KR20020067308A - 심근 트로포닌 ｉ 및 ｔ를 심근 표지자로 하는 동맥경화성심장질환 진단방법, 진단용 키트 및 진단용 분석장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 심근 트로포닌 I 와 T를 심근 표지자로 하는 동맥경화성 심장질환 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 심근 트로포닌 I 와 T를 특이적으로 인식하는 각각의 단일클론 항체의 한 모듬을 표지자로 하여 동맥경화성 심장 질환을 진단하는 방법 및 진단 키트에 관한 것이다. 상기 본 발명의 구성에 의하면 심장질환의 예후관리는 물론 특이성을 높일 수 있어 동맥경화성 심장질환을 정확하게 진단할 수 있다.

Description

심근 트로포닌 Ｉ 및 Ｔ를 심근 표지자로 하는 동맥경화성 심장질환 진단방법, 진단용 키트 및 진단용 분석장치{Diagnostic Method of Arteriosclerotic Heart-related Disease Such as Myocardial Infarction and Stenocardie Using Troponin I and T As an Marker, and Diagnostic kit and Analyzer Thereby}

본 발명은 심근 트로포닌 I 및 T를 심근 표지자로 하는 동맥경화성 심장질환 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 심근 트로포닌 I 와 T를 특이적으로 인식하는 각각의 단일클론 항체를 포함하는 동맥경화성 심장 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

심장질환을 갖고 있는 사람이거나 또는 그렇지 않은 사람인 경우에도, 심장질환에서 느끼는 가장 큰 두려움은 급사 즉 돌연사이다. 심장병의 유무와 상관없이 평소 건강하던 사람들에게 증상 발생 후 1시간 내에 예기치 않은 사망에 이르게 하는 돌연사는, 동맥경화성 심장질환인 협심증과 심근경색이 그 주원인이다. 동맥경화증이 있는 혈관은 정상적인 혈관과는 다르게 탄력을 상실하고, 오랜 시간에 걸쳐서 혈관 내경이 점점 좁아지게 된다. 따라서 그 혈관을 통해서 산소 및 영양분을 공급받고 있는 특정 장기는 충분한 혈류 공급이 이루어지지 않는 빈혈 상태에 놓이게 된다. 관상동맥에 동맥경화증이 발생하여 혈관이 좁아지거나 막혀서 심장근육에 빈혈이 생기는 경우를 협심증, 심근경색증이라고 한다. 상기 두 가지 질환이 관상동맥질환의 대표적인 것으로 볼 수 있으며, 심근경색증의 경우는 돌연사의 중요한 원인 질환이 된다.

협심증과 심근경색증의 발생 빈도는 1983년과 비교하여 현재 6배 이상 증가하였다.

한편, 40대 돌연사의 중요한 원인이 되는 협심증과 심근경색증은 1950년대 이후 지금까지 구미에서는 가장 흔한 사망원인이다. 아직도 미국에서는 연간 30만명이 넘는 사람이 심장마비로 돌연사하는 것으로 보고되어 있으며, 우리나라의 경우 심장병은 이미 사망률 3위에 올라와 있어 정확한 통계자료는 없으나 인구 비례로 볼 때 1년에 4만명 정도가 돌연사하는 것으로 추정된다.

최근까지 심장질환이 있는 환자를 진단하는 생화학적 표지자(Biochemical Marker)로서, 트로포닌 I(TnI), 트로포닌 T(TnT), 젖산 탈수소분해효소(LDH), 크레아틴키나제(CK), 크레아틴 키나제 동질효소(CK-MB), 그리고 미오글로빈(Myoglobin)등을 사용하여 왔다.

상기 젖산 탈수소분해효소는 인체의 모든 근육에 존재하며, 심근 경색 후기에 상승하게 되므로, 특이성 및 예민도가 낮아 진단에 크게 도움이 되지 않는다.

크레아틴 키나제는 모든 근육에서 발견되기 때문에 심장근육에 대하여 특이성이 없고, 근육손상, 외상, 뇌손상 등 여러 가지 요인에 의해서 상승한다..

미오글로빈은 다른 근육 손상 시에도 그 농도가 상승하여, 심장 근육에 대한 특이성이 매우 낮다.

크레아틴 키나제 동질효소는 심근 경색의 생화학적 표지자로서 현재까지 가장 보편적으로 사용되고 있으나, 경색의 급성기에 매우 빨리 그 농도가 변하기 때문에 수회 측정하여야 하고, 측정된 CK-MB 양을 복잡한 수학적 공식을 통해 얻어야 하며, 경색 24시간 경과한 후에 내원한 경우 경색의 크기와의 상관성이 떨어지고, 재관류(reperfusion) 여부에 따라 매우 다른 양상을 나타낸다는 단점이 있다.

상기한 심장질환의 생화학적 표지자들은 공통적으로 질환에 따른 측정치의 변이가 심하고, 심근 손상 정도와의 상관 관계가 낮으며, 경색이 아닌 고 위험군의 불안정성 협심증과 같은 미세 심근 손상의 경우에는 예민도가 낮아 진단적 가치가 낮다.

한편, 최근에는 심장질환의 생화학적 표지자로서 트로포닌 I 또는 T를 각각 이용하는 경우가 있다. 트로포닌 I는 일반 골격근에서는 발견이 되지 않고, 성인의 심근에만 존재하므로 심근 손상 이외에 크레아틴 키나제 동질효소(CK-MB)가 증가되어 있을 수 있는 상황에서는 혈중에서 검출되지 않아 심근 손상에 매우 특이하며, 심근 경색 크기와도 연관성을 나타낸다.

한편, 상기 트로포닌 T는 심근 손상이 있을 때 지속적으로 혈중으로 유리되어 그 농도가 증가된다. 심장질환 후 24시간 이내에 최고값을 보이고, 9일 이상 계속하여 최고값 이상으로 존재하기 때문에 크레아틴 키나제, 크레아틴 키나제 동질효소보다 진단 시간대가 넓어 높은 예민도 및 특이도를 가지므로 심근 경색증의 초기 및 이후 진단에 유용하고 경색 크기의 추정에도 유리하다.

하지만 트로포닌 T는 95%가 심근에 존재하고, 나머지 5% 는 세포질에 존재하여 오진의 원인이 되고 있으며, 트로포닌 I는 99% 이상이 심근에 존재하여 그 특이성이 인정되나 상대적으로 불안정하고 유리 농도가 정상치로 돌아오는 회귀시간이 트로포닌 T에 비해 짧아 그 측정이 용이하지 않은 단점이 있다.

본 발명자들은 상기한 종래의 심장 질환의 진단의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력하였고, 이에 본 발명에서는 두 종류의 트로포닌을 동시에 사용하여 서로의 단점을 상호 보완하고자 하였다. 즉, 오진 가능성이 있는 트로포닌 T의 단점을 특이성이 높은 트로포닌 I를 측정함으로써 보완하고, 회귀 시간이 짧은 트로포닌 I의 단점을 회귀시간이 긴 트로포닌 T를 측정함으로써 보완하여 내원 시간에 관계없이 정확한 진단이 가능하도록 한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 심근 트로포닌 I 및 T에 대한 각각의 단일클론항체를 한 모듬으로 하여 항원항체의 면역반응을 이용한 동맥경화성 심장질환에 특이적인 신규한 진단방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트로포닌 I 및 트로포닌 T에 대한 단일클론 항체를 한 모듬으로 포함하는 동맥경화성 심장질환 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 트로포닌 I 및 트로포닌 T에 대한 단일클론 항체를 한 모듬으로 포함하는 동맥경화성 심장질환 진단용 분석장치를 제공하는데 있다.

도 1은 시간함수에 따른 트로포닌-I의 농도를 측정한 결과이다.

도 2는 시간 함수에 따른 트로포닌-T의 농도를 측정한 결과이다.

도 3은 시간 함수에 따른 트로포닌-I에 대한 진단적 예민도를 나타낸 그래프이다.

도 4는 시간 함수에 따른 트로포닌-T에 대한 진단적 예민도를 나타낸 그래프이다.

도 5는 트로포닌 I와 T에 대하여 모두 양성 반응(True Positive)을 띠었을 때의 진단적 예민도를 나타낸 그래프이다.

도 6은 비 심장 질환자와 심장 질환자의 트로포닌 I 및 T에 대한 임상적 특이도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 심근 트로포닌 I 및 T에 대한 단일클론항체를 한 모듬으로 하여 항원항체의 면역반응을 이용한 동맥경화성 심장질환에 특이적인 진단방법을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다:

본 발명에 사용되는 2종의 단일클론 항체는 각각 심근 트로포닌 I 및 T 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 본 명세서에서 용어 "특이적으로 인식"은 선행 기술에 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적 상호 작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

본 발명에 사용 가능한 상기 각각의 단일클론 항체는 심근 트로포닌 I 와 T를 적합한 동물(예를 들면 Balb/C mouse, 6주령을 포함한다)에 투여한 후 면역반응을 유발하여 대량의 항체 생성 B 림프구를 얻는 단계와, 상기 단계에서 얻어진 B 림프구가 대량 함유되어 있는 비장 세포와 통상적으로 선행 기술에서 이용되는 마이엘로마 세포를 융합시키는 단계와, 상기 융합단계를 거친 세포를 대상으로 HAT 선택 배지를 이용해 융합 세포를 분리하고, 단일 클론을 얻기 위해 제한 희석(Limiting Dilution)하는 단계를 거쳐 얻는 것이 가능하다.

상기 방법에 따라 수득한 단일 클론 항체 중 가장 적합한 융합 세포주, 즉 심근 트로포닌 I 와 T 단백질에 대해 가장 큰 민감성 및 특이성을 나타내는 세포주를 선별하기 위한 방법으로는 ELISA를 포함하는 다양한 면역학적 방법이 적용 가능하다.

또한 본 발명의 단일 클론 항체를 이용하여 혈액 시료 내의 트로포닌 I 와 T 단백질의 양을 측정하는 경우에는 ELISA를 포함하는 다양한 면역학적 반응을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 단일 클론 항체 모듬은 심근 트로포닌 I 또는 T에 대해서만특이적으로 반응하고 또한 트로포닌 I 및 트로포닌 T를 동시에 측정하므로 질병의 예후관리가 가능하고, 특이성을 높일 수 있어 동맥경화성 심장 질환을 정확하게 진단할 수 있다.

본 발명의 단일 클론 항체를 이용하여 진단 할 수 있는 심장 질환은 바람직하게는 협심증 및 심근 경색이 있다. 환자의 혈액에서 심근 손상의 트로포닌 I와 T의 존재를 검출하여, 환자가 불안정성 협심증으로 고통을 받고 있는지 여부 또는 심근 경색증이 일어나는지 여부를 결정할 수 있다. 심근경색의 초기 검출은 초기 단계에서만 가능한 혈전 용해 치료법을 가능하게 하며, 따라서, 심근 손상은 최소화할 것이고 환자의 생존기회는 증가될 것이다. 또한, 본 발명의 시험 결과는 흉통이 발현된 다음 며칠 후까지도 불안정성 협심증과 심근 경색증에서 판별될 수 있음을 보여준다.

본 발명은 상기와 같이 심근 트로포닌 I 및 트로포닌 T에 대해 특이적으로 반응하는 2종의 항체를 포함하며 공지의 제조방법에 따라 제조 가능한 항원 진단용 키트 및 분석 장치를 포함한다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 하나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 한정하지는 아니한다.

<실시예 1> 심근 트로포닌 I와 T 각각에 대한 융합세포주의 제조

6주령 Balb/C 마우스(female, 샘타코)를 10마리 준비하고 면역화에 앞서 하기와 같이 사전준비를 수행하였다. 두 개의 1ml 주사기에 500ul의 CFA (complete freunds adjuvant, Sigma or Difco)을 넣고, 다른 두 개의 주사기에 항원 (Troponin I, T, Roche)을 각각 넣고, CFA와 트로포닌 I, CFA와 트로포닌 T를 3-way에 각각 연결시켜 섞어준 후 200ul/mouse 씩 각각 주사하였다. 2차 면역화는 4주 후에 1차와 동일한 방법으로 시행하나 CFA 대신 IFA (incomplete freunds adjuvant, Sigme or Difco)를 사용하였다. 3차 면역화는 4주 후에 2차와 동일한 방법으로 시행하나 IFA 대신 PBS(no adjuvant, just in PBS, SIGMA)를 사용하였다. 4차 면역화는 4주 후에 3차와 동일하게 시행하고 3일 후에 비장을 분리하였다.

비장은 경추 탈골에 의해 각각의 마우스를 마취시킨 다음 전신, 특히 복부를 70% 에탄올로 잘 닦고 무균대에 고정시킨 후, 복부를 절개하고 조심스럽게 적출하고, 워시미디어(DMEM media 100ml, Gibco BRL + 1M HEPES 1ml Gibco BRL) 10 ml가 담긴 배양 접시(falcon)에 넣고 흔들어 세척하고 다시 새로운 워시미디어에서 세척하기를 4회 반복하였다.

다음으로 멸균망 위에 세척된 비장을 놓고 워시미디어를 방울 방울 떨어뜨리면서 핀셋으로 눌러 세포 현탁액을 만든 다음 2.5 ml의 피탈보바인시럼(Gibco BRL)이 들어 있는 멸균관에 넣고 섞은 후 10분간 방치하였다.

방치결과 형성된 상층액을 새로운 혈청에 넣고 원심분리 한 후 세포 침전물을 NH₄Cl에 현탁시킨 다음 다시 혈청과 섞은 후 원심분리하여 침전물만 모아 워시미디어로 2회 세척하였다.

상기 침전물을 워시미디어에 현탁시켜 세포 수를 측정하고 융합을 실시하였다. 미리 HAT 선택배지(Gibco BRL)에 키운 마이엘로마세포(SP2/0-Ag14)와 상기에서 얻은 각각의 세포 현탁액을 1:8의 비율로 섞어 일반적인 방법으로 융합시킨 후 HAT 선택배지(Gibco BRL)에서 하룻밤 배양하였다.

1회/1일의 비율로 배지를 신선하게 바꿔주고 2주간 배양한 후 96 웰에 제한 희석(limiting dilution)을 수행하여 각각의 단일 융합 세포를 얻는 선별 작업을 실시하였다.

<실시예 2> 심근 트로포닌 I와 T 각각에 대한 단일 클론항체를 생산하는 융합 세포주의 선별

96 웰 플레이트에 미리 두 종류의 항원(트로포닌 I 및 T)을 입힌 다음 수득한 두 종류의 융합 세포주(트로포닌 I 및 T 각각에 대한) 배양액을 50 ul/well 씩 넣고 2차 항원(Pierce)과 기질용액(OPD 0.4㎎, Sigma + 30% H₂O₂0.5㎕/㎖ in citrate-phosphate buffer)를 각각 순서대로 50 ul/well 씩 넣은 다음 1N 황산 용액으로 반응을 종결시켰다. 다음으로 ELISA 리더(Emax, Molecular devices)를 사용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하여 1차적으로 흡광도가 1이상인 세포주를 선별하고, 이들 1차 선발한 융합세포주를 대상으로 동일하게 2차선별실험을 수행한 결과 하기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 흡광도가 1.35로 가장 높은 융합 세포주 MST-B642를 최종적으로 선택하였다.

<표 1> 융합 세포주 선별 실험 결과

세포주	MST-B101	MST-B116	MST-B241	MST-B509	MST-B642	MST-B635	MST-B794	MST-B910
흡광도(492 nm)	0.94	0.85	1.13	1.02	1.35	1.21	1.05	1.13

<실시예 3> 선별된 융합 세포주로부터 단일 클론 항체의 제조 및 분리·정제

면역화 하기 3∼14일 전에 IFA 500 ul/mouse를 복강 내 주사하였다. 실시예 2에 의해 수득한 우수 융합세포주(트로포닌 I 및 T 각각에 대한)를 각각 인산염 완충 용액에 현탁시켜 600 ul/mouse 씩 다른 마우스에 각각 복강 내 주사하였다.

9∼14일 후 각각의 마우스를 경추 탈골 시켜 마취시킨 다음 전신, 특히 복부를 70% 에탄올로 잘 닦고 무균대에 고정시키고 복수를 채취하였다. 채취한 복수는 일반적인 방법으로 처리하여 사용하고, 나머지는 냉동 보관하였다. 채취한 복수를 Protein A column (Pierce)을 통과시켜 분리·정제·농축시킨 다음 UV-vis spectrophotometer(SHIMADZU)를 이용하여 정량한 후 상기한 방법으로 ELISA를 실시하여 역가를 결정하고, 냉장 보관하였다.

<실시예 4> 분리·정제 된 단일 클론 항체를 사용한 진단용 키트(strip)의 제조

진단용 키트(strip)는 랩인어박스패키지(Lab in a Box package, British BioCell international, Kinematic Automation)를 이용하였고, 스트립 제작에 필요한 멤브레인과 패드 등은 밀리포어(Milipore)사 제품을 사용하였다.

제작 단계는 공지의 제조방법에 따라 다음과 같이 진행하였다.

(1) 멤브레인 절단 (Kinematic Matrix 1201 Lapped Membrane cutter, Kinematic automation)

(2) 패드고정 (Kinematic Matrix 2210 Universal Laminator Module, Kinematic Automation)

(3) 항체고정 (Kinematic Matrix 1600 reagent Dispensing Module, Kinematic Automation)

(4) 진공 건조 (Kinematic Automation)

(5) 케이스 조립 (BBI Closure Machine, British BioCell International)

(6) 포장 (Pouch Sealer, Kinematic Automation)

<시험예> 인-하우스 테스트(in-house test)를 통한 임상 진단실험

인-하우스 테스트는 서울 대학 병원에 입원 혹은 통원 치료 중인 협심증, 심근 경색증 환자 100명과 비심장질환자 100명을 대상으로 하여 실시하였고, 진단에는 96 웰 플레이트를 이용한 ELISA 방법이 적용되었다.

먼저 내원 환자 및 입원 환자의 혈액을 채취한 다음 헤파린 처리하여 냉장 혹은 냉동보관 하였다. 상기 혈액을 96 웰 플레이트에 50 ul씩 분주하여 입힌 후, 상기 실시예 3에 따라 수득한 단일 클론항체를 50 ul씩 넣어 상기한 방법으로 ELISA를 수행하였다. 이때 사용파장은 492nm이었고, 3회 반복 실험하였다. 실험의편차는 ±1.5 % 이었다.

상기 방법에 따른 실험결과는 첨부하는 도면에 게시한 바와 같으며 이하 이를 참조하여 설명하기로 한다.

도 1은 시간함수에 따른 트로포닌-I의 농도를 측정한 결과이다.

트로포닌-I는 발병 후 6시간부터 분비되기 시작하여 12시간에 최고의 농도를 기록한 후 24시간 후에는 그 농도가 급격히 감소하여 2ng/ml 수준에 이르는 것으로 나타났다. 이 농도는 시판되고 있는 진단 키트의 차단 값(cutoff value)에 해당하는 값으로 정확한 진단이 불가능할 수 있는 농도이다. 피크의 형태를 살펴 본 결과, 피크의 형태가 매우 날카로워 항원에 대한 예민도가 매우 높음을 알 수 있었고, 유리 농도가 10 ng/ml 이상 다량 발견되어서 심장 내 골격근 상해를 검출하는 데에 있어서 가장 민감한 표지자임을 확인할 수 있었다.

도 2는 시간 함수에 따른 트로포닌-T의 농도를 측정한 결과이다.

트로포닌-T는 발병 후 6시간부터 분비되기 시작하여 48시간 후에 최고의 농도를 기록하고 완만하게 그 농도가 감소하여 발병 5일 후에도 상당히 높은 농도를 유지하고 있어 예후 관리에 매우 유용함을 확인할 수 있었다.

도 3은 시간 함수에 따른 트로포닌-I에 대한 진단적 예민도를 나타낸 그래프이다. 상기 결과에 의하면 트로포닌-I에 대해서는 발병 4시간 후부터 4일까지 진단적 예민도가 100% 임을 확인할 수 있었다.

도 4는 시간 함수에 따른 트로포닌-T에 대한 진단적 예민도를 나타낸 그래프이다. 심근 트로포닌-T는 발병 후 1일부터 6일까지 임상적 예민도가 상승된 상태로 유지되고 진단적 예민도가 100% 임을 확인할 수 있었다.

도 5는 트로포닌 I와 T에 대하여 모두 양성 반응(True Positive)을 나타냈을 때의 진단적 예민도를 나타낸 그래프이다. 심근 트로포닌 I와 T를 동시에 사용하였을 경우에도 발병 후 6시간부터 7일까지 임상적인 예민도가 100% 임을 확인할 수 있었다.

도 6은 비 심장 질환자와 심장 질환자의 트로포닌 I 및 T에 대한 임상적 특이도를 나타낸 그래프이다.

비 심장 질환자에 대한 임상적 특이도는 시간에 관계없이 5% 미만의 낮은 수준을 나타냈으며, 트로포닌 T에 대하여 양성 반응을 나타내고 트로포닌 I에 대해서 음성 반응을 나타냈을 때는 환자가 심각한 골수 손상 환자이거나 신장병 환자라는 것을 용이하게 추측할 수 있다. 신장병 환자의 경우 병의 중기 이후에 당뇨병이나 고혈압 등의 합병증을 일으킬 수 있는데, 이런 경우에 트로포닌 T에 양성을 나타내고, 트로포닌 I에 음성을 나타낸다는 보고가 있다.

심장 질환자의 경우에는 트로포닌 I와 T 모두에 대해 매우 높은 감수성을 나타냈다.

이로 인하여 트로포닌 I와 T를 동시에 측정하였을 경우에 진단적인 예민도와 특이도가 기존의 방법 또는 용구 및 시약보다 우수함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 심근 트로포닌 I 및 T에 대하여 민감성이 높을 뿐만 아니라, 특이성이 높은 단일 클론 항체를 적용함으로써 혈액 시료 내의 심근 트로포닌 I 및 T의 농도를 정확하게 측정할 수 있고, 이를 통해 심근 경색 및 협심증과 같은 심장 질환의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (4)

1. 심근 트로포닌 I 및 T에 대한 단일클론항체를 한 모듬으로 하여 표지자로 하고, 항원항체의 면역반응을 통해 혈액 중에 존재하는 트로포닌 I 및 T의 농도를 측정함을 특징으로 하는 동맥경화성 심장질환의 진단방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 동맥경화성 심장질환은 협심증 또는 심근경색증을 포함함을 특징으로 하는 동맥경화성 심장질환의 진단방법.
3. 공지의 동맥경화성 심장질환 진단용 키트에 있어서, 심근 트로포닌 I 및 T에 대한 단일클론항체의 한 모듬을 면역반응을 수행하기 위한 표지자로 포함함을 특징으로 하는 동맥경화성 심장질환 진단용 키트.
4. 공지의 동맥경화성 심장질환 진단용 분석장치에 있어서, 심근 트로포닌 I 및 T에 대한 단일클론항체의 한 모듬을 면역반응을 수행하기 위한 표지자로 포함함을 특징으로 하는 동맥경화성 심장질환 진단용 분석장치.