KR20010068676A

KR20010068676A - 5원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물의에이치씨브이 엔에스3/엔에스4 프로테아제 억제제로서의용도

Info

Publication number: KR20010068676A
Application number: KR1020000000706A
Authority: KR
Inventors: 최호일; 장승구; 안상열; 김선영; 김성규; 방정규
Original assignee: 최호일; 주식회사 펩트론
Priority date: 2000-01-07
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2001-07-23
Also published as: KR100392292B1

Abstract

본 발명은 HCV NS3/NS4 프로테아제를 억제하는 화합물과 합성과정에서 생성되는 합성 중간체에 관한 것으로서 좀더 자세히는 5-원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물(5-membered fused aromatic heterocyclic compound), 그 중간체, 유도체 및 요힘빈 계통 화합물의 HCV NS3/NS4프로테아제 억제제 용도에 관한 것이다.

Description

5원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물의 에이치씨브이 엔에스3/엔에스4 프로테아제 억제제로서의 용도{Use of 5-membered fused aromatic heterocyclic compounds as HCV NS3/NS4 protease inhibitor}

본 발명은 HCV(Hepatitis C Virus; C형 간염 바이러스) 프로테아제 억제제로서 유효활성을 지닌 5-원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물(5-membered fused aromatic heterocyclic compound), 그 중간체, 유도체 및 요힘빈 계통 화합물의 HCV NS3/NS4프로테아제 억제제 용도에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스에 대한 연구는 1987년 C형 간염 바이러스가 발견된 이래 선진국에서 다양한 연구가 진행되었으나, 아직까지도 바이러스 자체에 대해서도 밝혀지지 않은 부분이 많을 뿐만 아니라 그 치료제의 연구 개발은 초기 단계로 볼 수 있다. 현재 HCV치료제로서 유일하게 인터페론이 사용되고 있지만 치료율은 30%미만이며 투여를 중단하면 재발하고 인터페론에 내성을 갖는 변이 바이러스가 지속적으로 발생한다. 따라서 AIDS치료에서 볼 수 있듯이 C형 간염치료도 결국 복합요법으로 가리라 예상되며, 작용기전이 다른 여러 종류의 C형 간염치료제의 개발이 요구된다. C형 간염 백신으로는 바이러스를 사멸화시키거나, 바이러스의 병원성을 제거하여 약독화시키거나, 중화항체를 유도하는 바이러스의 항원 단백질들을 과량 발현시키거나, 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하는 항원 에피토프(epieope)를 이용하는 등의 기술이 있다. 중화항체 및 세포성 면역을 유도하는 항원 유전자를 기존에 안전성이 확인된 바이러스 유전자 전달체를 이용하는 백신 기술이 10년 전부터 개발되고 있으며, 최근에는 이들 항원 유전자가 도입된 네이키드(naked) DNA가 차세대 신기술로서 부각되고 있다. 이러한 다양한 백신개발 기술들 중 사멸화시킨 백신이나, 약독화시킨 백신의 개발은 효과적인 HCV 감염 배양계의 결핍으로 현단계의 기술로는 가능하지 않다. HCV 백신을 개발하기 위한 중요한 차세대 신기술들은 HCV의 외피 당단백질 E1,E2를 이용한 서브유닛(subunit) 백신, 바이러스 유전자 전달체를 이용하는 기술, 네이키드 DNA를 이용하는 기술을 들 수 있다. HCV 서브유닛 백신의 경우 중화 항체를 효과적으로 유도할 수 있는 원래 구조(native conformation)을 갖는 HCV E1, E2단백질 및 기타 HCV단백질(core, NS3, NS4)들을 다량으로 생산, 분리, 정제할 수 있는 기술의 개발이 필요하다. HCV 환자의 혈청 중에는 E2에 대한 항체가 있음에도 유전형이 다른 HCV감염이 일어나고 돌연변이가 발생하므로 중화항체를 유도할 수 있는 항원 단백질의 규명, 생산, 분리, 정제기술과 더불어 이들 항원 단백질들의 세포성 면역을 유도할 수 있는 백신 아주방트(adjuvant)개발 기술 역시 차세대로 개발되어야 할 기술이다. 바이러스 유전자 전달체나 네이키드 DNA를 이용할 경우 항원 유전자의 발현이 신체 세포 내에서 일어나 체액성 및 세포성 면역을 효과적으로 유도할 수 있으나 백신 바이러스유전자 전달체의 안전성, 중화항체 유도능 등의 문제가 해결 되어야 한다. 네이키드 DNA를 이용한 HCV 백신 개발의 경우 DNA투여용량을 최소화 시킬 수 있는 DNA전달 기술이 개발되어야 한다.

C형 간염 치료제 탐색에 표적이 되는 바이러스의 특이적 요소로는 NS3프로테아제, RNA 중합효소, RNA 헬리케이즈(helicase), 바이러스 흡수 저해제(virus absorption blocker)를 들 수 있다. 그 이유는 이러한 효소들은 바이러스 특이적인 효소이고 바이러스 증식에 필수불가결하며 인체 세포에서 이러한 효소들이 발견되지 않았기 때문이다. 바이러스는 유전자의 구조가 매우 단순하여 생존에 필수적인 극소수의 단백질만을 생산하기 때문에 항바이러스제 개발에서 표적이 될만한 단백질이 몇 가지 되지 않는데, 그 중 NS3 및 NS4 프로테아제(본 명세서에서 "NS3/NS4 프로테아제"로 표시함)가 항바이러스제의 타겟으로 많이 이용되고 있다. 이 이유는 바이러스의 단백질은 대부분 단백질로 전사된 후 프로테아제에 의해 성숙되는 과정을 거치게 되므로 바이러스에 있어서 프로테아제는 생존에 필수적인 요소이기 때문이다.

또한 바이러스의 프로테아제는 숙주의 프로테아제와는 다른 특성을 가지며, 기질을 인식하는 구조가 특이하여 특이성과 선택성이 뛰어날 뿐만 아니라 바이러스 복제의 초기 단계에 작용하므로 항바이러스제 개발에 좋은 표적이 될 수 있다. 이에 최근 항바이러스제 개발을 위하여 프로테아제에 대한 연구가 진행되어 왔으며 프로테아제 억제제로서 펩타이드 및 비펩타이드 저분자 화합물들을 인위적인 합성 등의 방법으로 합성하였으나, 아직 천연물로부터 바이러스 프로테아제에 대해 강력한 억제능력을 갖는 화합물을 발견하지는 못했다.

이에 본 발명자들은 프로테아제 억제제로서 현재까지 알려진 억제제와는 유래가 다른 천연물에서의 활성 성분을 탐색 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 HCV NS3/NS4프로테아제 효소를 억제하는 작용을 하는 종래 HCV치료제로서의 인터페론, 타이모신(thymosin) α1, NS3 단백질분해효소 억제제 목적으로 개발된 펩타이드계 프로테아제 억제제, 비펩타이드계 프로테아제 억제제, 헬리케이즈 억제제, 및 폴리머라아제 억제제 등의 생리활성 유효치보다 탁월하거나 유사한 생리활성을 가진 저분자 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 아래의 화학식 1로 표시되는 5-원환 방향족 헤테로사이클릭 화합물(5-membered aromatic heterocyclic compound), 그 중간체 및 요힘빈 계통 화합물의 HCV NS3/NS4프로테아제 억제제 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 천연물로부터 HCV NS3/NS4프로테아제 억제제로서 유용한 상기 5-원환 방향족 헤테로사이클릭 화합물 및 요힘빈 계통 화합물을 추출 정제하였으며, 이 추출물이 가지는 고유한 구조의 화합물과 중간체를 합성하였다. 본 명세서에서 "요힘빈 계통 화합물"이라 함은 요힘빈 외에도 슈도요힘비논, 슈도하이드로요힘빈 등의 요힘빈 유도체를 포함하는 의미로 사용되는 것임을 밝혀 둔다.

본 발명은 조등 및 오가피 등의 생약으로부터 추출하거나 합성된 신규한 HCV NS3/NS4프로테아제 억제제를 제공함을 특징으로 한다. 이와 같은 생약을 비롯한 천연물을 물 또는 알코올로 추출하여 활성성분의 분리는

(1)생약 또는 천연물을 물 또는 알코올성 수용액으로 추출하는 단계와,

(2)상기 추출 단계에서 얻어진 여액을 동량의 수포화 n-부틸알콜 또는 수포화 프로필알콜로 층분리하여 알코올 층을 감압 농축하는 단계와,

(3)상기 농축단계에서 얻어진 추출물을 물로 공비 농축하고 고성능 액상 칼럼 크로마토그래피(HPLC)로 분리하여 HCV NS3/NS4프로테아제 억제활성을 가지는 분획을 정제하고 동결 건조하여 분말을 제조하는 단계를 거쳐서 얻는다.

(4)순수하게 분리된 화합물의 규명은 1H-NMR spectra(300.1MHz), 질량분석기(Mass spectrometer)를 이용하여 얻어진 결과를 천연물 데이터 베이스와 비교 검색하여 확인하였다.

또한 본 발명에서는 HCV NS3/NS4프로테아제를 억제하는 천연물로써 생리활성을 갖는 하기 화학식1의 화합물 및 이의 합성 과정시 생성되는 중간체를 제공함을 특징으로 한다. 이와 같이 확인된 천연물 분획에 대한 HCV NS3/NS4프로테아제 억제제로서의 생리활성을 규명하기 위하여 유기합성화학을 이용하여 동일한 구조를 가지는 화합물을 전합성하였다. 이때 전 합성 과정에서 생성되는 중간체들에 대한 활성도 측정하였다.

즉, 본 발명에서는 HCV NS3/NS4 프로테아제 억제능으로서의 생리활성을 효과를 갖는 하기 화학식의 5원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물 및 요힘빈 화합물 외에도 이들의 중간체들을 제공한다.

본 발명의 구성은 하기 화학식1과 같이 표시되는 5원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물(5-membered fused aromatic heterocyclic compound)의 HCV NS3/NS4 프로테아제 억제제로서의 용도이며,

단, 상기 화학식 1에서 R1은 수소, 작용화된 저급 알킬(C1~C6), R2 및 R3는 수소, 아미노산, 작용화된 저급 알킬(C1~C6), 작용화된 저급 알콕시(C1~C6), 작용화된 저급 알킬 아민(C1~C6), 방향족이 치환된 저급 알콕시, 사이클릭 알킬이 치환된 저급 알콕시, 1개 또는 2개의 환으로 되어 있는 방향족 또는 1개 또는 2개의 질소 원자가 포함되거나 1 개 또는 2개의 황원자가 포함되고 1개 또는 2개의 환으로 되어 있는 방향족이다. 여기에서 저급 알킬은 탄소원자 1개 내지 6개로 이루어진 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미하며, 사이클릭 알킬에는 사이클로 프로필, 사이클로 부틸, 사이클로 펜틸 및 사이클로 헥실이 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어저급 알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미한다.

본 발명의 화합물 및 중간체의 제조 방법은 다음과 같은 단계로 요약될 수 있다.

1) 인돌알카로이드 계통의 화합물을 합성하는 단계;

2) 상기 1의 단계에서 얻은 화합물을 산 촉매하에서 고리화 반응을 통하여 4개의 고리화합물로 연결하는 단계;

3) 상기 2의 단계에서 얻은 화합물을 인돌퀴놀리지딘 계통의 알칼로이드 화합물로 변환시키는 단계;

4) 상기 2의 단계에서 얻은 화합물을 요힘빈 계통의 알카로이드 화합물로 변환시키는 단계;

5) 상기 3의 단계에서 얻은 화합물로부터 히루스틴 알카로이드 화합물을 합성하는 단계;

6) 상기 4의 단계에서 얻은 화합물로부터 요힘빈 알카로이드 화합물을 합성하는 단계.

보다 상세하게는, 본 발명의 화합물 및 중간체들은 하기 반응식 1 및 반응식 2에 도시된 바와 같이 합성할 수 있다.

아래에서는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 아래의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

각 실시예에서 번호 (1), (2), (4), (5), (6), (7a), (7b),(8), (9), (10), (11a), (12), (13) 또는 표 1에서 나타나는 괄호 없는 번호는 상기 반응식 1, 2에 기재된 각 화합물 또는 중간체의 번호와 대응되는 것이다.

실시예 1

3-Acetyl-1-[β-(β-indolyl)ethyl]pyridinium Bromide(1)의 제조

트립토필 브로마이드(Tryptophyl bromide) 26.30g (0.120mol) 과 3-아세틸피리딘(3-acetylpyridine) 26.88g(0.120mol)을 메탄올 30mL에 넣고 균일한 상이 될 때까지 혼합한다. 반응 혼합물을 상온에서 2일정도 방치 보관하여 침전물이 생성되면 침전물을 여과한다. 여과액을 감압 하에서 10mL정도로 농축하여 24시간동안 방치 보관한다. 생성된 침전물을 다시 여과하여 3-acetyl-1-[β-(β-indolyl)ethyl]pyridinium bromide salt (1) 40.70g (97%)을 얻었다.

실시예 2

Indoloquinolizidine(2)의 제조

3-acetyl-1-[β-(β-indolyl)ethyl]pyridinium bromide salt (1) 21.0g과 dimethyl sodio-malonate 12.0g (80.0mmol)을 1,2-dimethoxyethane 250mL에 넣고 질소 기류하에서 5시간동안 교반한다. 반응 혼합물에 건조된 벤젠 300mL을 넣고 1시간동안 다시 교반하고 건조벤젠 200mL을 추가로 첨가하고 HBr 가스로 반응 용기 내부를 포화 시킨다. HBr 가스로 포화된 반응 혼합액을 30분 동안 천천히 교반하고 반응 혼합액의 산도가 pH 4-5 정도로 되면 1시간 더 격렬하게 교반한다. 혼합액에서 침전물이 생기면 반응 여액과 침전물을 분리하고 침전물을 디클로로메탄 2L와 메탄올 50mL 혼합액에 녹인다. 생성된 침전물을 용해시킨 용액에 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 추출, 세척하고 유기층을 감압하에서 건조하여 용매를 제거하였다. 얻어진 고체 혼합물 16.5g을 MPLC로 분리하여 순수한 화합물 인돌퀴놀리지딘(indoloquinolizidine) (2), 3.90g (12%)을 얻었다.

실시예 3

인돌퀴놀리지딘 다이에스터(Indoloquinolizidine diester) (4)의 제조

인돌퀴놀리지딘(2) 3.90g과 1M triethyloxonium tetrafluoroborate 디클로로메탄 용액 10mL을 건조 디클로로메탄 120mL에 녹여서 30분동안 교반한 다음 침전물이 생기면 침전물을 여과하고 다시 건조 디클로로메탄 용액 200mL로 세척하고 건조시킨다. 건조된 염을 메탄올 100mL에 녹이고 20% palladium charcoal을 가하고 상온, 수소 하에서 12시간 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트(celite)와 여과용 플라스크를 이용하여 palladium charcoal을 여과 제거하고 여과액을 감압 하에서 용매를 완전히 제거하였다. 얻어진 고체 혼합물 3.78g을 실리카로 충진한 컬럼으로 분리 정제하여 순수한 인돌퀴놀리지딘 다이에스터 (4) 3.1g을 얻었다. 1H NMR (CDCl₃) δ0.82(t, 3 J=6Hz, Me), 3.73(s, 6, (OMe)₂), 3.97(m, 1, H-3), 6.6-7.2(m, 4, aromatic Hs), Anal. (C₂₂H₂₇O₄N₂) C, H, N.

실시예 4

인돌퀴놀리지딘 알데히도에스터(Indoloquinolizidine Aldehydoester)(5)의 제조

화합물 (4), 3.0g(7.82mmol)을 건조된 디클로로메탄 70mL에 녹이고 아르곤가스로 치환한 다음 -78°C를 유지하면서 DIBAL-H(diisobutylaluminium hydride), 1.0M 디클로로메탄 용액 8mL을 가하여 1-2시간동안 교반한다. 반응 혼합물에 6N 염산 수용액 20mL을 천천히 가하고 디클로로메탄 100mL로 추출한 다음 포화 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 수용액으로 세척하고 다시 브라인(brine) 수용액으로 세척한 다음 유기층을 무수 황산나트륨(Na₂SO₄)으로 건조시키고 감압 하에서 용매를 완전히 제거하였다. 얻어진 고체 혼합물 2.8g을 실리카로 충진한 컬럼으로 분리 정제하여 순수한 화합물 인돌퀴놀리지딘 알데히도에스터(5) 2.1g (76%)을 얻었다. 1H NMR (CDCl₃) δ0.80(m, 3, Me), 3.80(s, 3, OMe), 4.53(m, 1, H-3), 6.9-7.6(m, 4, aromatic Hs), 8.00(s, 1, H-17), Anal. (C₂₁H₂₅O₃N₂) C, H, N.

실시예 5

히루스틴(Hirsutine)(6)의 제조

화합물 (5) 2.0g(5.66mmol)을 메탄올 용액 25ml에 녹이고 디클로로메탄 75mL 을 가하여 온도를 -20°C로 낮춘다. 반응물을 잘 교반하면서 포화 염산가스로 반응 용기 내부를 포화 시키고 3일 동안 -20°C에서 교반했다. 반응혼합물을 상온에서 포화 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 용액으로 중화시키고, 감압 증류하여 용매를 제거했다. 건조된 화합물을 디클로로메탄 100mL에 다시 녹인 후 무수 황산나트륨(Na₂SO₄)으로 건조한 다음 여과하여 다시 감압 증류하여 건조 화합물2.1g을 얻었다. 이를 실리카로 충진한 칼럼으로 분리 정제하여 순수한 화합물 히루스틴(6) 1.2g(57.77%)을 얻었다. 1H NMR (CDCl₃) δ0.83(t, 3, Me), 3.58(s, 3, OMe), 3.79(s, 3, OMe), 4.21(m, 1, H), 6.91-7.62(m, 4, aromatic Hs), 7.90(s, 1, H-17), Anal. (C₂₂H₂₈O₃N₂) C, H, N.

실시예 6

β-(β-피리딜)아크릴산{β-(β-Pyridyl)acrylic acid}(7a)의 제조

Nicotinaldehyde, 1.07 g (0.01mol) 과 malonic acid 2.40 g (0.023mol) 을 건조 피리딘 10mL에 녹이고 한 시간동안 90°C에서 반응시킨 후 130°C에서 3시간동안 반응시켰다. 반응 후 반응 혼합물을 디에칠에테르(diethyl ether) 200mL로 희석시켰다. 희석후 침전된 반응물을 다시 디에칠에테르(diethyl ether) 200mL로 세척, 건조시키고 건조된 생성물을 메탄올 용매 하에서 재결정화시켜 β-(β-피리딜)아크릴산(7a) 1.44 g(96%)을 얻었다. 1H NMR (Me2SO-d6) ??6.68(d, 1, J=16Hz, α-H), 7.43(dd, 1, J=8.5Hz), H-5), 7.63(d, 1, J=16Hz, β-H), 8.83(d, 1, J=2Hz, H-2). Anal.(C₈H₇O₂N) C, H, N.

실시예 7

Methyl β-(β-pyridyl)acrylate(7b)의 제조

β-(β-Pyridyl)acrylic acid(7a) 305mg(2.0mmol) 과 농축황산 2.4mL을 메탄올 20mL에 혼합하고 건조된 벤젠 20mL을 반응 혼합물에 넣고 10시간동안 환류 교반했다. 반응후 얼음물 25mL을 넣고 반응을 종료 시킨 후 암모니아수로 반응 혼합물을 중화시켰다. 생성된 화합물을 다에칠에테르로 추출하고 벤젠과 다에칠에테르 (1:1)혼합물 50mL로 추가 추출하고 감압 하에서 추출된 유기층의 용매를 제거하고 건조시켜 methyl β-(β-pyridyl)acrylate(7b), 317mg(95%)을 얻었다. 1H NMR (Me₂SO-d₆) δ3.82(s, 3, OMe), 6.48(d, 1, J=16Hz, α-H), 7.29(dd, 1, J=8Hz, H-5), 7.65(d, 1, J=16Hz, β-H), 7.79(dt, 1, J=8.2, 2Hz, H-4), 8.56(dd, 1, J=5.2Hz, H-6), 8.70(d, 1, J=2Hz, H-2), Anal.(C₉H₉O₂N) C, H, N.

실시예 8

3-(β-Carbomethoxyvinyl)-1-[β-(β-indolyl)ethyl]pyridinium Bromide(8)의 제조

Tryptophyl bromide 263mg (12mmol) 과 methyl β-(β-pyridyl)acrylate(7b) 191mg (12mmol)을 메탄올 30mL에 넣고 균일한 상이 될 때까지 혼합했다. 반응혼합물을 상온에서 2일 동안 천천히 교반하여 침전물이 생성되면 침전물을 여과한다. 여과액을 감압 하에서 10mL정도로 농축하여 24시간동안 방치 보관하여 생성된 침전물을 다시 여과하여 3-(β-carbomethoxyvinyl)-1-[β-(β-indolyl) ethyl]pyridinium bromide salt(8) 449mg(98%)을 얻었다. 1H NMR (Me₂SO-d₆) δ3.45(t, 2, J=7Hz, benzylic CH₂), 3.78(s, 3, OMe), 4.92(t, 2, J=7Hz, NCH₂), 6.70(d, 1, J=16Hz, α-H), 6.68-7.6(m, 4, aromatic Hs), 6.98(d, 1, J=16Hz, β-H), 8.05(dd, 1, J=8, 5Hz, H-5), 8.86(br d, 1, J=8Hz, H-4), 8.97(br d, 1, J=5Hz, H-6), 9.56(brs, 1, H-2). Anal.(C₁₉H₁₉O₂N₂Br) C, H, N, Br.

실시예 9

1,2,6,7-Tetrahydroindolo[2,3-a]qunolizines(9, 10)의 제조

3-(β-Carbomethoxyvinyl)-1-[β-(β-indolyl)ethyl]pyridinium bromide(8) 200mg과 dimethyl sodiomalonate 120mg(0.80mmol)을 1,2-dimethoxyethane 25mL에 넣고 질소 기류 하에서 5시간동안 교반한다. 반응혼합물에 건조된 벤젠 30mL을 넣고 1시간동안 다시 교반하고 건조벤젠 20mL을 추가로 첨가하고 HBr 가스로 반응 용기내부를 포화시킨다. HBr 가스로 포화된 반응혼합액을 30분동안 천천히 교반하고 반응 혼합액의 산도가 pH 4-5 정도로 되면 1시간 더 격렬하게 교반한다. 혼합액에서 침전물이 생기면 반응 여액과 침전물을 분리하고 침전물을 디클로로메탄 20mL와 메탄올 5mL 혼합액에 녹인다. 생성된 침전물이 용해된 용매에 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 추출, 세척하고 유기층을 감압하에서 건조하여 용매를 제거하였다.얻어진 고체 혼합물 165mg을 MPLC로 분리하여 순수한 화합물 1,2,6,7-Tetrahydroindolo[2,3-a]qunolizines (9) 42mg (18%)을 얻었다. 1H NMR (Me₂SO-d₆) δ3.58, 3.60, 3.81 (s, 3 each, OMe), 3.69(d, 1, J=10Hz, H-16), 4.78(dm, 1, J=12Hz, H-3), 5.21(d, 1, J=15Hz, H-18), 6.8-7.5(m, 4aromatic Hs), 7.16(d, 1, J=15Hz, H-19), 7.17(s, 1, H-21), Anal. (C₂₄H₂₆O₆N₂) C, H, N.

1,2,6,7-Tetrahydroindolo[2,3-a]qunolizines (9) 100mg(0.23mmol)과 lithium iodide trihydrate 48mg(0.26mmol)을 DMSO(Me₂SO) 5mL에 녹이고 180°C에서 30분 동안 교반하고 상온으로 냉각하였다. 반응 혼합물에 물 15mL로 희석시키고 생성된 침전물을 물로 다시 세척하여 진공하에서 건조하였다. 건조된 고체 혼합물을 디클로로메탄에 녹이고 MPLC로 분리하여 순수한 화합물 1,2,6,7-Tetrahydroindolo[2,3-a]qunolizines(10) 71mg (82%)을 얻었다. 1H NMR (Me₂SO-d₆) δ3.67, 3.73(s, 3 each, OMe), 4.56(dm, 1, J=12Hz, H-3), 5.41(d, 1, J=15Hz, H-18), 6.58(s, 1, H-21), 6.9-7.6(m, 4, aromatic Hs), 7.22(d, 1, J=15Hz, H-19), Anal. (C₂₂H₂₄O₄N₂) C, H, N.

실시예 10

화합물 (11a)의 제조

1,2,6,7-Tetrahydroindolo[2,3-a]qunolizines(10) 50mg(0.13mmol)과 platinum oxide 10mg을 아세틸산 3mL에 녹이고 수소 기류하, 상온에서 5시간동안 반응하였다. 반응혼합물을 여과하고 메탄올 50mL에 희석하여 무수 Na2SO4로 건조한 다음 감압하에서 용매를 완전히 제거하였다. 건조된 고체 혼합물을 실리카로 충진한 칼럼을 통하여 분리 정제하여 순수한 화합물 (11a)를 41mg, (11b)를 6mg 얻었다.(11a); 1H NMR (Me₂SO-d₆) δ3.58, 3.67(s, 3 each, OMe), 3.91(m, 1, H-3),7.0-7.6 (m, 4, aromatic Hs), Anal. (C22H29O4N2) C, H, N, (11b); 1H NMR (Me₂SO-d₆) δ3.65, 3.72(s, 3 each, OMe), 3.91(m, 1, H-3), 7.0-7.6 (m, 4, aromatic Hs), Anal. (C22H29O4N2) C, H, N.

실시예 11

슈도요힘비논(Pseudoyohimbinone)(12)의 제조

화합물 11a 40mg(0.1mmol)과 소디움하이드라이드(NaH) 5mg(0.2mmol)을 무수 테트라히드로퓨란(tetrahydrofurane) 5mL에 녹이고 아르곤 기류하, 50oC에서 2시간 정도 교반하였다. 이를 아세틸산으로 중화시키고 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 증류하여 용매를 완전히 제거하였다. 얻어진 고체 혼합물을 실리카 칼럼으로 분리 정제하여 순수한 화합물 슈도요힘비논(12)을 47mg (0.13mmol) 얻었다. 1H NMR (Me₂SO-d₆) δ3.87(s, 3, OMe), 4.53(br s, 1, H-3), 6.9-7.5(m, 4, aromatic Hs), Anal. (C₂₁H₂₄O₃N₂) C, H, N.

실시예 12

슈도하이드로요힘빈(Pseudohydroyohimbine)(13)의 제조

슈도요힘비논 화합물12, 16mg(0.04mmol)을 0.1mL 농축 염산과 0.5mL 아세틸산에 녹이고 메탄올 10mL을 가하고 platinum oxide(PtO₂) 5mg을 넣고 상온에서 24시간동안 수소 기류하에서 교반하였다. 반응 혼합물에서 platinum oxide를 반응물과 분리 여과하고 용매를 감압 증류하여 완전히 제거하고 얻어진 고체 혼합물을 실리카 칼럼으로 분리 정제하여 순수한 화합물 슈도하이드로 요힘빈(13) 12mg (72%)을 얻었다.

HCV NS3/NS4프로테아제 억제능 분석 실험

실시예 1~12에 의해서 제조된 화합물을 이용하여 HCV 프로테아제에 대한 억제 활성을 측정하기 위하여 pH 8.3의 20mM 탄산수소나트륨 수용액에 1mg/ml의 농도로 녹인 다음 다이메칠설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 1mg/ml로 녹인 플루오르세인 이소치오시아네이트(fluorescein isothiocyanate) 50ul를 천천히 1ml의 효소용액에 넣었다. 섭씨 4oC에서 8시간 반응시킨 후 흡착버퍼수용액(50mM Tris, pH 7.6, 2% CHAPS, 10mM DTT, 30% Glycerol)에 투석하였다.

화합물을 부착한 수지를 96-웰 플레이트에 웰당 10mg씩 넣고 흡착버퍼수용액으로 200ul로 세 번 세척한 후 흡착버퍼수용액에 10ug/ml로 희석한 형광체로 표지된 HCV NS3/NS4 프로테아제 효소를 100ul 가하고 1시간동안 상온에서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 흡착버퍼수용액으로 200ul씩 세번 고정체를 세척한 후 세척버퍼수용액(50mM Tris, pH 7.6, 0.15M NaCl, 2% CHAPS, 10mM DTT, 30% Glycerol)으로 200ul씩 세번 세척하였다. 96-웰 플레이트를 STORM으로 효소와 화합물간의 결합도를 측정하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

위와 같이 본 발명은 천연물로부터 HCV NS3/NS4프로테아제 효소를 억제하는 작용을 하는 새로운 화합물을 추출, 정제하였으며, 동일한 구조를 가지는 화합물 및 그 중간체들을 합성하였다. 이들 화합물은 종래 HCV 치료제를 대체하거나 또는 복합적 치료에 유용할 것이다.

Claims

하기 화학식1과 같이 표시되는 5원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물(5-membered fused aromatic heterocyclic compound), 그 화합물의 중간체 및 유도체의 HCV NS3/NS4 프로테아제 억제제로서의 용도.

[화학식 1]

(단, 상기 화학식 1에서 R1은 수소 및 직쇄 또는 측쇄 저급 알킬(C1~C6), R2 및 R3는 수소, 아미노산, 작용화된 직쇄 또는 측쇄 저급 알킬(C1~C6), 작용화된 저급 알콕시(C1~C6), 작용화된 저급 알킬 아민(C1~C6), 방향족이 치환된 저급 알콕시, 사이클로 프로필, 사이클로 부틸, 사이클로 펜틸 및 사이클로 헥실을 포함하는 사이클릭 알킬이 치환된 저급 알콕시, 1개 또는 2개의 환으로 되어 있는 방향족 또는 1개 또는 2개의 질소 원자가 포함되거나 1 개 또는 2개의 황원자가 포함되고 1개 또는 2개의 환으로 되어 있는 방향족이다.)
제 1항에 있어서, 5원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물은 요힘빈 계통의 화합물인 것을 특징으로 하는 5원환 방향족 헤테로사이클릭 화합물의 HCV NS3/NS4 프로테아제 억제제로서의 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 염 또는 약학적으로 허용 가능한 담체와 결합된 것을 특징으로 하는 5원환 융합 방향족 헤테로사이클릭 화합물의 HCV NS3/NS4 프로테아제 억제제로서의 용도.