KR20020048418A - 개선된 독성 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소정 화합물의 생체내 독성을 예측하기 위한 재료 및 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 특정 표적 세포에서의 화합물의 3가지의 다른 세포독성 파라메터에 관한, 생체내 세포독성을 예측하는데 유용한 정보를 제공하기 위해 3가지 이상의 다른 검정을 동시에 수행하는 것을 포함한다.
Description
본 출원은 2000년 6월 2일자로 출원된 미국 특허 출원 제09/586,242호의 연속 출원이다. 본 출원 및 미국 특허 출원 제09/586,242호는 둘다 1999년 9월 27일자로 출원된 미국 임시 출원 제60/156,206호의 우선권 이득을 청구한다. 상기 명세의 전체 본문은 침해 또는 포기 없이 본원에 참고로 인용된다.
새로운 약물 후보의 확인 방법은 동물에서의 임상전 독성 시험 동안 개발로부터 제거되는 많은 유망한 화합물로 인해 길고 지루하다. 임상전 시기 중에 탈락 화합물의 수가 많은 한가지 이유는 약물 발견 프로그램 초기에 유용한 독성 데이타가 결여되어 있기 때문이다. 많은 제약 회사는 지난 2~3년간 이를 인식하여 왔다 [Cockerell et al., Toxicol. Path. vol 27, no. 4, p 471 (1991); Burkhardt et al., Toxicol. Path. vol 27, no. 4, p 472-473 (1999); Ryan, Toxicol. Path. vol 27, no. 4, p 474-476 (1999); Cockerell et al., Toxicol. Path. vol 27, no. 4,p 477-478 (1999) 참조].
지금까지, 잠재적 약물로서의 소정의 후보 물질의 생체내 독성은 동물 모델의 사용을 포함하였다. 동물 시험은 약제가 동물에서 나타내는 효과가 사람에게 적용가능하고 사람에서의 효과를 예측한다는 가정을 전제로 한다. 일반적으로, 투여량이 체표면적 단위 당 기준일 때, 동물로부터의 독성 데이타는 사람에게 적용가능하다. 한편, 투여량이 동물 체중을 기준으로 할 때, 사람은 시험 동물 보다 독성에 더욱 민감하다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 약물은 체중을 기준으로 제공되도록 개발된다.
추가로, 약물 시험에 사용된 실제 동물의 수는 약물에 노출되기 쉬운 사람 집단 보다 훨씬 더 작다. 예를 들면, 소정의 약물에 대한 0.01%의 사람 노출 빈도는 2억 5천만 개체 중 약 2만 5천이 약물에 노출되는 것을 의미한다. 동물에서의 그러한 낮은 빈도를 검출하기 위하여 3만의 동물이 약물에 노출되는 것을 필요로 한다. 이는 일정 시간에 개발되는 각종 약물을 고려할 때 분명히 비현실적인 수이다. 결과적으로, 고투여량의 후보 물질에 대한 보다 적은 수의 동물의 노출이 저투여량에 노출되는 사람에 대한 위험을 확인하는데 바람직하다.
약물 개발의 초기 단계에서의 동물의 사용은 특히 이러한 개발 초기에 대부분의 화합물이 충분히 고려된 약물 후보가 아닐 것이라는 사실에 비추어 신규 약물에 대한 독물 데이타를 얻는 값비싸고 비효율적인 방법이다. 여러 회사는 추정 약물이 동물 시험 단계에 들어가기 전에 다른 독물학적 스크리닝 방법을 이용하려고 시도하였다.
독물 데이타 결함을 해결하기 위한 통상적인 방법은 새로운 화합물이 치료 표적에 대한 잠재성 및 효능에 대해 확인되고 있을 때 유망한 새로운 약물의 시험관내 독성 시험을 약물 발견 과정에 포함시키는 것이다. 이러한 초기 단계에서의 성질 독성 데이타는 약제사가 효능/잠재성을 유지하면서 독성을 "설계 배제"시키는 시도를 가능하게 한다. 이것이 원리적으로 좋은 생각이긴 하지만, 실상은 번거로운 시험관내 독성 데이타를 개발하기가 힘들고 시험관내 데이타를 생체내 독성에 부합시키기가 극히 어려웠다.
핵심 문제는 이용될 검정의 유형과 특성 및 이용될 시험계에 대해 결정되어 왔다. 배양 시에 성장하는 세포에서 독성을 평가하기 위하여 요구되는 많은 생화학적 및 분자적 검정이 있다. 그러나, 제한된 노출 농도 범위에 대해 단 하나 또는 2가지의 검정이 이용될 때, 부정확한 음성 및 부정확한 양성 데이타의 확률이 높다. 가장 통상적으로 사용되는 검정의 일부는 락테이트 데히드로게나제 (LDH), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST) 및 칼륨에 의해 결정되는 세포내 마커의 누출, 및 MTT, XTT, 알라마르 블루 및 INT와 같은 테트라졸륨 염료의 환원을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 모든 것이 세포 손상의 지표로서 사용되어 왔다. 모든 경우에, 스크린은 전형적으로 하나 또는 두개의 종결점의 사용을 포함한다. 결과 데이타는 예/아니오 또는 생/사 응답을 제공한다. 독성 스크리닝 문제를 최소화하려는 방법은 동물에서 유사한 독성을 예측하는 의미를 갖는 유용한 독성 프로파일을 제공할 수 있는 번거로운 스크리닝 시스템을 개발하는데 있어서 거의 진척된 바가 없었다. 그러므로, 당 업계에는 더욱 유용한 독성 정보, 특히 약물 발견과정의 초기 단계에서 신속하고 비용 효율적으로 얻어질 수 있는 독성 정보를 제공하는 새로운 스크리닝 시스템의 개발의 필요성이 남아있다. 동물의 이용을 필요로 하지는 않지만 상대 독성 및 독성 기전에 대한 신뢰성 있는 정보를 제공하고 생체내 독성을 효율적으로 예측하는 독성 스크리닝 시스템의 필요성이 존재한다.
<발명의 요약>
본 발명은 본원에 기술된 수많은 재료 및 방법에 구체화되어 있는 독성 스크리닝 방법에 대한 상당한 개선을 기술한다. 이러한 개선은 제한된 독성을 갖는 신규 약물을 확인하고, 설계하고 제조하는데 사용될 수 있는 중요한 기계론적 정보를 갖는 독성 프로파일을 제공하며 약물을 사용하여 질환 및(또는) 질환 증후군을 치료한다. 그 방법은 "군집 분석 독성 스크리닝" 또는 "CATS"로 불리우며 검정 군집에서 각 시험 화합물에 대한 몇몇 생화학적 또는 분자 종결점을 모니터하는 것을 포함한다. 결과 데이타는 훨씬 더 많은 생/사 응답을 제공하는 생화학적 변화의 프로파일을 제공한다. 또한, 이 방법에서의 중복은 부정확한 양성 및 부정확한 음성 응답을 크게 감소시킨다. 또한, 다른 일련의 여러 군집을 설계함으로써 세포 독성의 많은 면을 평가할 수 있다. 예를 들면, 동일한 부류의 다른 화합물에 대한 상대 독성의 정보 및 독성 기전에 대한 정보가 얻어진다. 마지막으로, 규정된 분석 규칙을 적용함으로써 노출 농도 대 응답 곡선은 간 또는 조혈 세포에서 독성을 나타내는 생체내 약물의 혈장 농도의 적절한 평가를 제공할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, CATS 절차는 화합물을 독성에 대해 스크리닝하는 개선된 방법을 제공하며, 그것은 또한 약물 확인, 설계, 제조, 투여 등의 모든 면에 포함된다.
한 면에서, 본 발명은 세포 및 증식 배지를 함유하는, 3 또는 4개 이상의 다중웰 배양 평판을 제공하고; 세포를 상기 평판에서 한정된 밀도로 증식시키고; 대수 증식기의 확립 후에 시험 화합물에 세포를 노출시키고; 생활 시험계에서 화합물의 독성을 확인하고 시험 화합물에 대한 독성 프로파일을 형성하기 위해 3 또는 4가지 이상의 검정을 수행하는 것을 포함하는 생활계에서 화합물의 독성을 평가하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 검정은 세포 주기 평가 검정; 미토콘드리아 기능 검정; 에너지 균형 검정; 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 바람직한 양태에서, CATS계에 사용된 세포는 쥐의 간종양으로부터 유래되며 H4IIE 세포계 (ATCC 수탁 #CRL-1548)로서 알려져 있다. 또다른 양태에서, 이 검정에 사용된 세포는 사람의 간종양으로부터 유래되며 HepG2 세포계 (ATCC 수탁 #HB-8065)로서 알려져 있다.
다른 면에서, 본 발명은 여러 농도의 화합물을 포함하는 배지에서 세포를 배양하고; 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제1 지표를 측정하고; 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제2 지표를 측정하고; 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제3 지표를 측정하고; 세포 건강의 제1, 제2 및 제3 지표의 측정치로부터 상기 화합물의 독성 농도 (Ctox)를 예측하는 것을 포함하는 화합물의 생체내 세포독성의 예측 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 세포 건강의 제4 및 임의로 제5 지표가 사용될 수도 있다. 그 방법은 약물 개발 중에 동일한 검정이 다른 기 또는 기간 동안에 별도로 독립적으로 수행되는 경우 보다 화합물의생체내 독성을 훨씬 더 많이 예측하는 것이다. 이는 단일 독성 검정이 이용될 때, 종결점이 왜 변화하고 있는지에 관한 정보가 거의 얻어지지 않고 부정확한 음성 또는 부정확한 양성 결과의 확률이 높아서 불완전한 데이타 세트를 기초로 한 바르지 않은 결정을 유도하게 되기 때문이다.
여러 농도 및 검정을 사용하는 화합물의 시험관내 세포독성을 한정하면, 상대 독성 (TC50, NOEL 및 Ctox값) 및 독성의 기전을 확인하는데 사용될 수 있는 투여량 응답 곡선이 형성된다. TC50값은 추가의 시험에 대해 화합물의 우선 순위를 매기는데 사용되며 (예를 들여, 상대 독성을 기준으로 함) Ctox값은 시험되는 시험관내 CATS 분석으로부터 평가된 독성을 갖게 하는 생체내 혈장 농도이다. 이용된 시험계는 예측될 수 있는 생체내 독성 유형을 결정할 것이다. 예를 들어, H4IIE 세포가 사용되는 경우, 데이타는 특히 생체내 간 또는 조혈 독성을 예측하게 할 것이다.
더욱 특별한 양태에서, 제1, 제2 및 제3 지표 각각은 세포 복제의 지표, 미토콘드리아 기능의 지표, 세포내 에너지 균형의 지표, 세포막 통합성의 지표 및 세포 사멸율의 지표로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 또한, 본 발명의 방법은 세포 건강의 제1, 제2 및 제3 지표를 측정하는 것 외에 한가지 보다 많은 소정 부류의 세포 건강의 지표를 이용할 수도 있는 것으로 예측된다. 예를 들면, 그 방법은 2가지 이상의 유사분열생식 검정, 2가지 이상의 미토콘드리아 기능 검정, 2가지 이상의 에너지 균형 검정, 2가지 이상의 막 통합성 검정 및 2가지 이상의 세포사멸 검정을 포함할 수 있다.
본 발명의 예측 면에서, 예측은 일반적으로 세포 건강의 제1, 제2 및 제3 지표로부터의 측정치의 투여량 응답 분석을 수행하고; 세포 건강의 제1, 제2 및 제3 지표의 투여량 응답 분석에서 화합물의 측정가능한 독성 효과가 관찰될 수 없는 화합물의 최고 농도 (NOEL)를 투여량 응답 분석으로부터 확인하고; NOEL로서 확인된 농도에 의해 표시되는 농도를 Ctox로서 선택하는 것을 포함한다. NOEL 농도는 바람직하게는 세포 건강의 하나 이상의 지표에 대해 증가된 독성이 관찰될 수 있는 2가지 이상의 더 높은 농도로부터의 측정치에 의해 확인된다. Ctox는 예측된 독성 농도이며 NOEL은 바람직한 Ctox값을 제공하는 것으로 이해될 것이다. NOEL 값 약간 위 또는 아래의 Ctox를 선택함으로써 실질적으로 동등한 Ctox를 제공하는 것이 본 발명의 동등한 양태인 것으로 고려된다. 특히 바람직한 면에서, 예측하는 단계는 그래프 상의 화합물 효과의 측정치를 세포 건강 지표 각각에 대한 화합물 성분의 농도의 함수로서 플롯팅하는 것을 포함한다. 더더욱 바람직한 양태에서, 세포 건강 지표의 측정치는 단일 그래프 상에 표시된다. 특정 양태에서, 세포 건강 지표의 측정치는 대조군과 비교하여 표시된다.
본원에 설명된 바와 같이, 그 방법은 세포 건강 지표의 측정치가 화합물의 다중 (예를 들면, 4가지 이상) 농도에서 얻어질 수 있도록 세포를 여러 농도의 화합물에서 배양시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 화합물이 세포 건강 지표에 대한 명백한 독성 효과를 발휘하지 않는 대략 하나 또는 두가지 이상의 낮은 농도를 갖는 것이 바람직하다. 또한, NOEL/Ctox값이 얻어지는 적어도 최고 민감성 지표에 대해 Ctox농도 이상의 2가지 이상의 농도에서 지표를 측정하는 것이 바람직하다. Ctox보다 높은 농도에서의 2가지의 이상의 측정치의 존재는 Ctox이상의 농도가 측정되는 지표에 대한 독성 효과를 일으킨다는 결론을 확인하도록 한다. 약 0 마이크로몰 내지 약 300 마이크로몰의 농도 범위로부터 선택되는 화합물의 여러 농도는 지표를 측정하고 독성 효과가 관찰되지 않는 다중 측정치 및 독성 효과가 한가지 이상의 지표에 대해 관찰되기 시작하는 측정치를 얻는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 0 내지 300 마이크로몰의 농도 범위는 또한 많은 약물이 이 농도 범위 내의 생체내 어느 곳에서 치료학적으로 효과적이기 때문에 유용한 것으로 밝혀졌다. 따라서, CATS 분석시의 이 농도 범위 내의 효능의 증거와 함께 이 농도 범위 내의 임의의 곳에서 독성 효과가 관찰되지 않는 것은 약물 개발 방법에서 매우 유익할 것이다.
본 발명의 특정 면에서, 세포 건강 지표 중 하나 이상이 세포 배양물의 상청액으로부터 측정되는 것으로 예상된다. 일부 양태에서는, 세포 건강 지표 중 하나 이상이 세포 배양물의 세포 성분으로부터 측정된다. 세포로부터 특정 지표를 측정하고 세포 상청액으로부터 다른 것을 측정함으로써 CATS 분석 효능을 개선시킬 수 있으며, 또한 그러한 측정이 동시에 수행될 수 있으므로 세포로부터 단독으로 또는 상청액으로부터 단독으로 취한 측정치 보다 더욱 다양한 전체 세포 건강 지표를 잠재적으로 제공할 수 있다.
바람직한 CATS 분석에서, 제1 세포 건강 지표는 세포 복제를 모니터하고,제2 건강 지표는 미토콘드리아 기능을 모니터하고, 제3 세포 건강 지표는 막 통합성을 모니터한다. 아래의 실시예에서 입증되는 바와 같이, 다른 유형의 다수의 세포 건강 지표를 포함하는 CATS 검정은 화합물의 독성 기전을 예측하게 할 뿐만 아니라 화합물의 생체내 독성 농도를 예측하게 한다. 따라서, 본원에 기재된 방법에 대하여, 바람직한 한가지 변화는 세포 건강 지표의 측정치로부터 독성 기전을 예측하는 것을 (독성 농도를 예측하는 것 대신 또는 그 이외에) 포함한다.
세포 건강의 3가지 지표가 본 발명의 바람직한 하나의 양태를 제공하긴 하지만, CATS 분석은 세포 복제의 지표, 미토콘드리아 기능의 지표, 세포내 에너지 균형의 지표, 세포막 통합성의 지표 및 세포 사멸율의 지표로 이루어진 군에서 선택된 제4 세포 건강 지표를 측정하는 것을 더 포함할 수 있는 것으로 예상된다. 또한, 특정 CATS 분석은 세포 복제의 지표, 미토콘드리아 기능의 지표, 세포내 에너지 균형의 지표, 세포막 통합성의 지표 및 세포 사멸율의 지표로 이루어진 군에서 선택된 제5 세포 건강 지표를 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. 5가지를 넘는 지표가 측정되는 양태도 또한 예상된다.
특정 양태에서, 세포 복제 검정은3H-티미딘 혼입을 측정하는 검정; BrdU 혼입 검정; PCNA 발현 또는 CYQUANT (등록상표) 검정으로 이루어진 군에서 선택된 세포 복제 검정일 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 세포 복제 검정은 CYQUANT (등록상표) 세포 복제 검정이다. 막 통합성 검정을 포함하는 양태에서, 막 통합성 검정은 글루타티온 S-트랜스퍼라제 검정, 락테이트 데히드로게나제 검정, 아스파르틸아미노트랜스퍼라제 검정, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 검정, 이소시트레이트 데히드로게나제 검정, 소르비톨 데히드로게나제 검정, 글루타메이트 데히드로게나제 검정, 오르니틴 카르바밀 트랜스퍼라제 검정, γ-글루타밀 트랜스퍼라제 검정 및 알칼리 포스파타제 검정으로 이루어진 군에서 선택된다. 간 세포를 사용할 때 특히 바람직한 막 통합성 검정은 글루타티온 S-트랜스퍼라제 검정이다. 미토콘드리아 기능 검정을 포함하는 양태에서, 미토콘드리아 기능 검정은 ATP 검정, MTT 검정, 알라마르 블루 (Alamar Blue) 검정 및 로다민 (Rhodamine) 123 검정 및 시토크롬 C 옥시다제 검정으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 특히 바람직한 미토콘드리아 기능 검정은 ATP 검정 및 시토크롬 C 옥시다제 검정이다. 본 발명에서 별법으로 유용한 미토콘드리아 기능 검정은 MTT 검정이다.
바람직한 양태에서, 상기 논의된 세포 건강의 제4 지표는 ATP/ADP 균형 검정 및 산소 소비 검정으로 이루어진 군에서 선택된 에너지 균형 검정의 지표이다. 바람직하게는, 에너지 균형 검정이 ATP/ADP 균형 검정이다. 하나 이상의 세포 사멸 검정을 포함하는 CATS 분석에서, 세포 사멸 검정은 세포수 검정 및 아폽토시스 검정, 예를 들면 카스파제 활성 검정, BCL2검정, BAX 검정 또는 DNA 세분 검정으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. CATS 분석에 사용하기 위한 바람직한 세포 사멸 검정은 CYQUANT 세포수 검정이다.
본 발명의 CATS 검정은 임의의 화합물, 예를 들면 항균제와 같은 감염성 질환의 치료 또는 예방용 약제; 항종양제와 같은 암 및 신생물 질환 및 상태의 치료또는 예방용 약제; 면역조절제; 신경전달물질; 중추 신경계 (CNS) 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 약제; 심혈관 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 약제; 통증의 치료 또는 예방용 약제; 대사 질환의 치료용 약제; 및 항염증제의 생체내 세포독성을 예측하는데 유리하게 이용될 수 있다.
본 발명의 특정 면에서, CATS 검정은 배양 세포를 이용할 것이다. 바람직한 양태에서, 그러한 세포는 포유류의 것이다. 예를 들면, 세포는 간 세포, 신장 세포, 뇌 세포, 섬유 아세포, 신경 세포, 피부 세포, 폐 세포, 비장 세포, 자궁내막 세포, 심장 세포, 위 세포, 유방 세포, 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 조혈 세포; 또는 이들 세포 중 하나로부터 유래된 세포계일 수 있다. 그 세포는 일차 세포일 수 있거나 또는 세포계로부터 유래될 수 있는 것으로 예상된다. 특정 양태에서, 그 세포는 간 세포이다. 간 세포는 바람직하게는 사람 간 세포 또는 설치류 (예를 들면, 쥐) 간 세포이다. 바람직한 면에서, 사람 간 세포는 HepG2 (ATCC HB-8065), C3A (ATCC CRL-10741), DMS (ATCC CRL-2064), SNU-398 (ATCC CRL-2233), SNU-449 (ATCC CRL-2234), SNU-182 (ATCC CRL-2235), SNU-475 (ATCC CRL-2236), SNU-387 (ATCC CRL-2237), SNU-423 (ATCC CRL-2238), NCI-H630 (ATCC CRL-5833), NCI-H1755 (ATCC CRL-5892), PLC/PRF/5 (ATCC CRL-8024), Hep3B (HB-8064) 및 HTB-52 (ATCC HTB-52)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 다른 바람직한 양태에서, 쥐 간 세포는 H4IIE (ATCC CRL-1548), MH1C1 (ATCC CCL-144), 클론 9 (ATCC CRL-1439), BRL 3A (ATCC CRL-1442), H4TG (ATCC CRL-1578), H4IIEC3 (ATCC CRL-166), McA-RH7777 (ATCC CRL-1601), McA-RH8994 (ATCC CRL-1602), N1-S1 Fudr (ATCC CRL-1603) 및N1-S1 (ATCC CRL-1604)로 이루어진 군에서 선택된다. 물론, 이들은 단지 바람직하고 예시적인 세포계이며 당 업계의 숙련인은 본 발명에 사용될 수 있는 다른 세포를 잘 인지할 것이다.
또한, 본 발명에 의해 의도되는 것은 원하는 치료 효과와 상관있는 생물학적 활성에 대해 다수의 화합물을 검정하고; 원하는 생물학적 활성을 갖는 하나 이상의 화합물을 선택하고; 본원에 기재된 CATS 분석에 따라서 선택된 화합물(들)의 생체내 세포독성을 예측하고; 적절하게 낮은 수준의 예측된 세포독성을 갖는 화합물을 선택하고; 화합물을 상기 질환 또는 장애에 대한 효능에 대해 시험하는 것을 포함하는 장애 치료용 약제의 개발 방법이다. 검정되는 "생물학적 활성"은 연구원 또는 임상학자가 약물 개발 프로그램에 관련있는 것으로 고려하는 임의의 활성일 수 있다. 예시적인 생물학적 활성은 예를 들면 수용체 결합, 수용체 차단 또는 수용체 자극 활성; 유사분열생식 또는 세포 증식 자극 활성; 세포 증식 억제 활성; 화학주성 또는 세포 활성화 활성; 세포 형태 또는 다른 특성의 변화에 대한 검정; 분비된 인자 (예를 들면, 단백질, 호르몬, 전달물질)에 대한 검정; 및 전사, 해독 또는 세포내 단백질 트라픽킹 (trafficking) 또는 단백질 처리의 상향 조절 및 하향 조절에 대한 검정을 포함한다. 원하는 치료 효과는 일반적으로 질환 또는 장애의 예방 또는 치료 또는 그의 진행을 늦추는 것; 및(또는) 그의 증후 또는 발현의 개선일 것이다. 일반적으로, 특별한 생물학적 활성의 조절이 치료 또는 예방 효과와 상관있는 이유에 관한 과학적 원리 또는 이론이 존재할 것이다. 바람직한 양태에서, 원하는 생물학적 활성을 나타내며 적절하게 낮은 수준의 예측된 독성을 갖는화합물의 시험 단계는 생체내에서 수행된다. 두 동물 모델에서의 시험 및 사람에서의 임상 시험이 예상된다. 특정 양태에서, 생물학적 활성에 대해 검정될 다수의 화합물은 화합물의 화학적 라이브러리로부터 얻어진다. 별법으로, 다수의 화합물은 합리적인 약물 설계를 통해 얻어질 수 있다. 약제의 개발 방법은 임의의 의학적 장애를 치료하기 위한 약제를 개발하는데 적합하다. 예를 들면, 그 방법은 통증; 알쯔하이머 질환 및 중추신경계의 다른 질환 또는 장애; 대사 장애; 암 및 다른 신생물 질환 및 장애; 당뇨병; 우울증; 면역부전증; 면역 질환 및 장애; 자기면역 질환 및 장애; 위장 장애; 심혈관 질환 및 장애; 염증성 질환; 및 감염성 질환, 예를 들면 미생물, 바이러스 또는 진균 감염의 치료용 약제를 개발하는데 유용하다.
또다른 변화에서, 약제를 개발하는 방법은 물, 염 용액, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 스테아르산 마그네슘, 메틸- 및 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 알기네이트, 전분, 락토스, 수크로스, 덱스트로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 인산 칼슘, 미네랄유 또는 코코아버터 등의 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체 중에 화합물을 포함하는 조성물을 제조하는 하나 이상의 단계를 더 포함한다. 예를 들면, 그 방법은 시험 단계 전에 그러한 조성물을 제조하는 단계를 포함하며, 시험 단계는 그 조성물을 생체내 투여하는 것을 포함한다. 그 방법은 추가로 또는 별법으로 약제가 적절한 수준의 독성을 가진 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 효과적이라는 것을 생체내 시험이 확인한다면 그 시험 단계 후에 조성물의 제조 단계를 포함한다. 그 방법은 제조 단계 이외에 조성물을 설명하고 임의로그의 치료 징후를 설명하는 라벨을 함유하는 용기에 조성물을 포장하는 단계를 임의로 더 포함한다. 또한, 그 방법은 제조된 조성물을 질환 또는 장애의 치료 또는 예방학적 처치를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 임의로 더 포함한다.
밀접하게 관련된 면에서, 약제의 개발 방법은 질환 또는 장애의 치료용 의약을 제조하는 단계를 더 포함하며, 그 제조 단계는 화합물을 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체에 배합하는 것을 포함한다.
또다른 면에서, 본 발명은 잠재적 치료 활성을 갖는 화합물의 라이브러리를 얻고; 세포독성이 있는 것으로 예측되는 화합물을 제거하기 위하여 본원에 기재된 CATS 분석에 따라 화합물의 세포독성을 예측하는 것을 포함하여 라이브러리를 분석하고; 적절하게 낮은 수준의 예측된 세포독성을 갖는 라이브러리로부터 화합물을 선택하는 것을 포함하는 약물 개발용 리드 화합물의 확인 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 화합물의 라이브러리는 그 라이브러리 내의 화합물이 구조적 특징을 기준으로 선택된다.
추가의 면에서, 본 발명은 원하는 생체내 치료 효과와 상관있는 활성 (Cther)을 얻는데 필요한 화합물의 농도를 측정하기 위해 시험관내 활성 검정을 수행하고; 본원에 기재된 CATS 분석에 따라 화합물의 세포독성을 예측하고; Ctox미만의 Cther를 갖는 화합물을 후보 치료제로서 선택하는 것을 포함하는, 후보 치료제를 선택하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 검정되는 "활성"은 연구원 또는 임상학자가 약물 개발 프로그램에 관련있는 것으로 고려하는 상기 예시적인 생물학적 활성과 같은 임의의 생화학적 활성일 수 있다. 치료 효과는 본원에 기재된 질환 또는 장애와 관련있는 증후의 예방, 치료 또는 개선, 또는 질환 또는 장애를 앓고 있는 사람의 삶의 질을 개선시키는 치료 이외의 다른 효과일 수 있다. 다른 한 변형에서, 그 방법은 화합물을 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체 중에 포함하는 조성물의 제조 단계를 더 포함한다. 예를 들면, 그 방법은 후보 치료제로서 선택된 화합물을 가진 그러한 조성물의 제조 단계를 포함한다. 밀접하게 관련된 변형에서, 그 방법은 질환 또는 장애의 치료용 의약을 제조하는 단계를 더 포함하며, 그 제조 단계는 화합물을 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체에 배합하는 것을 포함한다. 그 방법은 제조 단계 이외에 조성물을 설명하고 임의로 그의 치료 징후를 설명하는 라벨을 함유하는 용기에 조성물을 포장하는 단계를 임의로 더 포함한다. 또한, 그 방법은 제조된 조성물을 화합물의 치료 효과를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 임의로 더 포함한다.
또다른 면에서, 본 발명은 원하는 생체내 치료 효과와 상관있는 활성 (Cther)을 얻는데 필요한 화합물의 농도를 확인하기 위해 시험관내 활성 검정을 수행하고; 본원에 기재된 CATS 분석에 따라 화합물의 세포독성을 예측하고; 각 화합물에 대한 추정 치료 지수 (ETI)를 제공하기 위해 각 화합물에 대해 Ctox:Cther의 비를 확인하고; 더 높은 ETI가 추가 개발에 대한 더 높은 우선권과 상관있는 ETI로부터 화합물의 후보 치료제로서의 우선 순위를 매기는 것을 포함하는, 제약학적 연구 및 개발을 위해 후보 치료제의 우선 순위를 매기는 방법을 제공한다. 검정되는 "활성"은연구원 또는 임상학자가 약물 개발 프로그램에 관련있는 것으로 고려하는 상기 예시적인 생물학적 활성과 같은 임의의 생화학적 활성일 수 있다. 치료 효과는 본원에 기재된 질환 또는 장애와 관련있는 증후의 예방, 치료 또는 개선, 또는 질환 또는 장애를 앓고 있는 사람의 삶의 질을 개선시키는 치료 이외의 다른 효과일 수 있다. 다른 한 변화에서, 그 방법은 높은 ETI 점수를 기준으로 높게 우선 순위 매겨진 화합물을 포함하는 조성물의 제조 단계를 더 포함하며, 그 조성물은 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체를 더 포함한다. 임의로, 그 방법은 생체내 독성/안전성 및(또는) 효능의 평가를 위해 그 조성물을 사람이 아닌 동물 또는 사람에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
때로는, ETI를 결정하는 것이 불가능하거나 또는 불편할 수 있다. 또다른 면에서, 본 발명은 본원에 기재된 CATS 분석에 따라 후보 치료제의 세포독성을 예측하고; 이용된 하나 이상의 CATS 검정 시에 반 최대 독성 응답 (TC50)을 나타내는 치료제의 노출 농도를 기준으로 치료제의 우선 순위를 매기는 것을 포함하는, 제약학적 연구 및 개발을 위해 후보 치료제의 우선 순위를 매기는 방법을 제공한다. 이 방법은 후보 치료제가 유사한 화학적 구조를 공유하고 유사한 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 예상될 때 특히 유용할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 여러 농도의 화합물을 포함하는 배지에서 세포를 배양하고; 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제1 지표를 측정하고; 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제2 지표를 측정하고; 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제3 지표를 측정하고; 상기 단계의 세포 건강의 제1, 제2 및 제3 지표의 측정치로부터 화합물이 세포독성 효과를 발휘하는 세포독성 기전을 예측하는 것을 포함하는 화합물의 생체내 세포독성의 예측 방법을 기술하고 있다. 특정 양태에서, 그 방법은 측정 단계에서 얻어진 측정치로부터 상기 화합물의 독성 농도 (Ctox)를 예측하는 것을 더 포함한다.
다른 양태는 본 발명의 각종 검정을 수행하는데 이용될 수 있는 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 면, 특징 및 이점은 도면 및 상세한 설명을 비롯한 출원 전체로부터 명백해질 것이며, 그러한 모든 특징은 본 발명의 면으로서 의도된다.
마찬가지로, 본원에 기재된 발명의 특징은, 특징의 혼합이 본 발명의 면 또는 양태로서 위에 특별하게 언급되어 있는지에 상관없이 본 발명의 면으로서 의도되는 추가의 양태로 재결합될 수 있다. 또한, 발명에 대해 결정적인 것으로 본원에 기재된 그러한 제한 만이 그 자체로 판단되어야 하며; 결정적인 것으로 본원에 기재되지 않은 제한이 없는 발명의 변화는 본 발명의 면으로서 의도된다.
세트 또는 부류로서 설명된 본 발명의 면에 대해 세트 또는 부류의 모든 개개의 일원이 개별적으로 본 발명의 면으로서 의도된다.
전술한 것 이외에, 본 발명은 위에 특별하게 언급한 변화 보다 어떻게든 더 좁은 범위의 본 발명의 모든 양태를 추가의 면으로서 포함한다. 출원인(들)이 여기에 첨부된 청구 범위의 전체 영역을 발명하긴 하였지만, 여기에 첨부된 청구 범위는 그의 영역 내에 다른 선행 기술 연구를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 그러므로, 청구 범위의 영역 내의 법정 선행 기술이 특허청 또는 다른 단체 또는 개인에 의해 출원인의 주의를 갖게 하는 경우, 출원인(들)은 그러한 청구 범위의 영역으로부터 그러한 법정 선행 기술 또는 법정 선행 기술의 명백한 변화를 특별하게 배제하도록 그러한 청구 범위의 주제를 재한정하기 위해 적용가능한 특허법 하에 보정권을 행사할 권리를 유보한다. 그러한 보정된 첨구 범위에 의해 한정되는 발명의 변화는 발명의 일면으로서 의도된다.
또한, 전체적으로 본 발명의 취지 내에 드는 양태를 여전히 제공하면서 본 발명의 영역 내의 변화 및 변형이 가능할 것이므로 아래에 기재된 상세한 설명이 본 발명의 바람직한 양태를 제공하면서 예시적으로만 의도됨을 이해하여야 한다.
본 발명은 화합물(chemical compound)의 생체내 독성을 예측하고, 약물 후보의 상대 독성을 이해하고 독성 기전을 확인하기 위한 새로운 시험관내 방법을 설명한다.
다음 도면은 본 출원의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 면을 더 입증하도록 의도된다. 본 발명은 본 발명의 특정 양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참고로 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 CATS 검정의 한 양태의 단계를 서술하는 개략도이다.
도 2는 CYQUANT (등록상표) 검정을 이용하여 세포수에 대한 케토코나졸의 투여량 응답 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 막 통합성을 모니터하기 위해 표준 GST 누출 검정에 대한 케토코나졸의 투여량 응답 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 세포수 및 GST의 방출에 대한 케토코나졸의 투여량 응답 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 미토콘드리아 기능 만을 모니터하기 위해 MTT 또는 ATP 검정에서의 케토코나졸의 투여량 응답 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6A 및 6B는 CATS 분석이 케토코나졸을 예로서 사용하여 우수한 생체내 독성 추정을 제공함을 나타내는 그래프이다. 도 6A는 케토코나졸 독성의 CATS 독성 프로파일을 밝히기 위해 세포수, GST 누출, MTT 및 ATP 검정에 대한 케토코나졸의 투여량 응답 효과를 나타낸다. 도 6B는 도 6A와 동일한 데이타를 나타내며, 라인 A는 본 발명에 의해 예측되는 Ctox농도를 나타내고, 라인 B는 사람에서의 실제 독성을 나타내고, 라인 C는 쥐에서의 실제 독성을 나타낸다.
도 7은 화합물 로테논에 대해 수행된 CATS 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 화합물 올리고마이신에 대해 수행된 CATS 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 고독성을 가진 항진균제에 대해 수행된 CATS 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 저독성을 가진 항진균제에 대해 수행된 CATS 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 잠재적으로 독특한 독성 기전을 가진 항진균제에 대해 수행된 CATS 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 생체내 독성의 시험관내 군집 분석 (CATS) 예측을 나타내는 그래프이다.
도 13A 및 도 13B는 증식 세포 집단에서의 독성 검출을 입증하는 그래프이다. 도 13A는 24시간 노출 이후에 일반적인 세포 건강에 대한 화합물 A의 효과를 나타낸다. 도 13B는 24시간 노출 이후에 일반적인 세포 건강에 대한 화합물 B의 효과를 나타낸다.
도 14A-도 14D는 화합물 A에 의해 매개되는 증식 세포 집단에서의 독성이 시간 의존적임을 나타내는 그래프이다. 도 14A는 막 통합성에 대한 화합물 A의 효과를 나타낸다. 도 14B는 세포수에 대한 화합물 A의 효과를 나타낸다. 도 14C는 미토콘드리아 기능의 마커에 대한 화합물 A의 효과를 나타낸다. 도 14D는 세포 건강에 대한 화합물 A의 효과를 나타낸다.
현재, 새로운 잠재성 치료 화합물을 초기 발견하여 임상전 개발 (생체내 동물 시험)까지는 3 내지 5년이 걸린다. 그러한 화합물에 대한 독성 데이타는 일반적으로 임상전 동물 독성 시험이 수행될 때까지 이용될 수가 없다. 수많은 약물이 이 개발 단계에만 이르고 독성 경향으로 인해 이후 개발에서 폐기되어야 한다. 그러한 실패는 회사 재원에 엄청난 손실을 가져다 준다. 이해가능하게, 약물 발견의 초기 합성 단계에 또는 그 즈음에 이르는 수많은 화합물의 독성을 예측하는 기술은 약물 발견 과정의 초기에 바람직하지 못한 독성 프로파일을 가진 화합물을 제거함으로써 확인되는 새로운 약물이 갖는 효능에 대해 막대한 영향을 미쳤을 것이다.더욱 강력한, 시험관내 독성 시험의 초기 단계의 예상되는 즉각의 이득은, 실패를 야기하는 3 내지 5년의 약물 발견 주기 수를 감소시키고, 따라서 성공적인 새로운 치료약을 개발하는데 필요한 평균 주기수를 감소시키는 것이다. 관련된 이득은 약물 개발에 대한 비용의 감소 및 새로운 약물의 의료 단체로의 더욱 신속한 이용성을 포함한다. 실패율의 감소는 유용한 화합물이 상업적으로 이용되는 특허 기간의 일부를 연장시킬 수 있다.
본 발명은 추가 개발을 위해 한 부류의 새로운 화학 물질을 우선 순위 매기고, 독성 기전을 확인하고 약물 개발 및 발견 과정의 초기에 생체내 독성을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 그 자체로 이후의 약물 개발을 위해 많은 수의 새로운 화합물의 우선 순위를 매기는데 사용될 수 있다. 또한, 그 방법은 확인된 약제가 임상전 독성 시험에서 성공적일 가능성을 크게 증가시킨다. 고처리량 분석에 대한 이들 시험관내 방법의 적합성은 그것을 약물 발견 프로그램에 경제적이고 비용 효율적으로 첨가할 수 있게 한다.
특히, 본 발명은 소정 화합물의 생체내 독성 농도를 예측하고, 상대 독성을 기준으로 화합물의 우선 순위를 매기고 독성의 기전을 확인하기 위하여 3가지 이상의 다른 생화학적 종결점을 평가하는 군집 분석을 제공한다. 바람직한 양태에서, 이 검정은 광범위한 농도의 화합물에 24시간 동안 노출시킨 이후에 정상 세포 기능에 필수적인 특정 생화학적 과정의 변화를 측정한다.
본 발명의 독성 군집 분석은 특정 세포 과정에서 일어나는 변화와 관련된 적절한 정보의 확인을 가능하게 한다. 이 정보는 다시 세포 손상 및(또는) 세포독성의 더욱 완전한 프로파일을 얻는데 사용된다.
I. 군집 분석 독성 스크리닝
본 발명에서, 군집 분석 독성 스크리닝은 소정의 화합물의 생체내 독성을 예측하는 방법으로서 제시된다. 특별한 면에서, 이 검정은 여러 농도의 화합물을 포함하는 배지에서 세포를 배양하고; 화합물의 3가지 이상의 농도에서의 배양에 대한 응답으로 세포의 다수의 세포 건강 지표를 측정하고; 그러한 측정치로부터 화합물의 TC50및 독성 농도 (Ctox)를 예측하는 것을 포함할 것이다. 그러한 검정을 수행하는데 관련된 각종 양태는 이후에 더욱 상세히 설명된다.
검정 포맷
특히 바람직한 양태에서, CATS 기술은 잠재적인 치료학적 가치를 가질 화합물의 우선 순위를 매기고 확인하는데 사용될 것이다. 본 발명자는 다중 종결점의 분석이 소정 화합물의 독성에 관한 중요한 정보를 줄 것임을 발견하였다.
특정 양태에서, 본 발명은 그러한 화합물의 확인 방법에 관한 것이다. 이러한 스크리닝 기술이 약물 개발을 위한 치료학적 리드 화합물로서 작용할 화합물의 일반적인 우선 순위 매김 및 확인에 유용할 것으로 예상된다. 본 발명은 특정 부류의 화합물로 제한되지 않으며, 알쯔하이머 질환, 중추신경계의 다른 장애 및 질환, 대사 장애 및 질환, 암, 당뇨병, 우울증, 면역부전 질환 및 장애, 면역 질환 및 장애, 자기면역 질환 및 장애, 위장 질환 및 장애, 심혈관 질환 및 장애, 염증성 질환 및 장애, 및 감염성 질환, 예를 들면 미생물, 바이러스 또는 진균 감염을비롯한 각종 질환 및 장애의 억제를 위한 새롭고 유용한 화합물을 확인하는데 관한 실험실 분석에 유용하게 추가될 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 일반적으로
a) 여러 농도의 화합물을 포함하는 배지에서 세포를 배양하고;
b) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제1 지표를 측정하고;
c) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제2 지표를 측정하고;
d) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제3 지표를 측정하고;
e) 단계 (b), (c) 및 (d)의 측정치로부터 상기 화합물의 독성 농도 (Ctox)를 예측하는 것을 포함하는 방법을 이용함으로써 후보 물질의 생체내 세포독성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
특정 면에서, 그 방법은 단계 (b), (c) 및 (d)의 측정치로부터 상기 화합물의 TC50을 예측하는 것을 더 포함할 수 있다. 임의의 특별한 검정에 대하여, TC50은 검정에서 50%의 최대 독성 응답을 일으키는 화합물의 농도를 나타낸다. 아래에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, CATS가 특정 조건하에서 진행될 때, TC50은 예측된 Ctox로서 선택될 수 있다.
상기 방법은 세포 배양액을 제조하는 것을 필요로 한다. 그러한 세포는 배양액 중의 일차 세포일 수 있거나 또는 그것은 세포계일 수 있다. 그 세포는 일차 배양 및(또는) 세포계로의 적응을 할 수 있는 임의의 포유류로부터 얻어질 수 있다. 동물로부터 세포계를 발생시키는 대신에, 그러한 세포계는 예를 들면 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, Rockville, MD) 또는 임의의 다른 부다페스트 조약 또는 다른 생물 수탁소로부터 구입될 수 있다. 검정에 사용되는 세포는 동물 공급원으로부터 얻을 수 있거나 또는 약물 개발이 고려되고 있는 특정 질환의 특징을 발현하도록 만들어진 재조합 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 사람 또는 다른 영장류, 쥐, 마우스, 토끼, 양 등에서 얻어진 조직으로부터 유래된다. 포유류 일차 세포 배양 및 세포계 배양에 이용되는 기술은 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 사실상, 상업적으로 이용가능한 세포계의 경우에, 그러한 세포계는 소정 세포계에 대해 바람직한 특정한 방향의 증식, 배지 및 조건과 함께 판매된다.
본 발명은 소정 세포에서 세포 건강의 적어도 제1, 제2 및 제3 지표를 측정함으로써 소정 화합물의 세포독성을 예측한다. 그러한 시도를 위해 선택된 세포는 측정될 생체내 독성의 추정 부위에 좌우될 것이다. 예를 들면, 간은 생체내 약물 독성의 특히 유력한 부위이다. 따라서, 본원에 기재된 검정에서의 간 세포 (간 세포로부터 유래된 일차 또는 세포계)의 사용이 특별하게 예상된다. 바람직한 양태에서, 본 발명자는 H4IIE 세포계 (ATCC #CRL-1548)가 간 세포의 전반적인 건강에 대한 화합물의 세포독성 효과를 예측하기 위한 우수한 후보임을 발견하였다. 또한, H4IIE 세포계가 증식 세포 집단이므로, 그 계는 조혈 세포와 같은 다른 증식 세포 유형에 역효과를 나타내는 화합물을 확인하는데 유용할 것이다. 그러한 세포는 극히 낮은 간독성을 갖지만 증식 세포에 대해서는 고독성을 갖는 화학요법제를 확인하는데 이용될 수 있다 (실시예 5 참조).
H4IIE 세포계가 본원에 바람직한 세포계로서 설명되어 있긴 하지만, 임의의포유류 일차 간 세포 또는 간 세포계가 본 발명에 유용할 것임을 이해하여야 한다. 특정의 바람직한 양태에서, 세포는 쥐 간 세포계이다. H4IIE 이외에, 본 발명에 유용한 것으로 예상되는 다른 바람직한 쥐 세포계는 MH1C1 (ATCC CCL-144), 클론 9 (ATCC CRL-1439), BRL 3A (ATCC CRL-1442), H4TG (ATCC CRL-1578), H4IIEC3 (ATCC CRL-166), McA-RH7777 (ATCC CRL-1601), McA-RH8994 (ATCC CRL-1602), N1-S1 Fudr (ATCC CRL-1603) 및 N1-S1 (ATCC CRL-1604)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 바람직한 양태에서, 세포는 사람 간 세포이다. 본 발명에 의해 기술된 방법에 유용한 바람직한 사람 간 세포계는 HepG2 (ATCC HB-8065)이다. 추가로, 본 발명에 유용할 수 있는 다른 예시적인 사람 간 세포계는 C3A (ATCC CRL-10741), DMS (ATCC CRL-2064), SNU-398 (ATCC CRL-2233), SNU-449 (ATCC CRL-2234), SNU-182 (ATCC CRL-2235), SNU-475 (ATCC CRL-2236), SNU-387 (ATCC CRL-2237), SNU-423 (ATCC CRL-2238), NCI-H630 (ATCC CRL-5833), NCI-H1755 (ATCC CRL-5892), PLC/PRF/5 (ATCC CRL-8024), Hep3B (HB-8064) 및 HTB-52 (ATCC HTB-52)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포가 간 세포 독성의 유용한 지표일 것이지만, 본 발명은 각종 유형의 조직에서 세포독성을 확인하고, 모니터하거나 또는 예측하는데 이용될 수 있다. 당 업계의 숙련인이 모니터하고자 하는 세포 독성의 생체내 부위는 특정 시험 화합물의 생체내 작용 부위 뿐만 아니라 시험 화합물의 작용 부위로부터 먼 부위를 포함하는 것을 이해하여야 한다. 그러므로, 검정에 사용될 수 있는 세포계는 신장,심장 및 췌장과 같은 생체내 세포독성의 다른 공통 부위로부터 유래된 세포계를 포함할 것이다. 간과 함께 이들 조직이 세포독성을 모니터하도록 선택될 수 있는 일차 조직이긴 하지만, 본 발명의 검정이 뇌, 신경, 피부, 폐, 비장, 자궁내막, 위 및 유방 조직으로부터 유래된 세포 뿐만 아니라 줄기 세포 및 조혈 세포에 대한 시험 화합물의 세포독성 효과를 예측하는데 이용될 수 있음을 이해하여야 한다. 세포독성 검정에서 조혈 세포 또는 "줄기" 세포 또는 그들로부터 유래된 세포계의 사용이 특히 예상된다.
특정 양태에서, 그 세포는 다중웰 (예를 들면, 96-웰) 평판에 접종되고 대수 증식기에 도달하게 된다. H4IIE 세포에서, 증식 기간은 약 48시간이다. 이 세포계에 대한 바람직한 배지 및 세포 배양 조건은 실시예에 설명되어 있다.
일단 세포 배양이 이루어지면, 시험될 각종 농도의 화합물이 배지에 첨가되고 24시간 동안 각종 농도에 노출된 세포는 증식된다. 24시간 노출 기간이 바람직하긴 하지만, 이것은 단지 예시적인 노출 시간일 뿐이며 더 길거나 또는 짧은 기간 동안 특정 화합물을 시험하는 것이 본 발명의 영역 내에서 예상됨을 인지하여야 한다. 그 자체로, 세포는 6, 12, 24, 36, 48 또는 그 이상의 시간 동안 노출될 수 있음이 예상된다. 증가된 배양 시간은 때로는 스크리닝 과정을 감소시키는 비용으로 추가의 세포독성 정보를 나타낼 수 있다.
또한, 세포는 증식 주기 내의 임의의 기에서 시험 화합물에 노출될 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 새로운 세포 배양이 개시될 때와 동시에 세포와 화합물을 접촉시키는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 세포가 전면 성장에 도달하거나또는 대수 증식기에 있을 때 화합물을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 증식기 세포를 측정하는 것은 당 업계의 숙련인에게 공지된 방법을 통해 이루어진다.
독성 효과가 관찰되지 않는 일부 농도 및 독성 효과가 관찰되는 2가지 이상의 더 높은 농도를 포함하는 것을 목표로 하여 소정의 시험 화합물의 가변 농도가 선택된다. 또다른 고려 사항은 생체내에서 달성될 수 있는 화합물의 농도에서 검정을 수행하는 것이다. 예를 들면, 0 마이크로몰 내지 약 300 마이크로몰 범위 내의 몇몇 농도를 검정하는 것이 통상적으로 이러한 목표를 달성하는데 유용하다. 300 마이크로몰 보다 높은 농도, 예를 들면 350 마이크로몰, 400 마이크로몰, 450 마이크로몰, 500 마이크로몰, 600 마이크로몰, 700 마이크로몰, 800 마이크로몰, 900 마이크로몰 또는 밀리몰 농도에서 이들 검정을 수행하는 것이 가능하거나 또는 바람직할 것이다. 화합물의 추정된 치료학적 유효 농도는 시험 농도의 위쪽 범위에 관한 초기 지침을 제공한다. 또한, 아래에 더 상세히 설명되는 바와 같이 CATS 분석은 바람직하게는 검정에서 세포독성이 관찰될 수 있는 2가지 이상의 농도를 포함하는 농도 범위를 검정하는 것을 포함한다. 300 마이크로몰과 같은 정도의 높은 농도 범위를 검정하는 것이 종종 이 기준을 만족시키는 것으로 밝혀졌다.
예시적인 검정 세트에서, CATS가 수행되는 범위 위인 시험 화합물 농도 범위는 배양 배지 중에 화합물의 0.05 마이크로몰, 0.1 마이크로몰, 1.0 마이크로몰, 5.0 마이크로몰, 10.0 마이크로몰, 20.0 마이크로몰, 50.0 마이크로몰, 100 마이크로몰 및 300 마이크로몰의 최종 증식 배지 농도를 형성하는 투여 용액을 포함한다. 언급된 바와 같이, 이것은 예시적인 범위이며 임의의 검정이 4가지 이상의 다른 농도로 행해질 것이고, 더욱 바람직하게는 투여 농도은, 예를 들면 시험될 화합물의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 농도를 포함할 것임이 예상된다. 그러한 농도는 배양 배지 중에, 예를 들면 0.05 마이크로몰, 0.1 마이크로몰, 0.5 마이크로몰, 1.0 마이크로몰, 2.0 마이크로몰, 3.0 마이크로몰, 4.0 마이크로몰, 5.0 마이크로몰, 10.0 마이크로몰, 15.0 마이크로몰, 20.0 마이크로몰, 25.0 마이크로몰, 30.0 마이크로몰, 35.0 마이크로몰, 40.0 마이크로몰, 45.0 마이크로몰, 50.0 마이크로몰, 55.0 마이크로몰, 60.0 마이크로몰, 65.0 마이크로몰, 70.0 마이크로몰, 75.0 마이크로몰, 80.0 마이크로몰, 85.0 마이크로몰, 90.0 마이크로몰, 95.0 마이크로몰, 100.0 마이크로몰, 110.0 마이크로몰, 120.0 마이크로몰, 130.0 마이크로몰, 140.0 마이크로몰, 150.0 마이크로몰, 160.0 마이크로몰, 170.0 마이크로몰, 180.0 마이크로몰, 190.0 마이크로몰, 200.0 마이크로몰, 210.0 마이크로몰, 220.0 마이크로몰, 230.0 마이크로몰, 240.0 마이크로몰, 250.0 마이크로몰, 260.0 마이크로몰, 270.0 마이크로몰, 280.0 마이크로몰, 290.0 마이크로몰 및 300.0 마이크로몰의 배지 농도를 형성할 수 있다.
전형적으로, 본 명세서에 기재된 각종 검정은 96 웰 평판에 또는 384 세포 평판에 접종된 세포를 이용할 수 있다. 그후에, 세포는, 예를 들면 0-300 마이크로몰의 농도 범위에 걸쳐 시험 화합물에 노출된다. 세포는 일정 기간, 예를 들면 24시간 동안 이 농도로 인큐베이션된다. 인큐베이션에 이어서, 각 시험 화합물에 대해 군집의 검정이 행해진다. 유사한 배양, 시간 및 취급 조건 하에서 완전한 일련의 데이타가 얻어지도록 모든 검정이 동시에 수행되는 것이 바람직하다. 그러나, 검정은 서로 수일 내에 일괄적으로 수행될 수 있다.
특정 양태에서, 세포 건강 및 생육성의 지표는 세포 복제, 미토콘드리아 기능, 에너지 균형, 막 통합성 및 세포 사멸율을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
CATS 검정은 계획하고 수행하기가 아주 간단하다. 예를 들면, 그것은 하나 이상의 검정을 모니터할 수 있는 조건 하에서 후보 물질과 적당한 세포를 조합한다. 도 1은 쥐 간종양 세포가 모델계로서 사용되고 96-웰 검정 포맷으로 성장되는 도해를 나타낸다. 이 다중웰 포맷은 단일 검정 평판 상의 군집 검정으로부터 개개의 검정의 각종 변경을 수행할 수 있게 한다.
시험될 화합물은 천연 화합물의 단편 또는 일부를 포함할 수 있거나 또는 합리적인 약물 설계안을 통해 기지의 화합물로부터 유래될 수 있다. 천연 공급원, 예를 들면 동물, 박테리아, 진균, 잎 및 나무 껍질을 비롯한 식물 공급원, 및 해양 샘플로부터 단리된 화합물이 잠재적으로 유용한 제약 화합물의 존재에 대한 후보로서 검정될 수 있는 것이 제안된다. 별법으로, 독성에 대해 스크리닝될 제약 화합물은 합성될 수도 있다 (즉, 합성 화합물).
모니터되는 화합물의 유형은 특히 항바이러스 화합물, 항생물질, 항염증성 화합물, 항울약, 진통제, 항히스타민제, 이뇨제, 항고혈압 화합물, 항부정맥약, 암 치료용 화학요법 화합물, 항균 화합물일 수 있다.
세포독성에 대해 시험될 화합물의 원료 또는 유형에 관계없이, 특정 화합물 또는 화합물 군의 치료 효능의 지표를 제공하기 위해 화합물의 생물학적 활성을 모니터할 필요가 있다. 물론, 그러한 검정은 시험되는 특정 치료 징후에 좌우될 것이다. 예시적인 징후는 알쯔하이머병, 암, 당뇨병, 우울증, 면역부전증, 자기면역 질환, 위장 장애, 심혈관 질환, 염증성 질환 등에 대한 효능을 포함한다.
<군집 분석 검정>
새로운 약물에 대한 독성 프로파일을 개발하기 위한 다중 검정의 사용은 생활계에서 화합물의 효과를 정확히 평가하기 위한 매우 강력한 수단인 것으로 입증된다.
본 발명의 군집에 사용되는 선택적인 검정은 소정 화합물의 독성 프로파일에 관계된 핵심 정보를 제공한다. 검정은 약물 개발 계획 중의 다른 시기에 검정을 수행하는 것과 반대로 각종 파라메터에 관한 정보가 약물 발견의 약물 개발 시기 중에 동시에 얻어지도록 수행되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 검정은 동시에 모두 일괄적으로 수행된다. 다른 바람직한 면에서, 초기 세포계로부터 모두 동시에 발생된 세포 배양에 대한 검정을 수행하는 것이 유용할 수 있다.
기준은 군집의 검정이 특별한 사항에 중점을 두도록 설계될 수 있다. 따라서, 세포의 일반적인 건강에 대한 특정 화합물의 효과를 모니터하기 위하여, 막 통합성, 유사분열생식, 미토콘드리아 기능 및 에너지 균형을 모니터하는 것이 특히 유용할 것이다. 이들 임의의 종결점에 대해 이용되는 특별한 검정은 제한되는 것으로 고려되지 않는다. 따라서, 막 통합성의 지표를 제공하는 임의의 검정은 미토콘드리아 기능 및 에너지 균형의 지표인 임의의 검정과 함께 유사분열생식 (세포 복제)을 예측하는 임의의 검정과 결합될 수 있다.
전반적인 세포 건강을 확인하는 기준 이외의, 당해 다른 기준은, 예를 들면 산화적 스트레스, 세포 주기 파라메터, 급성 염증성 응답, 아폽토시스 및 엔도크린 응답을 결정하는 것에 관한 것을 포함할 것이다.
산화적 스트레스를 결정하는 기준에서, 군집에 이용될 예시적인 검정은 제한되는 것은 아니지만 글루타티온/글루타티온 디술피드 (GSH/GSSG), 디클로로플루오로신-디아세테이트 (DCFDA), 과산화 지질, 8-이소프로스탄, 8-옥시 구아닌 (8-옥시 G) DNA 첨가물, 티오바르비투르산 (TBARS) 및 말론디알데히드 (MDA)를 포함하는 종결점을 모니터하는 것을 포함할 수 있다.
세포 주기를 모니터하도록 설계된 기준은, 제한하는 것은 아니지만 p53, p21, TGFβ, CDK1, PCNA, 텔로머라제, 산화 질소 및 유도성 산화 질소 신타제 (iNOS)를 비롯한 임의의 소정 세포 주기 지표의 존재 또는 수준에 대한 효과를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 다시, 임의의 특별한 검정은 임의의 세포 주기 지표의 수준 또는 양을 확인하는데 이용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 소정의 파라메터를 모니터하기 위한 특정 검정은 그 검정이 당 업계의 숙련인에 의해 확인될 생화학적 또는 분자 생물학적 종결점의 적절한 지표, 예를 들면 미토콘드리아 기능, 에너지 균형, 막 통합성, 세포 복제 등에 관한 정보를 제공하는 것으로 간주되기만 한다면 결정적인 것으로 고려되지 않는다. 다음 단락은 본 발명에 사용될 수 있는 예시적인 검정을 제공한다. 이것은 이러한 검정의 설명에 대한 완전한 보고서로 의도되기 보다는 당 업계의 숙련인에게 이용가능한 유형의 검정에 대한 지침서이다.
세포에 대한 직접적인 효과를 나타내는 화합물은 전형적으로 산화 호흡을 상향 또는 하향 조절하여 미토콘드리아 기능을 변화시킨다. 이는 ATP 형태의 세포 에너지가 변화될 수 있음을 의미한다. 미토콘드리아 기능은 세포독성 및 세포 증식의 지표로서 이용될 수 있다. 건강한 미토콘드리아는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)의 블루 또는 퍼플 포르마잔 화합물로의 환원을 촉매화한다. 비교적 불용성인 포르마젠 블루는 이소프로판올로 추출되며 추출물의 흡수도가 측정된다. 높은 흡수도 값은 생육 세포 및 기능성 미토콘드리아를 나타낸다. 반대로, 색도의 감소는 세포의 상실 또는 미토콘드리아에 대한 직접적인 독성 효과를 제안한다. MTT 검정은 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 MTT 미토콘드리아 염료 검정은 문헌 (Mosmann, J Immunol. Methods 65, 55-63, 1983 and Denizot et al., J. Immunol. Methods. 89, 271-277, 1986)에 기재되어 있다. XTT 미토콘드리아 염료를 모니터하는 유사한 검정은 문헌 (Roehm et al., J. Immunol. Methods, 142, 257-265, 1991)에 기재되어 있다. 또한, 당 업계의 숙련인은, 예를 들면 알라마르 블루 검정 (Goegan et al., Toxicol. In Vitro 9, 257-266, 1995), 로다민 123 검정 또는 시토크롬 C 옥시다제 검정을 수행함으로써 미토콘드리아 기능을 확인할 수 있다.
ATP는 많은 세포 과정에 대한 일차 에너지 공급원을 제공하며 세포 및 조직 생육성을 유지하는데 필요하다. 세포내 ATP 농도는 괴사 또는 아폽토시스 중에 신속하게 감소한다. 그러므로, ATP의 세포 농도의 변화는 세포 건강의 일반적인 지표로서 사용될 수 있으며, 세포 기준으로 규정될 때 ATP는 세포의 에너지 상태에대한 정보를 제공할 수 있으며 당분해 또는 미토콘드리아 기능의 초기 변화를 평가하기 위한 마커를 제공할 수 있다. ADP/ATP 에너지 균형을 확인할 수 있는 검정은 업계에 잘 알려져 있다 (Kangas et al., Med Biol, 62, 338-343, 1984).
배양된 세포로부터 배지로의 α-GST 누출의 측정은 막 통합성을 평가하는데 이용될 수 있다. 이 검정은 간세포의 사이토졸에서 고 농도로 존재하는 GST의 알파 형태에 대해 특이적이다. GST를 측정하기 위해 바이오트린 인크. (Biotrin Inc.)로부터 구입된 ELISA 키트를 사용하였다. GST 누출 검정은 예를 들면 문헌 (Redick et al., J Biol. Chem. 257, 15200-15203; Oberley et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 131, 94-107, 1995; Feinfeld, J Clin Chem Clin Biochem. 24, 529-532, 1986)에 기재되어 있다.
막 통합성을 확인하기 위한 다른 검정은 락테이트 데히드로게나제 활성, 아스파르틸 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 이소시트레이트 데히드로게나제, 소르비톨 데히드로게나제, 글루타메이트 데히드로게나제, 오르니틴 카르바밀 트랜스퍼라제, γ-글루타밀 트랜스퍼라제 및 알칼리 포스파타제를 확인하는 검정을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포의 분열 능력은 거대한 세포내 수용체 배열 사이에 동격의 시그날링을 필요로 한다. 세포 복제 또는 "유사분열생식"은 세포가 최적으로 기능하는 것을 필요로 한다. 그러므로, 복제 능력의 변화는 스트레스 또는 이상 기능의 지표이다. 세포 복제를 확인하게 할 예시적인 검정은 문헌 (In vitro toxicol 1990, 3, 219; Anal. Biochem. 1993, 213, 426)에 기재된 CYQUANT (등록상표) 검정계이다.유사분열생식의 지표를 제공하는데 사용될 수 있는 추가의 검정은3H-티미딘 혼입을 모니터하는 것; BrdU 혼입 검정을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 유사분열생식은 세포 주기를 조절하는 성분의 기능, 존재 또는 부재를 확인함으로써 모니터될 수 있다. 예시적인 성분은 당 업계의 숙련인에게 잘 알려져 있으며 p53, p21, TGFβ, CDK1, PCNA 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
CATS 분석의 일부로서 수행된 특정 검정은 배지의 성분을 측정하는 것을 포함하는 반면, 다른 것은 세포 또는 세포 용해질로부터 세포수 또는 파라메터를 측정하는 것을 포함할 것이다. CATS 분석은 유리하게는 배지를 사용할 수 있는 일부 검정 및 단일 웰로부터 세포를 사용할 수 있는 다른 검정을 선택하는 것을 포함한다.
<시험관내 분석으로부터의 화합물의 생체내 독성의 예측>
일단 정해진 검정 군집에 대한 모든 데이타가 얻어지면, 데이타는 화합물의 상세한 독성 프로파일을 얻도록 분석된다. 예를 들면, 가장 편리하게는 데이타는 단일 그래프 상에 투여량 응답 범위에 걸쳐 대조된다. 그러한 양태에서, 임의의 소정 농도에서 각 파라메터에 대해 평가된 측정치 (즉, 세포 건강의 각 지표)는 화합물의 부재 하에 얻어진 대조 측정치의 %로서 플롯팅된다. 그러나, 모든 파라메터가 다른 파라메터에 대한 화합물 농도의 효과의 상세한 정보를 얻기 위해 총체적으로 분석되어 전체 독성 프로파일을 얻기만 한다면 데이타가 단일 그래프 상에 플롯팅되지 않아도 됨을 주지하여야 한다. 아래에 기재된 바와 같이, 이러한 전체독성 프로파일은 생체내 독성이 있는 것으로 예측되는 혈장 농도 Ctox의 확인을 용이하게 할 것이다. Ctox는 간독성 또는 조혈 독성과 같은 독성을 갖게 하는 생체내 지속된 혈장 농도의 추정치를 나타낸다.
독물학 분야의 기본적인 전제는 모든 화합물이 독물이며 그것이 유익한/치료 효과 대 독성 효과를 결정하는 화합물의 투여량이라는 것이다. 투여량은 노출 시간, 투여 계획, 약물동력학적 파라메터, 예를 들면 흡수, 대사 및 제거에 의해, 치료받는 종 사이의 차이에 의해 또한 투여 경로에 의해 영향받는다. 이들 모든 인자는 약물의 혈장 농도 및 그의 노출 기간에 영향을 미친다. 따라서, 원리적으로 시험관내 스크린은 대사 및 노출 시간에 대한 근거 만을 필요로 한다. 이론적으로, 증가된 노출 시간은 투여량 응답 곡선을 좌측으로 이동시켜야 한다 (예를 들면, TC50이 더 낮거나 또는 화합물이 더 긴 시간의 노출에 대해 더 많은 독성을 나타낸다). 이러한 인자는 모두 CATS 검정 시에 Ctox선택에서 고려되어 왔다.
예를 들면, H4IIE 세포를 이용하는 시험관내 경시적 실험은 72시간의 노출 기간에 걸쳐 클로람페니칼 및 케토코나졸에 대한 투여량 응답 곡선의 변화를 평가하기 위해 수행되었다. 이 데이타는 TC50값의 가장 큰 변화가 24 내지 48 시간에서 일어났으며 연장된 노출 (72시간)이 독성 프로파일에 거의 또는 전혀 효과를 미치지 않았음을 나타내었다. 이 데이타로부터 24시간 노출의 NOEL이 생체내 독성과 많이 연관되었으며 독성을 갖게 하는 생체내 혈장 농도의 적절한 추정치를 제공하였음이 확인되었다. 생체내 동물 연구와 비교할 때, 더욱 민감한 검정에 대한 24시간 TC50농도는 독성이 발생된 농도를 넘었다. 그러나, 24시간 기간의 NOEL도 또한 더욱 민감한 검정에 대한 72시간 TC50농도와 관련되어 있으며, 따라서 72시간 TC50농도 또한 독성을 갖게 하는 생체내 혈장 농도의 적절한 추정치를 제공하였다.
이러한 연구는 Ctox를 결정하기에 바람직한 농도가 군집 분석, 특히 24시간 군집 분석 시에 측정되는 임의의 지표에 대한 효과가 관찰되지 않는 최고 농도임을 나타낸다. 72시간 군집 분석 시에 독성 검정에 대해 가장 민감한 TC50농도는 24시간 NOEL/Ctox와 연관이 있는 것으로 관찰되었으며, 독성을 갖게 하는 지속된 생체내 혈장 농도의 추정치로서 작용하는 CATS 분석에서의 또다른 데이타포인트를 나타낸다. 24시간 검정이 더욱 시간 효율적이며, 따라서 24시간 NOEL/Ctox가 CATS 검정시에 Ctox로서 선택하기에 바람직한 데이타포인트를 나타냄이 명백할 것이다. 또한, 추가 시간의 연구에 의해 다른 CATS 검정 시점 (예를 들면, 24 내지 72시간, 또는 24시간 미만)에서 동등하게 적합한 Ctox를 선택할 수 있음이 명백할 것이다.
바람직한 면에서, 군집 분석을 수행하여 얻은 데이타는 화합물 농도의 함수로서 측정되는 소정의 파라메터에 대한 화합물의 상대적 효과 (대조군과 비교됨)의 단일 그래프 플롯으로 제공된다. Ctox는 화합물이 생체내 독성 효과를 일으킬 추정 농도이다. Ctox를 찾기 위하여, 시험관내 독성 군집 검정에서 효과가 없는 100% 선위의 최고 농도는 효과가 없는 수준의 추정 NOEL로서 확인된다 (도 12). 이러한 NOEL 값의 확인은 그것이 관찰가능한 투여량 관련 독성 효과를 나타내는 2가지 이상의 높은 농도에 의해 이어질 때 (제1의 관찰된 독성 효과로부터 무작위 실험 변동을 구별하기 위하여) 가장 신뢰성이 있다. 수직선은 NOEL 점에서 시작하고 그것이 X-축과 교차할 때 끝나도록 작성된다 (도 12의 선 A). 이 선에 의해 교차되는 X-축 상의 농도 값은 생체내 독성 (Ctox)을 일으키는 예측된 혈장 농도를 나타낸다. 치료 농도 또는 투여량은 동반되는 세포독성 효과 없이 원하는 치료 효과를 나타내는데 필요한 혈장 농도이다. 약물 후보의 경우, 유효 또는 치료 투여량 (Cther)이 독성 투여량 (Ctox)으로부터 충분히 분리되어 최소의 독성 종결 위험으로 효과적인 치료를 가능하게 하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, Cther은 Ctox보다 10배 이상 또는 그 미만이다. 도 12에 나타낸 예에서, 간 독성이 처음으로 관찰된 생체내 실제 혈장 농도는 수직선 (B)로 표시된다. 예측된 (A) 값 및 실제 (B) 값은 서로의 20% 내에 있다. 원하는 치료 효과를 나타내는 것으로 관찰되는 혈장 농도는 선 (C)로 표시된다. 선 (C)와 (B) 사이의 농도 범위는 약물이 독성을 나타내지 않고 효과적인 "치료 윈도우"를 나타낸다. 도 12의 선 (D)는 TC50농도, 즉 MTT, GST 및 ATP 검정이 24시간 CATS 분석에서 50% 최대 독성 효과를 나타내는 농도를 나타낸다. 알라마르 블루 및 세포수 검정의 TC50은 MTT, GST 및 ATP 검정으로부터 보여지는 것 보다 크다. 24시간 시점에서, NOEL은 약물의 독성 농도 TC50보다 더 잘예측한다.
바람직한 양태에서, 예측은 군집 분석에 이용되는 3가지 이상의 분리 검정으로부터의 측정치의 투여량 응답 분석을 수행하는 것을 포함한다. 예를 들면, 세포 건강 군집에서, 그러한 예측은 세포 복제를 모니터하는 제1 세포 건강 지표, 미토콘드리아 기능을 모니터하는 제2 세포 건강 지표 및 막 통합성을 모니터하는 제3 세포 건강 지표에 대한 화합물의 투여량 응답 효과를 모니터하는 것을 포함할 것이다. 물론, 제4, 제5, 제6 또는 더 많은 세포 건강 지표가 이용될 수도 있는 것으로 이해된다. 이러한 투여량 응답 분석으로부터, 화합물의 측정가능한 독성 효과가 관찰되지 않는 화합물의 최고 농도, 즉 NOEL이 결정되며, Ctox가 NOEL과 관련있는 농도로서 확인된다. 분석을 위한 화합물의 농도를 선택하는데 있어서, 당 업계의 숙련인은 Ctox농도 보다 높은 2가지 이상의 농도 값의 농도에서 세포 건강의 지표를 제공하도록 선택되는 투여량 응답 투여 계획을 고안해야 한다.
특정 양태에서, 분석의 결과는 그 값이 대조군과 비교하여 제시되어 있는 단일 그래프 상에 서술된다. "대조군과 비교"라는 용어는 소정 농도의 화합물의 존재 하의 측정치가 화합물의 부재 하에 수행된 유사한 검정과 비교되는 것을 의미한다. 화합물의 부재하의 측정은 도 12에 100% 측정치로서 표시된다. 따라서, 화합물의 효과는 이후에 화합물의 부재하에 확인된 측정치와 비교하여 조정되는 원래 수치로서 결정된다.
어떤 경우에는, 치료 효과를 알아보는데 필요할 사람의 혈장 농도를 예측하는 효능/활성 실험으로부터 화합물 또는 일련의 화합물에 대해 얻어진 충분한 생물학적 활성 정보가 있을 수 있다. 그러한 예측이 너무 이른 때라도, 원하는 치료 활성과 상관있는 생물학적 효과를 얻는데 필요한 화합물 또는 적어도 일련의 화합물의 농도를 나타내는 일부 활성 데이타가 있을 수 있다. 그러한 경우에, 치료 지수 (TI)를 평가하기 위해 CATS 분석으로부터 시험관내 데이타를 사용할 수 있게 된다. 약물에 대한 TI는 독성 농도 (통상적으로 TC50값)을 유익한 치료 농도로 나눔으로써 계산된다. 따라서, TI 수가 클수록, 약물은 더 안전하다. 예를 들면, 100 마이크로몰 보다 큰 TC50값, 50 마이크로몰의 추정 Ctox값 및 0.2 마이크로몰의 추정 치료 농도를 갖는 화합물의 경우, 500의 TI가 얻어진다. 추정 Ctox가 독성 농도로서 사용된다면, 250의 TI가 얻어진다. 이는 적어도 간 독성에 대해 안전한 약물을 나타낸다. 10 이상인 TI가 바람직하며, 100의 TI가 특히 바람직하다. 물론, 100를 넘는 값이 약물이 특히 안전함을 나타내는 지표일 것이며 가장 바람직할 것이다.
따라서, 후보 치료제를 우선 순위 매기는데 유용한 본 발명의 한 양태에서는, 원하는 생체내 치료 효과와 상관 관계가 있는 활성 (Cther)을 얻는데 필요한 화합물의 농도를 확인하기 위해 시험관내 검정을 수행하고; 본원에 기재된 CATS 검정 절차에 따라 화합물의 세포독성을 예측하고; 각 화합물에 대한 추정 치료 지수 (ETI)를 제공하기 위해 각 화합물에 대해 Ctox:Cther의 비를 확인하고; 더 높은 ETI가추가 개발에 대한 더 높은 우선권과 상관있는 ETI로부터 화합물의 후보 치료제로서의 우선 순위를 매긴다. CATS 검정으로부터의 추정 TC50의 사용은 또한 특히 구조적으로 관련있는 화합물로 연구하는 경우에 ETI를 얻고 화합물을 우선 순위 매기는데 적합할 것이며, TC50은 CATS 종합 검정시에 동일한 특별한 검정으로부터 얻어진다. (화합물의 상대 독성을 비교하는데 종종 사용되는 데이타의 주요 부분은 정해진 검정에서 반 최대 효과를 나타내는 약물의 농도이다. 이 값은 50% 응답 또는 TC50을 나타내는 독성 농도로서 언급된다.)
II. 잠재적인 비독성 신규 치료약을 확인하기 위한 독성 군집 검정의 사용
바람직한 양태에서, 본 발명의 검정은 제한된 독성을 가진 추정 치료 화합물을 확인하기 위한 약물 개발 프로그램의 일부로서 사용될 수 있다. 약물 발견은 표적 치료면에서 유망함을 나타내는 후보 물질의 범위를 확인하는 것으로 시작된다. 이러한 제1 단계는 수백의 "히트 (hit)"가 이루어지게 할 수 있다. 그후에, 발견 팀은 화합물이 이후 스크린에서 전개되는 문제에 직면하게 된다. 이 단계에서의 CATS 분석으로 추정 독성 또는 추정 상대 독성 값을 기준으로 화합물을 우선 순위 매길 수 있다. 최고 화합물은 효능 및 특이성에 대한 추가의 스크린 범위에 통과된다. 그 취지는 이후의 약물 개발 노력에 가장 유망함을 나타내는 코어 구조 또는 주형을 확인하는 것이다. 일단 주형이 선택되면, 화합물의 가능성을 증가시키기 위해 추가의 화학 및 구조적 활성 분석이 수행된다. 이 방법은 리드 화합물을 형성한다. 이들 잠재성의 리드 화합물에 대해 독성 데이타를 제공하기 위해 방법의 이 단계에서 CATS 스크린이 수행될 수 있다. 최고 리드 화합물은 임상전 동물 시험 단계에 들어가기 위해 선택된다. 동물 시험 단계에서, 모든 약물 후보의 30%가 예상치 못한 독성으로 인해 실패한다. 발견 과정 초기에 포함되는 CATS 스크리닝은 나중 단계 동안에 실패하는 화합물의 수를 크게 감소시켜야 한다.
본 발명에 기재된 CATS 기술은 약물 발견 프로그램 내의 임의의 단계에서 이용될 수 있지만 발견 과정 초기에 특히 유용하다. 군집 분석으로부터 얻어진 정보는 약제사에게 새로운 주형에서의 잠재성 및 효능을 최대화하면서 독성을 설계 배제하기 위한 적절한 정보를 제공한다. 또한, 독성 군집 분석으로부터 얻어진 데이타는 독성을 나타내는 화합물의 세포하 표적을 확인할 수 있다. 이 방법을 이용하여, 추정 치료 화합물은 동일한 치료 및 화학적 부류의 공지 약물과 비교된 그의 상대 독성(들)을 기준으로 분류되거나 우선 순위 매겨질 수 있다. 예를 들면, 항진균 케토코나졸은 아졸류의 새로운 항진균약에 대한 표준 화합물로서 사용될 수 있다.
많은 화합물을 독성에 대해 스크리닝하기 위한 고처리량 검정이 특별히 예상된다. 특정 양태에서, 고처리량 스크린은 자동화될 수 있다. 고처리량 스크리닝 검정에서, 화합물 군은 생물학적 표적에 노출된다. 이들 군은 이미 개별적으로 제조되고 그 이후 화합물 은행에 저장된 화합물 집합으로부터 어셈블링될 수 있으며, 그 어셈블리는 무작위적이거나 유사한 구조가 형성되는 유사성 프로그램의 사용에 의해 안내된다.
또한, 화합물의 라이브러리 및(또는) 배열의 신중한 제조 및 사용에서 신속한 증식이 일어날 수도 있다. 각 라이브러리는 효소 또는 수용체와 같은 생물학적 표적에 대해 스크리닝된 다수의 화합물을 함유한다. 생물학적 히트가 발견될 때, 히트의 원인이 되는 화합물이 확인된다. 그러한 화합물 또는 리드 화합물은 일반적으로 스크린에서 비교적 약한 활성을 나타내지만 활성을 증가시키기 위한 더욱 전통적인 의약 화학 프로그램 수행의 기초를 형성한다. 라이브러리는 복합적 화학의 신속하게 개발되는 기술을 이용하여 또는 병행 합성에 의해 제조될 수 있다 (De Witt et al., Proc Natl Acad Sci, 90, 6909, 1993; Jung et al, Angew Chem Int Ed Engl, 31:367-83, 1992; Pavia et al., Bioorg Med Chem Lett, 3:387-96, 1993).
별법으로, 스크리닝될 화합물은 공통 주형 또는 코어 구조를 기초로 한 라이브러리로부터 얻어질 수 있다 [예를 들면, Ellman and Bunin, J Amer Chem Soc, 114:10997, 1992 (벤조디아제핀 주형), WO 95/32184 (옥사졸론 및 아미니딘 주형), WO 95/30642 (디히드로벤조피란 주형) 및 WO 95/35278 (피롤리딘 주형) 참조]. 주형은 5 x 5 x 5의 다른 치환체 결합을 도입하여 125 성분을 함유하는 라이브러리를 제공하기 위해 각각이 단계별 방식으로 몇몇, 예를 들면 5종의 다른 시약과 반응될 수 있는 몇몇, 예를 들면 3개의 기능적 부위를 가질 것이다. 라이브러리는 치환체의 모든 또는 실질적으로 모든 가능한 교환을 함유할 것이다. 주형은 예를 들면 벤조디아제핀 고리와 같은 공지된 생리활성골격 (pharmacophore)을 포함하는 "비스듬한" 주형, 또는 생물학적 사항 보다 화학적 사항에 의해 더욱 영향받는 "비스듬하지 않은" 주형일 수 있다.
따라서, 본 발명은 약물 발견을 위한 리드 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 상기 논의된 라이브러리 스크리닝 이외에, 그러한 리드 화합물은 라이브러리에서 개별적으로 제조된 단일 합성 화합물의 무작위 교차 스크리닝에 의해 또는 미생물 대사산물, 해면 및 식물과 같은 천연 산물 자원으로부터 얻어진 추출물의 스크리닝에 의해 형성될 수 있다.
또다른 별법에서, 화합물은 공지된 생물학적 활성 화합물 및(또는) 그의 생물학적 작용 부위의 구조를 기초로 한 합리적 약물 설계를 통해 형성될 수 있다. 이는 현재 컴퓨터 보조 약물 설계의 유력한 기술에 의해 보충되고 있다. 합리적인 약물 설계의 목표는 당해 생물학적 활성 분자의 구조적 유사체를 생산하는 것이다. 그러한 기술은 본 발명을 이용하여 세포독성에 대해 스크리닝될 수 있는 특별한 지표에 대한 잠재적으로 수천개의 화합물을 생산할 것이다.
III. 키트
본 발명의 특정 면에서, CATS 검정을 수행하는데 필요한 화합물은 모두 키트 내에 포장될 수 있다. 특별하게는, 본 발명은 세포독성 검정에 사용하기 위한 키트를 제공하며, 그 키트는 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 제1 세포독성 검정; 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 제2 세포독성 검정; 및 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 제3 세포독성 검정을 수행하기 위한 포장된 시약 세트를 포함하며; 상기 제1, 제2 및제3 세포독성 검정은 서로 다르다. 그 키트는 또한 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 제4 또는 제5 세포독성 검정을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 시약 이외에, 그 키트는 또한 바람직하게는 시약을 사용하는 본 발명의 CATS 검정의 한가지 이상의 변화를 수행하기 위해 시약과 함께 포장된 사용 설명서를 포함한다. 사용 설명서는 인쇄지와 같은 실체적인 매체, 또는 컴퓨터 가독성 자기 또는 광학 매체에 정착될 수 있거나, 또는 인터넷을 통해 접근가능한 전세계 웹 페이지와 같은 원격 컴퓨터 데이타 소스를 참고로 한 사용 설명서일 수 있다.
상기 실시태양이 주기 평가, 미토콘드리아 기능, 에너지 균형 및 세포 사멸 검정 부류 각각으로부터 한가지의 검정이 수행되는 키트를 예상하긴 하지만, 그 키트 및 방법은 임의 유형의 검정 중 한가지 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있는 것으로 예상된다. 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 검정을 위한 시약을 포함하는 키트 이외에 자체로서, 그 키트는 또한 부류 각각으로부터 제2 검정을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있는 것으로 예상된다. 그러므로, 그 키트는 또한 다수의 다른 세포 주기 평가 검정을 수행하기 위한 시약; 다수의 다른 미토콘드리아 기능 검정을 수행하기 위한 시약; 다수의 다른 에너지 균형 검정을 수행하기 위한 시약; 및 다수의 다른 세포 사멸 검정을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있는 것이 예상된다.
IV. 실시예
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 제시한다. 당 업계의 숙련인은이 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 실행에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 설명된 기술을 나타냄을 이해할 것이며, 그 자체로 그의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성할 것이다. 당 업계의 숙련인은 본 발명의 취지 및 영역에서 벗어나지 않고 기재된 특정 방법에서 많은 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1
<재료 및 방법>
본 실시예는 본 발명의 특정 면에서 이용될 수 있는 예시적인 재료 및 방법을 설명하며 그것은 이후 실시예에 기재된 결과를 나타내는데 이용되었다.
<투여 원액의 제조>
미리 칭량된 시험 화합물을 유리 바이알에 넣었다. 충분량의 디메틸술폭시드 (DMSO)를 바이알에 직접 첨가하여 20 밀리몰 원액을 제조하였다. 이 원액을 사용하여 DMSO 중의 200 마이크로몰 원액을 제조하였다. 0.5%의 최종 DMSO 농도를 가진 배지 중의 0.05, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 100 및 300 마이크로몰의 투여 용액을 제조하는데 20 밀리몰 및 200 마이크로몰 원액 둘다를 사용하였다. 원액 및 투여 용액은 투여하기 전날에 제조하였다. 그 용액은 다음날 아침까지 호일에 싸서 4 ℃에 저장하였다.
<시험 및 대조 품목>
배지 + DMSO (0.5%)의 음성 대조군을 세포 존재 및 부재하에 포함시켰다. 디지토닌 (1 mM) 처리된 군을 완전한 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서 포함시켰다.
<세포계 및 증식 배지>
H4IIE 세포로부터 유래된 쥐 간 종양을 시험계로서 사용하였다. 세포를 ATCC (#CRL-1548)로부터 얻고 실험실에서 계대배양시켰다. 이 세포에 대해 사용된 배양 배지는 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 10% 송아지 혈청을 함유한 이글스 최소 필수 배지 (MEM)였다. 보증 FBS 및 송아지 혈청은 기브코 라이프 테크놀로지 (Gibco Life Technologies)로부터 입수하였다.
<처리 및 실험 계획>
96-웰 평판을 투여하기 48시간 전에 200 마이크로리터의 배지 중의 10,000 세포/평판으로 접종시켰다. 접종 후 3일 째 아침에, 시험 화합물을 200 마이크로리터 용적의 배지 (DMSO = 0.5%) 중의 평판에 첨가하였다. 300 마이크로몰 처리는 1.5%의 최종 DMSO 농도를 가졌다.
방법 개발 실험 중에, GST, MTT, 및 세포 증식에 대한 DMSO의 효과를 0.01 내지 4%의 DMSO 농도에서 평가하였다. 이 연구는 2% 미만의 DMSO의 농도에서 시험된 어떠한 종결점에 대해서도 효과를 나타내지 않았다. 또한, 세포 흡수 및 화합물의 독성을 증가시키는 DMSO의 능력은 케토코나졸 및 암포테리신을 사용하여 평가하였다. 광범위한 농도의 케토코나졸 및 암포테리신이 0%, 0.5% 및 1.0%의 최종 DMSO 농도에서 시험될 때에는 상당한 독성 차이가 검출되지 않았다.
<글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST) 누출 검정>
세포를 투여한 후 (약 24시간) 아침에, 각 웰 중의 세포를 커버하는 배지를 제거하고 적절하게 표지된 새로운 96-웰 평판에 두었다. 이들 배지 평판을 분석을위해 필요할 때 까지 -80 ℃에서 저장하였다.
세포를 24시간의 노출 기간 말기에 시험 화합물에 노출시킨 배지를 모아서 GST 효소의 누출을 확인하였다. 따라서, GST 값은 노출 기간에 걸친 총 GST 손실을 나타낸다. 100% 사멸 또는 최대 GST 방출에 대한 대조군은 T0에서 1 mM 디지토닌으로 처리된 세포를 기준으로 한다. 디지토닌 처리된 세포와 비교된 사멸 세포 %를 확인하고 100에서 빼서 살아있는 세포 %를 얻었다.
<미토콘드리아 기능 검정>
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2.5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드 (MTT). GST 분석을 위해 평판으로부터 배지를 제거한 후에, 각 웰에 남아있는 세포를, 테트라졸륨 염료를 미토콘드리아 데히드로게나제 활성을 통해 포르마잔으로 환원시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. MTT 원액을 얼스 (Earl's) 완충 염 용액 (EBSS)에서 5.0 ㎎/㎖의 최종 농도로 제조하였다. 이 원액을 사용 직전에 완전 배지 (0.5 ㎎/㎖)로 10배 희석하고 수조에서 37 ℃로 가온하였다. 일부 예에서, MTT 분말을 0.5 ㎎/㎖의 최종 농도까지 완전 배지에 직접 첨가하였다. 일단 배지를 모든 웰로부터 제거하고, 200 마이크로리터의 0.5 ㎎/㎖ MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 평판을 37 ℃에서 3-4시간 동안 인큐베이션시켰다. 발색은 이 시간 내내 비례적이었다.
3-4시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 모든 배지를 제거하고 200 마이크로리터의 무수 이소프로판올을 첨가하여 퍼플 포르마잔 생성물을 추출하였다. 평판을 호일로 커버하고 실온에서 30분 동안 오르비탈 진탕기 상에 두었다. 각 웰을 다중 채널 피펫으로 흡기시켜 포르마잔 염료를 가용화하고 그후에 평판을 GH3.8 로터가 장치된 벡크만 알레그라 (Beckman Allegra) 6R 원심분리기에서 3000 rpm으로 원심분리시켜 불용성 세포 파쇄물을 제거하였다. 100 마이크로리터의 상청액을 깨끗한 96-웰 평판에 옮기고 그후에 팩카드 (Packard) 주사 분광 광도계를 사용하여 570 ㎚에서 샘플 흡수도를 읽고 650 ㎚에서 기준 흡수도를 읽어서 분석을 수행하였다.
24시간 노출 말기에, 배지를 제거하고 남아있는 부착된 세포를 미토콘드리아 기능에 대해 검정하였다. 살아있는 미토콘드리아를 가진 세포는 최대량의 MTT 활성 및 최고 흡수도 값을 가질 것이다. 처리 군의 평균 흡수도를 대조군의 평균 흡수도로 나누고 100을 곱하여 대조 % 값을 확인하였다.
<세포 증식 (CYQUANT (등록상표)) 검정>
각 웰 중의 세포수를 몰레큘라 프로브 (Molecular Probes)로부터 구입한 CYQUANT (등록상표) 세포 증식 키트로 확인하였다. 이 검정은 DNA와의 상호작용 시에 형광을 발하는 DNA-특이적 결합 염료를 기초로 하였다. 샘플 형광 단위를 형광 단위/세포를 기준으로 표준 곡선과 비교하여 세포수로 전환하였다. 다음을 제외하고는 거의 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 검정을 수행하였다: 디지토닌 (1 mM) 또는 트리톤 X100 (1%)를 용해 완충액에 첨가하였다. -80 ℃ 냉동기로부터 평판을 제거한 직후에 용해 완충액을 평판에 첨가하였다. 형광을 읽기 전에 평판을 20분 동안 진탕시켰다. 상당한 시그날 손실 없이 -80 ℃에서의 최대 저장 시간은 7일을 넘지 않도록 결정하였다.
보정 곡선을 만들어 세포수를 측정하였다. 세포 당 형광 단위 (FU)를 얻기 위하여, 1 x 106세포를 관에 넣고 펠릿으로 원심분리시켰다. 그후에, 펠릿을 DNA 결합 염료를 함유하는 1 밀리리터의 세포 용해 완충액에 재현탁시켰다. 따라서, 1000 밀리리터 중의 백만개의 세포는 현탁액 마이크로리터 당 1000개 세포의 관계를 형성한다. 이는 FU/세포를 제공한다. 얻어진 FU를 보정 곡선에 적용하여 샘플에 대한 세포수를 확인하였다. 처리 세포수를 대조 세포수로 나누고 100을 곱하여 대조군과 비교한 변화 %를 확인하였다.
<ATP 검정>
팩카드 인스트루먼트로부터 구입한 ATP-라이트 (Lite) 키트로 제조업자의 지시에 따라 세포 아데노신 트리포스페이트 (ATP)를 확인하였다. 이 검정은 루시퍼라제에 의해 촉매화되어 옥시루시페린 + AMP + PPi + CO2+ 광을 형성하는 ATP + D-루시페린 + 산소 사이의 반응을 기초로 한 것이다. 방출된 광은 존재하는 ATP의 양에 비례한다. 이 검정은 아주 짧은 반감기를 갖는 "플래쉬 (flash)" 타입 시그날 보다는 시그날 반감기를 5시간으로 연장시키는 "글로 (glow)" 기술을 이용한다. 또한, 특이적 세포 용해 시약은 내인성 ATPase를 억제하므로 세포 ATP의 ADP로의 분해를 억제함으로써 세포 ATP를 안정화시킨다. ATP는 모든 살아있는 세포에 존재하며 세포 사멸 시에 신속하게 감소한다. 또한, 이 검정은 MTT 검정과 함께 미토콘드리아 활성 및 세포 에너지 상태의 지표를 제공한다.
ATP의 변화는 평균 처리 발광 값을 대조 값으로 나누고 100을 곱하여 대조군과 비교한 변화 %로서 표시될 수 있다. 검정에 ATP 보정 곡선을 포함시키고 그후에 회귀 계수로 발광 응답을 ATP 농도로 전환시켜 실제량의 ATP를 확인할 수도 있다. 마지막으로, pmol ATP 데이타를 세포수로 나누어 세포 당 생산된 ATP의 양을 평가할 수 있다. 전형적으로, 세포는 안정한 수준의 ATP를 유지하려고 하며 그러므로 이 파라메터는 ATP 푸울의 안정성에 대한 정보가 바람직하지 않으면 일상적으로 계산되지 않는다.
실시예 2
<케토코나졸: CATS에 의해 확인된 제한된 독성의 약물>
이 실시예에서, 케토코나졸을 시험 약물로서 사용하였다. 쥐 간종양 세포를 96-웰 배양 평판에 접종하고 48시간 동안 증식시켰다. 이 증식기 이후에, 세포를 0.5% DMSO 및 증식 배지 중의 0, 0.05, 0.1, 1, 5, 10, 20, 50, 100 및 300 마이크로몰의 케토코나졸로 처리하였다. 24시간 노출 기간 후에, 세포 및 주위 배지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석하였다.
세포수 (도 2), GST 누출 (도 3), 세포수 및 GST의 방출 (도 4) 및 MTT 검정 또는 ATP 검정 (도 5)을 측정하여 케토코나졸 가변 농도의 효과를 확인하였다. 세포수, GST 누출, MTT 및 ATP 검정으로부터의 데이타를 케토코나졸 독성의 더욱 완전한 그림을 나타내도록 혼합하였다.
이 화합물에 대해 세포수 만을 모니터하였다면, 그 효과는 도 2에서 알 수 있는 투여량 관련된 세포수 감소였을 것이다. 이 데이타 만으로는 많은 의문점이 남는다. 세포 사멸 때문에 세포수가 감소되는가 또는 세포수가 감소되는 것으로보이지만 (대조군과 비교), 실제로 그 세포가 복제를 간단하게 중단시키는가? 한편, 표준 효소 누출 검정이 세포 사멸을 모니터하는데 사용되었다면 (예를 들면, LDH 또는 GST), 그 결과는 케토코나졸이 300 마이크로몰 미만의 세포에 대해 독성이 아님을 제시한다 (도 3). 그러나, 2가지 검정이 함께 실행될 때, 더욱 유용한 정보가 얻어진다. 이 경우에, 세포수는 GST 방출의 동반 증가 없이 감소되고 있다 (도 4). 그러므로, 세포수의 감소는 세포 사멸로 인한 것이 아니라 감소된 복제로 인한 것이다. MTT 또는 ATP가 사전 정보 없이 수행되었다면, 20 마이크로몰 미만에서 관찰된 초기 효과로 케토코나졸이 독성이라는 결론이 내려진다 (도 5). 다시, ATP/MTT 검정의 감소는 급성 세포독성 (사멸 세포), 감소된 복제율 또는 미토콘드리아 기능에 대한 직접적인 효과로 인한 것일 수 있다. 4가지 검정 모두를 함께 판단할 때, 케토코나졸 독성의 더욱 완전한 그림이 보여진다 (도 6A).
케토코나졸은 세포 복제에 대한 억제 효과를 나타내기 전에 미토콘드리아 기능을 억제하며 ATP 농도를 감소시킨다. 세포 ATP의 감소는 스트레스 상황을 신호하며 그 세포는 G0또는 휴지기로 들어가서 에너지를 보존한다. 이는 다시 대조군에 비해 세포수의 명백한 감소가 일어나게 한다. 따라서, 이들 데이타 모두를 혼합하면 독성 예측을 위한 유력한 기전을 얻게 된다.
세포수는 세포 증식 또는 세포 사멸의 지표이다. 대조군에 비교된 세포수가 GST와 같은 마커 효소의 동반 방출과 함께 노출이 증가함에 따라 감소한다면, 세포수의 감소는 세포 사멸 탓일 수 있다. 한편, 세포수가 GST 방출의 부재 하에 감소된다면, 화합물은 명백한 세포독성을 나타내지 않고 세포의 복제 능력에 영향을 줄 수 있다. MTT 활성의 감소는 세포 사멸, 유사분열생식의 억제 또는 직접적인 유사독성 효과의 결과일 수 있다. 시험 화합물이 GST 누출의 증가가 아니라 세포수 및 MTT 활성의 감소를 나타내었다면, 그 화합물은 세포 복제 또는 유사분열생식을 억제하는 것일 수 있다.
MTT 활성에 대한 반 최대 응답을 나타내는 노출 농도 (TC50)가 세포수 감소에 대한 TC50보다 더 낮다면, 화합물은 감소된 세포수 및 궁극적으로는 세포 사멸 및 GST 누출을 유도하는 미토콘드리아를 직접 억제할 수 있다. 따라서, 각 검정의 응답 프로파일을 주의깊게 평가하고 측정되는 특정 종결점 및 그것이 어떻게 영향받는지를 인지함으로써 세포독성의 가능성 있는 기전에 대한 충분한 예측을 개발할 수 있다.
케토코나졸은 항진균제이고 그의 부류 중에서 임상적으로 우선적으로 사용된다. 이 약물은 일반적으로 정상적인 투여 계획 하에 사람에게 내성이 있다. 그러나, 장기간에 걸친 고투여량의 처리 결과 간, 부신 및 정소와 관련된 독성을 가질 수 있다. 간은 케토코나졸을 신속하게 대사시키며 독성은 모 화합물과 관련이 있는 것으로 생각된다. CATS 계에서, 50 마이크로몰 이상의 TC50값을 가진 화합물은 심각한 생체내 간 독성을 나타내지 않는다. 케토코나졸의 CATS 분석 결과 측정된 모든 파라메터가 50 마이크로몰 이상의 TC50값을 가졌음이 밝혀졌다. 이 데이타는 케토코나졸이 정상적인 처리 계획 하에 낮은 간 독성을 갖는다는 사실과 일치한다.케토코나졸이 장기간에 걸쳐 고투여량으로 사용될 때, 간 독성은 계속해서 일어날 수 있다. 쥐에서, 60 마이크로몰에서 지속된 혈장 농도는 간 손상을 일으켰다 (도 6B의 C선). 사람에서, 30 마이크로몰에서 유지된 혈장 농도는 간 손상을 일으켰다 (도 6B의 B선). CATS 분석은 20 마이크로몰에서 독성을 나타낼 혈장 농도 (Ctox)를 추정하였다 (도 6B의 A선). 케토코나졸 매개된 간 독성의 기전(들)은 단리된 미토콘드리아에서의 상태 III 호흡의 직접적인 억제에 의해 입증되는 바와 같이 부분적으로는 미토콘드리아 기능의 억제로 인한 것이다. CATS 분석은 사실상 ATP 및 MTT가 감소되고 이어서 최고 노출 농도 (완전한 GST 누출)에서 세포 사멸에 이르게 하는 세포 복제의 감소 (GST 누출 없음)가 이루어짐을 밝혀냈다 (도 6A 및 도 6B).
이 데이타는 약물 발견 방법에서의 CATS 분석의 유용성을 입증한다. 케토코나졸은 TC50값이 50 μM 이상이기 때문에 독성으로 인해 개발로부터 탈락되지 않을 것이며, 대부분의 투여 계획 하에서 혈장 농도는 Ctox수준에 도달하지 않을 것이다. 또한, CATS는 독성의 잠재적 표적 (미토콘드리아)에 대한 정보 및 독성 (Ctox)이 생기게 할 생체내 혈장 농도의 우수한 추정치를 제공하였다.
실시예 3
<3종의 항진균 화합물과 케토코나졸의 독성의 비교>
이 실시예에서, 독성 군집 분석을 이용하여 형성된 3종의 아졸 항진균 화합물의 독성 프로파일을 서로 또한 공지된 항진균 약물인 케토코나졸과 비교하였다.
본 실시예에서, 세포수, MTT, ATP 및 GST 누출 검정을 이용하여 각종 농도의이들 3가지의 화합물의 효과를 모니터하였다. 개개의 검정을 거의 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 실시하였다. "고 독성"으로 표지된 그래프에서, 모두 4개의 생화학적 종결점은 10 마이크로몰 부근의 TC50를 갖도록 동일한 방식 및 크기로 영향받았다 (도 9). "저 독성"으로 표지된 그래프에서, 시험 화합물은 평가된 어떠한 검정에 대해서도 효과를 나타내지 않았다 (도 10). 비교하여, "잠재적으로 독성의 특이한 기전"으로 표지된 그래프에 제시된 제3 화합물에 대해 수집된 데이타는 ATP 만이 분명한 농도 의존 방식으로 응답하였음을 나타낸다 (도 11). 이들 데이타는 특이한 기전을 가진 잠재적으로 독성인 화합물을 나타낸다. 시험 화합물은 중요한 생화학적 경로 (ATP 또는 에너지)를 변화시키지만, 이 효과는 군집 분석에 사용된 실험 조건 하에서 급성 독성을 갖게 하지 않았다. 그러나, 이것은 독성이 변화된 실험 범례, 예를 들면 연장된 노출 시간의 결과로서 생긴 것이 아니라는 것을 의미하는 것은 아니다.
이들 화합물을 케토코나졸과 비교할 때, 추가의 정보가 얻어질 수 있다. 예를 들면, 도 9에 독성으로 기록된 화합물은 약 10 마이크로몰의 TC50값을 갖는 반면, 케토코나졸의 TC50값은 MTT에 대해서는 70 마이크로몰이고 다른 모든 종결점에 대해서는 100 마이크로몰을 넘는다. 따라서, 케토코나졸은 다른 아졸 항진균약 보다 덜 독성인 것으로 간주된다.
단일 독성 검정은 동일한 정보를 제공하지 않을 것이다. 예를 들면, "고 독성" 그래프 (도 9)에서, 세포수가 사용된 유일한 검정이라면, 세포수의 감소가 급성 세포독성 (세포 사멸)으로 인한 것인지 또는 간단하게는 세포 복제의 감소로 인한 것인지 분명하지가 않아서 2가지의 아주 다른 결론이 지워진다. 마찬가지로, MTT 또는 ATP가 단독으로 전개되었다면, 그 감소가 감소된 세포수와 관련있는지 (사멸에 의해 또는 감소된 복제에 의해) 또는 미토콘드리아 기능에 대한 직접적인 효과와 관련있는지 분명하지 않을 것이다 (도 9).
GST가 프로파일의 일부일 때, 다른 파라메터에 대한 효과가 세포 사멸에 이르게 하는 급성 세포독성으로 인한 것임이 분명하게 되었다 (도 9). 모든 투여량 응답 곡선이 겹쳐질 수 있고 각 검정에서 균일하게 화합물 노출 농도에 응답하는 프로파일을 형성한다는 사실은 그들이 모두 동일한 사건, 세포 사멸에 의해 영향받음을 제시하는 것이다. MTT 또는 ATP가 GST 누출의 변화 전에 낮은 투여량에서 응답하였다면, 독성을 유도하는 이전 사건에 대한 정보가 얻어질 수 있다. 이 시나리오의 예는 다른 어떠한 파라메터의 변화 없이 ATP의 농도 관련 감소를 나타내는 도 11에서 알 수 있다.
이 데이타는 ATP 합성에 대한 또는 미토콘드리아 막 투과성 (커플링되지 않음)에 대한 직접적인 효과를 나타낸다. 미토콘드리아 내의 MTT 감소는 산화성 인산화 연쇄의 컴플렉스 I 및 II에서 일어나므로 MTT는 영향받지 않는다. ATP 합성은 콤플렉스 V에서 일어난다. 유사한 효과를 얻게 하는 예시적 화합물은 콤플렉스 V에서 ATP 신타제를 특별하게 표적화하는 올리고마이신이다 (도 8). 올리고마이신에 대한 6시간 노출 후에, 세포수 및 GST는 영향받지 않는다. MTT는 상당히 감소되었지만 ATP는 완전히 소모되었다. 도 8은 거의 모든 ATP가 MTT의 임의의 상당한변화 전에 소모되었음을 나타낸다. 이 예에서, GST 또는 세포수 검정이 이용되었다면, 그 화합물은 비독성인 것으로 나타날 것이지만, 그러나 핵심 생화학적 과정에 대한 마커, 예를 들면 미토콘드리아 기능에 대한 ATP를 포함시킴으로써 세포독성이 밝혀진다.
실시예 4
<로테논: CATS에 의해 연구된 바와 같은 강독성 약물의 예>
핵심 세포 생화학적 과정 (CATS)을 측정하는 다중 검정이 가장 완전한 그림을 제공하는 이유에 대한 또다른 예는 세포수, MTT, ATP 및 GST 누출 검정에 대한 각종 농도의 로테논의 효과를 나타내는 도 7에서 볼 수 있다. 그 검정은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다.
로테논은 미토콘드리아 산화성 인산화 및 그에 따른 콤플렉스 I 및 II에서의 ATP의 합성을 특별하게 차단하는 잘 연구된 화합물이다. 이 화합물은 포유류에 대해 아주 독성이며, GST 검정이 시험관내 6시간 노출에 사용된 유일한 검정이라면, 독성은 검출되지 않았을 것이다. 그러나, 검정의 전체 군집이 평가될 때, 초기 사건 중의 하나가 ATP의 소모라는 것은 분명하다. ATP, MTT 및 알라마르 블루는 모두 감소되었지만, 다음 대부분의 민감성 마커는 ATP였다. 세포수는 감소되었지만, 이는 세포 사멸에 의한 것이 아니라 감소된 복제에 의한 것이다 (GST 누출 없음). 세포에서 일어나는 가장 에너지 의존적인 과정 중 하나는 복제이다. 그러므로, ATP의 소모 및 변화된 미토콘드리아 기능의 결과는 고 투여량에서의 복제 능력의 감소 및 세포수의 감소일 것이다. 더 긴 노출은 세포 사멸 및 GST 누출의 증가를일으켰을 것이다. 이 데이타는 또한 연장된 기간 동안의 작은 노출이 또한 세포에 대해서 독성일 수도 있음을 나타낸다.
실시예 5
<증식 세포 집단에서의 독성의 검출>
본 실시예는 CATS 분석이 도 13A-B 및 14A-D에서 알 수 있는 바와 같이 주로 증식 세포 집단에 대해 독성인 화합물을 검출하는데 어떻게 이용될 수 있는지를 나타낸다.
도 13A는 24시간 노출 이후에 일반적인 세포 건강에 대한 화합물 A의 효과를 나타내며 도 13B는 화합물이 표준 CATS 분석에서 평가될 때 24시간 노출 이후에 일반적인 세포 건강에 대한 화합물 B의 효과를 나타낸다. 이 화합물은 둘다 골수에서 상당한 저세포충실성을 나타내는 화합물의 예이다. 화합물 A는 화합물 B 보다 상당히 더 독성이다.
도 13A는 화합물 A에 노출된 세포내 GST의 변화 없이 세포수 및 MTT의 적당한 농도 의존성 감소를 나타낸다. 대조적으로, 화합물 B는 거의 효과를 나타내지 않았다. 화합물 A의 경우, 더 높은 투여량에서 감소된 세포수 및 감소된 미토콘드리아 기능의 패턴은 미토콘드리아 또는 증식 세포, 또는 둘다에 대해 독성을 나타내는 것으로 보였다.
독성을 정확하게 예측하기 위해 증식 세포에 대한 독성이 집단 배가를 필요로 할 수 있다는 가정을 평가하기 위하여, 화합물 A에 대하여 표준 24시간 보다는 72시간 동안 또다른 CATS 분석을 실시하였다. 결과를 도 14A - 14D에 나타내었다.72시간의 노출 후에, GST 검정에 의해 확인되는 바와 같이 저노출 시에 급성 세포독성이 거의 없었다 (도 14A). 그러나, 세포수는 미토콘드리아 마커 MTT 및 ATP가 그랬던 것 처럼 (도 14C) 뚜렷한 농도 의존적 감소를 나타내었다 (도 14B). 도 14D는 한 그래프 상에 모든 종결점을 나타낸다. 가장 쉽게 미토콘드리아 기능을 변화시키는 세포의 복제 불능 상태에 이르게 하는 증식 세포에 대해 화합물 A가 현저한 효과를 나타냄이 분명하다. 종결점 사이의 더 높은 해상도는 24시간 내지 72시간 사이의 시점에서 CATS 분석을 수행함으로써 얻어졌다.
이 실시예 내의 데이타는 24시간에서 프로파일된 CATS 독성이 골수 세포와 같은 증식 세포의 독성을 예측하는데 유용함을 나타낸다.
본원의 방법 및 조성물이 바람직한 양태 면에서 설명되긴 하였지만, 그 변화는 본 발명의 개념, 취지 및 영역에서 벗어나지 않고 방법 및(또는) 조성물에 적용될 수 있음이 명백할 것이다. 더욱 상세하게는, 생리학적으로 관련된 검정이 여전히 동일하거나 또는 유사한 결과를 나타내면서 본원에 기재된 검정으로 대체될 수 있음이 명백할 것이다. 당 업계의 숙련인에게 자명한 그러한 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 영역 내에 드는 것으로 생각된다.
본원에 기재된 바에 대해 보충되는 특정의 예시적 절차 또는 다른 상세한 내용이 본원에 인용된 참고 문헌에서 발견될 수 있을 정도로, 그러한 참고 문헌은 모두 특별하게 본원에 참고로 인용된다.
Claims (42)
- a) 여러 농도의 화합물을 포함하는 배지에서 세포를 배양하고;b) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제1 지표를 측정하고;c) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제2 지표를 측정하고;d) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제3 지표를 측정하고;e) 단계 (b), (c) 및 (d)의 측정치로부터 상기 화합물의 독성 농도 (Ctox)를 예측하는것을 포함하는 화합물의 생체내 세포독성의 예측 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 지표 각각이 세포 복제의 지표, 미토콘드리아 기능의 지표, 세포내 에너지 균형의 지표, 세포막 통합성의 지표 및 세포 사멸율의 지표로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 방법.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 세포 건강의 상기 지표 각각에 대해 반 최대 독성 효과를 나타내는 상기 화합물의 농도 (TC50)를 측정하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여러 농도가 0 마이크로몰 내지 약 300 마이크로몰의 농도 범위로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예측 단계가(i) 단계 (b), (c) 및 (d)로부터의 측정치의 투여량 응답 분석을 수행하고;(ii) 단계 (i)의 임의의 투여량 응답 분석에서 화합물의 측정가능한 독성 효과가 관찰될 수 없는 화합물의 최고 농도 (NOEL)를 투여량 응답 분석으로부터 확인하고;(iii) 단계 (ii)에서 확인된 농도 이하의 농도를 Ctox로서 선택하는것을 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 여러 농도가 Ctox농도 이상의 2가지 이상의 농도 값을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 단계가 72시간 이상 동안 이루어지고, 예측 단계가(i) 단계 (b), (c) 및 (d)로부터의 측정치의 투여량 응답 분석을 수행하고;(ii) 세포 건강의 상기 지표 각각에 대한 반 최대 독성 효과 (TC50)를 나타내는 상기 화합물의 농도를 측정하고;(iii) 단계 (ii)에서 측정된 최저 TC50농도 이하의 농도를 Ctox로서 선택하는것을 포함하는 방법.
- 제5항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)가 그래프 상의 상기 세포 건강 지표 각각에 대한 측정치를 화합물의 상기 세포 건강 지표 각각에 대한 농도의 함수로서 플롯팅하는 것을 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 세포 건강 지표 각각의 측정치가 화합물 농도의 함수로서 대조 측정치와 비교되어 표시되는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 세포 건강 지표 모두의 측정치가 단일 그래프 상에 플롯팅되는 방법.
- 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 건강 지표 중 하나 이상이 상기 세포 배양물의 상청액으로부터 측정되는 방법.
- 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 건강 지표 중 하나 이상이 상기 세포 배양물의 세포 성분으로부터 측정되는 방법.
- 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 건강 지표가 세포 복제를 모니터하고, 상기 제2 세포 건강 지표가 미토콘드리아 기능을 모니터하고, 상기 제3 세포 건강 지표가 세포막 통합성을 모니터하는 방법.
- 제13항에 있어서, 세포 복제가3H-티미딘 혼입을 측정하는 검정, BrdU 혼입 검정 및 CYQUANT (등록상표) 검정으로 이루어진 군에서 선택된 검정으로 모니터되는 방법.
- 제13항 또는 14항에 있어서, 상기 미토콘드리아 기능이 ATP 검정, MTT 검정, 알라마르 블루 (Alamar Blue) 검정 및 로다민 (Rhodamine) 123 검정으로 이루어진 군에서 선택된 검정으로 모니터되는 방법.
- 제12항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 통합성이 글루타티온 S-트랜스퍼라제 검정, 락테이트 데히드로게나제 검정, 아스파르틸 아미노트랜스퍼라제 검정, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 검정, 이소시트레이트 데히드로게나제 검정, 소르비톨 데히드로게나제 검정, 글루타메이트 데히드로게나제 검정, 오르니틴 카르바밀 트랜스퍼라제 검정, γ-글루타밀 트랜스퍼라제 검정 및 알칼리 포스파타제 검정으로 이루어진 군에서 선택된 검정으로 모니터되는 방법.
- 제1항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 복제의 지표, 미토콘드리아 기능의 지표, 세포내 에너지 균형의 지표, 세포막 통합성의 지표 및 세포 사멸율의 지표로 이루어진 군에서 선택된 제4 세포 건강 지표를 측정하는 것을 더 포함하는방법.
- 제17항에 있어서, 상기 세포 건강의 제4 지표가 ATP/ADP 균형 검정 및 산소 소비 검정으로 이루어진 군에서 선택된 검정으로 측정되는 에너지 균형의 지표인 방법.
- 제17항에 있어서, 세포 건강의 제4 지표가 세포수 검정 및 아폽토시스 검정으로 이루어진 군에서 선택된 세포 사멸율 검정인 방법.
- 제17항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 복제의 지표, 미토콘드리아 기능의 지표, 세포내 에너지 균형의 지표, 세포막 통합성의 지표 및 세포 사멸율의 지표로 이루어진 군에서 선택된 제5 세포 건강 지표를 측정하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제1항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 일차 세포인 방법.
- 제1항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유류 기원이고 간 세포, 신장 세포, 뇌 세포, 섬유아 세포, 신경 세포, 피부 세포, 폐 세포, 비장 세포, 자궁내막 세포, 심장 세포, 위 세포, 유방 세포, 줄기 세포 및 조혈 세포; 및 이들 임의의 세포로부터 유래된 세포계로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포계로부터 유래된 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 세포가 간 세포계 세포인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 간 세포가 사람 간 세포계 세포인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 간 세포가 설치류 간 세포계 세포인 방법.
- 제1항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 항균제, 항종양제, 면역조절제, 신경전달물질, 중추 신경계 질환 또는 장애, 또는 심혈관 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 약제, 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
- a) 원하는 치료 효과와 상관있는 생물학적 활성에 대해 다수의 화합물을 검정하고;b) 원하는 생물학적 활성을 갖는 하나 이상의 화합물을 선택하고;c) 제1항 내지 27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단계 (b)로부터 선택된 화합물의 생체내 세포독성을 예측하고;d) 적절하게 낮은 수준의 예측된 세포독성을 갖는 화합물을 선택하고;e) 상기 화합물을 상기 질환 또는 장애에 대한 효능에 대해 시험하는것을 포함하는, 질환 또는 장애 치료용 약제의 개발 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 선택 단계 (d) 후에 선택된 화합물을 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체 중에 포함하는 조성물의 제조 단계를 더 포함하는 방법.
- a) 잠재적 치료 활성을 갖는 화합물의 라이브러리를 얻고;b) 세포독성이 있는 것으로 예측되는 화합물을 확인하기 위하여 제1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따라 화합물의 세포독성을 예측하는 것을 포함하여 상기 라이브러리를 분석하고;c) 적절하게 낮은 수준의 예측된 세포독성을 갖는 상기 라이브러리로부터 화합물을 선택하는것을 포함하는, 약물 개발용 리드 화합물의 확인 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 라이브러리 내의 화합물이 공통의 구조적 특징을 공유하는 방법.
- a) 원하는 생체내 치료 효과와 상관있는 활성 (Cther)을 얻는데 필요한 화합물의 농도를 측정하기 위해 시험관내 활성 검정을 수행하고;b) 제1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따라 화합물의 세포독성을 예측하고;c) Ctox미만의 Cther를 갖는 화합물을 후보 치료제로서 선택하는것을 포함하는, 후보 치료제를 선택하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
- 제30항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택 단계 (c) 후에 선택된 화합물을 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체 중에 포함하는 조성물의 제조 단계를 더 포함하는 방법.
- 제28항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 통증; 중추 신경계의 질환 및 장애; 암; 당뇨병; 우울증; 면역부전증; 자기면역 질환 및 장애; 위장 질환 및 장애; 심혈관 질환 및 장애; 염증성 질환 및 장애; 및 감염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
- a) 원하는 생체내 치료 효과와 상관있는 활성 (Cther)을 얻는데 필요한 화합물의 농도를 측정하기 위해 시험관내 활성 검정을 수행하고;b) 제1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따라 화합물의 세포독성을 예측하고;c) 각 화합물에 대한 추정 치료 지수 (ETI)를 제공하기 위해 각 화합물에 대해 Ctox:Cther의 비를 확인하고;d) 더 높은 ETI가 추가 개발에 대한 더 높은 우선 순위와 상관있는 ETI로부터 화합물의 후보 치료제로서의 우선 순위를 매기는것을 포함하는, 제약학적 연구 및 개발을 위해 후보 치료제의 우선 순위를 매기는 방법.
- a) 여러 농도의 화합물을 포함하는 배지에서 세포를 배양하고;b) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제1 지표를 측정하고;c) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제2 지표를 측정하고;d) 상기 화합물의 4가지 이상의 농도에서 세포 건강의 제3 지표를 측정하고;e) 단계 (b), (c) 및 (d)의 측정치로부터 화합물이 세포독성 효과를 발휘하는 세포독성 기전을 예측하는것을 포함하는 화합물의 생체내 세포독성의 예측 방법.
- 제36항에 있어서, 단계 (e)가 단계 (b), (c) 및 (d)의 측정치로부터 상기 화합물의 독성 농도 (Ctox)를 예측하는 것을 더 포함하는 방법.
- a) 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 제1 세포독성 검정;b) 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 제2 세포독성 검정; 및c) 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 제3 세포독성 검정을 수행하기 위한 시약을 포함하며, 상기 제1, 제2 및 제3 세포독성 검정이 서로 다른 것인, 세포독성 검정에 유용한 키트.
- 제38항에 있어서, 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 별개의 제4 세포독성 검정을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 키트.
- 제39항에 있어서, 주기 평가 검정, 미토콘드리아 기능 검정, 에너지 균형 검정 및 세포 사멸 검정으로 이루어진 군에서 선택되는 별개의 제5 세포독성 검정을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 키트.
- 제38항 내지 40항 중 어느 한 항에 있어서, CATS 검정을 수행하기 위해 시약과 함께 포장된 사용 설명서를 더 포함하는 키트.
- a) 세포 건강의 3가지 이상의 지표를 측정하기 위한 시약; 및b) 제1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 생체내 세포독성의 예측 방법을 수행하기 위해 시약과 함께 포장된 사용 설명서를 함께 포함하는 세포독성 예측용 키트.
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|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |