KR20020016164A

KR20020016164A - 갈근 추출액을 활성성분으로서 포함하는알콜탈수소효소활성저해제 조성물

Info

Publication number: KR20020016164A
Application number: KR1020000049326A
Authority: KR
Inventors: 이장훈; 강철훈
Original assignee: 이장훈; 강철훈
Priority date: 2000-08-24
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2002-03-04

Abstract

본 발명은 한약추출물을 함유하는 알콜탈수소효소활성 저해제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알콜탈수소효소활성에는 저해성을 보이고, 알데히드탈수소효소 활성에는 영향이 없는 갈근추출농축액을 활성성분으로 포함하는 저해제 조성물에 관한 발명이다.

Description

갈근 추출액을 활성성분으로서 포함하는 알콜탈수소효소활성저해제 조성물{Alcohol dehydrogenase inhibitor composition comprising Puerariae radix extract}

본 발명은 한약추출물을 함유하는 알콜탈수소효소(alcohol dehydrogenase;이하 "ADH" 라 함)활성 저해제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알콜탈수소효소활성에는 저해성을 보이고, 알데히드탈수소효소(aldehyde dehydrogenase;이하"ALDH"라 함)활성에는 영향이 없는 갈근추출액을 활성성분으로포함하는 저해제 조성물에 관한 발명이다.

일반적으로, 알콜은 단순한 확산에 의하여 쉽게 세포막 사이를 이동하며, 혈액과 조직 사이에서 빠르게 평형을 이룬다. 구강이나 식도의 점막에서 소량 흡수되고, 위나 대장에서 일부가 흡수되며, 소장의 근위부에서 대부분 흡수된다. 흡수된 알콜의 2% 내지 10%는 직접 폐, 소변 혹은 땀을 통해서 배설되나, 대부분(90%이상)은 간에서 아세트알데히드로 대사 된다( 김원동 편저 : 내과학의 최신지견II, 서울, 한국의학, pp.143-155, 1998; 해리슨내과학편찬위원회편 : Harrison 내과학 한글I판, 서울, 정담, pp.1596-1609, 1997; 이방헌, 박경남 : Ethanol투여가 간장해에 미치는 영향, 대한내과학회지, 22(9): 714-724, 1979.). 간에서 대사되는 알콜의 섭취량이 증가할수록 간질환의 발생빈도도 증가한다(서울대학교 의과대학 내과학교실 : 최신지견내과학II, 서울, 군자출판사, pp.18-27, 1998).

알콜성 간질환은 알콜대사와 밀접한 관계가 있다. 체내의 알콜 대사는 주로 세 가지 효소 계에 의해 대사되는데, 알콜탈수소효소, 마이크로좀의 알콜 산화 효소군(microsomal ethanol oxidation system;이하'MEOS'라 함)과 카탈레이즈(catalase)에 의한 계가 있다.

알콜은 ADH에 의해 아세트알데히드로 산화되고 이는 알데히드탈수소효소에 의해 아세테이트로 산화된다. 이 과정에 있어 두 효소 모두 조효소 NAD⁺를 환원형인 NADH로 변환시켜 그 양이 증가하게 되는데, 간세포가 알콜을 분해할 수 있는 능력을 초과한 알콜을 섭취하게 되면, NADH/NAD⁺비가 크게 증가하게 되며, 이러한 상태는 독소나 약제에 의한 간손상의 감수성을 증가시킨다(김원동 편저 : 내과학의 최신지견II, 서울, 한국의학, pp.143-155, 1998;서울대학교 의과대학 내과학교실 : 최신지견내과학II, 서울, 군자출판사, pp.18-27, 1998). 알콜 대사과정에서 생성된 아세트알데히드와 대사과정에서 증가된 NADH/NAD⁺비율은 알콜 독성의 직접적인 원인이 되며, 영양장애, 중추신경계장애, 소화기 장애, 심혈관계장애, 생식비뇨기장애, 근골격계장애 등 인체 전반적인 장애를 유발하게 되고 특히 간 손상의 중요한 원인이 된다고 보고되어 있다. 알콜 대사과정에서 생성되는 NADH와 아세트알데히드를 처리하기 위해 간내 대사과정이 한 방향으로만 계속됨으로써 지방산 산화가 억제되어 지방이 축적되며, 젖산 생성 증가, 요산 생성 증가, 케오에시도시스(ketoacidosis), 및 저혈당 등이 나타나게 된다. 또한, 대사항진 상태가 유발되어 간내 저산소증 상태가 발생되고 특히 세정맥 주위 저산소증(perivenular hypoxia)이 심하게 발생된다. ADH가 분해할 수 있는 양을 초과한 알콜 섭취 후에는 MEOS가 활성화되는데 MEOS경로에 의한 알콜 대사 중에는 NADPH가 보조인자로 사용되며 이 과정에서 유리산소기 독성 free radical을 만들게 되고, 처리되지 못한 중간 대사산물인 아세트알데히드는 지방의 과산화(peroxidation)촉진, 소정맥주위 공간에 교원질(collagen)형성의 증가와 미토콘드리아호흡의 억제, 비타민 B₆대사의 변화, 여러 간세포내 단백질과의 아세트알데히드 단백질 부가물(adduct)을 형성하고 세포막을 변형시켜 세포독성을 나타내고 간의 심각한 기능 및 구조장애를 초래하게 되며, 또한 독소나 약제에 의한 간손상의 감수성이 증가하게 된다.

따라서 아세트알데히드의 혈중농도와 NADH/NAD⁺의 비율을 교정하는 것이 일반적인 치료의 관건이라 할 수 있다.

알콜탈수소효소에 대한 저해제로는 활성원자단으로서 기질에 작용하는 효소의 -SH기를 실활시키는 p-chloromercuribenzoate, N-ethylmaleimide, iodoacetate 유도체 등이 알려져 있고, 알콜탈수소효소저해제에 대한 특허는 미국특허 제 4,020,070호에서 알킬기로 치환된 6-클로로-2-싸이오우라실화합물이 알려져 있다. 그러나 이러한 저해제들은 알콜탈수소효소에 특이적인 저해성을 나타내는 것이 아니라, 생리적으로 중요한 효소를 포함한 -SH를 가진 많은 화합물의 비특이적 저해제로 광범위한 저해성을 나타내므로, 독성 등을 나타낼 수 있어서 안전성에 대한 문제점을 가질 수 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기한 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 알콜탈수소효소 활성에 대한 저해물질을 함유하고 있는 한약추출물을 제공하는 것이다.

도 1은 알콜탈수소효소에 대한 갈근의 저해효과에 대한 그림.

도 2는 알데히드탈수소효소에 대한 갈근의 저해효과에 대한 그림.

도 3은 갈근의 HPLC 프로파일에 대한 그림.

도 4는 갈근의 HPLC 실험의 튜브에 대한 알콜탈수소효소의 활성에 대한 그림.

도 5는 부분정제된 갈근의 알콜탈수소효소에 대한 정량의존적인 저해를 보여주는 그림.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈근 추출액을 활성성분으로서 포함하는 알콜탈수소효소활성저해제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

인간 ADH는 두 단백질 단위체의 다이머로 구성되어 있고, class I ADH는 알파, 베타 및 감마 단위체가 호모와 헤테로다이머 아이조자임으로 연결되어 있고, class Ⅱ,Ⅲ 및 Ⅳ는 호모다이머의 형태만을 갖는다.

또, ALDH는 에탄올대사경로의 두 번째 단계를 촉매하는 효소로, ADH와 마찬가지로 다양한 형태로 존재한다.

본 발명에 사용된 재료는 표 1과 같다.

<표 1> 본 발명에 사용된 한약의 생약명 및 학명

한약명	생 약 명	학 명
갈근	Puerariae Radix	Pueraria lobata(Willd.) Ohwi
갈화	Puerariae Flos	Pueraria lobata(Willd.) Ohwi
인삼	Giseng Radix	Panax ginseng C.A. Meyer
인진	Artemisiae Capillaris Herba	Artemisia capillaris Thunb.
적양	Alny Cortex et Ramulus	Alnus japonica Sieb. et Zucc.
지구자	Hoveniae Semen	Hovenia dulcis Thunb.
진피	Aurantii Nobilis Pericarpium	Citrus Unshiu Makino
창이자	Xanthii Fructus	Xanthium strumarium L.

본 발명에 사용한 약재 중 갈근(葛根), 갈화(葛花), 인진(茵蔯), 인삼(人蔘), 진피(陳皮), 창이자(蒼耳子)는 경희의료원 한방병원 약제과에서 구입하고, 지구자와 적양(赤楊)은 경동시장에서 구입하여 경희대학교 본초학 교실에 의뢰하여 엄선한 후 사용하였다.

본 발명에 사용된 동물은 중앙동물사육장에서 공급받은 Sparague Dawley계의 웅성 흰쥐를 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후, 체중이 180∼220g에 해당하는 건강한 동물만을 골라 평균체중 및 분산이 균등하게 되도록 분배하고 실험을 시작하였다. 사료는 삼양유지사료(주)의 고형사료를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 식수는 증류수를 충분히 공급하면서 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험실 온도는 24±2℃이었다.

한편, 한약재가 알콜성 간손상에 미치는 역할을 관찰하기 위해 쥐 12마리를 1군으로 하여 대조군과 실험군으로 삼고 실험군에는 상기의 검액 400mg/ kg를 24시간에 한번씩 오후 1시에 3주간 투여하였다. 또한 각 군을 양분하여 한 군은 알콜 투여가 없는 상태에서 혈액을 취하고, 다른 군은 알콜이 투여된 상태에서 혈액을 취하여 검액 및 알콜의 유무에 따른 간손상의 정도를 평가하고자 하였다. 알콜은 30% 알콜 25ml/1kg을 하루에 1회, 3주간 투여하였다. 한약의 투여시 알콜은 동시에 투여하였다. 3주 후 쥐를 클로로포름으로 마취한 후, 심장에서 주사기로 혈액을 취하여 EDTA를 함유한 시험관에 옮기고, bench-top 원심분리기를 이용하여(15,000rmp)혈청을 준비하였다.

이하, 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: 검액의 조제

상기 표 1의 한약재 각 600g을 3차 증류수 10ℓ로 2시간 동안 2회 환류추출한 후 면으로 여과하여 그 남은 액을 80℃ 물 중탕 위에서 감압 농축하고, 동결건조기(Christ LDC-1, Alpha/4, Germany)를 이용하여 건조추출물을 얻었고 대체로 15∼20%의 수율을 보였다. 동결건조한 추출물을 일정량의 물에 용해한 후 알콜의 대사와 간보호작용에 관한 각 약물의 기전 연구에 사용하였다.

실시예 2: 알콜 대사효소에 대한 작용평가

1) 알콜탈수소효소에 대한 저해 활성 검사

동결 건조된 Alcohol dehydrogenase(Sigma Co.)를 구입하여 1mg을 0.1% albumin(bovine serum albumin)을 함유한 0.1M sodium phosphate (pH 7.5)에 녹이고 활성을 조사하여 약 0.01Unit를, NAD(7.5mM)과 에탄올(0.33M)을 함유한 Tris-Lys 1ml 용액(pH 9.2)에 더하여 UV spectro-photometer를 이용하여 340nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 한약의 존재 하에서 이 값이 감소하는 정도를 측정하여 이 효소의 활성에 관한 한약의 저해효과를 검사하였다. 한약물이 ADH의 활성을 저해하는 정도를 정량적으로 조사하기 위하여 상기의 조건을 유지하며 약재의 양을 점차 증가시키며 잔류 효소활성을 조사하였다. 이 결과에서 잔류활성이, 약물이 없을 때의 활성의 반값이 되도록 하는 약물의 양을 Ki, app라 정의하고 hyperbolic한 형태의 식을 모델로 이 값을 정하였다. 이 값이 작을수록 적은 양의 약물로도 활성의 억제가 일어남을 의미한다.

ADH효소활성을 분광기를 이용하여 측정한 결과 본 연구의 경우, 1.50mUnit/ml의 활성을 보였다. 하지만 이 값은 다음과 같은 한약물의 존재하에서(200-400㎍/ml) 감소하였다. 이는 각 한약물들이 ADH의 저해제를 함유하고 있으며 체내에서 알콜의 분해를 지연시킬 것이라는 것을 의미한다(표 2참조).

[표 2] 알콜탈수소효소에 대한 한약들의 효과

시료	활성	비
대조군	1.50 mUnit/ml	1
갈근	0.116 mUnit/ml	0.0771
인진	0.294 mUnit/ml	0.194
창이자	0.806 mUnit/ml	0.537
진피	0.578 mUnit/ml	0.385
인삼	1.19 mUnit/ml	0.790
갈화	0.369 mUnit/ml	0.246
적양	0.818 mUnit/ml	0.545
지구자	1.03 mUnit/ml	0.685

여기서 적양과 지구자 시료는 400㎍/ml을 사용하였고, 나머지는 200㎍/ml을 사용하였다. 본 실시예에서 갈근, 인진, 갈화, 진피는 각기 ADH 활성도를 초기의 7.71, 19.4, 24.6, 38.5%로 감소시켜 알콜로부터 아세트알데히드의 생성을 억제하는 효과가 있음을 보여주었으며, 창이자, 인삼, 적양, 지구자는 ADH의 활성을 각기 53.7, 79.0, 54.5, 68.5%로 감소시켜 ADH 활성도에 관한 저해효과가 상대적으로 미미한 것으로 나타났다. 인삼 등도 임상과 동물실험에서 숙취에 도움을 준다고 알려져 있지만 상기의 결과는 이들의 주된 효과가 ADH의 활성에 관한 영향 때문은 아닌 것으로 보여주었다. 이러한 한약물의 ADH 활성 저해효과는 체내의 아세트알데히드의 농도를 낮추어 알콜에 의한 독성을 감소시킬 수 있을 것이다. 이러한 저해과정이 한약물 내 특별한 화합물이 존재하기 때문인지 아니면 비특이적 저해작용인지를 연구하기 위하여 용량의 변화에 따른 저해정도를 조사하여 그 작용이 강하게 나타난 갈근을 대표적으로 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이 갈근의 ADH 활성에 관한 효과는 갈근의 농도 증가에 따라 역함수적으로 감소함을 보여주고 있으며 이는 갈근내에 특정한 화합물이 ADH 효소의 저해작용을 유발하고 있음을 보여주고 있다. 도 1에서 갈근의 ADH의 활성도에 관한 외형적인 활성저해상수는 약 22.7±2.1㎍/ml이며 이 농도에서 ADH의 활성은 초기의 반으로 감소한다.

한편, 다른 약제에 관한 결과들이 표 3에 요약되어 있다.

<표 3> 알콜탈수소효소활성에 대한 한약들의 효과

시료	Ki,app*
갈근	22.7 ± 2.1 ㎍/ml
갈화	317 ± 18 ㎍/ml
인진	163 ± 40 ㎍/ml
진피	276 ± 38 ㎍/ml

표 3에서 Ki,app는 초기의 활성도가 반감되게 하는 약물의 농도로 정의되었고 통계적인 값은 hyperbolic한 식에 적용하여 결정되었다.

표 3에서, 인진은 163±40g/ml로 비교적 갈근과 근사한 값을 가지며, 갈화와 진피는 각각 317±18μg/ml와 276±38μg/ml로 그 효과가 미약하게 나타났다. 인삼 등 다른 약재들은 표 2의 결과로 미루어 이 값이 매우 클 것으로 예상되어 값을 측정하지 않았다.

2) 아세트알데히드탈수소효소에 대한 저해 활성 검사

40μM 아세트알데히드, 2mM NAD(Hepes 50mM, pH 7.5)에 알세트알데히드탈수소효소(Beohringer Mannheim Biochemicals.) 0.01Unit를 넣어 반응을 진행시킨 다음, 효소반응의 진행을 340nm에서 흡광도의 증가를 측정하였다. 한약물의 존재하에서 같은 방법으로 얻어진 활성도와 비교하여 효소 활성의 저해 효과를 측정하였다. 효소에 대한 약물의 저해상수, Ki,app는 ADH의 경우와 유사하게 측정하였다.

ALDH 효소활성을 측정한 결과 2.12mUnit/ml의 활성을 보였다. 각 한약물의 존재하에서(200㎍/ml) 활성도는 다음과 같이 관측되었다. 이 중 인진, 갈화, 갈근은 초기 ALDH 활성도를 4.20, 19.7, 23.6%로 감소시켰으며 창이자, 진피, 인삼, 적양, 지구자 등은 각기 47.3, 43.6, 87.8, 54.2, 65.5%의 활성도를 보여주었다. 따라서 인진, 갈화, 갈근은 알콜의 대사의 부산물인 아세트알데히드의 분해를 억제시키며 다른 약재는 그 효과가 미미하였다(표 4참조).

<표 4> 아세트알데히드탈수소효소활성에 대한 한약의 효과

시료	활성	비율
대조군	2.12 mUnit/ml	1
갈근	0.500	0.236
인진	0.0890	0.042
창이자	1.00	0.473
진피	0.924	0.436
인삼	1.86	0.878
갈화	0.428	0.197
적양	1.15	0.542
지구자	1.39	0.655

3) 알콜탈수소효소와 아세트알데히드탈수소효소에 미치는 상대적인 효과

알콜에 의한 독성을 연구하기 위하여 한약물이 ADH와 ALDH에 미치는 효과를 조사하였다. 본 발명에서의 주된 관심사는 아세트알데히드의 혈액내 축적을 방지하는 효과이다. 따라서 체내의 아세트알데히드의 농도를 낮게 유지시키기 위해 ADH의 활성을 저해하고 ALDH의 활성을 증가, 혹은 적게 감소시키는 효과를 가지는 약재가 바람직하다. 따라서 in vitro 실험에서의 약재에 관한 평가는 ALDH에 대한 활성저해효과를 ADH에 대한 활성저해효과로 나눈 값으로 비교하였다. 이 비율이 높을수록 아세트알데히드의 체내 축적을 방지하는 것이다. 본 발명에 사용된 약물이 아세트알데히드의 농도에 미치는 영향을 고려하기 위하여 각 약물이 ADH와 ALDH에 미치는 영향을 동시에 고려하여야 한다. 따라서 본 연구에서는 두 효소에 미치는 영향의 상대치로 아세트알데히드에 미치는 영향을 추측하였다(표 5참조).

<표 5> 알콜탈수소효소와 알데히드탈수소효소에 대한 한약의 상대적 효과

시료	비(ADH/ALDH)
대조군	1
갈근	3.06
인진	0.214
창이자	0.881
진피	1.13
인삼	1.11
갈화	0.801
적양	0.994
지구자	0.958

표 5에서 오른쪽 숫자는 아세트알데히드탈수소효소의 활성도를 알콜탈수소효소의 활성도로 나눈 값이다. 즉 아세트알데히드의 생성과 분해에 관한 상대적인 값이다. 시료가 없을 경우를 1.00으로 하고 1보다 큰 값은 분해가 활발하고 1보다 작은 값은 생성이 활발하다. 이중 갈근은 3.06으로 아세트알데히드의 분해속도가 매우 활발하며, 진피 및 인삼은 각기 이 값이 1.13과 1.11로 생성보다는 분해가 약간 우세하게 나타났다. 창이자, 갈화, 적양, 지구자는 각각 0.881, 0.801, 0.994, 0.958로 오히려 생성이 우세하였다. 인진은 이 값이 0.214로 생성이 압도적으로 우세하였다. 상기의 한약물이 ADH에 미치는 저해효과(아세트알데히드의 생성속도 지연)와 ALDH에 미치는 효과를 종합하면, 갈근이 체내의 아세트알데히드의 농도를 감소시키는데 크게 기여할 수 있고 인진의 경우 오히려 아세트알데히드의 분해를 억제하는 효과가 있음을 보여주고 있다.

ALDH에 대한 갈근의 농도의존도를 도 2에 요약하였다. 도 1과 비교하여 보면 갈근의 농도가 증가하더라도 ALDH의 활성에는 거의 영향을 미치지 않고 있음을 보여주고 있다(Ki,app=1.15±0.07mg/ml). 위의 결과와 다른 약물에 관한 용량 효과는 표 6에 정리되어 있다.

<표 6> 아세트알데히드탈수소효소에 대한 한약의 효과

시료	Ki,app
갈화	220 ± 43 ㎍/ml
갈근	1150 ± 70 ㎍/ml
진피	359 ± 45 ㎍/ml
인진	651 ± 47 ㎍/ml

실시예 3: 알콜탈수소효소와 아세트알데히드탈수소효소의 활성저해물질의 분획 및 분리 탐색.

1) Sep-Pak에 의한 고체상 분리법에 의한 분획 :

표 5의 ADH/ ALDH 비율에서 갈근이 효율성이 가장 높게 나타났고 다음으로 진피 및 기타 약재였지만, 갈근에서의 비율과 진피에서의 비율도 큰 차이가 있었다. 또한 기타 약재들은 진피보다도 그 효율성이 낮은 편이었으므로 분획 실험은 갈근과 진피 두 가지의 약재에만 실시하였다. 갈근과 진피의 Sep-Pak을 이용한 고체상 분리에 의한 분획에 따른 각 분획물의 ADH 활성억제 현상은 표 7과 같았고, 그 실험방법은 다음과 같았다.

C¹⁸Sep-Pak(Waters Co.)을 10ml의 메탄올로 처리하여 활성화시키고 10ml의 증류수로 씻어준다. 200㎍의 시료를 1ml의 증류수에 녹여 Sep- Pak 필터에 흡착시키고 다음과 같은 용매로 씻어낸다.

1. 1ml의 물

2. 1ml의 30 % 메탄올

3. 1ml의 50 % 메탄올

4. 1ml의 70 % 메탄올

5. 1ml의 100 % 메탄올

각각의 용액을 튜브에 받고 5㎕를 ADH와 ALDH의 활성측정에 사용하였다.

<표 7> Sep-Pak에서 나온 갈근과 진피분획의 알콜탈수소효소활성에 대한 저해효과

과정	갈근(%)^*	진피(%)^*
시료 로딩	85.4	62.0
물	101	70.0
30 % 메탄올	75.3	49.0
50 % 메탄올	78.4	31.5
70 % 메탄올	93.0	64.2
100 % 메탄올	102	73.0

표에서 "*"는 아무런 시료가 없을 때의 활성도에 관한 %를 의미한다.

위의 결과에서, 진피는 활성 저해물질이 50%의 메탄올에 의해 나오고 있지만 이 활성이 전 범위에서 일정정도 나타났다. 하지만 갈근은 30과 50%의 메탄올에 의해 가장 많은 활성저해효과가 나타나, ADH의 활성저해 물질이 효율적으로 분리될 수 있을 것으로 보여졌다. 각 약재의 ALDH 활성저해효과는 전 범위에서 미약하게 나타났다.

2) 유기용매에 의한 추출 :

10g의 분말을 100ml의 증류수에 녹여 상온에 2시간 방치한 후 원심분리기로 침전물을 제거하였다. 그 상층액(100ml)을 분액깔데기에 넣고 CHCl₃300ml로 교반하여 분리하여 각층의 활성도를 측정하였다. CHCl₃에서 얻어진 상층액 20ml에 물 80ml를 더하고 분액깔데기에서 교반하여 유기층과 물층을 분리하여 효소활성에 미치는 영향을 측정하였다.

클로로포름의 경우, 갈근과 진피 모두 CHCl₃에 의한 분획에서 ADH활성저해물질이 물층에만 용해되어 있었다(표 8참조).

<표 8> 클로로포름추출의 유기층과 수층에서 알콜탈수소효소활성에 대한 효과

	갈근(mUnit/ml)	비율^*	진피(mUnit/ml)	비율^*
유기층(25㎕)	1.43	1	1.35	1
물층(5㎕)	0.250	0.175	0.547	0.405

표 8에서 비율은 각 유기층 25㎕의 존재하에서의 ADH활성도를 기준으로 한 값이다.

한편, n-부탄올을 이용한 분획의 경우에는 갈근은 n-부탄올에 의해 유기층으로 ADH의 활성저해물질이 많이 분포하였고, 진피는 물층과 유기층으로의 분획이 이루어지지 않았다(표 9참조).

<표 9> n-부탄올추출의 유기층과 수층에서 알콜탈수소효소활성에 대한 효과

	갈근(mUnit/ml)	비율	진피(mUnit/ml)	비율
유기층(25㎕)	0.361	0.301	0.598	1.15
물층(25㎕)	1.20	1	0.52	1

3) HPLC에 의한 분리실험 :

물층과 유기층에서 얻어진 시료를 0.45㎛의 필터(Waters Co.)로 거른 후 C¹⁸역상의 HPLC 컬럼을 이용하여 사용하였다. 분리실험에서는 photodiode arraydetector(Waters 996 Photodiode Array Detector), auto sampler(Waters 717_plusAutosampler)와 Waters 600 controller를 장착한 HPLC system을 이용하였다. Column은 μBondpak^TMC¹⁸Column(7.8×300mm, Water)을 사용하였고, 물과 아세토나이트릴의 혼합물을 다음과 같은 비율로 gradient program을 이용하였다.

분획된 시료를 20㎕를 HPLC에 주입하여 220nm에서의 흡광도를 측정하여 profile을 만들었으며. 분리를 목적으로 할 때에는 200㎕를 사용하여 5분 간격으로 모아 감압 상태에서 용매를 제거하고 알콜에 녹여 ADH와 ALDH 효소활성에 미치는 영향을 측정하였다. HPLC에서 속도는 2ml/분으로하였고, 시간에 따른 용매의 gradient(물 : Acetonitrile 비율(%))는 처음은 90:10, 0∼5분은 90:15, 5∼30은 50:50 , 30∼80은 0:100, 80∼120은 90:10이었다.

HPLC에 의한 분리실험은 갈근 등 약재의 ALH 및 ALDH의 저해물질이 같은 화합물에 의한 활성인지 아니면 다른 화합물들에 의한 저해활동인지를 조사하기 위해서 행하여졌고, 이 실험을 통하여 저해활성을 나타내는 물질의 분리가 가능한지의 여부를 조사할 수 있다. 갈근의 분획중 n-부탄올층에 녹아나온 성분들의 HPLC 프로파일은 각 피크들이 매우 잘 분리된 상태로 나타났으며(도 3), 도 4에 나타난 바와 같이 ADH의 활성은 약 32-38분 사이에 분리되어 나옴을 확인할 수 있었다. ALDH의 활성저해 효과는 본 실험의 농도에서는 검출되지 않았다. 따라서 Sep-Pak의 결과와 같이 비교적 혐수성이 강한 ADH 저해제의 존재를 알려주고 있다. 그러므로 갈근에서의 ADH 활성저해물질은 물전탕 용액을 n-부탄올로 분획하고 혐수성 크로마토그래피로 분리를 한후 HPLC로 분리가 가능하다.

4) 부분 정제된 갈근의 ADH 활성저해 물질의 특징

HPLC에서 부분적으로 정제된 갈근 분획물로 ADH의 활성저해의 특성을 분획물의 량을 증가함에 따른 잔류 ADH 활성도를 측정하였다. 그 결과가 도 5에 보여지고 있다. 도 5는 ADH의 저해효과가 갈근 분획물에 관하여 시그모이들(sigmoidal)형태의 저해현상을 보이고 있다. 이는 갈근의 전탕액으로 유사한 방법으로 조사한 도 1에 나타난 결과와 다른데 이는 이전의 결과가 정제되지 않은 전탕액을 사용하였기 때문으로 생각된다.

도 5의 결과는 갈근의 한 성분이 ADH에 대해 2분자가 상호작용하여 그 활성을 저해하고 있음을 보이고 있다. 즉 이 화합물이 효소에 협동적으로 결합하여 효소활성을 억제하고 있는데 이는 이 효소가 네 개의 같은 단위가 모여 기능을 하며 활성에 있어서 두 개처럼 행동하기 때문으로 보인다.

실시예 4: 알콜로 유발된 간대사 기능 장애에 미치는 영향

1) 포도당에 대한 효과

갈근, 진피, 인진의 유무와 알콜의 유무가 혈액 중 포도당 수치에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 표 10에 요약하였다. 그 실험방법은 다음과 같다. 혈중 포도당의 함량은 hexokinase와 glucose-6-phosphate dehydrogenase의 두 효소가 동시에 존재하는 상태에서 포도당의 양을 NADH로 환원시켜 관찰하였다(Stein M.W.: In Methods of Enzymatic Analysis. HU Bergmeyer, Editor, Academic Press, New York, p.117, 1963). 이를 위하여 Sigma Glucose Assay Kit(Sigma Co.)를 이용하였고 Sigma에서 제공된 용액 1ml에 10㎕의 준비된 혈장을 더하여 25℃에서 5분간 방치한 후 340nm에서의 흡광도의 변화를 측정하여 포도당의 양으로 환산하였다. 정상군의 포도당 수치는 45.4±5.7mg/dL였으며, 알콜 투여군에서는 26.1±4.8mg/dL로 약 42.5% 감소하였다. 갈근과 알콜의 동시 투여군에서는 포도당 수치가 47.9±6.9mg/dL로 정상치와 비슷하게 회복되었다. 진피와 인진의 경우도 포도당 수치가 각각 31.9±2.4, 40.3±2.7mg/dL로 유의성 있게 회복되었다.

<표 10> 갈근, 진피 및 인진의 혈장 포도당 수치에 대한 효과

군	동물 수	혈중 포도당 수치(mg/dL)
A	6	45.4 ± 5.7^a)
B	6	26.1 ± 4.8^#
C	6	47.9 ± 6.9^****
D	6	31.9 ± 2.4^*
E	6	40.3 ± 2.7^****

상기 표에서, a)는 평균 ± 표준편차이고, #는 A와 B를 비교한 통계적 유의성(#;p<0.005), *는 B군과 비교한 통계적 유의성(*;p<0.05, **;p<0.01, ***;p<0.005, ****;p<0.001)이다. 또 표에서 A는 대조군, B는 알콜처리군, C는 알콜과 갈근처리군, D는 알콜과 진피처리군이며, E는 알콜과 인진처리군이다.

2) 트리글리세라이드에 대한 효과

트리글리세라이드의 함량측정은 혈청 내 트리글리세라이드를 리파제를 이용해 글리세롤로 전환시키고 이를 글리세롤 카이네이즈에 의해 인산화를 수행하여 glycerol-1-phosphate와 ADP를 생성하게 한다. 생성된 ADP를 pyruvate kinase와 lactate dehydrogenase를 이용하여 NAD의 환원반응과 연계시키는 효소법(BucoloG., David H., Clin. Chem. 19: 476, 1973)을 사용하였다. 이 경우 triglyceride는 생성된 NADH의 양과 같게 된다. 이에 따라 Sigma Triglyceride Assay Kit(Sigma Co.)를 이용하여 혈액 내의 triglyceride의 양을 측정하였다. Sigma에서 제공된 반응용액 1ml에 20㎕의 준비된 혈장을 넣고 10분 후 340nm에서의 흡광도의 차이를 측정하여 이를 트리글리세라이드의 양으로 환산하였다.

혈액 중 트리글리세라이드 수치를 측정한 결과 정상군에서 58.3±8.2mg/dL였으며, 알콜의 투여군에서는 87.6±11.0mg/dL로 49.5% 가량 증가하였다. 갈근과 알콜의 동시 투여군에서는 54.4±10.0mg/dL로 유의성있게 감소하였다. 진피의 경우는 82.4±13.1mg/dL로 알콜 투여군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었고, 인진은 68.3±10.0mg/dL로 알콜 투여군에 비하여 유의성있게 감소하였다 (표 11참조).

<표 11> 혈장 트리글리세라이드에 대한 갈근, 진피 및 인진의 효과

군	동물수	혈장 TG 값(mg/dL)
A	6	58.3 ± 8.2^a)
B	6	87.6 ± 11.0#
C	6	54.4 ± 10.0****
D	6	82.4 ± 13.1
E	6	68.3 ± 10.0***

3) 혈 중 뇨질소(Urea Nitrogen)에 대한 효과

Urease 10 Unit가 포함된 75mM sodium phosphate 완충용액(pH 7.0) 1ml에 혈청 30㎕를 넣어 반응을 시킨 다음, 생성된 NH₃를 phenolhypochlorite로 반응시켜 450nm에서의 흡광도를 측정하여 혈청 내에 있는 요소 질소의 양을 정하였다.

약재와 알콜의 유무가 혈액 중 요소 질소 수치에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 표 12에 요약하였다. 정상군의 요소 질소 수치는 26.6±2.6mg/dL이며, 알콜 투여군에서는 33.7±4.4 mg/dL로 약 27%의 증가를 보여주고 있다. 갈근과 알콜의 동시 투여군에서는 질소 값이 24.4±2.5mg/dL으로 정상군의 수준으로 회복되고 있음을 보여주고 있다. 진피 투여군에서는 30.3±2.9mg/dL으로 유의성 있는 효과가 인정되지 않았고, 인진 투여군에서는 24.8±2.6mg/dL로 나타나 유의성있는 효과가 인정되었다.

<표 12> 혈장 요 질소 수치에 대한 갈근 등의 효과

군	동물 수	혈장 요소 수치(mg/dL)
A	6	26.6 ± 2.6^a)
B	6	33.7 ± 4.4^#
C	6	24.4 ± 2.5^****
D	6	30.3 ± 2.9
E	6	24.8 ± 2.6^****

실시예 5: 알콜로 유발된 간세포손상에 미치는 영향

1) 혈중 AST에 미치는 효과

한약물의 유무와 알콜의 유무가 혈액 중 AST 수치에 미치는 영향을 조사하였다. Aspartate aminotransferase(AST)의 활성은 1ml의 L-aspartate 200 mM, 2-oxoglutarate 12mM, malate dehydrogenase 600Unit/L, NADH 0.25mM이 함유된 Hepes 완충용액(pH 7.8)에 100㎕의 혈청을 더하여 340nm에서의 흡광도의 시간당 감소율로 측정하였다. 그 결과를 표 13에 요약하였다. 정상군의 AST 수치는 48.5±5.6Unit/mL이며, 이 값은 알콜 투여군의 경우 83.6±7.5Unit/mL로 약 72%의 증가를 보여주고 있다. 갈근과 알콜이 투여된 상태에서는 AST 수치는 53.2±8.4Unit/mL로 거의 정상에 가깝게 유의성있는 회복을 나타내었다. 진피와 인진는 각각의 AST level이 75.4±6.8Unit/mL와 58.2±6.7Unit/mL로 나타나, 인진은 간보호에 유의성 있는 효과가 있었으나 진피는 유의성이 없었다.

<표 13> 혈장 AST 수치에 대한 갈근, 진피 및 인진의 효과

군	동물 수	혈장 AST 수치(Unit/mL)
A	6	48.5 ± 5.6^a)
B	6	83.6 ± 7.5^#
C	6	53.2 ± 8.4^****
D	6	75.4 ± 6.8
E	6	58.2 ± 6.7^****

2) 혈중 ALT에 미치는 효과

한약물이 알콜의 유무에 따라 혈액 중 ALT 수치에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 표 14에 요약하였다. Alanine aminotransferase(ALT)의 활성은 1ml의 L-alanine 400mM, 2-oxoglutarate 12mM, lactate dehydrogenase 2,000Unit/L, NADH 0.25 mM이 함유된 Hepes 완충용액(pH 7.4)에 100㎕의 혈청을 더하여 340nm에서의 흡광도의 시간당 감소율로 측정하였다.

정상군의 ALT 수치는 18.5±2.3Unit/mL이며, 이 값은 Alcohol 투여군에서 35.4±5.6Unit/mL로 증가하여 약 91%의 증가를 보여주고 있다. 갈근과 알콜을 동시에 투여한 군에서는 ALT 수치는 20.7±3.1Unit/mL로 뚜렷한 회복효과를 보였다. 알콜 존재하에서 진피와 인진의 ALT 수치는 각각 30.3±3.7Unit/mL와 23.6±4.3Unit/mL로 나타나, 인진은 간보호작용이 있음을 보였으나 진피는 유의성이 없었다. AST에 대한 실험에서와 마찬가지로 인진은 알콜대사에는 직접적인 영향을 주지 않고 있으나 간보호작용에 유의성있는 효과를 나타내고 있다.

<표 14> 혈장 ALT 수치에 대한 갈근, 진피 및 인진의 효과

군	동물 수	혈장 ALT 수치 (Unit/mL)
A	6	18.5 ± 2.3^a)
B	6	35.4 ± 5.6^#
C	6	20.7 ± 3.1^****
D	6	30.3 ± 3.7
E	6	23.6 ± 4.3^***

상기 표에서, a)는 평균 ± 표준편차이고, #는 A와 B를 비교한 통계적 유의성(#;p<0.005), *는 B군과 비교한 통계적 유의성(*;p<0.05, **;p<0.01,***;p<0.005, ****;p<0.001)이다. 또 표에서 A는 대조군, B는 알콜처리군, C는 알콜과 갈근처리군, D는 알콜과 진피처리군이며, E는 알콜과 인진처리군이다.

상기와 같은 구성의 본 발명의 갈근추출물은 알콜탈수소효소의 활성을 뚜렷이 억제하였으나, 아세트알데히드탈수소효소의 활성도에는 상대적으로 영향을 미치지 않아서, 알콜성독성물질 제거에 큰 효과가 있고, 알콜로 인하여 변화된 혈중 포도당, 트리글리세라이드 등의 수치를 정상치로 유의성있게 회복시켰으며, 알콜에 의하여 증가된 혈중 AST와 ALT 수치는 유의성있게 감소시키는 효과가 있다.

Claims

갈근 추출액을 활성성분으로서 포함하는 알콜탈수소효소활성저해제 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기의 갈근 추출액은 물 또는 부탄올 용매에 의해 추출된 것을 특징으로 하는 알콜탈수소효소활성 저해제조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기의 갈근 추출액은 용매추출 후 HPLC에 의해 정제되는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 알콜탈수소효소활성 저해제조성물.