KR20020065537A - 신규한 ｈｃｖ 비구조 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

진단 및/또는 면역원성 조성물에 유용한 돌연변이 비구조 간염 C 바이러스를 포함하는 폴리펩티드가 개시되고, 여기에서 돌연변이는 NS3 의 촉매 도메인을 기능적으로 파괴시키는 N-말단 돌연변이이다. 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포 및 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법이 또한 개시된다.

Description

신규한 ＨＣＶ 비구조 폴리펩티드{NOVEL HCV NON-STRUCTURAL POLYPEPTIDE}

현재 HCV 는 전세계적으로 만성 간염 및 간질환의 주요 병원체로 인식된다. HCV 는 세계 인구의 3% 이상에 해당하는, 전세계적으로 약 4 억 인구를 감염시키는 것으로 추정된다.

간염 C 바이러스("HCV")는 약 10 킬로베이스의 양성-가닥 RNA 게놈을 함유하는, 작은 외피로 쌓인 RNA 플라비바이러스(flavivirus)이다. 게놈은 3010-3011 아미노산의 단백질을 코딩하는 단일의 비간섭 ORF 을 가진다. HCV의 구조 단백질은 고면역성인 코어 단백질(C)뿐만 아니라, 생체내에서 이형이량체를 형성하는 것으로 추정되는 2 개의 외피 단백질(E1 및 E2), 및 비구조 단백질 NS2-NS5를 포함한다. 바이러스의 NS3 영역은 각각의 단백질로의 다단백질의 번역후 프로세싱에 중요하고, NS5 영역은 RNA-의존속 RNA 폴리머라제를 코딩한다는 것이 알려진다.

중성화 항체와 함께 바이러스-특이적 T 림프구가 확립된 바이러스 감염에서 항바이러스 면역 방어의 메인스테이(mainstay)이다. CD8⁺세포독성 T 세포가 바이러스 감염 세포를 제거하는 반면에, CD4⁺T 헬퍼 세포는 항바이러스 면역 반응의 효율적인 조절에 필수적이다. CD4⁺T 헬퍼 세포는 자기유래의 HLA 클래스 II 분자에 결합한 펩티드로서 특이적 항원을 인식한다( 바이러스 항원 또는 입자는 전문적인 항원-제시 세포에 의해 섭취되고, 펩티드로 프로세싱되고, 리소좀 구획에서 HLA 클래스 II 분자에 결합되고, 세포 표면에 다시 수송된다). 몇몇의 관찰은 HCV 감염을 제거하는 데 있어서의 CD4⁺T세포의 중요한 역할을 증명한다. Tsai et al., 1997 Hepatology 25 : 449-458 ; Diepolder et al 1995 Lancet 346 : 1-6-1009 ; Missale et al 1996 JCI 98 : 706-714 ; Botarelli et al 1993 ; Gastro 104 : 580-587 ; Diepolder et al 1997 J. Virol 71 : 6011. 면역원성 펩티드는 일반적으로 최소 길이의 8-11 개의 아미노산을 가진다. 그러나, HLA 클래스 II 분자의 펩티드 결합 그루브가 양 말단이 개방되어 있기 때문에, 더욱 긴 펩티드가 관용화된다. 그러므로, HLA 클래스 II 로부터 추출된 펩티드는 전형적으로 15-25 아미노산의 범위이다. HLA 클래스 II 분자는 매우 다형성이고, 각 대립유전자가 펩티드 결합에의 각각의 필요성을 가지는 것 같다. 그러므로, 허여된 개체의 HLA 클래스 II 레파토리는 어떤 바이러스 펩티드가 T 세포에 제시될 수 있는지를 결정한다. T 세포 수용체에 의한 특이적 HLA-펩티드 복합체의 인식은 T세포 활성, 시토카인의 분비, 및 T 세포 증식을 유도하는 적절한 공자극 신호에 의해서 이루어진다.

많은 연구는 HLA 클래스 II 제한 CD4⁺반응이 재조합 바이러스 항원 또는 펩티드로 말초혈 단핵 세포를 자극함으로써 결정된다는 것을 증명한다. Botarelli et al., (1993) Gastroenterology 104 : 580-587 ; Farrari et al., (1994) Hepatology 19 : 286-295 ; Minutello et al., (1993) C. J. Exp. Med. 178 : 17-25 ; Hoffmann et al., (1995) Hepatology 21 : 632-638 ; Iwata et al., (1995) Hepatology 22 : 1057-1064 ; 및 Tsai. et al., (1995) Hepatology 21 : 908-912.

폴리클론 다중 특이적 CD8⁺T 세포 반응이 만성 간염 C 를 가진 환자에서 검출되었다. 추가적으로, CD8⁺CTL 은 침팬지에서 급성 HCV 감염을 해결하는데 있어서, 중요성을 보였다(Cooper et al., Immunity 1999). 만성 간염 C 를 가진 약 50%의 환자가 HCV 코어 및/또는 NS4 에 대하여 가장 자주 지시되고, 인터페론-α치료법동안 확증된 바이러스 제거를 획득한 환자에서 가장 일반적인 경향인, 검출가능한 바이러스 특이적 CD4⁺T 세포 반응을 나타낸다.

림포카인의 패턴에 의존하여, CD4⁺T 헬퍼 세포는 TH1, THO, 또는 TH2로 분류되었다. TH1 형의 시토카인은 바이러스 특이적 CD8⁺T 세포 및 천연 킬러 세포의 활성을 지지하는 것으로 여겨지는, 전형적으로 IFN-γ, 림프독소, 및 인터루킨-2(IL-2)이다. TH2 시토카인 IL-4, IL-5, IL10, 및 IL-13 은 B 세포 활성 및 분화에중요하고 따라서, 체액성 면역 반응을 유발한다.

급성 간염 C 감염동안에, NS3 및 아마도 다른 비구조 단백질에 대하여 강하고 지속적인 TH1/TH0 반응은 질환의 자가 제한 과정과 연관된다. Diapolder et al., (1995) Lancet 346 : 1006-1007 은 모든 CD4⁺T 세포 클론이 TH1 또는 TH0 시토카인 프로파일을 가지고, 클론이 생체내에서 세포독성 면역 기작을 지지한다는 것을 제안한다. NS3 의 상대적으로 작은 단편, 즉 아미노산 1207-1278에 반응한 대다수의 CD4⁺T 세포 클론은 NS3 의 영역이 CD4⁺TNS3 의 촉매 도메인내에 촉매 도메인을 기능적으로 파괴하는 돌연변이를 가지는 폴리펩티드를 포함하는, 분리된 돌연변이 비구조("NS")HCV 폴리펩티드.

세포에 대해 면역지배적임을 암시한다. HCV 에 걸린 70% 이상의 환자가 만성 감염 및 간염으로 진행되고, 그들의 상당 부분이 간경병과, 결국 간세포성 암으로 진행된다. 현재 유일하게 승인된 치료법은 단지 20% 의 환자만을 확실한 개선으로 유도하는 6 내지 12 개월 코스의 인터페론 α이다. 지금까지, 어떠한 상업적인 백신도 이용가능하지 않다.

그러므로, 항-HCV 반응을 촉진시킬 수 있는 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.

(발명의 개요)

한 양태에서, 본원발명은 NS3, NS4, 및 NS5의 적어도 일부를 포함하는 돌연변이 간염 C("HCV")폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, NS3 는 촉매 도메인이 제거되도록 N-말단 결실을 가지는 핵산 서열로 코딩된다. NS 돌연변이 폴리펩티드는 NS3, NS4s, NS4b, NS5a, NS5b 또는 그것의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 돌연변이 NS 폴리펩티드는 NS3, NS4 (NS4a 및 NS4b) 및 NS5 (NS5a 및 NS5b)를 포함한다. 다른 구체예에서, NS 폴리펩티드는 NS3 및 NS4(예를 들어, NS4a 및/또는 NS4b) 또는 NS3 및 NS5(예를 들어, NS5a 및/또는 NS5b)로 구성된다. 비구조 성분의 전장 또는 단편의 다른 조합이 또한 기대된다.

다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 비구조 HCV 폴리펩티드가 아닌 바이러스 폴리펩티드를 더 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게 C, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게, HCV 의 절단된 C이다. 다른 폴리펩티드는 바람직하게 E, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는, HCV 의 E1 또는 E2이다. 이러한 폴리펩티드는 천연 HCV 게놈에 의해서 코딩될 필요가 없고, 예를 들어, 절단되거나 그렇지 않으면, 돌연변이 HCV 폴리펩티드 또는 예를 들어, HBV 의 폴리펩티드와 같은 다른 게놈으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로, 본원발명은 NS3의 촉매 도메인내에 촉매 도메인을 기능적으로 파괴하는, 돌연변이를 가지는 폴리펩티드를 포함하는 분리된 돌연변이 비구조("NS")HCV 폴리펩티드를 포함한다. 돌연변이는 예를 들어, 결실 또는 치환 돌연변이일 수 있다. 어떤 구체예에서, 돌연변이 NS 폴리펩티드는 NS3, NS4 및 NS5 를 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에 개시된 돌연변이 NS 폴리펩티드는 HCV의 NS3, NS4, 또는 NS5 가 아닌 제2의 바이러스 폴리펩티드, 예를 들어 HCV 코어 폴리펩티드("C"), 또는 그것의 단편, 또는 HCV 외피 단백질("E"), 예를 들어, E1 및/또는 E2를 더 포함한다. 어떤 구체예에서, C 가 절단된다(예를 들어, 아미노산 121에서).

다른 양태에서, 본원발명은 본원에 개시된 어떤 돌연변이 간염 C("HCV")폴리펩티드, 예를 들어, NS3, NS4, 및 NS5 의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, NS3 는 예를 들어, 촉매 도메인을 제거함으로써 촉매 도메인의 기능을 파괴하도록 N-말단 결실을 가지는 핵산 서열로 코딩된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 비구조 HCV 폴리펩티드가 아닌 바이러스 폴리펩티드를 더 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게는 C, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는 HCV 의 절단된 C 이다. 다른 폴리펩티드는 바람직하게는 E, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는, HCV 의 E1 또는 E2 이다. 이러한 폴리펩티드는 천연 HCV 게놈에 의해 코딩될 필요가 없고, 예를 들어, 절단되거나 그렇지 않으면 돌연변이 HCV 폴리펩티드 또는 예를 들어, HBV 의 폴리펩티드와 같은 다른 게놈으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 다른 양태에서, 본원발명은 (a) 본원에 개시된 어떤 폴리펩티드; 및 (b) 제약학적으로 허용가능한 부형제(예를 들어, 담체 및/또는 애쥬번트)를 포함하는 조성물을 포함한다.

다른 양태에서, 본원발명은 본원에 개시된 어떤 돌연변이 HCV 폴리펩티드를 코딩하는 분리되고 정제된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본원발명은 (a)어떤 돌연변이 HCV 폴리펩티드를 코딩하는 분리 정제된 폴리뉴클레오티드; 및 (b)제약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 플라스미드내의 DNA이거나, 또는 플라스미드내에 존재할 수있다. 추가적으로, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 첨부된 도면 및 서열 목록에 도시된 발현 벡터에 포함될 수 있다.

다른 양태에서, 본원발명은 NS3, NS4, 및 NS5 의 적어도 일부를 포함하는 돌연변이 HCV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 다른 양태에서, 숙주 세포의 발현 벡터는 비구조 HCV 폴리펩티드가 아닌 바이러스 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 더 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게는 C, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는, HCV 의 절단된 C 이다. 다른 폴리펩티드는 바람직하게는 E, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는 HCV 의 E1 또는 E2 이다. 이러한 폴리펩티드는 천연 HCV 게놈에 의해 코딩될 필요가 없고, 예를 들어, 절단되거나 그렇지 않으면 돌연변이 HCV 폴리펩티드 또는 예를 들어, HBV 의 폴리펩티드와 같은 다른 게놈으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 발현 벡터의 핵산 서열이 공발현된다. 더이상의 다른 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포 또는 포유동물 세포이다.

다른 양태에서, 본원발명은 NS3, NS4, 및 NS5 를 포함하는 돌연변이 HCV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 다른 바람직한 양태에서, 숙주 세포의 발현 벡터는 비구조 HCV 폴리펩티드가 아닌 바이러스 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 더 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게는 C, 또는 그것의 항원 단편, 또는 더욱 바람직하게는, HCV 의 절단된 C이다. 다른 폴리펩티드는 바람직하게는 E, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는 HCV 의 E1 또는 E2 이다. 중요하게, 이러한 폴리펩티드는 천연 HCV 게놈, 예를 들어, 절단되거나 그렇지 않으면 돌연변이 HCV 폴리펩티드 또는 예를 들어, HBV 의 폴리펩티드와 같은 다른 게놈으로부터 유래된 폴리펩티드에 의해서 코딩될 필요가 없다. 다른 양태에서, 본원발명은 돌연변이 HCV 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 방법은 NS3, NS4,및 NS5 의 적어도 일부를포함하는 돌연변이 HCV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, HCV 폴리펩티드는 비구조 HCV 폴리펩티드가 아닌 바이러스 폴리펩티드를 더 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게는 C, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는, HCV 의 절단된 C 이다. 다른 폴리펩티드는 바람직하게는 E, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는 HCV 의 E1 또는 E2 이다. 이러한 폴리펩티드는 천연 HCV 게놈으로부터 코딩될 필요가 없고, 예를 들어, 절단되거나 그렇지 않으면 돌연변이 HCV 폴리펩티드 또는 예를 들어, HBV 의 폴리펩티드와 같은 다른 게놈으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포 또는 포유동물 세포이다.

다른 양태에서, 본원발명은 NS3, NS4, 및 NS5 를 포함하는 돌연변이 HCV 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 및 이것을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, HCV 폴리펩티드는 비구조 HCV 폴리펩티드가 아닌 바이러스 폴리펩티드를 더 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게는 C, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는, HCV 의 절단된 C이다. 다른 폴리펩티드는 바람직하게는 E, 또는 그것의 항원 단편, 더욱 바람직하게는, HCV 의 E1 또는 E2 이다. 이러한 폴리펩티드는 천연 HCV 게놈, 예를 들어, 절단되거나 그렇지 않으면 돌연변이 HCV 폴리펩티드 또는 다른 게놈으로부터 유래된 폴리펩티드에 의해서 코딩될 필요가 없고, 예를 들어, HBV의 폴리펩티드를 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 또는 폴리클론이다.

더이상의 양태에서, (a)폴리펩티드가 발현되는 조건하에서, 본원에 개시된 어떤 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b)폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는, 돌연변이 NS HCV 폴리펩티드를 제조하는 방법이다. 숙주 세포는 예를 들어, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충세포일 수 있다. 폴리펩티드는 세포내 발현되고 분리될 수 있거나 주위 환경으로부터 분비 및 분리될 수 있다.

더이상의 양태에서, 피험자에서 면역반응을 유발하는 방법이 제공된다. 면역 반응은 일회 또는 다중 투여로 본원에 개시된 어떤 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 투여함으로써 유발될 수 있다.

대상 발명의 이러한 구체예는 본원에 개시된 관점에서 당업자가 용이하게 실시할 수 있다.

본 발명은 HCV 에 대하여 사용하기 위한 면역원성 화합물에 유용한 돌연변이 비구조 간염 C 바이러스(HCV)폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 그것을 제조하고 사용하는 방법, 및 그것을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본원발명은 또한 (a)돌연변이 비구조 HCV 폴리펩티드 및 (b) 비구조 HCV 폴리펩티드가 아닌 바이러스 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

도1은 pCMV-NS35를 제조하기 위한 클로닝 도해를 도시한다.

도2는 벡터 pCMV-NS35의 9621bp 를 도시한다.

도3은 NS35 ORF 의 핵산서열을 포함하는 pCMV-NS35(SEQ ID NO:1)의 핵산서열, 및 NS35(SEQ ID NO:2)의 번역을 도시한다.

도4는 9621bp pCMV-delNS35를 도시한다.

도5는 delNS35 ORF의 핵산 서열을 포함하는 pCMV-delNS35(SEQ ID NO:3)의 핵산 서열, 및 delNS35 폴리펩티드(SEQ ID NO:4)의 번역을 도시한다.

도6은 4276bp pCMV-II을 도시한다.

도7은 pCMV-II(SEQ ID NO:5)의 핵산서열을 도시한다.

도8은 6300bp pCMV-NS34A를 도시한다.

도9는 NS34A ORF의 핵산 서열을 포함하는 pCMV-NS34A(SEQ ID NO:6)의 핵산 서열, 및 NS34A (SEQ ID NO:7)의 번역을 도시한다.

도10은 pd.△NS3NS5 를 제작하기 위한 클로닝 도해를 도시한다.

도11은 pd.△NS3NS5(SEQ ID NO:8 및 9)의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.

도12은 pd.△NS3NS5 로 형질전환된S. cerevisiae균주 AD3 에 의해서 발현된 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한다.

도13은 pd.△NS3NS5.pj.를 제작하기 위한 클로닝 도해를 도시한다.

도14는 pd.△NS3NS5.pj (SEQ ID NO:10 및 11)의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.

도15는 특히 △NS3NS5 폴리펩티드의 발현을 나타내는 pd.△NS3NS5.pj로 형질전환된S. cerevisiae균주 AD3 에 의해 발현된 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한다.

도16은 pd△NS3NS5.pj.corel21RT 및 pd△NS3NS5.pj.corel73RT를 제작하기 위한 클로닝 도해를 도시한다.

도17은 pd.△NS3NS5.pj.corel21(SEQ ID NO:12 및 13)의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.

도18은 pd.△NS3NS5.pj.corel73(SEQ ID NO:14 및 15)의 핵산 아미노산 서열을 도시한다.

도19는 특히 △NS3NS5.corel21 및 ANS3NS5.corel73 폴리펩티드의 발현을 나타는, pd.△NS3NS5.pj로 형질전환된S. cerevisiae균주 AD3 에 의해 발현된 단백질의 웨스턴 플롯을 도시한다. 레인 1 및 7은 블루 표준을 나타낸다. 레인 2은 대조표준 효모 플라스미드를 나타낸다. 레인 3 및 4는 △NS3NS5.corel21RT 폴리펩티드 , 콜로니 1 및 2을 나타낸다. 레인 5 및 6는 △NS3NS5.corel73RT 폴리펩티드, 콜로니 3 및 4 를 나타낸다.

도20은 pd△NS3NS5.pj.corel40RT 및 pd△NS3NS5.pj.corel50RT를 제작하기 위한 클로닝 도해를 도시한다.

도21은 pd.△NS3NS5.pj.corel40(SEQ ID NO:16 및 17)의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.

도22는 pd.△NS3NS5.pj.corel50(SEQ ID NO:18 및 19)의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.

도23은 특히 ANS3NS5corel40 및 ANS3NS5corel50 폴리 펩티드의 발현을 나타내는, pd.△NS3NS5.pj로 형질전환된S. cerevisiae균주 AD3 에 의해 발현된 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한다. 레인 1은 블루 표준을 나타낸다. 레인 2 및 3은△NS3NS55corel40RT 폴피펩티드, 콜로니 5 및 6 를 나타낸다. 레인 4 및 5는 △NS3NS5corel5ORT 폴리펩티드, 콜로니 7 및 8을 나타낸다. 레인 6은 대조표준 효모 플라스미드를 나타낸다. 레인 7은 △NS3NS5corel21RT 폴리펩티드, 콜로니 1을 나타낸다. 레인 8은 △NS3NS5corel73RT 폴리펩티드, 콜로니 5를 나타낸다.

본원발명의 실행은 다르게 나타내지 않는한, 당업계의 기술범위내인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기법, 및 면역학의 종래 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING ;A LABORATORY MANUAL (1989) ; DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D. N.Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed., 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE(R. I. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); 시리즈, METHODS OF ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller and M. P. Calos eds. 1987, Cold Springs Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 및 Vol. 155 (각각 Wu 및 Grossman, 및 Wu, eds.); Mayer and Walker eds. (1987), IMMUNOHISTOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London) ; Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION : PRINCIPALS AND PRACTICE, 제2판(Springer-Verlag, New York); 및 HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,VOLUMES I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986).

본원 명세서 및 첨부된 청구항에 사용될 때, 단수형 "하나", 및 "그"는 명세서에서 명백하게 달리 나타내지 않는다면, 복수의 참조를 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "항원"에 대한 참조는 둘 또는 그 이상의 항원의 혼합물을 포함한다.

I. 정의

본원발명을 개시하면서, 하기의 용어가 사용될 것이고, 하기에 나타난대로 정의되도록 의도된다.

용어 "간염 C 바이러스"(HCV)는 비-A, 비-B 간염(NANBH)의 원인성 병원체를 말한다. HCV 의 핵산 및 추정되는 아미노산 서열은 U.S.특허 번호 5,856,437 및 5, 350,671에 개시된다. HCV 에 의해 유발된 질환은 간염 C 라 하고, 공식 명칭은 NANBH이다. 본원에 사용될 때, 용어 HCV는 NANBH 를 유발하는 병원성 균주뿐만 아니라 감약 균주 또는 그로부터 유래된 결실 간섭 입자인 바이러스 종을 나타낸다.

HCV 는 바이러스 부류 플라비비리데(flaviviridae)의 구성원이다. 플라비바이러스 입자의 형태 및 조성물이 공지되고,Reed et al., Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus. (1998), 62 : 1-37 ; HEPATITIS C VIRUSES IN FIELDS VIROLOGY (B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, eds.)(3d ed. 1996)에 개시된다. HCV 게놈의 부분은 또한 페스티바이러스에 동형이라는 것이 최근에 밝혀졌다. 일반적으로, 형태와 관련하여, 플라비바이러스는 지질 이중층에 의해 둘러쌓인 중앙 뉴클레오캡시드을 함유한다. 비리온은 구형이고 직경이 약 40-50 nm 이다. 이들의 코어는 직경이 약 25-30 nm 이다. 비리온의 외피의 외부 표면은 직경이 약 2nm 인 말단 마디(knob)를 가진 약 5-10 nm 길이의 돌출이다.

HCV 게놈은 RNA 로 구성된다. 바이러스를 함유하는 RNA 는 상대적으로 높은 비율의 자발성 돌연변이를 가진다고 알려진다. 그러므로, HCV 클래스 또는 종내의 독성 또는 비독성일 수 있는 다균주일 수 있다. 코어, 비구조, 및 외피 단백질의 번역 범위를 포함하는 HCV 의 ORF 는 U.S. 특허 번호 5,856,437 및 5,350,671에 개시된다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 말하고, 최소 길이의 생산물에 제한되지 않는다. 그러므로, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체등은 본 정의에 포함된다. 전장 단백질 및 그것의 단편 모두 본 정의에 포함된다. 용어는 또한 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 폴리펩티드의 발현후 변형을 포함한다. 더욱이, 본원발명의 목적을 위한 "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 결실, 첨가 및 치환(일반적으로 천연에서 보존적인)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 말한다. 이러한 변형은 부위 특이적 돌연변이유발에 의한 것과 같이 의도적이거나, 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭에 의한 에러와 같이 우연일 수 있다.

HCV 폴리펩티드는 상기에 개시된대로, HCV 다단백질로부터 유래된 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 HCV 로부터 물리적으로 유래되는 것이 아니라, 합성 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드는 HCV 의 균주 1,2,3, 또는 4 와 같은 어떤 다양한 HCV 균주로부터 유래될 수 있다. 많은 보존 및 가변 영역이 이러한 균주간에 알려지고, 양 서열을 배열하고 본원에 개시된 어떤 프로그램 또는 알고리즘으로 동일성을 결정할 때, 일반적으로 이러한 영역으로부터 유래된 에피토프의 아미노산 서열이 높은 정도의 서열 동일성, 예를 들어, 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 그러므로, 예를 들어, 용어 "NS4"폴리펩티드는 하기에 더 정의된, 어떤 다양한 HCV 균주뿐만 아니라 NS4 유사체, 뮤테인 및 면역원성 단편으로부터의 천연 NS4 를 말한다.

더욱이, 용어 "△NS35","delNS35,""△NS3NS5," 및 "△NS3-5"는 NS3, NS4, 또는 NS5 의 적어도 일부를 포함하고, NS3 프로테아제 활성 부위 영역이 프로테아제 비기능적이 되도록 그 안에 결실, 또는 돌연변이를 포함하는, 돌연변이 폴리펩티드를 말한다. 한 구체예에서, △NS3-5 는 도5에 도시된 아미노산 1242-3011 또는 ,그것에 실질적으로 동형인 폴리펩티드를 포함한다. NS3 프로테아제가 비기능적이 되었는지를 결정하는 방법은 당업자에게 자명하다. 만약 프로테아제가 기능적이라면, 발현상에서 기대되는 분자량의 단백질을 얻을 것이다. 실시예 2 및 도15에 제시된 대로, 균주 AD3를 pd.△NS3NS5.PJ 클론#5로 형질전환시킨 경우에 SDS-페이지, 4-20%를 사용하여, 대략 194kD 의 분자량을 가지는 단백질을 얻었다. 당업자는 원하는 분자량의 단백질이 어떤 허여된 결실 또는 돌연변이에 대하여 발현되었는지를 용이하게 결정할 수 있다.

용어 "유사체" 와 "뮤테인"은 참조 분자의 생물학적으로 활성인 유도체, 또는 하기에 정의된 바와 같이 세포-매개 면역반응을 자극하는 능력과 같은, 바람직한 활성을 보유하는 그러한 유도체의 단편을 말한다. 통상, 용어 "유사체"는 변형이 면역활성을 파괴하지 않는 한, 본래 분자에 대해서 하나 이상의 아미노산 삽입,치환 (통상 본질적으로 보전적), 및/또는 결실을 가진 본래 폴리펩티드 서열 및 구조를 가진 화합물을 말한다. 용어 "뮤테인"은 국제 공보 제 WO91/04282호에 기재된 것들과 같은, 하나 이상의 펩티드 모조체 "펩토이드 (peptoid)"를 가지는 펩티드를 말한다. 바람직하게는, 유사체 또는 뮤테인은 적어도 본래 분자와 동일한 면역활성을 가진다. 펩티드 유사체와 뮤테인을 제조하는 방법은 당업계에 공지이고 하기에 더 기재된다.

특히 바람직한 유사체는 본질적으로 보전적인 치환들, 즉 측쇄들이 관련성 있는 하나의 아미노산의 집단 내에서 발생하는 치환들을 포함한다. 구체적으로, 아미노산은 통상 네 개의 집단으로 나뉜다: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때로는 방향성 아미노산으로 분류된다. 예를들면, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로의 치환하거나, 한 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 치환하는 유사한 보전적 치환은, 생물학 활성에 중요한 영향을 끼치지 않을 것이라고 예상하는 것은 타당하다. 예를들면, 관심의 폴리펩티드는 그 분자의 바람직한 기능을 온전하게 보유하는 한, 약 5 내지 10개까지의 보전적 또는 비보전적 아미노산 치환, 또는 약 15 내지 25개까지의 보전적 또는 비보전적 아미노산 치환, 또는 5 내지 25개 사이의 정수 개를 포함할 수 있다. 당업자는 당업계에 주지인 Hopp/Woods 및 Kyte-Doolittle 플롯을 참조하여 변화되지 않도록 하는 관심의 분자의 부위들을 쉽게 결정할 수 있다.

"단편"은 완전한 전장 폴리펩티드 서열 및 구조의 단지 한 부분으로 구성된 폴리펩티드를 의도하는 것이다. 단편은 본래 폴리펩티드의 C-말단 결실 및/또는 N-말단 결실을 포함할 수 있다. 특정 HCV 단백질의 "면역원적 단편"은 여기에 기재된 분석에 의해서 측정된 대로 관심의 단편이 면역원 활성을 보유하는 한, 통상 전장 분자의 적어도 약 5 내지 10개의 연속 아미노산 잔기, 바람직하게는 전장 분자의 적어도 약 15 내지 25개의 연속 아미노산 잔기, 그리고 가장 바람직하게는 전장 분자의 적어도 약 20 내지 50개 또는 그 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 다양한 HCV 에피토프의 기재에 관하여는, 예컨대, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992)89: 10011-10015; Chien et al.,J. Gastroent. Hepatol.(1993)8:S33-39; Chien et al., 국제 공보 제 WO93/00365호; Chien, D. Y., 국제 공보 제 WO94/01778호; 공공으로 소유되고, 허여된 미국 특허출원 번호 제 08/403,590 및 08/444,818호를 참조.

여기서 사용된 용어 "에피토프"는 스스로 또는 큰 서열의 부분으로서, 그러한 서열에 대한 반응으로 생성된 항체에 결합하는 서열을 정의하는, 적어도 약 3 내지 5개, 바람직하게는 약 5 내지 10개 또는 15개, 및 약 1,000개 아미노산 (또는 그 숫자 사이의 정수) 이하의 서열을 말한다. 그 단편의 길이에 대해서는 특정 상한이 없는데, 거의 전장의 단백질 서열 또는 HCV 폴리단백질 유래의 둘 이상의 에피토프를 포함하는 융합 단백질까지도 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 에피토프는 이것이 유래된 모 단백질의 부분의 정확한 서열을 가지는 폴리펩티드에한정되지는 않는다. 사실, 바이러스 게놈은 지속적 가변 상태에 있고, 분리체들 사이에서 상대적으로 고도의 가변성을 보이는 여러개의 가변 도메인들을 가지고 있다. 따라서, 용어 "에피토프"는 결실, 삽입 및 치환 (통상 본질적으로 보전적)과 같은 본래 서열에 대한 변형은 물론이고, 본래 서열에 동일한 서열 역시 포함한다.

에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩티드의 영역은 본 분야에 공지인 여러 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 예를들면,Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey 참고. 예를들면, 선형 에피토프는 예컨대, 고체 지지체상에서 단백질 분자의 부분에 대응하는 여러 펩티드를 동시적 합성하고, 펩티드를 지지체상에 부착시킨 채로 항체와 반응시키는 것에 의해 결정될 수 있다. 그러한 기술들은 본 분야에 공지이고, 예컨대, 미국특허번호 제 4,708,871호; Geysen et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci.USA81: 3998-4002; Geysen et al. (1986)Molec. Immunol. 23:709-715에 기재되어 있다. 유사하게, 형태 (conformational) 에피토프는 예컨대, x-선 결정학 및 2차원 핵자기 공명에 의한 것과 같은 아미노산의 공간 형태 결정에 의해 즉시 확인된다. 예를들면, 상기의Epitope Mapping Protocols를 참조.단백질의 항원 부위는 예컨대, Oxford Molecular Group으로부터 구입 가능한 Omiga version 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것들과 같은, 표준 항원성 및 하이드로파시 (hydropathy) 플롯을 사용하여 역시 확인될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위한 Hopp/Woods 방법, Hopp et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA(1981)78: 3824-3828, 및 하이드로파시 플롯을 위한 Kyte Doolittle 기술, Kyte et al.,J Mol Biol.(1982)157: 105-132을 사용한다.

여기서 사용된, 용어 "형태 에피토프"는, 전장의 본래 단백질 내의 에피토프를 코딩하는 아미노산 서열에 고유한 구조적 특징들을 가지는, 전장 단백질 또는 그것의 유사체 또는 뮤테인의 부분을 말한다. 본래 구조적 특징들은 이것에 한정되는 것은 아니나, 글리코실화 및 삼차원 구조를 포함한다. 바람직하게는, 형태 에피토프는 재조합으로 생산되고, 예컨대 에피토프의 변성이 없이, 그것의 바람직한 구조적 특징들을 보전하는 조건하에서 추출할 수 있는 세포에서 발현된다. HCV 폴리단백질로부터 재조합 형태 에피토프의 발현과 분리는 예컨대, 국제공보 제 WO96/04301, WO94/01778, WO95/33053, WO92/08734호에 기재되어 있다.

(폴리펩티드 및 생체내에서 발현되는 폴리펩티드를 코팅하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는) HCV 항원 또는 조성물에 대해 "면역적으로 반응"은 관심의 조성물에 존재하는 분자에 대해 피검자의 체액성 및/또는 세포성 면역반응의 발생이다. 본 발명의 목적에서, "세포성 면역반응"은 T-림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 것임에 비해, "체액성 면역반응"은 항체분자에 의해 매개되는 면역반응을 말한다. 세포성 면역의 중요한 한 측면은 세포독성 T-세포 ("CTLs")에 의한 항원-특이적 반응을 포함한다. CTL은 주요 조직적합성 복합체 (HMC)에 의해서 코딩되는 단백질과 결합되어 발현되는 펩티드 항원에 대한 특이성을 가지며, 세포의 표면에 발현을 한다. CTL은 유도를 돕고 세포내 미생물의 세포내 파괴 또는 그러한 미생물에 의해 감염된 세포의 파괴를 촉진한다. 세포성 면역의 다른 측면은 헬퍼T-세포에 의한 항원-특이적 반응을 포함한다. 헬퍼 T-세포는 기능을 자극하는 것을 돕기 위해 활동하고, 그들의 표면의 MHC 분자와 관련된 펩티드 항체를 보여주는 세포에 대항한 비특이성 효과기 세포의 활성에 집중한다. "세포성 항원반응"은 시토카인, 케모카인 및 CD4⁺및 CD8⁺T-세포로부터 유래된 것들을 포함하는, 활성화된 T-세포 및/또는 다른 백혈구 세포에 의해 생산된 다른 그러한 분자의 생산을 말한다.

세포성 면역반응을 이끌어 내는 조성물 또는 백신은 세포 표면에서 MHC 분자에 결합된 항원을 제시하여 척추동물 피험자의 감작화에 기여할 수 있다. 세포-매개 면역반응은 그들의 표면에 항원을 제시하는 세포에서 또는 세포 근처에서 행해진다. 이에 덧붙여, 항원-특이적 T-림프구는 면역화된 숙주의 장래 보호를 허락하기 위해서 발생될 수 있다.

특정 항원의 세포-매개 면역반응을 자극하기 위한 능력은 림프증식 (림프구 활성화) 분석, CTL 세포독성 세포 분석에 의한 것, 또는 감작화 피험자내 항원에 대해 특이적인 T-림프구에 대한 분석에 의한 것과 같은 여러 분석에 의해 결정될 수 있다. 그러한 분석은 본 분야에 주지이다. 예를들면, Erickson et al.,J. Immunol.(1993)151: 4189-4199; Doe et al.,Eur. J. Immunol.(1994)24: 2369-2376; 및 하기의 예를 참조.

따라서, 여기서 사용된 면역학적 반응은 CTL의 생산 및/또는 헬퍼 T-세포의 생산 또는 활성화를 자극하는 것일 수가 있다. 관심의 항원은 또한 항체-매개 면역반응을 유도할 수도 있다. 따라서, 면역학적 반응은 하나 이상의 하기의 효과들을 포함한다: B-세포에 의한 항체의 생산; 및/또는 서프레서 T-세포 및/또는 조성물 또는 관심의 백신에 나타나는 하나의 항원 또는 항원들에 특이적인 γδT-세포의 활성화. 이 반응들은 감염성의 중화, 및/또는 항체-보체 또는 보호를 제공하기 위한 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 중재 또는 면역화된 숙주에 대한 증상의 감소에 기여할 수 있다. 이러한 반응들은 본 분야에 주지인 표준 면역분석 및 중화 분석을 사용하여 결정될 수 있다.

"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "코딩하는" 서열은 적절한 조절 서열의 조절하에 놓였을 때, 생체내 또는 시험관내에서 폴리펩티드로 전사 (DNA의 경우) 및 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산분자이다. 코딩 서열의 영역은 5'(아미노) 말단의 개시코돈과 3'(카르복시) 말단의 번역 종결코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩서열의 3'에 위치될 수 있다.

"핵산" 분자 또는 "폴리뉴클레오티드"는 이중- 및 단일-가닥 서열 모두를 포함할 수 있고, 이것에 한정되는 것은 아니나 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 (예컨대, DNA 바이러스, 레트로바이러스)로부터의 게놈 DNA 서열 또는 원핵생물 DNA, 및 특히 합성 DNA 서열을 말한다. 이 용어는 또한 DNA와 RNA의 공지 염기 유사체를 포함하는 서열을 포함한다.

"작동하게 연결된"은 요소들의 배열을 말하는데, 여기서 기재된 요소들은 그것의 희망하는 기능을 수행할 수 있도록 배열된다. 따라서, 코딩서열에 작동하도록 연결된 제공된 프로모터는 적절한 전사 요소 등이 제공될 때 코딩서열을 발현하도록 하는 능력이 있다. 프로모터는 그것이 발현을 지시하도록 기능하는 한, 코딩서열과 인접할 필요가 없다. 따라서, 예를들면 개재된 아직 비번역된 전사된 서열은 전사된 인트론이 할 수 있는것 처럼 프로모터 서열과 코딩서열 사이에 존재할 수 있으며, 그 프로모터 서열은 여전히 코딩서열과 "작동하도록 연결된" 것으로 생각되어 질 수 있다.

핵산 분자를 기술하기 위해 여기에서 사용된 "재조합"은 조작에 의해서 그것과 본래 관련이 있는 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 부분에 연관되어 있지 않은, 게놈성, cDNA, 바이러스성, 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 단백질과 폴리펩티드와 관련하여 여기에서 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 하기에서 더욱 기술하는 바와 같이, 관심의 유전자는 클론되고 형질전환된 생물에서 발현된다. 숙주 생물은 발현조건 하에서 단백질을 생산하기 위해 외래 유전자를 발현한다.

"조절 요소"는 그것이 연결된 코딩서열의 발현을 돕는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 이 용어는 프로모터, 전사 종결서열, 상류 조절 도메인, 폴리아데닐화 신호, 5'UTR 및 3'UTR을 포함하는, 비번역 영역 및 적절할 경우, 숙주세포내에서 코딩서열의 전사 및 번역을 총체적으로 제공하는 리더 서열 및 인핸서를 포함한다.

여기서 사용된 "프로모터"는 숙주세포에서 RNA 폴리머라제와 결합할 수 있는 DNA 조절 영역이고 그것에 작동하도록 연결된 하류 (3'방향) 코딩서열의 전사를 개시한다. 본 발명의 목적을 위해서, 프로모터 서열은 상기 배경하에서 검출가능한 레벨로, 관심의 유전자의 전사를 개시하기에 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함한다. 프로모터 서열내에는 RNA 폴리머라제 결합에 관련있는 단백질 결합 도메인 (보존서열)은 물론 전사 개시 위치도 있다. 진핵세포 프로모터는 자주 그러나 항상은 아니지만 "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 포함할 것이다.

조절 서열은 RNA 폴리머라제가 프로모터 서열과 부착하고 코딩서열을, 뒤에 코딩서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드로 번역되는 mRNA로 전사할 때, 세포내에서 코딩서열의 "전사를 지시한다".

"발현 카세트" 또는 "발현 구성체"는 관심의 서열(들) 또는 유전자(들)의 발현을 지시할 수 있는 능력이 있는 조립체를 말한다. 발현 카세트는 상기에 기술한 바와같은, 관심의 서열(들) 또는 유전자(들) (의 전사를 지시할 수 있도록)에 작동하도록 연결된 프로모터와 같은 조절요소를 포함하고, 종종 폴리아데닐화 서열을 또한 포함한다. 본 발명의 특정 구체예내에서, 여기에서 기술한 발현 카세트는 플라스미드 구성체내에 포함될 수 있다. 발현 카세트의 구성요소에 덧붙여, 플라스미드 구성체는 하나 이상의 선택마커, 플라스미드 구성체를 단일-가닥 DNA (예컨대, M13 복제원점)로 존재하도록 하는 신호, 적어도 하나의 다중 클로닝 위치, 및 "포유동물" 복제원점 (예컨대, SV40 또는 아데노바이러스 복제원점)을 또한 포함할 수 있다.

여기에 사용된, "형질전환"은, 예컨대 직접 흡수에 의한 형질전환, 트랜스펙션, 감염 등과 같은, 삽입에 사용된 방법에 상관없이, 숙주세포내로 외래 폴리뉴클레오티드의 삽입을 말한다. 특정의 형질전환의 방법에 대해서는 하기를 참조. 외래 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 에피솜과 같은 비통합된 벡터로서 유지될 수 있고 또는 대안으로는 숙주 게놈에 통합될 수 있다.

"숙주 세포"는 형질전환되었거나 또는 외래 DNA 서열에 의해서 형질전환이 될 수 있는 세포이다.

"분리된"은 폴리펩티드를 지칭할 때, 지시된 분자는 분리되고 자연상에서 그 분자가 발견되는 생물 전체로부터 분리되거나 동종의 다른 생물학적 거대분자가 실질적으로 없는 곳에 존재하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 관하여 용어 "분리된"은 본질적으로 그것과 통상적으로 관련된 서열; 또는 자연상에 존재할 때 그것과 관련된 이형 서열을 가지는 서열; 또는 염색체로부터 분리된 분자가 전체 또는 부분적으로 없는 핵산 분자이다.

여기서 사용된 용어 "정제된"은 동종의 생물학적 거대분자의 무게로 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 무게로 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 무게로 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 무게로 적어도 98%가 존재하는 것을 의미한다.

"상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 부분 사이의 퍼센트 동일성을 말한다. 두 개의 DNA 또는 두 개의 폴리펩티드 서열은, 서열이 분자의 정의된 길이에 대하여 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 내지 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 내지 98%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낼 때, 서로 "실질적으로 상동성"이다. 여기에 사용된 바와같이, 실질적으로 상동성은 특정한DNA 또는 폴리펩티드 서열에 완전한 동일성을 나타내는 서열을 또한 말한다. ΔNS35에 대한 참조로서 여기에 사용된 바와같은 용어 "실질적으로 상동성"은 서열 동일성이 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85%, 특히 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 98% 이상일 때, ΔNS35 (도 5 참조)에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 전체 서열에 적어도 60% 동일한 핵산 또는 아미노산 서열을 통상 말한다. 이들 상동성 폴리펩티드는 변이체 및 단편의 대립유전자 변이체를 포함하는 단편들을 포함한다. 두 서열 사이의 동일성은, 갭 오픈 페널티 (gap open penalty) = 12 및 갭 익스텐션 페널티 (gap extension penalty) = 1의 매개변수로 어핀 갭 (affine gap) 조사를 사용하는, MPSRCH 프로그램 (Oxford Molecular)에서 수행되는 바와 같이, Smith-Waterman 상동성 조사 알고리즘에 의하여 바람직하게 결정된다. 따라서, 예를들면 본 발명은 ΔNS35에 의해서 암호화되는 폴리펩티드에 80% 상동성인 분리체를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 ΔNS35에 실질적으로 상동성이다.

통상, "동일성"은 각각 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응성을 말한다. 퍼센트 동일성은 서열을 배열하고, 두 배열된 서열 사이의 정확히 일치된 개수를 계산한 것을, 더 짧은 서열의 길이로 나누어, 그 결과에 100을 곱하는 것에 의해 두 분자 사이의 서열정보의 직접비교에 의해서 결정될 수 있다. 즉시 가용한 컴퓨터 프로그램은 펩티드 분석을 위한 Smith and Waterman Advances inAppl. Math. 2:482-489, 1981의 국지 상동성 알고리즘을 채택한, ALIGN, Dayhoff, M. O.inAtlas of Protein Sequence and StructureM. O. Dayhoff ed., 5 Suppl.3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC와 같은 분석을 돕기위해 사용될 수 있다. 핵산 서열 동일성 결정용 프로그램은 Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (Genetics Computer Group, Madison, WI으로부터 구입가능) 예컨대, Smith and Waterman 알고리즘에 의존하는, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램에서 사용 가능하다. 이들 프로그램은 제조사에 의해 추천되는 기본 파라미터로서 즉시 활용되며, 상기에 언급된 Wisconsin Sequence Analysis Package에 기술되어 있다. 예컨대, 참고 서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 기본 점수 표 (scoring table) 및 6 뉴클레오티드 위치의 갭 페널티를 이용한 Smith and Waterman의 상동성 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 본문에서 퍼센트 동일성 결정의 다른 방법은 John F. Collins와 Shane S. Sturrok에 의해 개발되고, IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)에 의해서 배포된, 에딘버그 (Edinburgh)대학에 저작권이 있는 MPSRCH 패키지 프로그램을 사용하는 것이다. 이 패키지 세트로부터, 점수 표를 위해 기본 파라미터 (예를들면, 12의 갭 오픈 페널티, 1의 갭 익스텐션 페널티, 6의 갭)가 사용될 때, Smith Waterman 알고리즘은 사용될 수 있다. 생성된 데이타로부터 "매치 (Match)" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열사이의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적절한 프로그램은 본 분야에 통상 공지이다. 예컨대, 다른 배열 프로그램은 기본 파라미터와 사용되는 BLAST 이다. 예를들면, BLASTN 및 BLASTP는 하기 기본 파라미터를 사용하여 사용될 수 있다; 유전자 코드 = 기본; 필터 = 없음;가닥 = 양쪽 모두; 컷오프 = 60; 예상 = 10; Matrix = BLOSUM62; 기재 (Descriptions) = 50 서열; 정열 (sort by) = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 무-중복 (non-redundant), GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세는 하기 인터넷 주소에서 볼 수 있다: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

대안으로는, 상동성은 상동성 영역 사이의 안정한 이중체를 형성하고, 단일가닥-특이적 뉴클레아제로 분해하고, 분해된 단편의 크기 결정을 하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 의해서 결정된다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은 예컨대, 그 특정 시스템에 대해 정의된 바와같은 긴축도 (stringent) 조건하에서, 서던 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 당업자의 범위내이다. 예컨대, 상기의 Sambrook et al.; 상기의DNA Cloning; 상기의Nucleic Acid Hybridization참조.

"긴축도"는 다른 서열에 대해서 매우 유사한 서열의 결합을 선호하게 하는 혼성화 반응에서의 조건을 말한다. 예컨대, 온도 및 염 농도의 조합은 대략 120 내지 200℃, 연구로서 혼성체의 계산된 Tm 이하인 것으로 선택된 것이어야 한다. 온도 및 염 조건은 필터에 고정화된 게놈 DNA의 샘플이 관심의 서열과 혼성화되고 나서 다른 긴축도의 조건하에서 세척되는 예비 실험에서 경험적으로 종종 결정될 수 있다. Sambrook et al. 9.50쪽 참조.

예컨대, 서던 블롯을 수행할 때 고려해야할 변수는 (1) 블롯될 DNA의 복잡성 (2) 프로브와 검출될 서열 사이의 상동성이다. 연구될 단편들의 총량은, 고도로 복합한 진핵생물 게놈에서의 단일 카피 유전자 10^-9내지 10^-8g에 대해 플라스미드 또는 파지 0.1 내지 1 ㎍으로, 10의 규모로 변화할 수 있다. 낮은 복잡성 폴리뉴클레오티드에 대해, 실질적으로 더 짧은 블롯팅, 혼성화 및 노출 시간, 더 적은량의 시작 폴리뉴클레오티드, 및 프로브의 더 낮은 특이 활성이 사용될 수 있다. 예컨대, 단일-카피 효모 유전자는 1㎍의 효모 DNA로 시작하여 단지 한 시간의 노출 시간, 두 시간동안 블롯팅, 및 10⁸cpm/㎍의 프로브로 4 내지 8시간동안 혼성화로 검출될 수 있다. 단일-카피 포유동물 유전자에 대한 보수적 접근은 10㎍의 DNA로 시작하고, 하룻밤동안 블롯팅, 10⁸cpm/㎍ 이상의 프로브를 사용한 10% 덱스트란 술페이트의 존재하에서 하룻밤동안 혼성화, 결과된 ~24시간의 노출시간이다.

여러 인자가 프로브와 관심의 단편 사이의 DNA-DNA 혼성체의 용해 온도 (Tm), 결과적으로 혼성화와 세척에 적절한 조건에 영향을 줄 수 있다. 여러경우에서 프로브는 단편에 대해 100% 상동성이 아니다. 다른 통상적으로 마주치는 변수는 길이와 혼성화 서열들의 총 G+C 함량 및 이온 강도 그리고 혼성화 완충액의 포름아미드 함량을 포함한다. 모든 이들 요소의 영향은 대략 단일 등식이 될 수 있다:

Tm = 81 + 16.6(log₁₀C_i) + 0.4[%(G+C)] - 0.6(%포름아미드) - 600/n-1.5(%미스매치). 여기서 Ci는 염의 농도 (일가 이온) 및 n은 염기쌍으로 혼성체의 길이 (Meinkoth & Wahl(1984)Anal. Biochem.138:267284을 약간 변형). 통상, 50% 포름아미드의 존재하에서 편리한 혼성 온도는 표적 단편에 95% 내지 100% 상동성인 프로브에 대해 42℃, 90% 내지 95% 상동성에 대해 37℃, 그리고 85% 내지 90% 상동성에 대해 32℃이다. 낮은 상동성에 대해 포름아미드 농도는 낮아져야 하고, 상기 등식을 사용에 의하여 온도는 조정된다. 프로브와 표적 단편 사이의 상동성이 미지라면, 가장 단순한 접근은 혼성화와 비긴축적인 세척조건을 동시에 시작하는 것이다. 방사선 사진 이후 비특이적 밴드 또는 많은 백그라운드가 관찰된다면, 필터는 높은 긴축도에서 세척되고 재노출될 수 있다. 노출에 요구되는 시간이 이 접근을 비실용적으로 만든다면, 여러 혼성화 및/또는 세척 긴축도가 병렬적으로 시험되어야 한다.

"핵산 면역화"는 항원 또는 항원들의 생체내 발현을 위해서, 숙주세포내로 하나 이상의 선택된 항원을 암호화하는 핵산 분자의 도입을 의미한다. 핵산 분자는 주입, 흡입, 경구, 비강 및 점막 투여, 또는 유사한 것과 같은 것에 의해서 수용 피검체로 직접 도입될 수 있고, 또는 숙주로부터 제거된 세포내로 생체 외적으로 도입될 수 있다. 후자의 경우에, 형질전환된 세포는 면역반응이 핵산 분자에 의해 암호화되는 항원에 대하여 증가될 수 있는 피검체내로 재도입될 수 있다.

"오픈 리딩 플레임" 또는 ORF는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 영역이다; 이 영역은 코딩 서열의 부분 또는 총 코딩 서열을 나타낼 수 있다.

여기서 사용된, 용어 "항체"는 적어도 하나의 항원 결합 위치를 포함하는 항원 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 집단을 말한다. "항원 결합 위치"는 항원-항체 복합체를 형성하기 위해 특이적 결합을 허용하는, 항원의 에피토프의 특성에 대해상보적인 내부 표면 형태 및 전하 분포를 가진 삼차원 결합 위치를 형성하기 위한 항체 분자의 가변 도메인의 폴딩으로부터 형성된다. 항원 결합위치는, 항원 결합에 기여하는 고도 가변부위를 형성하는, 중쇄 및/또는 경쇄 도메인 (VH 및 VL, 각각)으로부터 형성될 수 있다. 용어 "항체"는, 제한 없이 폴리클론 항체, 모노클론 항체, 키메라 항체, 변형된 항체, 일가 항체, Fab 단백질, 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 여러 경우에서, 항원에 대한 항체의 결합 현상은 다른 리간드/항-리간드 결합과 동등한 것이다.

만약 폴리클론 항체가 바람직하다면, 선택된 포유동물 (예컨대, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)은 HCV 에피토프(들)을 함유하는 면역원성 폴리펩티드로 면역화된다. 면역화된 동물 유래의 혈청은 수집되고 공지의 절차에 따라 처리된다. 만약 HCV 에피토프에 대한 폴리클론 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유한다면, 폴리클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해서 정제된다. 폴리클론 항혈청을 생산 및 처리하는 기술은 본 분야에 공지이다, 예를들면, Mayer and Walker, eds.(1987) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London) 참조.

HCV 에피토프에 대한 모노클론 항체는 또한 당업자에 의해 즉시 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의한 모노클론 항체를 제조하는 일반 방법론은 주지이다. 불사의 항체-생산 세포주는 세포융합에 의해서 제조될 수 있고, 종양성 DNA로 B 림프구를 직접 형질전환, 또는 엡스테인-바 (Epstein-Barr) 바이러스로 트랜스펙션하는 것과 같은 다른기술에서도 또한 제조된다. 예컨대, M. Schreier etal.(1980)HYBRIDOMA TECHNIQUES; Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS; Kennett et al.(1980) MONOCLONAL ANTIBODIES 참조; 또한 미국특허번호 제 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 및 4,493,890호 참조. HCV 에피토프에 대해 생성된 일련의 모노클론 항체들은 여러 성질들에 대해 스크린될 수 있다; 즉, 이소형, 에피토프 친화성 등에 대해. 여기서 사용된, "단일 도메인 항체" (dAb)는 지정된 항체에 특이적으로 결합하는, HL 도메인으로 구성되는 항체이다. dAb는 VL 도메인을 포함하지 않지만, 항체에 존재하는 것으로 알려진 다른 항원 결합 도메인, 예컨대, 캅파 및 람다 도메인을 함유할 수 있다. dAb를 제조하는 방법은 본 분야에 공지이다. 예를들면, Ward et al, Nature 341: 544(1989) 참조.

항체는 다른 공지의 항원 결합 도메인들은 물론 VH 및 VL 도메인으로 구성될 수도 있다. 이런 형태의 항체 및 그것의 제조방법의 예는 본 분야에 공지이고 (예를들면, 미국특허 제 4,816,467호 참조), 다음의 것을 포함한다. 예를들면, "척추동물 항체"는 통상 "Y"자 형태로 응집된 경쇄 및 중쇄를 포함하고 사슬들 사이에 공유결합을 가질 수도 가지지 않을 수도 있는, 그것의 4량체 또는 다량체인 항체를 말한다. 척추동물 항체에서 사슬의 아미노산 서열은, 원위치이든 시험관내이든 (예를들면, 하이브리도마에서), 척추동물에서 생성된 항체에서 발견되는 서열들과 상동성이다. 척추동물 항체는 예를들면, 정제된 폴리클론 항체 및 모노클론 항체, 여기서 기술된 제조방법들을 포함한다.

"혼성 항체"는 두 다른 항원이 4량체 또는 응집체에 의해 침전할 수 있도록,포유동물 항체 사슬들에 대해 개별적으로 상동성이고 그들의 새로운 응집체를 나타내는 사슬이 있는 항체이다. 혼성 항체에서, 두 번째쌍의 사슬이 두 번째 항체에 대해 발생한 항체에서 발견되는 것들과 상동성인 것에 비해, 한쌍의 중쇄 및 경쇄는 첫번째 항원에 대해 발생한 항체에서 발견되는 것들에 대해서 상동성이다. 이 결과는 "2가성"의 특성의 결과가 된다, 즉, 두개의 항원에 동시적으로 결합할 수 있는 능력. 그러한 혼성체는 하기에 나타낸 바와같은 키메라 사슬을 사용하여 또한 형성된다.

"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄가 융합된 단백질인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 아미노산의 한 부분은 특정 종이나 특정 부류에서 유래한 항체의 대응하는 서열에 동형인 반면 사슬의 잔여 단편은 다른 종 및/또는 부류에서 유래한 서열에 동형이다. 일반적으로, 중쇄와 경쇄 모두의 가변부는 척추 동물의 한 종에서 유래한 가변부나 항체와 유사한 반면, 불변부는 척추 동물의 다른 종에서 유래한 항체의 서열에 동형이다. 그러나, 그 정의는 이 특정 예에 한정되지 않는다. 이들 기원이 상이한 부류에서 유래하든 상이한 종에서 유래하든 및 융합 지점이 가변부든 불변부든지, 중쇄나 경쇄 또는 둘 모두가 상이한 기원의 항체의 서열과 유사한 서열의 조합으로 구성된 어떤 항체도 또한 포함된다. 그러므로, 불변부도 가변부도 알려진 항체 서열과 유사하지 않은 항체를 제작하는 것이 가능하다. 그렇다면, 예를 들어, 특정 항원에 고도의 특이적 친화성을 가지는 가변부를 가지거나, 불변부가 증강된 보체 고정을 도출할 수 있는 항체를 제작하거나, 특정 불변부가 가지는 성질의 다른 개선을 이루는 것이 가능하다.

다른 예는, 척추 동물의 천연 발생 아미노산 서열이 변화된 항체를 지칭하는 "변화된 항체"이다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 원하는 성질을 가지는 항체가 재고안될 수 있다. 가능한 변화는 다수이고 하나 이상의 아미노산의 변화에서부터 일부분, 예를 들어, 불변부의 완전 재고안까지에 그 범위는 다양하다. 일반적으로, 불변부의 변화는 바람직한 세포성 과정 성질을 유지하기 위한 변화, 예를 들어, 보체 고정, 막과의 상호작용, 및 다른 이펙터 기능의 변화이다. 가변부의 변화는 항원 결합 성질을 변화시키기 위하여 이루어질 수 있다. 항체는 또한 분자나 물질의 특이적 세포나 조직 부위로의 특이적 송달을 돕기 위하여 조작될 수 있다. 바람직한 변화는 분자생물학에서 알려진 기술, 예를 들어 재조합 기술, 부위-특이적 돌연변이유발 등에 의하여 이루어질 수 있다.

또 다른 예는, 제 2의 중쇄의 Fc (즉, 기부) 영역에 결합된 중쇄/경쇄 이량체를 포함하는 응집체인 "단일결합가 항체"이다. 이 유형의 항체는 항원성 변조에서 벗어난다. 예를 들어, Glennie et al. Nature 295 : 712 (1982)를 참조하시오. 항체의 정의 내에는 항체의 "Fab" 단편 또한 포함된다. "Fab" 부위는, 중쇄와 경쇄의 분지 부분을 포함하는 서열에 거의 균등하거나 유사하고, 특이적 항원에 면역학적 결합을 나타내는 것으로 증명되었으나 이펙터 Fc 부분을 결여한 중쇄와 경쇄의 부분을 지칭한다. "Fab"는, 고안된 항원이나 항원 부류에 선택적으로 반응할 수 있는, (F(ab)2로 지칭되는) 2H와 2L 사슬을 함유하는 4량체 뿐 아니라 (Fab′로 일반적으로 알려진) 중쇄 하나와 경쇄 하나의 응집체를 포함한다. Fab 항체는 상기된 것, 즉, "척추동물 Fab", "혼성 Fab", "키메라 Fab", 및 "변화된 Fab"와 유사한 서브세트로 나누어질 수 있다. 항체의 Fab 단편을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 재조합 기술에 의한 단백질 분해와 합성을 포함한다.

"항원-항체 복합체"는 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 의하여 형성되는 복합체를 지칭한다.

"면역원성 폴리펩티드"는 단독이든 또는 담체와 연결되어서든, 애쥬번트 존재 또는 부존재 하에서 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 도출하는 폴리펩티드를 지칭한다.

"항원성 결정인자"는 특이적 항체 분자나 특이적 세포 표면 수용체가 결합하는, 항원 또는 합텐 상의 부위를 지칭한다.

여기에서 사용될 때, "치료"는 (i) 전통적 백신에서와 같은 감염이나 재감염의 방지, (ii) 증상의 감소나 제거 및 (iii) 문제의 병원체의 실질적 또는 완전한 제거를 지칭한다. 치료는 예방적 (감염 전) 또는 치료적 (감염 후)으로 이루어진다.

"척추 동물 피험자"는 침팬지와 다른 유인원과 원숭이 종 같은 비-인간 영장류를 포함하는, 인간과 다른 영장류; 소, 양, 돼지, 염소 및 말 같은 농장 동물; 개와 고양이 같은 가내 포유동물; 마우스, 래트 및 기니아 피그 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물; 닭, 칠면조 및 다른 닭목의 새, 오리, 거위 등 같은 가금, 야생 및 경기용 새를 포함하는 새를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 척색동물 아문의 어떤 구성원을 의미한다. 이 용어는 특정 연령을 지칭하지는 않는다. 따라서, 성체와 유체 모두가 포괄되도록 의도된다. 여기에 기재된 발명은, 이들 척추동물의모두의 면역 체계가 유사하게 작동하므로, 상기 척추동물 종의 어떤 것에서도 사용되도록 의도된다.

II. 본 발명을 수행하는 방식

본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 이 발명은 특정 조제물이나 방법 매개변수에 한정되지 않고, 당연히 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 여기에 사용되는 용어는 본 발명의 특정 구체예를 기재하기 위한 것일 뿐, 이에 한정하기 위한 것이 아님 또한 이해되어야 한다.

여기에 기재된 것과 유사하거나 균등한 다수의 조성물과 방법이 본 발명의 실시에 사용될 수 있으나, 바람직한 물질과 방법은 여기에 기재된다.

일반적 개요

HCV가 발산적이고 세포성 뿐 아니라 체액성 면역 반응이 이 인간 병원체와 싸우는데 바람직하기 때문에, HCV 백신의 목적의 하나는 광범위한 항원에 대한 광범위한 면역성을 제조하는 것이다. 외피 당단백질에 대하여 생성되는 항체가 바이러스 중화에 도움이 될 수 있으며, 다른 영역을 포함하는 백신으로부터 유래될 추가적 이점이 있다. 폴리뉴클레오티드에 대하여 생성되는 T-헬퍼 반응의 가능성은 세포독성 T 세포의 생성과 마찬가지로 벡신 세팅에서 도움이 된다. 비-구조 영역은 후보 항원을 나타내지만 프로테아제에 의하여 프로세싱되어 몇몇 폴리펩티드를 생성시키고 정제를 복잡하게 한다. 그러므로, NS3 프로테아제에 의하여 프로세싱되지 않은 비-구조 카세트를 유발하는 것이 유리할 수 있다.

본 발명은, 촉매 도메인을 제거하는, NS3의 N-말단 결실과 관련된 조성물과방법을 사용하여 이런 및 다른 문제를 해결한다. 이와 같이 하여, 비-구조 영역의 잔여물의 일부 또는 전부가 (NS5B를 통하여) 온전한 폴리펩티드로서 발현된다. 이 종의 발현은 효모 뿐 아니라 포유동물 세포 내에서 입증되어 왔다. 게다가, 특정 양태에서, HCV 코어 폴리펩티드 (또는 그것의 단편)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 비-구조 카세트의 카르복시-말단에 (예를 들어 작동 가능하게) 부착된다. 코어 코딩 영역은 HCV 분리체 사이에서 상대적으로 고도로 보존적이므로, 이 영역의 존재는 면역반응을 증강시킬 수 있다. 코어는 그것의 C- 말단에 매우 소수성 도메인 (아미노산 174-191)을 가지므로, 코어의 더 짧은 별형 또한 폴리펩티드 상에서 조작되었다. 여기에서 상세히 기재되는 바와 같이, 돌연변이 NS 폴리펩티드의 C-말단 상에 조작될 때, 코어 내지 아미노산 121로의 절단은 아미노산 173 절단보다 더 고도의 발현을 야기한다. C-말단 절단된 코어가 폴리펩티드에 융합된 대부분의 비-구조 영역의 조합은 신규하고 백신 면역화에 유리하다. 더구나, 목적이 반드시 이 폴리펩티드에 대하여 항체반응을 생성하는 것이 아니므로, 천연 입체구조를 유지하는 것이 필요하지 않고, 이는 더 용이한 정제 프로토콜을 가능케 한다.

돌연변이 HCV 비-구조 폴리펩티드

HCV 균주의 게놈은, 폴리단백질로 전사되는 약 9,000 내지 12,000 뉴클레오티드의 단일 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 한 HCV 폴리단백질은 NH2-코어-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH 순서의 적어도 10 개의 별개의 산물로 절단된다. 본 발명의 돌연변이 HCV 폴리펩티드는, 촉매성 도메인을 제거하거나 무력화시키는, NS3에서의 N-말단 결실을 함유한다. 바람직하게는, 비록 특정 구체예에서는 폴리펩티드는 잔여 NS 폴리펩티드, 예를 들어, NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b (예를 들어, NS3NS3-NS5a-NS5b ; NS3-NS4a-NS4b ; NS3-NS4a-NS4b-NS5a ; NS3-NS4b-NS5a-NS5b ; NS3-NS4a-NS5a ; NS3-NS4b-NS5a ; NS3-NS4b-NS5b ; 등)의 조합을 포함하는 돌연변이 NS 폴리펩티드의 모두 보다 적은 것을 포함하지만, 폴리펩티드는 또한 비-구조 영역의 잔여부분을 함유한다.

HCV NS3 단백질은 프로테아제와 헬리카제로서 기능을 하고 (HCV-1과 상대적으로 번호매김 할 때) 폴리단백질의 대략 아미노산 1027 내지 아미노산 1657에서 존재한다. Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 2451-2455 참조. (HCV-1과 상대적으로 번호매김 할 때) HCV NS4 는 아미노산 1658 내지 아미노산 1972에서, NS5a는 대략 아미노산 1973 내지 아미노산 2420에서, 그리고 HCV NS5b는 아미노산 2421 내지 아미노산 3011 에서 존재한다(Choo et al., 1991).

여기에서 기재되는 돌연변이 폴리펩티드는 NS3, NS4 (NS4a와 NS4b), NS5a, 및 NS5b 폴리펩티드의 전장 폴리펩티드이거나 부분일 수 있다. NS3, NS4 (NS4a와 NS4b), NS5a, NS5b, NS3NS4NS5a, 및 NS3NS4NS5aNS5b의 에피토프는 몇가지 방법으로 확인될 수 있다. 예를 들어, NS3, NS4, NS5a, NS5b 폴리뉴클레오티드 또는 상기 것의 어느 조합을 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어, 폴리펩티드나 단백질에 대한 단일클론 항체를 사용한 면역 친화성 정제에 의하여 분리될 수 있다. 분리된 단백질 서열은, 그 다음 정제된 단백질의 단백질 분해적 절단에 의하여, 합하여 전체 단백질 서열을 포괄하는 일련의 짧은 펩티드를 제조하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 100-원 폴리펩티드로 시작하여 각 폴리펩티드는, T 세포 수용체에 의하여 인지되는 HCV-활성화 T 세포 상의 에피토프의 존재에 대하여 시험될 수 있고, 점차 작고 중복되는 단편이 그 다음 관심의 에피토프를 맵핑하기 위하여 확인된 100-원(mer)으로부터 시험될 수 있다.

HCV-활성화 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의하여 인식되는 에피토프는 예를 들어⁵¹Cr 배출 분석 (실시예 2 참조)또는 림프 증식 분석(실시예 4 참조)에 의하여 확인될 수 있다.⁵¹Cr 배출 분석에서, 표적 세포는, 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 표적 세포 내로 클로닝함으로써, 관심의 에피토프를 제시하도록 제작될 수 있다. 비-구조 폴리펩티드는 융합 단백질 내에서 어떤 순서로도 존재할 수 있다. 만일 바람직하다면, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 가지 이상의 하나 이상의 폴리펩티드가 융합 단백질 내에 존재할 수 있다. HCV의 다수 바이러스 균주가 존재하고, 이들 균주 중 임의의 것의 NS3, NS4, NS5a, 및 NS5b 폴리펩티드가 융합 단백질에 사용될 수 있다.

NS3, NS4, NS5a, 및 NS5b의 핵산과 아미노산 서열을 포함하는 다수의 HCV 균주와 분리체의 핵산과 아미노산 서열이 결정되었다. 예를 들어, 분리체 HCV J1.1은 Kubo et al. (1989) Japan. Nucl. Acids Res. 17 : 10367-10372 ; Takeuchi et al. (1990) Gene 91 : 287-291 ; Takeuchi et al. (1990) J. Gen. Virol. 71 : 3027-3033 ; 및 Takeuchi et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18 : 4626에 기재된다. 두가지 독립적 분리체인 HCV-J와 BK의 완전항 코딩 서열은 각각 Kato et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 9524-9528 and Takamizawa et al., (1991) J.Virol. 65 : 1105-1113에 의하여 기재되었다.

HCV-1 분리체를 기재한 간행물은 Choo et al. (1990) Brit. Med. Bull. 46 : 423-441 ; Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 2451-2455 및 Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1711-1715를 포함한다. HCV 분리체 HC-J1과 HC-J4는 Okamoto et al. (1991) Japan J. Exp. Med. 60 : 167-177에 기재된다. HCV 분리체 HCT 18~, HCT 23, Th, HCT 27, EC 1 및 EC 10은 Weiner et al. (1991) Virol. 180 : 842-848. HCV 분리체 Pt-1, HCV-K1 및 HCV-K2는 Enomoto et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 170 : 1021-1025에 기재된다. HCV 분리체 A, C, D & E는 Tsukiyama-Kohara et al. (1991) Virus Genes 5 : 243-254에 기재된다.

NS3, NS4 및 NS5의 적어도 일부를 포함하는 돌연변이 HCV 폴리펩티드 각각은 동일한 HCV 균주나 분리체로부터 또는 상이한 HCV 균주나 분리체로부터 얻어질 수 있다. 따라서, 폴리펩티드의 각 비-구조 영역은 동일한 HCV 균주나 분리체 또는 각 상이한 HCV 균주나 분리체로부터 유래할 수 있다. 여기에 기재된 돌연변이 HCV 비-구조 폴리펩티드에 추가하여, 단백질은 HCV 폴리단백질에서 유래하는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, HCV 폴리 단백질의 코어영역으로부터 유래하는 폴리펩티드 포함하는 것이 바람직하다. 이 영역은 HCV-1에 상대적으로 번호매김된, 아미노산 위치 1 내지 191에 존재한다. 전장 단백질이나 전장 단백질의 에피토프는, 아미노산 10-53, 아미노산 10-45, 아미노산 67-88, 아미노산 120-130, 또는 예를 들어 Houghton et al., U. S. Patent No. 5, 350, 671 ; Chien et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89 : 10011-10015 ; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8 : S33-39 ; Chien et al., International Publication No. WO 93/00365 ; Chien, D. Y., 국제출원번호. WO 94/01778 ; 및 공유인 U. S. 특허 번호 6, 150, 087에서 확인된 코어 에피토프 중 임의의 것에서 발견되는 에피토프 같은 피험자 융합에 사용될 수 있다. 제시될 때, 코어 같은 추가적 비-구조 HCV 폴리펩티드가 동일한 HCV 균주나 분리체로부터 또는 상이한 HCV 균주나 분리체로부터 얻어질 수 있다.

바람직하게는, 이들 단백질의 구성요소 뿐 아니라 상기-기재된 돌연변이 단백질은 재조합적으로 제조된다. 이들 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적당한 발현 시스템에서 발현될 수 있는 발현 벡터 내로 도입될 수 있다. 다양한 박테리아, 효모, 포유동물, 곤충 및 식물 발현 시스템이 당업계에 이용가능하고 이같은 시스템 중 어느 것도 사용될 수 있다. 선택적으로, 이 단백질을 코딩하는 폴리펩티드는 무-세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 이 같은 방법은 당업계에 주지이다. 단백질은 또한 고상 단백질 합성에 의하여 제작될 수 있다.

바람직하다면, 돌연변이 폴리펩티드나 이 폴리펩티드의 개별 구성요소는 또한 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 스트랩토코커스 단백질 A 같은 단백질 정제에 유용한 리간드 뿐만 아니라 아미노산 링커나 신호서열 같은 아미노산 서열을 함유할 수 있다.

폴리뉴클레오티드

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 나타난 뉴클레오티드 서열로부터 물리적으로유래할 필요는 없고, 예를 들어 화학적 합성이나 DNA 복제 또는 역전사나 전사를 포함하는 어떤 방식으로든 제작될 수 있다. 또한, 표시된 서열의 그것에 대응하는 영역의 조합이 의도된 용도에 일치하도록 당업계에 알려진 방법에 의하여 변형될 수 있다.

바람직한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는, 융합된 형태든 성숙 형태든 및 분비를 허용하는 신호 서열을 함유하든 하지 않든, 편리한 임의의 숙주에 적당한 발현 벡터 내로 라이게이션될 수 있다. 진핵 및 원핵 숙주 모두가 재조합 폴리펩티드 형성에 현재 사용되고 더 일반적인 대조표준 시스템의 몇가지와 숙주 세포의 요약이 아래에 주어진다. 이 같은 숙주 세포에서 생산되는 폴리펩티드는 그 다음 용균된 세포 또는 배양 배지로부터 분리되어 의도된 용도에 사용하는데 필요한 정도로 정제된다.

정제는, 예를 들어, 미분적 추출, 염 분획, 이온 교환 수지 상의 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 원심분리, 불용성 단백직의 알칼리성 용해 등의 당업계에 알려진 기술에 의할 수 있다. 예를 들어, Methods in Enzymology for a variety of methods for Purifying proteins 참조.

폴리뉴클레오티드는 전체 HCV 게놈보다는 적은 것을 함유하고 RNA나 단일- 또는 이중-사슬 DNA를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 단백질이나 지질같은 다른 구성요소가 없도록 분리된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 링커를 코딩하는 서열, 신호 서열, 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 스트랩토코커스 단백질 A 같은 단백질 정제에 유용한 리간드같은 다른 뉴클레오티드 서열을포함할 수 있다.

돌연변이 HCV 비-구조 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 HCV로 감염된 개체의 혈장, 혈청, 또는 간 호모지네이트에 존재하는 핵산 서열에서 유래한 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있거나, 예를 들어 자동 합성기를 사용하여 실험실에서 합성될 수 있다. HCV 게놈 DNA나 cDNA 유래 폴리펩티드를 증폭하기 위하여 PCR 같은 증폭 방법이 사용될 수 있다.

더구나, 본 발명의 HCV의 NS3, NS4, 또는 NS5 아닌 폴리펩티드는 실질적으로완전한 바이러스 도메인을 포함할 수 있지만, 모두가 요구되는 많은 용도에 있어서 폴리펩티드는 바이러스의 항원성 또는 면역원성 영역을 포함한다. 폴리펩티드의 항원성 영역은 일반적으로 상대적으로 작은-전형적으로 8 내지 10원 아미노산 또는 그 길이 미만의 것이다. 5원 아미노산 정도로 작은 단편이 항원영역을 특성화할 수 있다. 이들 단편은 예를 들어 C, E1 또는 E2 에피토프의 영역에 대응할 수 있다. 따라서, C, E1 또는 E2의 cDNA를 기초로 사용하여, C, E1 또는 E2 폴리펩티드의 짧은 단편을 코딩하는 DNA가 융합 단백질 또는 분리된 폴리펩티드로서 재조합적으로 발현될 수 있다. 또한, 짧은 아미노산 서열은 화학적 합성으로 편리하게 얻어질 수 있다.

여기에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 발생하는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 또는 천연에서 발생하지 않는 인공 서열을 포함할 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는 표준 분자생물학 기술을 사용하여 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 형성하도록 라이게이션될 수 있다. 바람직하다면, 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 클로닝되고, 본 발명의 융합 단백질이 발현되고 세포 배양액으로부터 분리될 수 있도록, 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충, 식물 또는 포유동물 세포 내로 형질전환될 수 있다.

예를 들어 박테리아, 효모, 곤충, 식물 또는 척추동물 세포를 포함하는 다양한 재조합 숙주에서의 이들 도메인을 함유하는 폴리펩티드의 발현은, 진단, 검출 및 백신에 사용될 수 있는 중요한 면역학적 시약을 초래할 수 있다.

바이러스 유래 게놈을 추출하고, cDNA라이브러리를 제작하고 프로빙하고, 클론을 서열 결정하고, 발현 벡터를 제작하고, 세로를 형질전환하고, 방사성 면역분석과 ELISA 분석 같은 면역학적 분석 등을 수행하는데 사용되는 일반적인 기술은 당업계에 알려져 있고, 이들 기술을 기재한 실험실 안내서가 이용가능하다. 그러나, 일반적 안내서로서, 다음 것들이 그것을 수행하는데 유용한 이 같은 방법 및 물질에 대하여 현재 이용 가능한 기원 들을 제시한다.

공존할 수 있는 적당한 대조표준 서열이 사용될 때, 원핵 및 진핵 숙주 모두는 원하는 코딩 서열의 발현에 사용된다. 원핵 숙주 중 E. coli가 가장 자주 사용된다. 원핵생물에 대한 발현 대조표준 서열은 오퍼레이터 부분을 선택적으로 포함하는 프로모터 및 리보솜 결합 부위를 함유한다. 원핵세포 숙주에 적당한 전달 백터는 일반적으로 예를 들어, 암피실린과 테트라시클린 내성을 가지는 오페론을 함유하는 플라스미드인 pBR322, 및 항체 내성 마커를 나타내는 서열을 함유하는 다양한 pUC 벡터로부터 유래한다. 이들 마커는 선택에 의하여 성공적인 형질전환체를 얻는데 사용한다. 일반적으로 사용되는 원핵 대조표준 서열은 β-락탐 (페니실린)과 락토스 프로모터 시스템 (Chang et al. (1977), Nature 198 : 1056), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel et al. (1980) Nucleic Acid Res. 8 : 4057), 람다-유래 P [L] 프로모터와 N 유전자 리보솜 결합 부위 (Shimatake et al. (1981) Nature 292 : 128) 및 trp과 lac UV5 프로모터의 서열에서 유래한 혼성 tac 프로모터 (De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 292 : 128)를 포함한다. 상술의 시스템은 E. Coli에 특히 적당하다; 만일 바람직하다면, Bacillus나 Pseudomonas 같은 다른 원핵 숙주가, 대응하는 대조표준 서열과 함께 사용된다.

진핵 숙주는 배양 시스템 내 포유동물과 효모 세포를 포함한다. 숙주로서 이용가능한 포유동물 세로주는 당업계에 알려져 있고, HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO)세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 구입 가능한 다수의 불사화 세포주를 포함한다. 포유 동물 세포를 위한 적당한 프로모터는 또한 당업계에 알려져 있고, Simian Virus 40 (SV40)(Fiers (1978), Nature 273 : 113), Rous sarcoma 바이러스 (RSV), 아데노바이러스 (ADV), 및 소 파필로마 바이러스(BPV)로부터 유래한 것 같은 바이러스 프로모터를 포함한다. 포유동물 세포는 또한 터미네이터 서열 및 폴리 A 부가 서열을 필요로 하고; 발현을 증가시키는 인핸서 서열 또한 포함될 수 있고 유전자의 증폭을 초래하는 서열 또한 바람직하다. 이들 서열은 당업계에 알려져 있다. 포유 동물에서의 복제에 적당한 벡터는 바이러스성 레플리콘, 또는 NANBV 에피토프를 코딩하는 적당한 서열의 숙주 게놈 내로의 삽입을 보장하는 서열을 포함한다.

우두 바이러스 시스템 또한 포유 동물 내에서 외래 DNA를 발현시키는데 사용된다. 이형 유전자를 발현하기 위하여, 외래 DNA는 일반적으로 우두 바이러스의 티미딘 키나제 유전자 내로 삽입된 다음, 감염된 세포가 선택될 수 있다. 이 과정은 당업계에 알려져 있고, 더 나아간 정보는 이들 참고 문헌에서 발견될 수 있다 (Mackett et al. J. Virol. 49 : 857-864 (1984) and Chapter 7 in DNA Cloning, Vol. 2, IRL Press).

효모 발현 시스템은 또한 당업계에 통상적 지식을 가진자에게 알려져 있다. 효모 프로모터는 효모 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 코딩서열의(예를 들어, 구조 유전자) mRNA로의 하류(3') 전사를 할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 일반적으로 코딩서열의 5' 말단에 근접하여 위치하는 전사 개시 영역을 가질 것이다. 이 전사 개시 영역은 일반적으로 RNA 폴리머라제 결합 부위 ("TATA Box")와 전사 개시 부위를 함유한다. 효모 프로모터는 또한, 만약 존재한다면 일반적으로 구조유전자와 원거리에 있는 상류 활성체 서열 (UAS)인 제 2의 도메인을 가진다. UAS는 조절된 (유도적) 발현을 허용한다. 조절된 발현은 포지티브나 네거티브일 수 있어서, 전사를 증강 또는 감소시킬 수 있다.

효모는 활성 대사 경로를 가지는 발효 생체이고 따라서 대상 경로 내 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 예는 알콜 탈수소효소 (ADH) (EP-A-0 284 044), 에놀라제, 글루코키나제, 포도당-6-포스페이트 이소머라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈수소효소 (GAP 또는 GAPDH), 헥소키나제, 포스포프룩토키나제, 3-포스포글리세리트 뮤타제, 및 피루베이트 키나제 (PyK) (EPO-A-0 329 203)를 포함한다. 산 포스페이트를 코딩하는 이스트 PHO5 유전자는 또한 유용한 프로모터 서열을 제공한다 (Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 1).

또한, 천연적으로 존재하지 않는 합성 프로모터 또한 효모 프로모터로 기능한다. 예를 들어, 한 효모 프로모터의 UAS 서열은 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 부위와 연결되어 합성 혼성 프로모터를 생성한다. 이 같은 혼성 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 부위에 연결된 ADH 조절 서열을 포함한다. (US 특허 제 4, 876, 197호 및 제 4, 880, 734호). 혼성 프로모터의 다른 예는 GAP나 PyK (EP-A-0 164 556)같은 해당효소 유전자의 전사조절 부위와 결합된 ADH2, GAL4, GAL10, 또는 PHO5 유전자의 조절 서열로 구성된 프로모터를 포함한다. 나아가, 효모 프로모터는, 효모 RNA 폴리머라제를 결합시키고 전사 개시의 능력을 가지는 비-효모 기원의 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 이 같은 프로모터의 예는 특히 (Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 1078 ; Henikoffetal. (1981) Nature 283 : 835 ; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96 : 119 ; Hollenberg et al. (1979)"The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae,"in : Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K. N. Timmis and A. Puhler) ; Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11 : 163 ; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2 : 109) 에 기재된 것을 포함한다.

DNA 분자는 효모에서 세포내 발현될 수 있다. 프로모터 서열은 DNA 서열에직접 연결될 수 있고, 그 경우 재조합 단백질의 N-말단에서의 제 1의 아미노산은 항상, ATG 개시 코돈에 의하여 코딩되는 메티오닌일 것이다. 만일 바람직하다면, N-말단의 메티오닌은 시아노겐 브로미드에 의한 시험관내 항온처리에 의하여 단백질로부터 절단된다.

융합 단백질은, 포유 동물, 배큘로바이러스, 및 박테리아 발현 시스템 뿐 아니라 효모 발현 시스템에 대한 대안을 제공한다. 일반적으로, 내인성 효모 단백질의 N-말단 부분 또는 다른 안정한 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 이형 코딩 서열의 5′말단과 융합된다. 발현되면, 이 구성체는 두 아미노산 서열의 융합체를 제공할 것이다. 예를 들어, 효모나 인간 스퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD) 유전자는 외래 유전자의 5′말단에서 연결될 수 있다. 두 아미노산 서열의 연결부위에서 DNA 서열은 절단 부위를 코딩하거나 코딩하지 않을 수 있다. EP-A-0 196 056 참조. 다른 예는 유비퀴틴 융합 단백질이다. 이같은 융합 단백질은, 외래 단백질로부터의 유비퀴틴의 절단을 위한 프로세싱 효소 (예를 들어, 유비퀴틴-특이적 프로세싱 프로테아제)와 관련된 부위를 바람직하게 유지하는 유비퀴틴 영역으로부터 제작된다. 따라서, 이 방법에 의하여, 천연 외래 단백질이 분리될 수 있다 (예를 들어, W088/024066).

대안으로, 외래 단백질은 또한, 외래 단백질의 효모내 배출을 위하여 제공되는 리더 서열 단편으로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 키메라 DNA 분자를 제조함으로써 세포로부터 성장 배지로 배출될 수 있다. 바람직하게는, 리더 단편과 외래 유전자 사이에서 코딩되고 생체내 또는 시험관 내에서 절단될 수 있는 프로세싱 부위가 존재한다. 리더 서열 단편은 일반적으로 세포로부터 단백질의 배출을 야기하는 소수성 아미노산을 포함하는 신호 펩티드를 코딩한다.

적합한 신호 서열을 코딩하는 DNA 는 효모 인버타제 유전자(EP-A-0 012 873;JPO. 62,096,086) 및 A-인자 유전자(US 특허 4,588,684)와 같은 분비된 효모 단백질에 대한 유전자로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 인터페론 리더와 같은 비효모 기원의 리더는 또한 효모에서의 분비를 제공하도록 존재한다(EP-A-0 060 057).

분비 리더의 바람직한 클래스는 "프리"신호 서열, 및 "프로"영역 모두를 함유하는 효모 알파-인자 유전자의 단편을 사용하는 것이다. 사용될 수 있는 이러한 형태의 알파-인자 단편은 전장 프리-프로 알파 인자 리더(약 83 아미노산 잔기)뿐만 아니라 절단된 알파-인자 리더(일반적으로 약 25 내지 약 50 아미노산 잔기)(US 특허 4,546,083 및 4,870,008;EP-1-0 324 274)를 포함한다. 분비를 위하여 제공되는 알파-인자 리더 단편을 사용하는 추가적인 리더는 제1의 효모의 프리서열로 만들어지나, 제2의 효모 알파 인자로부터의 프로-영역은 아닌 혼성 알파-인자 리더를 포함한다(예를 들어, WO 89/02463참조).

일반적으로, 효모에 의해 인식된 전사 종결 서열은 번역 종결 코돈에 대하여 3'에 위치한 조절 영역이므로, 프로모터와 함께 코딩 서열의 양측면에 위치한다. 서열은 DNA 에 의해 코딩된 폴리펩티드로 번역될 수 있는 mRNA 의 전사를 지시한다. 전사 종결 서열 및 다른 효모-인식 종결 서열의 예는 해당 효소를 코딩하는 것과 같은 것이다.

일반적으로, 프로모터, 리더(원한다면), 관심의 코딩 서열, 및 전사 종결 서열을 포함하는 상기 개시된 성분은 함께 발현 구성체에 놓인다. 발현 구성체는 종종 효모 또는 세균과 같은 숙주에서 안정한 유지를 할 수 있는 염색체외 요소(예를 들어, 플라스미드)와 같은 레플리콘내에 유지된다. 레플리콘은 2 개의 복제 시스템을 가지므로, 그것이 예를 들어, 발현되도록 효모에 유지되고, 클로닝 및 증폭되도록 원핵 숙주에 유지되도록 허용할 수 있다.

그러한 효모-박테리아 셔틀 벡터의 예는 YEp24(Bostein et al.(1979)Gene 8:17-24), pCl/1(Brake et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:4642-4646)및 YRp17(Stinchcomb et al.(1982)J.Mol.Biol.158:157)를 포함한다. 게다가, 레플리콘은 높거나 낮은 복제 수 플라스미드를 가질 수 있다. 높은 복제 수 플라스미드는 일반적으로 약 5 내지 약 200, 통상적으로 약 10 내지 약 150 범위의 복제 수를 가질 것이다. 높은 복제 수 플라스미드를 함유하는 숙주는 바람직하게 적어도 약 10, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 약 20을 가질 것이다. 숙주상의 벡터 및 외래 단백질의 효과에 의존하여 높거나 낮은 카피수의 벡터가 선택될 수 있다. 예를 들어, 앞에서의 Brake et at.,참조.

대안으로서, 발현 구성체는 통합 벡터와 함께 효모 게놈안으로 통합될 수 있다. 통합 벡터는 통상적으로 벡터가 통합되도록 하는 효모 염색체와 상동인 적어도 하나의 서열을 함유하고, 바람직하게는 인접하는 두개의 발현 구성체를 함유한다. 통합은 벡터에서의 상동 DNA와 효모 염색체(ORR-Weaver et al.(1983) Methods in Enzymol. 101:228-245)사이의 재조합으로부터 생기는 것으로 보인다. 통합 벡터는 벡터에서의 개재를 위한 적절한 상동 서열을 선택함으로써 효모에서의 특이유전자로 직접 보내질 수 있다. 상기한 Orr-Weaver et al.,참조. 하나 또는 그 이상의 발현 구성체는 통합할 수 있고, 아마도 생산된 재조합 단백질의 수준에 영향을 줄 수 있다. (Rine et al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750) 벡터안에 포함된 염색체 서열은 벡터에서의 단일 구획(이것은 전체 벡터의 통합을 야기하고) 또는 염색체에서 인접한 구획과 상동인 두가지 구획 중의 하나로 나타날 수 있고, 벡터에서 발현 구성체에 인접하는 것은 오직 발현 구성체의 안정적인 통합을 초래할 수 있다.

통상적으로, 염색체외 및 통합 발현 구성체는 변형된 효모 균주의 선택을 허용하는 선택가능한 표지를 함유할 수 있다. 선택가능한 표지는 ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, 및 ALG7와 같은 효모 숙주에서 발현될 수 있는 생합성 유전자, 그리고 G418 내성 유전자를 포함할 수 있고, 이는 효모 세포에서 투니카마이신 및 G418에 대해 내성을 준다. 게다가, 적절한 선택가능한 표지는 또한 효모에게 금속과 같은 독성 화합물의 존재하에서 성장할 수 있는 능력을 줄 수 있다. 예를 들어, CUPI의 존재는 효모가 구리 이온의 존재하에서 성장할 수 있게 해준다 (Butt et al.(1987) Microbiol, Rev.51:351).

대안으로서, 상기한 화합물의 일부는 변형 벡터안으로 함께 넣을 수 있다. 변형 벡터는 통상 상기한 바와 같이, 레플리콘에서 유지되거나 또는 통합 벡터로 발전되는 선택가능한 표지로 구성된다.

발현 및 변형 벡터는 염색체외 레플리콘 또는 통합 벡터 중의 하나인데, 발전되어 많은 효모로 변형된다. 예를 들어, 발현 벡터는 그중에서도 특히 하기의효모로 발전되었다: 칸디다 알비칸스(Kurtz et al.(1986) Mol.Cell.Biol.6:142), 칸디다 말토사(Kunze, et al.(1985)J.Basic Microbiol. 25:141). 하세눌라 폴리모르파(Gleeson, et al.(1986)J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al.(1986) Mol.Gen. Gent. 202:302), Kluyeromyces fragilis(Das et al.(1984)J.Bacteriol.158:1165), Kluyeromyces lactis(De Louvencourt et al.(1983) J.Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135), Richia guillerimondii(Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141), Pichina pastoris(Cregg, et al.(1985) Mol. Cell.Biol. 5:3376;미국 특허 4,837,148 및 4,929,555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al.(1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al.(1983)J.Bacteriol. 153:163), Schizosaccaromyces pombe(Beach and Nurse(1981) Nature 300:706), 및 Yarrowia lipolytica(Davidow, et al.(1985) Curr. Genet. 10:380471 Gailardin, et al.(1985) Curr. Genet. 10:49)

효모 숙주안으로 외인성 DNA를 도입하는 방법은 당업계에서 잘 공지되고, 통상 변형 스페로플라스트 또는 알칼리 양이온으로 처리한 완전(무손상) 효모 세포의 의 변형을 포함한다. 변형 과정은 통상적으로 변형되는 효모 종에 의해 변한다. (예를 들어, Kurtz et al.(1986) Mol.Cell.Biol. 6:142;Kunze et al.(1985) J.Basic Michrobiol. 25:141; 칸디다; Gleeson et al.(1986) J.Gen.Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al.(1986) Mol.Gen.Genet. 202:302; Hansenula; Das et al.(1984) J.Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al.(1983) J.Bacteriol. 154:1165; Vander Berg et al.(1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces;Cregg et al.(1985) Mol.Cell.Biol. 5:3376; Kunze et al.(1985) J.Basic Microbiol. 25:141; 미국 특허 4,837,148 및 4,929,555; Pichina; Hinnen et al.(1978) Proc. Natl. Acad. Schi. USA 75;1929; Ito et al.(1983) J. Bacteriol.153:163 Saccharomyces; Beach and Nurse(1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces;Davidow et al.(1985) Curr. Genet. 10:39; Gallardin et al.(1985) Curr. Genet. 10:49;Yerrowia).

박테리아 발현 기술은 당 업계에 공지되어 있다. 박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 폴리머라제와 결합할 수 있고 mRNA로 코딩 서열(예를 들어, 구조 유전자)의 하류(3') 복제를 개시할 수 있는 어떠한 DNA 서열이다. 프로모터는 복제 개시 영역을 갖을 것이고 이것은 통상 코딩 서열의 5' 말단에 인접하여 위치한다. 이러한 복제 개시 영역은 통상 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 복제 개시 부위를 포함한다. 박테리아 프로모터는 또한 오퍼레이터라고 부르는 두번째 도메인을 가질 것이고, 이는 RNA 합성이 시작되는 인접한 RNA 폴리머라제 결합 부위를 겹칠수있다. 오퍼레이터는 음성 조절(유도할 수 있는)복제를 허용한다. 유전자 억제제 단백질이 오포레이트를 결합하고 따라서 특이 유전자의 복제를 억제한다. 구성적 발현은 오퍼레이터와 같은 음성 조절 성분의 존재하에서 발생할 수 있다. 게다가, 양성 조절은 그것이 만일 RNA 폴리머라제 결합 서열에 인접하여 존재한다면, 유전자 활성제 단백질 결합 서열에 의해 달성될 수 있다. 유전자 활성제 단백질의 예는 이화대사산물 활성제 단백질(CAP)인데, 이것은 Escherichia 콜리(E.coli)에서의 락(lac) 오페론의 복제를 개시하는것을 돕는다. (Raibaud et al.(1984) Annu. Rev. Genet.18:173) 조절된 발현은 따라서 양성 또는 음성 중의 하나가 될 수 있고, 따라서 복제가 증강되거나 감소한다.

염색체외 레플리콘 또는 통합 벡터 중에 하나인 발현 및 변형 벡터는 발전하여 많은 박테리아로 발전하였다. 예를 들어, 발현 벡터는 그중에서도 특히, 하기의 박테리아로 발전되었다.: Bacillus subtilis (Palva et al.(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582;EP-A-0036 259 및 EP-A-0 063 953; WO 84/04541), Esherichia coli(Shimatake et al.(1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al.(1986) J.Mol. Biol. 189:113; EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 및 EP-A-0 136 907), Streptococcus cremoris(Powell et al.(1988) Appl. environ. Microbiol. 54:655); Streptococcus lividans(owell et al.(1988) Appl. environ. Microbiol. 54:655), Streptococcus lividans(미국 특허 4,745,056).

외인성 DNA를 박테리아 숙주로 도입하는 방법은 당 업계에서 잘 공지되어 있고, 통상 CaCl₂또는 2가 양이온 및 DMSO와 같은 다른 약제로 처리된 박테리아의 변형 중의 하나를 포함한다. DNA는 또한 전기작동에 의해 박테리아 세포 안으로 도입될 수 있다. 변형 과정은 통상적으로 변형되는 박테리아 종에 의해 변한다. (예를 들어, Masson et al.(1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273;Palva et al.(1982) Proc.Natl.Acad. Sci.USA 79:5582; EP-A-0 036 259 및 EP-A-0 063 953; WO 84/04541,Bacillus, Miller et al.(19988) Proc. Natl.Acad.Sci. 85:856; Wang etal.(1990) J.Bacteriol. 172:949; Campylobacter, Cohen et al.(1973) Proc. Natl. Acad. Schi 69:2110; Dower et al. (1998) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner(1987)"Co1E1-유도된 플라스미드를 갖는 Escherichia coli의 향상된 변형 방법. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(eds. H.W.Boyer 및 S. Nicosia);Mandel et al.(1970) J.Mol. Biol. 53:159; taketo(1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Esherichia; Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus; fiedler et al.(1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas; Augustin et al.(1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus, Barany et al.(1980) J.Bacteriol. 144:698;Harlander(1987) "전기작동에 의한 Streptococcus lactis의 변형: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III);Perry et al.(1981) Infect. Immun. 32:1295;Powell et al.(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655;Somkuti et al.(1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus 참조)

게다가, 바이러스성 항원은 배큘로바이러스 시스템에 의해 곤충 세포에서 발현될 수 있다. Summer and Smith에 의한 배큘로바이러스 발현에 대한 일반적인 가이드는 Baculovirus 벡터 및 곤충 세포 배양 과정에 대한 방법 메뉴얼(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555)이다. 이형 유전자를 배큘로바이러스 게놈으로 포함시키기 위해서, 유전자는 먼저 일부 배큘로바이러스 서열을 함유하는 전달 벡터안으로 복제된다. 이러한 전달 벡터는 그것이 야생형 바이러스와 함께 곤충 세포로 동시 세포 감염될 때, 야생 타입 바이러스와 재조합할 것이다. 통상적으로, 전달 벡터는 처리되어 이형 유전자가 야생 타입 배큘로바이러스 다면체 유전자를 분열시킬 것이다. 이러한 분열은 재조합 바이러스에 감염된 세포가 야생 타입 바이러스에 감염된 세포와 표현형적으로 다를 것이기 때문에, 재조합 바이러스의 쉬운 선택을 가능하게 한다. 정제된 재조합 바이러스는 이형 유전자를 발현하는 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 신호 펩티드가 구조적으로 이형 유전자에 연결된다면, 외래 단백질은 배지에 분비될 수 있다.; 그렇지않으면, 단백질이 세포 용해질에서 결합될 것이다. 더 많은 정보는 Smith et al Mol.& Cell. Biol.3:2156-2156(1983) 또는 Luckow 및 Summers in Virology 17:31:39(1989)를 참조하라.

배큘로바이러스 발현은 또한 식물 세포에서도 영향받을 수 있다. 많은 식물 세포 배양 및 전체 식물 유전자 발현 시스템이 당 업계에 공지되어 있다. 식물 배양 유전자 발현 시스템의 예는 US 5,693,506;US 5,659,122; 및 US 5,608,143과 같은 특허에서 설명된 것들을 포함한다. 식물 세포 배양에서 유전자 발현의 추가적인 예는 Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863(1991)에 의해 설명되었다. 식물 단백질 신호 펩티드의 설명은 상기한 참고문헌에 더하여, Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40(1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407-418(1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738(1985); Rothstein et al.,Gene 55:353-356(1987);Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535(1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14(1989);Yu et al., Gene 122:247-253(1992)에서도 찾을 수 있다. 식물성 호르몬, 지베렐린 산 및 지베렐린 산에 의해 유발된 분비된 효소에 의한 식물 유전자 발현 조절의 설명은 R.L. Jones and J. MacMillin, Gibberellins; in:Advanced Plant physiology,. Malcolm B. Wikins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp.21-52 에서 찾아볼 수 있다. 신진대사적으로 조절된 다른 유전자를 설명하는 참고문헌은 Sheen, Plant Cell,2:1027-1038(1990);Maas et al., EMBO J.9:3447-3452(1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad Sci. 84:1337-1339(1987).

전체 재생된 식물을 얻기위해 프로토플라스트가 분리되고 배양된 모든 식물은 본 발명에 의해 변형되어 전달된 유전자를 함유하는 전체 식물이 회복되도록 할 수 있다. 실제로 모든 식물이 이것으로 제한되지는 않지만 사탕수수, 사탕무, 목화, 과일 및 다른 나무의 모든 종, 콩과식물 및 야채를 포함하여 배양된 세포나 조직으로부터 재생될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 일부 적절한 식물은 예를 들어Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum,및Datura속으로부터의 종을 포함한다.

형질전환은 숙주 세포안으로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 어떠한 방법,예를들어, 바이러스에서 폴리뉴클레오티드를 패키징하고 숙주 세포를 바이러스로 형질 도입하고, 폴리뉴클레오티드의 직접적인 흡수에 의해 일어날 수 있다. 사용된 형질전환 과정은 변형되는 숙주에 의존한다. 직접적인 흡수에 의한 박테리아 형질전환은 일반적으로 염화칼슘 또는 염화루비듐(Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69 : 2110 ; Maniatis et al. (1982), MOLECULAR CLONING ; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)으로 처리하는 것을 채용한다. 직접적인 흡수에 의한 효모 형질전환은 Hinnen et al.(1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75 : 1929 의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 직접적인 흡수에 의한 포유류 형질전환은 Graham 및 Van der Eb(1978), Virology 52:546 의 인산칼슘 석출법 또는 그것이 변형된 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

벡터 구성은 당업계에 공지된 기술을 사용한다. 부위-특이성 DNA 분열은 일반적으로 상업적으로 이용가능한 이러한 효소의 제조업체에 의해 명기된 조건하에서 적절한 제한 효소로 처리함으로써 수행된다.분열된 단편은 Methods in Enzymology(1980) 65:499-560에서 발견된 일반적인 과정에 따라, 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 겔 전기 영동 기술을 사용하여 분리될 수 있다.점착성 말단 단편은 적절한 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재하에서 E. coli DNA 폴리머라제I(Klenow)를 사용하여 무딘 말단으로 될 수 있다. S1뉴클레아제로 처리하는 것도 또한 사용될 수 있고, 어떠한 단일 가닥 DNA 일부분의 가수분해를 초래한다.

T4 DNA 리가제 및 ATP를 사용하는 표준 완충제 및 온도 조건을 사용하여 결찰을 수행하는데 점착성 말단 결찰은 무딘 말단 결찰보다 더 적은 ATP와 리가제를 필요로 한다. 벡터 단편이 결찰 혼합물의 일부로서 사용될때, 벡터 단편은 종종 박테리아 알칼리 포스파타제(BAP) 또는 송아지 장(관) 알칼리 포스페이트로 처리되어 5'-포스페이트를 제거하고 따라서 벡터의 라이게이션을 예방한다; 대안으로서, 원치않는 단편의 제한 효소 분해는 라이게이션을 막기위해 사용될 수 있다. 라이게이션 혼합물은 E.coli와 같은 적절한 클로닝 숙주로 변형되고, 예를 들어, 항생제 저항성에 의해 성공적인 변형이 선택되고, 정확한 구성을 위해 스크리닝된다.

합성 올리고뉴클레오티드는 Warner(1984), DNA 3:401에 의해 설명된 바와 같이, 자동 올리고뉴클레오티드 합성제를 사용하여 제조될 수 있다. 원한다면, 합성 표준은 반응을 위한 표준 조건을 사용하여,³²P-ATP의 존재하에서 폴리뉴클레오티드 키나아제로 처리함으로써³²P로 라벨링될 수 있다. Zoller(1982), Nucleic Acids Res. 10:6487에 의해 설명된 바와 같이, cDNA 라이브러리로부터 분리된 것들을 포함하는, DNA 서열은 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이유발을 포함하여 공지된 기술에 의해 변형될 수 있다.

본 발명의 발현 구성체는 원하는 융합을 포함하여, 또는 이들 융합의 개별적인 성분을 포함하는 개별적인 발현 구성체는 표준 유전자 운반 프로토콜을 사용하여, HCV-특이성 T 세포를 활성화하기 위해 핵산 면역에 사용될 수 있다. 유전자 운반 방법은 당업계에서 공지되어 있다. 미국 특허 Nos. 5, 399, 346, 5, 580, 859, 5, 589, 466 참조. 유전자는 척추동물 피험자에 직접적으로 또는 대안으로서, 생체외에서 피험자로부터 유도된 세포 및 피험자에서 재이식된 세포로 운반될 수 있다. 예를 들어, 구성체는 pBR322,pUC 또는 Co1E1와 같은 플라스미드 내에 함유된 플라스미드 DNA로서 운반될 수 있다.

게다가, 발현 구성체는 세포로 운반하기 전에 리포솜에 패키징될 수 있다. 지질 캡슐화는 일반적으로 핵산을 안정적으로 결합하거나 잡고 보유할 수 있는 리포솜을 사용하여 수행된다. 농축 DNA 대 지질 조제물의 비는 변할 수 있지만 일반적으로 대략 1:1(mg DNA:마이크로몰 지질)이 될 것이다. 핵산 운반을 위한 담체로서 리포솜의 사용의 리뷰에 대해서는 Hug and Sleight, Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1097 : 1-17 ; Straubinger et al., in Methods of Enzymology (1983), Vol. 101, pp. 512-527를 참조하라.

본 발명과 함께 사용하기 위한 리포솜 제조는 양이온(양전하), 음이온(음전하) 및 중성 조제물을 포함하고, 양이온 리포솜이 특히 바람직하다. 양이온 리포솜은 손쉽게 이용할 수 있다. 예를 들어, N[1-2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄(DOTMA)리포솜은 상표 Lipofectin, from GIBCO BRL, Grand Island, NY하에서 입수할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 다른 지질은 트랜스팩타세(DDAB/DOPE) 및 DOTAP/DOPE(Boerhinger)를 포함한다. (또한 Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84 : 7413-741 참조). 다른 양이온 리포솜은 당업계에 잘 공지된 기술을 사용하여 손쉽게 이용가능한 재료로부터 제조될 수 있다. Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75 : 4194-4198 참조; DOTAP(1,2-비스(올레올일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판)리포솜의 합성의설명에 대해서는 PCT Publication No. WO 90/11092 를 참조하라. 다양한 리포솜-핵산 복합체가 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조된다. Straubinger et al., in METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Vol. 101, pp. 512-527 ; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75 : 4194-4198 ; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394 : 483 ; Wilson et al., Cell (1979) 17 : 77) ; Deamer and Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976) 443 : 629 ; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76 : 836 ; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 3348) ; Enoch and Strittmatter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 145) ; Fraley et al., J. Biol. Chem. (1980) 255 : 10431 ; Szoka and Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75 : 145 ; and Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215 : 166. 참조.

DNA는 또한 Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta. (1975) 394 : 483-491에 의해 기술된 것들과 유사한 코클리에이트 지질 조성물로 운반될 수 있다.

바이러스 기반 시스템의 수는 포유류 세포안으로 유전자 전달을 위해 발전되어 왔다. 예를 들어, 레트로바이러스는 쥐 사크로마 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스,몰로니 쥐 백혈병 바이러스 및 Rous 사크로마 바이러스와 같이, 유전자 운반 시스템에 대해 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 벡터 안으로 삽입될 수 있고 레트로바이러스 입자로 패키징할 수 있다. 재조합 바이러스는 분리될 수 있고 그후 생체내 또는 생체외 중 피험자의세포로 운반될 수 있다. 레트로바이러스 시스템의 수는 설명되어 있다. (미국 특허 No. 5, 219, 740 ; Miller and Rosman, BioTechniques (1989) 7 : 980-990 ; Miller, A. D., Human Gene Therapy (1990) 1 : 5-14 ; Scarpa et al., Virology (1991) 180 : 849-852 ; Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90 : 8033-8037 ; and Boris-Lawrie and Temin, Cur. Opin. Genet. Develop. (1993) 3 : 102-109) 간략하게, 본 발명의 레트로바이러스 유전자 운반 전파체는 예를 들어, FIV,HIV,HIV-1,HVI-2 및 SIV와 같은 스푸마바이러스 및 렌티바이러스는 물론 B,C 및 D 타입 레트로바이러스를 포함하여, 다양한 레트로바이러스로부터 손쉽게 구성될 수 있다(RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 9185 참조). 그러한 레트로바이러스는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)와 같은 보관소 또는 수집물로부터 손쉽게 얻거나, 통상적으로 이용가능한 기술을 사용하여 공지된 공급원으로부터 분리될 수 있다.

아데노바이러스 타입 2 및 타입 5 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터의 수가 또한 기술되어 있다. 숙주 게놈안으로 통합하는 레트로바이러스와 달리, 아데노바이러스는 염색체외에서 존속하고 따라서 삽입 돌연변이유발과 관련된 위험을 최소화한다. (Haj-Ahmad and Graham, J.Virol.(1986)57;267-274;Bett et al.,J. Virol.(1993)67;591-5921;Mittereder et al.,Human Gene Therapy(1994)5;717-727;Seth et al.,J.Virol.(1994)68;933-940;Barr et al.,Gene Theraoy(1994)1:51-58;Berkner,K.L. BioTechniques(1998)6:616-629;및 Rich et al.,Human GeneTherapy(1993)4:461-476)

Michael et al.,J.Biol.Chem.(1993)268:6866-6869 및 Wagner et al., Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1992)89:6099-6103에서 기술된 아데노바이러스 키메라 벡터와 같은 분자 결합 벡터는 또한 유전자 운반에 사용될 수 있다.

이것으로 제한되지는 않지만 Sindbis 및 Semliki Forest 바이러스, VEE로부터 유도된 벡터와 같은 알파바이러스 속(genus)의 일부는 또한 관심있는 유전자를 운반하기 위한 바이러스 벡터로 사용되는 것을 볼 수 있다. 즉각적인 방법의 실행에 유용한 Sindbis 바이러스 유도된 벡터의 설명에 대해서는 Dubensky et al.,J.Virol.(1996)70:508-519; 및 International Publication Nos. WO 95/07995 및 WO 96/17072를 참조.

이것으로 제한되지는 않지만 원숭이 바이러스 40, 시토메갈로바이러스를 포함해서 다른 벡터가 사용될 수 있다. 살모넬라 ssp. 예르시니아 엔테로콜리티카, 시겔라 spp., 비브리오 콜레라, 마이코박테리아 균주 BCG, 및 리스테리아 모노시토겐과 같은 박테리아 벡터가 사용될 수 있다. MC 및 MCI, 박테리오페이지, 코스미드(파지 람다 코스 부위가 삽입된 플라스미드)와 같은 미니크로모솜 및 레플리콘(세포내에서 그들의 고유 제어하에서 복제할 수 있는 유전 성분)이 또한 사용될 수 있다.

발현 구성체는 또한 캡슐화되고, 흡수되고, 또는 특히 담체와 결합될 수 있다. 그러한 담체는 면역 시스템으로 선택된 분자의 다중 복제를 나타내고 국소 림프 노드에서 분자의 트랩(trapping) 및 보유를 증진한다. 입자들은 매크로페이지에 의해 식세포작용이 될 수 있고 시토킨 방출을 통해 항원 표시를 강화할 수 있다. PLG 로서 알려진 특정 담체의 예는 폴리(락티드) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드) 로부터 유도된 미세입자는 물론, 폴리메틸 메타크릴레이트 폴리머로부터 유도된 것들을 포함한다. 예를 들어, Jeffery et al., Pharm.Res.(1993)10;362-368;및 McGee et al.,J.Microencal.(1996) 참조.

광범위하게 다양한 다른 방법은 발현 구성체를 운반하는데 사용될 수 있다. 그러한 방법은 DEAE 덱스트란-중재 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 석출, 폴리리신- 또는 폴리오르미틴-중재 트랜스펙션, 또는 벤토나이트 및 카올린, 산화크롬, 마그네슘 실리케이트, 활석 등을 포함하여 스트론튬 포스페이트, 알루미늄 실리케이트와 같은 다른 불용성 무기염을 사용하는 석출을 포함한다. 트랜스펙션의 다른 유용한 방법은 전기작동, 소노포레이션, 프로토플라스트 융합, 리포솜, 펩토이드 운반 또는 현미주사를 포함한다. 예를 들어, 관심있는 세포를 변형하기 위한 기술의 논의를 위해서는 위에서의 Sambrook et al.,를 참조하고; 유전자 전달에 유용한 운반 시스템의 리뷰에 대해서는 Felgner, P.L.,Advanced Drug Delivery Reviews(1990)5:163-187를 참조하라. 전기작동을 사용한 DNA 운반의 한가지 특히 효과적인 방법은 국제 공보 No.WO/0045823에서 설명되어 있다.

추가로, 금 및 텅스텐과 같은 미립자 담체를 채용하는 바이오리스틱 운반 시스템은 특히 본 발명의 발현 구성체를 운반하는데 유용하다. 입자들은 일반적으로 환원된 분위기하에서, "유전자 총"으로부터 화약 방출을 사용하여, 구성체로 코팅되어 운반되고 고속으로 가속화된다. 그러한 기술의 설명 및 그것을 위한 유용한장비에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 Nos.4,945,050; 5,036,006; 5,100,792;5,179,022;5,371,015; 및 5,478,744 를 참조하라.

조성물

본 발명은 또한 여기서 설명된 HCV 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 예를 들어, 증상 시약에서 돌연 변이체 폴리펩티드(또는 이들 폴리펩티드를 폴리뉴클레오티드 인코딩)를 사용하는 진단학에서 유용하다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 사용하는 진단학은 당업자들에게 공지되어 있다.

게다가, 면역원 화합물은 여기서 설명된 폴리펩티드로부터 유도된 하나 이상의 면역원 폴리펩티드, 예를 들어 △NS35 폴리펩티드로부터 제조될 수 있다. 활성 성분으로서 면역원 폴리펩티드(들)을 함유하는 면역원 화합물의 제조는 당업자들에게 공지되어 있다. 전형적으로, 그러한 면역원 화합물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액; 용액에 적합한 고형, 또는 현탁액으로 제조되고, 또한 주사하기 전에 액체로 제조될 수 있다. 조제물은 또한 유상화될 수 있고 또는 단백질은 리포솜안에 캡슐화될 수 있다.

본 발명의 면역원 및 진단 조성물은 바람직하게 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 담체는 그 자체가 숙주에 해로운 항원의 생산을 유발해서는 안된다. 약학적으로 허용되는 담체는 당업자들에게 잘 공지되어 있다. 그러한 담체는 물론 이것으로 제한하는 것은 아니지만, 단백질, 유액 기능 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 비즈 등과 같은 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리글루탐산, 폴리리신등과 같은 폴리머 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 비활성 바이러스 입자와 같이 크고 느리게 신진대사되는 거대분자를 포함한다.

예를 들어 아세테이트, 프로피오에니트, 말로네이트 또는 벤조에이트는 물론이고 염화수소, 브롬화수소, 포스페이트, 또는 술페이트와 같은 미네랄 염과 같이 약학적으로 허용되는 염은 또한 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있다. 특히 유용한 단백질 기질은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티오글로불린, 오발부민, 테타누스 톡소이드 및 당업자들에게 잘 공지된 다른 단백질이다. 본 발명의 조성물은 또한 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제와 같은 물질은 물론이고 물, 살린, 글리세롤, 덱스트로스, 에탄올 등과 같은 액체 또는 부형제를 단독으로 또는 조합하여 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 본 발명의 조성물을 위한 담체로 사용될 수 있고, 그러한 리포솜은 상기되어 있다.

원한다면, B7-1 또는 B7-2, 또는 CM-CSF, IL-2 및 IL-12와 같은 시토킨과 같이, 림프구에 대한 면역원 표시를 향상시키는 동시-자극성 분자가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 선택적으로, 애쥬번트는 또한 조성물에 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 애쥬번트는 이것으로 제한되지는 않지만, (1)알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 술페이트 등과 같은 알루미늄염(알룸)(2)(a)5% 스퀄렌, 0.5% 트윈 80, 및 0.5% 스판 85(선택적으로 다양한 양의 MTP-PE함유)를 함유하는 MF59(PCT 공보 NO.WO 90/14837)수유에멀젼 조제물(무라밀 펩티드(하기참조) 또는 박테리아 세포 벽 성분과 같은 다른 특정 면역자극제를 갖거나 갖지않는)은 Model 110Y 마이크로유동화제(마이크로유동화제,뉴턴, MA )와 같은 마이크로유동화제를 사용하여, 초미세 입자로 조제된다. (b)10% 퀄란, 0.4% 트윈80, 5% 플루로닉-블락 폴리머 L121 및 thr-MDP(하기 참조)를 함유하는 SAF를 초미세 에멀젼으로 마이크로유동화하거나 소용돌이를 일으켜서 더 큰 입자크기의 에멀젼으로 성장시킨다.(c)2% 스퀄란, 0.2% 트윈80, 그리고 모노포스포릴리피드 A(MPL),트레할로스 디미콜레이트(TDM), 및 세포 벽 골격(CWS), 바람직하게 MPL + CWS (Detox^TM) 으로 구성되는 기로부터 하나 이상의 박테리아 세포 벽 성분을 함유하는 Ribi^TM애쥬번트(RAS)(Ribi 면역화학, 헤밀턴, MT); (3)Stimulon^TM(캠브리지 바이오사이언스, Worcester, MA)와 같은 사포닌 애쥬번트가 사용될 수 있다. ISCOMs(면역 자극 복합체)로부터 생성된 입자;(4)Complete Freund's Adjuvant(CFA) 및 Incomplete 's Adjuvant(IFA);(5)인터레우킨(예를 들어,IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-12등)과 같은 시토킨,인터페론(예를 들어 감마인터페론), 메크로페이지 군체 자극 인자(M-CSF), 종양 회저 인자(TNF) 등;(6)콜레라 독소(CT), 백일해 독소(PT), 또는 E.coli 열-불안정 독소(LT), 특히 LT-K63,LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 와 같은 박테리아 ADP-리보실레이팅 독소의 해독 돌연변이종, WO 93/13302 와 WO 92/19265참조;(7)조성물의 효과를 강화하기 위해 면역자극제로서 작용하는 다른 물질;그리고 (8)미국특허출원번호 09/285,855(1999.4.2출원) 및 국제 특허 출원 번호 PCT /US99/17308(1999.7.29 출원)에 기술된 바와 같이, 흡수된 거대분자를 갖는 미세입자 알루미늄염과 MF59가 바람직하다. 애쥬번트의 효과는 또한 다양한 애쥬번트로 구성된 면역원 화합물로 이러한 폴리펩티드의 투여로부터 기인하는 HCV 항원 서열을 함유하는 면역원 폴리펩티드에 대해 지시된 항원의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.

상기한 바와 같이, 무라밀 펩티드는 이것으로 제한되지는 않지만, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), -아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP라고 언급함), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민일-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE라고 언급함) 등을 포함한다.

그러므로, 그러한 재조합체 또는 합성 HCV 폴리펩티드는 백신으로 및 진단학적으로 사용될 수 있다. 또한, 이들 폴리펩티드에 대해서 생긴 항체들 또한 진단학적으로 또는 수동적인 면역치료요법적으로 사용될 수 있다. 또한, 이들 폴리펩티드에 대한 항체들은 HCV 입자를 분리 및 동정하는데 유용하다.

본래의 HCV 항원은 또한 HCV 비리온에서 분리될 수 있다. 비리온은 조직 배양중의 HCV 감염 세포 또는 감염된 숙주에서 생장할 수 있다.

투여 및 송달

본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 조성물(예를들면, 면역원성의 화합물)을 적당한 송달 수단을 사용하여 환자에 투여할 수 있다. 핵산을 숙주세포로 송달하는 방법은 앞서 논의되었다. 또한, HCV 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드는 보통 피하, 근육내, 경피(transdermal) 또는 경피 (transcutaneous)적으로 주사에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 어떤 애쥬번트(예를들면 LTK63, LTR72, 또는 PLG 조제물)들은 비강 또는 경구로 투여될 수 있다. 다른 방식으로 투여하기에 적당한 추가의 조제물들은 좌약을 포함한다. 좌약으로는, 종래의 바인더 및 담체가 포함될 수 있다. 예:폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드; 그러한 좌약들은 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2%의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 다른 경구적 조제물은 보통 부형제로 사용되는 예를들면 제약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘등을 포함한다. 이들 조성물들은 용액, 현탁악, 정제, 환제, 캡슐, 지효성 조제물 또는 파우더의 형태를 취하며, 10% 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 70%의 활성 성분을 함유한다.

본 발명의 폴리펩티드는 중성 또는 염 형태로 면역원성 화합물안으로 조제될 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 염은 산 첨가염(펩티드의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함하며, 예를들면 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 말레산등과 같은 유기산과 형성된다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 예를들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제 2 철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인등과 같은 유기 염기로부터 또한 유도될 수 있다.

면역원성 화합물은 1회 복용 조제물과 적합한 방식으로, 그리고 병의 예방 및/또는 치료요법적 유효량으로 투여된다. 투여량은 (일반적으로는 1회 복용당 5㎍ 내지 250㎍의 폴리펩티드임) 치료를 받을 환자, 항체를 합성할 환자의 면역계의 역량, 및 원하는 보호의 정도에 따라 달라진다. 투여되어야할 정확한 활성 성분의 양은 의사의 판단에 따르며, 각 환자에 따라 특별할 수 있다.

면역원성 화합물은 단일 복용 계획, 또는 바람직하게는 다중 복용 계획을 세울수 있다. 다중 복용 계획은 백신화의 주요 과정이 1-10의 분리된 복용량을 가질 수 있으며, 면역 반응을 유지 및/또는 재시행하는데 필요한 후속 시간 간격, 예를들면 2번째 복용을 위해 1-4달이 뒤따르며, 필요하다면 수개월후 후속 투여가 뒤따르는 것이다. 또한, 투여의 과정은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 함께 또는 순차적으로(예를들면, 폴리뉴클레오티드 조성물로 주투여하고, 폴리펩티드 조성물로 보조투여함) 포함할 수 있다. 투약 요법 또한 적어도 부분적으로 개인의 필요성에 따라 결정될 것이며, 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.

어떤 구체예에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 투여는 T 세포를 활성화시키는데 사용된다. 구성 및 변형이 단순하다는 실제적인 이익외에도, 변이체 NS 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여는 숙주내에서 변이체 NS 폴리펩티드 합성으로 이른다. 그러므로, 이러한 면역원은 본래의 번역 후 변형, 구조 및 변형과 함께 숙주 면역계에 제시된다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 사람과 같은 덩치가 큰 포유류에게는 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5 또는 10 mg/kg의 복용량으로 근육내 주사된다. 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드는 HCV에 감염되지 않은 포유류 또는 HCV에 감염된 포유류에 투여될 수 있다. 조성물내의 폴리뉴클레오티드 또는 융합 단백질의 구체적인 복용량은 종, 나이, 및 조성물을 투여하는 포유류의 일반적인 상태, 조성물 투여 형태를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 발명의 조성물의 유효량은 단지 일상적인 실험을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 적당한 복용량을 인식하는데 시험관내 및 생체내 모델을 적용할 수 있다. 일반적으로, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5 또는 10 mg/kg이 개코원숭이, 침팬치, 또는 사람과 같은 덩치가 큰 포유류에 투여될 것이다. 바람직하다면, 공동-자극 분자 또는 애쥬번트가 또한 조성물 투여 전, 후, 또는 함께 제공될 수 있다.

항체 및 진단학

HCV 에피토프에 대해 지시되는 단일클론 및 폴리클론 항체가 진단학에서 특히 유용하며, 중화하는 것들은 수동 면역요법에서 유용하다. 단일클론 항체는 구체적으로는 항-유전자형 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

항-유전자형 항체는 보호하는 것이 바람직한 감염성 제제의 항원의 "내부 이미지"를 전달하는 면역글로블린이다. 항-유전자형 항체를 배양하는 기술은 당업계에 알려져 있다. 예를들면, Grzych(1985), Nature 316:74; MacNamara등(1984), Science 226:1325, Uytdehaag 등(1985), J. Immunol. 134:1225 참조. 이들 항-유전자형 항체는 NANBH 의 치료 및/또는 진단은 물론 HCV 항원의 면역원성 영역의 해명에 유용할 수 있다.

바이러스 항원에 대해 면역분석법이 사용될 수 있다. 예를들면, 바이러스성 에피토프로 지시되는 단일클론 항체, 하나의 바이러스성 폴리펩티드의 에피토프로 지시되는 단일클론 항체의 조합, 다른 바이러스성 폴리펩티드의 에피토프로 지시되는 단일클론 항체, 동일한 바이러스성 항원으로 지시되는 폴리클론 항체, 다른 바이러스성 항원으로 지시되는 폴리클론 항체 또는 단일클론 및 폴리클론 항체의 조합.

면역분석 프로토콜은 예를들면 경쟁, 또는 직접 반응, 또는 샌드위치형 분석법에 기초할 것이다. 프로토콜은 또한 예를들면 고체 지지를 이용하거나 면역침전에 의할 수 있다. 대부분의 분석법은 라벨링된 항체 또는 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 라벨은 예를 들면, 형광의, 화학발광, 방사능, 또는 염색 분자일 수 있다. 탐침으로부터 신호를 증폭시키는 분석법도 알려져 있다. 예로는 바이오틴 및 아비딘을 이용하는 분석법, 및 ELISA 분석과 같은 효소 표지된 및 중개된 면역분석법이다. 효소-결합된 면역흡수 분석법(ELISA)을 항원 또는 항체 농도를 측정하는데 사용할 수 있다. 이 방법은 효소가 항원 또는 항체에 접합하는 것에 의존하며, 정량적 라벨로서 결합 효소 활성을 사용한다. 항체를 측정하기위해, 알고있는 항원은 고체상(예를들면, 마이크로플레이트 또는 플라스틱컵)에 고정되고, 시험 혈청 희석제로 배양되고, 세척되고, 효소로 라벨링된 항-면역글로블린으로 배양되며, 다시 세척된다. 라벨링에 적합한 효소는 당업계에 알려져 있으며, 예를들면, 겨자무 과산화수소를 포함한다. 고체상에 결합된 효소 활성은 특이성 기질을 첨가하여 측정하고, 생성물 조성을 결정하거나 기질 용도를 색체계를 이용하여 결정한다. 효소 활성 결합은 많은 항체 결합의 직접작용이다.

항원을 측정하기 위해, 알고있는 특이성 항체를 고체상에 고정시키고, 항원을 함유하는 시험 물질을 첨가하고, 배양후, 고체상을 세척하고, 두번째 효소-라벨링된 항체를 첨가한다. 세척후, 기질을 첨가하고, 효소 활성을 색체계를 이용하여 평가되고, 항원 농도에 관련된다.

NS3 변이체 및 코어 융합 단백질과 같은 HCV 융합 단백질이 HCV-특이성 폴리클론 및 단일클론 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. HCV-특이성 폴리클론 및 단일클론 항체는 특이적으로 HCV 항원에 결합한다.

폴리클론 항체는 융합단백질을 마우스, 토기, 염소, 또는 말과 같은 포유류에 투여하여 생성할 수 있다. 면역된 동물로부터 혈청을 수집하고, 예를들면 황산암모늄으로 침전후 크로마토그래피, 바람직하게는 유사 크로마토그래피하여 항체를 혈청으로부터 정화한다. 폴리클론 항혈청의 제조 및 가공 기술은 당업계에 알려져 있다.

융합단백질에 존재하는 HCV-특이성 에피토프에 대해 지시되는 단일클론 항체도 쉽게 제조될 수 있다. 예를들면, 변이체 NS3 폴리펩티드 또는 NS-코어 융합 단백질로 면역화된 마우스와 같은 포유류의 정상적인 B 세포는 예를들면, HAT-민감성 마우스 미엘린 세포와 융합되어 하이브리도마를 제조한다. HCV-특이성 항체를 제조하는 하이브리도마는 RIA 또는 ELISA를 이용하여 인식되며, 반-고체 한천에서 클로닝에 의해 또는 희석을 한정함에 의해 분리된다. HCV-특이성 항체를 생성하는 클론은 또 다른 스크리닝으로 분리된다.

HCV 에피토프에 대해 지시되는 단일클론 및 폴리클론 항체는 HCV-감염된 사람으로부터의 혈청 샘플과 같은 샘플내의 HCV 또는 HCV 항원의 존재를 탐지하는데 특히 유용하다. HCV 항원에 대한 면역분석법은 하나의 항체 또는 몇가지 항체를 이용할 수 있다. HCV 항원에 대한 면역분석법은 예를들면 HCV 에피토프로 지시되는 단일클론 항체, 하나의 HCV 폴리펩티드의 에피토프로 지시되는 단일클론 항체의 조합, 다른 HCV 폴리펩티드의 에피토프로 지시되는 단일클론 항체, 동일한 HCV항원으로 지시되는 폴리클론 항체, 다른 HCV 항원으로 지시되는 폴리클론 항체, 또는 단일클론 및 폴리클론 항체의 조합을 사용할 수 있다. 면역분석 프로토콜은 예를들면, 경쟁, 또는 직접 반응, 또는 예를들면 라벨링된 항체를 사용하는 샌드위치형 분석법에 기초할 것이다. 라벨은 예를 들면, 형광의, 화학발광, 방사능, 또는 염색 분자일 수 있다.

폴리클론 또는 단일클론 항체는 HCV 입자 또는 항원을 면역친화성 컬럼에 의해 분리시키데 더욱 사용될 수 있다. 항체는 고체지지체에 예를들면 흡착 또는 공유결합에 의해 고정되어 항체는 그들의 면역선택성 활성을 보유한다. 선택적으로는, 스페이서 기가 포함될 수 있어 항체의 항원 결합 부위가 접근이 가능하게 된다. 부동화된 항체는 그후 HCV 입자 또는 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플로 부터의 항원을 결합시키는데 사용될 수 있다. 결합 HCV 입자 또는 항원은 예를들면 pH 변화에 의한 컬럼 매트릭스로부터 회수된다.

면역 반응을 도출하는 방법

상기 폴리펩티드에 의해 활성화되는 HCV-특이성 T세포는 바람직하게는 변이체 HCV 폴리펩티드의 에피토프를 포함하는 변이체 NS3 폴리펩티드와 같은 HCV 폴리펩티드의 에피토프를 인식하는 생체내 또는 시험관내에서 발현된다. HCV-특이성 T 세포는 CD8⁺또는 CD4⁺일 수 있다.

HCV-특이성 CD8⁺T 세포는 바람직하게는 MHC 클래스 I 분자로 착화된 NS3, NS4, NS5a, NS5b 에피토프를 보이는 HCV 감염 세포를 죽일 수 있는 세포독성 T 림포사이트(CTL)이다. HCV-특이성 CD8⁺T세포는 또한 인터페론-γ(IFN-γ)를 발현시킨다. HCV-특이성 CD8⁺T 세포는 예를들면⁵¹Cr방출 분석법에의해 탐지될 수 있다.⁵¹Cr 방출 분석법은 비구조적(예를들면, 변이체 NS)에피토프를 보여주는 표적세포를 용해시키는 능력을 측정한다. IFN-γ을 발현시키는 HCV-특이성 CD8⁺T세포도 면역학적 방법에 의해, 바람직하게는 변이체 NS 폴리펩티드로 시험관내 자극후 IFN-γ에 대한 세포내 착색에 의해 탐지될 수 있다.

상기 폴리펩티드에 의해 활성화되고, 생체내 또는 시험관내에서 발현된 HCV-특이성 CD4⁺세포와 이들 단백질 개개의 성분의 조합은 바람직하게는 HCV-감염된 세포상의 MHC 클래스 II 분자에 결합되어 있는 변이체 단백질의 에피토프를 포함하는 변이체 비-구조적 폴리펩티드의 에피토프를 인식한다. HCV-특이성 CD4⁺T세포는 림포증식 분석법에 의해 탐지될 수 있다. 림포증식 분석법은 에피토프에 반응하여 증식하기 위한 HCV-특이성 CD4⁺T세포의 활성을 측정한다.

변이체 NS(또는 코어, 외피 또는 다른 바이러스성 폴리펩티드와의 융합 변이체 NS)는 시험관내 또는 생체내에서 HCV-특이성 T세포를 활성화시키는데 사용될 수 있다. HCV-특이성 T세포의 활성화가 특히 사용되어 HCV 감염에 대한 예방 또는 치료요법적 처리를 제공한다. 시험관내 활성화를 위해, 단백질은 상기와 같이 아데노바이러스 벡터와 같은 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 통해 T세포로 공급된다.

폴리클론 T세포 집단은 혈액으로부터 유래될 수 있고, 바람직하게는 HCV로 감염된 포유류의 림프절, 지라, 흉선와 같은 말초 림프계 기관으로 부터 유래된다. 바람직한 포유류는 마우스, 침팬지, 개코원숭이, 및 사람을 포함한다. HCV 는 포유류에서 활성화된 HCV 특이성 T세포의 수를 확대하는데 이바지한다. 포유류로 부터 유도된 HCV-특이성 T세포는 T-세포에 HCV 에피토프 펩티드를 첨가하여 시험관내에서 재자극될 수 있다. HCV 특이성 T 세포는 특히 증식(예를들면, 당업계에 알려진 림포증식 분석법), IFN-γ제조, 및 시험관내 HCV NS 에피토프를 보여주는 표적 세포를 용해시키는 능력에 대해 시험될 수 있다.

다음 실시예는 발명을 예시하기 위함이며, 어떤 방식으로든 제한되도록 의도되지 않는다. 당업자들은 본원의 발명의 목적과 범주내에서의 변형을 인정할 것이다.

실시예 1: 구성체

pCMV-II: pCMV-II(도 7, SEQ ID NO:5)를 CMV 프로모터, 인핸서, 인트론 A, 폴리링커 및 결실된 pUC 백본에 황소의 성장 호르몬 종결자를 함유하도록 제조하였다(Life Technologies).

pT7-HCV:pT7-HCV를 폴리링커-변형된 pUC 벡터에서 완전한 길이의 합성 T7프로모터가 선행된 HCV cDNA 를 함유하도록 제조하였다. pT7-HCV는 또한 완전한 5'UTR 및 3'UTR의 폴리 A 버전을 함유한다.

pCMV.ΔNS35:pCMV.ΔNS35(도 5, SEQ ID NO:3)를 발생시키기 위해 2단계를 거친다. 첫번째로 PCR 제조물을 하기한 것에 상응하는 pT7-HCV로 부터 발생시킨다.: 5' EcoRI 부위, 그후 ACCATGG 의 Kozak 서열; 개시 ATG 후 아미노산 #1242 및 StuI 부위. 두번째로, 완전한 길이의 게놈 클론으로 부터 StuI 내지 XbaI 단편을 분리시켰다. 게놈 클론은 pUC 벡터내에서 폴리 A 버전 3'말단을 가지는 완전한 길이의 HCV cDNA에 융합된 T7 프로모터로 구성된다. 마지막으로, EcoRI-TtuI 및 StuI-XbaI 단편을 pCNV-II 발현 벡터에 봉합하고, HB 101 수용성 세포로 형질전환되고 암피실린(100㎍/ml)상에 놓여진다. 미니프렙 분석으로 제조 설명서에 따라 Quigen Grgaprep 키트를 사용하여 더 큰 규모로 확대되는 바람직한 클론을 인식하게된다. 결과의 클론은 pCMV.ΔNS35로 부른다(도 5, SEQ ID NO:3).

pd.ΔNS3NS5:도 10에 개략적으로 보인대로, 효모 발현 플라스미드 pCMV.ΔNS35(SEQ ID NO:8)를 포유류 발현 플라스미드 pCMV.ΔNS35로 부터 얻어진 제한 단편을 사용하여 구성하였다. pCMV.KM.ΔNS35는 pCMV.ΔNS35(도 5, SEQ ID NO:3)와 바이러스의 백본에 카나마이신 저항성 유전자를 함유하는 것을 제외하고는 동일하다. pCMV.KM.ΔNS35은 EcoRI 및 NgeI로 분해되어 289bp EcoRI-NheI 단편을 얻었다. EcoI-NheI 단편은 pRSET HindIII-NheI 서브클로닝 벡터로 올리고(HE)와 함께 HindIII로 부터 EcoRI로 라이게이션된다. 서열확인후, pRSETHindIII-NheI #6 단편을 HindIII 및 NheI로 분해시켜 2908bp HindIII-NheI 단편을 얻었다.

pCMV.ΔNS35는 XbaI로 선형화되었고, XbaI-SalI로 부터 합성 올리고(XS)로 라이게이션되었다. 라이게이션은 NheI 및 SalI로 분해되어 2481bp NheI-SalI 단편을 얻었다. 단편은 pET3a NheI-SalI 서브클로닝 벡터로 라이게이션되었다. 서열확인후, pET3a NheI-SalI#2를 NheI 및 SalI로 분해하여, 2481bp NheI-SalI 단편을 얻었다. BamHI-HindIII ADH2/GAPDH 프로모터 단편을 그후 HindIII-NheI 및 NheI-SalI단편과 pBS24.1 BamHI-SalI 효소 발현 벡터로 라이게이션되었다.

pd.ΔNS3NS5.PJ:pd.ΔNS3NS5.PJ(도 13 및 14; SEQ ID NO:10)를 HCV 코딩 영역의 5' 및 3' 말단에서 "완전한 연접"을 형성시키기위해 발생시켰다. pd.ΔNS3NS5의 5' 말단에서, 효소 ADH2/GAPDH 프로모터 및 폴리펩티드의 ATG사이에 6개의 예비염기가 있다. 3' 말단에, 폴리펩티드의 정지 코돈 및 효소 발현 벡터내의 α성분 종결자사이에 52개의 비번역 서열의 염기가 있다.

pd.ΔNS3NS5.PJ를 SphI-SalI 단편을 얻기위해 SphI 및 SalI 로 pd.ΔNS3NS5 #17을 분해시켜 제조하였다. pd.ΔNS5b3011을 SphI 및 SalI로 분해시켜 폴리펩티드의 3'말단에서 "완전한 연접"을 주는 321bp SphI-SalI 단편을 얻는다. SphI-SalI 및 SphI-SalI단편을 5'말단에서 "완전한 연접"을 위해 HindIII-ScaI(HS)로 부터 합성 올리고를 가지는 pSP72 HindIII-SalI 서브클로닝 벡터로 라이게이션된다.

pSP72 HindIII-SalI 클론#6내의 합성 서열의 영역을 확인하였다. pSP72 HindIII-SalI 클론#6을 HindIII 및 BlnI로 또는 BlnI 및 SalI로 분해하여 2441bp HindIII-BlnI 및 2895bp BlnI-SalI 단편으로 각각 얻었다. BamHI-HindIII ADH2/GAPDH 프로모터 단편은 HindIII-BlnI로 라이게이션되었고, BlnI-SalI 단편은 pBS24.1 BamHI-SalI 효소 발현 벡터로 라이게이션되었다.

pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어121RT 및 pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어173RT를 ΔNS3NS5 폴리펩티드의 C-말단에서 HCV 코어 aa 10-121(pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어121RT로 나타냄,SEQ ID NO:12), 및 ΔNS3NS5 폴리펩티드의 C-말단에서 HCV 코어 aa 1-173(pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어173RT로 나타냄, SEQ ID NO:14)을 발생시키고 암호화하였다. 코어 서열은 Lys로 부터 Arg로 변이된 aa 9 및 Asn 으로 부터 Thr로 변이된 aa11를 가진다(코어 121RT 또는 173RT로 나타냄).

pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어121RT 및 pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어173RT:pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어121RT(도 17, SEQ ID NO:12) 및 pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어173RT(도 18, SEQ ID NO:14) 발생. 도 16에 보이듯이, NotI-Sal HCV 코어 121RT 및 HCV 코어 173RT를 PCR로 E.coli 발현 플라스미드, pSODCF2.HCV 코어191RT#2로 부터 증폭하였다. 코어 121RT NotI-Sal PCR 생성물 또는 코어 173RT NotI-Sal PCR 생성물을 PstI 내지 NotI 의 합성 올리고(PN)를 가진 pT7블루2PstI-SalI 서브클로닝 벡터로 라이게이션하였다. 서열확인후, pT7블루2코어 121RT 클론 #9 및 pT7블루2코어 173RT 클론 #11을 PstI 및 SalI로 분해하여 403bp 및 559bp PstI-SalI 단편을 더이상의 클로닝을 위해 각각 얻었다.

pSP72 HindIII-SalI 클론#6으로 부터 121bp NotI-PstI 단편을 상기와 같이 pd.ΔNS3NS5.PJ의 클로닝동안 분리시켰다. NotI-PstI 및 PstI-SalI 단편을 pd.ΔNS3NS5.PJ클론 #5(상기됨)를 분해시켜 만든 벡터로 NotI-SalI로 조립하였다.

ΔNS3NS5 및 코어 140 및 코어 150: 개코원숭이에서 CTL을 제거한 HCV 코어 에피토프를 발견하였다(HCV 코어 aa 121-135). pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 121 RT는 이 매우 중요한 에피토프 직전에서 끝나고, 더긴 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 173 RT 구성체(실시예 2)보다 더 잘 발현되기 때문에, 이 에피토프를 포함하는 두개의 중간체 구성체가 만들어지고, 가능하게는 중간체 발현 레벨을 내놓는다. 두개의 새로운 구성체는 HCV 코어 aa 1-140 또는 HCV 코어 aa 1-150를 NS3NS5.PJ의 C 말단에 융합시킨다.

pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어140RT(도 22, SEQ ID NO:16) 및 pd.ΔNS3NS5.PJ. 코어150RT(도 22, SEQ ID NO:18):도 20에 보이듯이, PstI-SalI HCV 코어140RT 및 PstI-SalI HCV 코어150RT 단편을 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어173RT#16으로부터 PCR에 의해 증폭하였다. HCV 코어 PstI-SalI PCR 생성물을 또한 pT7블루2 PstI-SalI 서브 클로닝 벡터로 라이게이션시킨다. 서열확인후, pT7블루2코어 140RT 클론 #22 및 pT7블루2코어 150RT 클론 #26을 PstI 및 SalI로 분해하여 460bp 및 490bp PstI-SalI 단편을 더이상의 클로닝을 위해 각각 얻었다.

pSP72 HindIII-SalI 클론#6으로부터 121bp NotI-PstI 단편을 상기와 같이 pd.ΔNS3NS5.PJ의 클로닝동안 분리시켰다. NotI-PstI 및 PstI-SalI 단편을 pd.ΔNS3NS5.PJ클론 #5(상기됨)를 분해시켜 만든 벡터로 NotI-SalI로 조립하였다.

실시예 2: 단백질 발현

HCV-1 ΔNS3를 NS5 항원으로 코딩하는 본원에 기술된 다양한 구성체가 효소에서 발현되었다. S. cerevisiae 균주 AD3를 pd.ΔNS3NS5.PJ로 형질전환시켰고, 발현을 체크하였다. 기대되는 194kD의 분자량에서 착색된 단백질 밴드는 관찰되지 않았다(도 12). 균주 AD3는 또한 pd.ΔNS3NS5.PJ 클론 #5로 형질전환시시켰고, 발현을 체크하였다. 기대되는 194kD의 분자량에서 착색된 단백질 밴드는 관찰되지 않았다(도 12).

균주 AD3를 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 121RT#6 및 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 173RT#5로 형질전환시켰고, 발현을 체크하였다. 기대되는 194kD 및 210kD의 분자량에서 단백질 밴드를 각각 관찰하였다. pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 173RT 구성체의 발현 수준은 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 121RT 구성체의 발현 수준에 비해 매우 낮았다(도 19 참조). 그러므로, 단백질 발현 수준과 HCV 코어의 길이사이에는 연관관계가 있다.

균주 AD3를 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 140RT#29 및 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 150RT#35로 형질전환시시켰고, 발현을 체크하였다. 기대되는 208kD 및 209kD의 분자량에서 단백질 밴드는 pd.ΔNS3NS5.PJ 코어 173RT의 단백질 밴드와 유사한 수준에서 착색이 보여진다(도 23 참조).

실시예 3: 면역 반응 제거

A. 면역

변이체 NS 폴리펩티드의 면역원성을 평가하기위해, 기니아픽, 토끼, 마우스, 붉은털 짧은 꼬리 원숭이 및/또는 개코원숭이를 사용하여 연구를 수행하였다. 연구는 하기와 같이 지시된다: 단독 DNA 면역(단일 또는 다중); 단백질 면역후 DNA 면역(권장); 단백질 면역후 DNA 면역; PLG 입자에 의한 면역. 면역은 근육내 또는 점막적으로 이루어진다.

그러므로, 단백질 발현 수준과 HCV 코어의 길이사이에는 연관관계가 있다.

B. 체액성 면역 반응

체액성 면역 반응을 항-NS 항체 ELISA(효소 결합된 면역흡수 분석법)로 면역된 동물로 부터의 혈청 견본에서 면역후 다양한 시간에서 체크한다. 간단하게는면역된 동물로 부터의 혈청은 NS 또는 변이체 NS 단백질로 역으로 유도된 항체에 대해 스크린한다. ELISA 마이크로타이터 플레이트 웰을 선택된 HCV 단백질로 밤새 코팅하였고, 4회 세척하였다; 그후, PBS-0.2% 트윈(시그마)으로 블로킹한다. 블로킹 용액을 제거한후, 희석된 마우스 혈청을 첨가한다. 혈청들을 다양하게 희석시켜 시험한다. 마이크로타이터 플레이트를 세척하고, 두번째의 퍼옥시다아제 커플링된 항-마우스 Ig 항체(Pierce, Rockford, IL)로 배양하였다. ELISA 플레이트를 세척하고, 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(TMB;Pierce)을 웰마다 첨가한다. 눈으로 각 웰의 밀도를 측정한다. 타이터는 전형적으로 반-최대 시각 밀도(O.D.)를 주는 혈청 희석물을 환용할 수 있는 것으로 보고된다. 유사하게는, 결합의 중화(NOB) 항체의 발생은 당업계에 알려진 방법으로 측정될 수 있다.

C. 세포성 면역 반응

특이성 세포독성 T-림포사이트(CTL)의 주기를 펄스 Balb/c 마우스 CD4 세포 단백질의 표준 염색체 배출 분석법으로 평가하였다. 간단하게, 지라세포(효과기 세포, E)를 면역되고, 배양되고, 재자극되고, HCV펩티드-펄스 표적세포에 대한 CTL 활성에 대해 시험된 BALB/c 마우스로 부터 얻었다. 세포독성 활성은 표준⁵¹Cr 배출 분석법으로 측정한다.

실시예 4: PLG-송달된 DNA로의 면역

폴리락티드-코-글리콜리드(PLG)폴리머를 Boehringer Ingelhein, U.S.A.로 부터 얻는다. PLG폴리머는 50/50의 코폴리머 비율을 가지며, 분자량이 65kDa(제조자데이터)인 RG505이다. 흡수된 DNA를 가지는 양이온성 미세입자를 변형된 용매 증발 과정(Singh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97:811-816에 기술됨)을 이용하여 제조한다. 간단하게는 미세입자를 염화메틸렌내에서 PBS와 높은 속도로 IKA 균질화기를 사용하여 5% w/v 폴리머 용액을 유화하여 제조한다. 그후, 주요 에멀젼을 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)를 함유하는 증류된 물에 첨가한다. 이것은 염화메틸렌이 증류되도록하면서 실온에서 교반된 w/o/w 에멀젼의 형성으로 이르게 된다. 결과의 미세입자를 증류수로 원심분리로 세척하고, 동결건조시킨다. 제조, 세척 및 수집후, DNA는 DNA 용액내의 양이온성 미세입자를 배양하여 미세입자상에 흡수된다. 미세입자는 그후 원심분리기로 분리되고, 펠릿은 TE 완충제로 세척하고, 미세입자는 동결건조되고, 재현탁되고, 동물에 투여된다. 항체 타이터는 ELISA 분석법으로 측정한다.

Claims (42)

1. NS3 의 촉매 도메인내에 촉매 도메인을 기능적으로 파괴하는 돌연변이를 가지는 폴리펩티드를 포함하는, 분리된 돌연변이 비구조("NS")HCV 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 돌연변이는 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, 돌연변이는 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NS 폴리펩티드는 NS3, NS4 및 NS5 를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NS 폴리펩티드는 NS3, NS4 및 NS5 로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NS 폴리펩티드는 NS3 및 NS5로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
7. 제 6 항에 있어서, NS5는 NS5a 로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
8. 제 6 항에 있어서, NS5는 NS5b 로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NS 폴리펩티드는 NS3 및 NS4 로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
10. 제 9 항에 있어서, NS4 는 NS4a 로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
11. 제 9 항에 있어서, NS4 는 NS4b 로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
12. 제 4 항에 있어서, HCV 의 NS3, NS4, 또는 NS5가 아닌 제2의 바이러스 폴리펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
13. 제 12 항에 있어서, 제2의 바이러스 폴리펩티드는 HCV 코어 폴리펩티드 ("C"), 또는 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
14. 제 13 항에 있어서, C 폴리펩티드는 절단된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
15. 제 14 항에 있어서, 절단은 아미노산 121에서인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
16. 제 12 항에 있어서, 폴리펩티드는 HCV 외피 단백질("E")을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
17. 제 16 항에 있어서, E 는 E1인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
18. 제 16 항에 있어서, E 는 E2인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
19. (a) 제 1 항 내지 제 18 항 중 어는 한 항에 따른 폴리펩티드; 및

    (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 HCV 폴리펩티드를 코딩하는 분리 및 정제된 폴리뉴클레오티드.
21. (a) 제 20 항에 따른 분리 정제된 폴리뉴클레오티드; 및

    (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
22. 제 21 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 인 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 제 21 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드내에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
24. 제 20 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
25. SEQ ID NO:8의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
26. 제 20 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
27. 제 26 항에 있어서, 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
28. 제 26 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
29. 제 26 항에 있어서, 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
30. 제 26 항에 있어서, 세포는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
31. 제 26 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:8 의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
32. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
33. (a) 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 제 24 항에 따른 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및

    (b) 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 돌연변이 NS HCV 폴리펩티드를 제조하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서, 숙주 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 33 항에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 33 항에 있어서, 숙주 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 33 항에 있어서, 숙주 세포는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
39. 제 38 항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
40. 제 38 항에 있어서, 항체는 정제된 폴리클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
41. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 피험자에 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 면역 반응을 유발시키는 방법.
42. 제 20 항의 폴리뉴클레오티드를 피험자에 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 면역 반응을 유발시키는 방법.