KR20010109842A - 다양한 종류의 항원이나 항체들을 마이크로 웰 플레이트의한 웰에 각기 다른 위치에 부착, 고정하여 분석하고자하는 시료내에 존재하는 다종 다양한 항원과 항체의존재여부를 확인할 수 있게 하여 주는 실험기법. - Google Patents

Abstract

본 발명의 실험기법은 기존의 면역 검사 방법에서 각각의 면역 검사를 따로 수행함에 의해 발생하는 시간적, 경제적인 불편함을 극복하고 단시간에 많은 정보를 판독하여낼 수 있는 기법으로 micro well plate의 한 개의 well의 표면에 많은 종류의항원 또는 항체를 각기 다른 정하여진 위치에 고정, 부착하고 여기에 분석하고자하는 시료를 가하여 면역 반응을 이루게 하고 fluorescente 등의 표지자가 부착된 2차 항체를 주입하여주고 세척한 후 이를 laser scanner 나 형광 현미경 등의 분석 기기를 활용하여 각 위치별로 면역 반응 여부를 판정하는 기법이다.

본 발명의 기법은 기존의 면역 검사에서 활용되고 있는 Micro well plate를 활용하여 그 바닥면에 한 종류가 아닌 여러 종류의 항원 또는 항체를 정해진 위치에 부착 고정하여 주고 이를 시료와 반응시켜 준 이후 결과 탐지과정에서 각 위치별 반응 여부를 확인하는 기법으로, 부착하여준 항원과 항체의 종류 와 수량에 따라 많은 정보를 단시간 내에 확인할 수 있게 하여준다.

Description

다양한 종류의 항원이나 항체들을 마이크로 웰 플레이트의 한 웰에 각기 다른 위치에 부착, 고정하여 분석하고자 하는 시료내에 존재하는 다종 다양한 항원과 항체의 존재여부를 확인할 수 있게 하여 주는 실험기법.{Multiple immuno assay method in 1 micro well with coat the variable number of antigens or antibodies in 1 micro well( in 96 well micro well plate ), and each coating materials are coated at separated site in well bottom.}

본 발명은 다양한 종류의 항원이나 항체들을 micro well plate의 한 개의 Tube well 표면에 각 단백질 별로 정하여진 각기 다른 위치에 부착하고 여기에 분석하고자 하는 시료를 가하여 tube well의 각기 다른 위치에서 각기 다른 종류의 항원 항체 반응이 이루어지도록 한다. 항원 항체 반응 이후 정당한 세척 용액으로 세척하고 여기에 반응 결과 여부를 판독할 수 있도록 fluorescent가 부착된 2차 항원을 가하여 이와 항원 항체 반응을 이루도록 하고 이를 Laser scanner 또는 형광현미경 등의 판독기구를 사용하여 각 항원 또는 항체가 부착 된 위치에서 2차 항원에 부착되어 있던fluorescence 물질로부터 발생되는 fluorescence의 유무를 확인하여 시료에 어떠한 종류의 항원 또는 항체가 존재하는지 여부를 확인할 수 있게 하여 주는 실험기법이다.

그리고 본 기법을 활용할 경우 기존에 각기 다른 종류의 항원과 항체 등이 따로 고정된 well plate에서 각각 따로 수행되었던 다양한 종류의 항원 항체 검사를 간편하고 빠르게 동시에 수행할 수 있다.

기존 기법의 특징과 단점은 아래와 같다.

첫 번째 방법인 EIA ( Enzyme Immuno Assay )은 Micro well plate의 각 well 바닥 표면에 1종의 분석 대상 물질에 대한 1 차 포획 항체( 시료내의 항원을 검사하려는 경우 )나 항원( 시료내의 항체를 검사하려는 경우 )을 고정하여주고 여기에 환자 혈청을 주입하여주고 면역 반응으로 검사하고자 하는 생체 물질이 well plate에 고정 되도록 한다. 여기에 효소가 부착된 2 차 항체를 주입하여 well plate에 고정된 생체물질이나 항체에 면역 반응으로 결합할 수 있도록 하여준다. 이후 당 효소에 대한 발색 기질을 주입하여 반응을 시켜주고 발색 정도를 확인하여 정성 및 정량 검사를 시행한다.

단점은 본 기법은 1종의 분석 대상 물질의 유무와 양만을 측정할 수밖에 없는 단점을 갖고 있다.

두 번째 방법인 RIA ( Radio Immuno Assay )은 Micro well plate의 각 well 바닥 표면에 1종의 분석 대상 물질에 대한 1 차 포획 항체( 시료내의 항원을 검사하려는 경우 )나 항원( 시료내의 항체를 검사하려는 경우 )을 고정하여주고 여기에 환자 혈청을 주입하여주고 면역 반응으로 검사하고자 하는 생체 물질이 well plate에 고정 되도록 한다. 여기에 방사선 동위원소가 부착된 2 차 항체를 주입하여well plate에 고정된 생체물질이나 항체에 면역 반응으로 결합할 수 있도록 하여준다. 이후 각 tube well에 고정되어진 방사선 동위원소로부터 방출되는 방사능의 정도를 확인하여 정성 및 정량 검사를 시행한다.

단점은 1종의 분석 대상 물질의 유무와 양만을 측정할 수밖에 없는 단점을 갖고 있다. 그리고 방사선 동위원소를 활용하기에 방사능에의 노출 위험과 반감기에 의하여 검사 감도의 저하 및 보관상의 문제점들을 갖고 있다.

세 번째 방법인 Protein chip.은 alluminum 이나 유리 표면에 여러종류의 단백질을 고정 부착하고 이를 다양한 면역 반응을 통하여 분석하여 주는 실험 기법이다.

단점은 본 발명 기법과의 차이는 단백질이 고정되는 matrix가 다르다는 것으로 기본적으로 1 시료당 1 chip을 제조, 사용하여야 하며 이러한 chip들이 따로 따로 떨어져 있는 형식으로만 생산되기에 대량 검사의 경우 많은 소요시간을 필요로 하는 등의 불편한 점을 나타낸다.

본 발명은 다양한 종류의 항원이나 항체들을 micro well plate의 한 개의 Tube well 표면에 각 단백질 별로 정하여진 각기 다른 위치에 부착하고 여기에 분석하고자 하는 시료를 가하여 tube well의 각기 다른 위치에서 각기 다른 종류의 항원 항체 반응이 이루어지도록 한다.

그리고 본 기법을 활용할 경우 기존에 각기 다른 종류의 항원과 항체 등이 따로 고정된 well plate에서 각각 따로 수행되었던 다양한 종류의 항원 항체 검사를 간편하고 빠르게 동시에 수행할 수 있다.

본 발명을 살펴보면 다음과 같다.

(1) Micro well plate에 항원, 항체 별로 정하여진 위치에 항원 또는 항체를 주입하여 고정, 부착하여 준다.

(2)고정되지 않은 단백질을 세척으로 세척하여 제거하고 여기에 BSA(Bovine serum albumin)을 주입하여 상기 (1)에서 단백질을 주입 고정한 이외의 공간에 결합 시켜줌으로서 분석 대상 시료내의 여러 단백질이 비특이적으로 부착되는 것을 방지하여준다.

(가). Micro well Plate는 그림 1과 같이 96개의 작은 Tube well로 이루어져 있다.

(나). Micro well Plate내의 모든 96개 tube well에는 아래의 그림 2.와 표 1.처럼 DNA Probe가 부착 고정된다.

(다). 본 기법의 실시예를 설명하기 위하여 표 2.에서 같은 병원성 미생물 (Virus)에 대한 항원 단백질을 활용하여 혈청내의 병원성 미생물(virus)에 대한 항체를 탐지하는 실험을 활용하였다.

(3)상기 (2)에서와 같이 원하는 항원, 항체 단백질이 부착 고정된 Micro well plate 에 시료를 가하여 well plate 표면에 부착된 단백질과 시료내의 항원 또는 항체가 면역 반응으로 결합 될 수 있도록 하여준 이후 적당한 세척 용액으로 세척하여 시료의 비반응 물질을 제거한다.

(4) 시료 단백질과 면역 반응으로 결합될 수 있는 2차 항체에 fluorescent 물질이 부착하고 이를 상기 (3)의 well plate에 주입하여 2차 면역 반응을 이룰 수 잇도록 하여준 후 적당한 세척 용액으로 세척하여 준다.

(5)상기 (4)의 micro well plate를 laser scanner나 형광 현미경등의 분석 장비를 사용하여 각 단백질이 부착 고정되어진 위치별로 fluorescence의 발생 여부를 확인하여 시료내 분석 대상 물질의 존재 여부를 확인한다.

그림 1. Micro well Plate와 각 well의 모습.

그림 2. 항원 또는 항체가 부착된 Micro well plate의 Tube측면과 바닥면.

표 1. 주요 병원성 미생물(Virus)의 항원 단백질의 부착 위치.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

[실시예 1]

(1) 분석하고자 하는 환자의 시료를 본 특허의 방법에 의하여 준비된 micro well plate에 가하고 면역 반응이 이루어지도록 하여준다.

(2) 상기 (1)의 well에 적당한 세척용액을 가하여주고 반응하지 않은 시료 성분을 세척하여준다.

(3) 상기 (1)의 well에 fluorescence 물질이 부착된 2차 항체를 가하여 시료내 대상 단백질과 면역반응을 이룰 수 있도록 하여준다.

(4) 상기(3)의 well에 적당한 세척 용액을 가하여 반응하지 않은 2차 항체를 제거하여준다.

(5)상기(3)의 well을 laser scanner 또는 형광 현미경을 사용하여 fluorescence 이 발생하는 위치를 확인하여 분석한다.

그림 3. 실시예 1의 결과 예상도.

시험 결과 : 본 환자는 HBV와 HCV에 동시 감염되어 있음이 확인되었다

[실시예 2]

(1) 분석하고자 하는 환자의 시료를 본 특허의 방법에 의하여 준비된 micro well plate에 가하고 면역 반응이 이루어지도록 하여준다.

(2) 상기 (1)의 well에 적당한 세척용액을 가하여주고 반응하지 않은 시료 성분을 세척하여준다.

(3) 상기 (1)의 well에 fluorescence 물질이 부착된 2차 항체를 가하여 시료내 대상 단백질과 면역반응을 이룰 수 있도록 하여준다.

(4) 상기 (3)의 well에 적당한 세척 용액을 가하여 반응하지 않은 2차 항체를 제거하여준다.

(5)상기 (3)의 well을 laser scanner 또는 형광 현미경을 사용하여 fluorescence 이 발생하는 위치를 확인하여 분석한다.

그림 4. 실시예 2의 결과 예상도.

시험 결과 : 본 환자는 HIV와 CMV에 동시 감염되어 있음이 확인되었다.

[실시예 3]

(1) 분석하고자 하는 환자의 시료를 본 특허의 방법에 의하여 준비된 microwell plate에 가하고 면역 반응이 이루어지도록 하여준다.

(2) 상기 (1)의 well에 적당한 세척용액을 가하여주고 반응하지 않은 시료 성분을 세척하여준다.

(3) 상기 (1)의 well에 fluorescence 물질이 부착된 2차 항체를 가하여 시료내 대상 단백질과 면역반응을 이룰 수 있도록 하여준다.

(4) 상기 (3)의 well에 적당한 세척 용액을 가하여 반응하지 않은 2차 항체를 제거하여준다.

(5)상기(3)의 well을 laser scanner 또는 형광 현미경을 사용하여 fluorescence 이 발생하는 위치를 확인하여 분석한다.

그림 5. 실시예 3의 결과 예상도.

시험 결과 : 본 환자는 결핵과 Legionella에 동시 감염되어 있음이 확인되었다.

[실시예 4]

(1) 분석하고자 하는 환자의 시료를 본 특허의 방법에 의하여 준비된 micro well plate에 가하고 면역 반응이 이루어지도록 하여준다.

(2) 상기 (1)의 well에 적당한 세척용액을 가하여주고 반응하지 않은 시료성분을 세척하여준다.

(3) 상기 (1)의 well에 fluorescence 물질이 부착된 2차 항체를 가하여 시료내 대상 단백질과 면역반응을 이룰 수 있도록 하여준다.

(4) 상기 (3)의 well에 적당한 세척 용액을 가하여 반응하지 않은 2차 항체를 제거하여준다.

(5)상기 (3)의 well을 laser scanner 또는 형광 현미경을 사용하여 fluorescence 이 발생하는 위치를 확인하여 분석한다.

그림 6. 실시예 4의 결과 예상도.

시험 결과 : 본 환자는 HSV와 Malaria에 동시 감염되어 있음이 확인되었다.

[비교예 1]

본 발명의 기법과 전통적인 EIA 기법을 비교하였다.

(1) 분석하고자 하는 시료를 분석장비 등이 구비되어 있는 장소로 운반하여 이를 정해진 순서에 따라 아래의 그림과 같은 micro well plate에 일정량을 주입한다.

(2) 이때 분석의 기준이 되는 표준 시료를 함께 주입하여 분석한다.

(3) 각 micro well plate의 내부 표면에 고정되어 있는 1차 포획 항체와의 결합 반응에 의하여 대상 물질은 well plate 표면에 부착된다.

(4) 각 micro well을 세척하여 불순물을 제거하고 여기에 발색 효소가 부착된 2차 항체를 주입하여 분석 대상 물질과 결합 반응을 이루도록 하고 세척한다.

(5) 상기의 (4)에 발색 시약을 가하여 효소에 의한 분해를 이루도록 하여 발색을 시켜주고 이를 micro well plate reader등의 분석 장비로 확인한다. 이때 시료내의 분석 대상 물질의 농도는 표준 시료의 수치와 각 시료의 수치를 비교하여 판정한다.

비교 결과 : 상기의 EIA 기법은 한 종류의 분석 대상 단백질에 대하여 각각 실험을 시행하여야 한다. 이에 반하여 본 발명의 기법은 한번의 실험으로 많은 정보를 확인할 수 있게 하여준다.

[비교예 2]

본 발명의 기법과 전통적인 RIA 기법을 비교하였다.

(1) 분석하고자 하는 시료를 분석장비 등이 구비되어 있는 장소로 운반하여 이를 정해진 순서에 따라 비교예 1에서 활용된 것과 유사한 형태의 micro well plate( 그림 6. )에 일정량을 주입한다.

(2) 이때 분석의 기준이 되는 표준 시료를 함께 주입하여 분석한다.

(3) 각 micro well plate의 내부 표면에 고정되어 있는 1차 포획 항체와의 결합 반응에 의하여 대상 물질은 well plate 표면에 부착된다.

(4) 각 micro well을 세척하여 불순물을 제거하고 여기에 방사선 동위 원소가 부착된 2차 항체를 주입하여 분석 대상 물질과 결합 반응을 이루도록 하고 세척 한다.

(5) 상기(4)의 micro well plate를 방사선 동위원소 분석 장비 등의 분석 장비로 확인한다. 이때 시료내의 분석 대상 물질의 농도는 표준 시료의 수치와 각 시료의 수치를 비교하여 판정한다.

비교 결과 : 상기의 RIA 기법은 한 종류의 분석 대상 단백질에 대하여 각각 실험을 시행하여야 한다. 이에 반하여 본 발명의 기법은 한번의 실험으로 많은 정보를 확인할 수 있게 하여준다. 아울러 분석에 사용되는 시약이 방사선 동위 원소이기에 보관과 관리에 각별히 주의하여야 하며 이와 함께 시약의 제조일이 많이 경과하게 되면 사용을 할 수 없게 된다.

[비교예 3]

본 발명의 기법과 Protein chip 기법을 비교하였다.

(1) Aluminum 또는 Glass Plate 표면에 많은 수의 항원 또는 항체를 각각의 위치별로 부착, 고정한다.

(2) 상기 (1)의 Plate에 시료를 가하여 1차 면역 반응을 이루도록 하여주고 적당한 세척 용액으로 세척한다.

(3) 상기 (2)의 plate에 표지자가 부착된 2차 항체를 주입하고 2차 면역 반응을 이루도록 하여주고 적당한 세척 용액으로 세척하여준다.

(4) 상기 (3)의 Plate를 laser scanner 또는 형광 현미경을 사용하여 fluorescence 이 발생하는 위치를 확인하여 분석한다.

비교 결과 : 기존의 Protein chip는 주로 aluminum 이나 glass로 이루어진 plate 위에 많은 종류의 항원 또는 항체를 부착 고정하여 사용한다. 본 발명의 기법의 경우 micro well plate에 항원 또는 항체를 고정하기 때문에 다량의 시료를 확인하는 경우에 적합하다 이에 반하여 기존의 Protein chip은 다량 의 시료를 분석하는 경우에는 적합하지 않다.

Claims (1)

1. 여러 종류의 항원 또는 항체를 micro well plate의 한 개의 Tube안에 각각의 항체와 항원에 따라 각각의 정해진 위치에 부착하고,부착한 Tube에 혈청 시료를 주입하여 주고 Tube에 부착되어있는 항원 또는 항체와 면역반응을 이루어 결합되도록 하여주고,그 Tube를 적당한 세척 용액으로 세척하여 준 후 여기에 Fluorescence등의 표지자가 부착된 2차 항체를 주입하여 2차 면역 반응을 이루도록 하여주고,다시 Tube를 적당한 세척 용액으로 세척하고 Laser scanner 또는 형광 현미경 등으로 형광 발생 위치를 분석하여 결과를 확인하는실험기법.