KR20010104724A - 전기중합성 필름 및 그것의 제조방법 및 사용방법 - Google Patents

전기중합성 필름 및 그것의 제조방법 및 사용방법 Download PDF

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KR20010104724A
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nucleic acid
vbpy
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poly
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KR1020017011551A
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토프에이치.홀든
온코알린씨.
Original Assignee
프란시스 제이 메이어
더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
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Abstract

전극의 전도성 작용 표면에 필름을 전기중합 함으로써 전극을 제조하는 방법과 전극. 상기 전극은 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 혹은 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba](vba=4-비닐-4'-메틸-2,2'-비피리딘이고 vba=p-비닐벤조산)의 얇은 필름의 환원적 전기중합에 의해 변형되고, 상기 전극은 수용성 GMP, 폴리[G], 그리고 표면 고정된 단일-가닥 DNA 프로브의 전기화학적 검출을 위해 사용된다. 상기 필름은 Ru(vbpy)3 2+와 같은 매개체 및 p-비닐벤조산과 같은 카르복실레이트기를 갖는 관능화된 부분의 공중합체로부터 생성된다. DNA 프로브는 카르보디이마이드 반응 및 이후의 아미노-연결 단일-가닥 DNA의 아마이드화를 통해 카르복실레이트기에 공유적으로 부착된다. 구아닌 함유 부분의 존재 하에서, 구아닌의 촉매적 산화로 인한 Ru3+/2+커플(중합체의 얇은 필름에 존재하는)의 산화적 전류의 급격한 증가가 관찰된다.

Description

전기중합성 필름 및 그것의 제조방법 및 사용방법{Electropolymerizable film, and method of making and use thereof}
발명의 분야
본 발명은 핵산 혼성화를 검출하기 위한 전극 및 그러한 전극을 제조하고 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.
종래 기술의 설명
표면 변형 기술의 최근 발전은 특히 복잡한 형광(fluorescent) 검출기술과 결합하여 바이오 분석(bioassay) 기술에 대한 많은 새로운 방법을 촉진시켰다. 예를 들어, 유전자 발현 분석(Schena, M. 등, Science 1995, 270, 467); 고밀도 어레이(array) 상의 유전자 DNA의 시퀀싱(Chee, M. 등, Science, 1996, 274, 610); 및감염 생물을 동정하기 위한 핵산의 검출(Spargo, C. A. 등, Molecular and Cellular Probes, 1993, 7, 395; Martin, W. J. The Polymerase Chain Reaction; Mullis, K.B.; Ferre, F.; Gibbs, R. A, eds,;406-417, Berkhauser, Boston)은 기존의 배양 혹은 면역학적 분석-기초 방법에 비교하여 더 우수한 선택성과 감도에 대한 잠재성을 갖는다. 여기에 언급된 특허 및 공개의 개시내용은 참조로 여기에 통합되어 있다. 이러한 체계는 상당한 발전을 나타내는 반면, 여전히 광범위한 전처리 단계 및 값비싼 형광 현미경의 사용을 포함한다.
핵산의 전기화학적(electrochemical) 검출은 라벨링의 필요성을 강력하게 제거하는, 형광 바이오어세이 기술에 대한 대안을 제공한다(Johnston, D.H. 등, Metal Ions Biol. Syst. 1996, 33, 297; Johnston, D.H.; Cheng, C.C. 등, Inorg. Chem. 1994, 33, 6388; Steenken, S. 등, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 617; Johnston, D.H. 등, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8933; 및 Johnston, D.H. 등, J.Phys.Chem. 1996, 100, 13837).
본 발명은 여기에서 중합 DNA의 구아닌 핵산염기가, 초민감성 검출에 적합한 산화환원(redox)-활성 라벨의 어레이를 제공하며, 이것은 초미세전극 방법과 결합하여 PCR 증폭 전에 생리학적으로 관련된 많은 핵산을 검출하는 방법을 제공한다는, 발견을 이용한다. 개개의 미세전극의 어레이로의 통합은 고-밀도, 다중 센서 어레이를 갖는 저비용 고속-효율 장치를 허여한다.
매개체로서 Ru(bpy)3 2+을 이용하는 구아닌 염기의 촉매적 산화을 통해, 핵산을 용액 내에서 검출할 수 있다(Johnston, D.H. 등, Metal Ions Biol. Syst. 1996, 33, 297; Johnston, D.H. 등, Inorg. Chem. 1994, 33, 6388; Johnston, D.H. 등, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8933; 및 Johnston, D.H 등, J. Phys. Chem. 1996, 100, 13837). 용액 내에서, Ru(bpy)3 2+는 구아닌에서 보여지는 산화력과 유사한 1.05V에서 가역적 산화환원 커플을 나타낸다. Ru(bpy)3 2+의 용액에 구아닌 함유 DNA의 부가 시 하기 2단계의 기전에 따라 산화 전류의 촉매적 증진에 이르게 된다.
Ru(bpy)3 2+----> Ru(bpy)3 3++e-
Ru(bpy)3 3++ DNA -----> DNAox+ Ru(bpy)3 2+
여기에서 DNAox는 구아닌이 하나의 전자 산화를 겪었을 경우의 DNA를 나타낸다.
함께 계류 중인 특허출원(출원번호 08/667,338)에 나타나 있듯이, 혼성화된 DNA를 고체 지지체에 고정화 한 다음, 동일한 고체 지지체에 산화제를 고정시키고, 산화제 및 기선택된 염기와의 산화-환원 반응을 허여하기에 충분한 조건의 용액에 그 고체 지지체를 담금으로써, 산화제를 혼성화된 DNA와 반응시킬 수 있다.
함께 계류 중인 출원번호 08/950,503(중합체-전극 출원)에 나타나 있듯이, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 혹은 PET 막에 고정된 DNA 및 In-Sn Oxide(ITO) 전극에 직접적으로 부착된 DNA 프로브를 PCR 앰플리콘(amplicon) 바이오 어세이와 같은용도로 상보적 DNA의 검출에 사용된다. (Napier, M.E. 등, Langmuir 1997, 13, 6342; Napier, M.E. 등, H.H. Biovonjugate Chem. 1997, 8, 906). 본질적으로, 이전의 조사의 대부분이 1)용액 DNA와의 용액 매개체 및 2)고정된 DNA와의 용액 매개체의 두 개의 시나리오에 초점을 맞추었다.
전기화학적 공중합을 매트릭스를 제조하기 위해 사용하였다. 예를 들어, 혼성화를 검출하기 위해 올리고뉴클레오티드의 방서성라벨링과 함께 피롤기를 생산해 내는, 피롤과 피롤기를 갖는 올리고뉴클레오티드의 전기화학적으로 지향된 공중합을 통해, DNA 매트릭스를 전극 표면상에 제조하였다(Livache, T; 등, Nucleic Acids Res. 1994, 22, 2915; Roget, A. 등, Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 943). 또한, 바이오센서를 올리고뉴클레오티드 프로브로 관능화된 전기활성의 폴리피롤을 사용하여 고안하였다(Korri-Youssoufi, H. 등, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 7388).
Livache 및 Roget이 전기중합된 필름에 부착된 DNA를 검출하기 위해 방사성 라벨을 사용하고, Korri-Yousoufi가 DNA 혼성화를 간접적으로 검출하기 위해 필름 그 자체의 전압을 모니터한 반면에, 본 발명은 여기에서 구아닌으로부터의 유도(faradaic)전류를 통해 전기중합된 필름에 부착된 DNA를 직접적으로 검출할 수 있었다. 그러므로, Korri-Yousoufi 접근은 전압측정(potentiometric) 방법이고, 반면에 본 방법은 전류측정(amperometric) 방법이다. 여기에 기술된 중합체는 유도전류의 검출을 가능하게 하는, 핵산으로부터 전극으로의 전자 이동을 위한 촉매를 제공한다. 그런데 이것은 고정된 매개체 없이 실질적인 신호를 제공하기에는 너무 느리다. 게다가, 본 발명의 필름은 0-0.9V 영역에서 전기화학적으로 불활성한 반면에, 선행 폴리피롤 필름은 이 영역에서 반응성이 있다.
Yachynych의 특허(미국특허번호 5,540,828)은 산화적으로 전기중합함으로써 단백질 인식을 위한 전극을 제조하는 방법을 제공한다. Yachnych에 비교하여, 본 발명은 여기에서 핵산을 위해 사용되고, 본 발명에서는 중합체가 중합동안 산화적이라기 보다는 환원적으로 형성되고, 본 발명은 여기에서 비닐-함유 폴리머를 이용하고, 사용된 금속 복합체는 전기중합을 위한 개시제이기도 하고 고정된 매개체이기도 하다.
그러므로 본 발명의 목적은, DNA 혹은 RNA에서 구아닌 혹은 다른 기선택된 염기에 대해서 관찰되는 것과 가까운 전압에서 전자 전달 사건의 검출을 위한 표면-변형된 전극을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 용액 및 표면 고정된 종 모두에 존재하는 구아닌 염기의 전기화학적 검출에서의 사용을 위한 매개체, 즉 Ru2+센터를 고정화 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 보다 많은 수의 기선택된 염기를 함유하는 표적에 혼성화 시 보다 큰 산화적 전류를 부여하는 프로브로 변형된 전극을 생산하기 위해 전기중합을 이용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기중합의 개시제 및 기선택된 염기의 산화를 위한 매개체로서 작용하는 시약을 제공하는 것이다.
다른 목적과 잇점은 다음의 개시와 첨부된 청구의 범위로부터 보다 충분히 명백해질 것이다.
관련 출원에 대한 교차참조
본 출원은 함께 계류중인 1996년 6월 20일에 출원된 출원번호 08/667,338과 함께 계류중인 1997년 10월 14일에 출원된 출원번호 08/950,503의 일부계속출원이며, 출원번호 08/667,338은 1996년 6월 27일에 출원된(현재는 포기된) 출원번호 08/495,817의 일부계속출원이고, 출원번호 08/950,503은 출원번호 08/667,338의 일부계속출원다. 상기 출원의 개시내용은 모두 참조로 여기에 통합되어 있다.
도 1a 및 도 1b는 (A) 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 및 (B) 5:1 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba]의 0.1M TBAH를 함유하는 아세토니트릴 용액으로부터 유리질(glassy) 탄소 전극으로의 전기중합을 나타내는 사이클릭 볼타모그램이다(100mV.s 스캔속도, Ag/AgNO3 참조전극). 용액의 Ru(vbpy)3 2+농도는 0.2mM이었다.
도 2는 비변형된 GCE(A) 및 GMP의 부존재 하에서의 폴리[Ru(vbpy)3 2+]필름 변형된 GCE(B) 그리고 GMP의 존재 하에서의 폴리[Ru(vbpy)3 2+]필름 변형된 GCE(C)를 사용하여 구아노신 모노포스페이트(GMP)의 산화를 나타내는 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다(50mV/s 스캔속도, Ag/AgCl 참조전극, 50mM, pH 7.0 인산 완충용액).
도 3a는 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 필름-변형된 GCE의 첫 번째 및 두 번째 산화적 스캔을 나타내고, 도 3b는 GMP 존재 하에서 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 필름-변형된 GCE의 첫 번째 및 두 번째 산화적 스캔을 나타낸다(50mV/s 스캔속도, Ag/AgCl 참조전극, 50mM, pH 7.0 인산 완충용액).
도 4는 비변형된 GCE(A) 및 폴리[G]의 부존재 하에서의 폴리[Ru(vbppy)3 2+] 변형된 GCE(B) 그리고 폴리[G] 존재 하에서의 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 변형된 GCE(C)를 나타내는 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다(50mV/s 스캔속도, Ag/AgCl 참조전극, 50mM, pH 7.0 인산 완충용액).
도 5는 고정된 CpFe(C5H4-NH2)를 갖는 5:1 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba] 필름-변형된 GCE의 사이클릭 볼타모그램을 보여준다(50mV/s 스캔속도, Ag/AgNO3참조전극, 0.2mM Ru2+, 0.1M TBAH 용액).
도 6은 pH 6.5에 고정된 20-mer 폴리[dG]를 갖는 5:1 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba] 필름-변형된 GCE(A) 및 pH 9.0에 고정된 20-mer 폴리[dG]를 갖는 5:1 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba] 필름-변형된 GCE(B)의 볼타모그램을 나타낸다(50mV/s 스캔속도, Ag/AgCl 참조전극, 50mM, pH 7.0 인산 완충용액).
도 7은 전기중합에 대한 공중합체의 형성을 보여주는 공정 1을 나타낸다.
도 8은 표면에 아미노-연결 DNA 프로브의 고정화를 보여주는 공정 2를 나타낸다.
발명의 요약
본 발명은 여기에서 정의된 환경 하에서 중합이 일어나도록 변형된 금속 복합체를 이용하고, 전극의 전도성 작용 표면에 필름을 전기중합함으로써 전극을 제조하는 방법 및 전극을 포함한다. 전극은 폴리[Ru(vbpy)3 2+]혹은 폴리[Ru(vpby)3 2+/vba](vbpy=4-비닐-4'-메틸-2,2'-비피리딘이고 vba=p-비닐벤조산)의 얇은 필름의 환원적 전기중합에 의해서 변형되고, 수용성 GMP, 폴리[G], 표면 고정된 단일-가닥 DNA 프로브, 및 혼성화된 DNA 혹은 RNA 표적의 전기화학적 검출을 위해 사용된다. 필름은 Ru(vbpy)3 2+와 같은 매개체 및 p-비닐벤조산과 같은 카르복실레이트기를 갖는 관능화된 부분(moiety)의 공중합체로부터 형성된다. DNA 프로브는 카르보디이마이드 반응과 이후의 아미노가 연결된 단일가닥 DNA의 아마이드화에 의해 카르복실레이트기에 공유결합된다. 구아닌 함유 부분의 존재 하에서, 구아닌의 촉매적 산화 때문에 Ru3+/2+커플(중합체의 얇은 필름에 존재하는)에 대한 산화적 전류의 급격한 증가가 괸찰된다.
본 발명의 다른 목적과 특징은 다음의 개시 및 첨부된 청구의 범위로부터 보다 충분히 명백해 질 것이다.
발명의 상세한 설명 및 그 바람직한 구체예
본 발명은 전기중합성 필름을 제조하는 방법 및 그 결과물인 필름 그리고 그것의 용도에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 전기중합성 필름을 갖는 본 발명의 전극을 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다;
a) 전기중합의 개시제 및 전자-전달 매개체 모두로서 작용하는 금속 복합체와 카르복실레이트기를 갖는 관능화된 부분의 공중합체를 포함하는 필름을 전극에 전기중합하는 단계; 그리고
b) 카르보디이마이드 반응 후 아미노-연결 단일 가닥 DNA의 아마이드화를 통해 DNA 프로브를 카르복실레이트기에 공유결합시키는 단계.
본 발명의 전극은 수용성 GMP, 폴리[G], 및 기선택된 염기를 함유하는 표면 고정 핵산의 전기화학적 검출에 유용하다. 그것은 얇은 필름의 환원적 전기중합에 의해 변형된 전도성 작용 표면을 갖는 기질을 포함한다. 얇은 필름은 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 및 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba]로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 여기서 vbpy는 4-비닐-4'-메틸-2,2'-비피리딘이고 vba는 p-비닐벤조산이다.
특히, 본 발명은 바람직하게는 묽은 아세토니트릴 용액(vbpy=4-비닐-4'-메틸비피리딘)으로부터 Pt 및 유리질(glassy) 탄소 전극표면상에 환원적 전기중합함으로써 제조되는, 일반적으로 Ru(vbpy)3 2+에 기초한 RuⅡ의 폴리피리딜복합체를 함유하는 얇은 중합체 필름을 제공한다. 이러한 필름은 수용액에서 구아닌에 대해서 보여지는 것(1.05V vs Ag/AgCl) 보다 약간 높은 1.1V(모든 전압 vs Ag/AgCl)에서 산화적 산화환원 커플을 나타낸다(Abruna, H.D. 등, J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 1;Denisevich, P. 등, Inorg. Chem. 1982, 21, 2153). 그러므로 이러한 필름은 구아닌 및 구아닌 혹은 다른 기선택된 염기를 함유하는 DNA 혹은 RNA와 같은 중합체의 전기적 산화를 위한 활성 촉매이어야 한다.
더욱이, Ru(vbpy)3 2+및 p-비닐벤조산(vba)의 혼합물의 전기중합을 사용하여 루테늄 촉매를 함유하고, vba를 라벨링하는 카르보디이마이드 반응을 통해 아민-첨부 올리고뉴클레오티드가 부착할 수 있는 필름을 생산해 낸다. 본 발명의 일부분으로서, Ru(vbpy)3 2+의 필름으로 변형된 전극을 사용하여 DNA 산화를 촉진시키고, Ru(vbpy)3 2+와 vba의 공중합체를 사용하여 DNA 검출을 위한 부위-특이적으로 결합된 위치(loci)를 제조한다.
증폭
본 발명에 따른 전기중합된 막을 갖는 전극을 이용하는 공정은 핵산 시료를 올리고뉴클레오티드 프로브에 접촉시켜 혼성화된 DNA 혹은 RNA를 생산하는 것을 포함하므로, 프로브와 접촉시키기 전에 DNA 혹은 RNA를 증폭시키는 것이 어떠한 경우에는 바람직할 수 있다. 선택된 혹은 표적 핵산 서열의 증폭은 함께 계류중인 출원에서 공개되고 논의된 것과 같은 어떤 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다.
핵산의 검출
상기한 바와 같이, 본 발명은 전기중합된 막이 형성된 전극을 포함하며 이런 전극을 이용하는 방법을 혼성화 된 핵산의 검출을 가능케 한다. 이런 방법에서, 핵산 시료를 올리고뉴크레오티드와 접촉시켜 혼성화된 핵산을 형성시킨다. 본 발명의 방법에 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 4 혹은 6개의 염기에서 약 80 혹은 100개 혹은 그 이상의 염기, 보다 바람직하게는 약 8과 30개 사이의 염기로 구성된 어떠한 프로브일 수 있다. 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술에 따라 매우 다양한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드도 제조될 수 있다. 올리고뉴크레오티드 프로브를 제조하기 위해 적합한 염기는 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 및 티민과 같은 자연적으로 발생되는 뉴클레오티드 염기; 그리고 8-옥소-구아닌, 6-머캅토구아닌, 4-아세틸사이티딘, 5-(카르복시히드록시에틸)우리딘, 2'-O-메틸사이티딘, 5-카르복실메틸아미노-메틸-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 디히드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, D-갈락토실쿠에오신(galactosylqueosine), 2'-O-메틸구아노신, 이노신, 7-데아자구아노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸사이티딘, 5-메틸사이티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, D-만노실쿠에오신, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-D-리보퓨라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌, N-((9-D-리보퓨라노실퓨린-6-일)N-메틸-카르바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스터, 우리딘-5-옥시아세트산, 비부톡소신(wybutoxosine), 슈도우리딘, 쿠에오신, 2-티오사이티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 5-메틸우리딘,N-((9-D-리보퓨라노실퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 비부토신(wybutosine) 및 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘과 같은 비자연적으로 발생되는 혹은 "합성" 뉴클레오티드 염기에서 선택할 수 있다. DNA, RNA(비록 RNA가 DNA보다 덜 바람직하여도), 탄소환과 같은 변형된 당, 및 플루오로 및 메톡시와 같은 2'-치환체를 함유하는 당을 포함한 어떠한 뉴클레오티드 골격도 이용할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 가교 인산 잔기의 적어도 하나 혹은 모두가 메틸포스페이트, 메틸 포스포노티오에이트, 포스포노몰폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포라미데이트와 같은 변형된 인산(예를 들어 뉴클레오티드간 가교 인산 잔기가 교대로 기술한 바와 같이 변형될 수 있다)인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 P.Nielsen 등, 1991, Science 254, 1497-1500에 기술된 바와 같은 "펩티드 핵산"일 수 있다. 유일한 요구조건은 상기 올리고뉴클레오티드가 적어도 일부가 표적 핵산의 서열 중 알려진 부분에 상보적인 서열을 포함하여야 한다는 것이다. 핵산 시료를 다른 염기서열을 갖는 수많은 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 것이 어떤 경우에 있어서는 바람직할 수 있다(예를 들어, 시료에 두 개 이상의 표적 핵산이 있는 경우, 혹은 단일 표적 핵산이 "샌드위치" 분석에서 두 개 이상의 프로브와 혼성화되는 경우).
기선택된 염기
혼성화 후에, 전기중합된 막에 부착된 혼성화된 핵산은 막에 고정된 적절한 매개체와 반응할 수도 있고 산화-환원 반응에서 기선택된 염기를 산화시킬 수 있다. 기선택된 염기는 기선택된 매개체와 반응하여 산화가 일어나는, 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 염기나 혹은 합성 뉴클레오티드 염기일 수 있다. 기선택된 염기는 4개의 자연적으로 발생된 염기 각각과 짝지워질 때, 특이적인 산화 속도을 나타내어야 한다. 일반적으로, 5'-모노뉴클레오티드(예, 5'-데옥시리보뉴클레오티드, 혹은 5'-리보뉴클레오티드)가 104M-1s-1이 넘는 속도상수를 나타내는 염기는 촉매 반응을 이용하여 검출될 수 있다. 적절한 기선택된 염기의 예에는 구아닌, 아데닌, 8-옥소-구아닌, 그리고 8-옥소-아데닌, 8-브로모구아닌, 잔틴, 슈도우리딘우리딘캅토구아닌, 8-머캅토구아닌, 2-티오잔틴, 6-티오잔틴, 6-머캅토퓨린, 2-아미노-6-카르복시메틸-머캅토퓨린, 2-머캅토퓨린, 6-메톡시퓨린, 2-아세틸아미노-6-히드록시퓨린, 6-메틸티오-2-히드록시퓨린, 2-디메틸아미노-6-히드록시퓨린, 2-히드록시퓨린, 2-아미노퓨린, 6-아미노-2-디메틸알릴-퓨린, 2-티오아데닌, 8-히드록시아데닌, 8-메톡시아데닌이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 전형적으로, 기선택된 염기는 구아닌, 아데닌, 6-머캅토구아닌, 8-옥소-구아닌, 및 8-옥소아데닌으로 구성된 그룹에서 선택되며, 구아닌이 현재 바람직한 자연적으로 생성된 기선택된 염기이고 8-옥소구아닌이 현재 바람직한 합성 기선택된 염기이다.
매개체
전자전달을 가능하게 하고 전자중합을 개시하는데 사용하는 매개체는 a) 가역적인 산화적 산화환원 커플을 갖고 기선택된 염기를 산화시킬 수 있는, b) 산화적 산화환원 커플의 전압 이외에 전압에서 전기중합을 할 수 있는 치환체를 갖는, 그리고 c) 전기중합을 개시하는데 사용될 수 있는 다른 산화환원 커플을 나타내는 것이다. 예를 들어, 루테늄2+(2,2'-비피리딘)3(Ru(vbpy)3 2+여기서 vbpy=4-비닐-4'-메틸-2,2'-비피리딘)복합체가 구아닌의 산화를 매개할 수 있는 약 1.0 V에서 산화적 산화환원 커플을 나타내고, bpy 리간드 상의 비닐기는 중합을 위해 사용될 수 있고, 그리고 복합체는 중합을 개시하는데 사용될 수 있는 -1.1V에서 환원적 산화환원 커플을 나타낸다.
이러한 기준에 맞는 매개체는 산화적 그리고 환원적 산화환원 커플을 나타내는 비닐-치환된 폴리피리딜 리간드를 함유하는 금속 복합체를 포함한다.
산화-환원 반응의 검출
산화-환원 반응의 발생은, 본 발명 따른 전극에 전기중합된 막을 사용하여 산화-환원 반응의 발생을 지시하는 전자 신호의 변화를 관찰함으로써 검출할 수 있다. 전형적으로, 개시제를 함유하는 전기 중합된 필름으로 변형되고 핵산이 고정된 전극을 참조 및 보조 전극과 또한 접촉하고 있는 용액과 접촉시킨다(대부분의 전류는 보조 전극을 통해 지나감). 비슷하게, 적절한 참조전극은 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 Ag/AgCl 전극이 있다.
산화-환원 반응과 연관된 전자 신호의 검출은 혼성화된 핵산의 존재 여부의결정을 가능케 한다. 혼성화된 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계는 전형적으로 (ⅰ)산화-환원 반응의 반응속도를 측정하는 단계, (ⅱ) 상기 측정된 반응속도를 단일가닥 핵산과의 전이금속 복합체의 산화-환원 반응속도와 비교하는 단계, 그리고 (ⅲ) 상기 측정된 반응속도가 단일-가닥 핵산과의 전이금속 복합체의 산화-환원 반응속도와 본질적으로 동일한 지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 반응속도를 측정하는 단계는 어떠한 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상대적인 반응속도는 동일한 스캔속도, 프로브 농도, 표적 농도, 매개체, 버퍼, 온도에서 전류를 비교함으로써 및/또는 전기화학적 방법으로써 결정할 수 있다.
산화-환원 반응속도를 당업자에게 알려진 적절한 수단에 따라 측정할 수 있다. 전형적으로, 산화-환원 반응속도를 산화-환원반응의 생성과 연관된 전자 신호를 측정함으로써 측정한다. 예를 들어, 산화-환원 반응과 연관된 전자 신호를 여기에 개시된 바와 같은 전기중합된 막으로 코팅된 전극과 전자적으로 연결된 적절한 장치를 제공함으로써 측정할 수 있다. 적절한 장치는 혼성화된 핵산과 매개체 사이 반응의 산화-환원 반응속도를 측정하기 위해, 생성된 전자 신호를 측정할 수 있는 포텐시오스탓(potentiostat)이다.
전자 출력은 사이클릭 볼타메트리, 노말펄스 볼타메트리, 크로노암페로메트리(chronoamperometry) 및 스퀘어웨이브 볼타메트리를 포함한 어떠한 전기화학적 방법의 특징이며, 사이클릭 볼타메트리가 현재 바람직한 형태이다. 당해 기술분야에 알려진 컴퓨터를 전극의 사용을 제어하고 그러한 사용의 결과를 기록하는데 사용한다. 본 발명에 따라 ITO 전극에 막을 전기중합하기 위해 가장 자주 사용하는방법은 사이클릭 볼타메트리이다. 사이클릭 볼타메트리에서, 전기화학적 시스템의 전압은 초기 전압(0-800mV)에서 최종 전압(1300-1800mV)까지 직선형으로 변화한다. 최종 전압에 도달할 때, 스캔 방향은 역전되고 동일한 전압 범위가 반대방향으로 펼쳐진다. 전압은 일정한 스캔속도 (25mv/s, 50V/s)로 변화한다. 대다수의 실험에서, 초기 전압을 0mv에 맞추고 최종전압은 매개체를 산화시키기에 충분하다. 현재 바람직한 스캔속도는 1.4V의 스위칭 전압을 갖는 50mV/s이다. 전류를 각 전압에서 수집하여 데이터를 전류 vs 전압 스펙트럼으로 도시한다.
사이클릭 볼타메트리에 대한 대안으로서, 크로노쿨로메트리 혹은 크로노암페로메트리와 같은 전압 단계 방법을 본 발명의 전기중합성 막을 분석하기 위해 사용할 수 있다. 크로노쿨로메트리에서, 단계 전압(step potential)를 적용한다. 초기 전압(0-800mV)에서 시작하여, 전기화학적 시스템을 직접적으로 최종 전압(1100mV-1600mV)으로 승단시킨다(be stepped). 전기화학적 시스템을 최종 전압전압 어떤 특정 기간의 시간(50μs에서 10s)동안 유지하고 전하를 시간의 함수로서 수집한다. 비록 현재는 행해지지 않지만, 원한다면 전압을 초기 전압으로 되돌려서 초기전압에서 시간의 함수로서 전하를 수집할 수 있다. 크로노암페로메트리에서, 전기화학적 시스템을 초기 전압(0mV-800mV)에서 직접적으로 최종 전압(1000-1500mV)으로 특정 기간의 시간동안 승단시키고, 전류를 시간의 함수로서 수집한다. 원한다면, 전압을 초기 전압으로 되돌리고 전류를 초기 전압에서 시간의 함수로서 수집할 수 있다.
함께 계류중인 특허번호 08/667,337에 기술된 방법에서, 단일 혹은 이중 가닥의 핵산으로부터 전기화학적 전류를 얻기 위해 금속복합체를 사용한다. 구아닌과 같이 기선택된 염기는 전기화학적 신호를 제공하고, 이 신호는 이중가닥 DNA에서 훨씬 더 약하다. 그런 방법은 유리하게 고도의 구조적 민감성을 나타내고, 단일 염기의 미스매치(mismatch)을 해결할 수 있다. 그러므로, 그러한 방법은 DNA의 시퀀싱에 특히 유리하다. 그러나, 그런 방법의 두 가지 단점은 (a) 프로브 가닥으로부터 혼성가닥으로 가는 음의 신호가 있으며 (b) 기선택된 염의 수는 제한되어서 신호를 제한한다는 것이다. 여기에 나타낸 기술은 이런 문제점들을 해결한다. 게다가, 이런 기술은 특히 진단적 분석에 유용하다, 그리고 특히 핵산의 정량적 검출에 특히 유용하다.
선행의 관점에서, 적어도 하나의 기선택된 염기를 함유하는 표적 핵산을 함유한다고 의심 가는 시험 시료에서 표적 핵산이 존재하는 지의 여부를 검출하는 방법이 여기와 특허번호 08/667,338에 개시되어 있다. 이런 방법에서, 기선택된 염기를 올리고뉴클레오티드 프로브 보다는 표적 핵산에 위치시킨다.
시험 시료
표적 핵산을 함유하는 시료를 시험하기 위해 본 방법을 실행할 수 있다. 표적 핵산을 함유한다고 의심 가는 어떤 시험 시료를 사용할 수 있고, 이에는 생검 시료과 같은 조직 시료, 혈액, 타액, 및 정액 시료과 같은 생물학적 액체, 세균 배양물, 토양 시료, 식품 시료 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 표적 핵산은 그 특정 실험의 목적에 따라, 동물, 식물, 혹은 미생물(예, 바이러스, 세균, 원충, 및 진균을 포함하는 원핵세포 및 진핵세포 생물) 어떠한 기원이어도 된다. 예로서는외과적 시료, 의학적 진단을 위해 사용되는 시료, 유전자 검사를 위해 사용되는 시료, 환경적 시료, 식품 시료, 치과적 시료, 및 수의학적 시료가 있다. 시료를 본 방법을 수행하기 전에 당업자에게 알려지거나 명백한 기술에 따라 처리하거나 정제할 수 있고, 그것의 핵산을 본 방법을 수행하기 전에 원한다면 분해, 절단, 및/또는 증폭할 수 도 있다.
검출 방법
본 발명에 따른 전기중합 막을 갖는 전극을 사용하여 표적핵산의 기선택된 염기를 검출하는 것은 (a) 혼성화된 핵산을 형성하기 위해 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브에 시험시료를 접촉시키는 단계; (b) 혼성화된 핵산과 연관된 산화-환원반응의 존재 여부를 검출하는 단계; (c) 기선택된 염기에서 검출된 산화-환원 반응으로부터 시험시료에 표적 핵산의 존재여부를 결정하는 단계를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 고체 지지체(전기중합된 필름)에 고정하여 검출 단계 전에 일어나는 분리의 단계로서(예, 단계(a) 및 (b) 사이 혹은 단계(b) 및 (c) 사이) 혼성화된 핵산으로부터 시험 시료를 분리하는 것을 촉진할 수 있다. 택일적으로, 올리고뉴클레오티드 프로브를 용액에 유리상태로 제공하고, 다른 수단을 제공하여 혼성화된 핵산을 시료으로부터 분리할 수 있다(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 매개체 핵산에 의해, 혹은 비오틴-아비딘 결합 상호작용에 의해, 이 경우 비오틴은 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하고 아비딘은 고체 지지체지지체한다). 필름을 기질의 전도성 작용 표면과 접촉시키기 전 혹은 후에 산화-환원 반응 및 검출 단계까지의 어떠한 단계를 전기중합된 필름상에 행할 수 있다.
바람직하게는, 표적 핵산은 적어도 올리고뉴클레오티드 프로브 보다 기선택된 염기를 적어도 10개 더 넘게 함유하거나, 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 보다 적어도 50개 혹은 100개 더 넘게 기선택된 염기를 함유한다. 더 큰 현재의 발전은 표적 핵산이 올리고뉴클레오티드 보다 많은 기선택된 염기를 함유할 때, 유리하게 얻어진다.
선택적으로, 그러나 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 기선택된 염기가 없거나 적어도 본질적으로 기선택된 염기가 없다(즉, 기선택된 염기를 충분히 적게 함유하여 프로브로부터의 신호가 표적 핵산으로부터의 신호를 방해하거나 그 신호로 오해되지도 않는다). 표적 핵산에 쉽게 혼성화 하는 자연적으로 발생되는 염기의 서열은 사용 불가한 반면에, 산화환원 불활성의 교체 염기를 사용하는 전략(아래에서 논의됨)이 이용될 수 있다.
표적 핵산은 올리고뉴클레오티드 보다 바람직하게는 더 길고, 혼성화된 핵산에서 기선택된 염기 중 적어도 하나는 "돌출된(overhanging)" 염기, 즉 올리고느클레오티드 프로브에 혼성화 되지 않는다. 바람직하게는, 기선택된 염기 중 적어도 10, 50, 혹은 100개가 "돌출된" 염기이고, 그럼으로써, 검출되는 전기화학적 신호의 충분한 증폭을 제공한다.
예를 들어, 어떠한 구아닌 잔기도 함유하지 않는 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 단지 A, T 및 C)를 선택할 수 있다. 이러한 가닥의 존재 하에서,Ru(bpy)3 2+의 사이클릭 볼타모그램(voltammogram)은 올리고머 없을 때의 그것과 매우 유사하다. 그리고 나서, 겹치는 염기쌍 부위 및/또는 표적 핵산이 올리고뉴클레오티드 보다 더 길다면 돌출 부위에 구아닌을 함유하는 표적 가닥에, 이 프로브를 혼성화 한다. 다수의 구아닌이 검출되기 때문에 신호가 형성된 혼성물의 숫자에 비하여 증폭된다. 게놈(genome) DNA 혹은 RNA가 표적 가닥인 경우에 수많은 돌출 구아닌을 만날 수 있고, 엄청나게 큰 신호의 증폭을 낳을 것이다.
예를 들어, 바람직한 구체예에서, 표적 가닥의 기선택된 염기의 분석은 전극 표면에 가깝게 배향된 필름에 (바람직하게는 산화-환원이 일어나지 않는)프로브 가닥을 고정하는 것을 포함하며, 이는 스캔 시 낮은 배경(background) 신호를 제공한다. 그리고 나서 전기중합된 필름을 기선택된 염기를 함유하는 표적 가닥의 용액과 접촉시킨다. 혼성화가 일어나면, 표적 가닥은 전극의 가까이에 있게 될 것이고, 전류의 증가가 검출될 것이다. 이러한 방법은 혼성화의 정도가 클수록 표면에 기선택된 염기의 양이 더 커지고, 전기화학적 신호가 더 커지기 때문에, 특히 핵산의 정량적 검출에 적합하다.
산화환원 불활성의 교체 염기
프로브 가닥에서 구아닌의 대체물(즉, 구아닌과 같이 핵산 이중가닥에서의 다른 염기 보다 시토신에 대해 더 큰 친화성을 갖는 염기)이지만 사용되어 적용 가능한 반응 조건 하에서 매개체에 의해 산화되지 않는 교체(alternate) 염기를 사용할 수 있다. 표적 핵산의 기선택된 염기가 구아닌이고 표적 핵산 또한 시토신을 함유하는 경우(통상적으로 프로브의 구아닌과 결합하는) 프로브는 혼성화된 핵산에서 시토신과 결합하는 교체 염기를 함유한다. 예를 들어 교체 염기는 이노신일 수 있다. 이노신은 구아닌 보다 반응성이 작은 3 오더(order)의 크기를 갖는다. 반응 단계는 전형적으로 교체 염기를 산화하지 않고 기선택된 염기의 선택적 산화를 나타내기에 충분한 상태 하에서 전이금속 복합체를 핵산과 함께 반응시키는 것을 포함한다.
그러므로, 표적 핵산은 기선택된 염기를 적어도 하나 함유하고, 프로브 혹은 포획 핵산은 교체 산화환원 불활성의 염기를 함유하는, 표적 핵산을 검출하는 방법은 (a) 특이적으로 표적 핵산과 결합하여 혼성화된 핵산을 형성하는 상보적 핵산에 표적 핵산을 접촉시키는 단계; (b) 산화-환원 반응을 검출하는 단계; (c) 기선택된 염기에서 검출된 산화-환원 반응으로부터 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특징은 다음의 실시예로부터 보다 명확하게 이해될 것이며, 다음 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1
시약과 DNA
이러한 실험에서 사용한 무기 시약은 분석적 등급 혹은 더 높은 등급이다. 무기 복합체, [Ru(vbpy)3](PF6)2를 표준의 문헌적 방식(Abruna, H.D. 등, J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 1)을 이용하여 제조하였다. 검출 프로브, CpFe(C5H4-C2H4NH2)를 시아노-치환된 페로센, CpFe(C5H4-CH2CN)의 표준 LiAlH4환원 뒤 디에틸에테르로부터의 워크-업에 의해 합성하였다. 수용성 카르보디이마이드(WSC, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이마이드 히드로클로라이드), DCC(디사이클로헥실-카르보디아마이드), TBAH(테트라부틸암모늄 헥사플루오로포스페이트), NHS(N-히드록시석시니마이드), GMP(구아노신 모노포스페이트, 디소듐염), 폴리[G], 및 vba를 Aldrich(Milwauke, WI)에서 구입하고, 입수된 대로 사용하였다. 순수성을 확실히 하기 위해, 전기 화학적 실험 전에 두 번의 50% 에탄올로부터의 재결정화를 행하였다. MES(2-몰폴리노에탄올설포닉 액시드 소듐염 및 2-몰폴리노설포닉 액시드 모노하이드레이트)를 Fluka(New Ulm, 스위스)에서 구입하였다. Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl 및 아세토니트릴은 Mallinckrodt(Phillipsburg, NJ)에서 얻었다. 아세토니트릴을 잔기중합 실험에서 사용하기 전에 활성화된 분자체(sieves)로 건조하였다. 합성 뉴클레오티드는 Department of Pathology, The University of North Carolina at Chapel Hill에 의해 합성된 것이고 분자량 3000의 커트오프(cutoff)로 Amicon 미크론 3 농축기를 이용하여 정제하였다. 물을 Milli-Q Plus 정제 시스템(Millipore, Bedford, MA)으로부터 얻었다. 유리질 탄소 전극(GCE's, 3mm 직경)을 BAS(West Lafayette, IN)에서 구입하였고, 사용 전에 광택을 냈다.
실시예 2
전기화학적 분석
사이클릭 볼타모그램을 PAR 273A 포텐시오스탓/갈바노스탓을 이용하여 수집하였다. 아세토니트릴에서 행한 실험은 유리질 탄소 작용 전극, 백금 메시 카운터 전극, 및 Ag/AgNO3참조전극으로 장착된 두 개의 컴파트먼트 볼타메트릭 셀을 사용하였다. 수용성 실험을 유리질 작용 전극, 백금 와이어 카운터 전극, 및 Ag/AgNO3참조전극으로 장착된 단일 컴파트먼트 볼타메트릭 셀을 이용하여 수행하였다. 사용하기 전에 모든 GCEs를 펠트 광택 플랫폼 상에서 METADI 다이아몬드 광택 화합물(Buehler, Lake Bluff, IL) 및 Al2O3(물에서 0.5μm)로 완전히 광택을 내었다. 그리고 나서 사용 직전에 전극을 Milli-Q 물과 건조 아세토니트릴로 여러 번 헹구어 내었다. 작용 전극 컴파트먼트를 0.2mM [Ru(vbpy)3](PF6)2, 0.1M TBAH 아세토니트릴 용액 3.5ml로 채우고, 100mV/s의 스캔 속도로 -0.9 및 -2.0 V 사이에서 10번 환원적으로 스캔함으로써 전기중합 반응을 행하였다. 환원적 스캔을 하기 전에 이러한 용액을 완전히 건조하고 가스를 제거해야 하며, 참조전극 컴파트먼트를 아세토니트릴에서 0.1M TBAH로 채워야 한다. vba-도프처리된 필름의 형성을 위해 vba 용액에 대한 [Ru(vbpy)3](PF6)2의 비율이 5:1인 경우가 가장 큰 재생산성을 갖는 필름을 생산해 낸다는 것을 알아냈다. 수용성 GMP, 폴리[G], 및 부착된 DNA 프로브의 전기화학적 산화를 50mM, pH 7.0, 인산 완충용액에서 50mV/s 스캔속도에서 0.0에서 1.4V로 양의 값으로 스캔하였다.
실시예 3
필름-변형된 전극으로의 DNA의 부착
표면 카르복실기(vba의 스페이서로서 필름에 존재하는)가 잘 알려진 카르보디이마이드 화학을 이용하여 활성화되고 이어서 아미노-연결된 단일-가닥 DNA와 아미이드화 반응을 하는 표준 아마이드화 방식을 이용하여 DNA 프로브의 부착을 행하였다(Millan, K. M. 등, Anal. Chem. 1993, 65, 2317; Sehgal, D. 등, Anal. Biochem. 1994, 218, 87). 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba]의 GCE로의 전기중합 후에, 전극을 조심스럽게 아세토니트릴 용액으로 헹구어 내어 잔여 [Ru(vbpy)3](PF6)2및 TBAH를 제거하였다. 그리고 나서 전극을 역전시키고, EDC/NHS 용액(EDC 10mg 및 NHS 1mg을 1.0ml Milli-Q 물에 용해하여 제조된) 50μl 방울을 조심스럽게 전극 표면에 위치시켰다. 전극을 역전된 비이커로 30분 동안 감쌌다. 그리고 나서 처리된 GCE를 물로 여러번 헹구어 내고 조심스럽게 말려서 물기를 없앴다. 다시, 전극을 역전시키고, pH 완충된 5μM DNA 프로브 용액(20-mer, 3'-(CH2)6NH2연결 그룹을 갖는 폴리[dG] 25μl)를 전극 표면에 위치시켰다. 전극을 90분 동안 감싸서 평온하게 한 다음, 800mM NaCl, 50mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 헹구었다. 폴리머 표면과 비공유적으로 결합된 DNA와의 어떠한 정전기적 상호작용을 중단시키는 이러한 헹구는 단계에 고농도의 염용액이 필요하다.
실시예 4.
고정된 프로브의 정량.
20-mer 프로브를 표준방법에 따라서 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 γ-32P-ATP(6000 Ci/mmol)을 사용하여 5'-32P-라벨링 하였다(Maniatis, T. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989. Cold Spring Harbor Press). 미반응의 ATP를 표준 기술을 이용하여 Stratagene NucTrap 칼럼을 사용하여 라벨링된프로브로부터 제거하였다. pH 6.5 혹은 pH 9.0 카보네이트 완충용액 중 어느 하나에서 비라벨링된 프로브와 함께 0.5μM로 희석한 라벨링된 프로브 5pmol을 함유하는 DNA 스탁용액 (총270μl 부피)을 사용하여 비라벨링된 프로브에 대해서 기술된 것과 동일한 방법을 이용하여 방사성 라벨링된 프로브를 부착하였다. 고정한 후에, 프로브-변형된 필름을 기계적으로 한 장의 여과지 상에 중합체를 문지름으로써 전극표면으로부터 제거하였다. 대조 필름을 반응 중 EDC/NHC 아마이드화 단계를 제외하고 동일한 방법으로 얻었다. 그러고 나서 이러한 시료의 방사능을 3중으로 하여 모두 액체 섬광 및 포스포이미징(phosphorimaging) 기술을 이용하여 결정하였다.
실시예 5
중합체-변형된 전극의 제조.
폴리[Ru(vbpy)3 2+] 필름의 전극 표면에 대한 전기중합을 잘 특성화하여 필름을 여기에 논의된 바와 같은 다양한 스캔 시간 및 스캔 속도를 이용하여 재생산 가능한 두께로 쉽게 제작할 수 있다. 간단한 루테늄-함유 필름, 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 및 카르복실-함유 vba기, 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba]로 도프된 필름 모두에 대한 중합체의 성장을 도 1a 및 도 1B에 나타내었다. 전기중합에 대한 공중합체의 형성을 도 7에 있는 공정 1에 나타내었다. 전에 입증한 바와 같이, 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 필름을 Ru3가 형성 시 안정화되는 매체에서(즉, 건조 아세토니트릴과 강산용액) 가역적으로 매체에서 산화시킬 수 있다(Abruna, H.D. 등, J.Am.Chem.Soc. 1981, 103, 1;Denisevich, P. 등, Inorg. Chem. 1982, 21,2153). 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba] 도프된 필름에 대한 이러한 연구에서 또한 동일한 반응이 관찰된다.
실시예 6
GMP 및 폴리[G]의 검출
폴리[Ru(vbpy)3 2+] 필름으로 변형된 GCE를 pH 7.0, 인산완충용액에서 GMP 및 폴리[G]의 존재 및 부존재 하에서 산화적으로 스캔하였다(도 2,3, 및 4). 도 2에서, 0.1mM GMP 용액에 비변형된 GCE를 노출하면 폴리머-변형된 전극에 비해서 산화 전류를 현저히 더 작게 생성한다. 폴리머 자체의 산화에 의해 생성된 배경 전류를 제거해도 촉매적 전자전달 공정의 양의 전류 표시를 보인다. 제안된 촉매 기전에 대한 더 이상의 뒷받침을 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 전자공여 GMP의 존재 하에서 필름의 안정성을 도 3의 볼타모그램에 나타내었다. 전자 공여체의 적절한 농도의 존재 하에서, 필름의 루테늄 센터의 완전한 분해가 관찰된다(도 3a). 그러나, GMP가 용액에 존재할 때, 고정된 필름에 존재하는 산화된 Ru3+는 때때로 신속한 분해 전에 가까운 GMP 분자로부터 전자를 제거할 수 있다. GMP 용액에서 두 번째 산화스캔의 완료 시 GMP 산화파동의 존재가 이러한 효과를 증명한다.(도 3b) GMP 분자는 너무 커서 필름으로부터 Ruz3+의 분해로 인한 손실로 생성된 구멍을 통해 확산할 수 없다. 폴리[Ru(vbpy)3 2+필름을 GMP 용액의 부존재 하에서 산화하고 GMP 함유 용액에서 두 번째 산화 스캔을 하는 실험에서, 도 3a에서의 두 번째 스캔의 것과 동일한 볼타모그램을 관찰하였다. 2오더의 크기에 의한 GMP 용액의 희석(0.01mM)은 첫 산화 스캔동안 생성된 전류의 양에 거의 영향을 미치지 못했다. 이런 효과는 양으로 하전된 중합체 표면과 음의 GMP 사이의 정전기적 인력 때문일 수 있다. 이것은 추측컨대 벌크 용액의 농도보다 훨씬 더 큰 전극 표면에서의 국소적 농도를 일으킨다.
깨끗하고 폴리[Ru(vbpy)3 2+]변형된 전극을 사용하여 폴리[G] 산화의 사이클릭 볼타모그램을 도 4에 나타내었고, 이것은 두 개의 정의할 수 있는 특성을 증명한다. 첫째로, 폴리[G]의 전기화학적 산화가 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 필름의 부존재 하에서 일어나지 않는다. 그러한 큰 중합체가 필름으로 느리게 확산하기 때문에(사이클릭 볼타메트릭 시간 크기에 상대적으로) 폴리[G]의 산화를 검출할 수가 없다. 그러나, 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 처리된 전극의 존재 하에서, 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 산화 단독에서 관찰되는 것 이상의 전류의 증가가 보여진다. 다시, 양이온의 중합체 표면의 정전기적 인력이 Ru-매개된 촉매적 산화가 일어날 수 있는 전극 표면으로의 거대한 폴리[G] 분자의 확산을 돕는 것 같다.
실시예 7
고정된 프로브의 검출
아미노-변형된 페로센 프로브(CpFe(C5H4-C2H4NH2))를 EDC 대신에 메틸렌 클로라이드에서의 DCC로 수용성 아마이드화를 위한 동일한 프로토콜을 이용하여 10-스캔, 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba]에 부착하였다. 그리고 나서 이러한 활성화 단계 후에, 페로센 분자를 표면에 고정시키는 페로센 아미노기의 아미노화를 행한다. 측정가능한 전류가 변형된 전극의 표면에 Fe2+/Fe3+펠로센 커플의 존재를 나타내는 0.1M TBAH, 아세토니트릴 용액, 0.2V에서 관찰되었다.
아미노-연결 DNA 프로브의 표면으로의 고정화를 행하였다(도 8에 나타낸 공정 2). 고정화 반응을 두 개의 다른 pH(6.5 및 9.0)에서 행한 결과 두 개의 명확히 다른 패턴으로 화학흡착을 하였다. 더 높은 pH에서, DNA의 퓨린 및 피리미딘 고리 상의 천연 내생의 아민기와는 대조적으로, 부착된 (CH2)6NH2기의 일차 아민에서 우선적으로 일어난다. 천연-아민기의 아미드화는 DNA가 아미노-연결기뿐만 아니라 여러 천연 아민에 부착하는 전극표면을 생산할 뿐 아니라 표면에 스태플된(stapled) 더 적은 프로브 분자를 갖는 표면을 생산할 것이다. 이런 가정을 이용하여, pH 9.0에서의 아미드화는 스택킹(stacking)은 최대로 되고 천연 아민 아미드화(혹은 스태플링(stapling))은 최소화되기 때문에 더 많은 수의 고정된 DNA 프로브 가닥을 함유하는 필름을 생성할 것이다.
그리고 나서 두 개 모두의 pH에서 DNA 프로브로 처리된 필름을 산화시키고필름산화 자체에 의해 생성된 전류와 비교하였다. 도 6에서, pH 6.5에서 DNA 프로브로 처리된 필름은 검출가능한 촉매적 증가를 갖는 전류를 생산하였다. DNA 프로브가 촉매적 전류의 증가를 보여주는 pH 6.5에서 DNA 프로브가 반응하는 유일한 필름이었다(8-13 μA의 증가를 전형적으로 관찰하였다).
실시예 8
고정된 프로브의 정량
전기화학적 데이터에 근거하여, 20-mer G 프로브의 존재 하에서, 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba]에 의해 생산된 산화 전류의 촉매적 증가는 폴리머 자체의 산화와 비교할 때, 약 10μC 넘는 전하, 혹은 10-10넘는 몰의 전자(볼타모그램 적분 값에 의해 결정됨)가 전달전달은 것을 알려준다. 방사성 라벨링된 프로브를 pH 6.5 및 9.0에서 GCE 표면에 화학흡착된 DNA 프로브의 양을 정량하는 방법으로 또한 사용하였다. pH 6.5 및 9.0에서 프로브로 처리된 표면에 대한 섬광 계수는 7.4×10-12및 3.0×10-14몰이 각각 고정되었다는 것을 제시한다. 이런 데이터는 검출을 위한 포스포이미징을 사용하여 행한 별개의 라벨링 실험으로 지지된다. 고정된 DNA 프로브에 대해 얻어진 값은 pH 6.5 및 9.0에서 이러한 대체적으로 보다 민감한 기술을 이용하여 8.0×10-12및 8.0×10-13mol이었다. 전기화학적 측정에 근거하여, 10-10몰의 구아닌은 10μC의 촉매적 증가를 관찰하기 위해 산화될 필요가 있다. 방사성 라벨링 데이터와 일치하게, 이것은 표면에 고정된 구아닌 염기의 50% 가까운 산화와일치할 것이다.
실시예 9
혼성화된 핵산의 검출
전기중합된 필름을 Ru(bpy)3 2+및 vba를 통해 이전의 실시에에서와 같이 제조하였다. 구아닌을 대신하여 교체 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 카르보디이마이드 반응을 통해 필름에 부착하였다. 그리고 나서, 구아닌을 함유하고 고정된 프로브에 상보적인 표적 핵산을 함유하는 용액과 접촉시켰다. 혼성화가 일어난 후에, 전극을 0 내지 1.4V에서 50mV/s로 스캔함으로써 사이클릭 볼타메트리로 분석하였다. 전기화학적 전류는 상보적인 구아닌-함유 시퀀스에 혼성화 되지 않은 전극에서 보다 더 크다고 여겨졌다.
본 발명이 특정 구체예를 참조로 기술되었다 하여도, 수많은 변화, 변형, 및 구체예가 가능하고 따라서 모든 그러한 변화, 변형, 및 구체예가 본 발명의 정신과 영역 내에 있다고 여겨진다는 것이 이해될 것이다.

Claims (8)

  1. 전기중합 개시제 및 핵산에서 기선택된 염기의 산화를 위한 매개체로서 모두 작용할 수 있는 금속 복합체와 핵산이 부착할 수 있는 관능화된 부분을 함유하는 얇은 필름을 포함하는, 핵산의 전기화학적 검출에 유용한 전극.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 복합체는 폴리[Ru(vbpy)3 2+] 및 폴리[Ru(vbpy)3 2+/vba]로 구성된 그룹에서 선택되고 여기서 vbpy는 4-비닐-4'-메틸-2,2'-비피리딘이고 vba는 p-비닐벤조산인 것을 특징으로 하는 전극.
  3. 다음 단계를 포함하는, 핵산의 전기화학적 검출에 유용한 전극을 제조하는 방법:
    (a) 매개체와 카르복실레이트기를 갖는 기능적 부분의 공중합체를 포함하는 상기 필름을 전극에 전기중합시키는 단계; 및
    (b) 올리고뉴클레오티드 프로브를 필름에 공유결합으로 부착시키는 단계.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 프로브를 카르보디이마이드 반응 후 아미노-연결된 단일-가닥 DNA의 아마이드화를 통해 부착시키는 것을 특징으로 하는방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 매개체가 Ru(vbpy)3 2+이고 상기 관능화된 부분이 p-비닐벤조산 인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. (a) 전도성 작용 표면을 갖는 기질; 및
    (b) 상기 유도 작용 표면상에, 매개체 및 카르복실레이트기를 갖는 관능화된 부분의 공중합체를 포함하는 전기중합된 필름
    을 포함하는 핵산의 기선택된 염기의 전기화학적 검출에 유용한 전극.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 매개체가 Ru(vbpy)3 2+이고 상기 관능화된 부분이 p-비닐벤조산인 것을 특징으로 하는 전극.
  8. 다음 단계를 포함하는 시료에서의 표적 핵산의 존재를 결정하는 방법:
    (a) 매개체와 카르복실레이트기를 갖는 관능화된 부분의 공중합체를 포함하는 전기중합된 필름을 표적 핵산을 함유한다고 의심되는 시료 및 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시켜서, 핵산 및 뉴클레오티드 프로브가 필름에 혼성화된 핵산을 형성하는 단계;
    (b) 산화-환원 반응을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 검출된 산화-환원 반응으로부터 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계.
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