KR20020011972A - Ａｋｔ 핵산, 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 Akt3 단백질 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람 Akt3을 암호화하는 분리된 핵산, 이를 함유하는 벡터 및 이의 치료적 용도, 구체적으로 유전자 요법의 치료적 용도에 관한 것이다. Akt3의 발현은 저산소증, 어팝토시스 또는 괴사와 관련된 세포 사멸을 억제한다.

Description

Ａｋｔ 핵산, 폴리펩타이드 및 이의 용도 {Akt nucleic acids, polypeptides, and uses thereof}
Akt 및 어팝토시스
어팝토시스(프로그램된 세포 사멸)는 배 발생 및 퇴행성 신경 질환 및 심장혈관 질환과 같은 여러 질병의 발병에서 필수적인 역할을 한다[MacLellan et al., 1998, Barinaga 1997a, Baringaga 1997b]. 따라서, 최근의 연구로부터 프로그램된 세포 사멸의 조절 또는 실행에 연루된 여러 프로- 및 안티-어팝토시스 유전자가 동정되었다. Bcl2 또는 Bcl-x와 같은 항-어팝토시스 유전자의 발현은 여러 자극에 의해 유도된 어팝토시스 세포 사멸을 억제한다. 다른 한편, Bax 또는 Bad와 같은프로-어팝토시스 유전자의 발현은 프로그램된 세포 사멸을 유도한다[Aams et al., 1998]. 프로그램된 세포 사멸의 실행은 카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8 및 카스파제-9 등을 포함한 카스파제-1 연관된 프로테이나제에 의해 매개된다[Thorneberry et al., 1998].
최근에, 세포 생존/사멸의 조절에 연루된 두 가지의 세포내 신호전달 경로가 연구되었다. 어팝토시스 자극 키나제1(ASK1)의 활성화는 여러 세포 유형에서 어팝토시스를 유도하는 한편[Ichijo et al., 1997], 포스포이노시타이드 3-키나제(PI3K) 및 Akt가 연루된 경로는 세포보호를 유도한다. ASK1의 활성은 종양 괴사 인자 알파(TNFa) 처리 또는 Fas 결합에 의해 유도되는 것으로 증명되었다 [Ichijo et al., 1997, Chang et al., 1998]. ASK1 우성 음성 돌연변이체의 과발현은 TNFa 또는 Fas 연결에 의해 유도된 어팝토시스를 억제하며 이것은 ASK1이 TNFa 또는 Fas 연결-유도된 어팝토시스 세포 사멸 동안에 중요한 역할을 한다는 것을 가리킨다. ASK1이 어팝토시스를 유도하는 분자적 기작은 명료하지 않다. ASK1의 이소 발현이 ASK1-유도된 어팝토시스를 매개할 수 있는 MKK4/JNK 및 MKK6/p38 경로와 같은 여러 스트레스-활성화된 신호발생 경로의 활성화를 유도하는 것으로 제시되어 왔다[Ichijo et al. 1997].
P13K/Akt 경로는 또한 세포 생존/세포 사멸을 조절하는데 중요한 것으로 보인다[Kulik et al. Franke et al 1997, Kauffmann-Zch et al. Hemmings 1997, Dudek et al. 1997]. 혈소판 유도된 성장인자(PDGF), 신경 성장 인자(NGF) 및 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1)과 같은 생존 인자는 P13K의 활성을 유도함으로써 여러 조건하에서 세포 생존을 촉진한다[Kulik et al., 1997, Hemmings 1997]. 활성화된 P13K는 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-트리포스페이트(Ptdlns(3,4,5)-P3)의 생성을 유도하며, 이것은 차례로 세린/쓰레오닌 키나제 Akt를 함유한 AH/PH-도메인과 결합하고 이의 활성을 유도한다[Franke et al. 1995, Hemmings 1997b, Downward 1998, Alessi et al., 1996]. P13K 또는 우성 음성 Akt 돌연변이체의 특정 억제제는 이들 성장 인자 또는 사이토킨의 생존-촉진 활성을 제거한다. 또한, 구성적으로 활성적인 P13K 또는 Akt 돌연변이체의 도입은 세포가 정상적으로 어팝토시스 세포 사멸을 겪는 조건하에서 세포 생존을 촉진한다[Kulik et al. 1997, Dud다 et al. 1997]. 이러한 관찰 결과는 P13K/Akt 경로가 세포 생존 또는 어팝토시스를 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 증명한다.
사람 Akt 단백질 키나제의 두 가지 동형체인 Akt1 및 Akt2가 동정되었다[Staal, 1987]. 랫트 Akt 서열이 또한 동정되었다[Konishi et al. 1995]. 사람 Akt1의 C-말단에서 세린-473은 이의 조절을 위해 중요한 것으로 제시되었다[Stokeo et al., 1997; Stephens et al. 1998]. 성장 인자의 자극시, P13K는 활성화된다. P13K의 산물인 Ptdlns(3,4,5)-P는 Akt1과 결합하고 세포질로부터 내부 세포질 막의 부근으로 Akt1의 전좌를 일으키며 여기서 Akt1는 쏙308 및 Ser473에서 인산화된다[Downward 1998]. 이들 잔기의 인산화는 Akt1의 활성화를 위해 중요하다. 최근에 동정된 단백질 키나제 PDK1은 Thr308의 인산화를 담당하는 것으로 제시된 한편 Ser473을 인산화한 키나제는 아직까지 동정되지 않았다[Stokeo et al. 1997, Stephens et al. 1998].
유전자 요법
유전자 요법은 환자의 비정상 세포 또는 기관내와 같이 환자 체내에 유전 정보를 도입하여 결함 또는 이상(돌연변이, 이상 발현 등)을 교정하는 것을 포함한다. 이 유전 정보는 세포내로 시험관내에서 도입될 수 있으며 그런 다음 변형된 세포는 체내로 또는 적당한 부위내로 직접 생체내 도입된다. 이와 관련하여, 나 DNA의 형질감염 및 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체의 형질감염[Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA와 지질의 형질감염[Felgner et al., PNAS 84(1987) 7413], 리포좀의 이용[Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] 등을 이용한 여러 기술을 포함하여 형질감염 및 유전자 전달의 상이한 기술이 공지되었다[참조: Roemer and Friedman, Eur. J. Biochem. 208(1992) 211]. 더욱 최근에, 유전자의 전달을 위한 벡터로서 바이러스의 이용이 물리적 형질감염 기술의 대안으로 대두되었다. 이런 관점으로, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노관련 바이러스 및 아데노바이러스를 포함한 다른 바이러스가 특정 세포 그룹을 감염시킬 수 있는 능력에 대해 검사되었다.
본원에서 어떠한 참고문헌의 인용도 그러한 참고문헌이 본원에 대한 "선행 기술"로 이용가능한 것으로 해석되어서는 안된다.
발명의 요약
본 발명의 첫 번째 관점은 신규한 Akt 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 핵산에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한 사람 Akt3 단백질을 암호화하고 하기 중에서 선택된 특성을 갖는 분리된 핵산에 관한 것이다:
A. 핵산은 서열 5 및 서열 6으로부터 유도된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭될 수 있다;
B. 핵산은 서열 1에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화한다;
C. 핵산은 서열 2, 이의 스플라이스 변이체 및 대립형질 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드를 암호화한다;
D. 핵산은 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 펩타이드내의 에피토프에 대해 발생된 항체와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 암호화한다.
바람직하게는, 핵산은 서열 2에 기술된 아미노산 서열을 포함한 사람 Akt3 단백질을 암호화한다. 보다 바람직하게는, 핵산은 서열 1에 기술된 서열을 포함한다. 핵산은 임의로 폴리펩타이드 태그를 암호화하고 그럼으로써 키메라 태그된 Akt3 단백질을 암호화한 서열을 포함할 수 있다. 다른 관점으로서, 핵산은 임의로 미리스틸화 서열을 암호화한 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 양태로서, 핵산은 포유동물 세포에서 Akt3 단백질의 발현을 허용하는 영역을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기된 핵산을 함유하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 사람 Akt3 단백질을 암호화한 핵산은 발현 컴피턴트 숙주 세포에서 사람 Akt3의 발현을 허용하는 발현 조절 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 벡터는 플라스미드 DNA 분자 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 바람직한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 백시니아 바이러스일 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 상기된 Akt3 암호화 핵산을 게놈내에 포함한 복제 결손 재조합 바이러스에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기된 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 추가의 다른 양태로서, 본 발명은 상기된 숙주 세포를 사람 Akt3의 발현을 허용하는 조건하에 배양 배지중에서 배양하고 사람 Akt3 단백질을 배양물로부터 분리함을 포함하여 사람 Akt3 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하고 하기 중에서 선택된 특성을 갖는 분리된 사람 Akt3 단백질에 관한 것이다:
A. 단백질은 상기된 핵산에 의해 암호화된다;
B. 단백질은 서열 2에 기술된 아미노산 서열, 이의 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다;
C. 단백질은 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 펩타이드내의 에피토프에 대해 발생된 항체와 특이적으로 결합한다.
바람직하게는, 단백질은 서열 2에 기술된 아미노산 서열을 포함한다. 단백질은 임의로 태그 서열을 포함할 수 있다. 추가의 다른 양태로서, 단백질은 임의로 미리스틸화 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 항원성 펩타이드 및 이에 대한 항체에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 하기 중에서 선택된 특성을 갖는 사람 Akt3 단백질의 단편인 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한 항원성 펩타이드에 관한 것이다:
A. 단백질은 상기된 핵산에 의해 암호화된다;
B. 단백질은 서열 2에 기술된 아미노산 서열, 이의 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다;
C. 단백질은 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 펩타이드내의 에피토프에 대해 발생된 항체와 특이적으로 결합한다.
바람직하게는, 항원성 펩타이드는 필수적으로 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 이의 항원성 단편으로 이루어진다. 다른 양태로서, 본 발명은 상기된 사람 Akt3 단백질과 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 바람직한 양태로서, 항체는 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys를 갖는 펩타이드내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기된 핵산을 세포에 투여함으로써 세포의 어팝토시스 또는 괴사를 억제하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 핵산은 조절 영역에 작동적으로 연결된다. 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 바람직한 세포는 심장 세포를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 세포는 심근 세포이다. 바람직한 양태로서, 세포는 심근 경색 또는 허혈 재관류 손상을 앓고 있는 환자의 세포이다. 따라서, 본 발명은 심근 경색 또는 허혈 재관류 손상을 앓고 있는 환자에게 조절 영역에 작동적으로 연결된 상기 핵산을 투여함으로써 상기 상해를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 핵산은 환자의 심장 근육세포에 투여한다. 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 형태일 수 있다. 바람직한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 HSV 바이러스를 포함한다.
본 발명은 또한 사람 또는 동물 신체의 외과적 및/또는 치료학적 치료를 위한 약제 조성물을 제조하기 위해 상기 핵산 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기된 벡터, 특히 바이러스 벡터 및 핵산을 포함한 약제 조성물에 관한 것이다.
추가의 다른 양태로서, 본 발명은 Akt3 단백질을 후보 분자와 접촉시키고 Akt3 활성을 후보 분자의 존재하에 검출함으로써 세포에서 Akt3 활성을 자극 또는 억제하는 분자를 선별하는 방법에 관한 것이다. 후보 분자는 Akt3의 효능제 또는 길항제일 수 있다. 바람직한 양태로서, Akt3은 세포내에서 핵산으로부터 발현되고 측정된 Akt3 활성은 어팝토시스의 억제이다. 어팝토시스의 억제는 마커 유전자의 존재에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 일반적으로 세포내에 Akt3 단백질의 수준을 증가시킴으로써세포내에 Akt3 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태로서, 세포는 Akt3 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 Akt3을 암호화한 벡터로 형질감염되었다. 유사하게, 본 발명은 세포내에 Akt3 단백질의 수준을 감소시킴으로써 세포내의 Akt3 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. Akt3 단백질의 수준은 안티센스 핵산이 세포내 조건하에서 Akt3 mRNA와 하이브리드화하는 조건하에서 세포내로 Akt3 안티센스 핵산을 도입함으로써 감소시킬 수 있다. 또한, Akt3 단백질의 수준은 Akt3과 특이적으로 결합하는 단일쇄 Fv 항체(scFv)를 Akt3과 결합하여 불활성화시키기에 충분한 수준으로 도입함으로써 감소시킬 수 있다.
본 발명은 분리된 핵산, 이들을 함유하는 벡터 및 이들의 용도, 특히 유전자 요법에서의 용도에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 Akt3으로 명명된 Akt 동형체(isoform)를 암호화한 핵산 및 이들의 유전자 요법에서의 용도에 관한 것이다. 활성화된 Akt3의 발현은 어팝토시스 자극 키나제 1(ASK1)에 의해 유도된 어팝토시스 세포 사멸을 예방한다.
도 1: Akt3 서열의 배열.
도 1a는 사람 Akt1(서열 14), 사람 Akt2(서열 13) 및 사람 Akt3(서 열 2)의 아미노산 서열의 배열이다.
도 1b는 쥐 Akt(서열 17)와 사람 Akt3(서열 2)의 아미노산 서열의 배열이다.
도 2: Akt3 mRNA의 조직 분포 패턴.
Akt3 특이적인 프로브는 실시예에 상술한 바와 같이 제조하였다. 다수의 사람 세포 mRNA 블롯(제조원: Clontech)은 Akt3 특이적인 프로브로 하이브리드화하였다.
도 3: 활성화된 Akt3 변이체의 작제.
도 3a는 활성화된 Akt3를 나타낸 도식이다. 사람 Akt3 서열을 암호화하는 전체 길이는 N-말단에서 사람 Src유전자(Myr)로부터 유래된 미리스틸화 시그날로 프레임내에서 융합하였고 C-말단(HA)에서 HA-태그로 프레임내에서 융합하였다(참조 실시예).
도 3b는 HEK293 세포에서 활성화된 Akt3의 이소성(ectopic) 발현을 나타낸다. HEK293 세포는 CMV6-MyrAkt3HA 또는 발현 플라스미드(CMV6)만으로 형질전환하였다. 형질전환하고 24시간 후에 세포 용해물을 제조하였고 a-HA 항체로 면역블롯팅하였다.
도 3c는 Akt 활성을 갖는 활성화된 Akt3을 나타낸다. HEK293 세포는 Akt3을 활성화하기 위해 발현 플라스미드 또는 발현 벡터(CMV6)만으로 형질전환하였다. 형질전환하고 24시간 후에 세포 용해물을 제조하였고 항-HA 항체로 면역침전하였다. 면역펠렛의 Akt3 키나제 활성은 GSK3으로부터 유도된 기질 펩타이드를 사용하여 측정하였다. bkgd: 비형질전환된 세포의 배경값; CMV6: CMV6으로 형질전화된 세포; Akt3cak: Akt3의 활성화(CMV6-MyrAkt3HA)를 위해 발현 플라스미드로 형질전환된 세포.
도 4: HEK293 세포에서 세포 사멸을 유도하는 ASK1을 억제하는 Akt3의 활성.
HEK293 세포는 표지 플라스미드와 CMV-β-gal 플라스미드(0.1mg)로 형질전환하였다. 각각의 형질전환을 위한 DNA양은 CMV6 벡터를 첨가하여 일정하게 유지하였다. Akt3cak: CMV6-MyrAkt3HA(0.4mg); Ask1: pCDNA3HA-ASK1-f1 (0.4mg). 형질전환하고 2일 후 세포를 고정화하고 X-gal 염색하였다. β-gal 포지티브 세포(청색 세포)는 광학현미경으로 각기 다른 5방향에서 계수하였다.
본 발명은 Akt 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 신규한 분리된 핵산 Akt3을 제공한다. 따라서, 본 발명의 첫 번째 주제는 포유동물세포에서 발현이 허용되는 조절 영역에서 신규한 Akt3 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, Akt 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 사람 또는 동물에 있어서 외과적 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 상기 핵산 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 벡터 특히 바이러스 벡터 및 상술한 핵산으로 이루어진 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 관점은 직접적으로는 본 발명의 핵산, 벡터, 바이러스, 조성물 및 방법은 다음 단락에서 보다 상세하게 설명하기로 한다. 상기 단락은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
정의
다음의 정의된 단어는 본 발명을 명확하게 하기 위해 사용되었으며 본 발명의 범주와 실시를 이해하는데 도움이 될 수 있다.
특정 양태에서, "약"(about) 또는 "대략"(approximately)은 주어진 수치 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10%이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
"핵산"은 공유결합된 서브유닛인 뉴클레오타이드로 이루어진 중합체이다. 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄의 폴리리보핵산(RNA)과 폴리디옥시리보핵산(DNA)을 포함한다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함한다.
"유전자"는 cDNA와 게놈 DNA 핵산을 포함하여 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드의 집합이다.
"재조합 DNA 분자"는 분자생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다.
"벡터"는 숙주 세포내로 핵산을 이동시킬 수 있는 수단이다. 벡터는 다른 DNA 단편을 부착시켜서 부착된 단편의 복제를 초래할 수 있는 리플리콘일 수 있다. "리플리콘"은 생체내 DNA 리플리콘의 독립 단위로써 기능을 갖는 것으로, 자체조절에 의해 복제할 수 있는 능력이 있는 유전적 요소(플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)이다. "벡터"는 생체외 또는 생체내에서 세포내로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스를 포함하는 수단을 의미한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노관련 바이러스, 폭스 바큘로바이러스, 백시니아, 헤르페스 심플렉스, 엡스테인-바르 및 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 비바이러스 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적인 전하를 갖는 지질(시토펙틴), DNA-단백질 복합체 및 바이오폴리머를 포함한다. 핵산 이외에, 벡터는 핵산 전달 결과(어느 조직으로의 전달, 발현 지속 등) 선별, 측정 및 모니터링에 유용한 하나 또는 그이상의 조절 영역, 및/또는 선택 마커를 포함한다.
"클로닝 벡터"는 다른 DNA 단편을 부착시켜서 부착된 단편이 복제되도록 하는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 리플리콘이다. 클로닝 벡터는 하나의 세포 형태에서 복제될 수 있고 다른 세포 형태(셔틀 벡터)에서 발현될 수 있다.
"카세트"는 특이적인 제한부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 DNA 단편을 의미한다. DNA 단편은 중요한 폴리펩타이드를 암호화하고 카세트와 제한부위는 전사와 해독을 위한 적절한 판독 프레임에 카세트의 삽입이 확실하게 되도록 설계한다.
세포의 "형질전환"은 외인성 또는 이형 DNA가 세포안에 도입되었을 일어난다. 세포의 "변형"은 외인성 또는 이형 DNA에 의해 형질전환된 결과 표현형의 변화가 일어난 경우이다. 변형된 DNA는 세포의 게놈을 작제하기 위하여 염색체 DNA로 융합(공유 결합)될 수 있다.
"핵산 분자"는 일본쇄 형태 또는 이본쇄 나선 형태의 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘: RNA 분자) 또는 데옥시리보뉴클레인산(디옥시아데노신, 데옥신구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; DNA 분자)의 인산 에스테르 중합체 형태 또는 인산티오에이트(phosphothioates) 및 티오에스테르 (thioesters)와 같은 인산에스테르 유사체를 의미한다. 이본쇄 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선형이 가능하다. 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 일차 및 이차 구조를 의미하며 특별한 3차 구조 형태로 한정되지 않는다. 따라서, 상기 핵산분자는 이본쇄 DNA, 그 중에서도 직선형 또는 환형 DNA분자(제한 단편)인 플라스미드와 염색체를 포함한다. 이본쇄 DNA 분자 구조에 관한 논의에서, 본원에 기재된 서열은 DNA 비전사 쇄를 따라 5'에서 3'방향에서 주어진 서열의 통상적인 관례에 따른 것이다. "재조합 DNA 분자"는 분자생물학적 조작을 거친 것이다.
핵산 분자는 온도와 용액 이온 강도의 적절한 조건하에서 핵산분자의 일본쇄 형태가 다른 핵산분자와 어닐링될 수 있을 때 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자와 "하이브리드화" 될 수 있다. 온도와 이온 강도의 조건은 하이브리드의 "엄격성(stringency)" 정도에 따라 결정된다. 이종 핵산의 예비 선별은 보다 덜 엄격한 하이브리드화 조건에서 (Tm 55℃, 5 x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유 및 포름아미드의 미첨가 또는 30% 포름아미드, 5 x SSC, 0.5%SDS) 이루어진다. 중간 정도의 엄격한 하이브리드화 조건은 더 높은 Tm, 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC이다. 매우 엄격한 하이브리드화 조건은 가장높은 Tm, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC이다. 하이브리드화는 상보적인 서열을 포함하는 두개의 핵산을 요구한다. 하이브리드화의 엄격한 정도에 의존적이지만, 염기간의 부정합 오류가 일어날 수 있다. 하이브리드화된 핵산의 적합한 엄격성은 종래기술에서 다양성이 잘 알려진 바와 같이 핵산의 길이와 상보성 정도에 따라 다르다. 두 개의 뉴클레오타이드 서열사이에 유사성 또는 동일성이 높을수록 이러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드화를 위한 Tm 값이 높다. 핵산 하이브리드화의 안정성은 RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA 순서에 따라 감소한다. 길이가 100개 뉴클레오타이드보다 더 긴 경우의 하이브리드화를 위해 Tm 계산식이 변형되어야 한다. 올리고뉴클레오타이드와 같은 짧은 핵산의 하이브리드화는 부정합 오류의 위치가 더욱 중요하고 올리고뉴클레오타이드의 길이가 그 특이성에 의해 결정된다. 하이브리드화할 수 있는 핵산의 바람직한 최소 길이는 약 뉴클레오타이드 10개 이상이다. 바람직하게는 뉴클레오타이드 15개 이상, 더욱 바람직하게는 뉴클레오타이드 20개 이상이다.
특정 양태에서, 용어 "표준 하이브리드화 조건"은 55℃의 Tm을 의미하며, 상기 제시된 조건을 사용한다. 바람직한 양태에서, Tm은 60℃이며, 보다 바람직한 양태에서, Tm은 65℃이다.
특정 양태에서, "올리고뉴클레오타이드"는 적어도 뉴클레오타이드 18개로 이루어진 Akt3을 암호화하는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자 또는 mRNA분자를 하이브리드할 수 있는 핵산을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드는 공유결합된32P-뉴클레오타이드 또는 바이오틴으로 표지된 뉴클레오타이드로 표지될 수 있다. 하나의 양태에서, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 Akt3을 암호화하는 핵산의 존재여부를 검출할 수 있는 프로브로 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드(하나 또는 두 개로 표지된) Akt3 전체 길이 또는 단편을 클로닝하기 위한 PCR 프라이머로써 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 Akt3 DNA 분자와 3중 나선구조를 형성할 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 합성으로 바람직하게는 핵산 합성에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 티오에스테르 결합과 같은 비천연적으로 생성된 인산에스테르 유사 결합을 갖도록 제조할수 있다.
DNA "암호화 서열"은 생체외 및 생체내의 세포에서 적합한 조절 서열이 조절되는 조건에서 폴리펩타이드로 전사되고 해독되는 이본쇄 DNA서열이다. 암호화 서열의 범위는 5' 말단의 개시 코돈과 3'말단의 해독 종결 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵세포 서열, 진핵세포 mRNA의 cDNA, 진핵세포 DNA의 게놈 DNA 및합성 DNA서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암호화 서열이 진핵세포에서 발현되면, 폴리아데닐화 시그날과 전사 종결 서열은 암호화 서열의 3'말단에 존재한다.
전사와 해독 조절 서열은 숙주 세포에 암호화 서열의 발현을 위해 제공되는 프로모터, 인핸서, 터미네이터와 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵세포에서, 폴리아데닐화 시그날은 조절 서열이다.
"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제와 결합할 수 있고 암호화 서열의 하류(3'방향)의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 서열이다. 본 발명에서 정의하기 위한 목적으로, 프로모터 서열은 상기 배경에서 발견할 수 있는 수준에서 전사를 개시하기 위해 필요한 최소한의 염기 또는 요소를 포함하는 전사 개시 부위의 3'말단과 상류(5'방향) 범위이다. 프로모터 서열에는 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1으로 맵핑됨으로써 통상 정의됨)와 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)이 있다.
RNA 폴리머라제가 mRNA로 암호화 서열이 전사될 때 트랜스-RNA가 스플라이스되고(암호화 서열이 인트론 함유시) 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독되는데 이때 암호화 서열은 "조절 하에" 세포에서 전사 및 해독 조절 서열이다.
본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "상동성"은 수퍼 패밀리(예를 들면, 면역글로불린 수퍼 패밀리로부터의 단백질) 및 다른 종(예를 들면, 미오신 경쇄 등)의 동형 단백질을 포함하여 "공통의 진화적 기원"을 갖는 단백질 사이의 관계를 의미한다[Reeck et al., 1987, Cell 50:667]. 그와 같은 단백질들(및 이를 암호화하는유전자)는 높은 서열 유사성을 반영하는 것으로써 서열 상동성을 갖는다.
그러므로, 용어 "서열 유사성"은 공통의 진화적 기원을 갖는 또는 갖지 않는 단백질의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 정도 또는 상응성 정도를 나타내는 말이다. 한편, 통상적인 용도와 출원시점에서 "매우"와 같은 부사로 변형된 용어 "상동성"은 서열이 유사하나 공통의 진화적 기원을 갖지 않는 것을 의미한다.
특정 양태에서, DNA 서열의 정의된 길이에서 적어도 약 50%가 동일한 경우, 바람직하게는 적어도 약 75%가 동일할 경우, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%가 동일할 경우에 2개의 DNA 서열은 "실질적으로 상동성"이거나 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동성인 서열은 표준 소프트웨어를 사용하여 유효한 데이터 뱅크에 등록된 서열과 비교하거나 또는 서던 하이브리드화 실험으로 예를 들면, 특정 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건에서 서열을 비교함으로써 동정할 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건은 공지되어 있다[Maniatis et al., 상기 참조, DNA Cloning, Vol. I & II, 상기; Nucleic Acid Hybridization, 상기].
"안티센스 핵산"은 센스 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열이다. 안티센스 핵산은 센스 쇄에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 하류를 조절하거나 또는 발현을 차단하는데 사용될 수 있다.
전사 및 해독 조절 서열은 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 위해 제공되는 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵세포에서, 폴리아데닐화 시그날은 조절 서열의 부가적인 형태이다.
"시그날 서열"은 세포 표면에서 발현되는 단백질의 암호화 서열의 개시부에포함된다. 상기 서열은 숙주 세포에 폴리펩타이드를 전위시키는 성숙 폴리펩타이드를 위한 시그날 펩타이드, N-말단을 암호화한다. 용어 "전위 시그날 서열"은 본원중 이러한 종류의 시그날 서열을 의미한다. 전위 시그날 서열은 진핵세포와 원핵세포의 다양한 단백질에서 발견되고 상기 두 종류 세포에서 기능성을 갖는다.
"조절 영역"은 두 번째 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 영역은 특정 핵산(상동성 영역)이 자연적으로 발현하도록 하는 서열을 포함하거나 또는 단백질과 합성단백질(이종성 영역)의 발현하도록 하는 다른 기원의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스 유전자 또는 특이적인 또는 비특이적인 방법과 유도적 또는 비유도적 방법에 의해 유전자의 전사가 촉진되거나 또는 억제되어 유래된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제, RNA 스플라이스 부위, 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열, 표적 세포의 2차 통로로 폴리펩타이드를 이동시킬 수 있는 시그날 서열의 기원 및 프로모터를 포함한다.
"이종성 공급원"으로부터 유래된 조절 영역은 발현된 핵산과 자연적으로 결합되지 않는 조절 영역이다. 이종성 조절 영역으로는 이종으로부터 유래된 조절 영역, 이종성 유전자로부터 유래된 조절 영역, 하이브리드화 조절 서열 및 자연적으로 존재하지 않으나 공지된 기술에 의해 설계된 조절 서열을 포함한다.
"이종성" DNA는 세포내 또는 세포의 염색체 부위에 자연적으로 존재하지 않는 DNA이다. 바람직하게는, 이종성 DNA는 외래 유전자를 포함한다.
"상동성 재조합"은 염색체내에 다른 DNA 분자, 예를 들면 벡터의 삽입과 같은 외래 DNA 서열의 삽입을 말한다. 바람직하게는, 벡터는 상동성 재조합을 위한특이적인 염색체 부위를 표적으로 한다. 특이적인 상동성 재조합을 위해 벡터는 염색체 서열이 상보적으로 결합할 수 있고 염색체안으로 벡터가 혼입될 수 있도록 하는데 효과적인 길이가 긴 상동성 영역을 포함한다. 상동성 영역이 길수록 서열의 유사성 정도는 클수록 상동성 재조합의 효과는 증가한다.
"폴리펩타이드"는 공유결합된 아미노산 잔기를 포함하는 중합체이다.
아미노산은 다음과 같은 일반 구조를 갖는다.
아미노산은 측쇄 R에 따라 다음의 7개의 그룹으로 나누어진다. (1) 지방족 측쇄, (2) 하이드록실 그룹(OH)을 함유한 측쇄, (3) 황 원자를 함유한 측쇄, (4) 산 또는 아미드 그룹을 함유한 측쇄, (5) 염기 그룹을 함유한 측쇄, (6) 방향족 환을 함유한 측쇄, (7) 프롤린, 이미노산이 아미노 그룹과 융합된 측쇄로 나누어진다. 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 약 14개의 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다.
"단백질"은 살아있는 세포에서 구조적 또는 기능적 역할을 하는 폴리펩타이드를 의미한다.
폴리펩타이드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래되고 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성이 남아있는유사체, 단편, 유도체 또는 변이체를 말한다. 각기 다른 종류의 폴리펩타이드 또는 단백질 변이체는 자연에 존재할 수 있다. 이러한 변이체는 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 차이 또는 각기 다른 스플라이싱 또는 해독후 변형의 차이에 의해 특징을 갖는다. 당업자는 하나의 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 대체를 갖는 변이체를 생산할 수 있다. 이러한 변이체는 예를 들면, (a) 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환된 변이체, (b) 하나 또는 그 이상의 아미노산이 폴리펩타이드 또는 단백질에 부가된 변이체, (c) 치환 그룹을 포함하는 하나 또는 그이상의 아미노산을 포함하는 변이체, (d) 폴리펩타이드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 다른 폴리펩타이드와 융합된 변이체가 있다. 이러한 변이체를 획득하기 위한 방법은 당업계에 공지된 유전적 방법(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적 방법 및 효소적 방법이 있다. 본 발명의 변이체는 적어도 약 14개의 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하다.
폴리펩타이드의 유도체를 초래하는 mRNA 스플라이싱 형태와 해독후 변형체 형태를 포함하여 상기 변이체, 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 및 변형체가 폴리펩타이드의 생물학적 특성을 지니고 있으면, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
"이형 단백질"은 세포내에서 천연적으로 생산되지 않는 단백질이다.
"실질적으로 상동성" 또는 "실질적으로 유사한" 2개의 아미노산 서열은 아미노산이 40% 이상 동일하거나 또는 60% 이상(기능적으로 동일) 유사한 경우이다.바람직하게는, 유사한 또는 상동성 서열은 예를 들면, GCG(Genetics Computer Group, Program Mannual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램을 이용하여 동정할 수 있다.
용어 "상응하는"이란 유사성 또는 상동성을 측정한 분자에서 정확한 위치가 동일한지의 여부에 따라 유사한 또는 상동성 서열이라고 말할 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열은 공간을 포함하여 일렬로 배열될 수 있다. 따라서, 용어 "상응하는"이란 서열의 유사성을 의미하는 것이며 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 염기수를 측정하는 것은 아니다.
Akt3 단백질을 암호화하는 유전자
본 발명은 전체 길이 또는 Akt3으로부터 자연적으로 발생된 또는 사람 Akt 특이적인 항체 단편을 포함한 사람 Akt3 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 본원에서 "Akt3"은 Akt3 폴리펩타이드를 의미하고 "akt3"은 Akt3 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 말한다. 본 발명의 목적에 있어서, Akt3은 어팝토시스를 억제할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미하고, Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-CYs-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 서열로 작제되어 있거나 또는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어져 있다. 바람직하게는, Akt3 단백질의 C-말단에 존재하는 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어져 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 신규한 Akt3은 서열 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 이루어져 있다. 본 발명에 따른 바람직한 핵산은 서열 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 핵산은 서열 1에 나타낸 바와 같은 서열로 이루어져 있다.
본 발명의 첫 번째 목적은 임의의 포유동물 세포에서 발현될 수 있는 조절 영역하에서 신규한 Akt 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, Akt 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한 벡터에 관한 것이며 사람 또는 동물에 외과적 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 사용되는 핵산 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기에서 정의된 바이러스 벡터와 같은 벡터, 핵산으로 이루어진 약제학적 조성물에 관한 것이다
본 발명에서는 공지된 기술인 통상적인 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 상기 기술들은 다음과 같은 문헌에 기술되어 있다[Sambrook, Fitsch & Manatis, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Second Edition(1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York ("Sambrook et al., 1989); DNA Cloning: A practical Approach. Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonuclotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture[R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal. A Practical Guide To MolecularCloning (1984); F.M. Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc (1994)].
게놈 DNA 또는 cDNA이건 간에 Akt3을 암호화하는 유전자는 어떤 공급원으로부터도 특히, 사람 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다. akt3 유전자를 획득하기 위한 일반적인 방법은 상술한 바와 같은 종래 기술에 잘 나타나 있다[참조: Sambrook et al., 1989, 상기 참조].
그러므로, 어떠한 동물 세포든지 akt3 유전자의 분자 클로닝을 위한 핵산 공급원으로써 제공될 수 있다. DNA는 클론된 DNA로부터 공지의 기술에 의해 획득될 수 있으며, 바람직하게는 화학합성, cDNA 클로닝 또는 게놈 DNA의 클로닝 또는 그들의 단편의 클로닝 또는 원하는 세포로부터 정제된 단편의 클로닝에 의해 단백질을 고수준으로 발현하는 세포(심장, 췌장, 골격근 cDNA)로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 획득될 수 있다[Sambrook et al., 1989, supra: Glover, D.M.(ed). 1985, DNA Cloning; A Practical Approach. MRL Press. Ltd., Oxford. U. K. Vol. I.II]. 게놈 DNA로부터 클로닝된 변이체는 암호화 영역에 부가되어 조절 영역과 인트론 DNA영역을 포함한다. cDNA로부터 클로닝된 변이체는 인트론 서열을 포함하지 않는다. 공급원이 무엇이든지 간에, 유전자는 유전자의 전달을 위한 적합한 벡터로 분자적으로 클로닝되어야 한다.
DNA 단편이 생성되면, akt3 유전자를 포함하는 특정 DNA 단편의 동정은 다양한 방법에 의해 시행될 수 있다. 예를 들면, DNA 단편은 표지된 프로브로 하이브리드화된 핵산에 의해 검색될 수 있다[Benton and Davis, 1977, Science 196:180;Grunstein and Hogness. 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961]. 본질적인 상동성을 갖는 이러한 DNA 단편은 프로브로 하이브리드화될 수 있다. 상술한 바와 같이, 상동성 정도가 클수록 하이브리드화 조건은 더 엄격하게 사용된다. 특정 양태에서, 노던 하이브리드화 조건은 akt3 유전자의 mRNA 스플라이싱 변이체를 동정하기 위해 사용할 수 있다.
나아가 선택은 유전자의 특성에 기초로 하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 유전자가 암호화하는 단백질 산물이 등전점, 정전기적 특성, 아미노산 조성, 또는 본원에 개시된 Akt3 단백질의 부분적인 아미노산 서열을 갖는다. 따라서, 유전자의 존재는 유전자의 발현 산물의 물리적, 화학적 또는 면역학적 특성에 기초한 분석으로 검출할 수 있다. 예를 들면, 하이브리드 선택된 cDNA 클론, 또는 DNA 클론은 이들에 의해 생산된 단백질의 정전기적 이동, 등전점, 또는 비평형 pH 겔 전기이동 형태, 단백질 가수분해 절단 지도, 또는 Akt3으로 알려진 항체 특성에 의해 선택될 수 있다. 특정 양태에서, 단백질의 발현은 사람 Akt3(Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys)에 특이적인 에피토프에 대해 생성된 폴리클로날 항체에 의해 인식된다.
또한, 본 발명은 Akt3과 동일하거나 유사한 기능 활성을 갖는 본 발명의 Akt3의 변이체, 스플라이싱 변이체, 유도체를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. Akt3 변이체 및 유도체의 생산과 용도는 본 발명의 범주에 포함된다. 상기 변이체, 유도체, 동족체는 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 변이체 또는 유사체는 기능적으로 활성화될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 야생형 Akt3의 전체 길이의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성을 나타낼 수 있다.
Akt3 유도체는 기능적으로 등가의 분자를 제공하는 치환, 첨가 또는 결실을 통해 암호성 핵산 서열을 변화시켜 제조할 수 있다. 유도체는 천연의 Akt3과 비교하여 증강 또는 증가된 기능적 활성을 갖도록 제조한다.
뉴클레오타이드 암호화 서열의 축퇴성으로 인하여, 단일 아미노산 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 비롯한 akt3 유전자와 거의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열도 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있다. 그 예로는, 대립형질 유전자, 다른 종 유래의 동종 유전자 및 서열 내에서 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 여러 코돈의 치환에 의해 변형되어 침묵 돌연변이체를 생산하는 akt3 유전자 전체 또는 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이와 마찬가지로, 본 발명의 Akt3 유도체로는 1차 아미노산 서열로서 그 서열내의 잔기 대신에 기능적으로 등가의 아미노산 잔기가 치환되어 보존적 아미노산 치환을 초래하는 변형된 서열을 포함한 Akt3 단백질의 아미노산 서열 전체 또는 일부를 포함하는 것이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들면, 서열내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가체로서 작용하여 침묵 돌연변이체를 생성하는 유사한 극성의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 상기 서열내의 아미노산에 대한 치환체는 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 아미노산 중에서 선택할 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 방향족 환 구조를 포함하는 아미노산으로는, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 있다. 극성의 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양하전을 띤(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 있다. 음하전을 띤(산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있다. 이러한 변형들은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점으로 측정되는 바와 같이 겉보기 분자량에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
특히 바람직한 치환체는 다음과 같다:
- 양하전이 유지될 수 있도록 Arg 대신 Lys 및 Lys 대신 Arg;
- 음하전이 유지될 수 있도록 Asp 대신 Glu 및 Glu 대신 Asp;
- 유리 -OH 기가 유지될 수 있도록 Thr 대신 Ser;
- 유리 CONH2기가 유지될 수 있도록 Asn 대신 Gln.
아미노산 치환은 특히 바람직한 성질의 아미노산을 치환시키기 위하여 사용할 수도 있다. 예를 들면, Cys은 다른 Cys과의 이황화 가교를 위한 잠재적 부위를 도입시킬 수 있다. His는 특히 "촉매성" 부위로서 도입될 수 있다(즉, His은 산 또는 염기로서 작용할 수 있어 생화학적 촉매작용에 가장 일반적인 아미노산이다). Pro은 특히 평면상 구조이기 때문에 단백질 구조에 β-턴을 유도하기 위해 도입될 수 있다.
본 발명의 Akt3 유도체 및 유사체를 암호화하는 유전자는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 그 생산을 초래하는 조작은 유전자또는 단백질 수준에서 실시할 수 있다. 예를 들면, 클로닝된 Akt3 유전자 서열은 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법으로 변형시킬 수 있다[Sambrook et al., 1989, 상기 문헌 설명 참조]. 서열을 제한 효소로 적당한 부위에서 절단한 뒤, 경우에 따라 다른 효소적 변형을 실시한 뒤 분리하여 시험관내에서 연결시킬 수 있다. Akt3 유도체 또는 유사체를 암호화하는 유전자의 생산시에는 변형된 유전자가 바람직한 활성이 암호되는 유전자 영역내에서 해독 종결 시그날이 중재됨이 없이 Akt3 유전자와 동일한 해독 판독 프레임내에 잔류되도록 주의를 기울여야 한다.
또한, Akt3을 암호화하는 핵산 서열은 해독, 개시 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴시키거나 또는 암호 영역내 변형을 만들고/만들거나 또 다른 시험관내 변형을 용이하게 하기 위하여 새로운 제한 효소 부위를 형성시키거나 기존의 제한 효소 부위를 파괴시키는 돌연변이를 시험관내 또는 생체내에서 실시할 수 있다. 이러한 돌연변이는 돌연변이된 Akt3 유전자 생성물의 기능적 활성을 향상시키는 것이 바람직하다. 돌연변이유발법으로는 당해 기술 분야에 공지된 모든 기법을 사용할 수 있으며, 그 예로는 시험관내 부위 지시된 돌연변이유발법[Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller and Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710], TAB링커(제조원: Pharmacia)의 사용 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 부위 지시된 돌연변이유발에는 PCR 기법이 바람직하다[Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplication, H.Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70].
동정 및 분리된 유전자는 그 다음 적당한 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 다양한 벡터-숙주 시스템을 사용할 수 있다. 가능한 벡터로는, 비제한적으로 플라스미드 또는 변형된 바이러스가 있으나, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 상용성이 있어야 한다. 벡터의 예로는, 이. 콜라이, 람다 유도체와 같은 박테리오파아지, 또는 pBR322 유도체 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드, 예를 들면 pGEX 벡터, pmal-c, pFLAG 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 클로닝 벡터내로의 삽입은 예를 들면, 상보성의 접착성 말단을 가진 클로닝 벡터에 DNA 단편을 연결시킴으로써 달성할 수 있다. 하지만, DNA를 단편화하는데 사용된 상보성 제한 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않는 경우에는 DNA 분자의 말단을 효소적으로 변형시킬 수 있다. 또는, DNA 말단 상에 뉴클레오타이드 서열(링커)을 연결시켜 필요한 임의의 부위를 생산할 수도 있다. 이와 같이 연결된 링커는 제한 효소 인식 서열을 암호화하는 특정의 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 분자는 유전자 서열의 다수의 복사체를 얻기 위하여 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공법 등을 통해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 클로닝된 유전자는 경우에 따라 이. 콜라이와 같은 클로닝 세포내에서 팽창시키고, 이어서 적당한 발현 세포주에 삽입시키기 위해 용이한 정제를 할 수 있도록 셔틀 벡터 플라스미드에 병입시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 하나 이상의 유기체 종류에서 복제할 수 있는 벡터인 셔틀 벡터는 이. 콜라이플라스미드 유래의 서열과 효모 2μ플라스미드 유래의 서열을 연결시키므로써 이. 콜라이와 사카로마이세스 세레비지애 모두에서 복제할 수 있도록 제조할 수 있다.
Akt3 폴리펩타이드의 발현
Akt3, 이의 항원성 단편, 유도체 또는 유사체, 또는 이의 키메라 단백질을 비롯한 기능적 활성 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질을 암호화하는 서열의 전사 및 해독에 필요한 인자를 포함하는 벡터에 삽입시킬 수 있다. 본 명세서에서는 이러한 인자를 "프로모터"라 명명한다. 즉, 본 발명의 핵산은 본 발명의 발현 벡터내에 프로모터와 작동가능하게 결합된다. cDNA 서열 및 게놈 서열은 이러한 조절 서열의 조절하에 클로닝 및 발현될 수 있다. 또한, 발현 벡터는 복제 오리진을 포함하는 것이 바람직하다.
필요한 전사 및 해독 시그날은 재조합 발현 벡터에 제공되거나 또는 Akt3 및/또는 이의 인접 영역을 암호화하는 천연 유전자에 의해 공급될 수 있다.
잠재적 숙주-벡터 시스템으로는 바이러스(예를 들면, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들면 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 벡터의 발현 인자들은 그 강도와 특이성이 다양하다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라 많은 적합한 전사 인자 및 해독 인자 중 임의의 인자를 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 Akt3 단백질, 또는 이의 기능적 단편, 유도체, 키메라 작제물 또는 유도체는 재조합으로 암호화 서열을 통합시킨 후 염색체 상에서 발현시킬 수 있다. 이와 관련하여, 고농도의 안정한 유전자 발현을 달성하기 위하여 다양한 증폭 시스템 중 임의의 시스템을 사용할 수 있다[Sambrook et al., 1989, 상기 문헌 설명 참조].
Akt3을 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 보유하는 세포는 적당한 세포 배양 배지에서 그 세포가 Akt3을 발현할 수 조건하에 배양한다. 적당한 전사/해독 조절 시그날 및 단백질 암호화 서열로 이루어진 유전자를 함유하는 발현 벡터를 작제하는 방법으로는 DNA 단편을 클로닝 벡터에 삽입시키는데 사용한 전술한 방법 중 임의의 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기법, 및 생체내 재조합(유전자 재조합)을 포함한다.
Akt3 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 임의의 조절 영역, 즉 당해 기술 분야에 공지된 프로모터/인핸서 인자에 작동가능하게 결합되어 조절될 수 있으나, 이 조절 인자들은 발현을 위해 선택된 숙주 표적 종양내에서 작용성이어야 한다. 조절 영역은 숙주 세포내에서 기능적 전사에 유용한 프로모터 영역, 뿐만 아니라 목적 유전자의 3'에 위치한 영역 및 구체적으로 전사를 종결시키기 위한 시그날 및 폴리아데닐화 부위를 포함할 수 있다. 이러한 인자들은 모두 발현 카세트를 작제한다.
본 발명에 사용할 수 있는 프로모터로는 구성성 프로모터 및 조절성(유도성) 프로모터를 모두 포함한다. 이 프로모터는 천연적으로 그 핵산을 발현시키는 역할을 하는 것일 수 있다. 또한, 이종성 공급원 유래의 것일 수도 있다. 구체적으로, 진핵성 유전자 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 감염시키고자 하는 세포의 게놈에서 유래된 프로모터 서열일 수 있다. 이와 마찬가지로, 바이러스, 예를 들면 아데노바이러스(EIA 및 MLP), 사이토메갈로바이러스 또는 라우스 육종 바이러스의 게놈에서 유래된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 프로모터는 활성화 서열 또는 조절 서열이나, 또는 조직 특이적 발현이나 우성적 발현에 관여하는 서열(에놀라제 및 GFAP 프로모터 등)을 첨가하여 변형시킬 수 있다. 더욱이, 핵산이 프로모터 서열을 함유하지 않는 경우에는 삽입시킬 수도 있다.
본 발명을 실시하는데 유용한 일부 프로모터로는, 편재적 프로모터(예, HPRT, 비멘틴, 액틴, 튜불린), 중재적 필라멘트 프로모터(예, 데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP), 치료적 유전자 프로모터(예, MDR형, CFTR, 제VIII 인자), 조직 특이적 프로모터(예, 평활근 세포내의 액틴 프로모터), 분열 세포내에서 주로 활성화되는 프로모터, 자극에 반응하는 프로모터(예, 스테로이드 호르몬 수용체, 레틴산 수용체), 테트라사이클린이 조절하는 전사 조절인자, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 초기 발현 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 메탈로티오네인, SV-40, 아데노바이러스 E1a 및 아데노바이러스 주요 후기(MLP) 프로모터가 있다. 테트라사이클린이 조절하는 전사 조절인자 및 CMV 프로모터는 본 발명에 참고 인용되는 문헌 [WO 제96/01313호, US 제5,168,062호 및 제5,385,839호]에 개시되어 있다.
보다 구체적으로, Akt3 단백질의 발현은 당해 기술 분야에 공지된 모든 프로모터/인핸서 인자에 의해 조절될 수 있으나, 이 조절 인자들은 발현을 위해 선택한숙주내에서 기능성이 있어야 한다. 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있는 프로모터로는 SV40 초기 프로모터 유전자[Benoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310], 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 함유된 프로모터[Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797], 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터[Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:1441-1445], 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열[Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42]; β-락타마제 프로모터[Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75:3727-3731] 또는 tac 프로모터[DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:21-25, 또한 "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980. 242:74-94 참조]와 같은 원핵성 발현 벡터; 효모 또는 다른 진균 유래의 프로모터 인자, 예를 들면 Gal 4 프로모터, ADC(알콜 데하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터; 돌연변이 동물에 사용되었고 조직 특이성을 나타내는 동물 전사 조절 영역; 췌장의 선포 세포(acinar cell)에서 활성적인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역[Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515]; 췌장의 베타 세포에서 활성적인 인슐린 유전자 조절 영역[Hanahan, 1985, Nature 315:115-122], 림프계 세포에서 활성적인 면역글로불린 유전자 조절 영역[Grosschedl et al., Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444]; 고환, 유방, 림프계 및 지방 세포에서 활성적인 마우스 유방암 바이러스 조절 영역[Leder et al., 1986, Cell 45:485-495], 간에서 활성적인 알부민 유전자 조절 영역[Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276], 간에서 활성적인 α-페토단백질 유전자 조절 영역[Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58], 간에서 활성적인 α1-안티트립신 유전자 조절 영역[Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171], 골수 세포에서 활성적인 β-글로빈 유전자 조절 영역[Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94], 뇌 중의 과돌기신경교세포에서 활성적인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 [Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712], 골격근에서 활성적인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역[Sani, 1985, Nature 314:283-286], 및 시상하부에서 활성적인 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역[Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378]을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 Akt3을 암호화하는 핵산을 함유한 발현 벡터는 5 단계의 일반적 방법, 즉 (a) 목적한 플라스미드 DNA 또는 특정 mRNA의 PCR 증폭, (b) 핵산 하이브리드화, (c) 선택 마커 유전자 기능의 존재 또는 부재, (d) 적당한 제한 효소에 의한 분석 및 (e) 삽입된 서열의 발현에 의해 확인할 수 있다. 제1 단계에서는, 증폭된 생성물을 확인하기 위하여 핵산을 PCR로 증폭시킬 수 있다. 제2 단계에서는, 삽입된 마커 유전자에 상동성인 서열을 포함하는 프로브를 사용한 핵산 하이브리드화를 이용하여 발현 벡터에 삽입된 이종 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 제3 단계에서는, 벡터내에 이종 유전자의 삽입시 일어나는 특정 "선택 마커" 유전자기능(예, β-갈락토시다제 활성, 티미딘 키나제 활성, 항생제 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스내에서의 폐색체 형성 등)의 존재 또는 부재에 근거하여 재조합 벡터/숙주 시스템을 동정 및 선택할 수 있다. 또 다른 예에서는, Akt3을 암호화하는 핵산이 벡터의 "선택 마커" 유전자 서열내에 삽입되어 있다면 Akt3 삽입체를 함유하는 재조합체는 그 유전자 기능의 부재를 통해 확인할 수 있다. 제4 단계에서는, 적당한 제한 효소로 절단하여 재조합 발현 벡터를 확인한다. 제5 단계에서는 발현된 단백질이 기능적으로 활성 형태라는 조건하에 재조합체에 의해 발현된 유전자 생성물의 활성, 생화학적 특성 또는 면역학적 특성을 분석하여 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키는 데에는 다양한 숙주/박현 벡터의 조합을 이용할 수 있다. 유용한 발현 벡터는, 예를 들면 염색체 서열, 비염색체 서열 및 합성 DNA 서열의 단편들로 작제될 수 있다. 적합한 벡터로는 SV40의 유도체 및 공지의 세균 플라스미드, 예를 들면 이. 콜라이 플라스미드, col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX[Smith et al., 1988, Gene 67:31-40], pMB9 및 이의 유도체, RP4와 같은 플라스미드; 파아지 DNAS, 예를 들면 파아지 1의 다양한 유도체, 예, NM989, 및 다른 파아지 DNA, 예, M13 및 섬사상의 일본쇄 파아지 DNA; 2m 플라스미드 또는 이의 유도체와 같은 효모 플라스미드; 진핵 세포에 유용한 벡터, 예를 들면 곤충 세포 또는 포유동물 세포에 유용한 벡터; 플라스미드 DNA 및 파아지 DNA의 조합에서 유래되는 벡터, 예를 들면 파아지 DNA 또는 다른 발현 조절 서열을 이용하기 위해 변형시킨 플라스미드 등이 있다.
예를 들면, 바큘로바이러스 발현 시스템에서는, 비융합성 전이 벡터, 예를 들면 비제한적으로 pVL941(BamHI 클로닝 부위; 제조원: Summers), pVL1393(BamHI, SmaI, XbaI, EcoRI, NotI, XmaIII, BglII 및 PstI 클로닝 부위; 제조원: Invitrogen), pVL1392(BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI 및 BamHI 클로닝 부위; 제조원: Summers and Invitrogen), 및 pBlueBacIII(BamHI, BglII, PstI, NcoI 및 HindIII 클로닝 부위, 청/백 재조합 선별이 가능함; 제조원: Invitrogen), 및 융합성 전이 벡터, 예를 들면 비제한적으로 pAc700(BamHI 및 KpnI 클로닝 부위, BamHI 인식 부위가 개시 코돈으로 시작함; 제조원: Summers), pAc701 및 pAc702(pAc700과 동일하나, 상이한 판독 프레임을 가짐), pAc360(폴리헤드린 개시 코돈의 36 염기쌍 하류에 BamHI 클로닝 부위; 제조원: Invitrogen(195)) 및 pBlueBacHisA, B, C(BamH1, BglII, PstI, NcoI 및 HindIII 클로닝 부위, ProBond 정제용 N-말단 펩타이드 및 플라크의 청/백 재조합 선별 가능성을 가진 3가지 상이한 판독 프레임; 제조원: Invitrogen(220))를 모두 사용할 수 있다.
본 발명에 유용한 것으로 고찰된 포유동물 발현 벡터로는 유도성 프로모터를 가진 벡터, 예를 들면, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, 예, DHFR 발현 벡터를 가진 모든 발현 벡터, 또는 DHFR/메토트렉세이트 동시증폭 벡터, 예를 들면 pED(PstI, SalI, SbaI, SmaI 및 EcoRI 클로닝 부위, 클로닝된 유전자와 DHFR을 모두 발현함)[Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12(1991)]를 포함한다. 또는, 글루타민 합성효소/메티오닌 설폭시민 동시증폭 벡터, 예를 들면 pEE14(HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI 및 BclI 클로닝 부위, 이 벡터는 글루타민 합성효소 및 클로닝된 유전자를 발현함; 제조원: Celltech)를 사용할 수 있다. 또 다른 구체적인 예에서는 엡스타인 바르 바이러스(EBV)의 조절하에 에피솜 발현을 유도하는 벡터, 예를 들면 pREP4(BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII 및 KpnI 클로닝 부위, 구성성 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복체(RSV-LTR) 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커; 제조원: Invitrogen), pCEP4(BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII 및 KpnI 클로닝 부위, 구성성 사람 사이토메갈로바이러스(hCMV) 초기 발현 유전자, 하이그로마이신 선택성 마커; 제조원: Invitrogen), pMEP4(KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI 클로닝 부위, 유도성 메탈로티오네인 IIa 유전자 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커; 제조원: Invitrogen), pREP8(BamHI, XhoI, NotI, HindIII, NheI 및 KpnI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, 히스티디놀 선택성 마커; 제조원: Invitrogen), pREP9(KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI 및 BamHI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, G418 선택성 마커; 제조원: Invitrogen), 및 pEBVHis(RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선택성 마커, ProBond 수지를 통해 정제할 수 있고 엔테로키나제에 의해 절단되는 N-말단 펩타이드; 제조원: Invitrogen)를 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 선택성 포유동물 발현 벡터로는 pRc/CMV(HindIII, BstXI, NotI, SbaI 및 ApaI 클로닝 부위, G418 선택; 제조원: Invitrogen), pRc/RSV(HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI 클로닝 부위, G418 선택; 제조원: Invitrogen) 등을 포함한다. 본 발명에 유용한 백시니아 바이러스 포유동물 발현 벡터로는 pSC11(SmaI 클로닝 부위, TK- 및 β-gal 선택), pMJ601(SalI,SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI 및 HindIII 클로닝 부위; TK- 및 β-gal 선택), 및 pTKgptF1S(EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindIII, SbaI, BamHI 및 Hpa 클로닝 부위, TK 또는 XPRT 선택)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, Akt3을 발현시키기 위하여 효모 발현 시스템을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 그 예로서 2가지를 언급하자면 비융합성 pYES2 벡터(XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnI 및 HindIII 클로닝 부위; 제조원: Invitrogen) 또는 융합성 pYESHisA, B, C(XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI 및 HindIII 클로닝 부위, ProBond 수지에 의해 정제되고 엔테로키나제에 의해 절단되는 N-말단 펩타이드; 제조원: Invitrogen)를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
특정의 재조합 DNA 분자가 동정 및 분리되면, 당해 기술 분야에 공지된 여러 방법을 사용하여 증식시킬 수 있다. 적합한 숙주 시스템과 성장 조건이 조성되면 재조합 발현 벡터를 증식시켜 다량으로 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이, 사용할 수 있는 발현 벡터로는 몇 가지 예를 들면, 다음과 같은 벡터 또는 이의 유도체를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 사람 또는 동물 바이러스; 바큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 벡테리오파아지 벡터(예, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 "천연" 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다. 또한, 포유동물 세포에서의 발현은 Akt3 활성을 재구성 또는 구성하는 도구를 제공할 수 있다. 또한, 상이한 벡터/숙주 발현 시스템은 상이한 정도로 단백질 가수분해 절단과 같은 프로세싱 반응에 영향을 미칠 수 있다.
벡터는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들면 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전법, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 트란스포터로 바람직한 숙주 세포에 도입시킨다[예를 들면, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988. J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., 캐나다 특허원 제2,012,311호, 1990년 3월 15일자로 출원됨].
단백질의 가용성 형태는 전술한 바와 같이 배양액을 수집하거나 봉입체를 가용화시켜(예를 들면 세정제로 처리한 뒤 경우에 따라 초음파처리 또는 다른 기계적 공정으로 처리함) 얻을 수 있다. 가용화된 단백질 또는 가용성 단백질은 다양한 기법, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 등전점, 2차원 겔 전기영동, 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 면역친화성 및 크기별 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 면역침전법 또는 단백질 정제에 유용한 기타 다른 표준 기법으로 분리할 수 있다.
Akt3에 대한 항체
본 발명에 따르면, 재조합 방법이나 화학적 합성 방법에 의해 생산된 Akt3 폴리펩타이드, 및 이의 단편이나 다른 유도체 또는 유사체 및 융합 단백질을 항체 생산용 항원 또는 면역원으로서 사용할 수 있다. 이 항체는, 사람 Akt3에는 특이적으로 결합하지만, Akt의 다른 형태에는 결합하지 않는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 것은, 이 항체가 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 가진 펩타이드 내에 존재하는 에피토프를 인식하는 것이다.
면역계의 항원 인식 분자, 예를 들면 면역글로불린(항체) 또는 T 세포 항원 수용체와 특이적으로 상호작용할 수 있다면 분자는 "항원성"이다. 항원성 폴리펩타이드는 약 5개 이상, 바람직하게는 약 10개 이상의 아미노산을 포함한다. 분자의 항원성 부분은 항체 또는 T 세포 수용체 인식에 면역우성인 부분 또는 그 항원성 부분이 면역화용 담체 분자에 접합하여 상기 분자에 대한 항체를 생성하는데 사용되는 부분일 수 있다. 항원성 분자는 그 자체가 면역원성, 즉 담체없이 면역 반응을 유도할 수 있는 것일 필요는 없다.
이러한 항체로는, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 일본쇄 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 항Akt3 항체는 교차반응성으로서, 예를 들면 다른 종 유래의 Akt3을 인식할 수 있다. 폴리클로날 항체는 교차 반응성의 가능성이 보다 크다. 또는, 본 발명의 항체는 Akt3의 단일 형태, 예를 들면 사람 Akt3에 특이적일 수 있다. 특히, 항체는 사람 Akt3에 특이적인 것이 바람직하다.
당해 기술 분야에 공지된 다양한 절차를 사용하여 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 항체 생산을 위해, 비제한적으로 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 비롯한 다양한 숙주 동물에게 Akt3 폴리펩타이드 또는 이의 유도체(예를 들면, 단편 또는 융합 단백질)를 주사하여 면역화시킬 수 있다. 한 가지 구체적인 예에서는, Akt3 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 면역원성 담체, 예를 들면 소혈청 알부민(BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 접합시킬 수 있다. 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키기 위하여 다양한 보조제를 사용할 수 있으며, 그 예로는 비제한적으로 프로인트(완전 및 불완전) 보조제, 수산화알루미늄과 같은 무기 겔, 표면 활성 물질, 예를 들면 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 유제, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적 유용성이 있는 사람 보조제, 예를 들면 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐이 있다.
Akt3 폴리펩타이드, 이의 단편, 유사체 또는 유도체에 대하여 지향성인 모노클로날 항체를 제조하기 위하여, 배양물 중에서 연속적인 세포주에 의하여 항체 분자를 생산할 수 있는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 그 예로는, 사람 모노클로날 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기법[Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985)], 사람 B-세포 하이브리도마 기법[Kozbor et al., Immunology Today 4:72 1983] 및 트리오마 기법 뿐만 아니라 본래 쾨흘러와 밀스타인에 의해 개발된 하이브리도마 기법[Nature 256:495-497(1975)]을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 또 다른 구체적인 예에서는, 무배세포 동물에서 모노클로날 항체를 생산할 수 있다[국제 특허 공개 WO 제89/12690호, 1989년 12월 28일자로 공개]. 사실상, 본 발명에 따르면, Akt3 폴리펩타이드에 특이적인 마우스 항체 분자 유래의 유전자를 적합한 생물학적 활성의 사람 항체 분자 유래의 유전자와 함께 접합시켜 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기법[Morrison, et al., J. Bacteriol. 159:870 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)]을 사용할 수 있으며, 이러한 항체는 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 이와 같은 사람 또는 사람화된 키메라 항체는 이종원성 항체보다 면역 반응, 특히 대립유전자 반응을 스스로 유도할 가능성이 더 적기 때문에 사람 질환 또는 질병(후술됨)의 치료에 사용하기에 바람직하다.
본 발명에 따르면, 일본쇄 Fv(scFv) 항체의 생산을 위해 개시된 기법[미국 특허 제5,476,786호 및 제5,132,405호, Huston; 미국 특허 제4,946,778호]을 변형시켜 Akt3 폴리펩타이드 특이적인 일본쇄 항체를 생산할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체적인 예에서는 Akt3 폴리펩타이드, 이의 유도체 또는 유사체에 대하여 바람직한 특이성이 있는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정하기 위하여 Fab 발현 라이브러리의 작제에 대하여 개시된 기법[Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)]을 이용한다.
항체 분자의 유전형을 포함하는 항체 단편은 공지의 기법으로 생산할 수 있다. 예를 들면, 상기 단편으로는 항체 분자를 펩신 분해하여 생산할 수 있는F(ab')2단편; F(ab')2단편의 이황화 가교를 환원시켜 생산할 수 있는 Fab' 단편; 및 파파인과 환원제로 항체 분자를 처리하여 생산할 수 있는 Fab 단편을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
항체 생산에 있어서 바람직한 항체의 선별은 당해 기술 분야에 공지된 기법, 예를 들면 방사능면역분석법, ELISA(효소 결합된 면역흡착법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사능측정 분석법, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석법, 동일계내 면역분석법(예를 들면 콜로이드성 금, 효소 또는 방사능동위원소 라벨 사용), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 분석법(예, 겔 응집 분석법, 혈구응집 분석법), 보체 고정화 분석법, 면역형광 분석법, 단백질 A 분석법 및 면역전기영동 분석법 등으로 달성할 수 있다. 한 가지 구체적인 예에서는, 항체 결합을 제1 항체상의 표지를 분석하여 측정한다. 또 다른 구체적인 예에서는, 제1 항체를 이 항체에 대한 제2 항체 또는 시약의 결합을 분석하여 측정한다. 또 다른 구체적인 예에서는 제2 항체를 표지시킨다. 면역분석법에서 결합을 분석하기 위한 다양한 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면, Akt3 폴리펩타이드의 특정 에피토프를 인식하는 항체를 선별하기 위하여 상기 에피토프를 포함하는 Akt3 폴리펩타이드 단편에 결합하는 생성물을 생성된 하이브리도마 중에서 분석할 수 있다. 바람직한 단편은 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys을 포함한다. 특정 동물 종 유래의 Akt3 폴리펩타이드에 특이적인 항체를 선별하기 위해서는, 그 동물 종의 세포에 의해 발현되거나 그 세포에서 분리된 Akt3 폴리펩타이드와 포지티븐 결합하는지를 토대로 하여 선별할 수 있다.
전술한 항체는 Akt3 폴리펩타이드의 편재성 및 활성과 관련하여 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들면 웨스턴 블롯팅, 원위치 Akt3 폴리펩타이드 영상화, 전술하거나 또는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 검출 기법을 사용하여 적당한 생리적 샘플 등에 존재하는 농도를 측정하는 방법에 사용할 수 있다.
특정의 구체적인 예에서는, Akt3 폴리펩타이드의 활성에 효능제로서 또는 길항제로서 작용하는 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항체는 후술되는 리간드 동정 분석법을 사용하여 시험할 수 있다. 특히, 이 항체는 세포내 발현된 scFv 항체일 수 있다.
유전자 요법 및 형질전환 벡터
어팝토시스 및 괴사를 통한 심근 세포의 사멸은 급성 심근 경색 및 심기능부전을 일으킨다. 사람 Akt3은 ASK1 유래 및 저산소증 유래의 어팝토시스 및 세포 사멸을 억제한다. 따라서, 본 발명은 사람 Akt3 단백질을 암호화하는 핵산을 환자에게 투여하는 유전자 요법을 포함한다. 급성 심근 경색의 경우에 Akt3을 이용한 유전자 요법은 세포 사멸된 양 및 최종 경색 크기를 감소시켜 경색후 향상된 기능과 생활 정도의 개선 및 사망률의 감소를 산출해낸다. 또한, 감소된 경색 크기는 경색 후 심기능부전의 발생 환자수를 감소시킬 것으로 예상된다. 이미 심기능부전이 있는 환자의 경우에는, Akt-3을 이용한 유전자 요법에 의해 근세포의 손실을 감소시켜 심실 확장의 과정을 지연시키고, 질병의 진행을 완화시키며 생활 정도를 향상시키고 입원의 필요성을 감소시킬 것으로 예상된다.
급성 심근 경색 동안 허혈 재관류 손상 과정은 세포 사멸을 초래한다. Akt-3은 세포 사멸을 억제한다. 따라서, Akt3 유전자 요법은 허혈 재관류 손상을 비롯한 다른 질병 상태, 예를 들면 비제한적으로 심근 허혈 재관류 손상, 발작, 간 상해, 신부전, 기관 이식(특히 심장) 및 관상동맥 바이패스 이식술의 치료에 효과적일 것으로 예상된다. 또한, Akt-3 유전자 요법은 어팝토시스를 통한 세포 사멸을 포함하는 다른 질환 상태, 예를 들면 비제한적으로 알츠하이머 질환, 긴경변 및 골관절염의 효과적인 치료법일 것으로 예상된다.
벡터에 적당히 병입시킨 본 발명의 핵산 및 이를 함유하는 약제학적 조성물은 많은 병리 상태의 치료에 유용할 수 있다. 특히, 임의 종류의 조직, 특히 심장내에서 유전자를 생체내 전이 및 발현시키는데 유용할 수 있다. 이 치료법은 또한 치료하고자 하는 병리 상태에 따라 표적화될 수 있다(특정 조직으로의 전이는 특히 벡터의 선택, 및 특정 프로모터의 선택에 의한 발현을 통해 결정될 수 있다). 본 발명의 핵산 또는 벡터는 저산소증 유래의 세포 사멸에 대한 예방, 어팝토시스, 심근 경색, 괴사, 세포 증식, 대사산물의 합성, 단백질 합성, DNA 복제 및/또는 전사 등과 같은 다양한 세포 기능에 특이적으로 작용할 수 있는 단백질을 사람 또는 동물내에서 생체내 및 세포내적으로 생산하는데 유리하게 사용된다. 따라서, 본 발명에 의하면 여러 병리 상태를 기원으로 하거나 그로부터 생기는 세포 이상, 특히 어팝토시스를 포함하는 이상을 특이적, 국소적 및 효과적으로 치료할 수 있다.
전술한 바와 같이, "벡터"는 본 발명에 기재된 핵산을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 모든 수단이다. 바람직한 벡터는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, Akt3 단백질 또는 이의 폴리펩타이드 도메인 단편을 암호화하는 유전자는 바이러스 벡터를 사용하여 또는 직접적인 DNA 도입을 통해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 도입시킨다. 표적 조직내에서의 발현은 돌연변이 벡터를 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드 등을 이용하여 특정 세포에 대해 표적화하거나 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하거나, 또는 그 두 방법 모두를 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 전술한 바와 같이 Akt3 활성의 조절인자를 선별하거나 생물학적 시험하기 위해 세포를 형질감염시키거나 또는 유전자 요법을 위해 akt3 유전자 또는 akt3 안티센스 유전자를 생체내 또는 생체외에서 전달하여, 예를 들면, Akt3 활성 농도를 증가 또는 감소시킬 목적으로 사용할 수 있다. 항Akt3 scFv를 발현하는 벡터 역시 후술되는 기법을 사용하여 도입시킬 수 있다.
생체내 및 생체외 표적화 및 치료법 절차에 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터는 DNA 기초 벡터 및 레트로바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터를 작제하여 사용하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[예를 들면, Miller and Rosman, Biotechniques 7:980-990 (1992)]. 바이러스 벡터는 복제 결손형, 즉 표적 세포에서 자발적으로 복제할 수 없는 것이 바람직하다. 일반적으로, 본 발명의 범위내에서 사용되는 복제 결손형 바이러스 벡터의 게놈은 감염된 세포내에서 바이러스의 복제에 필요한 영역 하나 이상이 결실된 것이다. 이 영역은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기법에 의해 비기능성화되거나 또는 제거(전체 또는 부분적으로)될 수있다. 이러한 기법으로는 필수(복제에 필요한) 영역에 대한 하나 이상의 염기의 부가, 전체 제거, 치환(다른 서열로의 치환, 특히 삽입된 핵산에 의한 치환) 또는 부분적 결실을 포함한다. 이러한 기법은 유전자 조작 기법을 사용하거나 또는 돌연변이유발제로 처리하여 시험관내(분리된 DNA에 대하여) 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 복제 결손형 바이러스는 바이러스 입자를 캡슐화하는데 필요한 게놈 서열을 보유하는 것이 바람직하다.
DNA 바이러스 벡터로는 약독화된 또는 결손형 DNA 바이러스, 예를 들면 비제한적으로 단순 포진 바이러스(HSV), 파필로마바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스 등을 포함한다. 바이러스 유전자가 전부 또는 거의 전부 결실된 결손형 바이러스가 바람직하다. 결손형 바이러스는 세포에 도입된 후에는 복제능이 없어 생산적인 바이러스 감염을 유도하지 못한다. 따라서, 결손형 바이러스 벡터를 사용하면 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수도 있다는 걱정없이 특정한 일부 영역에 있는 세포에 투여할 수 있다. 따라서, 특정 조직은 특이적으로 표적화할 수 있다. 특정 벡터의 예로는 결손형 헤르페스 바이러스 1(HSV1) 벡터[Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], 당단백질 L 유전자를 결실시킨 결손형 헤르페스 바이러스 벡터[특허 공개 RD 제371005 A호] 또는 기타 결손형 헤르페스 바이러스 벡터[국제 특허 공개 WO 제94/21807호, 1994년 9월 29일자로 공개; 국제 특허 공개 WO 제92/05263호, 1994년 4월 2일자로 공개]; 약독화된 아데노바이러스 벡터, 예를 들면 문헌[Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992);La Salle et al., Science 259:988-990 (1993)]에 의해 개시된 벡터; 및 결손형 아데노관련 바이러스 벡터[Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)]가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
생체내 투여시에는, 바이러스 벡터와 형질감염된 세포의 면역탈활성화를 피하기 위하여 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터와 함께 적당한 면역억제 처리를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 인터루킨-12(IL-12), 인터페론-γ (IFN-γ) 또는 항CD4 항체와 같은 면역억제 사이토킨을 바이러스 벡터에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 차단시키기 위하여 투여할 수 있다[예를 들면, Wilson, Nature Medicine(1995) 참조]. 또한, 최소의 항원을 발현하도록 제작된 바이러스 벡터를 이용하는 것이 유리하다.
물론, 본 발명은 유전자 요법 용도에 치료학적으로 유효한 양의 Akt3을 발현하는 벡터를 전달하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료학적으로 유효한 양"이란 숙주의 활성, 기능 및 반응에 있어서 임상적으로 유의한 결손을 약 15% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 감소시키고, 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미한다. 또는, 치료학적으로 유효한 양은 숙주내에서 임상적으로 유의적인 질환의 개선을 유발하기에 충분한 양이다.
아데노바이러스 벡터
바람직한 구체적인 예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 본 발명의 핵산을 다양한 세포 종류에 효율적으로 전달하기 위하여 변형시킬 수 있는 진핵성 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스에는 다양한 혈청형이 존재한다. 이 혈청형 중에서 타입 2 또는 타입 5의 사람 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스[WO 제94/26914호 참조]를 사용하는 것이 본 발명의 범위내에서 바람직하다. 본 발명의 범위내에서 사용할 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스로는 개, 소, 쥐[예, Mav1, Beard et al., Virology 75(1990) 81], 양, 돼지, 조류 및 원숭이(실시예: SAV) 기원의 아데노바이러스를 포함한다. 바람직하게는 동물 기원의 아데노바이러스는 개의 아데노바이러스이고, 보다 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스(예, Manhattan 또는 A26/61균주(ATCC 제VR-800호))이다.
바람직하게는, 본 발명의 복제 결손형 아데노바이러스 벡터는 ITR, 캡시드화 서열 및 당해의 핵산을 포함한다. 보다 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터의 적어도 E1 영역이 비기능적인 것이다. E1 영역 중의 결실부는 Ad5 아데노바이러스의 서열 중 뉴클레오타이드 455 내지 3329(PvuII-BglII 단편) 또는 382 내지 3446 (HinfII-Sau3A 단편)인 것이 바람직하다. 또한, 다른 영역, 특히 E3 영역 [WO 제95/02697호], E2 영역[WO 제94/28938호], E4 영역[WO 제94/28152호, WO 제94/12649호 및 WO 제95/02697호], 또는 후기 유전자 L1 내지 L5 중 임의의 유전자도 변형시킬 수 있다.
바람직한 구체적인 예에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역에 결실부를 갖고 있다(Ad1.0). E1 결실된 아데노바이러스의 예는 문헌[EP 제185,573호]에 개시되어 있고, 그 내용은 본 발명에 참고 인용된다. 또 다른 바람직한 구체적인 예에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역 및 E4 영역에 결실부를 갖고 있다(Ad3.0). E1/E4 결실된 아데노바이러스의 예는 본 발명에 참고 인용되는 문헌[WO 제95/02697호 및 WO 제96/22378호]에 개시되어 있다. 또 다른 바람직한 구체적인 예에서, 아데노바이러스 벡터는 E4 영역과 상기 핵산 서열이 삽입된 E1 영역에 결실부를 갖고 있다[본 발명에 참고 인용되는 FR 제94 13355호 참조].
본 발명에 개시된 복제 결손형 재조합 아데노바이러스는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기법으로 제조할 수 있다[Levrero et al., Gene 101 (1991) 15, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 구체적으로, 특히 당해의 DNA 서열을 보유하는 플라스미드와 아데노바이러스 간의 상동성 재조합에 의해 제조할 수 있다. 이 상동성 재조합은 상기 아데노바이러스와 플라스미드로 적당한 세포주를 동시형질감염시킨 후 실시한다. 사용되는 세포주는 바람직하게는, (i) 상기 성분들로 형질전환될 수 있어야 하고, (ii) 복제 결손형 아데노바이러스의 게놈 일부와 상보적일 수 있고, 바람직하게는 재조합의 위험을 피할 수 있도록 통합 형태인 서열을 포함해야 한다. 사용할 수 있는 세포주의 예는 Ad5 아데노바이러스의 좌측부(12%)가 게놈에 통합되어 있는 사람 배 신장 세포주 293[Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59], 및 문헌[WO 제94/26914호 및 WO 제95/02697호]에 개시된 바와 같이 E1 및 E4 기능에 상보할 수 있는 세포주이다. 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 잘 알려진 표준 분자 생물학적 기법을 사용하여 회수 및 정제한다.
아데노관련 바이러스 벡터
아데노관련 바이러스(AAV)는 감염된 세포의 게놈에 안정하고 부위 특이적 방식으로 통합될 수 있는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이 바이러스는 세포의 성장, 형태 또는 분화에 어떤 영향도 미치지 않고 다양한 세포를 감염시킬 수 있고 사람의 병리상태에 관계하는 것으로 보이지 않는다. AAV 게놈은 클로닝, 서열 분석 및 특성이 규명되어 있다. 약 4700개의 염기와 각 말단에 이 바이러스의 복제 오리진으로서 작용하는 약 145개 염기의 역위된 말단 반복체(ITR) 영역을 포함한다. 이 게놈의 다른 부분은 캡슐화 기능을 보유하는 2개의 필수 영역, 즉 바이러스 유전자의 바이러스 복제와 발현에 관여하는 rep 유전자를 포함하는 게놈의 좌측부 및 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측부로 나뉜다.
AAV 유래의 벡터는 시험관내 및 생체내에서 유전자를 전달하기 위한 용도에 관하여 이미 개시되어 있다[WO 제91/18088호; WO 제93/09239호; US 제4,797,368호, US 제5,139,941호, EP 제488 528호]. 상기 공보들은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 당해의 유전자로 치환된 다양한 AAV 유래의 작제물 및 시험관내(배양된 세포로) 또는 생체내에서(유기체에 직접) 당해의 유전자를 전달하기 위한 상기 작제물의 용도에 대하여 개시하고 있다. 본 발명에 기재된 복제 결손형 재조합 AAV는 당해의 핵산 서열이 2개의 AAV 역위된 말단 반복체(ITR) 영역에 인접해있는 플라스미드 및 AAV 캡슐화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 이용하여 사람 헬퍼 바이러스(예, 아데노바이러스)로 감염된 세포주를 동시형질감염시켜 제조할 수 있다. 그 다음, 생산된 AAV 재조합체를 표준 기법으로 정제한다.
또한, 본 발명은 게놈내에 AAV ITR이 인접해 있는 Akt3을 암호화하는 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 AAV 유래의 재조합 바이러스에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 AAV 유래의 2개의 ITR이 인접해 있는 Akt3을 암호화하는 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 플라스미드는 핵산 서열을 전달하기 위하여 그대로 사용될 수 있으며, 경우에 따라 리포솜 벡터(슈도바이러스)에 병입될 수도 있다.
레트로바이러스 벡터
다른 구체적인 예에서는 상기 유전자가 문헌[예, Anderson et al., 미국 특허 제5,399,346호; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al., 미국 특허 제4,650,764호; Temin et al., 미국 특허 제4,980,289호; Markowitz et al., 1988, J.Virol.62:1120; Temin et al., 미국 특허 제5,124,263호; EP 제453242호, EP 제178220호; Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; 국제 특허 공개 번호 WO 제95/07358호, 1995년 3월 16일자로 공개, Dougherty et al; 및 Kuo et al., 1993, Blood 82:845]에 개시된 바와 같이 레트로바이러스 유전자에 도입될 수도 있다. 레트로바이러스는 분열 세포를 감염시키는 통합 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 2개의 LTR, 캡슐화 서열 및 3개의 암호 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터에서 gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 그 전체 또는 일부가 결실되고, 당해의 이종성 핵산 서열로 대체된다. 이 벡터는 여러 종류의 레트로바이러스, 예를 들면 HIV, MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하베이 육종 바이러스"); SNV("비장 괴사 바이러스"); RSV("라우스 육종 바이러스") 및 Friend 바이러스로부터 제작할 수 있다. 결손형 레트로바이러스 벡터는 문헌[WO 제95/02697호]에 개시되어 있다.
일반적으로, 핵산 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서는, LTR, 캡슐화 서열 및 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 작제한다. 이 작제물을 사용하여 플라스미드에 결손된 레트로바이러스 기능을 자동적으로 공급할 수 있는 팩키징 세포주를 형질감염시킨다. 일반적으로, 팩키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 팩키징 세포주에 대해서는 종래 기술에 개시되어 있고, 그 예로는 세포주 PA317[미국 특허 제861,719호]; PsiCRIP 세포주 [WO 제90/02806호] 및 GP+envAm-12 세포주[WO 제89/07150호]가 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스 벡터는 일부 gag 유전자를 포함할 수 있는 확장된 캡슐화 서열 뿐만 아니라 전사 활성을 억제하기 위해 LTR 내에 변형을 포함할 수 있다[Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 재조합 레트로바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 표준 기법으로 정제한다.
레트로바이러스 벡터는 감염성 입자로서 작용하거나 1 회의 형질감염을 수행하도록 작제할 수 있다. 전자의 경우에는 바이러스를 종양원의 형질전환 성질에 중요한 유전자를 제외한 모든 유전자를 보유하고 이종성 유전자를 발현하도록 변형시킨다. 비감염성 바이러스 벡터는 바이러스 팩키징 시그날은 파괴하지만 이종성 유전자와 팩키징 시그날을 함유하도록 제작된 동시 도입형 바이러스를 팩키징하는데 필요한 구조 유전자는 보유하도록 제조한다. 따라서, 생산된 바이러스 입자는 또 다른 바이러스를 생산할 수 없게 된다.
표적형 유전자 전달에 대해서는 문헌[국제 특허 공개 WO 제95/28494호, 1995년 10월에 공개]에 개시되어 있다.
비바이러스 벡터
또 다른 방법으로, 벡터는 리포펙션법에 의해 생체내에서 도입될 수 있다. 시험관내에서 핵산을 캡슐화 및 형질감염시키기 위한 리포좀의 사용은 과거 10년 동안 증가되어 왔다. 리포좀을 매개로 한 형질감염시 나타나는 단점과 위험을 제한하기 위하여 고안된 합성 양이온 지질은 마커를 암호화하는 유전자를 생체내 형질감염시키기 위한 리포좀의 제조에 사용할 수 있다[Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413-7417 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al., Science 259:1745-1748(1993)]. 양이온성 지질의 사용은 음전하를 나타내는 핵산의 캡슐화 및 음전하를 나타내는 세포막과의 융합을 촉진시킬 수 있다[Felgner and Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. 핵산의 전이에 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물은 문헌[국제 특허 공개 WO 제95/18863호 및 WO 제96/17823호와, 미국 특허 제5,459,127호]에 개시되어 있다. 외인성 유전자를 생체내의 특정 기관으로 도입시키기 위해 사용되는 리포펙션법은 몇가지 실용적인 잇점이 있다. 특정 세포에 대한 리포좀의 분자 표적화가 한 가지 잇점이다. 특정 세포 종류에 대한 유도성 형질감염은 세포 이종성이 있는 조직, 예를 들면 췌장, 간, 신장 및 뇌에서 특히 유리하다는 것이 밝혀져 있다. 지질은 표적화를 위하여 다른 분자에 화학적으로 결합될 수 있다[Mackey et al., 상기 문헌 설명 참조]. 표적화된 펩타이드, 예를 들면 호르몬 또는 신경전달물질, 및 단백질, 예를 들면 항체 또는 비펩타이드성 분자가 리포좀에 화학적으로 결합시킬 수 있다.
또한, 핵산을 생체내 용이하게 형질감염시킬 수 있는 다른 분자, 예를 들면 양이온성 올리고펩타이드[예, 국제 특허 공개번호 WO 제95/21931호], DNA 결합 단백질 유래의 펩타이드[예, 국제 특허 공개번호 WO 제96/25508호] 또는 양이온성 중합체[예, 국제 특허 공개번호 WO 제95/21931호]도 사용될 수 있다.
벡터를 나출형 DNA 플라스미드로서 생체내 도입시킬 수도 있다[미국 특허 제5,693,622호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호 참조]. 유전자 요법에 사용되는 나출형 DNA 벡터는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 바람직한 숙주 세포로 도입시킬 수 있다. 그러한 방법의 예로는 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전법, 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 트랜스포터(transporter)의 사용이 있다[예를 들면, Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967(1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624(1988); Hartmut et al., 캐나다 특허 출허원 제2,012,311호, 1990년 3월 15일자로 출원; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]. 또한, 수용체를 매개로 한 DNA 전달 방법도 사용할 수 있다[Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]. 바람직한 나출형 DNA 벡터로는 조절성 복제 오리진을 가진 pCOR[WO 제97/10343호 참조] 및 복제 오리진과 마커 유전자가 결실된 미소원형 플라스미드[WO 제96/26270호 참조]가 있다.
약제학적 조성물 및 전달
또한, 본 발명은 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 전술한 바와 같은 Akt 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 Akt 단백질 또는 폴리펩타이드와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 유전자 요법용 생물학적 물질의 제조에 적합하다. 따라서, 바람직한 구체적인 예에서 조성물은 사람 Akt3 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.
본 발명에 개시된 바이러스성 또는 비바이러스성의 모든 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클 중에서 생체내 도입할 수 있는 것이 바람직하다. 용어 "약제학적으로 허용되는"이란 생리적으로 허용되며 사람에게 투여했을 때 구토, 현기증 등과 같은 알레르기 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 일반적으로 야기하지 않는 조성물 및 분자 실체를 의미한다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는"이란 미국 연방 정부 또는 주정부의 의약청의 승인을 받거나 또는 미국 약전이나 동물용, 특히 사람용으로 널리 인정된 다른 약전에 기재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 비히클 또는 운반체를 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면 물 및 오일, 예를 들면 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 그 예로는 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함한다. 물 또는 수용액, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액의 담체로서 바람직하게 사용된다. 적합한 약제학적 담체에 대해서는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 개시되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 경피, 안내 등의 투여용으로 제조할 수 있다.
약제학적 조성물은 주사용 제제의 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 것이 바람직하다. 이 조성물은 특히 멸균된 등장성 식염수 용액(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이 의 혼합물)이거나 또는 적당한 때 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하면 주사용 용액이 만들어질 수 있는 무수, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.
이 조성물은 특히 등장성, 멸균 식염수 용액(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이 염들의 혼합물)이거나 또는 적당한 때 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하면 주사용 용액이 만들어질 수 있는 무수, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.
바람직한 멸균 주사용 제제는 비독성의 비경구적으로 허용성인 용매 또는 희석제 중의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클의 예로는 식염수, 완충 식염수, 등장성 식염수(예, 인산일나트륨, 인산이나트륨,염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이의 혼합물), 링거액, 덱스트로스, 물, 멸균수, 글리세롤, 에탄올 및 이의 혼합물이 있다. 바람직하게는, 1,3-부탄디올 및 멸균 고정화 오일이 용매 또는 현탁매질로서 사용된다. 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 비롯하여 임의 상표의 고정화 오일이 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산 역시 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
투여시 사용되는 단독물 또는 벡터에 병입된 상태의 본 발명에 개시된 핵산의 투여량은 여러 매개변수, 특히 사용되는 투여 방식, 당해의 병리상태, 발현시키고자 하는 유전자 또는 원하는 치료 기간에 따라 조정될 수 있다. 일반적으로 말하면, 본 발명에 개시된 재조합 바이러스의 경우에 104내지 1014pfu 사이의 투여량, 바람직하게는 106내지 1010pfu 사이의 투여량 형태로 조제 및 투여한다. 용어 pfu(플라크 형성 단위)는 바이러스 용액의 감염력에 해당하는 것으로, 적합한 세포 배양물을 감염시키고, 일반적으로 48시간 후 감염된 세포 플라크의 수를 측정하여 결정한다. 바이러스 용액의 pfu 역가의 측정 기법은 문헌에 잘 개시되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료학적으로 유효한 양"은 숙주의 활성, 기능 및 반응에 있어서 임상적으로 유의적인 결손을 약 15% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 감소시키고, 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미한다. 또는, 치료학적으로 유효한 양은 숙주내에서 임상적으로 유의한 질환의 개선을 유발하기에 충분한 양이다.
본 발명의 조성물은 비경구 또는 경점막, 예를 들면 경구, 비측 또는 직장또는 경피적으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여는 비경구, 예를 들면 정맥내 주사이며, 예를 들면, 소동맥내, 근육내, 피내, 경피, 복강내, 심실내 및 두개내 투여를 포함하고, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 조성물의 투여는 치료 부위, 특히 심장에 직접 주사하여 실시할 수 있다.
심장에 대한 바람직한 투여 경로는 심장에 직접 주사하는 것이다[미국 특허 제5,693,622호]. 심장은 당해 기술 분야에 유용한 모든 기법, 예를 들면 자기 공명 영상화 또는 컴퓨터 보조 X선 단층 촬영을 사용하여 영상화할 수 있으며, 치료 조성물은 예를 들면 입체전략적 주사로 투여한다. 심장으로의 투여는 카테테르를 이용하여 실시할 수도 있다[미국 특허 제5,851,521호].
또 다른 구체적인 예에서, 사람 Akt3 폴리펩타이드, 또는 이 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물은 조절방출형 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 또는 폴리펩타이드는 정맥내 주입, 이식된 삼투 펌프, 경피형 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식으로 투여할 수 있다. 한 가지 구체적인 예에서는, 펌프를 사용할 수 있다[Langer, 상기 문헌 설명 참조; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)]. 다른 구체적인 예에서는 중합체 물질을 사용할 수 있다[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol.Chem. 23:61 (1983); Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)]. 또 다른 구체적인 예에서는, 치료 표적, 즉 심장 부근에 조절 방출 시스템을 배치할 수 있으며, 따라서 전신 투여량의 일부만으로도 충분하게 된다[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 상기 문헌 설명 참조, vol.2, pp. 115-138(1984)]. 다른 조절 방출 시스템은 랭거의 보고서[Science 249:1527-1533(1990)]에서 설명된 바 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내 또는 경피성 투여 경로로 전달할 수 있다. 또는, 적당하게 조제된 조성물은 비측 또는 경구 투여로 투여할 수 있다. 생물학적 물질의 일정 공급은 일정한 간격, 예를 들면 1일, 매 12시간 등으로 치료적 유효 투여량(즉, 피검체의 대사적 변화를 유도하기에 효과적인 투여량)을 제공함으로써 얻을 수 있다. 이 매개변수는 치료받는 질병 상태의 정도, 실시되는 다른 작용, 예를 들면 식이 변화, 체중, 연령 및 피검체의 성별, 및 다른 기준에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 표준 우수 의약 처방에 따라 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 범위내에서 생물학적 물질이 투여되는 유기체는, 사람인 것이 바람직하나, 모든 동물일 수도 있다. 즉, 당업자라면 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이 본 발명의 방법 및 약제학적 조성물은 특히 포유동물, 비제한적으로 가축, 예를 들면 고양이과, 개과 피검체, 사육 동물, 예를 들면 비제한적으로 소, 말, 염소, 양 및 돼지 피검체, 야생 동물(야생 또는 동물원 동물에 관계없음), 연구용 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등, 조류종, 예를 들면 병아리, 칠면조, 명금류 등, 즉 수의용의 모든 동물에 투여하기에 특히 적합하다.
스크리닝 분석법
본 발명의 Akt3 단백질을 암호화하는 유전자의 동정 및 분리는 천연 공급원에서 분리할 수 있는 양보다 다량으로 또는 세포의 형질감염 또는 형질전환 후 발현된 Akt3의 활성을 나타내도록 특별하게 제작된 지시 세포에서 Akt3을 발현시킬 수 있다. 따라서, Akt3 폴리펩타이드의 구조를 기초로 한 효능제 및 길항제의 추론적인 디자인 외에도 본 발명은 당해 기술 분야에 공지된 다양한 스크리닝 분석법을 사용하여 Akt3의 특정 리간드를 동정하는 다른 방법을 제공한다.
Akt3은 어팝토시스로부터 세포를 보호한다. 따라서, 어팝토시스의 억제력을 향상시키는 Akt3의 효능제는 심근 경색 또는 허혈 재관류 손상을 겪는 환자의 치료 동안 Akt3의 활성을 향상시킬 것으로 예상된다. 한편, 세포 생존률의 증가는 종양 발생의 한 요인으로서, 종양을 형성 및/또는 진행시킬 수 있다. 따라서, Akt3 활성 억제제는 종양 세포 생존율을 감소시켜 종양을 퇴화시킬 것으로 예상된다.
당해 기술 분야에 공지된 스크리닝 기법은 Akt3 효능제 또는 길항제를 선별하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 사람 배 신장 HEK293 세포와 같은 사람 Akt3 및 ASK1을 발현하는 적합한 세포주를 마커 유전자, 예를 들면 β-갈락토시다제를 암호화하는 핵산으로 형질감염시킬 수 있다. 그 다음, 세포를 효능제 또는 길항제를 함유하는 시험 용액에 노출시킨 뒤 β-갈락토시다제 활성에 대하여 발색시킬 수 있다. 시험 용액에 노출되지 않은 대조군 세포에 비하여 보다 많은 β-gal 포지티브 세포의 존재는 시험 용액에 Akt3 효능제가 존재한다는 것을 나타낸다. 반대로, 시험 용액에 노출되지 않은 대조군 세포에 비하여 보다 적은 β-gal 포지티브 세포의 존재는 시험 용액에 Akt3 길항제가 존재한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 소분자 리간드 또는 리간드 유사체 및 모방체에 대한 스크리닝 방법, 뿐만 아니라 생체내에서 Akt3에 결합하여 효능제 또는 길항제로서 작용하는 천연 리간드의 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들면, Akt3 활성에 효능제 또는 길항제로서 작용하는 분자를 선별하기 위하여 본 발명의 분석법을 사용하여 천연 생성물 라이브러리를 선별할 수 있다.
공지된 Akt3의 1차 서열 및 이 서열과 기능이 공지된 단백질과의 서열의 유사성은 이 단백질의 억제제 또는 길항제로서 초기의 실마리를 제공할 수 있다. 길항제의 동정 및 선별은 단백질의 구조적 특징을, 예를 들면 X선 결정학, 중성자 회절, 핵자기 공명 분광학, 및 기타 구조 결정의 기법을 사용하여 측정하면 더욱 용이해진다. 이러한 기법에 의해 효능제 및 길항제를 추론적으로 디자인 또는 동정할 수 있다.
또 다른 방법으로, 재조합 박테리오파아지를 사용하여 대형 라이브러리를 생산할 수 있다. "파아지법"[Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science 249:404-406 (1990)]을 사용하면 보다 대형의 라이브러리를 작제할 수 있다(106내지 108화학적 실체). 사용할 수 있는 또 다른 방법은 주로 화학적 방법, 예를 들면 게이센법[Geysen et al., Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)] 및 포도르 등의 방법[Fodor et al., Science 251:767-773 (1991)]이다. 문헌[Furka et al., 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013(1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991), Houghton(미국 특허 제 4.631.211호, 1986년 12월에 허여) 및 Rutter et al.(미국 특허 제5,010,175호, 1991년 4월 23일자로 허여)]에서는 효능제 또는 길항제로서 시험될 수 있는 펩타이드의 혼합물을 생산하는 방법을 개시하고 있다.
또 다른 양태로, 본 발명에 따른 Akt3 리간드를 선별하기 위하여 합성 라이브러리[Neels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4 (1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lam et al., 국제 특허 공개 번호 WO 제92/00252호; Kocis et al., 국제 특허 공개번호 WO 제94/28028호, 모두 본 발명에 참고인용됨] 등을 사용할 수 있다.
이 스크리닝 방법은 Akt3을 발현하는 재조합 세포를 사용하여 실시하거나 또는 정제된 단백질, 예를 들면 전술한 바와 같이 재조합적으로 생산된 단백질을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 전술한 문헌들에 기재된 바와 같이 표지된 가용성 Akt3을 사용하여 라이브러리를 선별할 수 있다.
한 가지 구체적인 예에서, Akt3은 직접 표지될 수 있다. 또 다른 구체적인예에서, 표지된 2차 시약을 사용하여 당해의 분자, 예를 들면 고상 지지체에 부착된 분자에 대한 Akt3의 결합을 검출할 수 있다. 결합은 효소 표지에 의해 발색단의 원위치 형성을 통해 측정할 수 있다. 적합한 효소로는 비제한적으로 알칼리성 포스파타제 및 서양고추냉이 퍼옥시다제가 있다. 또 다른 구체적인 예에서, 당해의 여러 수용체 분자 상에 2개의 효소 표지를 가진 두 가지 발색원성 기질을 사용하는 2색 분석법을 사용할 수 있다. 교차 반응성 리간드 및 단독 반응성 리간드는 2색 분석법으로 동정할 수 있다.
본 발명에 유용한 다른 표지로는, 유색의 라텍스 비드, 자기 비드, 형광 표지(예, 형광성 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 유리 또는 킬레이트화된 란탄족 염, 특히 Eu3+), 화학발광성 분자, 방사능동위원소 또는 자기 공명 영상화 표지등이 있다. 2색 분석법은 상이한 파장에서 방출하는 형광단 또는 2 이상의 유색 라텍스 비드를 사용하여 실시할 수 있다. 표지물은 육안 또는 기계적/광학적 수단으로 검출할 수 있다. 기계적/광학적 수단으로는 FACS와 유사한 형광성 활성화 분류법 및 현미조작기 제거 수단을 포함한다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, Akt3 단백질의 농도는 단백질의 대사적 표지화로 평가할 수 있다. [35S]-메티오닌이 보충된 배양액의 존재하에 조직 생검을 시험관내 항온배양하는 동안 대사적 표지화가 일어나면, 검출된 마커의 각 농도는 시험관내 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. [35S]-메티오닌을 이용한 대사적(또는생합성적) 표지화 외에도, 본 발명은 [14C]-아미노산 및 [3H]-아미노산(안정한 위치에 트리튬이 치환되어 있음)으로의 표지화를 제공한다. 따라서, 샘플이나 화합물의 라이브러리는 본 발명의 단백질을 표지한 후, 예를 들면 은, 금, 쿠마시 블루 또는 아미도-슈바르쯔를 이용한 비색 염색법; 예를 들면 [32P]-오르토인산염, [125I], [131I]에 의한 동위원소 표지화; 형광 또는 화학발광성 태그; 및 표지된 항체 또는 마커의 특정 결합 파트너를 이용한 면역학적 검출법으로 직접 분석할 수 있다.
이하, 본 발명의 예로서 제공되는 실시예를 참고로 하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이다. 본 발명은 이 실시예에 의해 제한되지 않는다.
일반적인 분자 생물학 기법
분자생물학에 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들면 정제용 플라스미드 추출, 염화세슘 구배에서의 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 페놀 또는 페놀/클로로포름에 의한 단백질 추출, 식염수 용액에서의 DNA의 에탄올 또는 이소프로판올 침전, 이. 콜라이의 형질전환 등은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌[Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982 (2nd Ed., 1989); Ausubel F.M.et al., (eds), "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에 충분히 설명되어 있다.
통상적인 클로닝 운반체로는 pBR322 및 pUC형의 플라스미드, M13 시리즈의 파아지를 포함한다. 이것은 시판(제조원: Bethestha Research Laboratories)되므로 입수용이하다.
연결을 위하여, DNA 단편은 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동으로 크기별로 분리한 뒤, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 다음 제조업자의 추천에 따라 파아지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 항온처리한다.
5' 돌출 말단의 충전은 제조업자의 지침서에 따라 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I(제조원: Biolabs)의 클레나우 단편을 사용하여 실시할 수 있다. 3' 돌출 말단의 제거는 제조업자의 추천에 따라 사용된 파아지 T4 DNA 폴리머라제(제조원: Biolabs)의 존재하에 실시한다. 5' 돌출 말단의 제거는 S1 뉴클레아제로 조절 처리하여 실시한다.
합성 올리고데옥시뉴클레오타이드에 의하여 시험관내 유발된 돌연변이는 제조원(Amersham)에서 공급하는 키트를 사용하여 문헌[Taylor et al., Nucleic Acids Res. 13(1985) 8749-8764]에 개시된 방법에 따라 실시할 수 있다.
PCR[폴리머라제 촉매된 연쇄 반응, Saiki R.K.et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth.Enzym. 155 (1987) 335-350] 기법에 의한 DNA 단편의 효소적 증폭은 "DNA 가열 순환기"(제조원: Perkin ElmerCetus)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 실시할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열의 확인은 제조원(Amersham)에서 공급하는 키트를 사용하여 생거 등에 의한 개발된 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467]에 따라 실시할 수 있다.
플라스미드 DNA는 퀴아젠 플라스미드 정제 시스템(제조원: Qiagen)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제할 수 있다.
실시예 1: 사람 Akt3의 클로닝
본 실시예는 Akt3 단백질을 암호화하는 핵산의 클로닝에 관한 것이다.
실시예 1.1: Akt3에 대한 cDNA 라이브러리 선별
데이터베이스를 조사하여 하나의 사람 cDNA 클론이 사람 Akt1 및 Akt2와 상이하지만 상동성이 있는 사람 cDNA 서열의 연속물을 포함하는 것을 확인하였다. 이러한 종래 알려지지 않은 사람 Akt 동형체(본 명세서에는 사람 Akt3이라 명명함)의 전체 길이의 암호화 서열을 분리하기 위하여 사람 심장 cDNA 라이브러리를 5'-UTR 및 N-말단 사람 Akt3의 암호 영역에 상응하는 cDNA 프로브로 선별하였다.
사람 cDNA 클론(ID#479072)은 구입하였다(제조원: Genome System Inc.). 5'-UTR(비해독 영역)의 일부 및 사람 Akt3의 5'-암호화 서열의 일부를 포함하는 이 DNA의 한 단편을 다음과 같은 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다: AKT3-5'UTR-F3(5' TCC AAA CCC TAA AGC TGA TAT CAC 3'; 서열 3) 및AKT3-C-R1(5'CCT GGA TAG CTT TCC ATT C 3'; 서열 4). cDNA 프로브는 제조업자의 지시에 따라 랜덤 프라이머 DNA 표지화 키트(제조원: Boerhinger Mannheim)를 사용하여 [α-P32]dCTP로 표지하였다. 이 프로브를 제조업자의 지시에 따라 바이오래드 크로마토그래피 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.
cDNA 파아지 라이브러리 선별을 위하여 처음에는 백만 이상의 파아지 클론을 사용하였다(제조원: Clontech, Cat# HL5027t). 숙주 세포 XL1-B는 LB 배지(20㎎/㎖ 테트라사이클린, 0.2% 말토오스 및 10mM MgCl2보충됨)에서 37℃하에 밤새 접종하였다. 파아지 감염 및 막으로의 전달은 문헌[Maniatis, 1989]에 기재된 바와 같이 실시하였다. 막은 변성, 복원 및 소성시킨 뒤 하이브리드화 용액과 65℃에서 4시간 동안 예비하이브리드화하였다. P32표지된 프로브의 변성된 형태(10분 동안 열변성)를 막에 첨가하여 하룻밤 동안 하이브리드화하였다. 하이브리드화 후, 막을 2 X SSC/0.1% SDS, 1 X SSC/0.1% SDS 및 0.5 X SSC/0.1% SDS로 65℃에서 연속 세척하였다. 막을 공기건조하고 코닥 X선 필름에 노출시켰다. 이와 같이 1차 선별한 후 포지티브 클론을 2차 및 3차 선별을 위해 선발하였다. 수득한 포지티브 파아지를 정제하고, 파아지 DNA를 제조업자(Boehringer Manheim)의 지시에 따라 BM25.8-25 숙주 세포를 사용하여 플라스미드 DNA로 변환시켰다.
완전한 서열 분석과 추가 특성을 규명을 위하여, 2개의 포지티브 클론을 선택하였다. 이 클론 중 하나(클론#9)는 5'-UTR의 일부와 사람 Akt3의 N-말단 암호화 서열(aa1 내지 127)을 포함한다. 또 다른 클론(클론#1)은 사람 Akt3 서열의 대부분(aa15 내지 C-말단)과 3'-UTR을 포함한다. 이 2개의 부분 서열을 융합시켜 전체 길이 cDNA 서열을 제조하였다. 사람 Akt3을 암호화하는 전체 서열은 서열 1에 제시한 바와 같다. 이에 대응하는 아미노산 서열은 서열 2에 제시하였다. 도 1a에는 래트 Akt3 서열과 사람 Akt3 서열을 정렬시켜 제시하였다. 도 1b에는 사람 Akt3 서열과 사람 Akt1 및 Akt2 서열을 함께 정렬시켜 제시하였다.
중요한 것은, Akt3이 Akt1 및 Akt2 보다 짧아서, 이 분자의 C-말단에 있는 Akt1 또는 Akt2와 Akt2 사이에 유의적인 상동성이 없다는 점이다. 특히, 사람 Akt-3의 C-말단 부위에 있는 마지막 14개의 아미노산은 사람 Akt1 및 Akt2에 존재하는 것과 상이하다. 중요한 것은, Akt1의 C-말단에 있는 Ser473이 조절에 중요한다는 것이다[Stokeo et al., 1997, Stephens et al. 1998]. 성장 인자의 자극시, PI3K의 활성이 활성화된다. PI3K의 생성물인 Ptdlns(3,4,5)-P는 Akt1에 결합하여 세포질 유래의 Akt1을 세포질의 내막에 근접한 위치로 Akt1을 전위시키고, 여기에서 트레오닌 잔기 308과 세린 473이 인산화된다[Downward, 1998]. 이 잔기의 인산화는 Akt1의 활성화에 중요하다. 최근 확인된 단백질 키나제, PDK1은 Thr308의 인산화에 중요한 역할을 한다. 하지만, Ser473을 인산화시키는 키나제는 아직 확인되지 못하였다[Stokeo et al., 1997, Stephens et al. 1998]. 사람 Akt3에는 Ser473이 결실되어 있어 상이한 인산화 패턴을 나타내고 Akt3 활성의 상이한 조절을 나타낸다.
실시예 1.2 : 노던 블롯 분석에 의한 Akt3 조직 분포의 측정
Akt3의 발현 패턴을 시험하기 위하여 사람의 다중 조직 mRNA 블롯을 사람 Akt3의 특정 5'-UTR에서 유래되는 p32-표지된 cDNA 프로브와 하이브리드화하였다. 사람의 다중 조직 mRNA 블롯은 제조원(Clontech)에서 구입하였다. 5'-UTR에 대응하는 사람 Akt-3 cDNA의 단편은 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다: Akt3-5'-UTR-F1(5'-TTT CGG AGG CTC TAG TTT GGT G-3'; 서열 15) 및 Akt3-5'UTR-R1(5'-CCC AAC TTG GAG AAA TGG TAC-3'; 서열 16). cDNA 50ng을 랜덤 프라이밍된 DNA 표지화 키트(제조원: Boehriger Manheim)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 표지하였다. 하이브리드화는 정제 및 68℃에서 1시간 동안 가열한 프로브(제조원: Clontech)와 하이브리드화 블롯을 사용하여 제조자의 지시에 따라 실시하였다. 하이브리드화 후, 블롯을 실온(각 세척 당 20분)에서 용액 1(2 X SSC, 0.05% SDS)로 2회 세척하였다. 그 다음, 블롯을 용액 2(0.1% SSC, 0.1% SDS)로 50℃에서 30분 동안 세척하였다. 세척후, 블롯을 -80℃에서 코닥 X선 필름에 하룻밤 동안 노출시켰다. 그 결과, Akt3은 심장에서 최고 농도의 발현율을 나타내면서 편재적으로 발현되었다(도 2).
실시예 2: Akt3 발현 플라스미드의 작제
PI3K의 활성은 혈청 또는 성장 인자 자극시 유도된다. 활성화된 PI3K는 PI3을 PI3-P로 변환시키고, 이 PI3-P는 Akt1의 AH/PH 도메인에 결합하여 세포질로부터 세포질막으로의 Akt1의 전위를 유도한다[Downward 1998, Alessi et al. 1996]. 세포질막에서 Akt는 PDK1에 의해 인산화되고 더욱 활성화된다[Stokoe et al. 1997,Stephens et al. 1998]. N-말단에서 v-Src의 미리스틸화 서열(막 편재화용)과 융합된 Akt는 Myr-Akt 변이체의 막 편재화를 유도한다. 이와 같이 막에 편재된 Akt는 구성적 활성형[Kulik et al., 1997]으로, 다양한 자극에 의해 유도되는 어팝토시스를 억제한다.
본 실시예는 활성화된 Akt3의 발현 플라스미드의 작제에 관한 것이다. 먼저 2개의 부분 cDNA 클론(전술한 클론 #1 및 클론 #9)을 융합시켜 전체 길이 AKT3 암호화 서열을 얻었다. 사람의 Src 미리스틸화 서열을 함유하는 DNA를 전체 길이 Akt3 서열의 N-말단에 융합시켰다. HA-태그 서열은 전체 길이 Akt3 서열의 C-말단에 융합시켰다(발현 검출용). 이 키메라 MyrAkt3HA의 서열은 CMV 프로모터의 조절하에 배치하였다. 완전한 작제물은 CMV6-MyrAkt3HA(도 2a)라 명명하였다.
실시예 2.1: CMV6-MyrAktHA
본 실시예는 Akt3을 발현할 수 있는 플라스미드 및 작제적 활성형태의 사람 Akt3의 작제에 관한 것이다. 전체 길이 Akt3 암호화 서열은 다음과 같은 프라이머를 사용하여 클론#1을 PCR 증폭시켜 수득하였다: Akt3의 처음 24개 아미노산의 암호화 서열을 함유하는 hAKT3cl9-PCR5(F): (5'-ATG AGC GAT GTT ACC ATT GTG AAA GAA GGT TGG GTT CAG AAG AGG GGA GAA TAT ATA AAA AAC TGG AGG CCA AG-3': 서열 5) 및 hAKT cII-PCR3(R): (5'-TTA TTT TTT CCA GGT ACC CAG CAT GCC-3'; 서열 6).
구성적으로 활성인 Akt3 형태를 제조하기 위하여 전체 길이 Akt3의 암호화 서열을 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 코작 서열(CCACC), 사람src 유래의 미리스틸화 서열(밑줄 부분) 및 사람 Akt3의 처음 8개 아미노산(굵은 문자)을 포함하는 MyrAKT3Ha-F1(5'-GCG CGC GAA TTCCCA CC A TGG GTA GCA ACA AGA GCA AGC CCA AGG ATG CCA GCC AGC GGC GCC GC A GCA GCG ATG TTA CCA TTG TGA AAG-3'; 서열 7) 및 HA 태그의 암호화 서열(굵은 문자)을 포함하는 MyrAKT3Ha-R(5'-GCG CGC GGG CCCTTA GGC GTA GTC GGG GAC GTC GTA CGG GTA TTT TTTCCA GTT ACC CAG CAT GCC-3'; 서열 8). PCR 생성물은 EcoR1/Apa1로 절단하여 pCDNA3.1의 EcoR1/Apa1 부위에 서브클로닝하여 pCDNA3-Myr-Akt-HA를 수득하였다. MyrAktHA의 암호화 서열 역시 PCR 증폭시키고 벡터 CMV6의 Kpn1/EcoR1 부위에 서브클로닝하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 다음과 같다: CMV6-AKT3cat-F(5'-CGG GGT ACC ACC ATG GGT AGC AAC AAG AGC AAG CC AAG GAT GCC AGC CAG-3'; 서열 9) 및 CMV6-AKT3cat-R(5'-CCG GAA TTC TTA GGC GTA GTC GGG GAC GTC-3'; 서열 10). 플라스미드는 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 2.2: 사람 AKT3의 발현
본 실시예는 조직 배양중에서의 사람 AKT3의 발현에 관한 것이다. HEK293 세포 및 COS-7 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DME 배지에서 보존시켰다. 세포는 37℃하에, 5% CO2항온배양기에서 증식시켰다.
플라스미드 CMV6-[MyrAkt3HA]를 사용하여 HEK 293 세포를 순간 형질감염시켰다. 대조군으로서, HEK 293 세포를 CMV6 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염하기 1일 전에 세포는 0.2x106/㎠의 밀도로 분할하였다. 형질감염은 리포펙타민 (LipofectAmine, 제조원: Gibco BRL)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 실시하였다. 간략히 설명하면, DNA를 DME 배지(혈청이나 항생체 무첨가)에서 혼합하였다. 리포펙타민을 첨가하였다(DNA:리포펙타민 = 1㎎/4㎖). 간단히 혼합한 후, DNA/리포펙타민 혼합물을 실온에서 30분 동안 유지시켰다. 세포를 1xPBS로 세척하고, DNA/리포펙타민 혼합물에 3시간 동안 노출시켰다. 형질감염 후, 세포를 1xPBS로 2회 세척하고 DMEM-10% FBS 배지로 교체하였다.
형질감염 24시간 후, 세포를 용균시켰다. 용균물을 항HA 항체로 면역침전시키고 면역 펠릿의 키나제 활성을 Akt1의 하류 표적인 GSK-3 유래의 펩타이드를 사용하여 측정하였다[Cross et al., 1995]. Akt의 시험관내 키나제 분석은 크로스 등이 교시한 방법[Cross et al., 1995]에 따라 형질감염 24시간 후 실시하였다. 세포를 1xPBS 용액으로 2회 세척하고, 용균 완충액(50mM Tris/HCl, pH 7.4, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.5mM Na3VO4, 0.1% β-머캅토에탄올, 1% 트립톤 X-100, 50mM NaF, 5mM 피로인산나트륨, 10mM 글리세로인산나트륨, 0.5mM PMSF, 2㎍/㎖ 아프로티닌, 2㎎/㎖ 류펩틴 및 1mM 마이크로시스틴) 중에서 용균시켰다. 불용성 물질은 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 청정화시켰다. 세포 용균물은 회전 플랫폼 상에서 폴리클로날 항HA 항체(BABCO)와 함께 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 용균물에 단백질 A-아가로오스 비드를 1시간 동안 첨가해 두었다. 면역침전 후, 펠릿을 세척 용액 A(0.5M NaCl이 보충된 용균 완충액)으로 3회, 세척 용액 B(50mM Tris/HCl,pH 7.4, 0.03% Brij35, 0.1mM EGTA 및 0.1% β-머캅토에탄올)로 3회 및 키나제 완충액(20mM MOPS, pH 7.2, 25mM β-머캅토글리세로인산나트륨 pH 7.0, 1mM Na3VO4, 1mM DTT)으로 3회 세척하였다. 세척 후, 펠릿을 키나제 반응 혼합물[100mM ATP, 0.1㎎/㎖ Crosstide 기질 펩타이드(UBI), 20mM MgCl2, 10mM 단백질 키나제 A 억제제/PK1(UBI) 및 10mCi(g-32P)-ATP] 40㎕ 중에 재현탁시켰다. 30℃에서 30분 동안 반응을 실시하였다. 반응 완료 후, 혼합물을 순간 원심분리한 후, 상청액 30㎕를 p81 니트로셀룰로스지 원판(제조원: Gibco BRL) 상에 장입하였다. 니트로셀룰로스지를 180mM 인산으로 3회 세척하고(각 세척마다 10분씩), 아세톤으로 2회 세척하였다(각 세척마다 2분씩). 이 니트로셀룰로스지의 방사능 활성은 신틸레이션 계수기로 모니터하였다. CMV6[MyrAkt3HA]로 형질감염된 샘플 중에 존재하는 키나제 활성은 이 분석에서 관찰된 배경 농도와 유사한 수준인 대조군용 벡터 CMV6로 형질감염된 세포에 존재하는 활성보다 20배 더 높았다(도 2b).
형질감염된 세포내 MyrAkt3HA의 발현을 시험하기 위하여, 형질감염된 세포로부터 제조한 용균물을 항HA 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다. 세포 용균물은 전술한 바와 같이 제조하였고, SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 단백질을 니트로셀룰로스막으로 전이시킨 뒤, 차단 용액(1xPBS, 0.2% 트윈 20, 5% 탈지분유)으로 4℃에서 밤새 처리하였다. 막은 마우스 모노클로날 항HA 항체(차단 용액 중에 1:500의 희석물)와 실온에서 3시간 동안 항온처리하였다. 차단 용액으로 3회 세척(각각 15분씩)한 후, 막을 HRP가 접합된 토끼 항마우스 IgG 항체(차단용액 중에 1:1000의 희석물)와 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 차단 용액으로 3회 세척(각각 10분)하고 0.2% 트윈 20을 보충한 1xPBS 로 3회 세척한 후, 막을 제조업자의 지시에 따라 ECL(PIERCE)로 발색시키고 코닥 X선 필름에 노출시켰다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 강한 약 60KD 밴드(MyrAkt1HA의 크기와 유사, 데이터는 제시 안함)가 CMV6-[MyrAkt3HA] 형질감염된 샘플에서 관찰되었으나, CMV6 형질감염된 샘플(음성 대조군)에서는 관찰되지 않았다. 종합해 보면, 이 결과들은 CMV6-[MyrAkt3HA]으로의 형질감염이 기능적 Akt 활성을 야기한다는 것을 입증한다.
실시예 3: 사람 ASK1의 클로닝
본 실시예는 사람 ASK1 단백질을 암호화하는 핵산의 클로닝에 관한 것이다. ASK1의 전체 길이 cDNA 클론은 사람 심장 cDNA 파아지 라이브러리를 선별하여 수득하였다. 선별에 사용한 프로브는 pT7T3d를 EcoRI/NotI으로 분해하여 수득한 클론#26237(제조원: Image Consortium)의 단편이었다. 라이브러리 선별, 플라크 정제 및 파아지 DNA의 플라스미드 DNA로의 변환은 전술한 바와 같이 실시하였다. 클론 #4는 ASK1의 암호화 서열 중 대부분(아미노산 150에서부터 아미노산 1376까지)을 포함하였고, 이하 ASK1-전체 길이라고 명명하였다. ASK1-전체 길이는 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다: ASK1-Clone#4F(5'-AAG GGC CGC CAG TGT GCT GGA GAG ATG AGC GAT GCC TTC-3'; 서열 11) 및 Ask1-clone#4R(5'-CCC TCT AGA TGC TCA TTC TGC ATT TGA TCC AGC TG-3'; 서열 12). PCR 생성물은 정제하여 벡터 pCDNA3-nHA의 BstX1/Xba1 부위에 서브클로닝하였다. pCDNA3-HA-AKS1(FL)로명명한 정확한 플라스미드는 서열분석으로 확인하였다. 문헌[Ichijo et al. (1997)]은 사람 ASK1의 클로닝 및 서열에 대하여 개시하고 있다.
실시예 4: ASK1 유도성 세포 사멸의 억제
어팝토시스 자극성 키나제 1(ASK1)의 과잉 발현은 어팝토시스 세포 사멸을 유도한다[Ichijo et al.1997]. 본 실시예는 ASK1에 의해 유도된 세포 사멸을 사람 Akt3의 발현이 억제하는지를 증명하기 위한 것이다. CMV-β-gal 플라스미드를 ASK1의 발현 플라스미드(pCDNA3-HA-ASK1FL) 단독물 또는 Akt3의 발현 플라스미드 (CMV6-MyrAkt3HA)와의 조합물과 함께 사용하여 사람 배 신장 HEK293 세포를 공동형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 다음과 같은 프로토콜에 따라 β-갈락토시다제 활성에 대하여 염색시켰다. 세포를 1xPBS(Mg2+및 Ca2+제거됨)로 3회 세척하고, PBS 중의 3% 포름알데히드 용액 중에서 실온하에 10분 동안 고정시켰다. 고정화된 세포를 1xPBS로 3회 세척한 뒤, PBS 중의 4mM 페로시안화칼륨, 4mM 페리시안화칼륨, 4mM MgCl2, 400㎎/㎖ X-Gal 용액으로 37℃의 가습실에서 하룻밤 동안 염색하였다. 염색된 세포를 1xPBS로 3회 세척하고, 70% 글리세롤에 보관하였다. β-gal 포지티브 세포는 광학현미경하에 계수하였다.
도 3에 도시한 바와 같이, ASK1 발현 플라스미드(Akt3 발현 플라스미드의 부재하에)에 의한 형질감염은 β-gal 포지티브 세포를 급격히 감소시킨다. 하지만, Akt3 발현 플라스미드와 공동형질감염시키면 β-gal 포지티브 세포의 존재를 통해측정되는 바와 같이 ASK1에 의해 유도된 세포 사멸이 현저하게 억제된다. 종합해 보면, 이와 같은 결과는 활성화된 Akt3 이 ASK1에 의해 유도된 세포 사멸을 방지한다는 것을 입증하는 것이다. Akt3의 항어팝토시스 활성은 심장 조직에서의 고농도 발현과 복합적으로 심장보호용으로서 사용될 수 있음을 증명한다.
ASK1은 다양한 세포 종류에서 어팝토시스성 세포 사멸을 유도한다[Ichijo et al.1997]. 하지만, ASK1이 어팝토시스를 유도하는 분자 기작은 명확하지 않다. ASK1의 정규 장소 외에서의 발현은 다양한 스트레스 활성형 신호전달 경로, 예를 들면 MKK4/JNK 및 MKK6/p38 경로를 활성화시키고, 이 경로들의 활성화가 ASK1-유도성 어팝토시스를 매개한다는 것을 암시하였다[Ichijo et al. 1997]. 하지만, p38의 특정 억제제를 첨가하여 ASK1-유도성 어팝토시스는 거의 영향을 받지 않았는 바(데이터 제시 안함), ASK1은 p38 키나제 활성과 무관하게 어팝토시스 세포 사멸을 유도하는 것으로 추정된다.
본 발명의 결과는 활성화된 Akt3이 ASK1 유도성 어팝토시스를 유의적으로 억제한다는 것을 입증한 것으로, Akt3 또는 이것의 하류 표적들 중 하나가 ASK1 유도성 어팝토시스 경로를 억제한다는 것을 암시한다. IGF-1은 PI3K/Akt 의존적 기작을 통해 JNK 활성을 억제하는 것으로 보고되었다[Okubo et al., 1998]. Akt3은 또한 JNK의 키나제 활성을 억제하므로써 작용할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 구체적인 예들에 의해서만 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 개시된 것 외에도 본 발명의 다양한 변형들이 전술한 설명과 첨부 도면으로부터 당업자에 의해 가능할 것이다. 이러한 변형 역시 본첨부되는 청구의 범위에 속하는 것이다.
핵산 또는 폴리펩타이드에 대하여 제시된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량이나 분자 질량값은 대략적인 값으로, 설명을 위해 제공된 것이다.
다양한 공보가 본 명세서에 인용되었고, 그 내용들은 모두 본 발명에 참고 인용된 것이다.
참고 문헌

Claims (60)

  1. A. 서열 5 및 서열 6으로부터 유도된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭될 수 있는 특성;
    B. 서열 1에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 특성;
    C. 서열 2, 이의 스플라이스 변이체 및 대립형질 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 특성;
    D. 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 펩타이드내의 에피토프에 대해 생성된 항체와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 암호화하는 특성 중에서 선택된 특성을 갖는, 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 사람 Akt3 단백질을 암호화하는 분리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 사람 Akt3 단백질이 서열 2에 기술된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로하는 분리된 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 서열 1에 기술된 서열을 포함함을 특징으로하는 분리된 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍이 서열 5와 6임을 특징으로하는 분리된 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드 태그를 암호화하는 서열을 추가로 포함하여, 결과적으로 키메라 태그화된 Akt3 단백질을 암호화함을 특징으로하는 분리된 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 미리스틸화 서열을 암호화하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로하는 분리된 핵산.
  7. 제1항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 사람 Akt3 단백질을 암호화하는 핵산이 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합되어 발현능이 있는 숙주 세포에서 사람 Akt3을 발현시킬 수 있음을 특징으로하는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, RNA 분자, 플라스미드 DNA 분자 및 바이러스 벡터로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 플라스미드 DNA 분자임을 특징으로하는 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 바이러스 벡터임을 특징으로하는 벡터.
  12. 제7항에 따른 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  13. 제8항에 따른 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  14. 제12항에 있어서, 세균 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로하는 숙주 세포.
  15. 사람 Akt3을 발현시키는 조건하에서 제12항에 따른 숙주 세포를 배양 배지 중에서 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 사람 Akt3 단백질을 분리하는 단계를 포함하여, 사람 Akt3 단백질을 제조하는 방법.
  16. A. 제1항에 따른 핵산에 의해 암호화되는 특성;
    B. 서열 2에 기재된 아미노산 서열, 이의 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함하는 특성;
    C. 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 펩타이드내의 에피토프에 대해 생성된 항체와 특이적으로 결합하는 특성 중에서 선택된 특성을 갖는, 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 분리된 사람 Akt3 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로하는 분리된 사람 Akt3 단백질.
  18. 제16항에 있어서, 태그 서열을 추가로 포함함을 특징으로하는 분리된 사람 Akt3 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 미리스틸화 서열을 추가로 포함함을 특징으로하는 분리된 사람 Akt3 단백질.
  20. A. 제1항에 따른 핵산에 의해 암호화되는 특성;
    B. 서열 2에 기재된 아미노산 서열, 이의 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함하는 특성;
    C. 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 펩타이드내의 에피토프에 대해 생성된 항체와 특이적으로 결합하는 특성 중에서 선택된 특성을 갖는 사람 Akt3 단백질의 단편인, 서열Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 항원성 펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp-Lys-Lys 또는 이의 항원성 단편으로 필수적으로 이루어진 것을 특징으로하는 항원성 펩타이드.
  22. 제16항에 따른 사람 Akt3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
  23. 제22항에 있어서, 서열 Cys-Gln-Gln-Ser-Asp-Cys-Gly-Met-Leu-Gly-Asn-Trp- Lys-Lys을 가진 펩타이드내의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체.
  24. 제23항에 있어서, 폴리클로날임을 특징으로하는 항체.
  25. 제1항에 기재되고 조절 영역에 작동가능하게 결합된 핵산을 세포에 투여하는 것을 포함하여, 세포 사멸을 억제하는 방법.
  26. 내용 없슴
  27. 제25항에 있어서, 세포가 심장 세포임을 특징으로하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 세포가 심근 세포임을 특징으로하는 방법.
  29. 제25항에 있어서, 핵산이 벡터내에 존재함을 특징으로하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 벡터가 플라스미드임을 특징으로하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터임을 특징으로하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 HSV 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로하는 방법.
  33. 제25항에 있어서, 세포가 심근 경색 또는 허혈 재관류 손상으로 고통을 겪는 환자 유래임을 특징으로하는 방법.
  34. 조절 영역에 작동가능하게 결합된 제1항에 따른 핵산을 심근 경색 또는 허혈 재관류 손상으로 고통을 겪는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 심근 경색 또는 허혈 재관류 손상을 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 핵산이 환자의 심근 세포에 투여됨을 특징으로하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 핵산이 벡터내에 존재함을 특징으로하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 벡터가 플라스미드임을 특징으로하는 방법.
  38. 제34항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터임을 특징으로하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 HSV 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로하는 방법.
  40. 제1항에 따른 핵산과 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물.
  41. 리포좀, 핵단백질, 지질 또는 덱스트란과의 복합체, 또는 처리되지 않은 형태로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 형태의 제1항에 따른 핵산과 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물.
  42. 제8항에 따른 벡터와 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물.
  43. 제10항에 따른 벡터와 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물.
  44. 제11항에 따른 벡터와 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물.
  45. 제16항에 따른 Akt3 단백질과 후보 분자를 접촉시키는 단계; 및 후보 분자의 존재하에 Akt3 활성을 측정하는 단계를 포함하여, 세포내의 Akt3 활성을 자극 또는 억제하는 분자를 선별하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, Akt3 활성이 어팝토시스의 억제임을 특징으로하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 어팝토시스의 억제가 마커 유전자의 존재를 통해 측정됨을 특징으로하는 방법.
  48. 제45항에 있어서, 후보 분자가 Akt3의 효능제임을 특징으로하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 후보 분자가 Akt3의 길항제임을 특징으로하는 방법.
  50. 세포내에서 제16항에 따른 Akt3 단백질의 농도를 증가시키는 것을 포함하여, 세포내 Akt3 활성을 증가시키는 방법.
  51. 제51항에 있어서, 세포가 Akt3 단백질을 발현시키는 조건하에 Akt3을 암호화하는 벡터로 형질감염됨을 특징으로하는 방법.
  52. 세포내에서 제16항에 따른 Akt3 단백질의 농도를 감소시키는 것을 포함하여, 세포내 Akt3 활성을 억제시키는 방법.
  53. 제52항에 있어서, Akt3 단백질의 농도가, 세포내 조건하에 Akt3 mRNA에 하이브리드화하는 Akt3 안티센스 핵산을 세포에 도입시킴으로써 감소됨을 특징으로하는 방법.
  54. 제52항에 있어서, Akt3 단백질의 농도가, Akt3에 특이적으로 결합하는 일본쇄 Fv 항체(scFv)를 Akt3에 결합하여 이를 불활성화시키기에 충분한 농도로 세포에 도입시킴으로써 감소됨을 특징으로하는 방법.
  55. 제8항에 있어서, 발현 조절 서열이 포유동물 세포에서 기능적인 프로모터를 포함함을 특징으로하는 벡터.
  56. 제55항에 있어서, 프로모터가 바이러스 프로모터, 세포 프로모터 또는 합성 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로하는 벡터.
  57. 제1항에 따른 핵산을 게놈내에 포함하는 복제 결손형 재조합 바이러스.
  58. 제57항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 HSV 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로하는 복제 결손형 재조합 바이러스.
  59. 제25항에 있어서, 세포 사멸이 저산소증, 어팝토시스 또는 괴사로부터 초래되는 방법.
  60. 제34항에 있어서, 허혈 재관류 손상이 심근 허혈 재관류 손상이거나 또는 발작, 간 손상, 신부전, 기관 이식 또는 관상동맥 바이패스 이식술과 관련이 있음을 특징으로하는 방법.
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