KR20010073943A - 히스톤 에이치2에이, 에이치2비 또는 그것의 단편을함유하는 류마티스 관절염 치료제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히스톤 H2A 또는 H2B의 새로운 용도에 관한 것으로, 진행성, 염증성 자가면역 관절염의 제반 증상을 완화할 수 있는, 히스톤 H2A, H2B의 또는 그것의 단편을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 발명이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로 히스톤 H2A, H2B의 또는 그것의 단편을 함유하며, 필요한 경우 약리학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있으며, 류마티스 관절염에 대하여 효과적으로 관절염 발생과 관절염 지수를 감소시켰다.

Description

히스톤 에이치2에이, 에이치2비 또는 그것의 단편을 함유하는 류마티스 관절염 치료제 조성물{Composition for treatment of rheumatoid arthritis containing histone H2A, H2B or its fragment}

본 발명은 진행성, 염증성 또는 자가면역성 관절염 증상을 개선할 수 있는 생물학적 활성 조성물에 관한 것이다.

관절염은 여러 치료제의 개발에도 불구하고 인구의 노령화에 따라 국내를 포함하여 여러 선진국들에서 여전히 심각한 질환으로 남아있다. 관절염은 치사율은낮지만, 운동성을 저해하여 생산성을 낮추는 등 삶의 질을 낮추는 주요 원인이 되고있다.

관절염의 종류에는 여러 가지가 있지만 그 중 가장 중요한 것은 류마티스 관절염이다. 류마티스 관절염은 자가반응성 T 임파구의 작용에 의한 자가면역성 질환으로 알려져 왔다. T 임파구는 속발성 과민반응에 의하여 병을 일으킨다. 체내의 어떠한 항원을 T 임파구가 인지하여 발병하게 되는지 정확히 알 수 없지만 콜라겐 II가 가장 유력한 것으로 알려져 있으나 다른 항원이 발병원인이 될 가능성도 배제할 수 없다. 항히스톤 자가 항체도 발견되었으나 이 항체가 발병의 원인이 되는지의 여부는 확실치 않다.

류마티스 관절염의 치료제로 여러 가지 약들이 사용되었으나 완전한 증상 개선을 이루지 못하였다. 종래의 치료제로는 비스테로이드성 항염증제(아스피린, 이부프로펜), 금제제, 페니실아민, 스테로이드성 호르몬제 등이 있다. 이중 가장 개선효과가 뛰어난 스테로이드성 호르몬제는 장기간 복용시 부작용이 따르는 문제점이 있다. 근래에는 염증 기전의 중심 역할을 하는 TNF(tumor necrosis factor)의 수용성 수용체를 유전자 재조합 기술로 생산하여 치료제로 개발하려는 노력도 있으며, 류마티스 관절염의 제반 증상인 염증, 부종, 비정상적인 신혈관 생성, 골 및 연골조직 침식 등을 개선할 보다 진보된 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

콜라겐 유발 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)은 T임파구성 류마티스 관절염의 동물 모델로 사용되어 왔다(Autoimmunity to Type II collagen: Experimental model of arthritis, J. Exp. Med. 146;857-868 (1977)). 관절염에걸리기 쉬운 실험용 쥐에 콜라겐 II를 주사하면 2주내에 파누스 형성, 뼈, 연골의 침식과 함께 관절염이 유발된다. 류마티스 관절염과 마찬가지로 콜라겐 유발 관절염도 콜라겐에 대한 체액성, 세포성 면역 반응을 일으킨다.

히스톤 H2A는 세포 핵의 중요한 구성 물질로서 핵산과 함께 염색체를 형성하는 물질로 알려져 있다. 사람을 비롯한 포유 동물에서도 여러 다른 형의 히스톤 H2A가 분리되었다(Nuc. Acids Res. Vol 17, p317-346,1989). 염색체를 구성하는 구조적 단백질로서의 기능이외에도 히스톤 H2A의 다양한 생리적 작용에 대하여 보고되었다.

소의 난소에서 분리된 GnRH-binding inhibitor가 히스톤 H2A임이 보고되었다(J. Biol. Chem. Vol 264, 11065-11071, 1989). 소의 흉선과 난소 및 쥐의 난소에서 분리된 히스톤 H2A는 모두 GnRH가 쥐의 난소 세포막에 결합하는 것을 저해하였다. 또한 히스톤 H2A를 황체세포에 처리하면 프로게스테론의 생산을 억제함이 보고되었다(Biol. Reprod. Vol 43, 1058-1063, 1990). 히스톤 H2A는 자궁내막조직에서 프로스타글란딘E가 분비되는 것을 촉진하며 뇌하수체에서 황체형성호르몬의 분비를 조절하는 것이 보고되었다(Clin. J. Physiol. Vol 39, 147-154, 1996). 한편 유방암 세포로부터 분비되는 성장인자 중 하나가 히스톤 H2A임이 보고된 바도 있다(J. Biol. Chem. Vol 271, 25126-25130, 1996). 히스톤 H2A와 그 단편인 MB35 및 히스톤 H2B는 싸이로트로핀을 분비시키는 효과가 있음도 보고되었다(Peptides vol 18, 1315-1319, 1997). 히스톤 H2A와 H2B는 하나의 안정화된 다이머 (H2A/H2B)를 형성하며 둘 다, 관절염 치료에 많이 사용되는 스테로이드의 일종인 호메오스테틱 흉선 호르몬(heomeostatic thymus hormone; HTH)의 구성물이다(Proc. Natl. Acad. Sci USA 1985;82:4871-5).

미국특허5,780,432에는 히스톤 H1, H2A, H2B, H2A:H2B, 및 H3를 임파선암 및 백혈병 치료제로 보고하였다. 한국특허출원 1998-3362에는 히스톤 H1의 류마티스 관절염 치료 효과가 제시되었다.

그러나, 어떤 종래기술도 히스톤 H2A 또는 H2B를 류마티스 관절염의 치료제로 사용할 것을 제의하지 않고 있다.

본 발명은 효과적으로 진행성, 염증성, 자가면역성 관절염 증상을 개선할 수 있는 약학 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 히스톤 H2A, H2B 또는 그것의 활성 단편을 함유하는 진행성, 염증성, 자가면역성 관절염 증상을 개선할 수 있는 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 히스톤 H2A를 투여하였을 때의 류마티스 관절염 발생율의 변화를 나타내는 그래프이다(●―●: 콜라겐 항원 접종 후 아무런 처리하지 않은 군, ■―■: 콜라겐 항원 접종 후 히스톤 H2A를 처리한 군, ▲―▲:콜라겐 항원 접종 후 덱사메타손을 처리한 군).

도 2는 히스톤 H2A 활성 단편을 투여하였을 때의 류마티스 관절염 발생율의 변화를 나타내는 그래프이다(●―●: 콜라겐 항원 접종 후 아무런 처리하지 않은 군, ▲―▲: 콜라겐 항원 접종 후 히스톤 H2A 활성 단편을 처리한 군, ).

본 발명은 진행성 또는 염증성 자가면역 관절염의 제반 증상을 완화할 수 있는, 히스톤 H2A, H2B 또는 그것의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 발명이다. 여기에서 증상 완화는 (1) 현존하는 증상의 개선; (2) 진행성 질환에서 진행의 방지 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로 히스톤 H2A, H2B 또는 그것의 활성 단편을 함유하며, 필요한 경우 약리학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.

본 발명에서 히스톤 H2A 또는 H2B의 활성 단편은 류마티스 관절염의 증상 완화 또는 치료 효과를 나타내는, 히스톤 H2A 또는 히스톤 H2B에서 유래된 단편을 의미한다. 이와 같은 히스톤 H2A 또는 H2B의 활성 단편은 일반적인 펩타이드 합성 방법에 의해 제조하거나, 원하는 활성단편을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡타로 형질전환시킨 재조합 미생물로부터 얻을 수 있다.

히스톤 H2A의 활성 단편의 한 예로, 다음과 같은 서열을 들 수 있다:

Thr-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys

위의 히스톤 H2A 활성 단편은, 두꺼비로부터 분리된 항균펩타이드인 부포린으로도 알려져 있다(Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol 229, 381-387, 1996). 이와 같은 히스톤 H2A의 활성 단편은 예를 들어 1999년도 한국특허출원 17920호 및 56378호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 즉 원하는 히스톤 H2A의 활성 단편을 코딩하는 DNA 분자와 융합파트너를 융합시켜 얻은 DNA 구조물을 포함하는 DNA 벡타를 클로닝하여 얻은 형질전화체를 배양하고, 배양된 세포를 파쇄하여 얻은 불용체를 하이드록시아민으로 절단하여 부포린 II를 얻은 후 컬럼크로마토그래피로 정제하여 원하는 히스톤 H2A의 활성 단편을 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 단독으로 또는 기존의 관절염 치료제와 함께 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 효과 즉, 히스톤 H2A, H2B 또는 그것의 활성 단편을 투여함으로써 자가면역 류마티스 관절염의 제증상을 완화할 수 있음을 확인하기 위하여, 관절염에 걸린 혹은 걸리기 쉬운 포유동물에 히스톤 H2A 또는 그것의 활성 단편을 투여하였다. 포유동물은 실험용 생쥐를 사용하였으며, 관절염은 류마티스 관절염의 잘 알려진 동물 모델인 콜라겐 유발 관절염을 사용하였다.

본 발명은 포유동물은 사람, 관절염은 류마티스 관절염으로 확대 적용할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 히스톤을 분리하는 기원에는 어떠한 제한도 없다. 또한 히스톤 H2A, H2B 또는 그것의 활성 단편은, H3, H4, 이들의 활성 단편 또는 이들의 혼합물로 확대 적용할 수 있다.

관절염의 증상을 억제하기에 충분한 히스톤 H2A, H2B 또는 그것의 활성 단편의 양은 이 분야의 전문가에 의해 특별한 어려움 없이, 치료 개체의 나이, 성별, 관절염 증상 등에 따라 적절한 양으로 결정될 수 있을 것이다.

본 발명의 경우 투여간격은 3-4일 간격이었으나, 간격을 1, 2, 4주로 늘릴 수 있을 것이며, 투여 방법은 정맥 주사나 복강내 주사가 이상적이지만 다른 투여 방법도 사용될 수 있다.

가장 효과적인 투여 방법이나 양, 간격은 환자의 증상 진행 정도와 투여 후 반응 등에 따라 의사의 진단과 처방에 따라 어려움 없이 조절될 수 있을 것이다.

본 명세서에 사용한 관절염 측정 방법은 다음과 같다.

관절염 지수로 표현되는 각 관절의 염증 정도는 매주 2명의 같은 실험자에 의하여, 다음과 같이 0부터 3까지 측정한다. 콜라겐투여 6주 후의 생쥐 중에서 선택하여 발을 촬영한다.

0: 정상상태;

1: 한두개의 발가락이 종창을 동반한 홍조를 띄거나 최소한의 종창이 유발된 상태;

2: 확실한 홍조를 띄거나 국소적 상지종창, 그리고 이러한 것들이 여러 발가락에서 관찰되는 상태;

3 :무릎까지의 상당한 부종과 종창이 관찰되며 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태.

네발을 합하여 관절염 지수를 산출하였으며 따라서 12가 최대치이다. 일반적으로 콜라겐 유도 관절염은 뒷발에만 유도되므로 지수 6~8은 증상의 정도가 극심한 것으로 이해된다(Korea J. Immunol 18, 437,1996; J. Immunol 151, 6546, 1993).

본 명세서의 실시예에서 각 실험군의 평균을 산출하기 위하여 Student's t-test가 사용되었다. Chi square test를 사용하여 표준편차치를 산출하였으며 P<0.05일 때 결과는 유의성이 있다고 판정하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 이들 실시예에 의하여 발명의 범위가 한정되지 않는다.

실시예 1. 실험용 생쥐에서 류마티스 관절염의 유도

5주령의 DBA/1J 생쥐 암컷을 일본 Charles River에서 수입하여 2주간 실험동물 사육실에서 적응하도록 한 후 7주령부터 (20-25g) 실험에 사용하였다.

분리 정량된 닭 콜라겐 II(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 0.1N 아세트산에 용해시키고(2mg/ml), complete Freund's adjuvant와 동량 섞어 4℃에서현탁액으로 만들었다. 이를 100ml씩 생쥐꼬리의 기시 부근에 주사한 후 처음 주사한 지 3주와 6주 후 동일한 방법으로 추가접종하였다(D. E. Trenthamet al., "Autoimmunity to Type II collagen: An Experimental Model of Arthritis",J. Exp. Med.146; 857-868 (1977)). 최초 콜라겐 투여 4주후부터 관절염이 발생되었다.

실시예 2. 히스톤 H2A 및 히스톤 H2A의 활성 단편 준비

히스톤 H2A은 Roche Diagnostics사의 카탈로그 번호 1034740(lyophilizate, from calf thymus, electrophoretically homogeneous)사용하였다.

히스톤 H2A의 활성 단편으로, Thr-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys 를 합성하였다. 이 DNA 서열은 한국특허 149278에 항균 활성을 가지는 펩타이드로 공지되어 있다.

실시예 3.히스톤 H2A 및 히스톤 H2A 활성 단편의 관절염 치료 효과

치료효과 검증군로써, 히스톤 H2A 처리구로 5마리 및 히스톤 H2A 활성 단편 처리구로 7마리의 생쥐를 사용하였다. 생쥐에 관절염이 유발된 후인 최초 콜라겐 접종 6주 후부터 10주 후까지 히스톤 H2A 또는 히스톤 H2A 활성 단편을 1mg/체중kg 씩 1주 2회 투여하였다. 히스톤 H2A 및 히스톤 H2A 활성 단편은 각각 PBS용액에 5mg/ml 농도로 희석하여 투여하였다. 비교군으로 7마리의 생쥐를 사용하였고, 관절염이 유발된 후인 최초 콜라겐 접종 6주 후부터 10주 후까지, 시판되는 류마티스 관절염 치료제인 덱사메타손을 1mg/체중kg 씩 1주 2회 복강내 투여하였다. 대조군은 7마리의 생쥐에 최초 콜라겐 접종 3주 후부터 10주 후까지 PBS 용액만을 300ml씩 투여하였다.

히스톤 H2A의 치료효과 검증군의 경우 항원접종 5주에는 관절염 지수 3.60±0.55로 대조군과 차이가 없었으나 6주부터 히스톤 H2A을 투여하였을 때 7주에는 관절염 지수가 4.80±0.45로 대조군에 비하여 감소하였다. 9주 이후에는 2.80으로 지수가 감소하여 이미 유발된 류마티스 관절염에 현저한 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 1). 덱사메타손을 투여한 비교군은 8주, 9주, 10주 후에 각각 4.57, 1.86, 1.86의 지수를 보였다 (도 1).

히스톤 H2A 활성 단편의 치료효과 검증군의 경우 항원접종 5주에는 관절염 지수3.14±0.69로 대조군과 차이가 없었으나 6주부터 히스톤 H2A 활성 단편을 투여하였을 때 7주에는 관절염 지수가 5.14±0.69로 대조군에 비하여 감소하였다. 9주 이후에는 3.00으로 지수가 감소하여 이미 유발된 류마티스 관절염에 현저한 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 2).

본 발명에 의해 관절염의 염증성 증상을 현저히 개선할 수 있는 류마티스 관절염 치료제를 제공할 수 있다.

Claims (2)

1. 히스톤 H2A, H2B 또는 그것의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 활성 단편이 다음 서열을 포함하는 조성물:

   Thr-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys