕의 트립신-EDTA 내에서 트립신을 처리하여 재현탁하였다. 세포를 대략 5분간 교반하여 세포를 현탁시켰다. 전체 현탁물을 10 ㎖의 Isoton Ⅱ에 넣었다. 피펫을 이용하여 Isoton Ⅱ 용액을 시험관으로부터 웰에 수회 첨가하여 모든 세포를 옮겼다. Isoton Ⅱ만을 이용하여 바탕 세포의 개수를 결정하였다. 각 샘플을 3회 계수하고, 평균수 및 각 평균의 표준 오차를 산출하는 데 사용하였다.

결과 및 결론

본 발명의 결과들은 혈청이 3일 후 HepG2 세포의 증식을 자극함을 시사한다(도 10). 증식은 인간 EGR-1 mRNA를 표적화하는 DNA자임(nt 189-207와 혼성화되는 아암)인 DzA(5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO: 3), 대문자는 촉매 모이어티임) 0.75 μM에 의해 거의 완전하게 억제되었다(도 10). 반면, HepG2 세포 성장은 ED5SCR에 의해 억제되지 않았다(도 10). 웨스턴 블롯 분석 결과, DzA는 HepG2 세포 내에서 EGR-1의 발현을 강하게 억제한 반면, 상이한 서열(5'-tcagctgcaGGCTAGCTACAACGActcggcctt)(SEQ ID NO: 24)을 가지는 크기가 일치하는 DNA자임은 전혀 효과가 없었다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 데이터는 이런 모델의 인간 악성 세포주의 유도성 증식이 EGR-1 DNA자임에 의해 차단될 수 있음을 시사한다. 이런 연구 결과들은 EGR 억제인자가 인간 암을 표적화하는 치료책으로서 임상적으로 유용할 수 있음을 시사한다.

당업자는 광범위하게 기재된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 특정한 구현예에서 제시된 바와 같이 본 발명이 다양하게 변경 및/또는 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 구현예는 설명을 위한 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 또한, 본 출원 전반에는 다양한 문헌이 인용되었는데, 이러한 문헌의 내용은 당 기술분야의 상황을 보다 상세하게 설명하기 위하여 본 발명에 참고로 인용되었다.

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Claims (25)

1. 종양의 치료를 필요로 하는 대상에게 EGR(Early growth response factor; 초기 성장반응 인자)의 유도를 억제하는 제제, EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 종양의 치료 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 제제가 혈관형성을 억제하는 종양의 치료 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 제제가 종양 세포의 증식을 직접적으로 억제하는 종양의 치료 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 종양이 고형 종양인 종양의 치료 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 EGR이 EGR-1인 종양의 치료 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 EGR의 발현이 감소되는 종양의 치료 방법.
7. 제6항에 있어서,

   상기 EGR의 발현이 EGR 안티센스 올리고뉴크레오타이드의 사용에 의하여 감소되는 종양의 치료 방법.
8. 제7항에 있어서,

   상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 종양의 치료 방법:

   (i) ACA CTT TTG TCT GCT(SEQ ID NO: 4) 및

   (ⅱ) CTT GGC CGC TGC CAT(SEQ ID NO: 2).
9. 제6항에 있어서,

   상기 EGR의 발현이 서열-특이성 리보자임에 의한 EGR mRNA의 절단에 의하여 감소되는 종양의 치료 방법.
10. 제6항에 있어서,

    상기 EGR의 발현이 EGR dsDNA에 대하여 표적화되는 ssDNA의 사용에 의하여 감소되고, 상기 ssDNA는 상기 dsDNA와 함께 3중 나선을 형성하도록 선택되는 종양의 치료 방법.
11. 제6항에 있어서,

    상기 EGR의 발현이 핵산 전사 유인체(decoy)를 이용한 EGR 유전자의 전사 억제에 의하여 감소되는 종양의 치료 방법.
12. 제6항에 있어서,

    상기 EGR의 발현이 안티센스 EGR mRNA의 발현에 의하여 감소되는 종양의 치료 방법.
13. 제6항에 있어서,

    상기 EGR의 발현이 서열-특이성 DNA자임에 의한 EGR mRNA의 절단에 의하여 감소되는 종양의 치료 방법.
14. 제13항에 있어서,

    상기 DNA자임이

    (ⅰ) 퓨린:피리미딘 절단 자리에서 mRNA를 절단하는 촉매 도메인;

    (ⅱ) 상기 촉매 도메인의 5' 말단과 인접한 제1 결합 도메인; 및

    (ⅲ) 상기 촉매 도메인의 3' 말단과 인접한 제2 결합 도메인

    을 포함하고, 상기 결합 도메인은 DNA자임이 EGR mRNA를 절단하는 SEQ ID NO: 15에 나타낸 뉴클레오타이드 168-332에 해당하는 EGR mRNA 부위 내의 퓨린:피리미딘 절단 자리의 바로 옆에 위치하는 두 부위와 충분히 상보적인 종양의 치료 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서,

    상기 촉매 도메인이 뉴클레오타이드 서열 GGCTAGCTACAACGA를 가지는 종양의 치료 방법.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 절단 자리가 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양의 치료 방법:

    (ⅰ) 뉴클레오타이드 198-199에 해당하는 GU 자리;

    (ⅱ) 뉴클레오타이드 200-201에 해당하는 GU 자리;

    (ⅲ) 뉴클레오타이드 264-265에 해당하는 GU 자리;

    (ⅳ) 뉴클레오타이드 271-272에 해당하는 AU 자리;

    (ⅴ) 뉴클레오타이드 301-302에 해당하는 AU 자리;

    (ⅵ) 뉴클레오타이드 303-304에 해당하는 GU 자리; 및

    (ⅶ) 뉴클레오타이드 316-317에 해당하는 AU 자리.
17. 제16항에 있어서,

    상기 절단 자리가 뉴클레오타이드 198-199에 해당하는 GU 자리, 뉴클레오타이드 271-272에 해당하는 AU 자리, 또는 뉴클레오타이드 301-302에 해당하는 AU 자리인 종양의 치료 방법.
18. 제16항에 있어서,

    상기 DNA자임이 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양의 치료 방법:

    (i) 5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO: 3);

    (ⅱ) 5'-tgcaggggaGGCTAGCTACAACGAaccgttgcg(SEQ ID NO: 6);

    (ⅲ) 5'-catcctggaGGCTAGCTACAACGAgagcaggct(SEQ ED NO: 7);

    (ⅳ) 5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO: 8);

    (v) 5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt(SEQ ID NO: 9);

    (ⅵ) 5'-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat(SEQ ID NO: 10);

    (ⅶ) 5'-cagcggggaGGCTAGCTACAACGAatcagctgc(SEQ ID NO: 11); 및

    (ⅷ) 5'-ggtcagagaGGCTAGCTACAACGActgcagcgg(SEQ ID NO: 12).
19. 제18항에 있어서,

    상기 DNA자임이 5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO: 3) 또는

    5'-gcggggacaGGCTAGCTACAAGGAcagctgcat(SEQ ID NO: 10) 서열을 가지는 종양의 치료 방법.
20. 제18항에 있어서,

    상기 DNA자임이 5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO: 8) 또는

    5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt(SEQ ID NO: 9) 서열을 가지는 종양의 치료 방법.
21. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 DNA자임의 3'-말단 뉴클레오타이드 잔기가 상기 촉매 도메인의 3'-말단과 접하는 결합 도메인 내에서 역위되는 종양의 치료 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,

    1종 이상의 부가의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양의 치료 방법.
23. EGR의 유도를 억제하는 제제, EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제와 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 종양 세포의 성장 또는 증식 억제 방법.
24. (ⅰ) EGR의 유도를 억제하는 제제, (ⅱ) EGR의 발현을 감소시키는 제제, 또는 (ⅲ) EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 제제를 포함하거나 코딩하는 핵산 분자를 세포 내에 도입하여 형질전환시킨 종양 세포.
25. EGR의 유발을 억제하거나, EGR의 발현을 감소시키거나, EGR의 핵 축적 또는 활성을 감소시키는 능력에 대해 추정되는 제제를 테스트하는 단계를 포함하는 혈관형성 억제제의 선별 방법.