KR102413041B1 - 기능성 세포 상태의 확인 - Google Patents

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Abstract

본원에 기술된 실시양태는 세포 집단의 표현형 파라미터를 측정하고, 그를 서로 비교될 수 있는 텐서로 표현하는 방법을 제공한다. 실시양태는 작용제에 대한 반응으로 세포 집단의 표현형 파라미터를 측정하는 방법을 제공한다. 실시양태는 작용제가 표현형 파라미터에 미치는 효과를, 그의 생체내 효과가 공지된 것인 참조 표준의 효과와 비교하는 방법을 제공한다. 실시양태는 참조 표준의 공지된 효과와 비교하여 작용제의 효과를 예측하는 방법을 제공한다. 실시양태는 표현형 파라미터에 대한 작용제의 효과에 의해 작용제를 분류하는 방법을 제공한다. 실시양태는 다중 파라미터 텐서를 계산하고, 그의 복잡성을 압축시키고, 압축 후 그를 비교하기 위한 소프트웨어 및 컴퓨터 시스템을 제공한다.

Description

기능성 세포 상태의 확인{IDENTIFICATION OF FUNCTIONAL CELL STATES}
본 발명의 기술분야
실시양태는 세포 검정법, 생리학 및 약물 개발 분야에 관한 것이다. 실시양태는 추가로 세포계측법(cytometry), 및 다중 파라미터 데이터, 예컨대, 세포계측 데이터의 반자동 및 자동 분석에 관한 것이다.
정부 재정 지원
본원에 개시되고, 청구된 본 발명을 이루는 데에는 어떤 정부 재정 자금도 사용되지 않았다.
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 번호 61/927,247의 우선권을 주장하고, 그의 전문을 본원에서 포함한다.
- I -
표현형 화합물 스크리닝은 제약 화합물을 신속하게 평가하는 첨단 기술이다. 최근, 교란 물질, 예컨대, 소분자 또는 생물 물질에 대한 세포의 표현형 반응의 특징을 규명하는 다수의 기법이 개발되었다. 보고된 연구들 대다수는 종래 벌크 생화학적 검정법, 또는 고함량 스크리닝에 기반한 단일 세포 기법(자동 현미경 검사)을 사용하여 왔다. 예를 들어, 문헌 [Abraham et al. ("High content screening applied to large-scale cell biology." Trends Biotechnol . 22, 15-22, 2004)] 및 [Giuliano et al. ("Advances in High Content Screening for Drug Discovery." ASSAY Drug Dev. Technol. 1. 565-577, 2003)](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다.
더욱 최근에는 복잡한 스크리닝 데이터세트의 분석에서 신규한 통계학적 방법이 수행되고 있다. 이 방법은 데이터세트들 사이의 상관 관계를 결정하는 수단을 제공할 수 있다. 스크리닝을 위한 간단한 경로 주도 모델은 문헌 [Cong et al. ("Method for using division arrested cells in screening assays," EP 1581645)])(상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있으며, (Cong)는 세포 표면 수용체, 예컨대, G 단백질 커플링된 수용체의 한 유형인 β2 아드레날린성 수용체(β2AR)의 활성을 조정하는 작용제를 스크리닝하기 위해 성장 정지 세포에서의 신호 전달을 연구하고, 상기 시스템을 사용하는 것을 제안한다. (Cong)는 심지어 상기 성장 정지 세포에서도 조차 이소프로테레놀 (100 μM) 처리가 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP: secreted alkaline phosphatase) 활성을 증가시킨다는 것을 입증하였고, 이로써, 결국에는 성장 정지 세포는 여전히 전사 반응으로의 하향 방향으로의 무손상 신호 전달 경로를 가지며, 효소 리포터 검정법은 상기 시스템을 사용하여 수행될 수 있다는 것을 확립하였다.
유사 기법이 (Hytopoulos) 등("Methods for analysis of biological dataset profiles." 미국 특허 출원 공개 번호 2007-0135997)(상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)에 의해 제공된다. (Hytopoulos)는 생물학적 데이터세트 프로파일을 평가하는 방법을 개시하였다. 다중 세포 파라미터에 대한 정보를 포함하는 데이터세트를 비교하고, 확인한다. 전형적인 데이터세트는 후보 작용제의 존재 또는 부재하에서 생물학적 인자에의 세포 노출로부터 생성되는 다중 세포 파라미터로부터의 판독값을 포함한다. 다중 콘텍스트 정의된 시스템 분석의 경우, 다중 시스템으로부터의 출력 데이터는 연결된다. 그러나, (Hytopoulos)는 반응 프로파일을 생성하고, 형성하는 것에 관한 정확한 방법 단계를 약술하지 않았다. 추가로, (Hytopoulos)는 생물학적 표본을 이용하여 해당 방법론을 수행하는 어떤 실험 실시양태도 제공하지 않았다.
(Berg) 등 ("Function homology screening," 미국 특허 번호 8,467,970)(상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)은 약물 사이의 기능적 상동성을 평가하는 방법을 개시하였다. 본 방법은 세포를 약물에 노출시키는 단계, 및 다중 출력 파라미터를 모니터링함으로써 세포 환경을 변경시킴에 따른 효과를 평가하는 단계를 포함한다. 2개의 상이한 환경, 예컨대, 상이한 화합물이 환경에 존재하는 것을 직접 비교하여 유사성 및 차이를 측정할 수 있다. 상기 비교에 기초하여, 화합물을 기능적 수준에서 특징규명할 수 있고, 이를 통해 경로를 확인하고, 화합물의 부작용을 예측할 수 있다. (Berg)는 또한 측정된 모든 세포 파라미터를 그래프로 보여주는, 매우 간소화된 히트맵인 "바이오맵" 형태의 측정된 데이터 표현을 개시하였다. (Berg)의 것은 스트레스에 대한 생리학적 반응보다는 생물학적 신호전달 경로를 측정하는 것과 관련이 있다.
(Friend) 등("Methods of characterizing drug activities using consensus profiles." 미국 특허 번호 6,801,859)(상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)은 상이한 약물 처리에 대한 반응으로 나타나는 생물학적 반응 패턴, 예컨대, 유전자 발현 패턴을 측정하는 방법을 개시하였다. 생물학적 시스템을 다양한 농도의 약물에 노출시킴으로써 작성된 반응 프로파일(곡선)은 특정 약물 군 또는 부류에 대한 세포의 생물학적 반응을 설명할 수 있다. 반응 곡선은 모델을 사용하여 근사값을 구하였다. 유사성에 관한 다양한 척도를 사용하여 곡선 또는 프로파일을 형성하는 생성된 데이터 벡터, 또는 그의 파라미터 모델을 비교할 수 있다. 상기 비교를 통해 거리 행렬이 형성되고, 이어서, 이는 프로파일의 유사성을 표현하는 트리를 구축하기 위해 계층적 클러스터링 알고리즘에서 사용될 수 있다. 그러나, (Friend) 등에 의해 개발된 프로파일은 벡터 유형 및 파라미터 수학적 모델을 간소화하는 데로 제한된다.
또한, 상기 언급된 프로파일링 방법을 (Berg) 등 및 (Friend) 등의 공개 내용에 적용시키는 것은 제한적이고, 특히, 비공지 후보 약물의 프로파일을 개발하기 위해 분포를 사용하는 것을 제공하지 않는다.
본 분야에서는 비교적 적은 연구가 큰 세포 집단에서의 단일 세포의 세포 상태를 분석할 수 있는 유세포계측법을 사용하여 수행되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Edwards et al. ("Flow cytometry for high-throughput, high-content screening," Curr . Opin . Chem . Biol. 8, 392-398, 2004, 2004)]; [Oprea et al. ("Associating Drugs, Targets and Clinical Outcomes into an Integrated Network Affords a New Platform for Computer-Aided Drug Repurposing." Mol Inform. 30, 100-111, 2011)]; [Robinson et al., ("High-throughput secondary screening at the single-cell level." J . Lab. Autom. 18, 85-98, 2013)] 및 [Sklar et al. ("Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening." Curr . Opin . Pharmacol, 7, 527-534, 2007)](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다.
그러나, 최근에는 세포계측법을 위해 고처리량 유동 처리 시스템이 이용가능함에 따라 웰당 수천 개의 세포를 샘플링하면서, 수분 이내에 전체 96 또는 384 웰 플레이트를 프로세싱하는 것이 실현 가능해졌고, 이로써, 세포계측법은 고처리량 세포 검정법을 위한 것으로 점점 더 관심의 대상이 되고 있다. 고처리량 유세포계측법을 사용하는 것을 기술하는 보고는 전형적으로는 분석되는 세포에 대한 세포 생리학적 성질을 기술하는 1 내지 5개의 상이한 변수를 획득하는 비교적 간단한 검정법에 초점을 맞추고 있다. 수학적 견지에서, 상기 검정법에서 수집된 데이터를, 행은 개별 세포에 대한 정보를 저장하고, 열은 측정된 정량(예컨대, 광 산란 특징, 형광 강도 신호 등)을 기술하는 것인 어레이로서 기술할 수 있다. 측정된 특징은 다양한 통계에 의해 요약될 수 있다. 관심 영역에서의 평균 형광 강도를 사용하는 것이 가장 일반적이다. 데이터 축소 후, 실험 결과는 벡터로 표현되며, 여기서, 요소는 선택된 요약 통계량의 값이고, 실험이 다수의 상이한 농도의 약물을 시험하는 것을 포함한다면, 최종 결과는 2D 어레이이고, 개별 열은 반응 곡선을 기술한다. 어레이에 추가 차원을 부가하기 위해 추가의 파라미터(예컨대, 다른 약물 인큐베이션 시간)가 사용될 수 있다.
전통적으로, 약물 반응 곡선은 선험적 수학적 모델 (예컨대, S자형 로그 정규 곡선, 로그 로지스틱 곡선, 곰퍼츠(Gompertz) 곡선, 와이불(Weibull) 등)을 사용하여 근사값을 구하고, 측정된 약물 반응 정보는 곡선을 설명하는 수개의 파라미터(또는 심지어는 단일 파라미터)로 축소된다. 전체 프로세스를 통하여 심하게 축약된 화합물 반응 요약: 전형적으로 다수의 EC50 값, 즉, 명시된 노출 시간 후 최대치와 기준선 사이의 중간인 반응을 유도하는 화합물의 농도를 표현하는 값을 포함하는 "시그너처"가 생성된다.
상기 접근법은 한다 하더라도 쉽게 완화될 수 없는 중요한 내재적인 제한을 받는다. 첫째, 상기 접근법은 시험된 모든 화합물의 반응을 설명하는, 파라미터를 적절하게 나타내는 공지의 적절한 수학적 모델이 사전에 존재한다고 가정한다. 둘째, 상기 접근법은 S자형 곡선으로부터 도출된 단일 파라미터(EC50)가 화합물 반응 패턴에 대한 필요한 정보 모두를 보유한다고 추정한다. 그리고 셋째, 상기 접근법은 측정된 파라미터에 의해 나타난 반응을 별개로, 즉, 1차원 방식으로 분석한다. 반응 곡선 형성을 유도하는 데이터 분석 및 특징 추출 또한 문제가 된다.
추가로, 전통적 및 널리 확립된 유세포계측 데이터 프로세싱은, 관심 집단의 간단한 통계학적 특징(피처)(평균, 중앙값, 변동 계수 등)을 컴퓨팅하기 위해 상기 집단을 수동으로 분리하는 것을 포함하는, 소위 게이팅 프로세스로 불리는 것에 의존한다. 이러한 게이팅은 고도로 주관적이며, 자동 설정 환경에서는 재현하기 어렵다. 추가로, 컴퓨팅된 특징은, 가능한 생물학적 반응의 범위 또는 세포계측 측정의 정확성을 반영하기 위해 규모 조정되거나, 표준화되지 못한다.
본원에 기술된 실시양태는 일부 실시양태에서 화합물 반응을 정량화하는 신규한 방법론을 사용함으로써 현행의 표현형 스크리닝 방법의 중대한 단점을 극복하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 기술된 실시양태는, 정보 품질을 손상시키지 않으면서, 및 반응에 대한 선험적 가정 없이도 다차원적인 화합물 핑거프린트(compound fingerprint)의 의미 있는 비교를 가능하게 하는, 다수의 혁신적인 데이터 획득 및 데이터 프로세싱 기법을 제공한다.
- II -
본 기술내용에 포함되는 다수의 실시양태 중 일부는 하기 번호로 표시된 문단에 요약되어 있다. 번호로 표시된 문단은 자기 참조식이며, 특히, 이러한 문단에서 사용된 "상기 또는 하기 중 임의의 것에 따른"이라는 어구는 다른 문단을 지칭한다. 하기 문단에서 상기 어구는 본원에 개시된 실시양태가 개별 문단에서 단독으로 이해되는 것으로 기술된 대상 및 문단에서 조합하여 이해되는 것으로 기술된 대상 둘 다를 포함한다는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 명백하게는 하기 문단을 기술하는 데 있어서 출원인의 목적은 특히 단독으로 또는 임의의 조합으로 이해되는 문단에 의해 다양한 측면 및 실시양태를 기술하고자 하는 것이다. 즉, 문단은 그 문단에 포함된 모든 실시양태의 명확하게 작성된 기술내용을 개별적으로 및 서로 임의의 조합으로 나타내고, 제공하는 간결한 방법이다. 구체적으로 출원인들은 언제든 하기 문단 중 임의의 것에 기술된 임의의 대상을 단독으로, 또는 단독으로 또는 그에 기술된 임의의 다른 값과의 임의 조합으로 이해되는, 그에 기술된 임의의 값의 임의 조합을 비롯한, 다른 문단들 중 임의의 하나 이상의 것의 임의의 다른 대상과 함께 주장할 수 있는 권리를 가진다. 필수적인 바, 구체적으로 출원인들은 본 출원에서 또는 본 출원의 이점을 가지는 임의의 후속 출원에서 완전하게 기술된 조합 모두를 본원에 기술할 수 있는 권리를 가진다.
방법 및 분석
A1. 복수 개의 농도(c)의 작용제(agent)에 세포 집단을 노출시키는 단계;
각 농도에서 집단 중 세포의 복수 개의 생리학적 파라미터(p)를 세포계측법에 의해 측정하는 단계;
각 농도에서 세포 집단에 대한 각 파라미터에 관한 집단과 대조군 사이의 거리 세트를 계산하는 단계; 및
계산된 거리로부터 각 화합물에 대한 하나 이상의 텐서(tensor)를 컴파일링하는 단계; 및
텐서 분해에 의해 텐서를 압축시켜 벡터 형태로 축약된 화합물 핑거프린트를 수득하는 단계를 포함하는,
작용제에 대한 하나 이상의 세포 반응을 특징규명하는 방법.
A2. (A) 복수 개의 농도의 제1 작용제에 제1 세포 집단을 노출시키는 단계;
상기 제1 작용제의 각 농도에서 집단 중 세포의 복수 개의 생리학적 파라미터(p)를 세포계측법에 의해 측정하는 단계;
측정값으로부터 하나 이상의 텐서를 컴파일링하여 상기 제1 작용제에 대해 기술하는 단계;
분해를 통해 텐서(들)를 압축시켜 벡터 형태로 축약된 화합물 핑거프린트를 수득하는 단계;
(B) 제2의 복수 개의 농도의 제2 작용제에 제2 세포 집단을 노출시키는 단계;
상기 제2 작용제의 각 농도에서 집단 중 세포의 복수 개의 생리학적 파라미터를 세포계측법에 의해 측정하는 단계;
측정값으로부터 하나 이상의 텐서를 컴파일링하여 상기 제2 작용제에 대해 기술하는 단계;
분해를 통해 텐서(들)를 압축시켜 벡터 형태로 축약된 화합물 핑거프린트(들)를 수득하는 단계; 및
(C) 제1 및 제2 축약된 핑거프린트 사이의 비유사성을 계산하여 제1 및 제2 작용제에 대한 세포의 반응 사이의 차이를 결정하는 단계를 포함하는, 작용제에 대한 하나 이상의 세포 반응을 비교하는 방법.
A3. 하나 이상의 음성 대조군에 대한, 하나 이상의 양성 대조군에 대한, 및 하나 이상의 농도의 화합물에 대한 2개 이상의 세포 생리학적 반응을 측정하는 단계;
수학적 제한에 의해 대조군 및 일련의 농도(concentration series)에 대하여 세포의 하부집단을 선별함으로써 특정 세포 주기 구획 및 특정 형태학적 부류에서 세포를 게이팅하는 단계;
각 양성 대조군 및 음성 대조군, 및 각 농도에 대한 세포 측정값의 분포들 사이의 비유사성을 계산하는 단계;
계산된 비유사성에 의하여 화합물에 대한 세포의 반응을 특징규명하는 단계를 포함하는, 작용제에 대한 하나 이상의 세포 반응을 결정하는 방법.
A4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응이 분포에 대한 수학적 메트릭 연산을 사용하여 계산되는 것인 방법.
A5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 측정값이 다차원 데이터 점 클라우드를 형성하는 것인 방법.
A6. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 다차원 데이터 점 클라우드에서의 변화가 바세르슈타인 메트릭(Wasserstein metric), 칸토로비치-루빈슈타인(Kantorovich-Rubinstein) 수송 문제에 대한 해결안으로서 정의된 메트릭, 이차 형식 거리, 이차 카이-거리, 쿨백 라이블러(Kullback-Leibler) 발산, 젠슨 샤논(Jensen-Shannon) 발산, 콜모고로프(Kolmogorov) 메트릭, 시자(Csiszar) φ-발산, 부르베아(Burbea) 및 라우(Rao) 발산, 및 브레그먼(Bregman) 발산 중 임의의 하나 이상의 것에 의한 거리로서 계산되는 것인 방법.
A7. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 대조군 내의 쌍별 거리의 95 백분위수의 값이 측정 정밀도 한계(통계적 유의도 한계)로서 선택되는 것인 방법.
A8. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 양성 대조군과 음성 대조군 사이의 비유사성에 관한 강력한 척도가 반응들 사이의 비유사성의 단위(unit)를 정의하는 것인 방법.
A9. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 화합물의 복수 개의 상이한 농도에서 측정된 다차원 데이터 점 클라우드의 분포 변화를 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
A10. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 복수 개의 반응 표로부터의 피처(features)를 요약함으로써 차원 축소를 사용하는 단계로서, 여기서, 모든 반응 벡터가 상기 화합물의 농도 수보다 더 적은 다수의 유도량(derived quantities)에 의해 요약되는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
A11. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 피처를 요약하는 것을 포함하는 멀티웨이 텐서에 의해 작용제에 대한 반응을 나타내는 단계를 추가로 포함하는 방법.
A12. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 상이한 작용제에 대하여 계산된 텐서가 비유사성 척도를 컴퓨팅함으로써 서로 비교되는 것인 방법.
A13. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 텐서가 터커(Tucker) 분해, CANDECOMP, PARAFAC, PARAFAC2, INDSCAL, CANDELINC, DEDICOM 또는 PARATUCK2 분해 중 하나 이상을 사용하여 분해되는 것인 방법.
텐서 및 상태 텐서
TSt1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응 텐서(response tensor)가 복수 개의 2개 이상의 세포 생리학적 파라미터의 측정 값의 데이터세트로부터 생성되고, 여기서, 반응 텐서가 다중 파라미터 및 다인자 세포 표현형을 정량화하는 것인, 세포 반응 텐서.
TSt2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 사용자에 의해 전체로 또는 부분적으로 접근, 복사, 사용 및/또는 검색될 수 있도록 유형(tangible) 형태로 코딩되는 세포 반응 텐서.
TSt3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 대조군 데이터세트에 대한 반응 텐서가, 시험 데이터세트가 대조군 또는 프로파일 데이터세트와 상이한지 여부를 결정하는 것에 대한 근거(basis)를 제공하는 것인 세포 반응 텐서.
대조군
Ctr1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 양성 대조군 세포를, 측정된 세포 생리학적 반응 중 하나 이상에 대하여 최대 측정가능한 효과를 일으키는 하나 이상의 공지 화합물로 처리하는 것인 방법.
Ctr2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 음성 대조군이 비처리 세포, 완충제로 처리된 세포, 배지로 처리된 세포, 또는 모의 화합물로 처리된 세포인 방법.
세포 주기
Ccy1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 상태가 세포의 성장 단계의 측정값, 바람직하게, 세포 분열의 측정값인 방법.
Ccy2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 상태 또는 세포 주기 단계가 단일 세포 수준에서 유세포계측법에 의해 검출되는 것인 방법.
Ccy3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 생리학적 파라미터 중 하나가 세포 주기인 방법.
Ccy4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 생리학적 파라미터 중 하나가 세포 주기 구간 G1, S, G2 및 M인 방법.
Ccy5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 구간 중 하나가 G1, S, 및 G2/M인 방법.
Ccy6. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 생리학적 반응 모두가 세포 주기 구간의 함수로서 측정되는 것인 방법.
Ccy7. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 형광 표지를 사용하여 측정되는 것인 방법.
Ccy8. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 하나 이상의 형광성 DNA 인터컬레이팅 염료를 사용하여 측정되는 것인 방법.
Ccy9. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 형광성 인터컬레이팅 염료 훽스트(HOECHST) 33342(2'-(4-에톡시페닐)-6-(4-메틸-1-피페라지닐)-1H,3'H-2,5'-비벤즈이미다졸), DRAQ5™(1,5-비스{[2-(디-메틸아미노)에틸]아미노}-4,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온), YO-PRO-1 아이오다이드(IODIDE)(퀴놀리늄, 4-((3-메틸-2(3H)-벤즈옥사졸릴리덴)메틸)-1-(3-(트리메틸암모니오)프로필)-, 디아이오다이드(diIODIDE)), DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 및 사이트랙 오렌지(CYTRAK ORANGE)(1,5-비스{[2-(디-메틸아미노)에틸]아미노}-4,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온의 유도체) 중 하나 이상을 사용하여 측정되는 것인 방법.
Ccy10. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 세포 주기 의존성 단백질의 면역표지에 의해 측정되는 것인 방법.
Ccy11. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 사이클린 A, 사이클린 B 및 사이클린 E 중 하나 이상을 면역표지함으로써 측정되는 것인 방법.
Ccy12. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 하나 이상의 인산화된 히스톤 단백질을 면역표지함으로써 측정되는 것인 방법.
Ccy13, 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 유전적으로 코딩된 세포 주기 의존성 형광 색소, 예컨대, 과인산화된 Rb 단백질을 사용하고, 세포 주기가 유세포계측법(문헌 [Juan et al., "Phosphorylation of retinoblastoma susceptibility gene protein assayed in individual lymphocytes during their mitogenic stimulation," Experimental Cell Res 239: 104-110, 1998] 참조)(상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)에 의해 측정될 수 있고, 사이클린 단백질 발현(또는 그의 인산화 상태)은 유세포계측법(문헌 [Darzynkiewicz et al, "Cytometry of cell cycle regulatory proteins." Chapter in: Progress in Cell Cycle Research 5;533-542, 2003] 참조)(상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)을 사용하여 모니터링될 수 있는 것인 방법.
Ccy14. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 단계가 예컨대, G2/M에서의 세포 주기 정지와 같이, 형광성 단백질 모이어티에 연결된 천연적으로 발현된 진동 단백질을 포함하는 유전적으로 코딩된 융합 단백질의 발현(문헌 [Cheng et al., "Cell-cycle arrest at G2/M and proliferation inhibition by adenovirus-expressed mitofusin-2 gene in human colorectal cancer cell lines," Neoplasma 60; 620-626, 2013]); S 기 진입 조절(문헌 [McGowan et al., "Platelet-derived growth factor-A regulates lung fibroblast S-phase entry through p27kip1 and FoxO3a," Respiratory Research, 14;68-81, 2013]); 또는 사이클린R1-GFP 융합 리포터를 사용하여 살아있는 증식 세포의 확인(문헌 [Klochendler et al., "A transgenic mouse-marking live replicating cells reveals in vivo transcriptional program of proliferation," Developmental Cell, 16:681-690, 2012])에 의해 측정되는 것인 방법. 상기 공개 문헌의 개시내용은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다.
Ccy15. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기가 작용제에 의해 변경되는 것인 방법.
Ccy16. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기가 세포 배양 방법의 변동에 의해 변경되는 것인 방법.
Ccy17. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기가 배양 배지 중의 하기: 글루코스, 필수 및 비필수 아미노산, O2 농도, pH, 갈락토스 및/또는 글루타민/글루타메이트 중 하나 이상의 수준 변화에 의해 변경되는 것인 방법.
Ccy18. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 상태를 교란시키는 것으로 공지된 복수 개의 화학 물질 또는 작용제에 노출된 대조군 세포 집단에서의 세포 상태 또는 세포 주기 단계를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
세포
Cls1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 시험관내 배양된 세포인 방법.
상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 생검 세포인 방법.
Cls2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 살아있는 세포인 방법.
Cls3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 고정 세포인 방법.
Cls4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 세포주인 방법.
Cls5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 천연적으로 발생된 건강한 세포 유형의 특징을 나타내는 것인 방법.
Cls6. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 질환의 특징을 나타내는 것인 방법.
Cls7. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 선천성 유전적 장애의 특징을 나타내는 것인 방법.
Cls8. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 암의 특징을 나타내는 것인 방법.
Cls9. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 대사 장애의 특징을 나타내는 것인 방법.
Cls10. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 동물 세포인 방법.
Cls11. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 포유동물 세포인 방법.
Cls12. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 인간 세포인 방법.
Cls13. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 생식 세포, 또는 만능 줄기 세포를 비롯한, 줄기 세포인 방법.
Cls14. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 체세포인 방법.
Cls15. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 줄기 세포인 방법.
Cls16. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
Cls17. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 만능 줄기 세포인 방법.
Cls18. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 유도 만능 줄기 세포인 방법.
Cls19. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 아세포인 방법.
Cls20. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 분화된 세포인 방법.
Cls21. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 최종 분화된 체세포인 방법.
Cls22. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 심장 근육 세포, 간세포, 뉴런 또는 이들의 조합인 방법.
Cls23. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포가 하기 세포: 1차 세포, 형질전환된 세포, 줄기 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 바람직하게, 부착 비의존성 세포, 예컨대, 예를 들어, 인간 조혈 세포주(HL-60, K562, CCRF-CEM, 주르카트(Jurkat), THP-1 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 또는 부착 의존성 세포주(HT-29(결장), T-24(방광), SKBR(유방), PC-3(전립샘) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음) 중 하나 이상인 방법.
지속기간
Dur1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 예컨대, 세포에서 신호전달 경로를 활성화시키기 위한 타임 코스(동태(kinetics))을 측정하면서, 세포를 복수 개의 지속기간 또는 다양한 시간 동안 작용제에 노출시키는 것인 방법(예컨대, 문헌 [Woost et al., "High-resolution kinetics of cytokine signaling in human CD34/CD117-positive cells in unfractionated bone marrow," Blood, 117; 131-141, 2011] 참조(상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)). 동태 분석을 포함하는 실시양태가 상기 분석을 필요로 하지 않는 실시양태보다 바람직하다(문헌 [Kornblau et al. "Dynamic single-cell network profiles in acute myelogenous leukemia are associated with patient response to standard induction therapy," Clin Cancer Res, 16;3721-3733, 2010] 참조(상기 문헌은 동태 분석을 교시하지 않는다)).
Dur2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포를 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 66, 72, 78시간 이상 또는 이들의 임의 조합인 시간 동안 작용제에 노출시키는 것인 방법.
농도
Cnc1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 복수 개의 2개 이상의 일련의 농도의 작용제인 방법.
복수 개의(다수의) 샘플
Plr1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 복수 개의 샘플을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
Plr2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 다중웰 플레이트의 웰 중에 배치된 복수 개의 샘플을 측정하는 것을 포함하는 방법.
Plr3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 96, 384, 또는 1536-웰 플레이트의 웰 중에 배치된 복수 개의 샘플을 측정하는 것을 포함하는 방법.
기본 기기 장치/방법
Ins1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응을 세포계측법에 의해 측정하는 것인 방법.
Ins2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응을 유세포계측법에 의해 측정하는 것인 방법.
Ins3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응을 살아있는 세포의 유세포계측법에 의해 측정하는 것인 방법.
Ins4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응을 고정 세포의 유세포계측법에 의해 측정하는 것인 방법.
Ins5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응을 고정화된 세포의 영상화에 의해 측정하는 것인 방법.
Ins6. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 반응을 형광측정법에 의해 측정하는 것인 방법.
Ins7. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 복수 개의 2개 이상의 반응 파라미터를 다채널 센서 어레이에 의해 측정하는 것인 방법.
신호 프로세싱
Sig1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 측정된 값의 벡터에, 사용된 형광 종의 스펙트럼을 자신의 열에 함유하는 역행렬을 곱하여 획득된 신호의 선형 불혼합(linear unmixing)을 통해 형광 신호를 역상관하는 단계로서; 상기 행렬이 열당 1로 정규화되는 것인 단계를 포함하는 방법.
Sig2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 측정된 값의 벡터에, 사용된 형광 종의 스펙트럼을 자신의 열에 함유하는 역행렬을 곱하여 획득된 신호의 선형 불혼합을 통해 형광 신호를 역상관하는 단계로서; 상기 행렬은 대각선당 1로 정규화되는 것인 단계를 포함하는 방법.
작용제
Agt1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포를 단일 화합물에 노출시키는 것인 방법.
Agt2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포를 2 이상의 화합물에 노출시키는 것인 방법.
Agt3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 화합물 중 하나 이상이 생리학적 반응을 자극시키는 것인 방법.
Agt4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 작용제가 유전적 작용제, 예컨대, 발현된 코딩 서열; 또는 화학 작용제, 예컨대, 약물 후보일 수 있는 것인 방법.
생리학적 파라미터
MMP
MMP1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 미토콘드리아 독성을 측정하는 것인 방법.
MMP2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 미토콘드리아 막 전위 또는 무결성(integrity)의 손실을 측정하는 것인 방법.
MMP3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 미토콘드리아 막 전위 또는 무결성의 손실을 형광 염료를 사용하여 측정하는 것인 방법.
MMP4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 미토콘드리아 막 전위 또는 무결성의 손실을 JC-1(5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴카보시아닌 아이오다이드), JC-9((3,3'-디메틸-β-나프톡사졸륨 아이오다이드, 미토프로브(MITOPROBE)™, 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes)), JC-10(예컨대, JC-1의 유도체), DiOC2(3)((3,3'-디에틸옥사카보시아닌 아이오다이드; 미토프로브™ 몰레큘라 프로브즈), DiIC1(5)((1,1',3,3,3',3'-헥사메틸인도디카보시아닌 아이오다이드; 미토프로브™, 몰레큘라 프로브즈), 미토트랙커(MITOTRACKER)™(몰레큘라 프로브즈), ORANGE CMTMROS(클로로메틸-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트, 미토트랙커™ 오렌지, 몰레큘라 프로브즈) 및 CMXROS (1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-18-이움, 9-[4-(클로로메틸)페닐]]-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-, 클로라이드, 미토트랙커™ 레드, 몰레큘라 프로브즈) 중 하나 이상을 사용하여 측정하는 것인 방법.
광 산란
LSg1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 상태의 생리학적 파라미터를 광 산란에 의해 측정하는 것인 방법.
LSg2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 상태의 생리학적 파라미터를 레이저 광 산란에 의해 측정하는 것인 방법.
LSg3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 상태의 생리학적 파라미터를 2개 이상의 각도에서 개별 세포로부터 산란되는 레이저 광의 양을 정량함으로써 측정하는 것인 방법.
LSg4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 상태의 생리학적 파라미터를 레이저 광 산란에 의해 측정하는 것인 방법.
LSg5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 상태의 생리학적 파라미터를 레이저 광 산란에 의해 측정하고, 여기서, 레이저에 의해 방출된 광의 파장이 403-408 nm, 483-493 nm, 525-53S nm, 635-635 nm 및 640-650 nm 중 임의의 하나 이상의 범위 내에 있는 것인 방법.
세포 생존도
Via1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 생존도를 측정하는 것인 방법.
Via.2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 막 무결성을 측정하는 것인 방법.
Via3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 생존도를 막 무결성을 측정함으로써 결정하는 것인 방법.
Via4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 막 무결성의 손실을 염료를 사용하여 검출하는 것인 방법.
Via5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 막 무결성의 손실을, 죽어가는 또는 죽은 세포의 특징을 나타내는 손상된 막을 가진 세포에는 유입되지만, 살아있는 세포의 특징을 나타내는 무손상 막을 가진 세포에는 유입되지 않는 염료를 사용하여 검출하는 것인 방법.
Via6. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 막 무결성의 손실을, 죽어가는 또는 죽은 세포의 특징을 나타내는 손상된 막을 가진 세포에는 유입되지만, 살아있는 세포의 특징을 나타내는 무손상 막을 가진 세포에는 유입되지 않는 염료를 사용하여 검출하고, 여기서, 염료는 DNA에의 결합시에 형광을 발하는 것인 방법.
Via7. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 막 무결성의 손실을 하기 염료: 프로피디움 아이오다이드, DAPI 및 7-아미노악티노마이신 D 중 하나 이상을 사용하여 검출하는 것인 방법.
Via8. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 막 무결성을, 무손상 세포막을 통과하고, 세포내 효소와의 상호작용시 형광을 발하며, 살아있는 세포의 세포질에 남아 있지만, 무손상 세포질 막이 없는 경우에는 밖으로 확산되는 하나 이상의 염료를 사용하여 측정하는 것인 방법.
Via9. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 막 무결성을, 무손상 세포막을 통과하고, 세포내 효소와의 상호작용시 형광을 발하며, 살아있는 세포의 세포질에 남아 있지만, 무손상 세포질 막이 없는 세포 밖으로 확산되는 하나 이상의 염료를 사용하여 측정하고, 여기서, 염료는 플루오레세인 디아세테이트, 칼세인 AM(CALCEIN AM), BCECF AM, 카복시에오신 디아세테이트, 셀트랙커™ 그린 CMFDA, 클로로메틸 SNARF-1 아세테이트 및 오레곤 그린(OREGON GREEEN) 488 카복실산 디아세테이트 중 하나 이상인 방법.
Via10. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 생존도를 아넥신 V, 절단된 카스파제/카스파제 활성화(인산화 포함) 및/또는 핵 라민 분해 중 임의의 하나 이상에 의해 측정하는 것인 방법.
GLU , ROS , MMP , CMP 및 생존도
GRC1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 하기 생리학적 파라미터: 글루타티온 농도("GLU"), 자유 라디칼 및/또는 반응성 산소 종("ROS"), 미토콘드리아 막 전위/투과성("MMP"), 세포질 막 투과성, 및 세포 생존도 중 하나 이상을 측정하는 것인 방법.
DNA 손상, 스트레스, 염증, 대사, 아폽토시스
DSI1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 하기 생리학적 파라미터: DNA 손상; 스트레스 반응 신호전달 경로 구성 성분(constituent); 염증성 반응 경로 구성 성분: 대사 경로 조절 구성 성분 또는 아폽토시스 경로 구성 성분 중 하나 이상의 것을 측정하는 것인 방법.
DSI2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 스트레스 반응 신호전달 경로 구성 성분 SAPK를 측정하는 것인 방법.
DSI3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 염증성 반응 신호전달 경로 구성 성분 NF-kB를 측정하는 것인 방법.
DSI4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 측정되는 대사 경로 조절 구성 성분이 지질 퍼옥시다제, GSk3B, 및/또는 리보솜 S6 키나제인 방법.
DSI5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 측정되는 아폽토시스 경로 구성 성분이 PI3K, AKT 및/또는 Bcl 패밀리 단백질인 방법.
참조 뱅크
Rbk1. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 공지된 교란 화학 물질 또는 외인성 분자 작용제를 그들의 공지된 효과에 기초하여 추가로 하부분류하는 것인 방법.
Rbk2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 세포 주기 의존성 마커에 의해 정의되는 각 세포 주기 단계에 대하여 컴퓨팅된 상기 화합물의 사용된 모든 농도에서의 세포 생존도, 미토콘드리아 독성, 및 적어도 하나의 추가의 생리학적 또는 표현형 기술자에 있어서의 변화에 대한 정보를 포함하는 반응표를 작성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
Rbk3. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 특정 질환을 치료하는 데 사용된 공지된 화합물을 기술하는 텐서를 단일의 정의된 부류 또는 복수 개의 정의된 부류들로 분류하고, 화합물 텐서를 공지되지 않은 또는 이전에 특징규명되지 않은 화합물을 상기 정의된 부류로 분류하는 지도형(감독형) 학습(supervised learning)을 위한 훈련 세트로서 사용하는 것인 방법.
Rbk4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 공지된 화합물을 기술하는 텐서를 이들의 오프-타겟 반응, 예컨대, 부작용에 기초하여 부류들로 분류하는 것인 방법.
Rbk5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 비지도형 학습을 이용하여 유사 화합물의 클러스터를 발견하기 위해 피처 텐서(feature tensor)를 사용하는 것인 방법.
Rbk6. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 피처 텐서를 벡터화하는 것인 방법.
작용제 작용의 분류
Cls1. 임의의 것에 따라, 생물학적으로 활성인 화합물에 노출된 세포 집단으로 복수 개의 세포 특징을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 특징은 2개 이상의 각에서 측정되는 광 산란 강도의 비율에 의해 동시에 정량화되는 형태적 특성과 관련되는 것인 단계를 포함하는, 생물학적으로 활성인 화합물을 분류하는 방법.
Cls2. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 상기 세포 집단의 배양물을 복수 개의 화합물에 노출시키는 단계, 및 상기 화합물의 존재 및 부재하에서 상기 세포 집단의 생리학적 반응을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
Cls3 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 상기 배양물로부터 샘플링된 개별 세포들의 생리학적 반응을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
Cls4. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 생리학적 반응이 미토콘드리아 독성이고, 이는 JC-1, JC-9, JC-10, DiOC2(3), DiIC1(5), 미토트랙커® 오렌지 CMTMROS, 미토트랙커® 레드 CMXROS로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형광 표지를 사용하여 미토콘드리아 막 전위의 손실 또는 미토콘드리아 막 무결성의 손실에 의해 정량화되는 것인 방법.
Cls5. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 생리학적 반응이 전체 세포 생존도이고, 이는 하나 이상의 형광 표지를 사용하여 세포 막 무결성의 손실에 의해 정량화되는 것인 방법.
Cls6. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 형광 표지가
세포 내부로 진입하여 매우 밝은 형광을 발하는 염료(예컨대, 프로피디움 아이오다이드 및 7-아미노악티노마이신 D);
무손상 세포 막의 막을 통과하여 세포내 효소와의 상호작용시 형광성 분자를 생성하는 염료(예컨대, 플루오레세인 디아세테이트, 칼세인 AM, BCECF AM, 카복시에오신 디아세테이트, 셀트랙커™ 그린 CMFDA, 클로로메틸 SNARF-1 아세테이트, 오레곤 그린 488 카복실산 디아세테이트)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
Cls7. 상기 또는 하기 중 임의의 것에 따라, 글루타티온의 농도, 반응성 산소 종 또는 자유 라디칼의 존재로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 생리학적 또는 표현형 기술자를 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
시스템
Sys1. 컴퓨터 상에서 실행되었을 때, 컴퓨터가 상기 또는 하기 방법 중 임의의 것을 실행하도록 하는 컴퓨터 프로그램을 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하는, 생물학적 데이터세트를 평가/비교하기 위한 시스템.
Sys2. 컴퓨터 상에서 실행되었을 때, 컴퓨터가 작용제에 대한 하나 이상의 세포 반응을 특징규명하는 상기 또는 하기 방법 중 임의의 것을 실행하도록 하는 컴퓨터 프로그램을 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하는, 생물학적 데이터세트를 평가/비교하기 위한 시스템으로서, 상기 방법이
농도(c)의 작용제에 노출된 집단 중 세포의 복수 개의 생리학적 파라미터(p)를 세포계측법에 의해 측정하는 단계;
각 농도에서 세포 집단에 대한 각 파라미터에 관한 집단과 대조군 사이의 거리 세트를 계산하는 단계; 및
각 화합물에 대한 텐서 또는 텐서 세트를 컴파일링하는 단계(여기서, 텐서는 화합물 핑거프린트를 함유한다); 및
텐서 분해를 통해 텐서를 압축시켜 벡터 형태로 축약된 화합물 핑거프린트를 수득하는 단계를 포함하는 것인 시스템.
Sys3. 컴퓨터 상에서 실행되었을 때, 컴퓨터가 작용제에 대한 하나 이상의 세포 반응을 특징규명하는 방법을 실행하도록 하는 컴퓨터 프로그램을 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하는, 생물학적 데이터세트를 평가/비교하기 위한 컴퓨터 시스템으로서, 상기 방법이
(A) 복수 개의 농도(c)의 제1 작용제에 제1 세포 집단을 노출시키는 단계;
상기 제1 작용제의 각 농도에서 집단 중 세포의 복수 개의 생리학적 파라미터(p)를 세포계측법에 의해 측정하는 단계;
상기 제1 작용제에 대해 기술하는 것으로부터 하나 이상의 텐서를 컴파일링하는 단계;
분해를 통해 핑거프린트 텐서(들)를 압축시켜 벡터 형태로 축약된 화합물 핑거프린트를 수득하는 단계;
(B) 제2의 복수 개의 농도(c2)의 제2 작용제에 제2 세포 집단을 노출시키는 단계;
상기 제2 작용제의 각 농도에서 집단 중 세포의 복수 개의 생리학적 파라미터(p)를 세포계측법에 의해 측정하는 단계;
상기 제2 작용제에 대해 기술하는 것으로부터 하나 이상의 텐서를 컴파일링하는 단계;
분해를 통해 핑거프린트 텐서(들)를 압축시켜 벡터 형태로 축약된 화합물 핑거프린트를 수득하는 단계; 및
(C) 제1 및 제2 축약된 핑거프린트 사이의 비유사성을 계산하여 제1 및 제2 작용제에 대한 세포의 반응 사이의 차이를 결정하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템.
Sys4. 컴퓨터 상에서 실행되었을 때, 컴퓨터가 작용제에 대한 하나 이상의 세포 반응을 특징규명하는 방법을 실행하도록 하는 컴퓨터 프로그램을 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하는, 생물학적 데이터세트를 평가/비교하기 위한 컴퓨터 시스템으로서, 상기 방법이
하나 이상의 음성 대조군, 하나 이상의 양성 대조군에 대한, 및 하나 이상의 농도의 화합물에 대한 2개 이상의 세포 생리학적 반응을 측정하는 단계;
특정 세포 주기 구간 및 특정 형태학적 부류에서 세포를 게이팅하여 대조군 및 일련의 농도에 대하여 세포의 하부집단을 선별하는 단계;
각 양성 및 음성 대조군, 및 각 농도에 대한 세포 측정값의 분포 사이의 비유사성을 계산하여 화합물에 대한 세포의 반응을 결정하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템.
데이터세트 및 데이터베이스
Dbs1. 2개 이상의 세포 파라미터에 대한 값을 포함하는 데이터세트.
Dbs2. 후보 작용제의 부재 또는 존재하에서 생물학적 인자에 노출된 세포에 대한 다수의 세포 파라미터에 대한 측정 값을 포함하는 데이터세트.
Dbs3. 화합물 반응 텐서 형태로 화합물 핑거프린트 데이터세트를 포함하는 데이터베이스.
Dbs4. 시험 프로파일의 확인을 위한 신뢰할 수 있는 프로파일의 데이터베이스로서, 여기서, 신뢰할 수 있는 프로파일은 선험적으로 공지되어 있고 특징이 잘 규명되어 있는 화합물의 반응 텐서인 데이터베이스.
Dbs5. 데이터세트는 대조군 데이터세트, 또는 시험군 데이터세트, 또는 공지된 작용제의 파라미터 변화를 반영하는 프로파일 데이터세트일 수 있다. 다중 컨텍스트-정의된 시스템의 분석을 위해, 다중 시스템으로부터의 출력 데이터는 결합(concatenate)될 수 있다.
핑거프린트
Fpt1. 다중 세포 반응 파라미터의 값을 포함하는 약물 핑거프린트.
Fpt2. 상태 텐서(state tensor)의 반복된 측정값의 평균을 포함하는, 화합물의 일 종류의 약물 핑거프린트.
Fpt2. 텐서 분해에 의해 생성된 벡터 또는 행렬을 포함하는, 화합물의 일 종류의 약물 핑거프린트로서, 여기서, 상기 텐서는 복수 화합물의 측정값을 함유하는 것인 약물 핑거프린트.
-III-
본원에 기술된 실시양태의 다양한 특징 및 이점은 첨부된 도면에 비추어 고려될 때 더욱 잘 이해된다는 것을 충분히 이해할 수 있다.
도 1a는 실시예 1에 기술된 바와 같은 정상 세포의 세포계측 프로파일을 보여주는 것이다. 세포/핵 티올 수준, 대개는 글루타티온(GSH) 수준을 측정하기 위해 세포를 모노브로모비만(MBBR)으로 측정하는 것과 같이 특이적으로 표지하였다. 세포를 실시예 1에 기술되어 있는 것과 같이, 다양한 형광 염료를 사용하여 염색하였다. 세포질 막 투과성은 칼세인 AM을 이용하여 측정하고; 반응성 산소 종(ROS; 미토콘드리아 기능 관련)은 미토속스 레드(MITOSOX RED)™를 이용하여 측정하고; 세포질 및 핵 막 투과성(생/사멸)은 사이톡스 레드™를 이용하여 측정한다.
도 1b는 "레이더" 플롯 형태의 도 1a에 관한 데이터를 보여주는 것이다.
도 2는 실시예 2에 기술된 바와 같이 전방 산란(FS: forward scatter). 글루타티온, 칼세인 AM, ROS 및 세포 생존도에 대하여 분석된, 100 μM 믹소티아졸(미토콘드리아 시토크롬 bc1 복합체의 억제제)로 처리된 세포의 플롯 세트이다. 도 1a를 도 2와 비교하였을 때, 100 μM 믹소티아졸 처리가 세포질 및 핵 막 투과성(생존도)을 교란을 시키다는 것을 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 기술된 바와 같이 전방 산란, 글루타티온, 칼세인 AM, ROS 및 생존도에 대하여 분석된, 미토콘드리아에서 언커플링제로서 작용하는 이오노포어 이동성 이온 운반체인, 33 μM 카보닐 시아나이드-4-(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존으로 처리된 세포의 산점도이다. 화살표 표시는 도 1a에 도시된 대조군 집단과 비교하였을 때의 세포 파라미터의 이동을 나타내는 것이다.
도 4a는 실시예 2에 기술된 바와 같이 전방 산란, 글루타티온, 칼세인 AM, ROS 및 생존도에 대하여 분석된, 100 μM 플루옥세틴(선택적 세로토닌 재흡수 억제제)으로 처리된 세포의 산점도이다.
도 4b는 100 μM 믹소티아졸(좌측 상단), 33 μM FCCP(우측 상단) 또는 100 μM 플루옥세틴(하단 중앙)으로 처리된 세포에 대한, 4개 축으로 플롯팅된, 도 2, 도 3, 및 도 4a의 다차원 프로파일 세트이다.
도 5는 실시예 3에 기술된 바와 같이 바이브란바이올렛(VYBRANVIOLET)™ 염료를 사용하여 살아있는 HL-60 세포에서 실시한 세포 주기 단계 조절 분석 결과를 보여주는 것이다. 세포 계수는 세로축에 명시되어 있다. DNA 함량은 가로축에 명시되어 있다. 좌측 보라색 스파이크 표시는 G1 기의 세포를 나타낸다. 넓은 분홍색 영역은 S 기의 세포를 나타낸다. 우측 십자 방격 모양의 보라색 피크는 G2/M 기의 세포를 나타낸다.
도 6a는 실시예 4a에 기술된 바와 같이, 신속한 미토콘드리아 막 전위(MMP: mitochondrial membrane potential) 탈분극을 유발하는 발리노마이신에 노출된 HL-60 세포의 MMP를 보여주는 그래프이다. 탈분극은 염료 JC-9의 그린 및 레드 형광 신호를 증가시킨다. 세포가 발리노마이신에 노출되었을 때, 레드 및 그린 형광, 둘 모두 유의적으로 더 높았고, 대략 ~0.045 μM 최대치에 도달하였다.
도 6b는 실시예 4b에 기술된 바와 같이, 다우노루비신의 유사체인 안트라사이클린 항백혈병 약물 이다루비신으로 처리된 HL60 세포에서의 JC-9 형광성을 보여주는 그래프이다. 이다루비신은 DNA 내로 삽입되어, DNA 복제 동안 풀림을 막는다. JC-9 염료의 레드 형광은 1.23 μM 이다루비신에서 유의적으로 증가하기 시작하여 상기 값 초과로 계속 증가한다. 그린 형광은 증가하지 않는다.
도 7은 실시예 5A에 기술된 바와 같이, 고정된 투과된 세포의 세포 주기 분석 결과를 보여주는 것이다.
좌측 상단 패널은 (상기 도 5에서 기술된 바와 같은) DNA 염색에 의한 주기의 G1, S, 및 G/2M 단계의 세포를 명확하게 묘사하여 보여주는 것이다.
우측 상단 패널은 세포 주기의 함수로 알렉사 플루오르(ALEXA FLUOR)® 647에 컨쥬게이션된 인산화된 히스톤 H3("P-H3") 항체를 사용하여 측정된 P-H3에 대한 결과를 보여주는 것이다. DNA 함량은 좌측 상단 패널의 경우와 같이 측정되었다. P-H3은 오직 G2/M에만 발현된다는 결과를 보여준다.
하단 두 패널은 세포 주기의 함수로서 PE에 컨쥬게이션된 항A2 항체를 사용하여 측정된 사이클린 A2에 대한 결과를 보여준다. DNA 함량은 좌측 상단 패널의 경우와 같이 측정되었다. 세포가 S를 거쳐 진행됨에 따라 사이클린 A2는 증가하고, G2/M에서 2개의 상이한 사이클린 A2 발현 집단을 형성한다.
우측 하단 패널은 세포가 후기 S를 거쳐 G2까지, M까지 진행되는 동안의 사이클린 A2에 대한 결과 대 P-H3에 대한 결과를 보여주는 것이다.
(DNA 함량을 사용하여) 오직 상기 세포주 집단에 대한 후속 분석을 "게이팅"함으로써, P-H3이 먼저 세포에서 발현되고, 여기서, 사이클린 A2 수준은 가장 높고(G2 집단), P-H3은 높은 수준으로 유지되는 반면, 사이클린 A2는 분해되고, 이어서, 세포가 유사분열(M)로부터 다시 G1로 진행됨에 따라, P-H3은 (G2로의 진입시 인산화된 특이적인 세린 잔기의 탈인산화에 의해) "손실된다"는 것이 명백해진다. 전통적인 유세포계측법 분석에서, 단백질 발현에서 이러한 서열 변화는 (DNA 함량에 기초하여) 상이한 세포 집단을 주의하여 수동식으로 "게이팅"(선별)하고, 이어서, 단백질(또는 상이한 항체-컨쥬게이트에 의해 정의되는 다른 표적)의 발현을 분석함으로써 확립된다.
도 8은 말초 혈액 단핵구에서 발견되는 톨 유사 수용체 4(TLR4: Toll-like receptor 4) 하류의 신호 전달 경로의 예를 보여주는 것이다. PI3 키나제(PI3K) 및 미토겐 결합 단백질 키나제 키나제(MAPKK: mitogen-associated protein kinase kinase) 경로의 대표적 억제제는 화살표로 표시되어 있다.
도 9는 실시예 6에 기술된 바와 같이, PI3 키나제 억제제 GDC0941의 부재(좌측 패널) 및 존재하에서의 LPS에 대한 인간 말초 혈액 단핵구의 신호 전달 반응의 동태(분 단위)를 보여주는 것이다.
그린 - IκBα; 레드 - P-ERK; 오렌지 - P-Akt; 블루 - P-S6.
좌측 패널에서 알 수 있는 바와 같이, LPS 처리는 Iκ 키나제를 활성화시고(이로써, IκBα의 프로테아좀 분해를 일으키고 - 그린/알렉사 플루오르® 488 형광 신호의 손실), ERK, Akt 및 S6(각각 알렉사 플루오르® 647, PE, 및 퍼시픽 블루(Pacific Blue)와 컨쥬게이션된 P-ERK, P-Akt, 및 P-S6에 대한 항체를 사용하여 유세포계측법에 의해 검출되는 개별 인단백질)을 활성화시킨다(인산화시킨다).
우측 패널은 LPS 단독으로 처리된 대조군 세포(좌측 패널)와 비교하였을 때, PI3 키나제 억제제 GDC0941의 존재하에서 P-Akt는 인산화되지 못하고, ERK 및 S6 인산화의 동태가 지연된다는 것을 보여준다. PI3K 억제는 IκBα의 프로테아좀 분해에 어떤 영향도 미치지 않는다는 것을 추가로 보여준다.
도 10은 글리벡(GLEEVEC)™(이마티닙, 또는 STI571)에 세포를 노출시켰을 ‹š의 효과를 보여주는 것으로, 그에 대한 상세한 설명은 실시예 7에 제공되어 있다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 30분 동안 2 μM으로 K562 세포를 처리하였을 때, 하류 STAT5 표적의 인산화는 >95% 억제되었다. 인산화된 STAT5는 사이클린 D를 비롯한 여러 표적 단백질의 전사 활성인자로서의 역할을 하고, 사이클린 D의 구성적 발현은 세포 주기에서 K562 세포를 유지시켜 준다.
도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 비록 (글리벡으로 처리된 세포에서 P-Stat5 양성인 전체 세포 집단의 임계선 위에서부터 임계선 아래로의 이동으로 입증되는 바와 같이) STAT5의 인산화가 30분 동안의 이마티닙 노출 후 억제되기는 하였지만, DNA 함량으로 측정되는 바와 같이(인서트 참조), 세포 주기에 있어서 부수 변화는 없다.
도 11은 반응 데이터의 멀티웨이 MDS 시각화의 예를 2차원 및 3차원으로 제공하는 것으로서, 이는 2차원에서 함께 가깝게 있는 것처럼 보이는 화합물이 3차원 그 이상으로 맵핑되었을 때에는 실제로 서로 원거리에 있을 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
도 12는 항당뇨병 약물인 트로글리타존에 대한 약물 핑거프린트를 보여주는 것이며, 그에 대한 상세한 설명은 실시예 8에 개략적으로 설명되어 있다.
도 13은 분석된 세포 표현형(예컨대, 세포 및 핵 막 무결성, 또는 ROS의 존재)에 기초하여 다양한 약물 사이의 생리학적 유사성을 시각화하는 대표적인 계통수를 보여주는 것이다.
도 14는 약물 반응 핑거프린트를 보여주는 멀티웨이 텐서의 예를 보여주는 것이다.
도 15는 대표적인 클라우드 진화를 보여주는 것이다. 복합 점 클라우드 사이의 비유사성에 의해 정의된 공간상 변화가 복잡한 궤도를 형성하며, 이는 고유하게 상기 변화를 유도하는 화합물의 특징을 기술한다.
도 16은 세포 생리학적 검정법을 수행하는 일반 방법 단계를 보여주는 흐름도이다.
도 17은 본원에 기술된 텐서 방법을 사용한 데이터 분석의 단계를 보여주는 흐름도이다.
도 18은 화합물에 노출된 세포(A) 및 노출되지 않은 세포(B)의 모의 유세포계측법 분석 결과에 관한 2D 산점도를 보여주는 것이다. (A) 및 (B)는 각각 상기 작용제에 대한 양성 대조군 및 음성 대조군을 나타낸다. FL1 및 FL2는 형광 신호 1 및 2이다.
도 19는 실시예 9에 기술된 바와 같이, 생물학적 작용제의 농도를 증가시키면서 그에 노출된 10개의 샘플의 모의 유세포계측법 분석 결과에 관한 2D 산점도를 보여주는 것이다. 각 샘플은 5,000개의 세포를 함유한다. 농도는 A부터 J까지로 증가되었다. 양성 대조군 유사 클러스터 중 세포의 개수는 A에서 4,909에서부터 J에서 29로 감소되었다. FL1 및 FL2는 형광 신호 1 및 2이다.
도 20은 실시예 9 및 도 18에 기술된 모의 유세포계측법 분석에 대한 2개의 반응 곡선 그래프를 제공한다. (A)는 양성 유사 대조군 클러스터 중의 세포 개수의 함수로서 각 샘플에 대한 결과를 보여주는 것이다. (B)는 양성 유사 대조군 클러스터 중의 세포 비율(%)의 함수로서 각 샘플에 대한 같은 결과를 보여주는 것이다.
도 21은 실시예 9에 기술된 바와 같이, 비유사성 척도를 제공하기 위하여 각 샘플에 대하여 계산된 4개의 거리를 보여주는 것이다. (1) 파라미터 1에 대한 샘플과 음성 대조군 사이의 거리. (2) 파라미터 1에 대한 샘플과 양성 대조군 사이의 거리. (3) 파라미터 2에 대한 샘플과 음성 대조군 사이의 거리. (4) 파라미터 2에 대한 샘플과 양성 대조군 사이의 거리.
도 22는 실시예 9에 기술된, 다항 텐서 분해에 의해 유도된 모의 반응 곡선을 보여주는 것이다. 결과는 벡터의 평균을 감산하고, 표준 편차로 나눔으로써 센터링되었다. 결과는 z 인자로 표시되어 있고, 좌측 그래프에 제시되어 있다. 우측 그래프는 음성 대조군과 양성 대조군 사이의 차로 정규화된 결과를 보여주는 것으로; 즉, 여기서, 음성 대조군과 양성 대조군 사이의 차는 1로 간주되는 양(1)으로 정의되며, 결과는 상기 차로 크기 조정되어 있다.
도 23은, 통상 세로축을 따라서는 음성 대조군 유사 클러스터 중의 세포의 비율이 표시되어 있고, 가로축을 따라서는 거리/비유사성이 표시되어 있는, 실시예 9에 기술된 모의 결과에 대한 그래프이다. 거리/비유사성은 실시예 9에 기술되어 있는 바와 같이, 도 18에 도시되어 있는 것처럼 양성 대조군 및 음성 대조군을 사용하여 동일한 결과에 대하여 계산되었다.
도 24는 실시예 9B에 기술된 바와 같이, 발리노마이신의 농도를 증가시키면서 그에 노출된 10개의 샘플의 유세포계측법 분석 결과에 관한 2D 산점도를 보여주는 것이다. JC9의 레드(세로축) 대 그린(가로축) 형광의 비를 측정하여 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다. 발리노마이신 농도는 A(최저 농도)에서부터 J(최고 농도)로 증가되었다.
도 25는 실시예 9B에 기술되고, 도 24에 도시된 발리노마이신 분석(동그라미 표시)에 대한, 및 같은 방식으로 관찰된 이다루비신(마름모꼴 표시) 및 아세트아미노펜(삼각형 표시) 데이터에 대한 비유사성 반응 곡선을 보여주는 것이다. 좌측 그래프는 샘플 개수의 함수로서의 비유사성을 보여주는 것이다. 우측 그래프는 농도의 함수로서의 비유사성을 보여주는 것이다.
- IV -
본 발명의 예시적인 실시양태는 예를 들어, 화학 화합물, 예컨대, 약물에 노출된 세포 생리학적 반응을 정량화하고, 비교하기 위한 것과 같이, 복합 집단 기반 정보, 특히, 예를 들어, 세포계측법 기반 정보를 수집하고, 컴파일링하고, 나타내고, 조사하기 위한 자동식의, 관찰자 독립적인 강력하고, 재현가능한 일반 방법을 제공한다. 다양한 실시양태는 반응 텐서에 의해 반응을 특징규명하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시양태는 1차원 이상에서의 분포 사이의 거리의 다양한 통계학적 척도, 및 멀티웨이 텐서로 분류된 반응 벡터 사이의 비유사성의 척도의 용도를 제공한다. 다양한 실시양태에서, 2개(또는 그 초과)의 화학 화합물에 대한 세포 반응의 차이는 상기 화합물을 나타내는 두 반응 텐서("핑거프린트") 사이의 차이로서 특징화된다. 실시양태는 상기 핑거프린트를 생성하는 방법, 및 그를 조작, 프로세싱, 저장, 분류, 및 사용하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 다양한 실시양태에서, 예를 들어, 생물학적 데이터세트를 분석하여 그들 사이의, 대개는 시험 데이터세트와 대조군 사이의, 또는 시험 데이터세트와 프로파일 데이터세트 사이의 일치를 측정한다. 2개 이상의 데이터세트 사이를 비교할 수 있고, 여기서, 전형적인 데이터세트는 다중 세포 파라미터로부터의 판독값, 예컨대, 후보 작용제의 부재 또는 존재하에서 생물학적 인자에 세포를 노출시킴으로써 생성된 값을 포함하고, 여기서, 상기 작용제는 예를 들어, 유전적 작용제, 예컨대, 발현된 코딩 서열; 또는 화학 작용제, 예컨대, 약물 후보; 또는 환경 독소일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 측정은 세포계측법, 예컨대, 유세포계측법을 사용하여 수행된다.
세포계측법
본원에 기술된 다양한 실시양태의 방법은 세포계측법에 의해 결정되는 바와 같이, 세포 집단 중의 개별 세포에 대한 복합 다중 파라미터 데이터를 분석하는 데 적합하다. 본원에 요약된 세포분석 장치 및 기법(예컨대, 유세포계측법 및 영상화 세포계측법)을 통해 개별 세포의 다중의 고유한 특징(예컨대, 광 산란, 세포 부피 등) 또는 유도된 특징(예컨대, 형광, 흡광도 등)을 동시에 측정할 수 있다. 광 산란 및 형광은 현 세포계측 적용을 위해 가장 일반적으로 사용되는 측정법을 나타낸다. 형광 측정은 세포에 천연적으로 존재하는 "고유한" 형광단(예컨대, 예를 들어, 포르피린, 플라빈, 리포푸신, NADPH), 특이 발현을 위해 유전적으로 조작된 형광단(예컨대, GFP, RFP 등), 또는 다양한 세포 유형내 또는 그 위의 특이 에피토프 또는 구조를 표적하는 형광성 리포터(예컨대, 항체, 압타머, 파지 디스플레이, 또는 펩티드에 컨쥬게이션된 형광단, 또는 세포내 또는 그 위의 특이 효소에 의해 비형광 상태에서 형광 상태로 전환되는 리포터)를 이용하여 수행될 수 있다.
본원에 기술된 실시양태에서 유용한 세포계측 기법은 살아있는 세포를 사용(예컨대, 세포 "생리학"의 측면에서 세포를 보고하는 프로브, 예컨대, 예를 들어, 미토콘드리아 막 전위, ROS, 글루타티온 함량, 또는 이들의 조합을 사용)한다. 일부 실시양태에서 유용한 세포분석 기법은 추가로 형광단, 컨쥬게이션된 리포터 등이 세포질 및/또는 핵 내로 수송될 수 있도록 고정 및 투과화된 세포를 이용한다.
유세포계측법을 이용하는 일반 세포 검정 방법
본원에 기술된 다양한 측면 및 실시양태에 따른 세포계측법에 유용한 일반 방법은 하기 기술되어 있고, 도 16의 일반화된 흐름도로 제시되어 있다.
부착 비의존성 세포의 배양
당업계에 널리 공지되어 있고, 통상적으로 사용되는 유세포계측법에 의한 활성 검정법 및 분석에 적합한 세포 및 방법은 본원에 기술된 본 발명의 실시양태를 수행하는 데 사용될 수 있다.
검정을 위한 세포는 상업적 공급원 또는 다른 공급원으로부터 입수할 수 있다. 인간 암으로부터 유래된 세포, 예컨대, 백혈병으로부터 유래된 것(예컨대, 현재 세포 생리학적 검정법에서 사용되는 HL-60 세포)가 사용될 수 있고, 이는 배양 베쓸에 부착되지 않고 성장한다. 세포는 표준 세포 방법에 따라 액체 질소 중에서 보관될 수 있다. 냉동된 세포는 37℃ 수조에서 빠르게 해동되고, 37℃ 조직 배양 인큐베이터 중 미리 가온된 신선한 조직 배양 배지 중에서 정치식 플라스크에서 배양된다. 조직 배양 배지는 전형적으로 세포가 그 안에 냉동되어 있는 DMSO를 희석시키기 위해 배양 동안 처음 2-4일 동안에는 매일 교체된다.
일단 정치식 플라스크에서 성장이 확립되고 나면(세포 개수 및 생존도를 비-셀(Vi-cell)™ 세포 계수기를 사용하여 모니터링한다), 분취량의 세포를 냉동기 보관을 위해 옮길 수 있다(이러한 조기 계대 세포는 오직 백업을 위해서만 사용된다). 추가로, 상기 세포를 사용하여 플레이트 검정법을 위해 충분한 세포 개수를 가지는 것이 요구되는 회전 병 배양을 확립할 수 있다. 플라스크에서 성장한 세포를 비교적 높은 세포 농도(200 ml의 신선한 조직 배양 배지 중에 ~106개의 세포/ml)로 회전 병에 놓고, 조직 배양 인큐베이터에서 배양한다. 먼저, 회전 병 배양은 전형적으로 신선한 조직 배양 배지를 첨가함으로써 공급받게 된다. 일단 성장이 확립되고 나면, 0.5-1.5 x 106개의 생존가능한 세포/ml인 농도로 세포를 유지시키기 위해 필요에 따라 세포를 제거한다. 많은 세포 유형은 회전 병 배양에 천천히 적응하고, 이러한 유형의 배양에 성공적으로 적응하는 데에는 수주가 소요된다. 성공적인 회전 병 적응은 연속된 높은 생존도(~95%) 및 일관된 성장률(배가 시간을 사용하여 측정)로 입증된다. 성공적으로 적응하였을 때, 검정에 사용되는 세포를 유사한 저 계대수로 유지시키기 위해 세포 스톡을 (하나의 새 회전 병 배양을 개시하는 데 충분한 세포를 함유하는 50 ml 멸균 튜브 중에서) 냉동시킨다(하기에서 상세히 설명). 회전 병에 유지된 세포를 검정용 플레이트에 수거하고, 원심분리하고, 수행하고자 하는 검정법에 적절한 세포 농도로 신선한 배양 배지 중에 재현탁시킨다(매 수거마다 세포 개수 및 생존도를 측정하고 기록한다).
상기 언급한 바와 같이, 회전 병에 적응한 세포를 추후 사용을 위해 냉동시켜 모든 플레이트 검정법을 위해 세포를 유사한 저 계대수로 유지시킬 수 있다. 저 계대 냉동 세포의 새로운 로트로 옮기기 전에 1개월 동안 회전 병 세포 배양물을 유지시킬 수 있다. 통상적으로 사용하는 상기 기간의 개월 동안 냉동된 세포의 한 튜브를 전형적으로 해동시키고, 회전 병 배양으로 재확립시킨다. 일단 (상기와 같이) 회전 병 배양에 성공적으로 적응하고 나면, 상기 세포 로트를 플레이트 검정법에 사용하기 이전에, 일반적으로 최신 세포 로트를 먼저 검정 수행능에 대하여 평가한다(하기의 "교차" 연구 참조). 냉동 세포를 회전 병 배양물로 확립시키고, 시험하는 데 통상 10 내지 21일이 소요된다.
세포를 일반적으로는 통상 배양 과정 중 다단계로 마이코플라스마 오염에 대해 검사한다. 이는 초기 플라스크 배양, 회전 병 적응 세포, 및 (각 "교차" 연구 전에 시험된) 냉동 세포의 각 튜브를 포함한다. 마이코플라스마 검사는 외부의 공인 검사 회사에 의하여 전형적으로는 PCR 기반 검정법을 사용하여 제공될 수 있다.
화합물 보관 및 화합물 검정 준비
시험 화합물은 일반적으로 96 웰 플레이트 중에 증착된 DMSO 중의 10 mM 스톡으로서 입수된다. 화합물 플레이트를 실온 암실에서 밀봉 보관한다. 화합물 검정을 위해, 스톡 용액을 희석시키고(DMSO 중 5 내지 10개 단계의 화합물 희석액), 액체 처리 시스템을 사용하여 검정용 플레이트에 증착시킨다. 희석 및 검정용 플레이트로의 화합물 증착은 모두 검정법을 수행하는 날과 같은 날에 수행한다. 각 웰에 증착된 화합물의 최종 부피는 2 ㎕이고, 이로써, 세포 첨가 후의 최종 농도는 1% DMSO이다.
시험 화합물을 사용하여 검정법의 재현가능성을 평가하여야 한다. 특이적인 세포 생리학적 측정값에 영향을 미치는 것으로 문서상 입증되어 있는 16개의 화합물로 이루어진 한 세트를 사용하여 세포 생리학적 검정법의 재현가능성을 시험할 수 있다. 상기 화합물을 상기와 같이 96 웰 플레이트 중의 DMSO에 10 mM 검정용 용액으로서 보관한다. "교차" 연구를 위하여, 16개의 화합물로 이루어진 세트를 사용하여 새로 해동되고, 회전 병 적응된 세포 생리학적 반응을 생산 세포의 현 로트와 비교한다.
세포 생리학적 검정법
세포 생리학적 검정법을 위해, 화합물이 10개 이상의 세포 반응 파라미터에 미치는 영향을 측정하기 위하여 384 웰 플레이트 2 세트를 이용하는 것이 편리할 수 있다. 플레이트 2 세트 모두, 화합물 희석액을 먼저 웰에 증착시킨 후, 단계 (2602)에 제시되어 있는 바와 같이, 1 x 106개의 검정용 세포를 각 웰에 첨가한다. 통상 같은 플레이트 상에서 이중 화합물 희석액 세트를 이용하여 화합물에 대해 실시하고; 개별 클라이언트의 경우, 연구 시작시, 반응의 재현가능성을 측정하기 위해 이중 플레이트를 처음 16 내지 32개의 화합물에 대하여 실시한다. 완전하게 혼합한 후, 플레이트를 밀봉시키고(O2/CO2 영구 밀봉 사용), 단계 (2604)에 제시되어 있는 바와 같이, 다양한 기간 동안 (전형적으로 4 hr) 37℃ 조직 배양 인큐베이터에 배치한다. 이어서, 단계 (2606)에서 플레이트를 원심분리하고, 상청액 유체 중 절반을 제거하고, 단계 (2608)에 제시되어 있는 바와 같이, 같은 부피의 적절한 염료 믹스로 교체한 후(플레이트 A의 경우, 염료 믹스는 모노브로모비만, 칼세인 AM, 미토속스(MitoSox)™, 및 사이톡스 레드(Sytox Red)™를 포함할 수 있고; 플레이트 B의 경우, 염료 믹스는 바이브란트 바이올렛™(살아있는 세포 주기), JC-9(미토콘드리아 막 전위), 및 사이톡스 레드™를 포함할 수 있다), 혼합한다. 단계 (2610)에서 플레이트를 약 15분(플레이트 A) 또는 30분(플레이트 B) 동안 조직 배양 인큐베이터로 복귀시킨 후, 혼합하고, 단계 (2612)에서 즉시 유세포 계측기 상에서 분석한다.
각 열 상의 양성 및 음성 대조군 웰로부터의 데이터를 이용하여 본원에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같이 반응을 계산한다. 플레이트 A 및 B에 대해 사용되는 양성 대조군 화합물은 상이하고, 개시된 실시양태를 사용하여 플레이트 A 또는 B에서 측정되는 세포 반응에서 독특한 "시그너처"("핑거프린트")를 제공하도록 디자인된다.
고처리량 유세포계측법
다양한 검정법에서 유세포 계측기는 플레이트 검정법이 수행되는 날 매일 표준 방법을 사용하여 설치된다. 설치는 각 검출기(PMT)를 표준화된 표적에 설치하는 데 사용되는 형광성 비드를 사용하는 유동 장치 QA/QC를 포함한다. 이어서, 6초 간의 짧은(sip) 시간을 사용하여 384 웰 플레이트의 각 웰을 순차적으로 샘플링한 후, 샘플 사이에 1초 간의 기포를 둔다. 샘플 스트림은 연속 방식으로 유세포 분석기를 통해 유동하고, 이때 20 내지 30분(각각 플레이트 A 및 B) 경과 후 플레이트의 샘플링은 완료된다.
이어서, (한 플레이트에 대한) 유세포계측법 데이터 파일을 개시된 실시양태에 의해 프로세싱하여 (일부 상호작용 및 인간의 개입을 이용하여) 개별 웰 데이터를 확인하고, 단일 플레이트로부터의 각 웰에 대한 목록 모드 데이터(LMD: list mode data)로서 서버에 저장된다.
각 플레이트에 대한 QA / QC 분석
두 플레이트(A 및 B) 모두 음성 대조군(비처리 샘플) 및 양성 대조군(플레이트 A의 경우, 50 uM FCCP + 50 uM 믹소티아졸의 혼합물로 처리되 샘플, 또는 플레이트 B의 경우, 25 uM FCCP로 처리되 샘플)을 포함한다. 이 검정법에서 양성 대조군과 음성 대조군 사이의 비유사성이 가능한 반응 범위를 정의하는 것은 아니다. 그러나, 이는 반응 단위는 정의한다. 전체 플레이트 분석 시간 동안 양성 대조군과 음성 대조군 사이의 비유사성은 플레이트에서의 생리학적 악화 조건(온도 변화, O2 변화 등)에 기인하여 변할 수 있다. 이는 모든 대조군 쌍에 대하여 특정의 최소 수분의 비유사성이 예상되기 때문이다. 단일 열 내의 각 양성 대조군 및 음성 대조군에 대하여 개시된 실시양태는 개별적으로 각 염료 반응에 대한 양성 및 음성 집단 사이의 QF 거리를 측정한다. 이어서, 개시된 실시양태는 플레이트의 시작점(A 열)에서부터 종점(P 열)까지의 QF 거리 변화를 플롯팅한다.
본원에 기술된 실험은 일반적으로 상기 방법에 따라 수행되어 왔다.
세포계측기 기기 장치
개별 세포로부터 기원하는 고유한 광학적 특징과 함께 많은 형광 신호를 동시에 정량화할 수 있는 다중의 개별 형광 검출기 및 다중 레이저가 현 유세포계측 장치에 장착된다. 세포계측 기법 및 장치, 예컨대, 하기에 예시적으로 기술된 것을 통하여 샘플 중 수천 내지 수백만 개의 세포를 측정할 수 있다. 생성된 대규모의 데이터 세트는 현재 사용되는 세포계측 데이터 프로세싱 및 시각화 방법에 중요한 도전 과제를 제시한다. 이러한 도전 과제는 본원에 기술된 방법에 의해 효과적으로 처리된다.
현 세포계측기는 전형적으로 샘플로부터의 여러 다른 신호를 동시에 검출하도록 디자인된 것이다. 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 다양한 세포계측기는 상업적으로 이용가능하다. 전형적인 장치로는 유동 셀, 집속 렌즈를 통하여 유동 셀에 조사하는 하나 이상의 레이저, 유동 셀을 통과하는 광에 대한 검출기, 전방 산란광에 대한 검출기, 수개의 다이크로익 미러 - 특이 파장의 광을 측정하기 위한, 전형적으로, 형광 검출을 위한 검출기 어레인지먼트를 포함한다. 대개는 매우 광범위한 다른 장치가 시판용 장치에 도입된다.
전형적으로 가동될 때, 레이저(레이저들)는 유동 셀, 및 상기 유동 셀을 통과하는 세포(또는 다른 샘플)에 조사한다. 레이저 조사를 받은 볼륨이 질의점(interrogation point)으로 지칭된다. 유동 셀은 유리, 석영 및 플라스틱 뿐만 아니라, 다른 물질로도 제조된다. 비록 세포계측기에서 가장 일반적인 광원은 레이저이기는 하지만, 다른 광원 또한 사용될 수 있다. 거의 모든 세포계측기는 전방 산란광 및 후방 산란광의 다양한 파라미터 및 여러 파장의 형광 방출도 검출하고, 측정할 수 있다. 상기 장치에서 검출기는 감도가 매우 높고, 매우 짧은 단기간에 개별 세포로부터의 광 산란 및 형광을 쉽게 정량한다. 검출기로부터의 신호는 전형적으로 디지털화되고, 전산상의 방법으로 분석되어 매우 다양한 샘플 특성을 측정하게 된다. 본원에 기술된 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태에 따라 사용될 수 있는 유세포계측에 관한 방법에 대하여 이용가능한 텍스트가 다수 존재한다. 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 바, 이에 관하여 유용한 참고 문헌은 문헌 [Practical Flow Cytometry, 4th Edition, Howard M. Shapiro, Wiley, New York (2003) ISBN: 978-0-471-41125-3])(상기 문헌은 특히 부분적으로 세포계측법 및 세포 분석과 관련하여 본원에 참조로 포함된다)이다.
유세포계측 신호의 스펙트럼 불혼합
기능성 형광 표지에 의해 방출되는 신호는 (유동 또는 영상 기반의) 세포계측 시스템에서 일련의 검출기에 의해 측정되기 때문에, 검출 시스템은 스펙트럼 크로스 토크(cross-talk)가 이루어지기 쉽다. 그 결과, 다른 형광단은 제외하고, 개별 형광단의 강도가 직접적으로 측정될 수는 없다. 스펙트럼 크로스 토크에 기인하는 잡음을 최소화시키거나, 또는 제거하기 위해서는 수집된 신호 모두를 선형 혼합물로 모델링하거나, 프로세싱할 수 있다. 불혼합 신호의 추정량에 혼합 행렬을 곱하여 형성된 구성 근사치와 측정된 결과 사이의 최소 편차값을 찾음으로써 각각의 측청된 세포에 대한 신호 혼합을 개별 신호 강도의 근사치로 분해한다. ("스필오버 행렬"로도 불리는) 혼합 행렬은 개별 표지의 형광 스펙트럼의 n 밴드 근사치를 기술한다(여기서, n은 시스템에서 사용된 검출기의 개수이다). 최소화 알고리즘을 적용함으로써 신호 구성의 최적 추정치를 찾을 수 있다. 상기 추정치는 상이한 표지의 존재비(abundance)에 대한 정보를 제공한다. 가장 단순히 용이하게, 측정 오차가 가우스(Gaussian) 안에 있다고 가정할 때, 불혼합 프로세스는 정규 최소 제곱(OLS: ordinary least-squares) 최소화를 사용하여 수행될 수 있다.
분산 안정화
분산 안정화(VS: Variance stabilization)는 탐구 데이터 분석을 간소화하거나, 더욱 복잡한, 대개는 잡음 이분산성 데이터 세트(즉, 시퀀스에서 확률 변수는 유한 분산을 가진다)에 대한 데이터 등분산성에 관하여 추정하는 데이터 분석 기법을 사용하도록 디자인된 프로세스이다. VS는 통상 형광에 기반한, 다양한 생물학적 측정 시스템에 널리 적용되어 왔다. 이는 마이크로어레이 분석에 중요한 도구이다.
유세포계측법과 관련하여, 및 마이크로어레이 분석에서, 전통적으로 로그 전환이 사용되어 왔다. 그러나, 예를 들어, 마이크로어레이 분석에서도 현 접근법이 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Rocke ei al. (Approximate variance-stabilizing transformations for gene-expression microarray data," Bioinformatics, 19, 966-972, 2003)] 및 [Huber et al. ("Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification of differential expression." Bioinformatics , 18, S96-S104, 2002)]를 참조할 수 있다. (Huber)는 분산 안정화에서 쌍곡선 아크사인 함수 사용을 기술하였다. 유세포계측법 데이터 분석과 관련하여 (Moore) 등(문헌 [("Automatic clustering of flow cytometry data with density-based merging," Adv Bioinformatics, 2009)]은 로그 전환을 사용하였다. (Bagwell)(문헌 [("Hyperlog-a flexible log-like transform for negative, zero, and positive valued data," Cytometry A, 64(1):34-42, 2005)]은 유세포계측기로부터의 결과 분석에서의 하이퍼로그 전환 사용을 기술하였다.
그에 반해, 본 발명의 실시양태에서, 실험적으로 관찰된 파라미터를 이용한 쌍곡선 아크사인 기법(일반 로그)이 분산 안정화에 사용된다.
Figure 112016078211527-pct00001
비교
본원에 기술된 특정 실시양태는, 불혼합 신호 강도의 분포를 대조군 또는 다른 시험 데이터로부터 기원하는 불혼합 신호의 분포와 비교하는 비교 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 적용된 비교 방법에 의존하여, 분포는 먼저 모든 분포를 그의 적분(integral)으로 나누어 정규화할 수 있다.
비교 단계는 세포 집단 사이의, 예컨대, 처리 이전과 처리 이후의 세포 집단 사이의 비유사성에 대한 정보를 포함하는 반응 텐서를 컴파일링하는 것을 포함한다. 비유사성은 처리된 세포 집단, 비처리 집단("음성" 대조군 또는 "비효과" 대조군)의 신호 분포와, 관찰가능한 생리학적 반응을 최대화시키도록 디자인된 교란제 혼합물로 처리된 집단("양성" 또는 "최대 효과" 대조군)의 신호 분포 사이의 거리로서 컴퓨팅된다.
결과를 표준화시키고, 실험 가변성에 의해 영향을 받지 않도록 하기 위해, 측정된 비유사성은 양성 대조군과 음성 대조군 사이의 평균 비유사성과 같은 단위로 표현될 수 있다.
바세르슈타인 메트릭, 이차 형식 거리(QFD: quadratic-form distance), 이차 카이-거리, 콜모고로프 메트릭, (대칭형) 쿨백-라이블러 발산 등을 포함하는(이를 포함하나, 이에 한정되지 않는) 다양한 비유사성 또는 거리 척도가 적용될 수 있다. 바람직한 실행에서, 본 발명의 방법 및 알고리즘은 바세르슈타인 메트릭 또는 이차 형식 거리를 사용한다.
하기의 예시적인 방법에서, 존재비 분포는 전형적으로 1차원으로 비교된다. 그러나, 일부 표지는 2개의 관련된 신호(예를 들어, 2개의 별개의 채널에서 형광을 방출하는 미토콘드리아 막 전위 표지인 JC-1)에 의해 코딩된다. 일부 경우에서, 분포 사이의 2D 비유사성 척도가 컴퓨팅된다. 마지막으로, (광 산란을 통해 수득된) 형태 관련 척도 및 (형광 신호로부터 컴퓨팅된) 존재비에 기반하여 다차원 분포를 사용함으로써 2D 또는 3D 비유사성 척도를 컴퓨팅하는 것이 바람직할 수 있다. 다차원으로 쉽게 일반화될 수 있는 것으로 가정할 때, 다양한 거리 또는 비유사성 척도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 콜모고로프 메트릭이 아닌, 바세르슈타인 메트릭 또는 QFD에 기반한 통상의 방법이 이와 관련하여 사용될 수 있다.
집단 비교를 위한 대표적인 방정식은 하기에 제공되어 있다(문헌 [Pele et al. "The Quadratic-Chi Histogram Distance Family," Computer Vision -ECCV2010, Lecture Notes in Computer Science. Springer Berlin Heidelberg, pp. 749-762; Daniilidis, K., Maragos, P., Paragios, N. (Eds.)] 참조):
Figure 112016078211527-pct00002
(여기서, x 및 y는 관심 분포이고, A는 양의 준정부호(semidefinite) 비유사성 행렬이다).
텐서를 이용한 세포계측 데이터의 분석
세포계측 다중 파라미터 데이터는 텐서로서 표현될 수 있고, 대조군과 시험 샘플 사이의 비교는 화합물 핑거프린트 텐서에 의해 기술될 수 있다. 텐서는 다차원 어레이이고, 행렬의 일반화로서 간주될 수 있다. 1차(또는 1-웨이) 텐서는 벡터이고; 2차(2-웨이) 텐서는 행렬이다. 3차(3-웨이) 이상의 텐서는 고차원 텐서로 명명된다.
집단 중의 모든 세포에 대하여 개별적으로 단일 세포 시스템에서 수행되는 생물학적 측정은 분포를 형성한다. 화합물의 존재에 노출된 세포에서 수행된 측정값의 분포와, 상기 화합물에 노출되지 않은 세포에서 수행된 측정값의 분포 사이의 거리는 단일 수치(스칼라 값)으로 표현될 수 있다. 세포를 다수의 상이한 약물 농도에 노출시킬 수 있고, 상기 노출 수준 각각에 대해 생물학적 측정을 수행할 수 있다. 상기 실험을 통하여 벡터(예컨대, 1-웨이 텐서)로 표현될 수 있는 일련의 값을 획득한다. 다중 생물학적 파라미터를 측정할 경우, 결과는 2-웨이 텐서(또는 행렬)로 배열될 수 있으며, 여기서, 모든 열은 측정된 상이한 파라미터를 포함하고, 모든 행은 화합물의 상이한 농도를 기술한다.
이러한 데이터 배열은 추가로 확장될 수 있다. 본 발명자들이 처리된 세포로부터 획득한 측정값의 분포와, 또 다른 화합물에 노출된 세포 집단으로부터 수집된 측정값의 분포 사이의 거리를 측정하고자 시도할 경우, 본 발명자들은 그 결과를 또 다른 행렬로 분류할 수 있다. 예를 들어, 한 화합물로 처리된 세포와, 양성 대조군으로서의 역할을 하며, 효과를 쉽게 관찰할 수 있도록 하는, 특징이 잘 규명된 상이한 화합물로 처리된 또 다른 세포 군 사이의 비유사성을 측정하는 것이 유익할 수 있다.
두 행렬(2-웨이 텐서)를 함께 종합하여 3-웨이 텐서를 생성한다. 이러한 3-웨이 텐서의 차원수는 I 1 x I 2 x I 3 이고, 여기서, I 1 은 농도의 수이고, I 2 는 측정된 생물학적 파라미터의 수이고, I 3 은 측정된 비유사성/거리의 수(전형적으로 2: 양성 대조군 거리 측정값, 및 음성 대조군 거리 측정값)이다. 그러므로, 생물학적 측정값을 나타내는 텐서 A의 경우, a i,j,k 로 표시되는 요소 (i,j,k)는 농도 i의 화합물에 노출된 세포 집단으로부터 수득된 파라미터 j의 측정값과 대조군 세포 집단 k 사이의 거리를 기술한다.
a :jk 로 표시되는, 텐서 A의 열 파이버(column fiber)는 일련의 시험 샘플에 대하여 수행된 파라미터 j의 측정값과 대조군 k 사이의 전체 일련의 거리를 포함한다. 10개의 화합물 농도로 시험할 경우, 열 파이버 a :jk 는 10 요소 벡터일 것이다. A ::k 로 표시되는 텐서 A의 전면 슬라이스는 k 대조군에 대하여 측정된 거리를 기술하는 행렬을 형성한다. 측면 슬라이스 A :j: 는 파라미터 j에 대한 거리의 측정값을 보여주는 행렬이다.
텐서 A는 다중 환경, 세포 배양물 또는 세포 주기 단계를 설명하기 위해 추가로 확장될 수 있다. 그러므로, 다중 반복 측정, 측정이 수행되는 다중의 세포 주기 단계 등이 화합물 핑거프린트 텐서에 저장될 수 있다. 실제로, 다차원 스크리닝 실험은 p차 텐서,
Figure 112016078211527-pct00003
로 표현될 수 있다. 예를 들어, 차원수 I 1 x I 2 x I 3 x I 4 (여기서, I 4 는 측정된 독특한 화합물의 수이다)를 이용하여 4-웨이 텐서에서의 다중 실험으로부터의 데이터를 분류할 수 있다. 상기 설정에서, 슬라이스 A :jkl 은 파라미터 j에 대하여 컴퓨팅된, 화합물 l을 함유하는 시험 샘플과 대조군 k 사이의 비유사성을 포함한다. 화합물 l을 4회 반복 측정한 경우, 생성된 A :jkl 슬라이스는 10행(농도), 및 4열(반복수)로 이루어진 행렬이다.
화합물 측정값에 대한 텐서 표현은 다수의 화합물 관련 메트릭스 및 연산자, 예컨대, 화합물 유사성/비유사성, 화합물 핑거프린트, 압축형 화합물 핑거프린트, 화합물 정규화 등을 정의하는 데 사용될 수 있다. 텐서 포맷으로 표현형 스크리닝 데이터를 배열함으로써 화합물 반응 유사성의 분석을 통한 화합물 특징에 관한 독특한 통찰을 체계적으로 나타낼 수 있다. 화합물에 관한 정보가 데이터 벡터로 간단하게 제시된 경우에는 불가능하다. 구체적으로, 화합물이 단지 스칼라 값(예컨대, 전통적으로 사용되는 IC50 값)만을 사용하여 기술되었다면, 하기에 기술되는 기법은 실행이 불가능할 것이다.
상기 분석은 본원에서 하기와 같이 언급되는 하기 방정식 및 연산 형태로 일반 용어로 언급될 수 있다.
집단 데이터의 일반적 텐서 분석
일반 방법 및 방정식 - I
제1 단계에서, 양성 대조군(C p)과 음성 대조군(C n) 사이의 거리 쌍을 모든 주변 히스토그램 Ψ에 대하여 컴퓨팅한다. 상기 거리는 추가 사용 및 크기 재조정을 위해 참조로 유지된다:
Figure 112016078211527-pct00004
(여기서, Ψ ∈ {1, ..., p})
거리 함수 D는 이차 형식 거리, 바세르슈타인 거리, 이차-χ 2 거리 또는 히스토그램을 나타내는 벡터 상에서 연산되는 임의의 다른 거리일 수 있다.
Figure 112016078211527-pct00005
상기 연산 후, 생물학적 샘플에 대한 일련의 거리는 유사한 방식으로 계산된다. 일련의 농도(S 1 , S 2 , ..., S i )(여기서, i는 시험된 화합물의 농도를 나타낸다)에서 생물학적 샘플 및 대조군 κ로 이루어진 모든 쌍에 대하여 컴퓨팅한다.
Figure 112016078211527-pct00006
생성된 값은 다차원 어레이, 또는 p차 텐서
Figure 112016078211527-pct00007
을 형성한다. 텐서의 크기 및 차원수는 대조군 수, 사용된 1차원 히스토그램의 수, 및 측정이 수행된 생물학적 조건의 수에 의존한다.
a [ κ,Ψ ]로 표시된, 텐서 A의 열 파이버는 일련의 시험된 샘플 및 대조군 κ에 대하여 수행된, 주변 히스토그램 Ψ에 의해 요약된 생물학적 파라미터의 측정값 사이의 일련의 거리를 함유하는 벡터이다.
Figure 112016078211527-pct00008
,
a [ κ,Ψ ]로 표시된, 텐서 A의 전면 슬라이스는 생물학적 파라미터 Ψ에 대한 거리를 기술하는 행렬을 형성한다(여기서, 측정값은 모든 대조군을 포함한다).
Figure 112016078211527-pct00009
측면 슬라이스 A [ Ψ ]는 다중 생물학적 파라미터에 대한 거리의 측정값을 보여주는 행렬이다(여기서, 측정은 오직 단일 대조군 κ만을 사용하여 수행되었다).
Figure 112016078211527-pct00010
따라서, 텐서 A는 하기와 같이 표현될 수 있다:
Figure 112016078211527-pct00011
생물학적 측정값은 모든
Figure 112016078211527-pct00012
를 상응하는
Figure 112016078211527-pct00013
로 나누어 거리에 관한 정규화된 텐서를 구함으로써 추가로 정규화될 수 있다:
Figure 112016078211527-pct00014
.
다양한 조건에 대하여 동일한 분석을 수행함으로써 거리에 관한 일련의 정규화된 텐서를 얻을 수 있다.
압축
일련의 측정으로부터 수득된 텐서 A는 시험된 화합물의 표현형 특성을 모두 함유하는 바, 독특한 화합물 핑거프린트를 형성한다. 이러한 텐서 A는 로우 랭크 텐서 근사 기법, 예컨대, 폴리아딕 텐서 분해 또는 다른 방법을 사용하여 "압축(compressed)"될 수 있다. 문헌 [Kolda and Bader, "Tensor decompositions and applications," SIAM Rev. 51 , 455, 2009](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다.
텐서 분해는 텐서를 성분 랭크-1 텐서들의 합으로 인수 분해한다. 정의에 의한 텐서
Figure 112016078211527-pct00015
는 p 벡터의 외적으로 표현될 수 있다면, 랭크 1이다:
Figure 112016078211527-pct00016
표준 폴리아딕(CP: canonical polyadic) 분해의 목적은 하기 기준을 충족하는,
Figure 112016078211527-pct00017
로 표시되는 텐서 A의 근사치를 찾는 것이다:
Figure 112016078211527-pct00018
텐서는 또한 다른 기법을 사용하여 분해될 수도 있다. 예를 들어, 터커(Tucker) 분해는 각 모드를 따라 행렬을 곱하여 텐서를 코어 텐서로 분해한다:
Figure 112016078211527-pct00019
다양한 텐서 분해 방법을 통하여 본 발명자들은 "압축되고" 축약된 버전의 복잡한 다차원 화합물 핑거프린트의 근사치를 구할 수 있다. 이러한 목표는 텐서 재구축 정확도에 유의적으로 기여하지 않는 분해의 일부를 소거함으로써 달성될 수 있다.
하기 예는 그 점을 예시한다. A가 화합물의 정보를 함유하는 3-웨이 텐서라고 가정한다. A ::1 및 A ::2로 표시되는, 텐서 A의 전면 슬라이스는 하기와 같다:
Figure 112016078211527-pct00020
CP 분해를 수행한 후, 본 발명자들은 하기 벡터를 얻게 된다:
Figure 112016078211527-pct00021
원래의 텐서는 CP 모델을 따라 상기 결과로부터 재구축될 수 있다:
Figure 112016078211527-pct00022
재구축 후, 근사 텐서
Figure 112016078211527-pct00023
는 하기 값을 함유하게 된다:
Figure 112016078211527-pct00024
그러나, 텐서 A는 a 1 및 a 2보다는 오직 벡터 a 1만을 사용함으로써 재구축될 수 있다. 비록 생성된 근사치의 오차가 더 높을 수도 있지만, 이는 여전히 A로 표현되는 정보 대부분을 포착한다:
Figure 112016078211527-pct00025
Figure 112016078211527-pct00026
상기에서 입증된 바와 같이, 텐서 A는 오직 a 1 벡터만을 사용하여 근사치를 구할 수 있다. 생성된 정확도가 충분하다면, 분해는 텐서 A를 대략 6배 정도 압축시킨다 - 원래의 텐서를 코딩하는 데에는 60개의 수치를 취하지만, 압축된 텐서
Figure 112016078211527-pct00027
(벡터 a (1), a (2), a (3), 및 λ의 값)를 코딩하는 데에는 단지 11개의 수치만을 취한다. 분해된 형태의 텐서는 추가로 텐서 대 텐서 비교뿐만 아니라, 예컨대, 예를 들어, 벡터 기계 학습을 지원하는 지도형 기계 학습 방법에 대한 입력값으로서 사용될 수 있다.
간단한 CP 분해 및 더욱 복잡한 터커 분해가 비록 이해하는 데 더욱 간단하고, 더 쉬운 형태로 텐서 배열된 정보 내용을 표현하는 데 가장 일반적으로 사용되기는 하지만, 상기 분해는 텐서를 분해하는 데 있어 유일한 방법은 아니라는 것에 주의하여야 한다. 데이터세트의 조직화가 허용 관례를 따르는 한, 다른 텐서 분해 방법이 또한 스크리닝 데이터와 함께 사용될 수 있다.
또한, 상기 언급된 바와 같이, 텐서 분해는 고차 텐서에 적용될 수 있다. 이러한 경우, 다중 화합물에 대하여 수행된 다중 측정값은 텐서 모드에 따라 분해될 것이며, 이를 통해 화합물 간의 중요한 차이가 밝혀지게 된다. 또한, 동일한 시험 화합물이 다회에 걸쳐 반복 사용될 수 있으며, 이로써, 합성 "평균" 화합물 핑거프린트를 효과적으로 컴퓨팅할 수 있고, 이어서, 이를 다른 핑거프린트와 비교할 수 있다.
형태 기반의 자동화된 게이팅
실시양태는 (비록 게이팅 알고리즘 사용이 임의적이기는 하지만) 모델 구동형 자동 게이팅의 용도를 제공한다. 본원에서, 소유물이 부가되거나, 또는 부가되지 않은 최신 혼합 모델링 기법이 상기 알고리즘에 부가될 수 있다. 시스템은 본 검정법의 효율을 개선시키기 위하여 반복 접근법에 의존할 수 있다.
한 실시양태에서, 게이팅 기법은 "살아있는 세포," "죽어가는 세포," 및 "죽은(사멸) 세포"(파편)를 나타내는 3개의 비대칭 정규 확률 분포를 포함한다. 데이터에 의존하며, 현(예컨대, 구식의 유효) 모델이 사용될 수 있거나, 신식 모델이 컨트롤에 기반하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 각 혼합 모델에 대해 전체 로그 가능도(LL:log-likelihood)를 계산함으로써 진행될 수 있다. 이어서, 추후 사용을 위해 LL이 더 큰 특정 모델을 유지한다.
화합물 비유사성
개별 화합물 핑거프린트의 분해 후, 모든 화합물(및 모든 반복 측정값)이 저장된 결과 텐서의 분해를 따라, 또는 직접 전체 "비압축형" 버전의 핑거프린트를 사용하여 화합물 비유사성 측정을 수행할 수 있다. 비교가 분해된 텐서를 포함할 경우, 문제는 본질적으로 벡터 비교로 축소된다.
그러나, 상기 언급된 바와 같이, 화합물 핑거프린트 텐서는 또한 직접 비교될 수도 있다. 이러한 경우, 화합물 텐서 사이의 비유사성은 화합물 텐서 A의 모드 1 파이버 a :jk 사이의 비유사성(거리)를 저장하는 벡터로서 표현된다. 파이버 a :jk 가 시험된 화합물의 농도를 증가시키면서 그에 노출된 세포 배양물의 반응에 대한 정보를 저장하기 때문에, 값은 일련의 값을 형성하며, 이는 다각형 곡선으로 보여질 수 있다. 결과적으로, 데이터를 텐서 배향으로 배열함으로써 본 발명자들은 개별 곡선(벡터) 사이의 거리를 이용할 수 있다.
상기 거리 중 하나는 개별 프레셰 거리( Frechet distance)로서, 이는 개와 조련사, 둘 모두가 비록 그들이 그의 속도를 제어할 수는 있지만, 오직 전방으로만 이동할 수 있다고 가정할 때, 개와 조련사가 그의 경로를 나타내는 두 곡선의 출발점으로부터 종점까지 이동하는 데 필요한 밧줄의 최소 길이로 정의된다. 파이버는 다각형 곡선으로 보여질 수 있는 바, 이러한 설정 환경에서 개 및 조련사, 둘 모두 곡선의 정점에서만 오직 정지할 수 있고, 그들은 각각 그의 현 정점에서는 그대로 머무르거나, 또는 보행하는 동안 다음으로 점프할 수 있다. 문헌 [Aronov et al., "Frechet Distance for Curves," Revisited, in: Azar, Y., Erlebach, T. (Eds.), Algorithms - ESA 2006, Lecture Notes in Computer Science, Springer Berlin Heidelberg, pp. 52-63, 2006](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다.
개념상 유사한 거리 척도는 동적 타임 워핑 거리로서, 이는 최적의 정렬을 찾기 위해 비선형 방식으로 2개의 다각형 곡선을 워핑함으로써 그들 사이의 거리를 측정하는 것이다. 정렬 수행 비용이 거리 값으로 정의된다. 문헌 [Berndt and Clifford, "Using dynamic time warping to find patterns in time series," AAA I94 Workshop on Knowledge Discovery in Databases, pp. 359-370, 1994](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다.
그러므로, 보통 용이하게 본 발명자들은 두 화합물 핑거프린트(텐서) A 및 B 사이의 비유사성을 하기와 같이 표현할 수 있다:
Figure 112016078211527-pct00028
여기서, D는 화합물 텐서 A 및 B 사이의 비유사성이고, d는 각 텐서의 모드 1 파이버를 비교하는 거리 함수(예컨대, 프레셰 거리 또는 동적 타임 워핑 거리)이고, w는 거리 벡터이다. 10 용량 반응 곡선, 4개의 파라미터, 및 양성 및 음성 대조군을 포함하는 실험에 의해 생성된 3-웨이 텐서의 경우, 벡터 w의 길이는 8이 될 것이다. 벡터의 각 요소는 텐서 A 및 B의 상응하는 파이버 사이의 곡선-거리로서 컴퓨팅될 것이다.
화합물 비유사성의 그래프식 표현
화합물 사이의 유사성/비유사성은 비유사성을 평가하는 데 사용되는 함수에 의존하여 다양한 방법을 사용함으로써 그래프로 표현될 수 있다. 한 예가 도 11에 도시되어 있다. 축약된 화합물 핑거프린트가 (다중 연결 벡터에 의해 형성된) 분해 이후의 벡터로 표현될 수 있다면, 벡터 사이의 선험적으로 선택된 거리를 적용할 수 있거나, 또는 메트릭 학습 방법을 사용하여 거리 함수를 훈련할 수 있다. 문헌 [Weinberger and Saul, "Distance metric learning for large margin nearest neighbor classification," J, Mach Learn. Res. 10, 207-244, 2009](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다. 최종 결과는 다차원 크기 조정(MDS: multidimensional scaling), 계층적 클러스터링, 또는 다중 학습 방법을 사용함으로써 시각화될 수 있다.
분해/압축이 사용되지 않는 경우, 화합물들 사이의 유사성을 시각화하기 위해서는 비유사성의 스칼라 척도보다는 비유사성의 벡터를 사용하는 접근법이 요구된다. 상기와 같은 한 접근법은 스트레스 우세화를 이용하는 다중 모드 MDS 알고리즘이다. 문헌 [Leeuw and Mair, "Multidimensional Scaling Using Majorization: SMACOF," R. J. Stat. Softw. 31, 1-30, 2009](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 본원에서 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다.
형성된 비유사성 행렬을 멀티웨이 다차원 크기 조정 기법에 의해 사용함으로써 화합물 간의 유사성을 정의하는 공간에 측정된 화합물 시그너처를 배치한다. 문헌 [Groenen et al. ("The majorization approach to multidimensional scaling for Minkowski distances," J. Classif . 12, 3-19, 1995](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다). 생성된 공간에서 근거리에 국재화된 화합물은 기술된 프로세스의 의미에서 "유사한" 것으로 간주될 것이며, 원거리에 국재화된 화합물은 "비유사한" 것으로 간주될 것이다.
다중 세포 서브세트를 이용한 분포 비교
대조군 대 시험 샘플의 비유사성은 측정된 모든 사례(세포)를 사용하여 컴퓨팅될 수 있거나, 또는 각각 기능상 정의된, 세포 집단의 서브세트에 대하여 별개로 계산될 수 있다. 예를 들어, 측정된 광 산란에 기초하여 형태상 상이한 2개의 세포 서브세트를 정의할 수 있다. 이러한 설정 환경에서, 2개의 세포 서브세트는 별개로 대조군과 비교될 수 있다. 다음은 비교수가 형성된 서브세트의 개수에 의존한다는 것이다. 예를 들어, 5개의 기능성 표지가 세포 생리학적 성질 중 5가지 상이한 측면을 입증하기 위해 지정되고, 선택하여 각 형태학상 상이한 세포 집단에 대하여 처리된 결과와 비처리된 결과를 비교한다면, 최대 20개(5개의 표지 x 2개의 대조군 x 2개의 세포 서브세트)의 상이한 거리가 생성될 수 있다.
원하는 생리학적 효과를 초래하는 교란제의 농도를 선험적으로 확인할 수 없기 때문에, 교란제 농도에 따른 효과의 점진적 증가를 기술하는 함수를 사용하여 교란제의 특성을 나타낼 수 있으며, 여기서, 측정은 수개 농도의 약물을 사용하여 수행된다. 그러므로, 10개 농도를 사용한다는 가정하의 상기 개요된 시나리오의 경우, 최종 데이터 세트는 200개의 값(5개의 표지 x 2개의 대조군 x 2개의 하부집단 x 10개의 농도)을 포함할 것이다. 측정된 값들은 독립적이지 않다; 그러므로, 멀티웨이 텐서로서 추가 프로세싱을 위해 처리된다. 예를 들어, 한가지 유형의 대조군(예컨대, "양성" 대조군)이 사용되는 경우, 데이터 세트는 5 x 10 x 2 차원의 3-웨이 텐서를 형성할 것이다. 도 14는 약물 반응 핑거프린트를 나타내는 멀티웨이 텐서의 예를 보여주는 것이다.
다차원 피처 공간 사용
본 발명의 한 실시양태에서, 다차원 피처 공간에서 점 클라우드의 진화는 분포들 사이의 거리를 직접 컴퓨팅함으로써 컴퓨팅될 수 있다. 다차원 피처 공간에서 진화하는 점 클라우드의 예로는 예를 들어, 변수, 예컨대, 약물 농도, 인큐베이션 시간 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 복합 점 클라우드 사이의 비유사성에 의해 정의된 공간상 클라우드 진화의 변화가 복잡한 궤도를 형성하며, 이는 고유하게 상기 변화를 유도하는 화합물의 특징을 기술한다.
대표적인 클라우드 진화는 도 15에 제시되어 있다.
세포 주기 정보를 사용하는 분포들의 비교
실시양태에서, 핑거프린트 텐서는 세포 주기 의존성 표지에 의해 정의되는 각 클러스터 또는 세포 서브세트에 대하여 생성된다. 이러한 설정 환경에서, 세포 주기 단계를 평가하는 것은 예컨대, DNA 내로 인터컬레이팅되는 형광 표지(예컨대, 훽스트 33342, DRAQ5, YO-PRO-1 아이오다이드, DAPI, 사이트랙 오렌지)의 강도를 정량화함으로써, 세포 주기와 연관된 면역표지된 단백질(예컨대, 사이클린, 인산화된 히스톤 단백질 등)의 존재를 정량화함으로써, 또는 세포 주기 단계와 연관된 유전적으로 코딩된 형광 색소의 신호를 측정함으로써 다른 측정과 함께 동시에 수행된다. 가장 간단한 경우에서, 상기 기법을 통해 세포 주기의 3개 구획을 측정할 수 있으며, 이로써, 5 x 10 x 3 결과 텐서(또는 추가 표지의 개수에 의존하여, 더욱 복잡한 텐서)가 형성될 수 있다. 이는 실시예 5A에 예시되어 있다.
비지도형 및 지도형 분류
실시양태는 후속 분석이 다중 접근법을 사용하여 수행되는 것인, 분류 방법을 제공한다. 상기 분석 기법은 결과의 바람직한 최종 표현 또는 시각화에 의존하여 실행될 수 있다. 예를 들어, 비지도형 설정 환경에서, 거리 텐서는 다중 모드 다차원 SMACOF(복합 함수를 우세화함으로써 크기 조정: Scaling by MAjorizing a COmplicated Function) 알고리즘, 또는 크기 조정에 적합한 다른 수학 기법에 의해 프로세싱될 수 있다. MDS 방법 적용 후, 약물 핑거프린트는 2D 평면 상에, 또는 연구원이 정의한 임의의 다른 n 차원 표면(예컨대, 구) 상에 배치될 것이다. 이를 통해서 데이터 세트를 쉽게 해석하고, 시각화할 수 있으며, 이는 MSD 투영 상에 "맵"을 형성한다.
지도형 프레임워크에서, 기능, 반응 유형, 화학적 구조 등에 의해 정의된 각종 군에 속하는 화합물을 나타내는 핑거프린트는 다중 부류를 이용하여 훈련 라이브러리를 생성하는 데 사용된다. 이어서, 훈련 라이브러리는 사전 비공지 핑거프린트를 공지 화합물에 의해 정의된 부류로 범주화하는 분류기(예컨대, 신경망 분류기, 서포트 벡터 머신, 또는 또 다른 유형의 머신 학습 시스템)를 훈련시키는 데 사용될 수 있다.
확장시킴으로써, 본 발명의 관련된 실시양태는 상이한 세포 주기 단계에서 MMP(및 다른 세포 생리학적 측정값, 예컨대, 사이톡스™ 레드 낮은 세포 대 높은 세포)에 대하여 차별적으로 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위해 (MMP에 영향을 주는지 선험적으로 공지되지 않은) 비공지 교란제의 효과를 평가하는 방법을 제공한다. 그러므로, 모든 시험 화합물에 대하여, 세포 상태가 평가되는 차원 중 하나로서 세포 주기 관련 상태 텐서를 포함하는 멀티웨이 측정 텐서(화합물 시그너처)를 제공한다.
하기는 본 발명의 시스템 및 알고리즘을 사용하여 상이한 교란제를 비교하는 대표적인 방법이다:
먼저, 각 형광 채널에 대하여(예를 들어, 살아있는 세포 및 죽어가는 세포에 대하여 별개로), 상기 기술된 기법을 사용하여 모든 화합물 사이의 거리 행렬을 생성한다. 예를 들어, 거리는 반응 곡선 사이의 동적 타임 워핑 거리(dtw: dynamic time warping distance)일 수 있다. 이어서, 멀티웨이 다차원 크기 조정(MDS)을 사용하여 수개의 행렬을 유클리드(Euclidean) 공간으로 컴바인(combine)한다. 이어서, 오직 MMP 데이터(칼세인, 사이톡스™)만을 포함하는 한 행렬 군 및 오직 투과성 데이터(MBBR, 미토속스™)만을 포함하는 또 다른 군에 대한 MDS를 계산할 수 있다. 공지된 맵핑 및 클러스터링 기법, 예컨대, 계통수 또는 그래프 시각화의 도움으로서(예컨대, 중간 노드를 생성하고, 데이터를 다양한 외부 시각화 소프트웨어 패키지 중 어느 하나로 익스포트하여) 화합물 사이의 다양한 생리학적 유사성을 시각화할 수 있다. 추가로, 하나 이상의 분류기를 사용하는 지도형 접근법 또한 사용될 수 있다.
세포 주기
본원에 기술된 실시양태를 통해 세포 주기(예컨대, G1, S, G2M)의 함수로서 세포 집단에서의 동조 단백질(또는 다른 마커) 발현을 측정할 수 있고, 시험 화합물의 세포 주기 의존 효과를 측정할 수 있다. 따라서, 상이한 농도 및/또는 시점에서의 각 교란제의 효과를 분석하여 상기 화합물이 다양한 세포 파라미터(예컨대, 미토콘드리아 막 전위, 핵 또는 세포질 막 투과성, ROS, 세포 사멸 또는 아폽토시스)에 미치는 효과를 조사함으로써 다중 파라미터 분석을 수행할 수 있다.
세포 주기 의존 분석의 예는 정상(비교란된) 세포에서의 사이클린 A2 발현 측정에 기반한다. 본원에서, 가능한 "상태"로는 사이클린 A2 음성, 사이클린 A2가 낮은 상태 및 사이클린 A2가 높은 상태를 포함한다. 유사하게, 세포 주기 분석에서 제2 마커인, 포스포-히스톤 3(P-H3)의 경우, 가능한 "상태"로는 "음성" 및 "양성"을 포함한다. 상기 두 세포 주기 마커는 또한 조합하여 분석될 수 있으며, 이로써, 9개의 상이한 가능한 조합("상태")을 얻을 수 있다. 모든 상태가 정상적인 생물학적 공간에 존재할 수 없기 때문에(희소 행렬), 항상 모든 가능한 "상태"를 조사해야 할 필요는 없다.
따라서, 특정 세포가 있는 세포 주기 상태에 의존하여, 개별(정규) 행렬 요소에 세포를 이주시켜 관심 약물 또는 화합물에 의해 유발되는 차별적 교란을 조사할 수 있다. 한 예로서, 유사분열로부터 다시 G1로의 정상적인 진행을 차단하여 "정규" 행렬 집단의 정량적 변화(즉, 세포의 "후기"(정상) 세포 주기 구간(예컨대, G2 및 M)에의 축적)를 유발하고/거나, G1 기의 세포를 고갈시키는 약물은 사이클린 A2 및/또는 P-H3 염색을 함께 협력하여 사용하여 분석할 수 있다. 유사하게, 딸 핵의 분리를 방해하는 약물은 S 기에서 세포를 정지시키는 약물(예컨대, 새로운 DNA 합성을 억제시키는 약물)과 비교하였을 때, 상이한 정량적 핑거프린트 패턴을 보일 것으로 예상된다. 따라서, 세포가 상이한 행렬 요소에서 출현하도록 하는 화합물은 독특한 시그너처를 생성할 뿐만 아니라, 점유된 특정 행렬 요소는 약물 작용 기전에 관한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, G1 및/또는 M에서의 사이클린 A2의 발현은 정상적인 사이클린 A2 분해를 방해하는 프로테아좀 억제제의 결과일 수 있다.
다중 세포 유형 검정 시스템
한 실시양태에서, 본 발명은 단일 검정법에서 복수 개의 세포 유형, 예컨대, (조직 배양물로부터의) 2개 이상의 세포주를 사용하여 세포 상태를 검정하는 방법을 제공한다. 상기 접근법의 한 장점은 DNA 손상/반응을 분석할 수 있다는 점이다. 추가의 장점은 (구성적 발현을 하는 한 세포주와, 적절한 효능제를 사용하여 같은 경로를 활성화시킬 수 있는 또 다른 것을 사용하여) 구성적 경로 및 유도성 신호전달 경로, 둘 모두를 같은 검정법에서 연구할 수 있다는 점이다. 2개의 (또는 그 초과의) 세포주를 동시에 사용함으로써, 한 검정법에서 다중 신호전달 경로가 적용될 수 있을 것이다.
예를 들어, (골수성 백혈병을 앓는 환자로부터 유래된) 인간 골수 세포주를 사용할 경우, LPS에 반응성인 한 세포주는 NF-κB 및 PI3 키나제 경로를 활성화시키는 반면, TNF-α에 대한 반응성인 또 다른 것은 다중 MAP 키나제 경로를 활성화시킬 것이다; 상기 두 경우 모두, 상류(NF-κB의 경우 Iκ 키나제) 및 하류(ERK의 경우 P-S6 및 PI3K의 경우 mTOR)를 평가할 수 있다. 추가로, 이러한 검정법은 상기 명시된 바와 같이, DNA 손상/반응 마커를 포함할 수 있다. 세포 혼합물 중 반응을 보이는 세포주는 DNA 함량(일부 세포주는 이배체이고; 나머지는 다른 비정상적인 DNA 함량을 가지는 이수성이다), 또는 생물학적 특징(세포 표면 마커)을 사용하여 확인할 수 있거나, 세포는 "바코딩"될 수 있다(문헌 [G. Nolan et al.]). 마지막으로, 신호전달 검정법은 같은 약물에 대한 반응으로 나타나는 세포 생리학적 성질과 신호 전달 경로 반응 사이의 상호 연관성을 입증할 수 있는 세포 주기 분석(예컨대, DNA 함량)을 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 다양한 특정 실시양태에 의해서만 예시적 설명을 거쳐 제공되며, 어느 방식으로든 완전한 것이거나, 배타적인 것은 아니다.
하기 실시예의 일반 방법
조직 배양
인간 조직 배양 세포를 냉동 스톡으로서 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 입수하였다. 세포주를 해동시키고, 먼저 1 L 회전 병 중 RPMI 1640/10%FBS/Glut(+/- 0.5-2 mM)Penn/Strep에서 정치 배양에 놓은 후, 이어서, 연속 배양에 놓았다. 시험관내 스크리닝 검정을 위해 세포를 고도로 표준화된 조건(유입 및 수거 세포 밀도, 생존도 등)하에 로그기 성장에서 유지시켰다.
세포 생리학적 성질 검정용 플레이트 1a 및 1b 제조
세포를 384 웰 플레이트에 침착시키고(40 ㎕ 조직 배양 배지 중 1 x 106개의 세포), 시험 화합물의 연속 희석액(또는 대조군인 경우, 비히클)을 표준 로보트식 기법을 이용하여 개별 웰에 증착시켰다. 화합물 증착 및 희석은 바이오멕 FX(BIOMEK FX)에 의해 수행하였다(100 μM부터 0.005 μM까지 5 또는 10단계의 희석액). 먼저 100% DMSO 중에 용해된 화합물 스톡 용액으로부터 희석액을 제조하였다. 각 웰에 증착된 최종 부피는 각 화합물 희석액 2 ㎕이다(화합물은 1% DMSO 중 최종 농도로 존재한다). 다양한 기간 동안(전형적으로 4시간 동안) 조직 배양 인큐베이터(37℃에서 5% CO2)에서 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 실온에서 원심분리한 후, 20 ㎕의 상청액 유체를 제거하였다. 플레이트를 진동시켜 세포를 재현탁시킨 후, 염료 믹스(플레이트 1a 모노브로모비만, 칼세인 AM, 미토속스™ 및 사이토속스™ 레드(SYTOSOX™ RED); 플레이트 1b 바이브란바이올렛™ 살아있는 세포 주기 염료, JC-9, 및 사이토속스™ 레드)를 20 ㎕의 총 부피로 첨가한 후, 추가의 혼합 단계를 수행하였다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터(37℃에서 5% CO2)로 복귀시켜 추가의 15분(플레이트 1a) 또는 30분(플레이트 1b) 동안 인큐베이션시킨 후, 하이퍼사이트/시안(HYPERCYT-CYAN)™을 사용하여 즉시 분석하였다.
세포 주기 또는 세포 신호전달 검정용 플레이트 2 및 3의 제조
상기 명시된 바와 같이, 96 웰 플레이트의 개별 웰에 침착된 시험 화합물의 희석액 상에 세포를 침착시켰다. 조직 배양 인큐베이터(37℃에서 5% CO2)에서 30분 내지 12시간 동안 인큐베이션시킨 후, 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상청액을 제거하고, 남은 상청액 유체 중에서 진동시켜 세포를 재현탁시키고, 50 ㎕의 고정제(PBS 중 3.2% 포름알데히드)를 첨가하였다. 15분 동안 (37℃에서) 인큐베이션시킨 후, 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상청액을 제거하고, 플레이트를 진동시켜 세포를 현탁시켰다.
150 ㎕ 냉 무수 메탄올을 첨가한 후, 4℃에서 35분 동안 인큐베이션시켜 세포를 투과시켰다. 투과된 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 4% FBS를 함유하는 냉(4℃) PBS로 3회에 걸쳐 세포를 세척하였다. 최종 세척 후, 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 상기 실험에 적절한 항체 칵테일(총 부피 20 ㎕) 중에 세포를 재현탁시켰다.
DNA 함량/세포 주기 분석을 위해, (세척 후 비결합 항체 컨쥬게이트를 제거한 후) 세포를 DAPI(1 ㎍/ml)를 함유하는 PBS/FBS 중에 재현탁시킨 후, 하이퍼사이트-시안™을 사용하여 분석하였다.
하이퍼사이트 -시안 고처리량 유세포계측법
웰 사이에는 1초 간의 지연 시간을 두고 6초 간의 짧은 시간으로 384 웰 플레이트의 각 웰에서 샘플링하여 각 플레이트에 대해 대략 45분의 총 판독 시간을 가졌다. 시안(CYAN)™ 유세포 계측기를 이용하여 데이터를 획득하고, 하이퍼사이트™ 소프트웨어를 사용함으로써 FCS 포맷을 이용하여 개별 플레이트 상의 각 웰에 대하여 파일을 컴파일링하였다. 이어서, 하기 기술하는 바와 같이, 수개의 품질 보증 파라미터(웰당 총 이벤트 수, 형태학상 정상적인 이벤트와 연관된 이벤트 수, 사멸 세포 개수)에 대해 각 플레이트에 대한 데이터를 분석하였다.
실시예 1 정상 세포
플레이트 1a 및 1b에 대하여 고유한 세포 특성(전방 광 산란 및 레이저 빔과 직각으로 산란된 광) 및 하기 표 1에 열거된 염료로부터 유도된 형광 신호에 관한 유세포계측 분석을 수행하였다.
생리학적 표적과 함께, 플레이트 1a 및 1b에서 사용된 염료 목록
염료 플레이트 생리학적 반응
모노브로모비만(MBBR) 1a 세포/핵 -SH(대개는 글루타티온 (GSH)
칼세인 AM 1a 세포질 막 투과성
미토속스 레드™ 1a 반응성 산소 종(미토콘드리아 기능 관련)
사이톡스레드™ 1a 및 1b 세포질 및 핵 막 투과성(생/사멸)
바이브란바이올렛™ 1b 생존가능한 세포를 포함한, 세포 주기 측정
JC-9 1b 미토콘드리아 막 전위(MMP)
™ 몰레큘라 프로브스(MOLECULAR PROBES)/인비트로겐(INVITROGEN)
본 결과는 도 1a에 산점도로 제시되어 있다. 플롯에서 알 수 있는 바와 같이, 광 산란만을 통해서는 "정상적인" 형태를 가지는 세포를 확인할 수 있다. 본 도면에서 세포는 어떤 약물로도 처리하지 않았고, 세포 대다수(여기서, 모든 이벤트의 95% 초과)는 "정상적인" 형태를 보였다.
본 도면에 제시된 세포를 하기와 같이 표 1의 염료 혼합물로 처리하였다:
(1) 앞서 문헌 [Cossarizza et al. ("Simultaneous analysis of reactive oxygen species and reduced glutathione content in living cells by polychromatic flow cytometry," Nat. Protoc. 4, 1790-1797, 2009)]; [Kosower et al. ("Bimane fluorescent labels: labeling of normal human red cells under physiological conditions." Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 76, 3382-3386, 1979)]; Radkowsky et al. ("Bimanes. 17, (Haloalkyl)-1,5-diazabicyclo[3.3.O]octadienediones (halo-9,10-dioxabimanes): reactivity toward the tripeptide thiol, glutathione." J . Am. Chem . Soc. 108, 4527-4531, 1986)]에 기술된 바와 같이, 세포내 글루타티온(GSH) 함량을 측정하기 위해 모노브로모비만(MBBR);
(2) 문헌 [Ivnitski-Steele et al. ("High-throughput flow cytometry to detect selective inhibitors of ABCB1, ABCC1, and ABCG2 transporters." Assay Drug Dev . Technol 6, 263-276, 2008)]에 기술되어 있는 바와 같이, 세포질 막 무결성을 측정하기 위해 칼세인 AM. 칼세인 AM은 세포질 막을 통과하는 비형광성 화합물이며, 살아있는 세포에서 상기 화합물은 세포질 막을 통과할 수 없는 강력한 그린 형광성 화합물로 전환된다; 그 결과로서, 세포가 세포질 막 무결성을 루스(loose)하면, 형광성 화합물은 수동 확산에 의해 세포에서 유리된다;
(3) 문헌 [Zielonka et al. ("Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine." Nat . Protoc. 3, 8-21, 2008)]에 기술되어 있는 바와 같이, 세포내 반응성 산소 종을 측정하기 위해 미토속스™ 레드. 미토속스™ 레드는 생존가능한 세포로 확산될 수 있고 수퍼옥시드 음이온 종, 특히, 미토콘드리아 호흡의 생성물과 반응하는 화합물이며; 조건, 예컨대, 세포 스트레스는 미토콘드리아가 호흡을 증가시킴으로써 (종종 빠르게) 반응하도록 하고/거나, 수퍼옥시드 음이온을 방출하도록 할 수 있다; 그리고,
(3) 세포 생존도(핵 막 무결성 손실)를 측정하기 위해 사이톡스레드™. 사이톡스레드™는 세포의 세포질 및 핵 막, 둘 모두의 무결성을 상실한 세포의 상기 막만을 오직 통과할 수 있는 고친화성 DNA 염색제이고; 따라서, 밝은 형광성을 띠는 세포는 죽은 세포이다.
특이적인 교란에 기초하여, 세포는 세포내 GSH를 상실(또는 일부 경우에는 획득)할 수 있고, 이로써, 형광 신호를 손실(또는 획득)할 수 있다.
정상 세포 집단의 클라우드 플롯에 대한 파라미터 텐서를 계산하고, 도 1b에 그래프로 도시 또는 기술하였다.
실시예 2: 믹소티아졸 , FCCP 및 플루옥세틴으로 처리된 세포
세포를 교란제(예컨대, 믹소티아졸, FCCP 및 플루옥세틴)로 처리하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다.
세포를 100 μM 믹소티아졸에 노출시켰을 때의 효과가 도 2에 제시되어 있다. 세포를 믹소티아졸로 처리한 결과, 대부분의 세포에서(모든 패널에서 짙은 청색 부분) 세포 형태가 유의적으로 변화하였고(좌측 상단 패널), GSH 및 칼세인 AM이 감소하였고(상단 중앙 및 우측 패널), ROS 및 사이톡스레드™는 증가하였다(하단 패널). 이들 반응은 각각 도 1a에 제시된 바와 같은 "정상" 세포에서의 각 염료 패턴과는 시각적으로 달랐다.
세포를 33 μM FCCP에 노출시켜 다른 반응 곡선을 유도하였으며, 이는 도 3에 제시되어 있다. 본 결과를 통해 "정상" 패턴, 및 100 μM 믹소티아졸에 대한 패턴과는 상이한, 추가의 또 다른 패턴이 입증되었다. FCCP 처리 후, "정상적인 형태"를 가지는 독특한 세포 집단이 존재하였고(좌측 상단 패널에서 녹색 세포); 이들 같은 세포는 모든 패널에서 녹색을 띠었고, 제시된 바와 같이, 정상적인 GSH 및 칼세인 AM 수준을 가졌고(상단 중앙 및 우측 패널), 사이톡스™ 레드 흡수에 의해 측정된 바와 같이, 무손상 핵 및 세포질 막을 가졌다(우측 하단 패널). 그러나, FCCP로 처리된 세포는 ROS 증가를 보였고(미토콘드리아 스트레스의 지표; 좌측 하단 패널), 추가로, "정상적인 형태"를 가지는 세포와 비교하였을 때, 형태 변경, GSH 감소, 칼세인 증가, ROS 증가, 및 더 높은 사이톡스레드™를 보이는 독특한 세포 집단(도 3의 모든 패널에서 밝은 청색을 띠는 세포)이 존재하였다.
100 μM 플루옥세틴에 노출된 세포에 대한 추가의 또 다른 반응 패턴이 도 4a에 제시되어 있다. 세포 중 대략 30%가 "정상적인 형태"를 상실하였고, GSH 감소, 칼세인 AM 감소, ROS 증가, 및 유의적으로 더 높은 수준의 사이톡스레드™를 보였다(도 4a의 모든 패널에서 짙은 청색 세포). 상기 반응의 독특한 "시그너처"는 사이톡스레드™ 히스토그램(우측 하단)에서 관찰되는 패턴이며-사이톡스레드™ 함량이 높은 세포 모두 모체 HL-60 세포주의 DNA 함량(세포 주기)을 판독하는 염료 흡수를 보이며, 이는 상기 처리 기간 이내에 세포가 세포 주기 전 기간 동안에 걸쳐 사멸하고, 그의 DNA를 분해하지 않는다는 것을 나타낸다(아폽토시스 세포의 일반적인 특징).
도 2, 도 3, 및 도 4a의 다차원 프로파일 세트가 도 4b에 4개 축을 따라 플롯팅되어 있으며; 이는 100 μM 믹소티아졸(좌측 상단), 33 μM FCCP(우측 상단) 또는 100 μM 플루옥세틴(하단 중앙)으로 처리된 세포에 대한 것이다.
실시예 3: 세포 주기
제2의 염료 조합을 이용하여 상기 실시예 2에 기술된 바와 동일하게 측정하였다;
(1) 살아있는 세포에서 세포 주기를 측정하기 위해 바이브란바이올렛™;
(2) 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 측정하기 위해 JC-9; 및
(3) 사이톡스레드™(본원 상기 기술된 바와 같음).
세포 주기 중 G1, S, 및 G2M 기에 있는 독특한 세포 집단을 나타내는, 비처리 세포의 세포 주기 측정은 도 5에 그래프로 도시되어 있다. 그래프 좌측의 뾰족하고, 높은 피크를 구성하는 첫 번째 집단은 G1에 있는 세포이다. 그래프 중간의 평평한 부분은 S 기에 있는 세포로부터 생긴 것이다. 그래프 우측의 피크는 G2/M에 있는 세포에 의해 생긴 것이다.
여기 제시된 세포 주기 구간은 고정된 HL-60 세포에서 측정된 것과 동일하며, 이는 하기 기술되는 바와 같이, DNA 결합 염료가 핵 DNA로 접근할 수 있도록 허용하는 세포 고정을 사용하는 "종래" 접근법을 이용하는 살아있는 세포 염색과 등가임을 입증한다.
실시예 4A: 발리노마이신의 효과
미토콘드리아 막 전위(MMP) 변화가 염료의 응집을 유발하며, 응집된 염료 분자 대 응집되지 않은 염료 분자에 의한 형광 방출이 상이한 바, 이에 2개의 독립 형광 채널(그린 및 레드 형광 신호)을 사용함으로써 JC-9를 이용하여 MMP 측정을 수행하였다. 도 6a에 제시된 바와 같이, 레드 및 그린 형광, 둘 모두 초기에는 발리노마이신 농도 증가에 대한 반응으로 증가하였고, 여기서, 발리노마이신이 ~0.05 μM일 때, 최고값의 그린 형광을 보였다. 더 높은 발리노마이신 농도에서 레드 형광은 증가하였고, 여기서, 레드/그린 형광비는 증가하였다. 상기 검정법의 독특한 측면은 MMP(JC-9) 및 세포 사멸(사이톡스레드™) 변화가 세포 주기의 단계(G1, S, 및 G2M)와 상관 관계가 있다는 점이다.
실시예 4B: 이다루비신의 효과
DNA 내로 삽입되어, DNA 복제 동안 그의 풀림을 막고, 세포 분열을 정지시키는 것인, 다우노루비신의 유사체인 1.23 μM 이다루비신에 노출된 HL60 세포를 노출시킴으로써 상기 기술된 것과 동일한 연구를 수행하였다. 도 6b에 제시된 바와 같이, JC-9 염료의 레드 형광은 비처리 대조군 세포(좌측의 처음 2개의 데이터 점이 대조군 세포를 나타낸다)에서보다 이다루비신으로 처리된 세포에서 유의적으로 더 높았다.
실시예 5: 고정 세포의 분석
연구 결과, 미토콘드리아는 정상 세포 주기 중 다른 단계 동안 유의적인 구조적 변화를 겪게 된다는 것이 확립되었다. 문헌 [Barni et al. ("Static cytofluorometr and fluorescence morphology of mitochondria and DNA in proliferating fibroblasts." Biotech. Histochem. Off. Publ Biol . Stain Comm. 71, 66-70, 1996)]; [Margineantu et al, ("Cell cycle dependent morphology changes and associated mitochondrial DNA." Mitochondrion 1, 425-435, 2002)]; [Schieke et al. ("Coordination of mitochondrial bioenergetics with G1 phase cell cycle progression." Cell Cycle 7, 1782-1787, 2008)] 및 [Sweet et al. ("Changes in mitochondrial mass, membrane potential, and cellular adenosine triphosphate content during the cell cycle of human leukemic (HL-60) cells." J. Cell. Physiol . 180, 91-96, 1999)](상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. 제한된 데이터가 G1 대 S+G2M 집단의 미토콘드리아 전위(ΔΨm) 차이를 제안한다(문헌 [Schieke et al. Cell Cycle 7, 1782-1787, 2008]); 그러나, 단일 세포 수준에서 MMP 변화와 세포 주기 단계에 상관 관계가 있음을 나타내는 보고는 공개된 바 없다. 또한, 상이한 세포 주기 단계에서 상이한 화학적 화합물, 예컨대, MMP를 변화시키는 것으로 알려져 있는 화합물의 차별적인효과를 조사한 연구는 없다. 하기에 기술되는 두 예시적인 실시양태에서는 고정 세포를 사용하여 세포 주기(실시예 5A) 및 신호 전달(실시예 5B) 분석을 수행하였다.
실시예 5A: 고정 세포를 이용하는 세포 주기 분석
세포질 및 핵 막을 통과할 수 있는 DNA 결합 염료(예컨대, 바이브란바이올렛™, 도 5에 제시)를 사용하여 살아있는 세포에서 세포 주기 단계를 측정할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 종종 문제가 된다. 일부 DNA 결합 염료는 잠재적으로 독성인 화합물을 제거하는 세포질 막 "펌프"(예컨대, 보통 암 세포 및 줄기 유사 세포 상에서 발견되는 P-당단백질 수송체)에 의해 생존가능한 세포 밖으로 수송된다. 추가 문제는 무손상 세포질 및 핵 막이 형광 유세포계측법을 위한 항체-컨쥬게이트에 의한 내부 단백질에의 접근을 차단한다는 점이다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 세포 단백질, 지질, 탄수화물 뿐만 아니라, 세포 구조의 분해를 막는 화학적 고정제의 조합을 이용하여 세포를 고정시키고, 투과시켰다. 고정시킨 후, 통상의 계면활성제를 사용하여 세포질 및 핵 막을 투과시켰고, 이 과정을 통해 프로브 분자(예컨대, 항체-컨쥬게이트)는 세포내 구획으로 접근할 수 있었다.
공지된 기법(예컨대, 포름알데히드 고정 후, -20℃에서 메탄올을 이용하여 투과)을 이용하여 (CML 세포주로부터 유래된) 인간 만성 골수성 백혈병 K-562 세포를 고정시키고, 투과시켰다. 이러한 고정 세포는 DNA 함량(세포 주기) 및 세포내 및 핵내 단백질을 동시에 측정하는 데 적합하다. 예를 들어, 문헌 [Pollice et al. ("Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins." Cytometry 13, 432-444, 1992)](상기 문헌은 부분적으로 그와 관련하여 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. 세척 후, 고정되고 투과된 세포를 하나 이상의 형광단-항체 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션시킨 후, 세척하여 비결합 항체를 제거하고, 유세포계측법에 의해 분석하였다.
도 7에 제시된 바와 같이, DNA 함량으로 나타난 바와 같이, 세포 주기 분석 결과, 도 5에서 생존가능한 세포 주기 염색으로 나타난 바와 같이, G1, S, 및 G2M 집단(좌측 상단 패널)은 유사한 패턴을 보였다.
같은 세포를 또한 (PE에 컨쥬게이션된) 사이클린 A2에 대한 항체로, 및 알렉사플루오르® 647에 컨쥬게이션된, 인산화된 형태의 히스톤 H3 단백질(P-H3)에 대한 항체로 염색하였다. 세포 주기 대 P-H3 분석(우측 상단 히스토그램) 결과, 인산화된 형태의 히스톤 H3 단백질은 오직 G2M 집단에서만 발현되는 것으로 나타났고; 세포 주기 대 사이클린 A2 단백질 발현에 대한 분석(좌측 하단 히스토그램) 결과, S를 거쳐 진행되는 동안 사이클린 A2 수준이 증가하는 더욱 복잡한 패턴, 및 G2M에서 사이클린 A2를 발현하는 두 집단이 나타났다.
교란되지 않은 세포에서의 사이클린 A2 발현의 생물학적 성질은 그 특징이 잘 규명되어 있으며, G2 동안 최고 발현 수준에 도달한 후, 사이클린 A2는 유사분열(M)로의 진입시 빠르게 분해된다. 우측 하단 패널에 제시되어 있는 바와 같이, 사이클린 A2 대 P-H3 발현 분석 결과, 후기 S를 거쳐 G2까지, M까지 진행되는 동안 상기 두 단백질의 발현은 더욱 복합 패턴을 띠는 것으로 나타났다. (DNA 함량을 사용하여) 오직 상기 세포 주기 집단에 대한 후속 분석을 "게이팅"함으로써, P-H3이 먼저 세포에서 발현되고, 여기서, 사이클린 A2 수준은 가장 높고(G2 집단), P-H3은 높은 수준으로 유지되는 반면, 사이클린 A2는 분해되고, 이어서, 세포가 유사분열(M)로부터 다시 G1로 진행됨에 따라, P-H3은 (G2로의 진입시 인산화된 특이적인 세린 잔기의 탈인산화에 의해) "손실된다"는 것이 명백해진다. 전통적인 유세포계측 분석에서, 단백질 발현에서 이러한 서열 변화는 (DNA 함량에 기초하여) 상이한 세포 집단을 주의하여 수동식으로 "게이팅"(선별)하고, 이어서, 단백질(또는 상이한 항체-컨쥬게이트에 의해 정의되는 다른 표적)의 발현을 분석함으로써 확립된다.
실시예 6: 신호 전달
신호 전달 경로는 세포 분열(증식), 세포 사멸(아폽토시스, 아노이키스), 및 세포 분화를 비롯한, 다중의 세포 운명 경로을 조절한다. 일반적으로, 신호전달은 세포질 수용체에 의해 인식되는 특이 리간드의 결합 이후에 하류 경로를 활성화시키는 상기 수용체를 통해 작용한다. 신호전달 경로의 특징은 단백질 변형(비록 신호전달이 메틸화, 아세틸화, 유비퀴틴화, SUMO일화를 비롯한, 다른 단백질 변형을 포함할 수도 있기는 하지만, 빈번하게는 세린, 또는 트레오닌, 또는 티로신 잔기의 인산화)의 캐스케이드이다.
현재 가장 널리 연구된 신호 전달 이벤트인 인산화에서, 세포 표면 수용체의 그의 동족 리간드에 의한 활성화를 통해 상기 수용체에서 키나제 활성이 발생하게 된다. 이어서, 상기 활성 키나제는 그의 하류 파트너 상의 특이적인 아미노산 잔기를 인산화시켜 보통은 키나제 활성을 발생시킨다. 이러한 캐스케이드는 일반적으로 최종 키나제가 핵(여기서, 상기 키나제는 DNA 상의 특이적인 전사 활성화 부위에 결합한다)으로 전위될 때까지 계속된다. 추가로, 다수의 신호전달 경로는 "측면에서" 작용하여 다른 신호전달 경로를 활성화시키거나, 또는 억제시킨다(예컨대, 활성화된 PI3 키나제는 하류 Akt>mTOR> 리보솜 S6 키나제> S6> 단백질 합성 경로 이외에도, MAP 키나제 경로를 활성화시킬 수 있다).
말초 혈액 단핵구에서 발견되는 톨 유사 수용체 4(TLR4) 하류의 신호 전달 경로의 예가 도 8에 제시되어 있다. 대부분의 표면 수용체-리간드 상호작용과 달리, 상기 고도로 특이한 반응에서, 동족 리간드인 지질다당류(LPS)의 TLR4에의 결합은 3가지의 모든 MAP(미토겐 활성화된 단백질) 키나제(ERK, p38 및 SAP/JNK MAP 키나제), PI3 키나제, 및 NF-κB 경로를 비롯한, 다중 신호 전달 경로를 활성화시킨다.
상기 경로 모두 말초 혈액 단핵구에서 유세포계측법을 이용하여 모니터링되었다. (세포 주기와 연관된 단백질을 모니터링하는 것에 관한) 상기와 같이, 형광단-항체 컨쥬게이트에 대한 세포내 (및 핵) 접근을 허용하기 위해 세포를 고정시키고 투과시킬 수 있다.
여기서, 세포 막 투과성(세포 사멸에 대한 마커), 핵 막 투과성(세포 사멸에 대한 마커), DNA 손상에 연루된 신호 전달 경로(포스포-히스톤 H2A, 포스포-ATM/ATR, 포스포-p53), 염증에 연루된 신호 전달 경로(예컨대, NF-κB), MAP 키나제 경로를 통한 신호 전달(ERK, SAP/JNK, p38), PI3 키나제 경로를 통한 신호 전달(Akt, GSK3B, RS6K, S6), 조기 아폽토시스 경로(예컨대, 아넥신 V), 중기 아폽토시스 경로(예컨대, 절단된 카스파제), 후기 아폽토시스 경로(예컨대, PARP/DNA 단편화) 등을 모니터링하는 특이적인 염료가 사용될 수 있다. 유세포계측법을 사용하여 4가지 신호전달 경로의 동태를 동시에 측정하는 대표적인 실험에 대한 결과는 도 9에 제시되어 있다. 여기서, 인간 전혈을 PI3 키나제 억제제 GDC0941의 존재(실험 샘플) 또는 부재(대조군 샘플)하에서 LPS로 처리하였다. 문헌[Shankey et al. ("Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations." Cytometry 67A;4-17, 2005)]에서 앞서 공개된 방법에 따라 세포를 고정시키고 투과시키며, (알렉사플루오르™488에 컨쥬게이션된) IκBα에 대한 항체, (알렉사플루오르™647에 컨쥬게이션된) P-ERK, (PE에 컨쥬게이션된) P-Akt, 및 (퍼시픽 블루에 컨쥬게이션된) P-S6과 함께, (정상 백혈구에서 세포 혼합물 중의 단핵구를 확인하기 위해) CD14-PECy7로 염색하였다.
도 9에 제시되어 있는 바와 같이, LPS로 처리한 결과, Iκ 키나제가 활성화되었고, 그로 인해 IκBα의 프로테아좀 분해가 일어났고, 그린/알렉사 플루오르® 488 형광 신호가 손실되었다. LPS 처리는 또한 (하류 이펙터의 인산화에 의해 검정된 바) ERK, Akt 및 S6을 활성화시켰다. PI3 키나제 억제제 GDC0941(우측 패널)의 존재하에서, P-Akt는 인산화되지 않고, (LPS 단독으로 처리된 세포와 비교하였을 때) ERK 및 S6 인산화의 동태는 지연되었다. PI3K 억제는 또한 IκBα의 프로테아좀 분해에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 여기서 제시된 결과는 하기 내용을 입증한다:
(1) 정상 세포 집단에서의 반응의 재현가능한 동태
(2) (가로) 경로 내에서의 상호작용(P-ERK는 단핵구에서 P-S6을 활성화시키고 - (3) 다른 비조혈 세포에서 관찰되는 바와 같이, S6은 Akt에 의해 활성화되지 않는다)
(4) 경로 연구를 위한, 잘 "맵핑된" 억제제의 사용.
실시예 7: 조직 배양 샘플
더욱 쉽게 이용가능하고, 재현가능한 세포 시스템을 제공하기 위해(및 현행 방법으로 관찰되는 문제점들을 피하기 위해), 조직 배양 세포주 기반의 실험 시스템을 사용하여 약물이 신호전달 경로에 미치는 영향을 모니터링할 수 있다.
약물, 예를 들어, 만성 골수 백혈병(CML) 요법에서 유용한, Bcr/Abl 키나제의 억제제의 효과를 조사하는 데에는 조직 배양 세포를 이용하는 유세포계측법이 통상적으로 사용되어 왔다. CML은 9번 염색체 상의 Abll 유전자를 22번 염색체 상의 BCR 유전자 중의 일부와 융합하는 유전자 전좌인 필라델피아 염색체와 연관이 있다. 생성된 융합 단백질은 P-STAT5, P-Crkl, P-mTOR, 및 P-HSF를 비롯한 수개의 하류 신호전달 경로를 구성적으로 활성화시키는 수용체 티로신 키나제를 함유한다. Abl 키나제는 이마티닙(글리벡™), 닐로티닙, 및 다사티닙을 비롯한, 현재 임상적으로 사용되는 수개의 치료제의 표적이 된다. 상기 화합물은 수용체 수준에서 티로신 키나제 활성을 억제시킴으로써 작용하고, 이는 또한 동시에 모든 하류 신호전달 경로를 억제시킨다.
CML의 대표적인 모델로서, Bcr/Abl 융합 단백질을 발현하고 하류 STAT5 표적을 구성적으로 인간화시키는 인간 K562 세포주(문헌 [Cytometry 54A; 75-88, 2003])를 하기 실험에서 사용하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, K562 세포를 30분 동안 2 μM 글리벡™(이마티닙, 또는 STI571)으로 처리한 결과, 하류 STAT5 표적의 인산화는 >95% 억제되었다. 또한, 도 10에 제시된 바와 같이, 비록 STAT5의 인산화가 30분 동안의 이마티닙 노출 후 억제되기는 하였지만, DNA 함량으로 측정된 바와 같이, 세포 주기에 있어서는 어떤 변화도 없었다.
인산화된 STAT5(P-STAT5)는 사이클린 D를 비롯한, 수개의 표적 단백질의 전사 활성인자로서 작용한다. (P-STAT5에 의해 유도된) 사이클린 D의 구성적 발현은 세포 주기에서 K562 세포를 유지시킨다. 24시간 동안의 이마티닙에의 노출이 (세포 증식의 마커로서의) S 기를 ~50%만큼 감소시키고, 추가로 24시간 동안의 이마티닙에의 노출은 S 기를 추가로 50-70%만큼 감소시킨 것(데이터 나타내지 않음)으로 나타났다.
실시예 8: 트로글리타존의 효과
세포를 트로글리타존으로 처리한 후, 각종 형광 염료(칼세인 AM, MBBR, 미토속스™ 및 사이토속스™)와 함께 인큐베이션시켰다. 각각의 비대조군 웰에 대해, (각 형광 채널에 대한) 양성 및 음성 대조군 주형까지의 이차 카이-거리 거리를 계산하고, 축적 계수로 정규화하였다. 정규화된 데이터를 텐서로 재조직화하고, 양성 및 음성 대조군 주형으로부터의 거리를 계산하였다. 동적 타임 워핑 거리를 사용하여 텐서의 파이버 열을 비교하여 공지된 기법을 사용하여 트리오글리타존 텐서의 또 다른 화합물 텐서와의 유사성을 컴퓨팅할 수 있다(문헌 [Giorgino et al. "Computing and Visualizing Dynamic Time Warping Alignments in R: The dtw Package," Journal of Statistical Software, 31(7), 1-24, 2009] 참조). 모든 다른 화합물에 대한 비유사성 또는 거리를 이러한 방식으로 계산할 수 있다.
결과는 도 12에 제시되어 있다.
실시예 9: 게이팅없이 세포 MMP 반응의 자동 유도
미토콘드리아 막 전위 측정은 대개 미토콘드리아 센서, 예컨대, JC-1 및 JC-9를 사용하여 유세포계측법으로 수행된다. 상기 화학물질 종은 미토콘드리아에서의 전위 의존적 축적을 보이는 염료로, 이는 가시광선 스펙트럼의 녹색 부분(JC-1의 경우, ~525 nm)에서 적색 부분(JC-1의 경우, ~590 nm)으로의 형광 방출 이동으로 표시된다. 그러므로, 미토콘드리아에서의 생리학적 변화는 관찰되는 두 형광 밴드 사이의 강도량의 이동으로 표시된다.
세포계측법에서, MMP의 전반적인(대중적인) 변화 검출은 전형적으로 대개 저수준 및 고수준의 MMP를 특징으로 하는 세포 하부집단을 게이팅(선별)함으로써 측정된다. 이는 관련된 세포 하부집단을 확인하기 위한 시도로 수동식 데이터 프로세싱, 또는 다양한 클러스터링 알고리즘 사용을 필요로 한다. 하부집단이 확인되면, 화합물 농도 증가와 상응하는 MMP 변화를 연관시키는 함수를 도시하는 MMP 반응 곡선을 작성할 수 있다.
상기 함수(곡선)는 전형적으로 화합물 노출에 대한 세포 집단의 반응에 관한 정보를 제공하는 프록시로서 특정 게이트(예컨대, "고 MMP" 집단을 기술하는 게이트)에 있는 세포 비율(%)을 사용하여 작성된다. 그러므로, 반응 곡선은 관심의 대상이 되는 생화학적 화합물의 특징을 규명하며, 이는 화합물을 클러스터로 추가 분류하는 데, 화학 화합물의 데이터베이스로부터 화합물의 특성을 조사하는 데, 또는 화합물 기능을 예측하는 데 사용될 수 있다.
게이팅이 전형적으로는 기술된 적용에 사용되지만, (Bernas) 등은 세포 집단을 기술하는 분포 사이의 강력한 비유사성 메트릭(거리)를 컴퓨팅함으로써 게이팅 없이도 유세포계측법 샘플 중의 세포 집단 사이의 차이를 결정하는 것이 실행가능하다는 것을 입증하였다(문헌 [Bernas et al, (2008): Quadratic form: A robust metric for quantitative comparison of flow cytometric histograms; Cytometry A 73A, 715-726. doi: 10.1002/cyto.a.20586]). (Bernas)에 의해 제안된 메트릭(이차 형식 거리)은 1차원 이상에서 연산될 수 있다. (Rajwa) 등은 유세포계측법에서 생물학적 샘플 사이의 차이를 정량화하는 맥락에서 상기 거리를 컴퓨팅하고 이를 사용하는 방법을 교시한다(문헌 [Rajwa et al. (2011): Quantification of differences between measured values and statistical validation based on the differences], 미국 특허 출원 공개 번호 US20110066385 A1). (Robinson) 등은 거리 함수를 이용함으로써 반응 곡선을 컴퓨팅하고 상기 곡선의 동반 파라미터, 예컨대, IC50, 점근선 등을 유도하는 방법을 교시한다 (문헌 [Robinson ei al. (2013): Gate-free flow cytometry data analysis], 미국 특허 출원 공개 번호 US20130226469 A1). 상기 개시내용에서 (Robinson)은 일련의 샘플과 대조군 사이의 거리를 컴퓨팅한다. 사용된 대조군은 양성 대조군, 또는 음성 대조군일 수 있다. 개시내용은 형광의 개별 채널에 대한 비유사성을 컴퓨팅하는 것을 입증하였다.
상기 참고 문헌에 의해 개시된 방법을 적용함으로써 4개의 보완적 반응 곡선이 생성되게 되는데: 하나는 제1 측정 형광 밴드에 대한 일련의 샘플과 양성 대조군 사이의 비유사성을 코딩하는 것이고, 두 번째 것은 같은 밴드에서의 샘플과 음성 대조군 사이의 비유사성을 코딩하는 것이고, 추가의 두 곡선은 제2 측정 밴드에 대하여 유사하게 구성된 것이다. 비록 4개의 반응 곡선은 종합되었을 때에 확인된 클러스터 중의 세포 비율(%)을 사용하는 전통적 접근법을 사용하여 유도된 정보와 유사한 정보를 함유한다는 것이 자명하기는 하지만, 생물학적 화합물 분석 및 약물 화학에서 잘 확립된 유용성을 가지는 단일 반응 곡선을 대신하여 유도 곡선이 어떻게 사용될 수 있는지에 대해서는 명확하지 않다.
그러므로, 심지어 상기 인용된 개시내용이 많은 다른 유세포계측법에 대하여 실용적인 해결 방안을 제공하기도 하지만, MMP 경우에는 적용될 수 없다.
일반적으로, 선행 기술은 생물학적 반응에 대한 정보가 1차원 초과로 코딩되고, 양성 대조군, 및 음성 대조군, 둘 모두가 요구되는 샘플에 대한 단일 반응 곡선을 컴퓨팅하는 방법을 포함하지 않는다고 볼 수 있다. (Bernaset) 등은 제안된 거리 함수가 다중 파라미터(다차원) 세포계측법으로 크기 조정될 수 있다는 사실을 언급하였고, 저자는 다차원 경우에 대하여 실제로 적용가능한 실행 또는 입증을 개시하지는 않았다. (Robinson) 등은 일련의 샘플과 대조군 사이의 다중 비교가 일련으로 배열될 수 있고, 이로써, 수동식 데이터 게이팅으로부터 추출된 반응 곡선과 유사한 반응 곡선을 얻을 수 있다는 것을 교시한다. 그러나, (Robinson) 등은 예컨대, JC-, JC-9, JC-10 및 다른 비율 척도형 염료 측정과 같이 2차원 경우에서의 개시된 방법의 사용에 대해서는 언급한 바 없다. 상기 개시내용은 2개 이상의 유형의 대조군이 사용되고, 생물학적 샘플이 2개 이상의 측정값에 의해 특징규명되는 경우에, MMP 측정값 및 다른 측정값에 대한 거리 함수를 사용하여 반응 곡선을 도출해 내는 것을 교시한다.
하기 기술되는 방법은 세포 집단에 대해 작용하였을 때, 관심의 대상이 되는 생물학적 화합물이 보이는 반응의 특징을 확인하는 데 필요한 모든 정보를 함유하는 단일 반응 곡선을 도출해 낼 수 있다.
본 방법은 유세포계측 측정값에 의해 형성된 주변 히스토그램(1차원 히스토그램)에 거리 함수를 적용시키는 것을 포함한다.
(A) 인 실리코 모의
하기의 인 실리코 예에서 예시된, 본원에 개시된 실시양태에 따른 유세포계측 측정값에 의해 형성된 주변 히스토그램(1차원 히스토그램)에 거리 함수를 적용시키는 것을 사용하는 방법.
도 19는 미토콘드리아 막 전위에 영향을 미치는 작용제의 농도를 증가시키면서 그에 노출된, 유세포계측법을 위한 10개의 샘플에 관한 컴퓨터 모의를 도시한 것이다. 도 18은 음성 및 양성 대조군을 보여주는 것이다. 음성 대조군에 의해 정의된 세포 클러스터에 속하는 세포 개수 및 비율(%)의 변화가 도 20에 도시되어 있다. 패널 A는 세포 개수의 함수로서의 반응 곡선을 보여주는 것이다. B는 세포 비율(%)의 함수로서의 반응 곡선을 보여주는 것이다.
먼저, 양성 대조군(Cp)과 음성 대조군(Cn) 사이의 거리 쌍을 컴퓨팅한다. 두 거리는 FL1 주변 히스토그램(CI), 및 FL2 주변 히스토그램(CII)에 대해 정의된다. 상기 거리는 추가 사용 및 크기 재조정을 위한 참조가 된다:
Figure 112016078211527-pct00029
여기서, i는 일련의 희석액 중 샘플을 나타내는 수치이고, 로마 숫자(Ⅰ, Ⅱ)는 채널 수를 나타낸다. 방정식은 2차원 경우(2개의 주변 히스토그램)를 보여주는 것이다; 따라서, 오직 두 로마 숫자만이 사용된다. 거리 함수 D는 이차 형식 거리, 바세르슈타인 거리, 이차-χ 2 거리 또는 히스토그램을 나타내는 벡터 상에서 연산되는 임의의 다른 거리일 수 있다.
상기 연산 후, 생물학적 샘플에 대한 일련의 거리는 유사한 방식으로 계산된다. 양성 대조군 및 일련의(S 1 , S 2 , ..., S i ) 생물학적 샘플 뿐만 아니라, 음성 대조군 샘플의 모든 쌍에 대하여 거리가 컴퓨팅된다(도 21 참조):
Figure 112016078211527-pct00030
생성된 값은 어레이를 형성한다. 어레이의 크기 및 차원수는 추가로 설명되는 바와 같이, 대조군 개수, 및 사용된 1차원 히스토그램의 개수에 의존한다. MMP 경우에, 2개의 대조군이 사용되고, 2개의 형광 채널이 측정된다.
Figure 112016078211527-pct00031
측정값의 어레이(상기 제시된 2개의 행렬)는 또한 3-웨이 텐서로서 보여질 수 있다. 상기 3-웨이 텐서의 차원수는 I1 x I2 x I3이고, 여기서, I1은 시험된 농도의 수(전형적으로 10)이고, I2는 측정된 반응의 수(JC-유사 표지인 경우, 2)이고, I3은 측정된 비유사성/거리의 수(전형적으로 2: 양성 대조군 거리 측정값, 및 음성 대조군 거리 측정값)이다. 그러므로, 생물학적 측정값을 나타내는 텐서 A의 경우, a i,j,k 로 표시되는 요소 (i,j,k)는 농도 i의 화합물에 노출된 세포 집단으로부터 수득된 파라미터 j의 측정값과 대조군 세포 집단 k 사이의 거리를 기술한다.
제3 단계에서, 텐서 A에 데이터를 배열한 후, 텐서 분해를 수행한다. 텐서 분해의 목적은 고차원 텐서의 모든 또는 대부분의 정보를 함유하는, 로우-랭크 텐서를 형성하는 것이다. 입증된 실시예에서, 사용된 분해는 폴리아딕 텐서 분해 (CP)이다. 텐서 A는 2개로 분해되어, 2개의 텐서로 분해된다.
CP 분해의 목적은 하기 기준을 충족하는,
Figure 112016078211527-pct00032
로 표시되는 텐서 A의 근사치를 찾는 것이다:
Figure 112016078211527-pct00033
여기서, ㅇ는 외적을 나타낸다.
제1 텐서
Figure 112016078211527-pct00034
(본원에서 간략화하기 위해 A1로 표시)를 구축하는 제1 벡터 a1 (1)(본원에서 a1로 표시)은 남은 농도의 화합물에 대한 일련의 생물학적 샘플이 보이는 반응의 전반적인 변화를 기술한다(도 22A). a1 벡터는 예상 반응 모델(예컨대, 로그 로지스틱, 곰퍼츠, 와이불, 세데르그린-리츠-스트라이비그(Cedergreen-Ritz-Streibig), 브레인-쿠센스(Brain-Cousens) 등)을 피팅함으로써 추가로 특징화될 수 있다(문헌 [Cedergreen et al., 2005]; [Meddings et al., 1989]). 상기 피텅의 예는 도 22B에 제시되어 있다.
도 19에 제시된 모든 인 실리코 모의 샘플에서, 세포의 총 개수는 5,000개이다. 도 19A 내지 도 19J의 도면에 제시된 "양성 대조군" 유사 클러스터 중의 세포 개수는 각각 4,909개, 4,753개, 4,409개, 3,650개, 2,478개, 1,370개, 581개, 234개, 87개, 및 29개이다. 상기 언급한 바와 같이, 변화에 대한 정보는 또한 클러스터 중 세포의 비율(%)로서, 또는 클러스터 중 세포 비율(%)과 음성 대조군 중의 클러스터에 속하는 세포의 비율(%)의 차이로서 시각화될 수 있다. 입증된 실시예에서, (도 19의) A 내지 J의 샘플에 대한 상기 비율은 각각 98.18, 95.06, 88.18, 73, 49.56, 27.4, 11.62, 4.68, 1.74, 및 0.58이다. 모든 경우에서, S자형 형상은 플롯팅된 함수를 특징화한다.
폴리아딕 텐서 분해에 의해 컴퓨팅된 반응 곡선(벡터 a1에 의해 기술된 곡선)은 도 22A에 입증되어 있다. 곡선은 S자형 특징을 유지하며, 이는 (샘플 수에 의해 코딩되는) 농도와 상대적인 반응 수준 사이의 기능적 의존도에 대하여 동일한 정보를 제공한다. 대조군들 사이의 거리를 사용하여 곡선은 크기가 재조정될 수 있다. 크기 재조정 후, 비유사성 1은 음성 대조군과 양성 대조군 사이의 비유사성과 동일하다. 전통적 방법을 사용하여 유도된 반응 곡선과, 기술된 방법을 사용하여 유도된 반응 곡선 사이에 일치를 보이는 플롯은 도 23에 제공되어 있다.
(B) 발리노마이신 및 2개의 다른 작용제에 대한 세포 반응 분석
실제 유세포계측 데이터에 대하여 상기 기술된 방법을 수행하였다. 결과는 도 24 및 25에 제시되어 있다. 본원에서 앞서 기술한 방법을 사용하여 데이터를 수득하였다.
도 24는 발리노마이신에 노출된 세포 집단의 변화를 보여주는 일련의 유세포계측 플롯을 나타낸 것이다. 도 25A는 유세포계측 데이터로부터 유도된 반응 곡선을 제공한다. 도 24에서의 발리노마이신 이외에도, 추가적으로 이다루비신 및 아세트아미노펜에 노출된 샘플을 사용하였다. 도 25A에서 비유사성의 단위는 양성 대조군과 음성 대조군 사이의 차이며, 여기서, 양성 대조군은 25 μM 농도의 FCCP로 처리된 샘플이다.
컴퓨팅된 반응 데이터는 또한 정의된 S자형 곡선 모델을 피팅하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제공된 예로 피팅된 로그 로지스틱 4 파라미터 모델은 도 25B에서 농도와 샘플 반응 사이의 근사 기능적 의존도를 나타낸다.
본원에서 인용된 참고 문헌에 비춘 상기 기술 내용에 관한 신중한 고려로부터, 당업자는 본원에 기술된 본 발명 및 실시양태의 특징을 확인할 수 있고, 이로써 그의 정신 및 범주로부터 벗어남이 없이 그에 관한 매우 다양한 변형 및 수정에 착수할 수 있을 것이다.
상기 인용된 모든 공개 문헌 및 특허는 그 전문이, 특히, 그의 상기 논의에 적절한 부분에 관해 본원에서 참조로 포함된다.

Claims (39)

  1. 세포에 대한 작용제의 효과를 특징규명하는 방법으로서,
    a) n개의 상이한 농도의 작용제와 접촉된 각각의 세포 집단의 샘플의 개별 세포에서 p개의 표현형 파라미터,
    Figure 112021145994504-pct00083
    각각을 측정하는 단계로서, 여기서
    Figure 112021145994504-pct00084
    이고, p는 적어도 2이고,
    Figure 112021145994504-pct00085
    는 각 특정 표현형 파라미터의 측정치를 나타내는 것인 단계;
    b) 각 표현형 파라미터
    Figure 112021145994504-pct00086
    에 대하여 각 농도 조건 i에 대한 측정 값의 분포
    Figure 112021145994504-pct00087
    를 수득하는 단계;
    c) 작용제에 노출되지 않은 m개의 상이한 대조군 조건에 상응하는 적어도 하나의 대조군 샘플, κ의 개별 세포에서 p개의 표현형 파라미터,
    Figure 112021145994504-pct00088
    각각을 측정하는 단계로서, 여기서 m이 적어도 1이고, p는 적어도 2이고,
    Figure 112021145994504-pct00089
    는 각 특정 표현형 파라미터의 측정치를 나타내는 것인 단계;
    d) 대조군 샘플에 대한 각 표현형 파라미터
    Figure 112021145994504-pct00090
    에 대하여 각 대조군 조건 κ에 대한 측정 값의 분포
    Figure 112021145994504-pct00091
    를 수득하는 단계;
    e) 각 표현형 파라미터
    Figure 112021145994504-pct00092
    에 대하여, 각 대조군 조건의 분포
    Figure 112021145994504-pct00093
    와 각 농도 조건의 분포
    Figure 112021145994504-pct00094
    사이의 쌍별 거리 d를 계산함으로써 비유사성을 계산하는 단계로서, 여기서
    Figure 112021145994504-pct00095

    D는 거리 함수인 단계; 및
    f) 계산된 비유사성을 조합하여 다중 파라미터 반응 텐서를 형성하는 단계로서, 상기 다중 파라미터 반응 텐서는
    Figure 112021145994504-pct00096

    로 표시되는 다중 파라미터 반응 텐서 A이고,
    각
    Figure 112021145994504-pct00097
    요소는 하나의 표현형 파라미터와 하나의 대조군에 대해 계산된 모든 쌍별 거리를 포함하는 것인 단계:
    Figure 112021145994504-pct00098

    를 포함하고,
    상기 단계 a) 내지 d)는 세포계측용 장치에서 수행되며, 상기 단계 e) 및 f)는 컴퓨터 시스템에 의해 수행되고,
    다중 파라미터 반응 텐서 A는 동일한 방식으로 생성된 다른 핑거프린트와 직접 비교될 수 있는, 세포에 대한 작용제의 효과에 특징적인 핑거프린트인, 세포에 대한 작용제의 효과를 특징규명하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 핑거프린트를 생성하고 저장하는데 사용하기 위한 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 핑거프린트를 비교하는데 사용하기 위한 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 비교는 작용제의 생체내 효과를 예측하기 위해 사용되는 것인 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표현형 파라미터는 세포 생존도, 세포 주기 단계, 미토콘드리아 막 무결성, 미토콘드리아 독성, 글루타티온 농도, 반응성 산소 종, 환원 종, 세포질막 투과성, DNA 손상, 스트레스 반응 신호전달 경로 구성 성분, 염증성 반응 경로 구성 성분, 아폽토시스 경로 구성 성분 및 지질 퍼옥시다제 중 임의의 2개 이상을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표현형 파라미터는 NF-κB, SAPK, PI3K, AKT, Bcl-1 패밀리 단백질, GSk3B 및 리보솜 S6 키나제 중 임의의 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표현형 파라미터 중 하나가 세포 주기인 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각 세포 집단이 복수 개의 형광 염료로 기능적으로 표지되고, 표현형 파라미터는, 상기 표지된 세포 집단에 대해 세포계측 분석을 실시했을 때 생성되는 스펙트럼 방출 신호(들)에 대해 검출되고 정량화되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표현형 파라미터 중 하나가 세포 주기이고, HOECHST 33342, DRAQ5, YOPRO-1 IODIDE, DAPI, CYTRAK ORANGE, 사이클린 A, 사이클린 B, 사이클린 E, 또는 인산화된 히스톤 단백질 중 하나 이상에 대해 정량화되는 것인 방법.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 다중 파라미터 반응 텐서 A는 하기 (a) 및 (b) 중 하나로 분해되는 것인 방법:
    (a) 랭크-1 텐서 A (i)의 세트, 여기서
    Figure 112021145994504-pct00080
    , 및
    (b) 각 모드를 따라 행렬 M (j)을 곱한 코어 텐서 G:
    Figure 112021145994504-pct00081
  13. 제1항에 있어서, 다중 파라미터 반응 텐서 A(제1 핑거프린트)와 다중 파라미터 반응 텐서 B(제2 핑거프린트) 사이의 비유사성은 하기 식에 따라 계산되는 것인 방법:
    Figure 112021145994504-pct00082

    여기서, D는 텐서 A와 B 사이의 비유사성이고, d는 각 텐서의 모드 1 파이버를 비교하는 거리 함수이며, w는 제1 핑거프린트와 제2 핑거프린트 사이의 비유사성을 나타내는 거리 벡터이다.
  14. 제1항의 방법에 따라 작용제의 효과를 특징규명하는 단계;
    저손실 압축 방법에 의해 다중 파라미터 반응 텐서 A를 컴퓨터 시스템에 의해 압축시켜 그의 복잡성을 감소시키는 단계;
    압축된 텐서와 생체내 효과가 공지된 화합물 뱅크에 대하여 유사하게 계산된 텐서 사이의 차이를 컴퓨터 시스템에 의해 계산하는 단계; 및
    차이 값으로부터 작용제의 생체내 효과를 예측하는 단계
    를 포함하는, 작용제의 생체내 효과를 예측하는 방법.
  15. 복수 개의 작용제 각각에 대하여, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 단계 a) 내지 f)에 의해 다중 파라미터 반응 텐서 A를 생성하는 단계로서, 각 다중 파라미터 반응 텐서 A는 세포에 대한 작용제의 효과에 특징적인 핑거프린트인 단계, 및
    핑거프린트를 서로 비교하고 동일한 방식으로 생성된 다른 작용제에 대한 핑거프린트와 비교할 수 있도록 핑거프린트를 컴퓨터 판독가능한 매체에 저장하는 단계
    를 포함하며, 이에 의해 세포에 대한 작용제의 효과에 특징적인 핑거프린트의 데이터베이스를 형성하는 것인, 세포에 대한 작용제의 효과에 특징적인 핑거프린트의 뱅크를 생성하는 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
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