KR20020026461A - 제2형 ｈｌａ 분자에 의해 제시되는 ｍａｇｅ-ａ1 펩티드 - Google Patents

제2형 ｈｌａ 분자에 의해 제시되는 ｍａｇｅ-ａ1 펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20020026461A
KR20020026461A KR1020017016231A KR20017016231A KR20020026461A KR 20020026461 A KR20020026461 A KR 20020026461A KR 1020017016231 A KR1020017016231 A KR 1020017016231A KR 20017016231 A KR20017016231 A KR 20017016231A KR 20020026461 A KR20020026461 A KR 20020026461A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
type
mage
hla
seq
binding peptide
Prior art date
Application number
KR1020017016231A
Other languages
English (en)
Inventor
쟈크 반스닉
베르나르 레테
파스칼 쇼
티에리 분-팔뢰르
피에르 반데어브루겐
Original Assignee
에드워드 에이. 맥더모트, 주니어
루드비히 인스티튜트 포우 캔써 리써치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에드워드 에이. 맥더모트, 주니어, 루드비히 인스티튜트 포우 캔써 리써치 filed Critical 에드워드 에이. 맥더모트, 주니어
Publication of KR20020026461A publication Critical patent/KR20020026461A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 MAGE-A1 종양 관련 유전자에 의해 코딩되는 제2형 HLA 결합 펩티드, 뿐만 아니라 이러한 펩티드를 코딩하는 핵산 및 그에 관련된 항체에 관한 것이다. 이들 펩티드는 CD4+T 림프구의 활성 및 증식을 자극한다. 또한, MAGE-A1 유전자의 발현을 특징으로 하는 병의 진단 및 치료를 위한 방법 및 물질이 제공된다.

Description

제2형 ＨＬＡ 분자에 의해 제시되는 ＭＡＧＥ-Ａ1 펩티드{MAGE-A1 PEPTIDES PRESENTED BY HLA CLASS II MOLECULES}
포유동물 면역 체계가 외래 또는 이질 물질을 인식하고 이것에 반응하는 과정은 복잡하다. 면역 체계의 가장 중요한 측면은 T 세포 반응이고, 이는 CD4 또는 CD8 세포 표면 단백질에 대해 양성인 성숙한 T 림프구를 부분적으로 포함한다. T 세포는, 다른 세포 위에 있는, 펩티드와 인간 백혈구 항원 ("HLA") 또는 주요 조직적합 복합체 ("MHC")라 불리는 분자의 세포 표면 복합체를 통하여 다른 세포들을 인식하고 상호작용할 수 있다. 펩티드는 HLA/MHC 분자를 제시하는 세포에 의해 처리되는 더욱 큰 분자로부터 유래된다. 참조 [Male 등,Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company, 1987), 특히 6-10 장]. T 세포와 HLA/펩티드 복합체 간의 상호작용은 제한되며, HLA 분자 및 펩티드의 특정 복합체에 대해 특정한 T 세포가 요구된다. 특정한 T 세포가 존재하지 않는다면, 파트너 복합체가 존재한다 하더라도 T 세포 반응은 존재하지 않는다. 유사하게, 특정 복합체가 부재하고 T 세포가 존재한다 하더라도, 반응이 존재하지 않는다. 상기 기재된 메카니즘은 외래 물질에 대한 면역 체계의 반응, 자가면역 질환의 병리, 및 세포 이상에 대한 반응에 관련되어 있다.
외래 항원에 대한 T 세포 반응은 세포용해 T 림프구와 헬퍼 T 림프구를 모두 포함한다. CD8+세포독성 또는 세포용해 T 세포 (CTL)는 활성화되면, 제1형 HLA 분자에 의해 제시되는 적절한 항원을 제시하는 세포를 용해시킨다. CD4+T 헬퍼 세포는, 제2형 HLA 분자에 의해 표면에 적절한 항원을 제시하는 항원 제시 B 세포 및 대식세포를 자극하기 위해 사이토카인을 분비하는 T 세포이다.
T 세포가 외래 물질을 인식하는 메카니즘은 암에도 관련된 것으로 시사되어 왔다. 자가 흑색종에 대항하는 다수의 세포용해 T 림프구(CTL) 클론이 설명된 바 있다. 일부 경우에, 이러한 클론에 의해 인식되는 항원들의 특성이 보고되어 있다. 문헌 [De Plaen 등, Immunogenetics 40:360-369 (1994)]에는, 종양 특이적 항원을 코딩하는 유전자 계통인 "MAGE" 계통이 기재되어 있다 (PCT 출원번호 PCT/US92/04354, 1992년 11월 26일 공개 참조). 이들 유전자의 발현 생성물은 펩티드로 처리되고, 이것은 다시 세포 표면상에 제시된다. 이는 특정 CTL에 의한 종양 세포의 용해를 일으킬 수 있다. 이들 유전자는 "종양 거절 항원 전구체," 또는 "TRAP" 분자를 코딩한다고 하며, 이로부터 유래된 펩티드는 "종양 거절 항원" 또는"TRA"라고 일컬어진다. 이러한 유전자 계통에 대한 추가의 정보를 위해서는 문헌 [Traversari 등, Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen 등, Science 254:1643 (1991)]을 참조한다. 또한 미국 특허 5,342,774호 참조.
미국 특허 5,405,940호에는, MAGE 노나펩티드가 HLA-A1 분자에 의해 제시되는 것으로 설명되어 있다. 특정한 HLA 분자에 대해 특정한 펩티드가 특이성을 가진다는 공지사실을 고려하면, 특정한 펩티드가 하나의 HLA 분자에는 결합하지만 다른 것들에는 결합하지 않을 것으로 예상하게 된다. 이것은, 각 개체들이 상이한 HLA 표현형을 갖고 있기 때문에 중요하다. 그 결과, 특정한 펩티드가 특정한 HLA 분자에 대한 파트너로서 동정되는 것은 진단 및 치료 관련 문제이긴 하지만, 이들은 단지 그 특정한 HLA 표현형을 가진 개체에 대해서만 의의가 있다. 세포 이상이 하나의 특별한 HLA 표현형에만 한정되는 것이 아니므로, 이 분야에 대한 추가의 연구가 요구되며, 표적 치료법은 문제가 되는 비정상 세포의 표현형에 관한 어느 정도의 지식을 필요로 한다.
미국 특허 5,591,430호에는, HLA-A2 분자에 의해 제시되는 추가의 단리된 MAGE-A3 펩티드가 설명되어 있다. 따라서, 주어진 TRAP는 다수의 TRA를 생산할 수 있다.
상기 참고문헌들은 제1형 HLA 분자에 의해 제시되는 종양 거절 항원의 단리 및/또는 특성 확인을 기재하고 있다. 이들 TRA는, TRA를 코딩하는 종양 관련 유전자(예, MAGE 유전자)를 발현하는 종양 세포를 인식하는 CD8+세포독성 T 림프구(CTL)의 활성화 및 증식을 유발할 수 있다.
동물 모델에서, CD4+T 림프구들은 협동 및 이펙터 기능을 가질 뿐만 아니라 면역 기억을 유지하는데 중요하다는 점에서, 항종양 면역에서 CD4+T 림프구 (헬퍼 T 세포)의 중요성이 증명되었다 [Topalian, Curr. Opin. Immunol. 6:741-745, 1994]. 또한, 몇몇 연구들은, 불량한 종양-특이적 면역성이 T-헬퍼 세포의 부적절한 활성화에 기인한다는 논점을 뒷받침하고 있다.
최근들어, MAGE-A3 및 티로시나제 유전자가 제2형 HLA 분자에 의해 제시되어 CD4+T 림프구를 자극하는 펩티드를 코딩한다는 것이 증명되었다 [PCT/US98/18601; Topalian 등, 1994; Yee 등, J.Immunol. 157:4079-4086, 1996; Topalian 등, J.Exp.Med. 183:1965-1971, 1996].
많은 암 관련 항원들이 그렇듯이, MAGE-A3 및 티로시나제는 종양 중에서도 제한된 비율에서, 그리고 특정한 유형에서 발현된다. 또한, MAGE-A3 및 티로시나제 제2형 MHC 결합 펩티드는 특정한 HLA 분자를 발현하는 세포에 의해서만 인식되는 HLA-제한된 펩티드이다.
따라서, 환자의 종양이 MAGE-A3 또는 티로시나제를 발현하지 않거나, 또는 환자가 MAGE-A3 또는 티로시나제 펩티드를 제시하기 위한 적절한 HLA 분자를 발현하지 않을 수 있기 때문에, 상기 기재된 MAGE-A3 및 티로시나제 펩티드를 통한 헬퍼 T 세포 자극을 포함하는 어떠한 치료법으로부터도 혜택을 받을 수 없는 많은 환자들이 존재한다. 따라서, 제2형 MHC 분자에 의해 제시되고 CD4+림프구에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 추가의 종양 관련 항원을 동정하는 것이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명자들은 MAGE-A1 유전자가 제2형 HLA 결합 펩티드인 추가의 종양 거절 항원을 코딩한다는 것을 알아내었다. 이러한 펩티드들은, 제2형 HLA 분자를 갖는 항원 제시 세포에 의해 제시될 때, CD4+T림프구의 활성화 및 증식을 효과적으로 유도한다.
본 발명은, 제2형 HLA 분자에 결합하는 단리된 MAGE-A1 펩티드, 및 이러한 펩티드의 기능적 변이체로서 MAGE-A1 펩티드 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 첨가, 치환 또는 결실을 포함하는 기능적 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터, 이러한 핵산 분자가 트랜스펙션된 숙주 세포, 및 이러한 펩티드에 대한 항체 및 펩티드와 제2형 HLA 항원 제시 분자의 복합체를 제공한다. 펩티드 및 제2형 HLA 항원 제시 분자의 복합체를 인식하는 T 림프구가 또한 제공된다. 상기 분자들을 함유하는 키트 및 백신 조성물이 또한 제공된다. 이들은 MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 병의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다. MAGE 계통 폴리펩티드의 구성원들과 MAGE 관련 유전자를 포함하는 핵산들이 상당한 서열 동일성 및 기능적 상동성 (예를 들어, 종양 항원 및 전구체로서)을 공유하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명은 또한 MAGE-A1 이외의 MAGE 및 MAGE-A 계통의 구성원으로부터 유래된 구조적으로 연관된 HLA 결합 펩티드를 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 MAGE-A1 펩티드와 유사한 아미노산 서열이 MAGE-A4 단백질에서도 발견된다. 따라서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, 이러한 펩티드를 함유하는 조성물, 및 이러한 펩티드를 동정하고 사용하는 방법에 관한 개시내용은, MAGE 종양 관련 항원 계통의 다른 구성원에도 또한 적용되는 것으로 이해된다.
본 발명의 한가지 측면에 따르면, 제2형 HLA 분자에 결합하는 서열 번호 2의 아미노산 서열의 단편 또는 하나 이상의 아미노산 첨가, 치환 또는 결실을 포함하는 그의 기능적 변이체를 포함하는 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 전체 MAGE-A1 단백질을 포함하지 않는다. 한가지 구현양태에서 단리된 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현양태에서, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 단리된 펩티드는 상기 아미노산 서열의 하나로 구성된다. 일부 구현양태에서, 단리된 펩티드는 엔도솜 표적 시그날, 바람직하게는 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함한다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드는 비-가수분해성이다. 바람직한 비-가수분해성 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드, -psi[CH2NH]-환원된 아미드 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[COCH2]-케토메틸렌 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[CH(CN)NH]-(시아노메틸렌)아미노 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[CH2CH(OH)]-히드록시에틸렌 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[CH2O]-펩티드 결합을 포함하는 펩티드, 및 -psi[CH2S]-티오메틸렌 펩티드 결합을 포함하는 펩티드로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 단리된 MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 및 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현양태에서, MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 및 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 폴리토프 폴리펩티드로서 조합된다. 다른 구현양태에서, 조성물 중의 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 조성물 중의 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 상기 조성물의 일부 구현양태에서, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 엔도솜 표적 시그날을 포함한다. 바람직하게는, 엔도솜 표적 시그날은 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 제2형 HLA 결합 펩티드의 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에 있어서, 핵산 분자는 전체 MAGE-A1 단백질을 코딩하지 않는다. 핵산 분자는 제2형 HLA 결합 펩티드 및하나 이상의 추가의 아미노산을 코딩할 수 있고; 바람직하게는 이러한 아미노산은 그 제2형 HLA 결합 펩티드에 이어지는 부분의 MAGE-A1 아미노산이다. 따라서, 바람직하게는 제2형 HLA 결합 펩티드의 말단으로부터 MAGE-A1 단백질의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단까지에 있는, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 또는 그 이상의 아미노산에서부터 해당 펩티드보다 하나 더 적은 아미노산까지를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 한쪽 또는 양쪽 말단에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 서열 번호 12를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 발현 벡터가 제공된다. 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 임의의 단리된 핵산을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 핵산은 서열 번호 12를 포함한다. 다른 구현양태에서, 발현 벡터는 HLA-DRB1*15 분자를 코딩하는 핵산을 더욱 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 임의의 상기 발현 벡터로 트랜스펙션되거나 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. HLA-DRB1*15 분자를 발현하고, 상기 임의의 발현 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환된 숙주 세포가 또한 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, T 림프구 집단에서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 대해 특이적인 CD4+T 림프구를 선택적으로 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 단리된 T 림프구 집단을, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 제2형 HLA 분자의 복합체를 해당 단리된 T 림프구 집단에서 CD4+T 림프구를 선택적으로 증가시키기에 충분한 양으로 제시하는 작용인자와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 작용인자는 MAGE-A1 단백질 또는 그의 제2형 HLA 결합 단편과 접촉된 항원 제시 세포이다. 바람직한 구현양태에서, 제2형 HLA 분자는 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 갖는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 방법의 특정한 구현양태에서, 단리된 MAGE-A1 단백질 또는 그의 제2형 HLA 결합 펩티드는 엔도솜 표적 시그날을 포함한다. 바람직하게는, 엔도솜 표적 시그날은 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병의 진단 방법이 제공된다. 이 방법은, 환자로부터 단리된 생물학적 시료를 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 특이적인 작용인자와 접촉시키고, 작용인자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 간의 상호작용을 질병의 확인수단으로서 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 생물학적 시료는 예를 들어 종양 세포 용해물이 공급된 수지상 세포이다. 일부 구현양태에서, 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직한 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7중의 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 제2형 HLA 분자와 복합체를 형성하는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 발현을 특징으로하는 질병의 진단 방법이 제공된다. 이 방법은 환자로부터 단리된 생물학적 시료를 복합체에 결합하는 작용인자와 접촉시키고; 복합체와 작용인자 간의 결합을 질병의 확인수단으로서 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2형 HLA 분자는 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다.
MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을 가진 환자의 치료 방법이 본 발명의 다른 측면에서 제공된다. 이 방법은, 질병을 호전시키기에 충분한 양의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 엔도솜 표적 시그날, 바람직하게는 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을가진 환자의 치료 방법이 제공된다. 이 방법은 질병을 호전시키기에 충분한 양의 MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 및 충분한 양의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7중의 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 HLA 클래스 II-결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다. 상기 방법의 특정 구현양태에서, MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 및 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 폴리토프 폴리펩티드로서 조합된다. 또 다른 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 엔도솜 표적 시그날, 바람직하게는 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을 갖는 환자의 치료 방법이 제공된다. 이 방법은, 환자내에서 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체의 존재를 선택적으로 증가시키는 작용인자를, 질병을 호전시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 제2형 HLA 분자는 HLA-DRB1*15 분자이다. 일부 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다.더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 구현양태에서, 작용인자는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 엔도솜 표적 시그날을 포함한다. 바람직한 엔도솜 표적 시그날은 인간 불변 사슬 Ii 및 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함한다.
MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을 가진 환자를 치료하기 위한 추가의 방법은 본 발명의 다른 측면에서 제공된다. 이 방법은 질병을 호전시키기에 충분한 양의 자가 CD4+T 림프구를 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 CD4+T 림프구는 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 제2형 HLA 분자는 HLA-DRB1*15 분자이다. 특정한 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 단리된 폴리펩티드가 제공된다. 단리된 폴리펩티드는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, 바람직하게는 서열 번호 7을 포함하는 에피토프를 선택적으로 결합하며, 단 이것은 제2형 HLA 분자가 아니다. 특정한 구현양태에서, 단리된 폴리펩티드는 항체이고, 바람직하게는 단클론성 항체이다. 다른 구현양태에서, 단리된 폴리펩티드는 Fab 단편, F(ab)2단편 또는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 대해 선택적인 CDR3 영역을 포함하는 단편으로 구성된 군에서 선택된 항체 단편이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 단리된 CD4+T 림프구가 제공된다. 단리된 CD4+T 림프구는 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체를 선택적으로 결합한다. 바람직하게는, 제2형 HLA 분자는 HLA-DRB1*15 분자이다. 일부 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 단리된 항원 제시 세포가 제공된다. 단리된 항원 제시 세포는 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체를 포함한다. 바람직하게는, 제2형 HLA 분자는 HLA-DRB1*15 분자이다. 특정 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 바람직한 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 기능적 변이체를 동정하는 방법이 제공된다. 이 방법에 따르면, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 결합하는 제2형 HLA 결합 분자, 및 제2형 HLA 결합 분자에 의해 제시되는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 의해 자극되는 T 세포가 선택된다. MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 첫번째 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 변이 펩티드를 생성한다. 이어서, 제2형 HLA 결합 분자로의 변이 펩티드의 결합 및 T 세포의 자극을 결정하며, 이때 제2형 HLA 결합 분자로의 변이 펩티드의 결합 및 제2형 HLA 결합 분자에 의해 제시되는 변형 펩티드에 의한 T 세포의 자극은, 변이 펩티드가 기능적 변이체임을 암시하는 것이다. 바람직한 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다. 특정한 구현양태에서, 이 방법은, 기능적 변이체에 의한 T 세포 자극의 유효성을 확인하는 수단으로서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 의한 T 세포의 자극과 기능적 변이체에 의한 T 세포의 자극을 비교하는 단계를 더욱 포함한다. 다른 구현양태에서는, 이 방법은 변이 펩티드를 기질로서 사용하여 기능적 변이체를 동정하는 방법을 반복하는 것을 포함한다. 이러한 방법은, (변이 펩티드의 돌연변이 이외에) MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 두번째 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 두번째 변이 펩티드를 생성하는 것을 포함한다. 제2형HLA 결합 분자로의 두번째 변이 펩티드의 결합 및 T 세포의 자극을 첫번째 변이 펩티드에 대조하여 결정한다. 기능을 매회 시험하는 한, 두번째 변이 펩티드등등을 사용하여 이 방법들을 계속 반복한다. 각각의 반복은, 기질 펩티드에 대해 하나의 아미노산이 상이한 변이 펩티드를 생성한다. 하나 이상의 아미노산 잔기가 각각의 반복에서 돌연변이되는 또다른 방법이 또한 포함되며, 이러한 방법들은 제2형 HLA 결합 분자 및/또는 T 세포의 자극과 같은 펩티드의 기능을 결정하는 단계를 또한 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기재되거나 명세서 전체에 기재된 하나 이상의 약제를 함유하는 제약학적 제제를 제공한다. 이러한 제약학적 제제는 제약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
약제, 특히 암 치료용 약제의 제조에서 상기 조성물, 펩티드 및 핵산의 용도가 또한 제공된다.
본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 이하에서 본 발명의 상세한 설명과 관련하여 더욱 상세히 기재될 것이다.
본 발명은, 제2형 HLA 분자에 의해 T 림프구에 결합하고 여기에 제시되는, 종양 관련 유전자 생성물 MAGE-A1의 단편에 관한 것이다. 이들 펩티드, 이러한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 뿐만 아니라 관련된 항체 및 CD4+T 림프구가 특히 진단 및 치료 측면에서 유용하다.
도 1은 항-MAGE-A1 CD4+T 세포 클론을 얻기 위해 사용하는 절차의 개략도이다. 이.콜리에서 재조합 MAGE-A1①단백질이 생성되었다. 재조합 MAGE-A1②단백질은 Sf9 곤충 세포에서 생성되었다.
도 2는 클론 14가 HLA-DR에 의해 제시되는 MAGE-A1 에피토프를 인식한다는것을 나타낸다. LB650-EBV-B 세포는 이.콜리에서 생성된 재조합 MAGE-A1①단백질 10㎍/ml의 존재하에서 배양되었다. 단클론성 항체[mAb](배지)없이 또는 mAb W6/32 (항-HLA-A, B, C) 또는 2B6 (항-HLA-DR)의 존재하에서, 클론 14(∼3000개 세포)를 둥근 바닥 마이크로웰에서 ∼10,000개 EBV-MAGE-A1와 함께 18 시간동안 배양하였다. 상층액에서의 IFN-γ 생성을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 3은 클론 14에 의한 인식에 관하여 MAGE-A1 펩티드의 스크리닝을 나타낸다. 자가 EBV-B 세포 (마이크로웰 당 ∼10,000개)를 ∼3000개 세포의 클론 14를 첨가하기 전에 2 시간동안 5 ㎍/ml의 펩티드로 펄스시켰다. 18 시간동안의 공동배양 후에, 상층액에서의 IFN-γ 생성을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 4는 클론 14가 펩티드 EYVIKVSARVRF (서열 번호 7) 및 기타 MAGE-A1 펩티드를 인식함을 나타낸다.
도 4A에서, 자가 EBV-B 세포 (마이크로웰 당 ∼10,000개)를 ∼3000개 세포의 클론 14를 첨가하기 전에 2 시간동안 5 ㎍/ml의 펩티드로 펄스시켰다. 18 시간동안의 공동배양 후에, 상층액에서의 IFN-γ 생성을 ELISA에 의해 측정하였다. 사용된 펩티드는 다음과 같다:
VKVLEYVIKVSARVRF (서열 번호 3); EYVIKVSARVRFFFPS (서열 번호 4); ETSYVKVLEYVI (서열 번호 5); VKVLEYVIKVSA (서열 번호 6); EYVIKVSARVRF (서열 번호 7); KVSARVRFFFPS (서열 번호 8); RVRFFFPSLREA (서열 번호 9); FFPSLREAALRE (서열 번호 10); 및 LREAALREEEEGV (서열 번호 11).
도 4B에서, 자가 EBV-B 세포 (마이크로웰 당 ∼10,000개)를 상이한 농도의 펩티드와 함께 2 시간동안 배양하였다. 클론 14 (3000개 세포)를 펩티드-펄스 세포와 함께 20 시간동안 공동배양하였다. 상층액중의 IFN-γ 생성을 ELISA에 의해 측정하였다. 사용된 펩티드는 다음과 같다: VKVLEYVIKVSARVRF (서열 번호 3); EYVIKVSARVRFFFPS (서열 번호 4); 및 EYVIKVSARVRF (서열 번호 7).
본 발명은, 제2형 HLA 분자에 의해 제시되는 단리된 MAGE-A1 펩티드로서, CD4+T 림프구의 증식 및 활성화를 자극하는 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드는 "MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드", "제2형 HLA 결합 펩티드" 및 "제2형 MHC 결합 펩티드"라고 일컬어진다. MAGE-A1 (서열 번호 1 및 2)은 또한 MAGE-A1으로 알려져있다. 따라서, 본 발명의 한가지 측면은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드이다. 부류 I에 의해 제시되는 펩티드 이외에도 추가로, 부류 II에 의해 제시되는 항원성 펩티드를 사용하면, 치료적 항-종양 예방접종의 효능을 향상시킬 수도 있다. 또한, HLA-부류 II 분자에 의해 제시되는 항원들을 이해하는 것은, 종양 항원을 코딩하는 전체 유전자를 보유한 재조합 바이러스 또는 단백질로 면역화된 암 환자의 면역 반응을 평가하는데 유익할 것이다.
이하 실시예는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드인 펩티드의 단리를 나타낸다. 이러한 일례의 펩티드들은 서열 번호 1의 핵산의 처리된 번역 생성물이다. 그것으로서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 제시를 위한 최종 형태로 처리된 번역 생성물은, 이것이 하나 이상의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 갖고 있는 한, 어떠한 길이 또는 서열일 수도 있음을 당업자라면 이해할 것이다. 하기 실시예에서 증명되는 바와 같이, 12개 아미노산 정도로 작거나 MAGE-A1 단백질 (서열 번호 2)의 아미노산 서열 정도로 큰 펩티드 또는 단백질들은 적절히 처리되고, 제2형 HLA 분자에 의해 제시되며, CD4+T 림프구를 자극하는데 효과적이다. MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, 예컨대 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 펩티드들은 하나 또는 양쪽 말단에 첨가된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산을 가질 수도 있다. 이러한 펩티드의 항원성 부분은 제2형 HLA 분자에 의한 제시를 위해 생리 조건하에서 절단된다. 또한, 제2형 HLA 펩티드 길이가 약 10개 아미노산 내지 약 30개 아미노산 사이에서 변할 수 있는 것으로 당 기술분야에 공지되어 있다 [Engelhard, Ann.Rev.Immunol. 12:181-201, 1994]. 대부분의 제2형 HLA 결합 펩티드는 12 내지 19개 아미노산 길이 범위에 속한다. 제2형 HLA 결합 펩티드의 포개어진 집합이 동정되었으며, 여기에서 펩티드들은 코어 서열을 공유하지만 아미노 및/또는 카르복실 말단 부분에서 상이한 아미노산을 갖는다 (예를 들어 실시예 및 문헌 [Chicz 등, J.Exp.Med. 178:27-47, 1993] 참조). 여기에 개시된 펩티드 보다 더 적은 아미노산을 갖는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 상동성인 MAGE 계통 제2형 HLA 결합 펩티드 뿐만 아니라, 추가의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드도 본 명세서에 기재된 절차에 따라 당업자에 의해 동정될 수 있다.
폴리펩티드에 관해 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단리된"이란, 고유의 환경으로부터 분리되고 그것을 동정 또는 사용하기에 충분한 양으로 존재하는 것을 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드을 언급할 때, "단리된" 이란 예를 들어 (i) 발현 클로닝에 의해 선택적으로 생성되거나 또는 (ii) 크로마토그래피 또는 전기영동에 의해 정제되는 것을 의미한다. 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 것일 수도 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 용어 "실질적으로 순수한"이란, 단백질 또는 폴리펩티드가 천연 상태 또는 생체내 체계에서 발견될 수도 있는 다른 물질을 그들의 목적하는 용도에 적절하고 실제적인 정도까지 반드시 함유하지 않음을 의미한다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 당 기술분야에 공지된 기술에 의해 제조될 수도 있다. 단리된 단백질을 제약학적 제제 중에서 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합할 수도 있기 때문에, 단백질은 단지 제제의 적은 중량%만을 차지할 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 생체 시스템에서 연관될 수 있는 물질로부터 분리, 다시말해서 다른 단백질로부터 단리되었다는 점에서, 단백질은 단리된 것이다.
실시예에서 기재된 절차들을 사용하여 MAGE 계통 제2형 HLA 결합 펩티드를 동정할 수 있다. 예를 들면, 세포를 MAGE 폴리펩티드와 접촉시키거나, 또는 당해 MAGE 단백질의 발현을 지시하는 핵산 분자를 세포내에 도입함으로써, 정상 혈액 공여체의 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에 재조합 MAGE 단백질 (또는 그의 단편)을 공급할 수 있다. 이어서, 항원-제시 세포를 사용하여, 시험관내에서, MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드를 인식하는 특이적 CD4 림프구의 활성화 및 증식을 유도할수 있다. 펩티드의 서열은 실시예에서 기재된 바와 같이, 예를 들어 CD4 림프구의 활성화 및 증식을 자극하기 위해 사용되는 MAGE 단백질의 펩티드 단편으로 세포를 자극함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, MAGE 단백질로부터 유래된 펩티드를 항원 제시 세포에 공급할 수 있다. 예를 들면, 제2형 HLA 분자에 결합하기 위한 공통 아미노산 서열을 기초로 하여, 후보 제2형 HLA 결합 펩티드인 MAGE 계통 단백질로부터 유래된 펩티드 서열을 예측할 수 있다. 이러한 점에서 대해서는, 예를 들어 국제 출원 PCT/US96/03182호 및 PCT/US98/01373호를 참조한다. 제2형 HLA 결합 펩티드를 선택하기 위한 컴퓨터 소프트웨어도 이용가능하다 [TEPITOPE; Sturniolo 등, Nature Biotechnol. 17:555-561, 1999; Manici 등, J.Exp.Med. 189:871-876, 1999]. 이렇게 선택된 펩티드는 특정 CD4 림프구의 유도 및 펩티드의 동정을 위해 여기에 기재된 분석방법에서 사용될 수 있다. 제2형 HLA 결합을 위해 펩티드를 선택 및 시험하는 추가의 방법들이 당 기술분야에 공지되어 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 기능적 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제2형 HLA 결합 펩티드의 "기능적 변이체" 또는 "변이체"란, 제2형 HLA 결합 펩티드의 1차 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형을 함유하고, 여기에 개시된 제2형 HLA 및 T 세포 수용체 결합 성질을 보유하는 펩티드이다. MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 기능적 변이체를 발생시키는 변형은, 예를 들어 1) MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 성질, 예컨대 발현 체계에서의 펩티드 안정성 또는 HLA-펩티드 결합과 같은 단백질-단백질 결합의 안정성을 향상시키거나; 2) 예컨대 항원성 에피토프의 첨가 또는 검출가능한 잔기의 첨가와 같이, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 새로운 활성 또는 특성을 제공하거나; 또는 3) 동일하거나 유사한 T 세포 자극 성질을 생성하는 상이한 아미노산 서열을 제공하기 위해 행해질 수도 있다. 펩티드를 코딩하는 핵산에 대해서도 MAGE-A1 (뿐만 아니라 MAGE 계통) 제2형 HLA 결합 펩티드에 대한 변형을 행할 수 있으며, 결실, 점 돌연변이, 말단절취(truncation), 아미노산 치환 및 아미노산 첨가를 포함할 수 있다. 대안적으로, 예컨대 절단, 링커 분자의 첨가, 검출가능한 잔기 (예컨대, 비오틴)의 첨가, 지방산의 첨가, 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 등에 의하여, 폴리펩티드에 직접적으로 변형을 가할 수도 있다. 변이체는 또한 펩티드의 라이브러리로부터 선택될 수 있고, 이것은 랜덤 펩티드 또는 하나 이상의 위치에서의 치환을 포함하는 MAGE 펩티드의 서열을 기초로 한 펩티드일 수 있다. 예를 들면, 펩티드 라이브러리는 제2형 HLA 분자에 결합된 MAGE 펩티드의 복합체 (예, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 공급된 수지상 세포)와의 경쟁 분석에서 사용될 수 있다. 제2형 HLA 분자에 대한 MAGE 펩티드의 결합을 경쟁하는 펩티드를 서열결정하고, MAGE 펩티드 기능적 변이체로서의 적합성을 결정하기 위해 다른 분석 (예, CD4 림프구 증식)에서 사용할 수 있다. 기타 기능적 변이체는 모의펩티드(peptidomimetic) 화합물일 수 있다. 모의펩티드를 제조하고 제2형 HLA 결합에 대해 시험하고 (문헌 [Falcioni 등, Nature Biotechnol. 17:562-567, 1999] 참조), 이어서 CD4+T 세포의 자극에 대해 시험한다.
변형은 또한 MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드 아미노산 서열, 예컨대 불변 사슬-MAGE-A1 융합 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 및 엔도솜 표적 시그날, 예컨대 인간 불변 사슬 (Ii) 또는 LAMP-1을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. MAGE-A1에 인간 불변 사슬의 엔도솜 표적 부분을 융합시키면, 제2형 HLA 펩티드 제시 경로에 대해 MAGE-A1이 효율적으로 표적화된다. 인간 불변 사슬 또는 기타 표적 폴리펩티드의 "엔도솜 표적 부위"는, 두번째 폴리펩티드에 융합 또는 접합될 때 두번째 폴리펩티드의 엔도솜 집적을 증가시키는 분자의 부위이다. 따라서, 엔도솜 표적 부위는 전체 서열 또는 인간 불변 사슬 Ii와 같은 표적 폴리펩티드의 단지 작은 일부를 포함할 수 있다. 당업자라면 표적 분자의 엔도솜 표적 부위를 쉽게 결정할 수 있다. 당업자라면 추가의 엔도솜 표적 시그날을 쉽게 동정하고, MAGE-A1 또는 그의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 부위에 융합시키고, 단지 통상적인 실험을 사용하여 제2형 HLA 펩티드 제시 경로에 대한 표적화를 시험할 수 있다. 엔도솜 표적 시그날 부위와 제2형 HLA 결합 펩티드 부위를 포함한 융합 폴리펩티드의 예에 대해서는 PCT 출원 공개 번호 PCT/US98/18601을 참조한다.
MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드의 아미노산 서열은 천연 또는 비-천연 유래일 수도 있고, 다시말해서 아미노산 서열이 제시시에 헬퍼 T 세포를 자극하는 능력을 보유하고 HLA-DRB1*15 분자와 같은 제2형 HLA 분자에 대한 결합 성질을 보유하는 이상, 이들은 천연 MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드 분자를 포함할 수도 있거나 또는 변형된 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 이러한 상황에서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 및 관련되지 않은 아미노산 서열을포함하는 융합 단백질, 서열 번호 3, 4 및 7에 나타낸 아미노산 서열의 합성 펩티드, 표지화된 펩티드, 암을 발현하는 MAGE를 가진 환자로부터 단리된 펩티드, MAGE-A1을 발현하는 배양된 세포로부터 단리된 펩티드, 비펩티드 분자에 결합된 펩티드 (예를 들어, 특정한 약물 전달 체계에서), 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 기타 분자를 포함하는 융합 단백질일 수도 있다.
바람직하게는, MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드는 비-가수분해성이다. 이러한 펩티드를 제공하기 위하여, 비-가수분해성 펩티드의 라이브러리로부터 MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드, 예컨대 하나 이상의 D-아미노산을 함유하는 펩티드 또는 아미노산을 연결하는 하나 이상의 비-가수분해성 펩티드 결합을 함유하는 펩티드를 선택할 수도 있다. 대안적으로, CD4+T 림프구를 유도하기 위해 적정한 펩티드를 선택한 다음, 이러한 펩티드를 필요에 따라 변형시켜 프로테아제에 의한 가수분해의 가능성을 감소시킬 수도 있다. 예를 들면, 단백질분해 절단에 대한 감수성을 결정하기 위하여, 펩티드를 표지화하고 세포 추출물 또는 정제된 프로테아제와 함께 배양한 다음 단리하여, 예를 들어 펩티드 및 단백질분해 단편을 서열결정함으로써 펩티드 결합이 단백질분해에 대해 민감한지를 결정할 수도 있다. 대안적으로, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 아미노산 서열을 공지된 절단 부위 특이성의 프로테아제와 비교함으로써, 잠재적으로 감수성있는 펩티드 결합을 동정할 수 있다. 이러한 분석 결과를 기초로 하여, 단백질분해에 감수성있는 각각의 펩티드 결합을 펩티드의 시험관내 합성에 의해 비-가수분해성 펩티드 결합으로 대체할 수 있다.
많은 비-가수분해성 펩티드 결합이 이러한 결합을 함유하는 펩티드의 합성 절차와 함께 당 기술분야에 공지되어 있다. 비-가수분해성 결합은 -psi[CH2NH]-환원된 아미드 펩티드 결합, -psi[COCH2]-케토메틸렌 펩티드 결합, -psi[CH(CN)NH]-(시아노메틸렌)아미노 펩티드 결합, -psi[CH2CH(OH)]-히드록시에틸렌 펩티드 결합, -psi[CH2O]-펩티드 결합, 및 -psi[CH2S]-티오메틸렌 펩티드 결합을 포함한다.
펩티드의 비펩티드 유사체, 예를 들어 안정된 구조 또는 감소된 생분해성을 제공하는 유사체가 또한 의도된다. 펩티드 모의 유사체는 선택된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 기초로 하여 하나 이상의 잔기를 비펩티드 잔기로 대체함으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는, 비펩티드 잔기는 펩티드가 그의 자연적 배위를 보유하도록 할 수 있거나, 바람직한, 예를 들어 생체활성 배위를 안정화할 수 있다. 이러한 펩티드들은 배위 및/또는 활성에 대한 치환(들)의 효과를 평가하기 위해 분자 또는 세포-기초 결합 분석에서 시험될 수 있다. 펩티드로부터 비펩티드 모의 유사체를 제조하기 위한 방법의 한가지 예는 문헌 [Nachman 등, Regul. Pept. 57:359-370 (1995)]에 기재되어 있다. 여기에서 사용된 펩티드는 상기 기재된 모두를 포함한다.
변이체가 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산에 대한 변화와 연관된다면, 보존적 아미노산 치환, 다시말해서 원래의 아미노산의 특성, 예컨대 전하, 소수성, 배위 등을 보유하는 치환을 가진 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 기능적 변이체가 바람직하다. 아미노산의 보존적 치환의 예는 하기 군 내의 아미노산 중에서 행해진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 기능적 변이체를 동정하는 다른 방법은 스트로밍거(Strominger)와 워쳐프훼니그(Wucherpfennig)의 PCT 출원 (PCT/US96/ 03182)에 제공된다. 이러한 방법들은 잠재적 에피토프들이 비교될 수도 있는 아미노산 서열 모티프의 발현에 의존한다. 각각의 모티프는 각각의 (상대적) 위치에서의 잔기가 (a) 단일 잔기로 제한될 수도 있거나, (b) 잔기의 제한된 집합중에서 변화되도록 하거나, 또는 (c) 모든 가능한 잔기 중에서 변화되도록 할 수 있는 한정된 집합의 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들면, 모티프는 첫번째 위치에서의 잔기가 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌 또는 페닐알라닌의 어느 하나 일수도 있고; 두번째 위치에서의 잔기가 히스티딘이어야 하고; 세번째 위치에서의 잔기가 임의의 아미노산 잔기일 수도 있고; 네번째 위치에서의 잔기가 잔기 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판 중의 어느 하나일 수도 있으며; 다섯번째 위치에서의 잔기가 리신이어야 한다는 것을 규정할 수도 있다.
MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 기능적 변이체에 대한 서열 모티프는, 주요 조직적합성 복합체 HLA-DR 단백질의 결합 도메인 또는 결합 포켓 및/또는 여기에 개시된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 T 세포 수용체 ("TCR") 접촉점을 분석함으로써 발현될 수 있다. 제2형 HLA 결합 포켓을 형성하는데 관련되는 잔기의 상세한 구조적 분석을 제공함으로써, 임의의 제2형 HLA 단백질에 대한 MAGE 펩티드의결합을 위하여 서열 모티프를 예측하는 것이 가능하다.
이러한 서열 모티프를 연구, 평가 또는 구조 기준으로서 사용하여, 특정한 HLA 분자에 대한 결합 및 T 세포 반응을 유도하기 위한 T 세포 수용체와의 상호작용 가능성을 가진 펩티드의 부류(예를 들어, MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드, 특히 본 명세서에 개시된 MAGE-A1 펩티드, 및 그의 기능적 변이체)를 동정할 수 있다. 이러한 펩티드들은 본 명세서에 개시된 활성에 대해 합성 및 시험될 수 있다. 순수한 서열 상동성 (항원성은 유사하지만 서열이 상당히 상이한 다수의 펩티드들이 제외됨) 또는 비제한 "보존적" 치환을 가진 서열 상동성 (중요한 고도 보존 부위에서 서로 상이한 많은 펩티드들이 허용됨)과는 반대로, 이러한 모티프의 사용은, 당업자가 질병의 치료에서 펩티드를 적용할 수 있는지를 평가할 수 있는 방법을 제공한다.
스트로밍거와 워쳐프페닌그의 PCT 출원 및 그곳에 인용된 참고문헌들 (모두 참고문헌으로서 포함된다)은, 제2형 HLA 펩티드의 잔기를 접촉하는 제2형 HLA 및 TCR 결합 포켓을 기술하고 있다. 제2형 HLA 및/또는 TCR 결합 포켓에 결합할 수 있는 잔기를 일정하게 유지시키거나 또는 단지 규정된 치환만을 허용함으로써, 제2형 HLA 및 T 세포 수용체에 대한 결합을 보유하는 MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드를 제조할 수 있다.
따라서, 추가의 MAGE 계통 제2형 HLA 펩티드, 특히 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, 및 그의 기능적 변이체를 동정하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 임의의 MAGE 단백질을 상기 나타낸 바와 같이 분석하고, 펩티드 서열을 선택하고 본 명세서에 기재된 바와 같이 시험할 수 있다. 예를 들어, MAGE-A1에 있어서, 방법은 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 결합하는 제2형 HLA 결합 분자, 및 제2형 HLA 결합 분자에 의해 제시되는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 의해 자극되는 T 세포를 선택하는 것을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다. MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 첫번째 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 변이 펩티드를 제조한다. 상기 기재된 스트로밍거와 워쳐프훼니그의 PCT 출원에 기재된 HLA 및 T 세포 수용체 접촉점 원리에 따라서 아미노산 잔기를 돌연변이시킬 수 있다. 변이 펩티드의 합성, 돌연변이된 핵산 분자를 사용한 변이 펩티드의 재조합 생성 등과 같은, 변이 펩티드를 제조하기 위한 임의의 방법이 사용될 수 있다.
이어서, 제2형 HLA 결합 분자에 대한 변이 펩티드의 결합 및 T 세포의 자극을 표준 절차에 따라 결정한다. 예를 들면, 하기 예시된 바와 같이, 변이 펩티드와 항원 제시 세포의 복합체를 형성하기 위하여, MAGE-A1 펩티드에 결합하는 제2형 HLA 분자를 함유한 항원 제시 세포와 변이 펩티드를 접촉시킬 수 있다. 이어서, 이 복합체를 제2형 HLA 결합 분자에 의해 제시되는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 인식하는 T 세포와 접촉시킬 수 있다. MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 병을 가진 환자로부터 T 세포를 얻을 수 있다. T 세포에 의한 변이 펩티드의 인식은 TNF 또는 INFγ 생성과 같은 T 세포 자극의 지시인자를 측정함으로써 결정될 수 있다. 다른 MAGE 계통 제2형 HLA 결합 펩티드의 동정 및 특징화를 위하여 유사한 절차를 수행할 수 있다.
제2형 HLA 결합 분자로의 변이 펩티드의 결합 및 제2형 HLA 결합 분자에 의해 제시되는 변이 펩티드에 의한 T 세포의 자극은, 변이 펩티드가 기능적 변이체임을 나타낸다. 방법은 또한, 기능적 변이체에 의한 T 세포의 자극의 효율성을 확인하는 수단으로서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 의한 T 세포의 자극을 기능적 변이체에 의한 T 세포의 자극과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 기능적 변이체를 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 비교함으로써, 증가된 T 세포 자극 성질을 가진 펩티드를 제조할 수 있다.
필요에 따라, 임의의 상기 방법에 의해 제조된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 변이체를 서열결정하여 아미노산 서열을 결정할 수 있고, 이에의해 이러한 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추정할 수 있다.
또한, MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산 서열, 및 엄격한 조건하에서 상기 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산 서열로 하이브리드화되는 기타 핵산 서열도 본 발명의 일부가 된다. 여기에서 사용되는 용어 "엄격한 조건"이란 당 기술분야에서 친숙한 매개변수를 말하는 것이다. 핵산 하이브리드화 매개변수는 이러한 방법을 열거한 모든 참고문헌, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J.Sambrook 등, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 등, John Wiley & Sons, Inc., NewYork]에서 찾아볼 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 명세서에서 사용된 엄격한 조건이란 하이브리드화 완충액 (3.5×SSC, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 25 mM NaH2PO4(pH7), 0.5% SDS, 2mM EDTA)중에서 65 ℃에서의 하이브리드화를 말하는 것이다. SSC는 0.15M 염화나트륨/0.15M 시트르산나트륨, pH 7이고; SDS는 소듐 도데실 설페이트이고; EDTA는 에틸렌 디아민테트라아세트산이다. 하이브리드화 후에, DNA가 옮겨져 있는 막을 실온에서 2×SSC로 세척한 다음, 68 ℃ 이하의 온도에서 0.1×SSC/0.1×SDS로 세척한다.
사용될 수 있는 다른 조건, 시약 등이 존재하며, 그에 의해서도 유사한 정도의 엄격한 조건이 얻어진다. 당업자라면 이러한 조건에 친숙할 것이므로, 그것들을 여기에 나타내지는 않겠다. 그러나, 당업자라면 본 발명의 MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 핵산의 상동체 및 대립유전자를 명확히 동정할 수 있는 방식으로 그 조건을 조작할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면, 그러한 분자의 발현을 위한 세포 및 라이브러리를 선별하고, 통상적으로 단리한 다음, 관련된 핵산 분자를 단리하고 서열결정하기 위한 방법에 친숙할 것이다.
일반적으로, 상동체 및 대립유전자는, 각각 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 아미노산 서열 (예컨대 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 7) 또는 그러한 펩티드를 코딩하는 핵산 (예, 서열 번호 7의 펩티드를 코딩하는 서열 번호 12)에 대해, 90% 이상의 아미노산 동일성 및/또는 75% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 공유한다. 일부 경우에, 상동체 및 대립유전자는 95 % 이상의 뉴클레오티드 동일성 및/또는 90% 이상의 아미노산 동일성을 공유하며, 또 다른 경우에는 99% 이상의 뉴클레오티드 동일성 및/또는 95% 이상의 아미노산 동일성을 공유한다. 상기 핵산의 보체도 본 발명에 의해 포함된다.
MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 핵산을 선별함에 있어서, P32프로브와 함께 상기 조건을 사용하여, 서던 블롯 또는 노던 블롯과 같은 핵산 하이브리드화를 수행할 수도 있다. MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 DNA가 최종적으로 전달되는 막을 세척한 후에, 막을 X-선 필름을 향해 위치시켜 방사능 시그날을 검출할 수 있다.
핵산에 관해 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"이란 (i) 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 시험관내 증폭; (ii) 클로닝에 의한 재조합적 생성; (iii) 절단 및 겔 분리에 의한 정제; 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성에 의한 합성을 의미한다. 단리된 핵산은 당 기술분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 쉽게 조작될 수 있는 것이다. 따라서, 5' 및 3' 제한효소 부위가 공지되어 있거나 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머 서열이 개시되어 있는 벡터내에 함유된 뉴클레오티드 서열은 단리된 것으로 간주되지만, 그의 본래의 숙주내에 천연 상태로 존재하는 핵산 서열은 그렇지 않은 것으로 간주된다. 단리된 핵산은 실질적으로 정제될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들면, 클로닝 또는 발현 벡터 내에서 단리된 핵산은, 이것이 존재하는 세포내에서 단지 작은 비율의 물질을 함유할 수도 있다는 점에서 순수하지 않다. 그러나, 이러한 핵산은 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 쉽게 조작될 수 있기 때문에, 본 명세서에서 사용된 용어에서처럼 그러한 핵산은 단리된 것이다. 본 발명에서 사용된 단리된 핵산은 자연발생 염색체가 아니다.
본 발명은 또한, MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드의 동일한 아미노산 잔기를 코딩하는 대안적인 코돈을 포함한 핵산 서열의 사용을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 펩티드 EYVIKVSARVRF (서열 번호 7)은 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드이다. 세린 잔기 (서열 번호 7의 아미노산 번호 7)는 코돈 UCU, UCC, UCA, UCG, AGU 및 AGC에 의해 코딩될 수 있다. 6개 코돈의 각각은 류신 잔기를 코딩하기 위한 목적에 상응한다. 따라서, 류신 잔기를 혼입하기 위해, 시험관내 또는 생체내에서 단백질 합성 장치를 지시하기 위하여 류신-코딩 뉴클레오티드 트리플렛중의 어느 것을 사용할 수도 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 유사하게, 서열 번호 7의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 포함한 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 트리플렛은 다음을 포함한다: CGA, CGC, CGG, CGT, AGA 및 AGG (아르기닌 코돈); AAA 및 AAG (리신 코돈); GUA, GUC, GUG 및 GUU (발린 코돈); GAA 및 GAG (글루타민 코돈); UUC 및 UUU (페닐알라닌 코돈) 및 UAC 및 UAU (티로신 코돈). 다른 아미노산 잔기가 다수의 뉴클레오티드 서열에 의해 유사하게 코딩될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 유전자 코드의 변성에 기인하여 천연 MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드 코딩 핵산과는 코돈 서열이 서로 상이한 변성 핵산을 또한 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 치환 및 결실을 포함하는변형된 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 구현양태에서, 이러한 변형 핵산 분자 및/또는 이들이 코딩하는 폴리펩티드는, 미변형된 핵산 분자 및/또는 폴리펩티드의 하나 이상의 활성 또는 기능, 예컨대 항원성, 효소 활성, 수용체 결합, MHC 부류 I 또는 부류 II와 펩티드의 결합에 의한 복합체의 형성 등을 보유한다. 특정한 구현양태에서, 변형된 핵산 분자는 변형된 폴리펩티드, 바람직하게는 본 명세서의 어딘가에 기재된 것과 같은 보존적 아미노산 치환을 가진 폴리펩티드를 코딩한다. 변형된 핵산 분자는 미변형된 핵산 분자에 구조적으로 관련되고, 바람직한 구현양태에서, 미변형된 핵산 분자와 구조적으로 충분히 관련되므로, 그 결과 변형된 핵산 분자 및 미변형된 핵산 분자는 당업자에게 공지된 엄격한 조건하에서 하이브리드화된다.
예를 들면, 단일 아미노산 변화를 가진 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 핵산 분자가 제조될 수 있다. 이러한 핵산 분자의 각각은 본 명세서에 기재된 유전자 코드의 변성에 상응하는 뉴클레오티드 변화를 제외하고는 하나, 둘 또는 세개의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 유사하게, 2개의 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 핵산 분자, 예를 들어 2-6 뉴클레오티드 변화를 갖는 분자를 제조할 수 있다. 당업자라면, 예를 들어 아미노산 2 및 3, 2 및 4, 2 및 5, 2 및 6 등을 코딩하는 코돈에서의 뉴클레오티드의 치환을 포함하여, 이와 같은 다수의 변형된 핵산 분자들을 쉽게 생각해 낼 수 있다. 상기 예에서, 2개의 아미노산의 각각의 조합 뿐만 아니라, 아미노산 치환을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 치환이, 변형된 핵산 분자의 집합에 포함된다. 추가의 치환 (즉, 3 개 이상), 첨가 또는 결실 (예, 정지 코돈 또는 스플라이스 부위(들)의 도입)을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 핵산 분자들이 또한 제조될 수 있고, 당업자라면 쉽게 생각해낼 수 있는 것으로서 본 발명에 포함된다. 상기 임의의 핵산 또는 폴리펩티드는, 본 명세서에 개시된 핵산 및/또는 폴리펩티드에 대한 구조적 관계 또는 활성의 보유에 관하여 통상적인 실험에 의해 시험될 수 있다.
본 발명은 발현 벡터에서의 서열의 용도 뿐만 아니라, 원핵 (예, 이.콜리) 또는 진핵 (예, 수지상 세포, CHO 세포, COS 세포, 효모 발현 체계, 및 곤충 세포에서의 재조합 바쿨로바이러스 발현)일 수 있는 숙주 세포 및 세포주를 트랜스펙션하는 것을 포함하는 것으로 이해된다. 발현 벡터는 상기 기재된 것과 같은 적절한 서열이 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것을 필요로 한다. 인간 HLA-DRB1*15 분자가 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 제시하는 것을 알아낸 바와 같이, 발현 벡터는 HLA-DRB1*15 분자를 코딩하는 핵산 서열을 또한 포함할 수도 있다 (다른 MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드에 대하여, 상이한 HLA 분자가 사용될 수 있다). 벡터가 코딩 서열을 둘다 함유하는 상황에서, 이것은 어느 한쪽을 통상 발현하지 않는 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 숙주 세포가 이미 HLA-DRB1*15 분자를 발현한 경우에는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 코딩 서열이 단독으로 사용될 수도 있다. 물론, 2개의 코딩 서열을 함유하는 벡터가 HLA-DRB1*15 분자를 발현하지 않는 숙주 세포에서 사용될 수 있고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 핵산이 HLA-DRB1*15 분자를 발현하는 항원 제시 세포에서 사용될 수 있을 때, 사용될 수 있는 특정한 숙주 세포에 대한 제한은 없다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "HLA-DRB1*15 분자"는 아형 DRB1*15011, DRB1*15012, DRB1*15021, DRB1*15022, DRB1*15023, DRB1*1503, DRB1*1504, DRB1*1505, DRB1*1506, DRB1*1507, DRB1*1508, DRB1*1509 및 DRB1*1510을 포함한다. HLA-DRB1*15 분자는 또한 문헌 [Bodmer 등, Tissue Antigens 49:297, 1996] 및 IMGT/HLA 데이타베이스 웹사이트 http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/에서 찾아볼 수 있는 아형을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 상이한 유전 환경 간의 전달을 위하여 또는 숙주 세포에서의 발현을 위하여 제한 및 결찰에 의해 원하는 서열이 삽입될 수도 있는 다수의 핵산일 수도 있다. 벡터는 RNA 벡터가 이용될 수도 있지만 전형적으로 DNA로 구성된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드 및 바이러스 게놈을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 클로닝 벡터는 자기 복제가능하거나 또는 숙주 세포에서 게놈내에 통합된 후에 복제가능한 것이고, 결정가능한 방식으로 벡터가 절단될 수도 있고 원하는 DNA 서열이 결찰될 수도 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 더욱 특징으로 하는 것이며, 따라서 새로운 재조합 벡터가 숙주 세포에서 복제되는 능력을 보유한다. 플라스미드의 경우에, 숙주 세균내에서 플라스미드의 카피 수가 증가함에 따라 원하는 서열의 복제가 여러번 일어날 수도 있거나, 또는 숙주가 유사분열에 의해 재생되기 전에 숙주 당 단 한번 일어날 수도 있다. 파지의 경우에, 용균 단계동안에 능동적으로 또는 용원 단계동안에 수동적으로 복제가 일어날 수도 있다. 발현 벡터는, 원하는 DNA 서열이 제한 및 결찰에 의해 삽입되어 조절 서열에 작동적으로 결합될 수 있고 RNA 전사물로서 발현될 수도 있는 것이다.
벡터는, 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션되었거나 되지않은 세포의 동정에서 사용하기에 적절한 하나 이상의 마커 서열을 더욱 함유할 수도 있다. 마커는 예를 들면 항생물질 또는 다른 화합물에 대한 내성 또는 감수성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 코딩하는 유전자, 당 기술분야에 공지된 표준 분석 방법에 의해 검출가능한 활성을 가진 효소 (예, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제)를 코딩하는 유전자, 및 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포, 숙주, 콜로니 또는 플라그의 표현형에 뚜렷한 영향을 미치는 유전자 (예, 녹색 형광 단백질)를 포함한다. 바람직한 벡터는 이들이 작동적으로 결합된 DNA 단편에 존재하는 구조 유전자 생성물의 자가 복제 및 발현이 가능한 것이다.
바람직하게는, 발현 벡터는, MAGE 계통 폴리펩티드, 예를 들어 MAGE-A1 또는 이로부터 유래된 제2형 HLA 결합 펩티드를 단백질 또는 펩티드가 발현되는 세포의 엔도솜에 표적화하는 서열을 함유한다. 제2형 HLA 분자는 제2형 HLA 분자에 다른 분자가 결합하는 것을 방해하는 불변 사슬(Ii)을 함유한다. 이러한 불변 사슬은 엔도솜에서 절단되며, 이에 의해 제2형 HLA 분자에 의한 펩티드의 결합이 가능해진다. 따라서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 및 그의 전구체 (예, MAGE-A1 단백질)가 엔도솜에 표적화하고, 이에 의해 제2형 HLA 분자에 대한 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 결합을 증가시키는 것이 바람직하다. 엔도솜으로 분자를 보내기 위한 표적 시그날이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 시그날은 발현 벡터에 편리하게 혼입될 수 있고, 그 결과 엔도솜 표적 시그날을 함유하는 융합 단백질이 생성된다. 샌더슨(Sanderson) 등 [Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:7217-7221, 1995], 위(Wu) 등 [Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:11671-11675, 1995] 및 톰슨(Thomson) 등 [J.Virol. 72:2246-2252, 1998]은 엔도솜 표적 시그날 (불변 사슬 Ii 및 리조솜-관련 막 단백질 LAMP-1 포함) 및, 엔도솜 및/또는 리조솜 세포 격실로 항원을 보내는데 있어서의 그의 용도를 기술하고 있다.
불변 사슬과 같은 엔도솜 표적 시그날은 비-펩티드 결합 (다시말해서 비 융합 단백질)에 의해 MAGE-A1 단백질 또는 펩티드에 접합되어 MAGE-A1을 특이적으로 표적화할 수 있는 접합체를 제조할 수 있다. 공유 결합의 특정한 예는 이작용성 가교제 분자가 사용되는 것들을 포함한다. 가교제 분자는 접합되는 분자의 성질에 따라 동종이작용성 또는 이종이작용성일 수도 있다. 동종이작용성 가교제는 2개의 동일한 반응기를 갖는다. 이종이작용성 가교제는 연속 접합 반응이 가능한 2개의 상이한 반응기를 갖는 것으로 정의된다. 통상적으로 입수가능한 가교제의 여러 유형은 하나 이상의 하기 기: 1차 아민, 2차 아민, 술프히드릴, 카르복실, 카르보닐 및 탄수화물과 반응성이다. 당업자라면 부적절한 실험을 사용하지 않고도, 결합 또는 결합들의 바람직한 특징 및 연결되는 분자의 화학적 성질을 기초로 하여, 엔도솜 표적 잔기 및 MAGE-A1 펩티드 또는 단백질을 결합하기 위해 바람직한 분자를 확인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 코딩 서열 및 조절 서열은, 이들이 코딩 서열의 발현 또는 전사를 조절 서열의 영향 또는 제어하에 두는 방식으로 공유 결합될 경우, "작동적으로" 결합된 것이라고 일컬어진다. 코딩 서열이 기능성 단백질로 번역되기를 원하는 경우, 5' 조절 서열에서의 프로모터의 유도에 의해 코딩 서열의 전사가 일어난다면, 그리고 2개의 DNA 서열간의 결합 성질이 (1) 프레임-시프트 돌연변이를 도입하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 명령하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 상응하는 RNA 전사물이 단백질로 번역되는 능력을 방해하지 않는다면, 2개의 DNA 서열들이 작동적으로 결합된 것이라 일컬어진다. 따라서, 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있다면, 프로모터 영역은 코딩 서열에 작동적으로 결합된 것이며, 그 결과 얻어진 전사물은 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수도 있다.
유전자 발현을 위해 필요한 조절 서열의 정확한 성질은 종 또는 세포 유형에 따라 변할 수도 있지만, 일반적으로 필요에 따라 전사 및 번역 개시와 관련되는 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함해야 한다. 특히, 이러한 5' 비-전사 조절 서열은 프로모터 영역을 포함하며, 이 영역은 작동적으로 결합된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함한다. 조절 서열은 필요에 따라 인핸서 서열 또는 상류 액티베이터 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명의 벡터는 임의로 5' 리더 또는 시그날 서열을 포함할 수도 있다. 적절한 벡터의 선택 및 구성은 당업자의 능력 및 결정 범위내에 있다.
발현을 위해 필요한 요소를 모두 함유하는 발현 벡터들이 통상적으로 입수가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조. 세포는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 이종 DNA (RNA)을세포내에 도입함으로써 유전자 조작된다. 숙주 세포내에서 이종 DNA의 발현이 가능하도록 하기 위해서는, 이러한 이종 DNA (RNA)를 전사 요소의 작동가능한 제어하에 둔다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 발현 구조물은 임의로 엔도솜 표적 시그날을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 인간 불변 사슬 또는 그의 표적화 단편을 함유한다.
포유동물 세포에서의 mRNA 발현을 위해 바람직한 체계는 G418 내성을 부여하는 유전자 (안정하게 트랜스펙션된 세포주의 선택을 용이하게 함) 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서-프로모터 서열과 같은 선택가능한 마커를 함유하는 pRc/CMV (미국 캘리포니아주 칼스배드의 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수가능함)와 같은 것이다. 추가로, 영장류 또는 개 세포주에서의 발현을 위해 적절한 것은 pCEP4 벡터 (인비트로겐)이고, 이것은 멀티카피 염색체외 유전인자로서 플라스미드를 유지시킬 수 있는 엡스테인 바르(Epstein Barr) 바이러스 (EBV) 복제 개시점을 함유한다. 다른 발현 벡터는 폴리펩티드 신장 인자 1α의 프로모터를 함유하는 pEF-BOS 플라스미드이고, 이것은 시험관내 전사를 효율적으로 자극한다. 플라스미드는 미시즈마(Mishizuma) 및 나가따(Nagata) [Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990]에 의해 기재되어 있으며, 트랜스펙션 실험에서의 그의 용도는 예를 들어 [Demoulin, Mol.Cell.Biol. 16:4710-4716, 1996]에 개시되어 있다. 다른 바람직한 발현 벡터는, 스트래트포드-페리코데트(Stratford-Perricaudet)에 의해 기재된, E1 및 E3 단백질이 결핍된 아데노바이러스이다 [J.Clin.Invest. 90:626-630, 1992]. 아데노.P1A 재조합체으로서 아데노바이러스의 용도는, P1A에 대한 면역화를 위해생쥐에서의 피내 주사에 관한 문헌 [Warnier 등, Int.J.Cancer, 67:303-310, 1996]에 개시되어 있다.
본 발명은 또한, 당업자들이 원하는 발현 벡터 또는 벡터들을 제조할 수 있도록 하는, 이른바 발현 키트를 포함한다. 이러한 발현 키트는 앞서 언급된 2 이상의 물질들을 적어도 별개의 분량으로 포함한다. 원한다면, 다른 성분들을 첨가할 수도 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명은 여러 용도를 가지며, 그 일부를 여기에 기재한다. MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 대해 다음의 용도가 기재되어 있지만, 기타 구조적으로 또는 기능적으로 관련된 MAGE 계통 제2형 HLA 결합 펩티드의 사용에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다. 먼저, 본 발명은 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 발현을 특징으로 하는 질병의 진단을 가능하게 한다. 이러한 방법은 생물학적 시료내에서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, 또는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 제2형 HLA 분자의 복합체의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 펩티드 또는 펩티드와 제2형 HLA 분자의 복합체의 발현은, 펩티드 또는 복합체에 대한 결합 파트너, 예컨대 항체를 사용하여 분석함으로써 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 발현을 특징으로 하는 질병을 가진 환자를 치료할 수 있도록 한다. 치료는 환자에게서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 제2형 HLA 분자의 복합체를 증가시키는 작용인자를 투여하고, 이러한 복합체에 대해 특이적인 CD4+T 림프구를 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료에서 유용한 작용인자는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 및 그의 기능적 변이체, 그러한 MAGE-A1 펩티드를 포함하는 엔도솜-표적 융합 단백질, 이러한 단백질 및 펩티드를 발현하는 핵산 (핵산을 함유하는 바이러스 포함), 이러한 펩티드와 제2형 HLA 결합 분자 (예, HLA-DRB1*15)와의 복합체, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 제2형 HLA 결합 분자와의 복합체를 포함하는 항원 제시 세포, 등을 포함한다. 본 발명은 또한 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 특이적인 CD4+T 림프구를 위해 T 림프구의 집단을 선택적으로 증가시킬 수 있다.
MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 단리는 또한 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 핵산을 단리하는 것을 가능하게 한다. 핵산을 사용하여 시험관내에서 또는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 생성할 수 있다. 당업자에게 공지된 여러 방법들을 사용하여, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 수득할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터를 세포내에 도입하여 펩티드의 생성을 유발할 수 있다. 다른 방법에서, mRNA 전사물을 세포내에 미량주입하거나 또는 다른 방법으로 세포내에 도입하여 코딩된 펩티드의 생성을 유발할 수도 있다. 망상적혈구 용해물 계와 같은 세포-비함유 추출물내에서 mRNA의 번역을 사용하여 펩티드를 생성할 수도 있다. 본 발명의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 포함하는 펩티드가 시험관내에서 합성될 수도 있다. 당업자라면, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 수득하기 위해, 펩티드를 단리하기 위한 공지된 방법을 쉽게 따를 수 있다. 이들은 면역크로마토그래피, HPLC, 크기-절단 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 면역-친화력 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
이러한 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, 이러한 펩티드를 포함하는 단백질, 또는 펩티드와 제2형 HLA 분자의 복합체, 예컨대 HLA-DRB1*15 분자들을 보조액과 같은 물질과 조합하여, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 발현을 특징으로 하는 질병을 치료하는데 유용한 백신을 생성할 수도 있다. 또한, 그들의 표면상에서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드/HLA 복합체를 제시하는 세포, 예컨대 수지상 세포, B 세포, 비-증식 트랜스펙션체 등으로부터 백신을 제조할 수 있다. 세포가 백신으로서 사용되는 모든 경우에, 이들은 CD4+림프구를 자극하기에 필요한 하나 또는 둘의 성분에 대한 코딩 서열로 트랜스펙션된 세포일 수 있거나, 또는 트랜스펙션의 필요없이 양쪽 분자들을 이미 발현하는 세포일 수 있다. 예를 들면, 자가 항원 제시 세포를 환자로부터 단리하고 처리하여, 제1형 HLA 및 제2형 HLA 분자의 결합에서 MAGE-A1 에피토프를 제시하는 세포를 수득할 수 있다. 이러한 세포들은 CD4+및 CD8+세포 반응을 자극할 수 있다. 이러한 항원 제시 세포들은 예를 들어 Ii.MAGE-A1 융합 단백질을 코딩하는 재조합 바이러스로 수지상 세포를 감염시킴으로써 수득될 수 있다. 수지상 세포들은 제1형 HLA 및 제2형 HLA 에피토프를 가질 수 있다.
백신은 또한 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 또는 그의 전구체를 코딩하는 노출된(naked) DNA 또는 RNA를 포함하며, 이는 시험관내에서 생성될 수 있고 주사,입자 충격, 코내 흡입 및 기타 방법을 통해 투여될 수 있다. "노출된 핵산" 유형의 백신은, 노출된 핵산이 코딩하는 펩티드에 특이적인 CTL의 발생을 포함한, 면역학적 반응을 유발하는 것으로 증명되었다 [Science 259:1745-1748, 1993]. 백신은 또한 바이러스, 리포좀, 또는 약물 전달에서 유용한 중합체 입자를 포함한 기타 입자내에 충전된 핵산을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 치료법에 의해 발생되거나 증가된 면역 반응은 당 기술분야에 공지된 여러 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 주어진 항원에 대해 특이적인 T 세포의 존재는, T 세포 수용체를 항원성 펩티드를 제시하는 가용성 형광 MHC 분자 사량체로 직접 표지화함으로써 검출될 수 있다 [Altman 등, Science 274:94-96, 1996; Dunbar 등, Curr.Biol. 8:413-416, 1998]. 간단하게, 수용성 MHC 부류 I 분자들은, β2-마이크로글로블린 및 부류 I 분자에 결합하는 펩티드 항원의 존재하에 시험관내에서 감겨진다. 정제 후에, MHC/펩티드 복합체를 정제하고 비오틴으로 표지화한다. 비오틴화 펩티드-MHC 복합체를 표지화된 아비딘 (예, 피코에리트린)과 4:1의 몰비로 혼합함으로써 사량체가 형성된다. 이어서, 사량체를 말초 혈액 또는 림프절과 같은 CTL의 원천과 접촉시킨다. 사량체는 펩티드 항원/MHC 부류 I 복합체를 인식하는 CTL을 결합한다. 사량체에 의해 결합된 세포를 형광 활성화된 세포 분류에 의해 구별하여 반응성 CTL을 단리한다. 이어서, 단리된 CTL을 본 명세서에 기재된 바와 같은 용도를 위해 시험관내에서 확장시킬 수 있다. 사량체로서 제2형 MHC 분자의 사용은 최근들어 크로포드(Crawford)등에 의해 증명되었다 [Immunity 8:675-682, 1998]. 다량체 가용성 제2형 MHC 분자는 공유 결합된 펩티드와 복합체를 형성하였다. 부류 II 사량체는 적절한 특이성 및 친화성으로 특정한 T 세포에 결합되는 것으로 나타났다. 따라서, 예방접종 프로토콜에 대한 CD4+및 CD8+세포 반응을 측정하기 위하여 사량체를 사용할 수 있다.
당 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 항체를 생성하기 위하여, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 뿐만 아니라 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 HLA 분자의 복합체를 사용할 수도 있다. 항체 생성의 일반적 원리를 나타낸 표준 참고 연구 문헌은, 문헌 [Catty, D.,Antibodies, A Practical Approach, vol.1, IRL Press, Washington DC (1988)]; [Klein,J.,Immunology: The Science of Cell-Non-Cell Discrimination, John Wiley and Sons, New York (1982)]; [Kennett,R., 등,Monoclonal Antibodies, Hybridoma, A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980)]; [Campbell, A.,Monoclonal Antibody Technology, in Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13 (Burdon 등, EDS.), Elsevier Amsterdam (1984)]; 및 [Eisen,H.N.,Microbiology, 제 3 판, Davis,B.D. 등, EDS (Harper & Rowe, Philadelphia (1980)]을 포함한다.
본 발명의 항체들은 단백질, 단백질의 단편, 단백질 또는 그의 단편을 발현하는 세포, 및 적절한 제2형 HLA 분자 등을 동물에 투여하여 다클론성 항체를 유도하는 것을 포함한 여러 방법중 임의의 방법에 의해 제조된다. 인간화 항체를 포함한 단클론성 항체들은 당 기술분야에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 본 명세서에 상술된 바와 같이, 이러한 항체들은 예를 들어 단백질을 발현하는 조직을 동정하거나 단백질을 정제하기 위해 사용될 수도 있다. 항체는 또한 화상진단을 위한 특정 표지화 시약에 결합되거나, 또는 이에 한정되지는 않지만 메토트렉세이트, 방사능요오드화 화합물, 리신과 같은 독소, 기타 세포분열 또는 세포용해 약물 등을 포함한 항종양 약제에 결합될 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 항체는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 펩티드/HLA 복합체에 대해 특이적이다.
본 명세서에서 "질병" 또는 "병"이 사용될 때, 이것은 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 발현되는 병리학적 상태를 말한다. 이러한 질병은 흑색종, 머리, 목, 폐 또는 식도의 편평상피암, 결장직장암, 골육종, 신경아세포종, 머리 또는 목의 비-편평상피암, 난소 종양, 림프구성 백혈병, 방광암, 전립선암, 유방암 및 위암과 같은 암을 포함한다.
이러한 개시내용을 기초로 한 일부 치료적 접근법은, MAGE 제2형 HLA 결합 펩티드 제시 세포에 대한 환자의 면역 체계에 의하여 반응을 유도하는 것을 전제로 한다. 이러한 한가지 접근법은, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 제2형 HLA 분자의 복합체에 대해 특이적인 자가 CD4+T 세포를 조직에서의 비정상 표현형 세포를 가진 환자에게 투여하는 것이다. 시험관내에서 이러한 CD4+T 세포를 발현시키는 것은 당업자의 기술범위내이다. 일반적으로, 환자로부터 채집된 혈구와 같은 세포 시료를, 복합체를 제시하고 CD4+T 림프구의 증식을 유발할 수 있는 세포와 접촉시킨다. 표적 세포는 수지상 세포 또는 B 세포와 같이 제2형 HLA 분자를 포함하는항원 제시 세포일 수 있다. CD4+T 림프구 집단을 단리하기 위하여 세포 시료를 먼저 분류한다면, 표적 세포는 COS 세포와 같은 트랜스펙션체일 수도 있다. 상기 기재된 사량체 기술을 분류에 사용할 수도 있다. 이러한 트랜스펙션체는 그들의 표면에서 바람직한 복합체를 제시하며, CD4+T 림프구와 조합될 때 그의 증식을 자극한다. 다른 적절한 숙주 세포에서와 같이, COS 세포도 널리 이용될 수 있다. CD4+T 림프구의 특이적 생성은 이하에 설명된다. 이어서, 클론으로 확장된 자가 CD4+T 림프구를 환자에게 투여한다. 이어서, CD4+T 림프구는 환자의 면역 반응을 자극하고, 이에 의해 원하는 치료 목표를 달성할 수 있다.
상기 치료법은, 환자의 비정상 세포의 적어도 일부가 관련된 HLA/펩티드 복합체를 제시하는 것으로 가정한다. 당 기술분야는 특정한 HLA 분자를 제시하는 세포를 동정하기 위한 방법 뿐만 아니라 적절한 서열, 이 경우에는 MAGE-A1 서열의 DNA를 발현하는 세포를 동정하는 방법에 매우 친숙하기 때문에, 이것을 매우 용이하게 결정할 수 있다.
상기 치료법이 본 발명에서 이용가능한 치료법의 유일한 형태는 아니다. 다수의 접근법을 사용하여 생체내에서 CD4+T 림프구를 유발할 수도 있다. 한가지 접근법은 복합체를 발현하는 비-증식 세포를 사용하는 것이다. 이러한 접근법에서 사용되는 세포는 복합체를 정상적으로 발현하는 것, 예컨대 수지상 세포 또는 복합체의 제시를 위해 필요한 유전자의 하나 또는 양쪽 모두로 트랜스펙션된 세포일 수 있다. 첸(Chen) 등 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110-114, 1991]은 이러한 접근법을 예시하고 있으며, 이는 치료 섭생법에서 HPV-E7 펩티드를 발현하는 트랜스펙션된 세포의 사용을 보여주고 있다. 여러 세포 유형이 사용될 수도 있다. 유사하게, 관심의 대상이 되는 유전자의 하나 또는 양쪽 모두를 보유하는 벡터가 사용될 수도 있다. 바이러스 또는 세균 벡터가 특히 바람직하다. 예를 들면, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 핵산을, 특정한 조직 또는 세포 유형에서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 발현을 지시하는 프로모터 및 인핸서 서열에 작동 가능하게 연결시킬 수도 있다. 핵산을 발현 벡터내에 혼입할 수도 있다. 발현 벡터는 미변형된 염색체외 핵산, 외인성 핵산의 삽입이 가능하도록 구축 또는 변형된 플라스미드 또는 바이러스성 게놈, 예컨대 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 것일 수도 있다. MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 레트로바이러스 게놈내에 삽입될 수도 있고, 이에 의해 표적 조직 또는 세포 유형의 게놈내로의 핵산의 통합을 촉진할 수 있다. 이러한 체계에서, 주요 유전자는 미생물, 예를 들어바시니아(Vaccinia) 바이러스, 일반적인 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 레트로바이러스 또는 세균 BCG에 의해 운반되고, 물질은 사실상 숙주 세포를 "감염"시킨다. 얻어지는 세포는 해당 복합체를 제시하고, 이는 자가 CD4+T 세포에 의해 인식되며, 이어서 CD4+T 세포가 증식한다.
생체내에서 제2형 HLA 제시 세포내로의 혼입을 촉진하기 위해, MAGE 제2형HLA 결합 펩티드를 보조액과 조합함으로써 유사한 효과를 달성할 수 있다. 제2형 HLA 결합 부위보다 더욱 크다면, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 필요에 따라 더욱 처리하여 HLA 분자의 펩티드 파트너를 얻을 수 있는 반면, TRA는 추가의 처리가 필요없이도 제시된다. 일반적으로, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 유효량을 환자에게 피내 주사할 수 있다. 초기 투여에 이어서 추가면역 투여한 다음, 당 기술분야에서 표준인 면역화 프로토콜을 행할 수 있다.
MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 제2형 HLA 제시 세포내로의 혼입을 촉진하기 위해 바람직한 방법은, 부류 II 결합 펩티드를 포함하는 MAGE-A1 폴리펩티드에 융합된 엔도솜 표적 시그날을 포함하는 폴리펩티드를, 제시 세포내에서 발현시키는 것이다. 인간 불변 사슬 Ii를 함유하는 MAGE-A1 융합 단백질이 특히 바람직하다.
임의의 상기 조성물 또는 프로토콜은 또한, 세포용해 T 림프구 반응을 유도하기위한 MAGE 제1형 HLA 결합 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하기 증명된 바와 같이, MAGE-A1 단백질을 세포내에서 처리하여 제1형 HLA 및 제2형 HLA 반응을 둘다 이끌어낼 수 있다. 이러한 몇가지 펩티드들은 미국 특허 5,405,940호 및 5,558,995호에 기재되어 있다. 제1형 HLA 및 부류 II 분자에 결합하는 MAGE-A1 펩티드 (또는 그러한 펩티드를 코딩하는 핵산)를 투여함으로써, T 헬퍼 세포 및 T 킬러 세포 양쪽 모두를 유도하는 것에 의해 개선된 면역 반응이 제공될 수도 있다.
또한, 비-MAGE-A1 종양 관련 펩티드를 투여하여 제1형 HLA 및/또는 부류 II를 통한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 암 세포는 하나의 종양 관련 유전자보다 더 많이 발현할 수 있는 것으로 증명되어 있다. 특정한 환자가 추가의 종양 관련유전자를 발현하는지의 여부와, 상기 MAGE-A1 조성물 및 백신에 이러한 유전자의 발현 생성물로부터 유래된 제1형 HLA 및/또는 제2형 HLA 결합 펩티드를 포함하는지의 여부를 결정하는 것은, 당업자의 통상적인 실험 범위내에 있다.
특히, "폴리토프"라고 공지된 일련의 에피토프를 코딩하는 핵산이 바람직하다. 에피토프는 천연 플랭킹 서열을 갖거나 갖지 않은채로 연속적으로 또는 중복된 방식으로 배열될 수 있으며 [Thomson 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:5845-5849, 1995; Gilbert 등, Nature Biotechnol. 15:1280-1284, 1997], 원한다면 관련되지 않은 링커 서열에 의해 분리될 수 있다. 면역 반응의 발생을 위해, 폴리토프를 처리하여 면역 체계에 의해 인식되는 각각의 에피토프를 발생시킨다.
따라서, 예를 들면 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 다른 종양 거절 항원으로부터의 펩티드와 조합시키고 (예, 하이브리드 핵산 또는 폴리펩티드의 제조에 의해), MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 (이들의 일부는 하기 기재된다)와 조합시켜 "폴리토프"를 형성할 수 있다. 면역 반응을 유도 또는 증가시키기 위해 투여될 수 있는 일례의 종양 관련 펩티드 항원은, 종양 관련 유전자 및 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9, BAGE-1, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), 티로시나제, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, 멜란-A, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7을 포함한 코딩된 단백질로부터유래된다. 예를 들면, 종양의 항원성 펩티드 특징은 하기 표 1에 기재된 것을 포함한다.
제1형 HLA 및 제2형 HLA 결합 펩티드의 다른 예가 당업자에게 공지되어 있으며 (예를 들어, [Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995] 참조), 여기에 개시된 바와 유사한 방식으로 본 발명에서 사용될 수 있다. 당업자라면 하나 이상의 MAGE-A1 펩티드 및 하나 이상의 상기 종양 거절 펩티드를 함유하는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드들을 코딩하는 핵산을 분자 생물학의 표준 절차에 따라 제조할 수 있다.
따라서, 폴리토프는 다양한 배열 (예를 들어, 연쇄, 중복)로 함께 결합될 수 있는 2 이상의 잠재적인 면역원성 또는 면역 반응 자극 펩티드의 군이다. 폴리토프 (또는 폴리토프를 코딩하는 핵산)는 면역 반응을 자극, 증가 및/또는 유발함에 있어서 폴리토프의 유효성을 시험하기 위해 예를 들어 동물에게 표준 면역화 프로토콜로 투여될 수 있다.
펩티드들은 폴리토프를 형성하기 위해 직접적으로 또는 플랭킹 서열의 사용을 통해 함께 결합될 수 있으며, 백신으로서 폴리토프의 사용이 당 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, [Thomson 등, Proc. Acad. Natl. Acad. Sci. USA 92(13):5845-5849, 1995; Gilbert 등, Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson 등, J.Immunol. 157(2): 822-826, 1996; Tam 등, J.Exp.Med. 171(1):299-306, 1990] 참조). 예를 들어, 탐(Tam)은 MHC 부류 I 및 부류 II 결합 에피토프로 구성된 폴리토프가 마우스 모델에서 항체 및 보호 면역성을 성공적으로 발생시킨다는 것을 나타내었다. 탐은 또한, 에피토프의 "스트링(string)"을 포함하는 폴리토프를 처리하면, MHC 분자에 의해 제시되고 CTL에 의해 인식되는 각각의에피토프가 얻어진다는 것을 증명하였다. 따라서, 다양한 수 및 조합의 에피토프를 함유하는 폴리토프를 제조하고, CTL에 의한 인식 및 면역 반응을 증가시키는데 있어서의 효능에 대해 시험할 수 있다.
종양은 종양 항원의 집합을 발현하며, 이들 중에서 단지 특정한 소집합만이 개별 환자의 종양에서 발현될 수 있는 것으로 알려져 있다. 특정한 환자에서 발현되는 종양 거절 항원의 소집합을 나타내는 에피토프의 상이한 조합에 상응하는 폴리토프를 제조할 수 있다. 또한, 종양 유형에 의해 발현되는 것으로 공지된 넓은 스펙트럼의 종양 거절 항원을 반영하는 폴리토프를 제조할 수 있다. 폴리토프는 폴리펩티드 구조물로서 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 당 기술분야에 공지된 핵산 전달 체계의 사용을 통해 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Allsopp 등, Eur.J.Immunol. 26(8):1951-1959, 1996] 참조). 아데노바이러스, 폭스 바이러스, Ty-바이러스 형 입자, 아데노-관련 바이러스, 플라스미드, 세균 등을 이러한 전달에서 사용할 수 있다. 전달 체계의 효능을 결정하기 위하여 마우스 모델에서 폴리토프 전달 체계를 시험할 수 있다. 체계는 또한 인간 임상 시험에서 시험될 수도 있다.
면역화 프로토콜의 일부로서, 면역 반응을 증강시키는 물질을 핵산 또는 암 백신의 펩티드 성분과 함께 투여할 수도 있다. 이러한 면역 반응 증강 화합물은 보조액으로서 또는 사이토카인으로서 분류될 수 있다. 보조액은 항체의 저장소를 제공하고 (세포외 또는 대식세포내), 대식세포를 활성화하고 림프구의 특정 집합을 자극함으로써 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 많은 종류의 보조액들이 당 기술분야에 공지되어 있으며; 특정한 예는 MPL (스미드클라인 비참 (SmithKline Beecham)),살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota) Re 595 리포폴리사카라이드의 정제 및 산 가수분해후에 수득된 동종체, QS 21 (스미드클라인 비참), 퀼리야 사포나리아 (Quillja saponaria) 추출물로부터 정제된 순수한 QA-21 사포닌, DQS21 (PCT 출원 WO96/33739 (스미드클라인 비참)에 기재됨); QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-L1 (So 등, Mol.Cells 7:178-186, 1997); 프로인트 불완전 보조액; 프로인트 완전 보조액; 비타민 E; 몬타나이드; 알룸; CpG 올리고뉴클레오티드 (예를 들어 [Kreig 등, Nature 374:546-9, 1995] 참조); 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 오일로부터 제조된 다양한 유중수 에멀젼을 포함한다. 바람직하게는, 펩티드를 DQS21/MPL의 조합과 혼합하여 투여한다. DQS21 대 MPL의 비는 약 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 약 1:5 내지 5:1, 더욱 바람직하게는 약 1:1이다. 전형적으로 인간 투여를 위해서는, DQS21 및 MPL이 약 1 ㎍내지 약 100 ㎍의 범위로 백신 제제중에 존재한다. 다른 보조액들이 당 기술분야에 공지되어 있으며 본 발명에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 제 2 판, 1986] 참조). 펩티드 및 보조액의 혼합물 또는 에멀젼의 제조 방법은 예방접종 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
환자의 면역 반응을 자극하는 다른 작용인자들을 또한 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 림프구 자극 성질의 결과로서 다른 사이토카인들도 예방접종 프로토콜에서 유용하다. 백신의 보호 효과를 증가시키는 것으로 밝혀진 인터류킨-12 (IL12) [Science 268: 1432-1434, 1995], GM-CSF 및 IL-18을 포함하여, 이러한 목적을 위해 유용한 많은 사이토카인들은 당업자에게 알려져 있다.
예방접종 프로토콜에서 사용될 수 있는 추가의 면역 반응 증강 화합물들이 다수 존재한다. 이들은 단백질 또는 핵산 형태로 제공되는 공동자극 분자를 포함한다. 이러한 공동자극 분자는 B7-1 및 B7-2 (각각 CD80 및 CD86) 분자를 포함하며, 이들은 수지상 세포(DC)에서 발현되고 T 세포상에서 발현되는 CD28 분자와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 항원/MHC/TCR 자극 (시그날 1) T 세포에 대한 공동자극 (시그날 2)을 제공하고, 이는 T 세포 증식 및 이펙터 기능을 증가시킨다. B7은 또한 T 세포 상에서 CTLA4 (CD152)와 상호작용하고, CTLA4 및 B7 리간드에 관한 연구는 B7-CTLA4 상호작용이 항종양 면역 및 CTL 증식을 증가시킬 수 있음을 나타낸다 [Zheng 등, Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 95:6284-6289, 1998].
B7은 전형적으로 종양 세포상에서 발현되지 않고, 따라서 이들은 T 세포에 대한 효과적인 항원 제시 세포 (APCs)가 아니다. B7 발현의 유도는, 종양 세포가 CTL 증식 및 이펙터 기능을 더욱 효율적으로 자극할 수 있도록 한다. B7/IL-6/Il-12 공동자극의 조합은 T 세포 집단에서 IFN-감마 및 Th1 사이토카인 프로파일을 유도하고, 이는 T 세포 활성을 더욱 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [Gajewski 등, J.Immunol. 154:5637-5648, 1995]. B7에 의한 종양 세포 트랜스펙션은 왕(Wang)등 [J.Immunother. 19:1-8, 1996]에 의해 양자 면역 전달 면역요법을 위한 시험관내 CTL 확장에 관련하여 논의되어있다. B7 분자에 대한 다른 전달 메카니즘은 핵산 (노출된 DNA) 면역화 [Kim 등, Nature Biotechnol. 15:7:641-646, 1997] 및 아데노바이러스 및 폭스 바이러스와 같은 재조합 바이러스 [Wendtner 등, Gene Ther.4:726-735, 1997]를 포함한다. 이러한 체계는, 여기에 개시된 항원 또는 항원(들)의 단편 (폴리토프 포함) 또는 사이토카인과 같은 선택된 다른 분자들과 B7을 공동발현시키기 위해 발현 카세트의 구축 및 사용에 모두 적합하다. 이러한 전달 체계는 시험관내 및 생체내 예방접종 상황하에서 적절한 분자들을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 T 세포를 직접적으로 자극하기 위해 항-CD28 항체를 사용하는 것을 또한 고려할 수 있다. 유사하게, 외래 항원에 대한 T 세포 반응을 유도하는 유도가능한 공동-자극 분자 ICOS를, 예를 들어 항-ICOS 항체의 사용에 의해 조정할 수 있다 [Hutloff 등, Nature 397:263-266, 1999].
림프구 기능 관련 항원-3 (LFA-3)은 APCs 및 일부 종양 세포 상에서 발현되고, T 세포 상에서 발현되는 CD2와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 T 세포 IL-2 및 IFN-감마 생성을 유도하고, 따라서 B7/CD28 공동자극 상호작용을 보충하긴 하지만 이를 대체하진 않는다 [Parra 등, J.Immunol., 158:637-642, 1997; Fenton 등, J.Immunother., 21:95-108, 1998].
림프구 기능 관련 항원-1 (LFA-1)은 백혈구 상에서 발현되고 APCs 및 일부 종양 세포 상에서 발현되는 ICAM-1과 상호작용한다. 이러한 상호작용은 T 세포 IL-2 및 IFN-감마 생성을 유도하고, 따라서 B7/CD28 공동자극 상호작용을 보충하긴 하지만 이를 대체하진 않는다 [Fenton 등, 1998]. 따라서, LFA-1은 B7에 대해 상기 언급된 다양한 방식으로 예방접종 프로토콜에서 제공될 수 있는 공동자극 분자의 다른 예이다.
완전 CTL 활성화 및 이펙터 기능은, Th 세포 CD40L (CD40 리간드) 분자와DCs에 의해 발현되는 CD40 분자 사이의 상호작용을 통한 Th 세포 보조를 필요로 한다 [Ridge 등, Nature 393:474, 1998; Bennett 등, Nature 393:478, 1998; Schoenberger 등, Nature 393:480, 1998]. 이러한 공동자극 시그날의 메카니즘은 B7의 증가조절 및 DC (APC)에 의한 관련된 IL-6/Il-12 생성과 연관되는 것으로 보인다. 따라서, CD40-CD40L 상호작용은 시그날 1 (항원/MHC-TCR) 및 시그날 2 (B7-CD28) 상호작용을 보충한다.
DC 세포를 직접적으로 자극하는 항-CD40 항체의 사용은, 염증 상태 이외에서 보통 직면하거나 또는 비-전문적 APCs (종양 세포)에 의해 제시되는 종양 관련 항원에 대한 반응을 증가시키는 것으로 기대된다. 예를 들어, CD40-CD40L 상호작용을 증가시킴으로써, 또는 DCs를 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 세포외 기질로부터의 자극성 당 잔기와 접촉시킴으로써, 수지상 세포의 돌연변이를 유발하기 위한 다른 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 상황에서는, Th 보조 및 B7 공동자극 시그날이 제공되지 않는다. 이러한 메카니즘은, 항원 펄스 DC를 기초로 한 치료 상황에서, 또는 Th 에피토프가 공지된 종양 관련 항원 전구체 범위내에서 정의되지 않는 상황에서 사용될 수도 있다.
투여시에, 본 발명의 치료 조성물은 제약학적으로 허용가능한 제제로 투여된다. 이러한 제제는 통상 제약학적으로 허용가능한 농도의 염, 완충제, 보존제, 상용가능한 담체, 보충 면역 증강제, 예컨대 보조액 및 사이토카인, 및 임의로 기타 치료제를 함유할 수도 있다.
본 발명의 제제는 유효량으로 투여된다. 유효량이란, 단독으로 또는 추가의용량과 함께, 원하는 반응을 자극하는 제약학적 제제의 양이다. 암을 치료하는 경우에, 원하는 반응은 암의 진행을 억제하는 것이다. 이는 단지 질병의 진행을 일시적으로 느리게 하는 것과 관련될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 영구적으로 질병의 진행을 정지시키는 것과 관련된다. 면역 반응을 유도하는 경우에, 원하는 반응은 사용되는 MAGE-A1 면역항원(들)에 대해 특이적인 항체 또는 T 림프구의 증가이다. 이러한 원하는 반응은 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있거나, 여기에 언급된 본 발명의 진단 방법에 따라 측정될 수 있다.
본 발명의 치료 조성물을 사용하여 면역 반응을 자극하는 것을 원하는 경우, 이것은 체액성 항체 반응의 자극과 연관될 수 있고, 이에 의해 혈청에서의 항체 역가의 증가, 세포독성 림프구의 클론 확장, 또는 일부 기타 바람직한 면역 반응이 얻어진다. 투여 방식에 의존하여, 1 나노그램/킬로그램에서부터 100 밀리그램/킬로그램 범위의 면역항원의 투여량이 유효한 것으로 생각된다. 바람직한 범위는 킬로그램당 500 나노그램 내지 500 마이크로그램인 것으로 생각된다. 절대량은 투여를 위해 선택된 물질, 투여가 단일 투여인지 또는 다중 투여인지의 여부, 및 연령, 물리적 상태, 체격, 체중, 및 질병 단계를 포함한 환자 개인의 변수를 포함한, 여러 요인에 의존하게 된다. 이러한 요인들은 당업자에게 알려져 있으며, 단지 통상적인 실험에 의해 해결될 수 있다.
실시예 1: CD4 + T 림프구에 대해 제2형 HLA 분자에 의해 제시되는 MAGE-A1 에피토프의 동정
단핵구-유래 수지상 세포에 MAGE-A1 재조합 단백질을 공급하고, 이것을 사용하여 자가 CD4+T 세포를 자극하였다. HLA-DRB1*15 분자에 의해 제시되는 펩티드 MAGE-A1281-292(서열 번호 7)을 인식하는 CD4+T 세포 클론을 단리하였으며, 이는 17%의 코카시안(Caucasians)에서 발현되었다.
I. 세포주, 사이토카인
EBV-형질전환된 B(EBV-B 세포) 세포주를, 10% 태아 소 혈청 (FCS) (Gibco BRL), 0.24 mM L-아스파라긴, 0.55 mM L-아르기닌, 1.5 mM L-글루타민 (AAG), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 이스코브(Iscove)의 개질 둘베코(Dulbecco)배지 (IMDM)에서 배양하였다. 인간 재조합 IL-2를 유로세투스 (Eurocetus) (네델란드 암스테르담)로부터 구입하고, IL-7을 겐자임(Genzyme) (미국 매사츄세츠 캠브리지)로부터 구입하고, GM-CSF를 쉐링 플루흐(Schering Plough) (아일랜드 브리니)로부터 구입하고, TNF-α를 R&D 시스템스 (영국 아빙던)로부터 구입하였다. 인간 재조합 IL-4, IL-6 및 IL-12를 표준 재조합 절차를 사용하여 실험실에서 생성하였다.
II. 2개의 재조합 MAGE-A1 단백질의 생성
A - 이.콜리에서 LipoD-MAGE-A1-His 단백질의 생성
재조합 LipoD-MAGE-A1-His 단백질은 스미드클라인 비참 코포레이션 파머슈티칼 컴퍼니 (벨기에 릭센사르트)에 의해 제조되었다. 이것은 N-말단 끝에해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) Lipo D 단백질 서열의 1/3을 함유하고, C-말단 끝에 7개 잔기의 폴리히스티딘 마커를 함유하며, LipoD와 His 말단 사이에 MAGE-A1 단백질 (서열 번호 2)를 함유한다. 이러한 재조합 단백질이 이.콜리에서 생성되었으며, 이후 단백질 MAGE-A1①이라 언급된다.
B- Sf9 곤충 세포에서 His-MAGE-A1 단백질의 생성
다른 재조합 MAGE-A1 단백질을 실험실에서 바쿨로바이러스 발현 체계를 사용하여 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (Sf9) 곤충 세포에서 생성하였다 (파르밍겐(PharMingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고). MAGE-A1의 코딩 서열 (서열 번호 1의 뉴클레오티드 139-1068)을, 바쿨로바이러스 균주인오토그래파 캘리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)의 gp67 표면 단백질의 시그날 서열에 대해 하류에서 바쿨로바이러스 전달 벡터 (pAcGP67-A; 파르밍겐)에 클로닝하였다. 용이한 정제를 위하여, 히스티딘 꼬리를 코딩하는 서열을 MAGE-A1의 서열의 C-말단에 첨가하였다. 이러한 구축물은 이하에서 MAGE-A1②라 일컬어지는 MAGE-A1 단백질을 곤충 세포에 의해 분비될 수 있도록 하였다. 재조합 플라스미드의 DNA를 치사 돌연변이된 AcNPV와 함께 Sf9 곤충 세포내에 공동-트랜스펙션하였다. 공동-트랜스펙션은 플라스미드와 바이러스의 상동 영역 사이에서 재조합을 가능하게 하고, 벡터로부터 AcNPV DNA로 외래 유전자를 전달시킨다. Sf9 곤충 세포 배양물의 상층액에 함유된 단백질의 정제는 하기 기재된 바와 같이 상이한 배치(batch)에 대하여 상이한 단계를 포함한다.
MAGE-A1②의 배치 번호 1를 여과, 음이온 교환 수지 (DEAE-세파덱스), NiCl2로 포화된 하이트랩(HighTrap) 킬레이트 컬럼, 고정화된 항-MAGE-A1 단클론성 항체 (MAb 11B2)를 가진 친화력 크로마토그래피, 농축 및 투석의 연속 단계에 의해 정제하였다.
MAGE-A1②의 배치 번호 2를 여과, 음이온 교환 수지 DEAE-세파덱스, NiCl2로 포화된 하이트랩 킬레이트 컬럼, 역상 HPLC 및 농축의 연속 단계에 의해 정제하였다.
III. 인간 혈액의 처리
혈색증 환자로부터 표준 피막 제제로서 말초 혈액을 얻었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 림포프레프(Lymphoprep) (노르웨이 오슬로의 니코메트 파르마(Nycomed Pharma))상에서 원심분리에 의해 단리하였다. 혈소판에 의한 PBMC의 오염을 최소화하기 위하여, 제제를 먼저 실온에서 1,000 rpm으로 20 분동안 원심분리하였다. 대부분의 혈소판을 함유하는 상부 20∼25 ml의 제거 후에, 관을 실온에서 1,500 rpm으로 20 분동안 원심분리하였다. PBMC를 함유하는 중간상을 수확한 다음, 2 mM EDTA를 가진 냉 인산염 완충액 중에서 3회 (또는 그 이상) 세척하여 남은 혈소판을 제거하였다. 자가 수지상 세포를 발생시키기 위하여, 2-아미노에틸이소티오우로늄 (시그마)으로 처리된 양 적혈구 (프랑스 마르시 레또왈, 바이오메리오(BioMerieux))로 로제트형성함으로써 T 림프구로부터 PBMC를 소멸시켰다. 림프구-소멸된 PBMC를, 배양 플라스크 (팔콘(Falcon))내에서 AAG 및 1% 자가 플라스마가 보충된 RPMI 1640 배지 (이후, 완전 RPMI 배지라 한다)중에서 2×106세포/ml의 밀도로 37 ℃에서 2 시간동안 고착을 위해 놓아두었다. 비-고착 세포를 버리고, 고착 세포를 IL-4 (100 U/ml) 및 GM-CSF (100 ng/ml)의 존재하에 완전 RPMI 배지중에서 배양하였다. 배지의 반을 새로운 배지 + IL-4 (100 U/ml) 및 GM-CSF (100 ng/ml)로 대체하여 2 일과 4일째에 배양액에 공급하였다. 5일째에, 비-고착 세포 집단을 증가된 수지상 세포 원으로 사용하였다.
로제트형성된 T 세포를 NH4Cl(160 mM)로 처리하여 양 적혈구를 용해시키고, 세척하였다. 자기 마이크로비드 (독일, 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotech))에 결합된 항-CD8 단클론성 항체를 사용하여 네가티브 선별하고, 제조업자에 의해 추천된 바와 같이 MACS를 통해 분류함으로써, 로제트형성된 T 세포로부터 CD4+T 림프구를 단리하였다. 림프구를 냉동시킨 다음, 수지상 세포와 공동배양하기 전날에 녹였다.
IV. 혼합된 림프구/수지상 세포 배양액
수지상 세포 (5×105/ml)를 IL-4 (100 U/ml), GM-CSF (100 ng/ml) 및 TNF-α (1 ng/ml)가 보충된 완전 배지에서 배치 번호 2로부터의 약 20㎍의 MAGE-A1②단백질의 존재하에 37 ℃, 5% CO2에서 18 - 20 시간동안 배양하였다. 세포를 세척하고, AAG 및 10% 인간 혈청이 보충된 200㎕ IMDM 배지 (이하, 완전 IMDM배지라 한다)중에서 IL-6 (1,000 U/ml) 및 IL-12 (10 ng/ml) 존재하에 둥근바닥 마이크로웰당 104에서 105자가 CD4+림프구까지 첨가하였다 (도 1). 배치 번호 2로부터의 MAGE-A1②단백질이 새로 공급된 자가 수지상 세포로 7일과 14일에 CD4+림프구를 재자극시킨 다음, IL-2 (10 U/ml) 및 IL-7 (5 ng/ml)이 보충된 완전 이스코브 배지중에서 생육시켰다. 4주 째에, 배치 번호 1로부터의 등량의 투석된 MAGE-A1②단백질로 자극을 수행하였다.
단백질 MAGE-A1①이 공급된 자가 EBV-B 세포로 자극될 때 IFN-γ를 생성하는 능력에 관하여, 35 일째에, 증식 CD4+T 세포를 함유하는 마이크로배양액을 평가하였다. 다른 단백질을 사용한 이유는, 수지상 자극인자 세포를 공급하기 위해 사용된 단백질에 함유된 오염물에 대해 반응하는 CD4+T 세포가 고려되는 것을 피하기 위해서였다. 자가 EBV-B 세포를, 네가티브 대조군으로서 20 ㎍/ml의 단백질 MAGE-A1①또는 난알부민(OVA) (시그마)의 존재하에서 18 내지 20 시간동안 배양하였다. 단백질-펄스된 EBV-B 세포를 세척하고, IL-2 (25 U/ml)가 보충된 150 ㎕의 완전 IMDM 배지중에서 ∼3,000개 CD4+T 림프구와 함께 둥근바닥 마이크로웰당 ∼20,000개 세포로 분배시켰다. 20 시간후에, 상층액을 수집하고, 메드제닉스 다이아그노스틱스-바이오소스 (Medgenix Diagnostics-Biosource) (벨기에 플레우러스)로부터의 시약을 사용하여 ELISA에 의해 그의 IFN-γ 함량을 측정하였다.
V. MAGE-A1 항원에 대항하는 CD4+T 세포 클론
단백질 MAGE-A1①이 공급된 자가 EBV-B 세포를 자극인자 세포로서 사용하여, 제한 희석법에 의해, 단백질 MAGE-A1①으로 자극 후에 다량의 IFN-γ을 생성하는 미소배양액 G3을 클로닝하였다 (마이크로웰당 5×103내지 10×104세포). 자가 수지상 세포의 제한된 공급으로 인해, 이러한 자극인자 세포를 클로닝 단계에서 사용하였다. 동종 LG2-EBV-B 세포 (마이크로웰당 5×103내지 10×104세포)를 공급 세포로서 첨가하였다. CD4+T 세포 클론을 1주 1회 재자극시키고, IL-2 (50 U/ml) 및 0.5 ㎍/ml 정제된 PHA (HA 16, 영국 다트포드의 뮤렉스 다이아그노스틱스(Murex Diagnostics))가 보충된 완전 IMDM 배지에서 생육시켰다. 정착된 CD4+T 세포 클론에 1주 1회 새로운 배양 배지를 보충하고, 1-2 주일 간격으로 공급 세포 (24개 웰 평판에서 웰 당 1.5×106동종 PBL + 5×105LG2 EBV-B 세포)를 통과시켰다. CD4+클론 LB650-CTL 488/G3.14 (이후 클론 14라고 일컫는다)를 수득하였다. 이것은 단백질 MAGE-A1①이 공급된 자가 EBV-B 세포를 인식하였다 (도 2).
항-HLA-DR 항체에 의하여, 단백질 MAGE-A1이 공급된 세포가 클론 14에 의해 인식되는 것을 막았다. 1/20 희석비로 사용되는 보존제-비함유 단클론성 항체의 연속 존재하에, MAGE-A1①-펄스 EBV-B 세포를 클론 14와 함께 37 ℃에서 8% CO2하에24 시간동안 공동배양하였다. 단클론성 항체 2B6 (HLA-DR에 대항)은 인식을 막는 반면, 단클론성 항체 W6/32 (HLA-A,B,C에 대항)의 존재하에서는 인식이 불변하였다.
VI. CD4 클론 14는 HLA-DRB1*15 상에서 MAGE-A1 펩티드 EYVIKVSARVRF (서열 번호 7)를 인식한다
CD4 클론 14에 의해 인식되는 MAGE-A1 펩티드를 동정하기 위하여, MAGE-A1 단백질 서열 (서열 번호 2)의 중복 부분에 상응하는 16개 아미노산 펩티드를 자가 EBV-B 세포상에 공급하고, 인식에 대해 시험하였다. 일시적인 NH2-말단 보호를 위해 F-moc를 사용하여 고체상에서 펩티드를 합성하고, 질량 분광법을 사용하여 특징결정하였다. 분석 HPLC에 의해 나타나는 바와 같이, 모든 펩티드는 80% 이상 순수하였다. 동결건조된 펩티드를 먼저 DMSO 중에 2 mg/ml로 용해시킨 다음 5 ㎍/ml의 농도로 사용되는 이스코브 배지에 희석하였다. EBV-B 세포를 상이한 펩티드의 존재하에 37 ℃에서 2 시간동안 배양하였으며, 표시된 농도는 배양 단계 동안의 농도를 나타낸 것이다. 이들을 IL-2 (25 U/ml)가 보충된 완전 IMDM 배지 100 ㎕중에서 ∼2,500개 CD4+T 림프구와 함께 둥근바닥 마이크로웰 당 ∼10,000개 세포로 분포시켰다. 18 내지 20 시간후에, 상층액을 수확하고 IFN-γ 분비에 대해 평가하였다. 메드게닉스 다이아그노스틱스-바이오소스 (벨기에 플레우러스)로부터의 시약으로 실험실에서 전개되는 ELISA 시험 (20∼4000 pg/ml)을 사용하여 IFN-γ 생성을 측정하였다.
2개의 펩티드, 즉 VKVLEYVIKVSARVRF (aa 277-292; 서열 번호 3) 및 EYVIKVSARVRFFFPS (aa 281-296; 서열 번호 4)는 포지티브를 기록하였다 (도 3). 이들은 12개 아미노산에 의해 중복되었다. 부류 I 분자에 의해 제시되는 펩티드와는 달리, 부류 II 분자에 의해 제시되는 펩티드는, 부류 II 분자 홈에서 그들의 말단이 고정되지 않기 때문에, 통상 길이가 다르고 아미노 및 카르복시 양쪽 말단에서의 연장이 허용된다. 따라서, 이러한 펩티드의 길이를 정확히 한정하는 것이 곤란하다. 2개의 포지티브 16개 아미노산 펩티드에 포함되는 서열을 가진 12개 아미노산 펩티드의 다른 집합을 시험하였다 (도 4). 펩티드 EYVIKVSARVRF (aa 281-292; 서열 번호 7)는 클론 14에 의해 잘 인식된다 (도 4). 자극인자 세포를 ∼10 nM의 이 펩티드와 배양함으로써 최대 자극값의 반이 수득되었다. 이것은, CD4+T 세포에 의해 제2형 HLA 분자상에서 인식되는 다른 MAGE 에피토프를 사용하여 수득된 결과와 유리하게 비교된다. 예를 들면, 항-MAGE-A3 CD4+클론의 IFN-γ생성 최대치의 반을 유도하기 위해서는 ∼10 nM의 MAGE-A3 펩티드가 필요하였다.
환자 LB650은 혈청학적으로 DRB1*0701, DRB1*15 및 DRB4*01 및 DRB5*0101로 유형화되었다. 제시 HLA-DR 분자를 동정하기 위하여, DRB1*0701, DRB1*15 및 DRB4*01 또는 DRB5*0101을 발현하는 추가의 EBV-B 세포주를 시험하였다. 단지 DRB1*15를 발현하는 것만이 모두 MAGE-A1281-292펩티드를 클론 14에 제시할 수 있었다 (표 2).
실시예 2: 클론 14에 의한 다른 MAGE 단백질의 인식
여기에 기재된 MAGE-A1 HLA 결합 펩티드에 상동성인 펩티드 서열이 MAGE-A4를 포함한 다른 암 항원에서 발견된다. 예를 들면, MAGE-A4 펩티드: YVKVLEHVVRVNARVR (서열 번호 13) 및 LEHVVRVNARVRIAYP (서열 번호 14)가 합성되었다. CD4+T 세포 클론이 이러한 MAGE-A4 펩티드를 인식하는지의 여부를 결정하기 위하여, 펩티드를 사용하여 항원 제시 세포 (예컨대 EBV-B 세포)에 공급하고, 상기 기재된 분석법에 따라 클론 14에 의한 인식을 시험하였다. CD4+T 세포 클론이 추가의 암 관련 항원을 인식하는지의 여부를 결정하기 위하여, 재조합 단백질 (예, MAGE 단백질) 또는 이러한 단백질내의 상동성 영역에 상응하는 기타 합성 펩티드를 상기 기재된 바와 같이 사용한다. 클론 14에 의해 인식되는 상동성 펩티드는 여기에 기재된 MAGE-A1 펩티드의 기능적 변이체로서 간주될 수 있다.
본 발명의 다른 측면들은 당업자에게 명백할 것이므로 여기에 반복할 필요가 없을 것이다. 본 명세서에 인용된 각각의 참고문헌들은 그 전체가 참조를 위해 포함된 것이다.
사용된 용어 및 표현들은 발명을 제한하는 것이 아니라 설명을 위해 사용된 것이고, 이러한 용어 및 표현들이 여기에 개시 및 기재된 특징의 균등물 또는 그의 일부를 배제하려는 의도는 없으며, 본 발명의 범위내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인정된다.

Claims (75)

  1. 제2형 HLA 분자에 결합하는 서열 번호 2의 아미노산 서열의 단편, 또는 하나 이상의 아미노산 첨가, 치환 또는 결실을 포함하는 그의 기능적 변이체를 포함하는, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 단리된 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 단리된 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드.
  4. 제 2 항에 있어서, 단리된 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서, 단리된 펩티드가 엔도솜 표적 시그날을 포함하는, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드.
  6. 제 5 항에 있어서, 엔도솜 표적 시그날이 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함하는, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 단리된 펩티드가 비-가수분해성인, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드.
  8. 제 7 항에 있어서, 단리된 펩티드가 D-아미노산을 포함하는 펩티드, -psi[CH2NH]-환원된 아미드 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[COCH2]-케토메틸렌 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[CH(CN)NH]-(시아노메틸렌)아미노 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[CH2CH(OH)]-히드록시에틸렌 펩티드 결합을 포함하는 펩티드, -psi[CH2O]-펩티드 결합을 포함하는 펩티드, 및 -psi[CH2S]-티오메틸렌 펩티드 결합을 포함하는 펩티드로 구성된 군에서 선택된, 단리된 제2형 HLA 결합 펩티드.
  9. 단리된 MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 및 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 포함하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 및 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 폴리토프 폴리펩티드로서 조합되는 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 조성물.
  14. 제 9 항에 있어서, 단리된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 엔도솜 표적 시그날을 포함하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 엔도솜 표적 시그날이 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함하는 조성물.
  16. 제 1 항의 펩티드, 제 2 항의 펩티드, 제 3 항의 펩티드, 제 4 항의 펩티드 및 제 5 항의 펩티드로 구성된 군에서 선택된 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  17. 제 16 항에 있어서, 핵산이 서열 번호 12로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  18. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제 17 항의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  19. 제 18 항에 있어서, 핵산이 서열 번호 12로 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 발현 벡터.
  20. 제 18 항에 있어서, HLA-DRB1*15 분자를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 18 항의 발현 벡터, 제 19 항의 발현 벡터 및 제 20 항의 발현 벡터로 구성된 군에서 선택된 발현 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환된 숙주 세포.
  22. 제 18 항의 발현 벡터 및 제 19 항의 발현 벡터의 군에서 선택된 발현 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환되고, HLA-DRB1*15 분자를 발현하는 숙주 세포.
  23. 단리된 T 림프구 집단을, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드와 제2형 HLA 분자의 복합체를 해당 단리된 T 림프구 집단에서 CD4+T 림프구를 선택적으로 증가시키기에 충분한 양으로 제시하는 작용인자와 접촉시키는 것을 포함하는,
    T 림프구의 집단에서 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 대해 특이적인 CD4+T 림프구를 선택적으로 증가시키는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 작용인자가 MAGE-A1 단백질 또는 그의 제2형 HLA 결합 단편과 접촉시킨 항원 제시 세포인 방법.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 방법.
  26. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 SEQ ID NO;3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  27. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 SEQ ID NO;3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, MAGE-A1 단백질 또는 그의 제2형 HLA 결합 펩티드가 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함하는 방법.
  29. 환자로부터 단리된 생물학적 시료를 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 특이적인 작용인자와 접촉시키고,
    작용인자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드 간의 상호작용을 질병의 확인수단으로서 결정하는 것을 포함하는,
    MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병의 진단 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  33. 환자로부터 단리된 생물학적 시료를 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체에 결합하는 작용인자와 접촉시키고;
    복합체와 작용인자 간의 결합을 질병의 확인수단으로서 결정하는 것을 포함하는, 제2형 HLA 분자와 복합체를 형성하는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 발현을 특징으로 하는 질병의 진단 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1/13 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  37. 질병을 호전시키기에 충분한 양의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을 가진 환자의 치료 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 엔도솜 표적 시그날을포함하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 엔도솜 표적 시그날이 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함하는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  42. 제 40 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  43. 질병을 호전시키기에 충분한 양의 MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드와 충분한 양의 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을 가진 환자의 치료 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, MAGE-A1 제1형 HLA 결합 펩티드 및 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 폴리토프 폴리펩티드로서 조합되는 방법.
  45. 제 43 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 엔도솜 표적 시그날을 포함하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 엔도솜 표적 시그날이 인간 불변 사슬 Ii의 엔도솜 표적 부분을 포함하는 방법.
  47. 제 43 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  49. 제 47 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  50. 환자 내에서 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체의 존재를 선택적으로 증가시키는 작용인자를, 질병을 호전시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을 가진 환자의 치료 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  54. 제 50 항에 있어서, 작용인자가 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드를 포함하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 엔도솜 표적 시그날을 포함하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 엔도솜 표적 시그날이 인간 불변 사슬 Ii 또는 LAMP-1의 엔도솜 표적 부분을 포함하는 방법.
  57. 질병을 호전시키기에 충분한 양의, 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체에 대해 특이적인 자가 CD4+T 림프구를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, MAGE-A1의 발현을 특징으로 하는 질병을 가진 환자의 치료 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1/13 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  60. 제 58 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  61. MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 결합하는 제2형 HLA 결합 분자, 및 제2형 HLA 결합 분자에 의해 제시된 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 의해 자극되는 T 세포를 선별하는 단계;
    MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 첫번째 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 변이 펩티드를 제조하는 단계;
    제2형 HLA 결합 분자에 대한 변이 펩티드의 결합 및 제2형 HLA 결합 분자에 의해 제시되는 변이 펩티드에 의한 T 세포의 자극은 변이 펩티드가 기능적 변이체임을 지시하는 것으로 하여 제2형 HLA 결합 분자에 대한 변이 펩티드의 결합 및 T 세포의 자극을 결정하는 단계,
    를 포함하는, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 기능적 변이체를 동정하는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  63. 제 61 항에 있어서, 기능적 변이체에 의한 T 세포 자극의 유효성을 결정하는 확인수단으로서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 의한 T 세포의 자극과 기능적 변이체에 의한 T 세포의 자극을 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
  64. 서열 번호 7을 포함하는 에피토프를 가진 폴리펩티드에 선택적으로 결합하고, 단, 단리된 폴리펩티드가 제2형 HLA 분자가 아닌, 단리된 폴리펩티드.
  65. 제 64 항에 있어서, 단리된 폴리펩티드가 항체인 단리된 폴리펩티드.
  66. 제 65 항에 있어서, 항체가 단클론성 항체인 단리된 폴리펩티드.
  67. 제 64 항에 있어서, 단리된 폴리펩티드가 Fab 단편, F(ab)2단편, 또는 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드에 대해 선택적인 CDR3 영역을 포함하는 단편으로 구성된 군에서 선택된 항체 단편인, 단리된 폴리펩티드.
  68. 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체에 선택적으로 결합하는, 단리된 CD4+T 림프구.
  69. 제 68 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는, 단리된 CD4+T 림프구.
  70. 제 69 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 CD4+T 림프구.
  71. 제 69 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는, 단리된 CD4+T 림프구.
  72. 제2형 HLA 분자와 MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드의 복합체를 포함하는, 단리된 항원 제시 세포.
  73. 제 72 항에 있어서, 제2형 HLA 분자가 HLA-DRB1*15 분자이고, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 7로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는, 단리된 항원 제시 세포.
  74. 제 73 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항원 제시 세포.
  75. 제 73 항에 있어서, MAGE-A1 제2형 HLA 결합 펩티드가 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는, 단리된 항원 제시 세포.
KR1020017016231A 1999-06-18 2000-06-14 제2형 ｈｌａ 분자에 의해 제시되는 ｍａｇｅ-ａ1 펩티드 KR20020026461A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/336,091 1999-06-18
US09/336,091 US7157091B1 (en) 1999-06-18 1999-06-18 MAGE-A1 peptides presented by HLA class II molecules
PCT/US2000/016287 WO2000078806A1 (en) 1999-06-18 2000-06-14 Mage-a1 peptides presented by hla class ii molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020026461A true KR20020026461A (ko) 2002-04-10

Family

ID=23314524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017016231A KR20020026461A (ko) 1999-06-18 2000-06-14 제2형 ｈｌａ 분자에 의해 제시되는 ｍａｇｅ-ａ1 펩티드

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7157091B1 (ko)
EP (1) EP1224216B1 (ko)
JP (2) JP2003502079A (ko)
KR (1) KR20020026461A (ko)
CN (1) CN100354305C (ko)
AT (1) ATE453665T1 (ko)
AU (1) AU778449B2 (ko)
DE (1) DE60043620D1 (ko)
WO (1) WO2000078806A1 (ko)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7157091B1 (en) * 1999-06-18 2007-01-02 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A1 peptides presented by HLA class II molecules
EP1390387A4 (en) * 2001-04-20 2004-12-08 Ludwig Inst Cancer Res CANCER AND TESTICLE ANTIGENS
US7049413B2 (en) * 2001-05-18 2006-05-23 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules
US20030148973A1 (en) * 2001-05-23 2003-08-07 Peter Emtage MAGE-A1 peptides for treating or preventing cancer
US7758892B1 (en) * 2004-05-20 2010-07-20 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical devices having multiple layers
US8354380B2 (en) * 2004-06-17 2013-01-15 Mannkind Corporation NY-ESO-1 peptide analogs
SI1874819T1 (sl) * 2005-04-18 2015-09-30 Amgen Research (Munich) Gmbh Protitelesni nevtralizatorji humanega faktorja stimulacije kolonij granulocitov makrofagov
EP2476435B1 (en) * 2006-08-11 2017-12-20 Life Sciences Research Partners VZW Immunogenic peptides and their use in immune disorders
WO2008053573A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 National University Corporation Hokkaido University Remède pour néoplasme malin
JP5292550B2 (ja) * 2007-03-23 2013-09-18 静岡県 Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子及びα鎖遺伝子
TWI526219B (zh) 2008-06-19 2016-03-21 腫瘤療法 科學股份有限公司 Ｃｄｃａ１抗原決定位胜肽及含此胜肽的疫苗
GB0905519D0 (en) * 2009-03-31 2009-05-13 Biofortuna Ltd Assay method and device
CA2847332A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Mie University Vaccine preparation for cancer treatment
EP2872532A4 (en) 2012-07-10 2016-04-13 Oncotherapy Science Inc CDCA1-EPITOPPEPTIDES FOR TH1 CELLS AND VACCINES THEREWITH
FR3008099B1 (fr) 2013-07-05 2020-08-07 Commissariat Energie Atomique Peptides immunogenes de l'antigene tumoral cycline b1
NL2014935B1 (en) * 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
KR20180117227A (ko) 2016-03-24 2018-10-26 난트셀, 인크. 네오에피토프 제시를 위한 시퀀스들 및 시퀀스 배열들
CA3020058A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Adaptimmune Limited T cell receptors
CN106084042B (zh) * 2016-06-24 2020-01-14 安徽未名细胞治疗有限公司 一种全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗体及其应用
US11779637B2 (en) 2017-04-24 2023-10-10 Nantcell, Inc. Targeted neoepitope vectors and methods therefor
CN108948184B (zh) * 2017-05-22 2021-04-23 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别衍生自prame抗原短肽的t细胞受体
CN109400697B (zh) * 2017-08-17 2021-04-23 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别prame抗原短肽的tcr及其相关组合物
FR3087448B1 (fr) 2018-10-23 2023-10-13 Pdc Line Pharma Lignee pdc modifiee pour secreter une cytokine
FR3090319A1 (fr) 2018-12-21 2020-06-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d’epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1
US20200318068A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Immatics US, Inc. Use of retinoic acid in t-cell manufacturing

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541104A (en) 1991-05-23 1996-07-30 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies which bind to tumor rejection antigen precursor mage-1
US5405940A (en) 1992-08-31 1995-04-11 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nonapeptides derived from MAGE genes and uses thereof
US6222012B1 (en) * 1992-08-31 2001-04-24 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nonapeptides presented by HLA molecules, and uses thereof
AU702517B2 (en) 1993-08-06 1999-02-25 Epimmune, Inc. Cloning and characterization of the complete MAGE-1 gene
US5585461A (en) 1994-03-24 1996-12-17 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated, MAGE-3 derived peptides which complex with HLA-A2 molecules and uses thereof
US6951917B1 (en) 1995-09-26 2005-10-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services MHC-class II restricted melanoma antigens and their use in therapeutic methods
US6043347A (en) * 1996-10-10 2000-03-28 Probe International Inc. Compositions and methods for treating viral infections
US5965535A (en) * 1997-09-12 1999-10-12 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules
US7157091B1 (en) * 1999-06-18 2007-01-02 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A1 peptides presented by HLA class II molecules

Also Published As

Publication number Publication date
AU778449B2 (en) 2004-12-02
EP1224216B1 (en) 2009-12-30
JP2003502079A (ja) 2003-01-21
EP1224216A1 (en) 2002-07-24
ATE453665T1 (de) 2010-01-15
WO2000078806A1 (en) 2000-12-28
CN100354305C (zh) 2007-12-12
AU5736700A (en) 2001-01-09
CN1357006A (zh) 2002-07-03
DE60043620D1 (de) 2010-02-11
JP2008109928A (ja) 2008-05-15
JP4652390B2 (ja) 2011-03-16
US7157091B1 (en) 2007-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4652390B2 (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ１ペプチド
US7371845B2 (en) MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules
JP4102027B2 (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ３ペプチド
JP4106179B2 (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−３ペプチド
US7311914B2 (en) MAGE-A4 antigenic peptides and uses thereof
JP2003512057A (ja) Ｍａｇｅ−ａ１２抗原ペプチド及びその利用
US6716809B1 (en) Mage-A3 peptides presented by HLA class molecules
AU3237300A (en) Tyrosine kinase receptor epha3 antigenic peptides
US6897288B1 (en) Mage-A12 antigenic peptides and uses thereof
WO2000013699A1 (en) An antigenic peptide encoded by an alternative open reading frame of human macrophage colony-stimulating factor
AU2002339748A1 (en) MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application