KR20010053018A

KR20010053018A - 항혈관형성 단백질 및 이들을 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20010053018A
Application number: KR1020007014426A
Authority: KR
Inventors: 라그후람 칼루리
Original assignee: 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터
Priority date: 1998-06-17
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2001-06-25
Also published as: IL140239A0; KR100682666B1; EP1086129A1; AU753249B2; CA2331332A1; JP2002517999A; WO1999065940A1; JP2008301823A; AU4575599A; CN1309663A; JP2008019271A

Abstract

본 발명은 항혈관형성 특성을 가진 단백질 및 이들을 사용하여 혈관형성을 억제시키는 방법에 관한 것이다.

Description

항혈관형성 단백질 및 이들을 사용하는 방법{ANTI-ANGIOGENIC PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF}

혈관 기저막은 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 피브로넥틴 및 엔탁틴과 같은 고분자들로 구성되어 있다(참조 : Timpl, R., 1996, Curr Opin Cell Biol 8:618-24). 기능적으로, 콜라겐은 세포 부착, 이동, 분화 및 성장을 촉진시키고(참조 : Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27:93-127), 이러한 기능들에 의해 혈관형성 동안 내피 세포 증식 및 거동에서 중대한 역할을 한다고 생각되며, 혈관형성이란 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정을 말한다(참조 : Madri, J. A. et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34:85-91; Folkman, J., 1972, Ann. Surg. 175:409-16). 혈관형성은 복잡한 과정이며, 내피 세포의 발아 및 이동, 이들 세포의 증식 및 이들의 튜브 모양의 구조로의 분화 및 발생중인 혈관 주위에 기저막 매트릭스의 생성을 필요로 한다. 또한 혈관형성은 상처의 치료 및 자궁내막의 재모델링과 같은 정상적인 생리학적인 이벤트에 중요한 과정이다(참조 : Folkman, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 267:10931-34). 현재 혈관형성은 크기가 수 mm³를 넘는 고형 종양의 전이와 성장을 위해 필요하다고 널리 공지되어 있다(참조 : Folkman, J., 1972, Ann. Surg. 175:409-16; Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1:27-31). 몇 가지 연구들을 통해 콜라겐 대사작용의 억제제가 항혈관형성 특성을 가짐이 밝혀졌으며, 이는 기저막 콜라겐 합성 및 퇴적이 혈관 형성과 생존을 위해 중요하다는 견해를 지지한다(참조 : Maragoudakis, M. E. et al., 1994, Kidney Int. 43:147-50; Haralabopoulos, G. C. et al., 1994, Lab. Invest. 71:575-82). 그러나, 기저막 조직구성 및 혈관 생성에서 콜라겐의 정확한 역할은 아직 잘 파악되지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 항혈관형성 특성을 가진 타입 IV 콜라겐의 알파 사슬의 NC1 도메인을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 신규한 단백질인 아레스텐(Arresten), 칸스타틴(Canstatin) 및 툼스타틴(Tumstatin), 및 이들의 생물학적으로 활성인(예컨대, 항혈관형성) 단편, 돌연변이체, 유사체, 동족체 및 유도체 뿐만 아니라 이들의 다량체(예컨대, 이량체) 및 융합 단백질(또한 본 명세서에서 키메라 단백질으로도 부름)에 관한 것이다. 이 단백질 모두는 타입 IV 콜라겐의 NC1(비교원질 1) 도메인의 C-말단 단편을 포함하고 있다. 더욱 상세하게는, 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴은 각각 타입 IV 콜라겐의 α1 사슬, α2 사슬 및 α3 사슬의 NC1 도메인의 각 C-말단 단편이다. 특히, 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴은 단량체 단백질들이다. 상기 세 단백질 모두는 생체내에서 종양의 성장을 정지시키며, 또한 내피 튜브 검정을 포함하는 몇몇 시험관내 모델에서 모세관의 형성을 억제시킨다.

본 발명은 항혈관형성 활성을 가지고 있는 타입 IV 콜라겐의 α1 사슬의 NC1 도메인을 포함하는 단리되어 재조합적으로 생성된 아레스텐(또한 본 명세서에서 "아레스틴(Arrestin)으로도 부름), 단리된 아레스텐의 항혈관형성 단편, 단리된 아레스텐과 항혈관형성 단편들의 다량체 및 이러한 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 또한 본 발명은 생물학적 활성 성분으로서 단리된 아레스텐, 이의 항혈관형성 단편, 또는 둘 모두를 함유하는 조성물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 포유류에게 항혈관형성 아레스텐 또는 이의 단편을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여 포유류에서 혈관형성 활성을 특징으로 하는 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 또한 항혈관형성 아레스텐 및 이의 단편들은 세포 이동 또는 내피 세포 증식을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 단리된 항혈관형성 아레스텐 및 이의 단편들에 대한 항체를 포함한다.

또한 본 발명은 항혈관형성 활성을 가지고 있는 타입 IV 콜라겐의 α2 사슬의 NC1 도메인을 포함하는 단리되어 재조합적으로 생성된 칸스타틴, 단리된 칸스타틴의 항혈관형성 단편, 단리된 칸스타틴과 항혈관형성 단편들의 다량체 및 이러한 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 또한 본 발명은 생물학적 활성 성분으로서 단리된 칸스타틴, 이의 항혈관형성 단편 또는 둘 모두를 함유하는 조성물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 포유류에게 칸스타틴 또는 이의 단편을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여 포유류에서 혈관형성 활성을 특징으로 하는 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 또한 항혈관형성 칸스타틴 및 이의 단편들은 세포 이동 또는 내피 세포 증식을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 단리된 항혈관형성 칸스타틴 및 이의 단편에 대한 항체를 포함한다.

또한 본 발명은 항혈관형성 활성을 가지고 있는 타입 IV 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인을 포함하는 단리되어 재조합적으로 생성된 툼스타틴, 단리된 툼스타틴의 항혈관형성 단편, 단리된 툼스타틴과 항혈관형성 단편들의 다량체 및 이러한 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 또한 본 발명은 생물학적 활성 성분으로서 단리된 툼스타틴, 이의 항혈관형성 단편 또는 둘 모두를 함유하는 조성물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 포유류에게 항혈관형성 툼스타틴 또는 이의 단편을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여 포유류에서 혈관형성 활성을 특징으로 하는 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 또한 항혈관형성 툼스타틴 및 이의 단편들은 세포 이동 또는 내피 세포 증식을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 단리된 항혈관형성 툼스타틴 및 이의 단편들에 대한 항체를 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1A 및 1B는 인간 타입 IV 콜라겐의 α1 사슬의 누클레오티드(도 1A, SEQ ID NO:1) 및 아미노산(도 1B, SEQ ID NO:2) 서열을 묘사하는 개략도이다. 정방향(SEQ ID NO:3) 및 역방향(SEQ ID NO:4) 프라이머의 위치가 표시되어 있다.

도 2는 아레스텐 클로닝 벡터 pET22b(+)를 나타내는 개략도이다. 정방향(SEQ ID NO:3)과 역방향(SEQ ID NO:4) 프라이머 및 아레스텐이 클로닝되는 부위가 표시되어 있다.

도 3A 및 3B는 내피 세포(C-PAE) 증식의 표시로서 아레스텐(도 3A, 0 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml, x-축) 및 엔도스타틴(도 3B, 0 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml, x-축)이³H-티미딘 혼입(y-축)에 미치는 효과를 보여주는 한 쌍의 선형 그래프이다.

도 4A, 4B, 4C 및 4D는 내피 세포 증식의 표시로서 아레스텐 및 엔도스타틴이³H-티미딘 혼입(y-축)에 미치는 효과를 보여주는 4개가 한 세트인 막대 챠트이다. 도 4A, 4B 및 4C는 각각 786-0, PC-3, HPEC 세포에 대한 아레스텐(0 ㎍/ml-50 ㎍/ml(도 4A 및 4B) 및 0 ㎍/ml-10 ㎍/ml(도 4C))의 효과를 보여준다.

도 5A, 5B 및 5C는 아레스텐(2 ㎍/ml, 도 5B) 및 엔도스타틴(20 ㎍/ml, 도 5C)이 인간 배꼽 내피(ECV-304) 세포에서 FBS-유도된 화학주성에 의한 내피 세포 이동에 미치는 효과를 보여주는 4개가 한 세트인 현미경사진이다. 도 5A는 처리되지 않은 대조군 세포를 보여준다.

도 6은 도 5의 결과를 그래프 형태로 보여주는 막대 챠트이다. 도 6은 아레스텐(2 ㎍/ml 또는 20 ㎍/ml) 및 엔도스타틴(2.5 ㎍/ml 및 20 ㎍/ml)이 ECV-304 내피 세포의 이동에 미치는 효과를 보여준다.

도 7은 아레스텐이 내피 튜브 형성에 미치는 효과를 보여주는 선형 그래프이다. 튜브 형성 퍼센트는 y-축에, 억제제의 농도는 x-축에 표시하였다. 처리는 다음과 같다: 없음(대조군, ◆), BSA(대조군, △), 7S 도메인(대조군, X) 및 아레스텐(■).

도 8A 및 8B는 대조군(도 8A)과 비교하여 아레스텐(0.8 ㎍/ml, 도 8B)이 내피 튜브 형성에 미치는 효과를 보여주는 한 쌍의 현미경사진이다.

도 9A, 9B, 9C 및 9D는 아레스텐 및 엔토스타틴이 생체내에서 종양 성장에 미치는 효과를 보여주는 4개가 한 세트인 선형 그래프이다. 도 9A는 10 mg/kg 아레스텐 처리된(□) 마우스, BSA 처리된(+) 마우스 및 대조군(●) 마우스에 대해 종양 부피가 700 mm³에서부터 증가하는 것을 보여준다. 도 9B는 10 mg/kg 아레스텐 처리된(□) 종양 및 BSA 처리된(+) 종양에 대해 종양 부피가 100 mm³에서부터 증가하는 것을 보여준다. 도 9C는 10 mg/kg 아레스텐 처리된(□) 마우스, 엔도스타틴 처리된(▲) 마우스 및 대조군 마우스(●)에 대해 종양 부피가 약 100 mm³에서부터 증가하는 것을 보여준다. 도 9D는 아레스텐(□) 대 대조군(●)을 사용하여 치료했을 때 200 mm³종양에 대한 증가를 보여준다.

도 10A 및 10B는 인간 타입 IV 콜라겐의 α2 사슬의 누클레오티드(도 10A, SEQ ID NO:5) 및 아미노산(도 10B, SEQ ID NO:6) 서열을 묘사하는 개략도이다. 정방향(SEQ ID NO:7) 및 역방향(SEQ ID NO:8) 프라이머의 위치를 표시하였다.

도 11은 칸스타틴 클로닝 벡터 pET22b(+)를 나타내는 개략도이다. 정방향(SEQ ID NO:7)과 역방향(SEQ ID NO:8) 프라이머 및 칸스타틴이 클로닝되는 부위를 표시하였다.

도 12A, 12B, 12C 및 12D는 다양한 농도의 칸스타틴이 내피(C-PAE) 세포(도 12A 및 12C) 및 비내피(786-0, PC-3 및 HEK 293) 세포(도 12B 및 12D)의 증식에 미치는 효과(x-축)를 보여주는 막대그래프이다. 증식을³H-티미딘 혼입(도 12A 및 12B) 및 메틸렌 블루 염색(도 12B 및 12D)의 함수로서 측정하였다.

도 13은 VFGF가 없는(VEGF 없이 또는 혈청) 세포 및 VEGF(1% FCS 및 10 ng/ml VEGE) 세포의 치료 및 0.01 ㎍/ml 칸스타틴(1% FCS, 10 ng/ml VEGF 및 0.01 ㎍/ml 칸스타틴) 및 1.0 ㎍/ml 칸스타틴(1% FCS, 10 ng/ml VEGF 및 1 ㎍/ml 칸스타틴)의 처리에 대한 필드(y-축) 당 이동된 내피 세포의 수를 보여주는 막대 챠트이다.

도 14는 BSA(□), 칸스타틴(■) 및 α5NC1(○)의 다양한 처리하에서 대조군(PBS 처리된 웰) 튜브 형성(y-축)의 퍼센트로서 내피 튜브 형성의 양을 보여주는 선형 그래프이다. 수직 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.

도 15A, 15B, 15C 및 15D는 부분 종양 부피(y-축, 도 15A 및 15B) 또는 mm³으로 표현한 종양 부피(y-축, 도 15C 및 15D)에 대해 칸스타틴(■), 엔토스타틴(○) 및 대조군이 PC-3 세포(도 15A 및 15B) 및 786-0 세포(도 15C 및 15D)에 미치는 효과를 묘사하는 선형 그래프로서, 치료일(x-축) 경과에 따라 플로팅되어 있다.

도 16A 및 16B는 인간 타입 IV 콜라겐의 α3 사슬의 누클레오티드(도 16A, SEQ ID NO:9) 및 아미노산(도 16B, SEQ ID NO:10) 서열을 묘사하는 개략도이다. 정방향(SEQ ID NO:11) 및 역방향(SEQ ID NO:12) 프라이머의 위치를 표시하였다. 또한 "툼스타틴 333" 및 "툼스타틴 334" 단편의 시작과 끝을 표시하였다.

도 17은 툼스타틴 클로닝 벡터 pET22b(+)를 나타내는 개략도이다. 정방향(SEQ ID NO:11)과 역방향(SEQ ID NO:12) 프라이머 및 툼스타틴이 클로닝되는 부위를 표시하였다.

도 18은 툼스타틴 돌연변이체 툼스타틴 N-53의 α3(IV)NC1 단량체내에 절단되는 아미노산의 위치를 보여주는 개략도이다. 채워진 원은 이 돌연변이체를 생성시키기 위해 툼스타틴으로부터 결실된 N-말단 53 아미노산 잔기에 상응한다. 짧은 막대로 표시된 이황화 결합은 이들이 α1(IV)NC1 및 α2(IV)NC1에 생기는 것과 같이 배열되어 있다.

도 19A, 19B 및 19C는 다양한 농도의 툼스타틴(x-축)을 사용하여 치료했을 때 C-PAE 세포(도 19A), PC-3 세포(도 19B) 및 786-0 세포(도 19C)에 대한³H-티미딘 혼입(y-축)을 보여주는 3개가 한 세트인 막대그래프이다. 모든 그룹은 삼중 샘플들을 나타낸다.

도 20은 다양한 양(x-축)의 툼스타틴(●), BSA(대조군, □) 및 7S 도메인(대조군, ○)이 내피 튜브 형성(y-축)에 미치는 영향을 보여주는 선형 그래프이다.

도 21A 및 21B는 치료일(x-축)에 걸쳐 툼스타틴(●) 및 엔도스타틴(○) 대 대조군(□)이 종양 부피(mm³, y-축)에 미치는 효과를 보여주는 한 쌍의 선형 그래프이다. 별표로 표시된 자료 점이 중요하며, 단측 스투던트 검정결과 P＜0.05이었다.

도 22는 대조군 마우스(□) 및 툼스타틴 돌연변이체 N-53을 사용하여 치료된 마우스(●)에 대해 치료일(x-축)에 걸쳐 종양 부피(y-축)의 증가를 보여주는 그래프이다. 별표로 표시된 자료 점이 중요하며, 단측 스투던트 검정결과 P＜0.05이었다.

도 23은 아레스텐(●), 칸스타틴(○), 12 kDa 아레스텐 단편(■), 8 kDa 아레스텐 단편(□) 및 10 kDa 칸스타틴 단편(▲)의 다양한 농도에 의한 내피 튜브 형성의 억제(y-축)를 보여주는 선형 그래프이다.

도 24는 툼스타틴 단편 333(●), 툼스타틴 단편 334(○), BSA(대조군, ■), α6(대조군, □) 및 툼스타틴(▲)의 다양한 농도(x-축)에 의한 내피 튜브 형성의 억제(y-축)를 보여주는 선형 그래프이다.

바람직하지 않은 혈관형성으로 인해 매우 다양한 질병들이 발생한다. 바꾸어 말하면, 어떠한 조건하에서, 특정 시간에 또는 특정 조직에서 모세혈관의 성장 및 확장을 중단시킬 수 있다면 많은 질병과 바람직하지 않은 질환들을 예방 또는 완화시킬 수 있다. 기저막 조직구성은 타입 IV 콜라겐 네트워크의 조립에 의존하며 이것은 타입 IV 콜라겐의 C-말단의 구형 비교원질(NC1) 도메인을 통해 일어난다고 생각된다(참조 : Timpl, R., 1996, Curr Opin Cell Biol 8:618-24; Timpl, R. et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120:203-211). 타입 IV 콜라겐은 6개의 서로 다른 유전자 산물(즉, α1 내지 α6)로 구성되어 있다(참조 : Prockop, D. J. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:403-34). α1 및 α2 동형물들은 인간 기저막에 편재(遍在)되어 있지만(참조 : Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27:93-127), 나머지 4개의 동형물들은 제한적으로 분포되어 있다(참조 : Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8).

기존 혈관으로부터 새로운 모세관의 형성, 즉, 혈관형성은 종양 성장 및 전이의 과정을 위해 필수적이다(참조 : Folkman, J. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-4; Folkman, J. 1995, Nat. Med. 1:27-31; Hanahan, D. et al., 1996, Cell 86:353-64). 인간 및 동물 종양들은 초기에는 혈관을 신생시키지 않지만, 수 mm³이상으로 성장한 종양은 혈관을 신생시킬 수 있다(참조 : Folkman, J. 1995, Nat. Med. 1:27-31; Hanahan, D, et al., 1996, Cell 86:353-64). 혈관형성 표현형으로의 전환은 혈관형성 자극제의 상향조절 및 혈관형성 억제제의 하향조절을 필요로 한다(참조 : Folkman, J. 1995, Nat. Med. 1:27-31). 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 섬유아세포 성장 인자(bFGF)는 종양에서 가장 보편적으로 발현되는 혈관형성 인자들이다. 혈관을 신생시키는 종양은 상기 혈관형성 인자들을 하나 이상 과잉발현시켜 종양 성장을 상승적으로 촉진시킬 수 있다. 수용체 길항제를 사용하여 VEGF와 같은 단일 혈관형성 인자를 억제시키는 것은 종양 성장을 정지시키기에 충분하지 않다. 수많은 혈관형성 억제제들이 최근에 동정되고 있으며, IFN-a, 혈소판-인자-4(참조 : Maione, T.E. et al., 1990, Science 247:77-9) 및 PEX(참조 : Brooks, P.C. et al., 1998, Cell 92:391-400)와 같은 특정 인자들은 종양 세포와 내생적으로 관련되어 있지 않지만, 앤지오스타틴(참조 : O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28) 및 엔도스타틴(참조 : O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell 88:277-85)은 종양 조직 자체에 의해 생성된 종양 관련 혈관형성 억제제이다. 이러한 내생적인 혈관형성 억제제를 사용한 종양 성장 및 전이의 치료는 매우 효과적이고 매혹적인 생각이지만, 항혈관형성 치료와 관련된 몇가지 잠재적인 문제점들이 고려되어야만 한다. 만성 항혈관형성 치료에 의해 유도된 지연된 독성 뿐만 아니라 치료 동안 일어나는 손상된 상처 치료 및 재생적인 혈관형성의 가능성을 심각하게 고려해야 한다.

본 발명에서는, 항혈관형성 특성을 가진 단백질 및 이들의 단편, 유사체, 유도체, 동족체 및 돌연변이체와 함께 상기 단백질, 유사체, 유도체, 동족체 및 돌연변이체를 사용하여 혈관형성-매개된 증식성 질환을 억제시키는 방법을 기술한다. 상기 단백질은 타입 IV 콜라겐의 α사슬의 NC1 도메인 또는 상기 도메인의 일부분, 상세하게는, 타입 IV 콜라겐의 α1, α2 및 α3 사슬의 NC1 도메인의 단량체들을 포함한다. 이러한 단백질들(특히 단량체 형태로 존재할 때)은 암의 생체내 모델에서 종양 성장을 억제하며, 또한 내피 튜브 검정을 포함하여, 몇 가지 시험관내 모델에서 모세관의 형성을 억제시킨다.

또한 상기 단백질들은 NC1 도메인의 연결 부위를 포함한다. α4, α5 및 α6 사슬들이 감소되거나 탐지 불가능한 항혈관형성 활성을 가짐을 시사하는 증거에 따라, α1, α2 및 α3 사슬이 바람직하다. 일반적으로, 육량체 형태는 활성이 거의 없거나 감소함을 시사하는 증거에 따라, 상기 단백질의 단량체 형태가 바람직하다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 "아레스텐"으로 표기되는 단백질을 기술하며, 아레스텐은 약 230 아미노산 길이의 단백질이고, 인간 타입 IV 콜라겐의 NC1 도메인의 α1 사슬의 N-말단에서의 아미노산들에 상응한다(참조 : Hostikka, S.L. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:19488-93).

본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이, 인간 아레스텐은 pET22b와 같은 세균성 발현 플라스미드를 사용하여 대장균에서 생산될수 있으며, pET22b는 페리플라즘 이동능력이 있어서, 가용성 단백질로 수득될 수 있다. 상기 단백질은 C-말단 6-히스티틴 태그를 가진 29 kDa 융합 단백질로서 발현된다. 추가적인 3 kDa(26 kDa를 지나서)은 폴리링커 및 히스티틴 태그 서열로부터 생긴다. 또한 아레스텐은 pcDNA 3.1 진핵성 벡터를 사용하여 293 신장 세포에서 분비된 가용성 단백질로서 생성될 수 있다.이 293-생성된 단백질은 정제되지 않거나 결실 태그가 없다.

대장균-생성된 아레스텐은 0.25 ㎍/ml의 ED₅₀을 사용하는 용량-의존적 수단으로 bFGF-자극된 내피 세포의 증식을 억제시킨다. 신장 암종 세포(786-0), 전립선 암 세포(PC-3) 또는 인간 전립선 내피 세포(HPEC)의 증식에 대해 어떠한 현저한 효과도 발견되지 않았다. 엔도스타틴은 0.75 ㎍/ml의 ED₅₀에서 C-PAE 세포의 증식을 아레스텐보다 3배 높게 억제시켰고, A-498 암세포를 억제시키지 않았다.

본 명세서에 기술한 바와 같이, 내피 세포 증식 및 이동의 특이적인 억제는 아레스텐이 세포 표면 단백질 또는 수용체를 통해 기능할 수 있음을 시사한다. 매트릭스 금속단백질분해효소 또는 MMP의 억제는 바티마스타트(batimastat)(BB-94) 및 마리마스타트(marimastat)(BB-2516)와 유사하게 종양 성장 및 전이에서 아레스텐의 직접적인 역할을 시사한다.

본 발명에서, 타입 IV 콜라겐의 α2 사슬의 NC1 도메인인 칸스타틴을 내피 세포의 증식과 이동의 억제 및 내피 튜브 형성의 억제에 의해 검정된 바와 같이, 혈관형성을 억제시키기 위해 사용하였다. 또한 칸스타틴에 의한 내피 세포 증식 및 이동의 특이적인 억제는 이의 항혈관형성 활성을 입증하며 칸스타틴이 세포 표면 단백질/수용체를 통해 기능할 수 있음을 증명한다. 인테그린은 이들의 세포외 매트릭스 결합 능력 및 이동 및 증식과 같은 세포 거동을 조절하는 능력으로 볼 때 잠재적인 후보 분자이다. 특히, avb3 인테그린은 혈관형성 동안 이의 유도 및 이의 무차별적인 결합 능력에 기인하여, 가능한 칸스타틴이다.

본 발명에서, 타입 IV 콜라겐의 α3 사슬의 NC1인 툼스타틴(참조 : Timpl, R. et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120:203-11; Turner, N. et al., 1992, J. Clin. Invest. 89:592-601)을 혈관형성 및 종양 성장의 시험관내 및 생체내 모델을 사용하여 혈관 내피 세포의 증식 및 혈관 형성을 조절하기 위해 사용하였다. α3(IV) 사슬의 분포는 GBM과 같은 특정 기저막, 와우각의 몇몇 기저막, 전방 렌즈 캡슐과 같은 눈의 기저막, 데스메막(Descemet's membrane), 난소 및 정소 기저막(참조 : Frojdman, K. et al., 1998, Differentiation 83:125-30) 및 폐포 모세관 기저막(참조 : Kashtan, C.E., 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9:1736-50)에 제한된다. 그러나 상기 사슬은 신장 맥관막, 피부의 혈관 기저막과 상피 기저막 및 간의 혈관 기저막(참조 : Kashtan, C.E., supra)에는 존재하지 않는다. 상처 치료의 과정에서, α3과 α4 사슬을 제외한 타입 IV 콜라겐의 α사슬들은 조립되어 새로운 모세관을 형성할 것이며, 그 이유는 이러한 두 사슬들은 '기존'의 기저막, 즉 피부 맥관구조의 구성요소가 아니기 때문이다. α3 (IV) 사슬은 정상적인 인간의 피부의 본래의 구성요소가 아니기 때문에, 상처의 손상 치료에서 콜라겐 조립 및 혈관형성의 과정은 툼스타틴을 사용하는 치료에 의해 달라지지 않을 것이다.

α3 (IV) 사슬은 인간 신장 혈관 기저막 뿐만 아니라 GBM에서도 발현된다(참조 : Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8). 이러한 '기존' 혈관들은 신장 세포 암종과 같은 일차적인 신장 종양의 진전과 관련되어 있는 것으로 생각된다. 툼스타틴은 다른 α사슬들과 α3 (IV) 사슬의 조립에 의해 매개되는 신혈관신생을 붕괴시킴으로써 일차적인 신장 종양의 치료에 효과적일 수 있다. 신장 세포 암종으로 진단된 환자의 수는 1996년도에 미국에서 약 3만명이었고(참조 : Mulders, P. et al., 1997, Cancer Res. 57:5189-95), 전이 경우에 대한 예측은 매우 바람직하지 않았다. 방사능 치료 및 화학요법의 진보에도 불구하고, 치료된 환자의 장기간 생존은 아직 현저하게 향상되지 않고 있다(참조 : Mulders, P., supra). 신장 세포 암종을 위한 중요한 치료 대안들의 부족은 신규 치료 전략 개발의 중요성을 역설한다. 이러한 사실을 고려하면, 고형 종양의 신혈관신생을 치료하는 것은 최근들어 몇몇 동물 모델에서 유망한 결과들이 증명되고 있다(참조 : Baillie, C.T. et al., 1995, Br. J. Cancer 72:257-67; Burrows, F.J. et al., 1994, Pharmacol. Ther. 64:155-74; Thorpe, P.E. et al., 1995, Breast Cancer REs. Treat. 36:237-51). 생체내에서 신장 세포 암종 성장을 억제시키는 툼스타틴의 효과는 상기 종양 타입에 대한 효과적인 항혈관형성 치료로서 상기 분자의 잠재력을 증명한다.

본 발명에서, 툼스타틴은 내피 세포 증식을 특이적으로 억제시키며 시험관내에서 종양 세포주 PC-3 및 786-O의 증식에는 효과가 없다. 툼스타틴은 내피 세포 이동을 억제시키지 않았지만, 시험관내에서 내피 튜브 형성을 현저하게 억제시켰다. 종합적으로, 이러한 결과들은 툼스타틴이 혈관형성 과정의 여러 단계들을 억제시킴으로써 새로운 혈관의 형성을 억제시킴을 보여준다.

생체내 연구에서, 툼스타틴은 매트리겔 플러그 검정에서 혈관형성을 억제시키고 마우스 이종이식 모델에서 PC-3 종양 및 786-O의 성장을 억제시켰다. 툼스타틴이 거대한 종양의 성장을 억제시켰다는 사실은 고무적인 것이며, 특히 임상적 세팅에서의 종양의 치료를 고려할 때 그러하다.

툼스타틴은 폐출혈 및 급속 진행성 사구체신염을 특징으로 하는 자가면역 질환인 굿파스튜어 증후군에 대한 병원성 에피토프를 가지고 있기 때문에(참조 : Butkowski, R.J. et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:7874-77; Saus, J. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13374-80; Kalluri, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:24018-24), 툼스타틴의 급성 또는 만성적인 투여는 이러한 자가면역 질환을 유발시킬 수 있다. α3 (IV) NC1상의 굿파스튜어 자가-에피토프의 맵핑(mapping) 또는 상기 에피토프의 위치를 예측하기 위해 몇몇 그룹들을 시험하였고, N-말단 부분, 중간 부분 및 C-말단 부분이 상기 에피토프를 가지고 있는 것으로 보고되었다(참조 : Kalluri, R. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6:1178-85; Kalluri, R, et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8; Levy, J.B. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:1698-1705; Quinones, S. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 19780-4; Kefalides, N.A. et al., 1993, Kidney Int. 43:94-100; Netzer, K.O. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:11267-74). 최근에는 재조합 키메라 제조체를 사용함으로써 α3 (IV) NC1의 N-말단에 특이적인 자가항체의 반응성이 신장의 생존 비율과 상호관련되어 있음이 보고되었다(참조 : Hellmark, T. et al., 1999, Kidney Int. 55:936-44). 또한 N-말단 부분의 처음 40 아미노산에 대한 질병 관련 에피토프가 동정되었다. 굿파스튜어 증후군에 대한 에피토프를 제거시키기 위해 N-말단 53 아미노산 잔기들을 결여시킴으로써 절단된 툼스타틴을 합성하였으며, 이 분자는 마우스 이종이식 모델에서 786-O 종양 성장에 대해 억제 효과를 나타내었다. 또한 이 분자는 심각한 굿파스튜어 증후군 환자로부터의 자가항체에 결합하지 않았다. 이러한 결과들은 툼스타틴의 항혈관형성 부위가 N-말단 53 아미노산들이 제거되었을 때에도 보존된다는 것을 시사한다.

툼스타틴에 의한 내피 세포 증식의 특이적인 억제는 툼스타틴이 세포 표면 단백질/수용체를 통해 기능할 수 있음을 강력히 시사하는 것이다. 또한 혈관형성은 인테그린 avb3에 의해 매개되는 특이적인 내피 세포 부착 사건에 의존한다(참조 : Brooks, P.C. et al., 1994, Cell 79:1157-64). 툼스타틴은 매트릭스 구성요소와 증식하는 내피 세포들의 상호작용을 붕괴시킴으로써 내피 세포들이 세포자멸(apoptosis)을 개시하도록 이끌 수 있다(참조 : Re, F. et al., 1994, J. Cell. Biol. 127:537-46). 매트릭스 금속단백질분해효소들(MMP)은 종양에서 새로운 혈관의 형성을 조절하는 핵심 효소로서 관련되어 있다(참조 : Ray, J.M. et al., 1994, Eur. Respir. J. 7:2062-72). 최근에, MMP-2(PEX)의 억제제가 혈관형성을 억제시킴으로써 종양 성장을 억제시킬 수 있음이 증명되었다(참조 : Brooks, P.C. et al., Cell 92:391-400). 툼스타틴은 MMP의 활성을 억제시킴으로써 기능할 수 있다.

툼스타틴은 시험관내 및 생체내에서 혈관형성을 억제시킴으로써 종양 진행을 억제시킨다. 또한 환자에게 이러한 방법을 적용시키기 위해선, 전신 투여에 의한 툼스타틴의 잠재적 독성 또는 부작용이 고려되어야만 한다. 툼스타틴의 분포가 제한되어 있고 피부 기저막에는 대부분 부재한다는 사실은 툼스타틴 치료에 의한 부작용의 낮음을 가능성이 시사한다. 또한, 신장과 같은 제한된 기관의 혈관 기저막에서의 툼스타틴의 존재는 제한된 기관들에서 증가하는 종양을 표적화하는데에 있어서 이의 잠재적인 독특한 장점을 시사한다. 궁극적으로 유전자 이동 접근방법을 활용하여 종양 맥관구조에서 생체내에서 툼스타틴 유전자를 발현시키기 위한 또 다른 방법을 개발하는 것이 바람직하다(참조 : Kashihara, N. et al., 1997, Exp. Nephrol. 5:126-31; Maeshima, Y. et al., 1996, J. Am. Soc. Nephrol. 7:2219-29; Maeshima, T. et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:2589-97).

α3 (IV) 사슬의 분포는 선택된 기관의 기저막에 제한되어 있으며, 따라서 툼스타틴은 α사슬들의 조립을 억제시킴으로써 이 분자의 가능한 메카니즘을 고려할 때 유해성이 낮을 것으로 생각된다. 또한 α3 (IV) 사슬은 신장의 혈관 기저막에서 관찰되며(참조 : Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8), 이 혈관들은 신장 세포 암종과 같은 일차적인신장 종양의 진행과 관련되어 있다고 생각된다. 그러므로, 툼스타틴은 다른 α사슬들과 α3 (IV) 사슬의 조립을 붕괴시킴으로써 상기 종양의 치료에 효과적일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "혈관형성"은 조직 또는 기관내 새로운 혈관의 생성을 의미하며, 내피 세포 증식과 관련되어 있다. 정상적인 생리적 조건하에서, 인간 또는 동물들은 매우 특이적인 제한된 상황에서만 혈관형성을 개시한다. 예를 들어, 혈관형성은 정상적으로 상처 치료, 태아 및 배의 발달, 및 황체, 자궁내막 및 태반의 형성에서 관찰된다. 용어 "내피"는 장막강, 림프관 및 혈관에 정렬하고 있는 평평한 상피 세포의 얇은 층을 의미한다. 그러므로 "항혈관형성 활성"이란 혈관의 성장을 억제시키는 조성물의 능력을 말한다. 혈관의 성장은 일련의 복잡한 사건이며, 개별적인 내피 세포 아래에 있는 기저막의 국소적인 파괴, 이 세포들의 증식, 차후 혈관의 위치로의 세포의 이동, 새로운 혈관막을 형성하기 위한 세포의 재구성, 내피 세포 증식의 정지 및 새로운 혈관벽을 지지하는 혈관주위세포와 다른 세포들의 결합과 관련되어 있다. 그러므로 본 명세서에 사용된 바와 같은 "항혈관형성 활성"은 새로운 혈관의 형성이 억제되는 최종 결과를 수반하는 상기 단계들 중 어떤 것 또는 전부의 차단을 포함한다.

항혈관형성 활성은 내피 억제 활성과 관련될 수 있으며, 이는 일반적으로 혈관형성을 억제시키는, 예컨대, 섬유아세포 성장 인자, 혈관형성 관련 인자 또는 다른 공지된 성장 인자들의 존재하에 배양액중의 소 모세관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제시키는 조성물의 능력을 말한다. "성자 인자"는 세포의 성장, 생식 또는 합성 활성을 자극하는 조성물이다. "혈관형성 관련 인자"는 형관형성을 억제시키거나 촉진시키는 인자이다. 혈관형성 관련 인자의 예에는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 혈관형성 성장 인자가 있으며, 상기 인자는 혈관형성 촉진제이다. 혈관형성 관련 인자의 또 다른 예에는 예컨대, 앤지오스타틴(예컨대, 미국 특허 제 5,801,012호, 미국 특허 제 5,837,682호, 미국 특허 제 5,733,876호, 미국 특허 제 5,776,704, 미국 특허 제 5,639,725호, 미국 특허 제 5,792,845호, WO 96/35774호, WO 95/29242호, WO 96/41194호, WO 97/23500호 참조) 또는 엔도스타틴(예컨대, WO 97/15666호 참조)과 같은 혈관형성 억제 인자가 있다.

"실질적으로 동일한 생물학적 활성" 또는 "실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성"이란 조성물이 항혈관형성 활성을 가지며, 표준 검정에서 결정된 바와 같이, 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴과 유사하게 작용함을 의미한다. "표준 검정"에는 항혈관형성 활성, 세포 주기 정지 및 세포자멸을 평가하기 위해 분자생물학 분야에서 사용되는 프로토콜들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 검정에는 내피 세포 증식, 내피 세포 이동, 세포 주기 분석 및 내피 세포 튜브 형성, 예컨대, 세포자멸 세포 형태학 또는 아넥신 V-FITC 검정, 융모요막(CAM) 검정 및 누드 마우스에서 신장 암 종양 성장의 억제에 의한 세포자멸의 탐지에 대한 검정이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 검정들은 하기 실시예에 제공되어 있다.

"아레스텐"(본 명세서에서 "아레스틴"으로서도 부름)에는 아레스텐 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 아미노산 서열의 대립형질 변형체 뿐만 아니라 다른 포유동물로부터의 아레스텐, 및 아레스텐 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체가 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "칸스타틴"에는 탄스타틴 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 아미노산 서열의 대립형질 변형체 뿐만 아니라 다른 포유동물로부터의 칸스타틴, 및 칸스타틴 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체가 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "툼스타틴"에는 툼스타틴 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 아미노산 서열의 대립형질 변형체 뿐만 아니라 다른 포유동물로부터의 툼스타틴, 및 툼스타틴 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체가 포함된다.

본 발명이 내피 억제 활성(예컨대, 일반적으로 혈관형성을 억제시키는, 예컨대, 섬유아세포 성장 인자, 혈관형성 관련 인자 또는 다른 공지된 성자 인자들의 존재하에 배양액중의 소 모세관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제시키는 조성물의 능력)을 가진 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 어떤 유도체들을 포함시키고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질, 이 단백질들의 유도체 및 이 단백질들의 생물학적으로 활성인 단편들 전체를 포함한다. 상기 단백질들은 아미노산 치환기 또는 아미노산 작용기에 부착된 당 또는 다른 분자들을 가지고 있는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 활성을 가진 단백질들이다.

또한 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴의 단편, 돌연변이체, 동족체 및 유사체를 설명한다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "단편"은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 분자보다 짧은 아미노산 서열로서 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 적어도 25개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또한 이러한 분자들은 클로닝의 과정으로부터 유래된 추가적인 아미노산, 예컨대, 완전하거나 부분적인 링커 서열에 상응하는 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에 의해 포함되기 위해서, 상기 추가적인 아미노산 잔기들을 가지거나 가지지 않은 상기 돌연변이체들은 참조 폴리펩티드의 천연 또는 완전한 길이의 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가져야만 한다.

"툼스타틴 N-53"으로 표기한 하나의 이러한 단편은 표준 검정에 의해 결정된 바와 같이 완전한 길이의 툼스타틴의 활성과 동등한 항혈관형성 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 툼스타틴 N-53은 N-말단 53 아미노산이 결실된 툼스타틴 분자를 포함한다. 본 명세서에 기술된 다른 돌연변이체 단편들은 본 명세서에 기술된 검정에 의해 제시된 바와 같이, 매우 높은 수준의 항혈관형성 활성을 가진 것으로 밝혀졌다. 이 단편들 "툼스타틴 333", "툼스타틴 334", "12 kDa 아레스텐 단편", "8 kDa 아레스텐 단편" 및 "10 kDa 칸스타틴 단편"은 각각 75 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 50 ng/ml 및 80 ng/ml의 ED₅₀값을 가진다. 대조적으로, 완전한 길이의 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴은 각각 400 ng/ml, 400 ng/ml 및 550 ng/ml의 ED₅₀값을 가지는 것으로 밝혀졌다. 툼스타틴 333은 SEQ ID NO:10의 아미노산 2 내지 125를 포함하며, 툼스타틴 334는 SEQ ID NO:10의 아미노산 126 내지 245를 포함한다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "돌연변이체"는 동등한 참조 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 서열에 어떤 변화를 포함하고 있는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변화들은 자발적으로 또는 인간에 의한 조작에 의해, 화학 에너지(예컨대, X-레이)에 의해, 또는 다른 형태의 화학적 돌연변이유발에 의해, 또는 유전자 조작에 의해, 또는 유전 정보의 메이팅(mating) 또는 다른 형태의 교환의 결과로서 일어날 수 있다. 돌연변이는 예컨대, 염기 변화, 결실, 삽입, 역위, 전좌 또는 중복을 포함한다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 돌연변이체 형태는 동등한 참조 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리누클레오티드에 비해 증가되거나 감소된 항혈관형성 활성을 나타낼 수 있으며, 또한 이러한 돌연변이들은 클로닝의 과정으로부터 유래된 추가적인 아미노산, 예컨대, 완전하거나 부분적인 링커 서열에 상응하는 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 항혈관형성 단백질들의 돌연변이체/단편들은 PCR 클로닝에 의해 생성될 수 있다. "툼스타틴 333" 및 "툼스타틴 334"로 표기된 단편들을 이러한 방법으로 생성시켰으며, 이들은 하기 실시예 18에 기술되고 도 23 및 도 24에 제시된 바와 같이, 완전한 길이의 툼스타틴의 활성보다 우수한 항혈관형성 활성을 가지고 있다. 상기 단편들을 제조하기 위해, 각 프라이머의 세트로 전체 단백질로부터 공지된 하위서열을 증폭시키는 방식으로 공지된 서열로부터 PCR 프라이머들을 디자인하였다. 그런 다음 이 하위서열들을 pET22b 벡터와 같은 적절한 발현 벡터내로 클로닝하고, 발현된 단백질을 하기 검정에 기술된 바와 같이 이의 항혈관형성 활성에 대해 시험하였다.

또한 본 발명의 항혈관형성 단백질들의 돌연변이체/단편들은 마리야마, 엠.(Mariyama, M.) 등의 문헌(참조 : 1992, J. Biol. Chem. 267:1253-8) 및 하기 실시예 24에 기술된 바와 같이, 슈도모나스 엘라스타제 분해에의해 생성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 12 kDa 및 8 kDa 아레스틴 돌연변이체 및 10 kDa 칸스타틴 돌연변이체를 생성시켰고, 상기 세 단백질 모두는 본래의 완전한 길이의 단백질들보다 더 높은 수준의 항혈관형성 활성을 가지고 있었다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "유사체"는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 분자 또는 이들의 단편 또는 대립형질 변형체와 실질적으로 유사한 비천연 분자를 의미하며, 이들은 실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성을 가지고 있다. 이 유사체들에 생물학적으로 활성인 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 유도체(예컨대, 상기 정의한 바와 같은 화학적 유도체) 뿐만 아니라 이의 단편, 돌연변이체, 동족체 및 대립형질 변형체를 포함시키고자 하며, 이 유도체들은 개질되지 않은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드, 단편, 돌연변이체, 동족체 또는 대립형질 변형체의 효과와 질적으로 동일한 촉진제 또는 길항제 효과를 나타낸다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 "대립형질"은 참조 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 비교하여 천연적으로 발생하는 서열 변화를 포함하는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 "대립형질"은 참조 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴 폴리펩티드를 엔코딩하는 참조 폴리누클레오티드 서열과 비교하여 서열 변화를 포함하는 폴리펩티드를 의미하며, 여기서 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 대립형질은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 대립형질 형태를 엔코딩하고 있다.

제공된 폴리펩티드는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 단편, 돌연변이체, 유사체 또는 대립형질 변형체이거나, 2가지 이상의 이러한 것들, 예컨대, 폴리펩티드는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 폴리펩티드의 유사체 및 돌연변이체 둘 모두일 가능성이 있다. 예를 들어, 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 분자의 짧아진 단백질(예컨대, 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 단편)은 실험실에서 생성될 수 있다. 그런 다음 이 단편이 본 기술 분야에 공지된 수단을 통해 돌연변이 된다면, 분자는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 단편 및 돌연변이체 둘 모두로 생성될 수 있다. 또 다른 예에서, 돌연변이체는 생성될 수 있으며, 이것은 나중에 일부 포유류 개체에서 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴의 대립형질 형태로서 존재하는 것으로 발견되었다. 그러므로 이러한 돌연변이체 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 분자는 돌연변이체 및 대립형질 변형체 둘 모두일 것이다. 단편, 돌연변이체, 대립형질 변형체 및 유사체들의 이러한 조합물을 본 발명에 포함시키고자 한다.

예를 들어, 하기 실시예 18에 기술한 대장균 발현 클로닝 방법에 의해 제조된 툼스타틴은 단량체이다. 또한 대장균 발현 클로닝 방법은 본래의 단백질에는 존재하지 않는 폴리링커 서열 및 히스티틴 태그를 발현된 단백질에 추가시키기 때문에 상기 툼스타틴은 융합 또는 키메라 단백질이다. 또한 실시예 18에 기술한 툼스타틴 단편 "툼스타틴 N-53"은 완전한 길이의 툼스타틴 단백질의 단편 및 결실 돌연변이체이며, 동일한 대장균 발현 클로닝 방법에 의해 제조될 때는 이것에 추가된 추가적인 서열을 가지며, 따라서 완전한 길이의 툼스타틴 단백질의 융합 또는 키메라 돌연변이체 단편이기도 하다. 예컨대, 이량체, 삼량체 등으로 서로 결합될 때, 이 툼스타틴 N-53의 서브유닛은 툼스타틴 단백질의 키메라 돌연변이체 단편의 다량체 융합체를 생성시킬 것이다.

본 발명에 의해 포함되는 것은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 가지고 있는 폴리누클레오티드이다. "실질적으로 동일한 서열"은 참조 서열, 예컨대, 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드와 적어도 약 70% 서열 동일성, 전형적으로는 참조 서열과 적어도 약 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 가장 바람직하게는 참조 서열과 적어도 약 97% 서열 동일성을 나타내는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 서열들에 대해 비교 길이는 일반적으로는 적어도 75 누클레오티드 염기 또는 25 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 150 누클레오티드 염기 또는 50 아미노산, 가장 바람직하게는 243-264 누클레오티드 염기 또는 81-88 아미노산일 것이다. 본 명세서에 사용된 "폴리펩티드"는 아미노산의 분자 사슬을 가리키며 특정한 길이의 생성물을 말하는 것이 아니다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의내에 포함된다. 또한 이 용어에는 예컨대, 당부가, 아세틸화, 인산화 등과 같은 후발현 개질된 폴리펩티드를 포함시키고자 한다.

본 명세서에 사용된 "서열 동일성"은 2개의 중합 분자, 예컨대, 2개의 폴리누클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드사이의 서브유닛 서열 유사성을 말한다. 2개의 분자 모두의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛으로 채워질 때, 예컨대, 2개의 펩티드 각각의 위치가 세린으로 점유되어 있으면, 이들은 이 위치에서 동일한 것이다. 2개의 서열간의 동일성은 일치하거나 동일한 위치들의 수의 직접적인 함수이다[예컨대, 2개의 펩티드나 화합물 서열에서 이러한 위치들의 절반(예컨대, 10 서브유닛 길이의 중합체에서 5개 위치들)이 동일하다면, 2개의 서열은 50% 동일한 것이고; 만일 위치들의 90%(예컨대, 10개중 9개가 일치)가 동일하다면, 2개의 서열은 90% 서열 동일성을 공유하는 것이다]. 예로써, 아미노산 서열 R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃과 R₉R₈R₁R₁₀R₆R₃은 6개 위치들 중 3개를 공통적으로 가지며, 따라서 50% 서열 동일성을 공유하는 반면, 서열 R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃과 R₈R₁R₁₀R₆R₃은 5개 위치들 중 3개를 공통적으로 가지며, 따라서 60% 서열 동일성을 공유한다. 2가지 서열간의 동일성은 일치하거나 동일한 위치들의 수의 직접적인 함수이다. 따라서, 참조 서열의 일부가 특정한 펩티드에서 결실된 경우, 이 결실된 부분은 서열 동일성 계산에 포함되지 않는다(예컨대, R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃및 R₂R₅R₇R₁₀R₃은 6개 위치중에서 5개를 공통적으로 가지고 있으며, 그 결과 83.3% 서열 동일성을 공유한다).

동일성은 종종 서열 분석 소프트웨어, 예컨대, BLASTN 또는 BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 이용가능함)를 사용하여 측정된다. BLASTN(누클레오티드 서열을 위한) 2개의 서열을 비교(예컨대, 2개의 서열을 서로 "Blast"하는것("Blast"-ing), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ bl2.html 참조)하기 위한 디폴트 파라미터는 매치 = 1, 미스매치에 대한 페널티 = -2, 오픈 갭 = 5, 익스텐션 갭 = 2에 대한 보상이다. 단백질 서열을 위한 BLASTP를 사용할 때, 디폴트 파라미터는 매치 = 0, 미스매치에 대한 페널티 = 0, 오픈 갭 = 11 및 익스텐션 갭 = 1에 대한 보상이다.

2개의 서열이 "서열 상동성"을 공유할 때, 서열 상동성이란 2개의 서열이 보존적인 치환에 의해서만 서로 차이가 있는 것을 의미한다. 폴리펩티드 서열에 있어서, 이러한 보존적인 치환은 주어진 위치에서의 하나의 아미노산으로 동일 부류의 또 다른 아미노산(예컨대, 소수성, 전하, pK 또는 다른 형태적인 특징 또는 화학적인 특성을 공유하는 아미노산)을 치환하는 것(예컨대, 류신을 발린으로, 리신을 아르기닌으로 치환하는 것), 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키는 정도로 폴리펩티드의 형태 또는 접힘을 변화시키지 않는 서열의 위치에서의 하나 이상의 비보존적인 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 구성되어 있다. "보존적인 치환"의 예에는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 비극성(소수성) 잔기로 또 다른 잔기를 치환하는 것; 하나의 극성(친수성) 잔기로 아르기닌과 리신간, 글루타민과 아스파라긴간, 트레오닌과 세린간과 같은 다른 잔기를 치환하는 것; 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 하나의 염기성 잔기로 또 다른 잔기를 치환하는 것; 아스파르탐산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기로 또 다른 잔기를 치환하는 것; 또는 비유도체화된 잔기 대신 화학적으로 유도체화된 잔기의 사용이 포함되는데, 단 폴리펩티드가 필수적인 생물학적 활성을 나타내어야 한다. 서열 상동성을 공유하는 2개의 서열을 "서열 동족체"라고 부르기도 한다.

폴리펩티드에 있어서 상동성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어[예컨대, 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 팩키지(참조 : Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)]를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 다른 개질에 대한 상동성의 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매치시킨다. 보존적인 치환에는 전형적으로 하기 군내에서의 치환이 포함된다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르탐산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.

또한 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴의 화학적 유도체들을 포함한다. "화학적 유도체"는 작용 사이드 기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기들을 가진 대상 폴리펩티드이다. 예를 들어, 이러한 유도체화된 잔기들에는 유리 아미노 기들이 유도체화되어 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐 기, 카보벤즈옥시 기, t-부틸옥시카보닐 기, 클로로아세틸 기 또는 포르밀 기를 형성하는 분자들이 포함된다. 유리 카복실 기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 타입의 에스테르 또는 하이드라지드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실 기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티틴의 이미다졸 질소는 유도체화되어 N-임벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 또한 본 발명은 화학적 유도체로서 20개의 표준 아미노산의 천연 발생 아미노산 유도체들을 하나 이상 포함하는 단백질들을 포함한다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 프롤린을 치환할수 있고; 5-하이드록시리신은 리신을 치환할 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘을 치환할 수 있고; 호모세린은 세린을 치환할 수 있고; 오르니틴은 리신을 치환할 수 있다.

또한 본 발명은 항혈관형성 단백질, 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체를 포함하는 융합 단백질 및 키메라 단백질을 포함한다. 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 재조합 발현 및 클로닝 과정의 결과로서 생성될 수 있으며, 예컨대, 상기 단백질은 추가적인 아미노산 또는 완전하거나 부분적인 링커 서열(예컨대, 본 발명의 아레스텐)에 상응하는 아미노산 서열을 포함하여 생성될 수 있으며, 대장균에서 생성될 때(하기 실시예 2 참조)에는, 히스티딘 태그를 포함하여, 단백질에 추가된 추가적인 벡터 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질 또는 키메라 단백질"은 본래의 단백질 서열에 상기 타입의 변화를 포함시키고자 한 것이다. 유사한 변화들이 칸스타틴 및 툼스타틴 단백질에 대해 일어날 수 있다(각각 실시예 11 및 18). 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 단일 단백질의 다량체, 예컨대, 항혈관형성 단백질의 반복체로 구성될 수 있거나 융합 단백질 및 키메라 단백질은 수개의 단백질, 예컨대, 수개의 항혈관형성 단백질로 구성될 수 있다. 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 공지된 항혈관형성 단백질(예컨대, 앤지오스타틴 및 엔도스타틴, 또는 앤지오스타틴과 엔도스타틴의 생물학적으로 활성인 단편들) 둘 이상의 조합물, 또는 표적화제와 결합한 항혈관형성 단백질(예컨대, 상피 성장 인자(EGF) 또는 RGD 펩티드와 엔도스타틴), 또는 면역글로불린 분자와 결합한 항혈관형성 단백질(예컨대, 엔도스타틴과 IgG, 상세하게는 제거된 Fc 부분)을 포함할 수 있다. 또한 융합 단백질 및 키메라 단백질은 항혈관형성 단백질, 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체, 및 다른 항혈관형성 단백질, 예컨대, 엔도스타틴, 또는 앤지오스타틴을 포함할 수 있다. 다른 항혈관형성 단백질들은 레스틴 및 아포미그렌(참조 : PCT/US98/26058, 참조로서 본 명세서에 인용되어 있는 것에 대한 교시); 및 엔도스타틴의 단편들(참조 : PCT/US98/26057, 참조로서 본 명세서에 인용되어 있는 것에 대한 교시)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에 사용되는 용어 "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질"은 예컨대, 화학요법 약제를 운반하기 위한 추가적인 구성요소를 포함할 수 있으며, 여기서 화학요법 약제를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 연결되어 있다. 또한 융합 단백질 또는 키메라 단백질들은 항혈관형성 단백질의 다량체, 예컨대, 이량체 또는 삼량체를 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질 또는 키메라 단백질들은 후번역 개질을 통해 서로 연결될 수 있거나(예컨대, 화학적으로 연결됨), 융합 단백질 전체는 재조합적으로 제조될 수 있다.

또한 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴, 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체를 포함하는 다량체 단백질들을 본 발명에 포함시키고자 한다. "다량체"는 서브유닛 단백질의 둘 이상의 복사본을 포함하는 단백질을 의미한다. 서브유닛 단백질은 본 발명의 단백질, 예컨대, 2번 이상 반복되는 아레스텐, 또는 2번 이상 반복되는 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 또는 대립형질 변형체, 예컨대, 툼스타틴 돌연변이체 또는 단편, 예컨대, 툼스타틴 333 중 하나일 수 있다. 또한 이러한 다량체는 융합 단백질 또는 키메라 단백질일 수 있다. 예컨대, 반복된 툼스타틴 돌연변이체는 단일 복사본으로 존재할 수 있는 폴리링커 서열 및/또는 항혈관형성 펩티드 하나 이상과 결합하거나, 일렬로 반복되어 있을 수도 있다(예컨대, 단백질은 전체 단백질내에 둘 이상의 다량체를 포함할 수 있다).

또한 본 발명은 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 엔코딩하는 단리된 폴리누클레오티드(들) 뿐만 아니라 상기 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포 하나 이상을 포함하는 조성물, 및 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴, 및 이들의 단편, 돌연변이체, 동족체, 유사체 및 대립형질 변형체를 제조하는 방법을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "벡터"는 핵산의 조각이 삽입되거나 클로닝될 수 있는 캐리어를 의미하며, 상기 캐리어는 숙주 세포내로 핵산의 조각을 이동시키는 기능을 한다. 또한 이러한 벡터는 이동된 핵산 조각을 복제 및/또는 발현시킬 수 있다. 벡터의 예에는 예컨대, 플라스미드, 박테리오파지 또는 포유류, 식물 또는 곤충 바이러스, 또는 리간드-핵산 컨쥬게이트, 리포좀 또는 지질-핵산 복합체와 같은 비바이러스성 벡터로부터 유도된 핵산 분자들이 포함된다. 이동된 핵산 분자는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 이동된 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 형성하는 것이 바람직하다. 핵산의 이러한 이동을 일반적으로 "형질전환"이라 부르며, 형질전환이란 삽입을 위해 사용되는 방법에 상관없이 숙주 세포내로 외인성 폴리누클레오티드를 삽입시키는 것을 말한다. 예를 들어, 직접적인 업테이크(uptake), 형질도입 또는 f-메이팅(mating)이 포함된다. 외인성 폴리누클레오티드는 비통합된 벡터, 예컨대, 플라스미드로서 유지되거나 숙주 지놈(genome)내로 통합될 수도 있다. "작동가능하게 연결된"은 기술된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 이들을 허용하는 관계에 있는 상황을 말하며, 예컨대, 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 상기 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립할 수 있는 조건하에서 달성될 수 있는 방식으로 연결되어 있다. "코팅 서열"은 mRNA로 전사되어 적절한 조절 서열의 제어하에(예컨대, 작동가능하게 연결된) 위치될 때 폴리펩티드로 번역되는 폴리누클레오티드 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단에 번역 시작 코돈 및 3'-말단에 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 이러한 경계는 천연적으로 발생되거나 본 기술분야의 공지된 방법에 의해 폴리누클레오티드 서열이 도입되거나 추가될 수 있다. 코딩 서열에는 mRNA, cDNA 및 재조합 폴리누클레오티드 서열이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

상기 클로닝된 폴리펩티드가 클로닝되는 벡터는 원핵생물체에서 기능한다는 이유 때문에 선택되거나, 진핵생물체에서 기능한다는 이유 때문에 선택될 수도 있다. 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 클로닝 및 상기 폴리누클레오티드로부터의 이 단백질들의 발현 둘 모두를 가능하도록 해주는 벡터의 2가지 예는 pET22b와 pET28(a) 벡터[노바젠사(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)] 및 개질된 pPICZαA 벡터[인비트로젠사(InVitrogen, San Diego, California, USA)]이고, 이들은 각각 세균 및 효모에서 상기 단백질의 발현을 가능하도록 해준다(예컨대, PCT/US98/25892 참조, 이의 교시는 본 명세서에 참고로 인용함).

일단 폴리누클레오티드가 적합한 벡터내로 클로닝되면, 이것은 적절한 숙주 세포내로 형질전환될 수 있다. "숙주 세포"는 벡터에 의해 이동되는 핵산의 수용세포로서 사용되거나 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물, 포유류, 식물 또는 곤충일 수 있으며, 단세포로서 존재하거나 집합체, 예컨대, 배양물로서 또는 조직배양물로, 또는 조직이나 생물체로 존재할 수 있다. 또한 숙주 세포는 다세포 생물, 예컨대, 포유동물의 정상 조직 또는 질병 조직으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 숙주 세포에는 핵산과 함께 형질전환된 본래의 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손으로서 여전히 상기 핵산을 가지고 있는 세포가 포함된다.

한 가지 양태에서, 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 단리된 폴리누클레오티드는 펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 링커를 추가적으로 포함한다. 이러한 링커는 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 예컨대 상기 링커는 추가적인 아미노산 하나 이상을 엔코딩하는 추가적인 코돈 하나 이상을 포함할 수 있다. 전형적으로 상기 링커에는 1 내지 20 또는 30개 아미노산이 포함된다. 폴리누클레오티드 링커는 번역되는데, 폴리누클레오티드가 항혈관형성 단백질을 엔코딩하고 있기 때문에, 항혈관형성 단백질의 아미노 또는 카복실 말단에 추가적인 아미노산 잔기를 하나 이상 가진 항혈관형성 단백질로 발현된다. 중요하게는, 상기 추가적인 아미노산 또는 아미노산들은 항혈관형성 단백질의 활성을 손상시키기 않는다.

벡터내로 선택된 폴리누클레오티드를 삽입시킨 후에, 벡터를 적절한 원핵세포 균주내로 형질전환시키고 생물학적으로 활성인 항혈관형성 단백질을 생성시키기 위해 이 균주를 적합한 배양 조건하에서 배양시킴으로써(예컨대, 유지시킴), 생물학적으로 활성인 항혈관형성 단백질, 또는 이들의 돌연변이체, 유도체, 단편 또는 융합 단백질을 생성시켰다. 한 가지 양태에서, 본 발명은 벡터 pET22b, pET17/b 또는 pET28a내로 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 클로닝한 다음 세균내로 형질전환시키는 것을 포함한다. 그러면 세균 숙주 균주는 혈관형성 단백질을 발현시킨다. 전형적으로 항혈관형성 단백질은 배양액의 리터당 약 10-20 밀리그람 이상의 양으로 생성된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 진핵세포 벡터에는 개질된 효모 벡터가 포함된다. 한 가지 방법은 다중 클로닝 부위를 포함하고 있는 pPICzα플라스미드를 사용하는 것이다. 다중 클로닝 부위는 상기 다중 클로닝 부위내에 삽입되어 있는 His.Tag 모티프를 가지고 있다. 추가적으로 상기 벡터는 개질되어 NdeI 부위 또는 다른 적합한 제한 부위들이 추가될 수 있다. 이 부위들은 본 기술분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 이 양태에 의해 생성된 항혈관형성 단백질들에는 하나 이상의 히스티딘, 전형적으로는 약 5-20개 히스티딘을 포함하는 히스티딘 태그 모티프(His.tag)가 포함된다. 상기 태그는 단백질의 항혈관형성 특성을 방해하지 말아야 한다.

예를 들어, 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 생성하는 한 가지 방법은 각각 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:9의 폴리누클레오티드를 증폭시키고, 이것을 발현 벡터, 예컨대, pET22b, pET28(a), pPICZαA 또는 일부 다른 발현 벡터내로 클로닝하고, 상기 폴리누클레오티드를 함유하는 상기 벡터를 상기 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 숙주 세포내로 형질전환시키고, 상기 단백질을 발현시키기에 적절한 배양 조건하에서 상기 형질전환시킨 숙주 세포를 배양시킨 다음, 배양물로부터 상기 단백질을 추출 및 정제하는 것이다. 일반적 항혈관형성 단백질, 및 아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴을 생성시키기 위한 모범적인 방법들은 하기 실시예에 제공되어 있다. 또한 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질은 유전자이식 동물의 생성물, 예컨대, 유전자이식 소, 염소, 양 또는 돼지의 유액의 구성요소 또는 유전자이식 식물의 생성물(예컨대, 옥수수에서 전분 분자와 결합되거나 연결된)로서 발현될 수 있다.

또한 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴은 통상적으로 공지된 화학적 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 합성 방법에 의해 본 발명의 단백질들을 제조하기 위한 방법들은 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 합성적으로 제조된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질 서열들은 예컨대, 재조합적으로 생성된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴과 1차, 2차 또는 3차 구조적 및/또는 형태적 특징을 공유함으로써 생물학적 활성을 포함하여, 이들과 함께 공통적인 생물학적 특성을 가질 수 있다. 따라서, 합성적으로 제조된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질 서열들은 예컨대, 치료 화합물의 스크리닝 및 항체의 발달을 위한 면역학적 방법에서 재조합적으로 생성되어 정제된 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴 단백질 대신 생물학적으로 활성이거나 면역학적인 대체물로서 사용될 수 있다.

아레스텐, 칸스타틴 및 툼스타틴 단백질들은 표준 검정에서 결정되고 하기 실시예에 제공되는 바와 같이 혈관형성을 억제시키기에 유용하다. 아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴은 다른 세포 타입, 예컨대, 비내피 세포의 성장을 억제시키지 않는다.

아레스텐, 칸스타틴 또는 툼스타틴을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 단리된 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 클로닝할 수 있다. 본 명세서에서 언급하는 "단리된" 핵산 폴리펩티드는 이들을 수득할 수 있게 한 생물학적 공급원의 물질(예컨대, 핵산의 혼합물 또는 세포에 존재하는 물질)을 사실상 함유하지 않는(예를 들면, 이러한 물질로부터 분리된) 핵산 또는 폴리펩티드로서, 이들은 추가로 처리될 수 있다. "단리된" 핵산 또는 폴리펩티드에는 필수적으로 순수한 핵산 또는 폴리펩티드, 화학적 합성, 화학적 또는 생물학적 방법의 조합에 의해 생성된 핵산 또는 폴리펩티드 및 단리된 재조합적으로 생성된 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하여, 본 명세서에 기술하는 방법, 유사한 방법 또는 다른 적절한 방법에 의해 수득된 핵산 또는 폴리펩티드가 포함된다. 그러므로 단리된 폴리펩티드는 정상적으로 결합되어 있는 다른 단백질, 탄수화물, 지질 및 다른 세포 구성요소를 비교적 함유하지 않는 것을 의미한다. 핵산이 유래된 생물체의 천연적으로 존재하는 지놈에서는 핵산이 양쪽 핵산과 직접 접촉(즉, 공유적으로 결합)하고 있지만 단리된 핵산은 양쪽 핵산과 직접 접촉하고 있지 않다. 그러므로, 상기 용어에는, 예컨대, 벡터내에 통합된 핵산(예컨대, 자가 복제하는 바이러스 또는 플라스미드) 또는 화학적 수단이나 제한효소 처리에 의해 생성된 핵산 단편과 같은 다른 핵산들과 독립적으로 분리된 분자로서 존재하는 핵산이 포함된다.

또한 본 발명의 폴리누클레오티드 및 단백질들은 다른 항혈관형성 단백질들을 단리시키기 위한 프로브를 디자인하기 위해 사용될 수 있다. 우수한 방법들이 자콥(Jacobs) 등이 기술한 미국 특허 제 5,837,490호에 제공되어 있으며, 이의 전체 교시는 참고로서 본 명세서에 완전히 인용되어 있다. 올리고누클레오티드 프로브의 디자인은 다음의 파라미터를 따르는 것이 바람직하다: (a) 불명확 염기("N")를 가지고 있더라도 최소한으로 가지는 서열의 영역으로 디자인해야 하고, (b) (A 또는 T 각각에 대해 2℃, G 또는 C 각각에 대해 4℃로 가정할 때) T_m이 약 80℃가 되도록 디자인해야 한다.

올리고누클레오티드를 표지시키기 위해 보편적으로 사용되는 기술을 사용하여 상기 올리고누클레오티드를 g-³²P-ATP(특이적 활성 6000 Ci/mmole) 및 T4 폴리누클레오티드 키나제를 사용하여 표지시키는 것이 바람직하다. 또한 다른 표지 기술들이 사용될 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피 또는 다른 확립된 방법들에 의해 비혼입된 표지를 제거시키는 것이 바람직하다. 프로브내로 혼입된 방사능의 양은 섬광 계수기로 측정함으로써 정량되어야 한다. 바람직하게는, 수득된 프로브의 비활성은 약 4 x 10⁶dpm/pmole이 되어야 한다. 완전한 길이의 클론의 혼합물을 포함하는 세균 배양물을 녹이고 이 보존배양물 100 ㎕를 사용하여 ml당 100 ㎍으로 암피실린을 함유하는 멸균 L-브로쓰 25 ml이 담겨있는 멸균 배양 플라스크에 접종하는 것이 바람직하다. 이 배양물을 37℃에서 포화되도록 성장시키는 것이 바람직하며, 포화된 배양물을 새로운 L-브로쓰중에 희석시키는 것이 바람직하다. 이 희석액들의 분취액을 플레이팅시켜 150 mm 페트리 디시(petri dish)중의 ml당 100 ㎍의 암피실린을 함유하는 L-브로쓰 및 1.5% 아가(agar)를 함유하는 고형 세균 배지상에 37℃에서 밤새 성장시켰을 때 약 5000개의 명확하게 분리된 콜로니를 생성시키는 희석도 및 부피를 결정하였다. 또한 명확하게 분리된 콜로니를 생성시키는 다른 공지된 방법들이 사용될 수 있다.

그런 다음, 표준 콜로니 혼성화 방법을 사용하여 콜로니를 니트로셀룰로오스 필터로 이동시키고 이들을 용해, 변성 및 베이킹(baking)시켜야 한다. 예를 들어, 고도의 엄중 조건은 적어도 65℃에서 1x SSC 또는 42℃에서 1x SSC 및 50% 포름아미드를 사용하는 조건이다. 적당한 엄중 조건은 적어도 65℃에서 4x SSC 또는 42℃에서 4x SSC 및 50% 포름아미드를 사용하는 조건이다. 약한 엄중 조건은 적어도 50℃에서 4x SSC 또는 40℃에서 6x SSC 및 50% 포름아미드를 사용하는 조건이다.

그런 다음, 필터를 0.5% SDS, 효모 RNA 100 ㎍/ml 및 10 mM EDTA(150 mm 필터 당 약 10 mL)를 함유하는 6배 SSC(20x 저장시약은 173.3 g NaCl/리터, 88.2 g Na 시트레이트/리터이고, NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정)중에 완만하게 교반시키면서 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키는 것이 바람직하다. 그런 다음 상기 프로브를 바람직하게는 1 x 10⁶dpm/mL이상의 농도로 혼성화 혼합물에 첨가한다. 그런 다음 온화한 교반하에 65℃에서 밤새 인큐베이션시키는 것이 바람직하다. 그런 다음 교반시키지 않으면서 실온에서 2x SSC/0.5% SDS 500 ml중에서 세척하는 것이 바람직하며, 이어서 온화한 교반하에 실온에서 15분 동안 2x SSC/0.1% SDS 500 mL중에서 세척하는 것이 바람직하다. 65℃에서 30분 내지 1시간 동안 0.1x SSC/0.5% SDS를 사용하는 세척은 선택사항이다. 그런 다음 필터를 건조시키고 충분한 시간 동안 자동방사선사진법을 수행하여 X-레이 필름상에 포지티브를 가시화시킨다. 또한 다른 공지된 혼성화 방법들이 사용될 수 있다. 그런 다음 포지티브 콜로니를 취하여, 배양액에서 성장시키고, 표준 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 단리시킨다. 그런 다음 클론을 제한 분석법, 혼성화 분석법 또는 DNA 서열분석법에 의해 확인할 수 있다.

본 발명은 아레스텐, 칸스타틴, 툼스타틴 또는 이들의 생물학적으로 활성인 단편, 유사체, 동족체, 유도체 또는 돌연변이체를 사용하여 포유동물 조직에서 혈관형성을 억제시키는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 항혈관형성 단백질 하나 이상, 이들의 생물학적으로 활성인 단편 하나 이상, 항혈관형성 활성을 가진 단편들의 조합물 또는 촉진제 및 길항제의 유효량을 사용하여 혈관형성-매개된 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 항혈관형성 단백질의 유효량은 질병 또는 질환을 초래하는 혈관형성을 억제시키기에 충분한 양이며, 따라서 상기 질병 또는 질환을 완전하게 또는 부분적으로 완화시킨다. 혈관형성-매개된 질병의 완화는 질병의 징후의 완화, 예컨대, 종양의 크기의 감소 또는 억제된 종양 성장을 관찰함으로써 결정될 수 있다. 또한 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 환자에게 의미있는 장점, 즉, 관련된 의학적 질환의 치료, 치유, 예방 또는 향상, 또는 상기 질환의 치료, 치유, 예방 또는 향상의 비율의 증가를 나타내기에 충분한 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 전체량을 의미한다. 조합물에 적용할 때, 상기 용어는 연속적으로 또는 일제히 함께 투여되든 안되든 간에, 치료적 효과를 야기시키는 활성 성분의 합한 양을 말한다. 혈관형성-매개된 질병에는 암, 고형 종양, 혈액-발생 종양(예컨대, 백혈병), 종양 전이, 양성 종양(예컨대, 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종), 류마티즘성 관절염, 건선, 안구 혈관형성 질환(예컨대, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 황반변성, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 후수정체 섬유증식, 홍색증), 오슬러-웨버 증후군, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생, 모세혈관 확장증, 혈우병 관절증, 혈관섬유증 및 외상 과립화가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 항혈관형성 단백질들은 내피 세포들을 과잉 또는 비정상적으로 자극시키는 질환을 치료하기에 유용하다. 이러한 질환들에는 장 유착증, 크론병, 동맥경화증, 경피증 및 비후성 반응(즉, 켈로이드)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 항혈관형성 단백질들은 배(胚) 착상을 위해 필요한 혈관신생을 방지시킴으로써 출산 제어제로서 사용될 수 있다. 항혈관형성 단백질은 캣 스크래치 질환[로켈레 미날리아 퀸토사(Rochele minalia quintosa)] 및 궤양[헬리오박터 필로리(Heliobacter pylori)]와 같은 병리학적인 결과로서 혈관형성을 가지는 질환들을 치료하기에 유용하다. 또한 항혈관형성 단백질들은 예컨대, 지방 조직에서 모세관 형성을 억제시켜, 모세관의 확장을 방지시킴으로써 투석 이식 혈관 통로 협착증 및 비만을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한 항혈관형성 단백질은 국부적인(예컨대, 전이되지 않은) 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. "암"은 신형성 성장, 과형성 또는 증식성 성장 또는 비정상적인 세포 발생의 병리학적 상태를 의미하며 백혈병에서 나타나는 바와 같은 고형 종양, 비고형 종양 및 어떤 비정상적인 세포 증식이 포함된다. 또한 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암"은 혈관형성-의존성 암 및 종양, 즉, 이들의 성장(부피 및/또는 질량에서의 확장)을 위해 혈액과 함께 이들을 공급하는 혈관의 수 및 밀도에서의 증가를 필요로 하는 종양을 의미한다. "퇴화"란 본 기술분야의 숙련자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 결정되는 것과 같이 종양 질량 및 크기의 감소를 말한다.

또한, 혈관형성의 증가가 바람직한 곳, 예컨대, 상처 치료, 또는 후경색 심장 조직, 항혈관형성 단백질에 대한 항체 또는 항혈청은 국부적인, 본래의 항혈관형성 단백질 및 과정을 방해함으로써, 새로운 혈관의 형성을 증가시켜 조직의 퇴화를 억제시키 위해 사용될 수 있다.

항혈관형성 단백질들은 질환의 치료를 위해 다른 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양은 통상적으로 항혈관형성 단백질과 함께 외과수술, 방사능, 화학요법 또는 면역요법을 사용하여 치료한 다음 항혈관형성 단백질을 환자에게 투여하여 미소전이의 휴면기를 연장시키고 남아있는 일차 종양의 성장을 안정화시켜 억제시킬 수 있다. 또한 항혈관형성 단백질, 또는 이들의 단편, 항혈청, 수용체 촉진제 또는 수용체 길항제, 또는 이들의 조합물들은 다른 항혈관형성 화합물, 또는 단백질, 단편, 항혈청, 다른 항혈관형성 단백질(예컨대, 앤지오스타틴, 엔도스타틴)의 수용체 촉진제, 수용체 길항제와 결합될 수 있다. 추가적으로, 항혈관형성 단백질 또는 이들의 단편, 항혈청, 수용체 촉진제, 수용체 길항제 또는 이들의 조합물들은 약제학적으로 허용되는 부형제 및 생분해성 중합체와 같은 임의로 지속방출되는 매트릭스와 결합하여 치료적 조성물을 형성한다. 또한 본 발명의 조성물들은 엔도스타틴 또는 앤지오스타틴과 같은 다른 항혈관형성 단백질 또는 화학적 화합물 및 이들의 돌연변이체, 단편 및 유사체를 함유할 수 있다. 상기 조성물들은 상기 단백질의 활성을 향상시키거나 부각시키는 또는 화학요법적이거나 방사능적인 약제와 같이 치료에 사용하는 다른 약제들을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 추가적인 인자 및/또는 약제는 상기 조성물에 포함됨으로써 본 발명의 단백질과 함께 상승효과를 생성시키거나 부작용을 최소화시킬 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 조성물의 투여는 예컨대, 화학요법 또는 방사능 치료 요양법과 함께 투여되는 다른 치료법과 병행할 수 있다.

본 발명은 조직을 본 발명의 단백질을 함유하는 조성물과 접촉시킴으로써 포유동물 조직에서 혈관형성을 억제시키기 위한 방법을 포함한다. "접촉"은 국소적인 적용 뿐만 아니라 조직 또는 조직의 세포내로 상기 조성물을 도입시키는 운반 모드를 의미한다.

또한 본 발명은 시한적인 방출 또는 지속적인 방출 운반 시스템의 용도를 포함한다. 상기 시스템은 외과수술이 곤란하거나 불가능한 상황, 예컨대, 환자가 연령 또는 병의 경과로 인해 쇠약해진 상황 또는 위험성-장점 분석 결과 치료보다 조절이 필요하다고 판단되는 상황에 매우 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 지속방출되는 매트릭스는 보편적으로 중합체인 물질로 구성된 매트릭스이고, 이것은 효소적 또는 산/염기 가수분해에 의해 또는 용해에 의해 분해될 수 있다. 일단 체내로 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 작용받게 된다. 지속방출된 매트릭스는 리포좀, 폴리락티드 (폴리락트산), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 공(co-)글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리산무수물(polyanhydrides), 폴리(오르쏘)에스테르, 폴리단백질, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신과 같은 아미노산, 폴리누클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생물호환성 물질로부터 선택되는 것이 바람직하다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜리드 또는 폴리락티드 공글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 중 하나의 매트릭스이다.

본 발명의 혈관형성 조절 조성물은 고형물, 액체 또는 에어로졸일 수 있으며 어떤 공지된 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 고형 조성물의 예에는 환약, 크림 및 주입가능한 투약 유닛이 포함된다. 환약은 경구적으로 투여될 수 있으며, 치료 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 주입가능한 투약 유닛은 국부적으로, 예컨대 종양 위치에 투여되거나 혈관형성-조절 조성물의 전신 방출을 위해, 예컨대 피하적으로 주입될 수 있다. 액체 조성물의 예에는 피하, 정맥내, 동맥내 주사를 위해 적합된 제형 및 국소적 및 안내(眼內)적 투여을 위한 제형이 포함된다. 에어로졸 제형에는 폐에 투여하기 위한 흡입용 제형이 포함된다.

상기 기술한 항혈관형성 활성을 가진 단백질 및 단백질 단편들은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있는 제형 방법을 사용하는 약제학적으로 허용되는 제형중에 단리되어 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물들은 국소적, 경피적, 복강내, 두개내(頭蓋內), 대뇌실내, 대뇌내, 질내, 자궁내, 경구, 직장 또는 비경구(예컨대, 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내) 경로를 통해 투여될 수 있다. 추가적으로, 항혈관형성 단백질들은 생분해성 중합체내에 혼입되어 상기 화합물의 지속된 방출을 가능하도록 해줄 수 있으며, 상기 중합체는 약제 운반이 바람직한 위치의 부근, 예컨대, 종양의 위치에 주입되거나 주입되어 항혈관형성 단백질을 전신으로 서서히 방출시킨다. 또한 삼투압 미니펌프를 사용하여 직접 전이성 성장을 하는 위치내에 또는 상기 종양에 공급되는 혈관내와 같은 관심있는 위치에 캐뉼러를 통해 고농도의 항혈관형성 단백질의 운반을 제어할 수 있다. 생분해성 중합체 및 이들의 용도는 예컨대, 브렘(Brem) 등의 문헌(참조 : 1991, J. Neurosurg. 74:441-446)에 상세하게 기술되어 있으며, 이의 전체를 본 명세서에 인용하였다.

본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 조성물들은 예컨대, 단위 용량의 주사에 의해서와 같이, 정맥내적으로 투여될 수 있다. 본 명세서의 치료적 조성물에 대한 참조로 사용될 때 용어 "단위 용량"은 피검자를 위한 단위 투여량으로서 적절한 단위를 물리적으로 분리시킨 것을 말하며, 각 단위는 요구되는 희석액, 즉, 캐리어 또는 비히클과 관련하여 바람직한 치료 효과를 생성시키도록 계산된 활성 물질의 미리결정된 양을 함유하고 있다.

본 발명의 조성물의 투여 모드에는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 동맥내 주사 및 주입이 포함된다. 비경구 주사를 위한 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용되는 멸균 수용액 또는 멸균 비수성용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀전 뿐만 아니라 사용하기 바로 전에 주사가능한 멸균수 또는 분산액내로 재구성되기 위한 멸균 분말이 포함된다. 적합한 수성 및 비수성 캐리어, 희석액, 용매 또는 비히클의 예에는 물, 에탄올, 폴리오이스(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카복시메틸셀룰로오스 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브 오일) 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 포함된다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분무의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 또한 상기 조성물들은 방부제, 습윤제, 유화제 및 분무제와 같은 애주번트를 포함할 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등과 같은 여러 항생제 및 항진균제를 함유시킴으로써 보장될 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 함유시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 약제를 함유시킴으로써 가능하다. 주사가능한 데포(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리코리드, 폴리(오르쏘에스테르) 및 폴리(무수물)과 같은 생분해성 중합체내에 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성시킴으로써 제조된다. 중합체에 대한 약물의 비 및 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출의 비가 제어될 수 있다. 또한 저장소 데포 제형들은 신체 조직과 적합성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼안에 약물을 넣음으로써 제조될 수 있다. 주사가능한 제형물들은 예컨대, 세균-잔류 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용하기 바로 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 매질중에 용해되거나 분무될 수 있는 멸균 고형 조성물의 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다.

본 발명의 치료 조성물들은 상기 조성물내의 구성성분들의 약제학적으로 허용되는 염, 예컨대 무기 또는 유기산으로부터 유도될 수 있는 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은 정상적인 의학적 판단의 범위내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하고 합리적인 장점/위험성 비와 균형을 이루는 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은 본 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 에스. 엠. 버지(S. M. Berge)등의 문헌[참조 : J. Pharmaceutical Sciences (1997) 66:1 et seq.]에는 약제학적으로 허용되는 염들이 상세하게 기술되어 있으며, 이를 본 명세서에 참고로 인용하였다. 약제학적으로 허용되는 염에는 예컨대, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성되는 산 부가염(폴리펩티드의 유리 아미노 기와 함께 형성된)이 포함된다. 또한 유리 카복실 기와 함께 형성된 염은 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 상기 염들은 본 발명의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 동일계내에서 또는 따로 유리 염기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시메탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙신에이트, 타르테이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한 염기성 질소-함유 기들은 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드와 같은 저급 알킬 할로겐화물; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트와 같은 디알킬 설페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드와 같은 장쇄 할로겐화물; 벤질 및 페네틸 브로마이드와 같은 아릴알킬 할로겐화물 등의 약제들로 4급화할 수 있다. 이렇게 하여 수용성, 유용성 또는 분산성 생성물이 수득된다. 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성시키기 위해 사용될 수 있는 산의 예에는 염산, 브롬산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산이 포함된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조성물, 캐리어, 희석액 및 시약을 말할 때 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이들의 문법적인 변형은 번갈아 사용되며 메스꺼움, 현기증, 구토 등과 같은 바람직하지 못한 생리학적 효과를 최소화시키면서 포유류에게 투여할 수 있는 상기 물질들을 나타낸다. 용해되거나 분산되어 있는 활성 성분을 함유하는 약리학적 조성물의 제법은 본 기술분야에서 널리 이해되고 있으며 제형을 근거로 하여 한정될 필요가 없다. 전형적으로 상기 조성물들은 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로서 제조되지만, 사용하기 전에 용액 또는 현탁액에 적합한 액체중의 고형물 형태로 제조될 수도 있다. 또한 제조물을 에멀젼화시킬 수도 있다.

활성 성분은 본 명세서에 기술하고 있는 치료 방법에 사용하기에 적절한 양으로 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼화성인 부형제와 함께 혼합될 수 있다. 예를 들어, 적절한 부형제는 물, 염수, 덱스트로오스, 글리세롤 또는 에탄올 등 및 이들의 조합물을 함유한다. 추가적으로, 원하는 경우, 상기 조성물은 활성 성분의 효과를 향상시키는 습윤제 또는 유화제와 같은 보조 물질, pH 완충제 등을 소량 함유할 수 있다.

또한 본 발명의 항혈관형성 단백질들은 프로드러그(prodrug)를 함유하는 조성물중에 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로드러그"는 생체내에서 빠르게 형질전환되어 예컨대, 혈액중에서 효소적 가수분해에 의해 모(母)화합물을 생성시키는 화합물을 말한다. 완전한 해설이 문헌(참조 : T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the ACS Symposium Series 및 Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Permagon Press, 1987)에 제공되어 있으며, 상기 문헌 둘 모두를 참고로 본 명세서에 인용하였다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 프로드러그"는 (1) 정상적인 의학적 판단의 범위이내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 동물 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하고 적합한 위험성에 대한 장점 비와 균형을 이루고 이들의 의도된 용도를 위해 효과적인 본 발명의 화합물의 프로드러그 및 (2) 가능한 경우, 상기 모화합물의 양쪽성 이온 형태를 말한다.

본 발명의 항혈관형성 단백질의 투여량은 치료되고 있는 질병의 상태나 상황, 인간 또는 동물의 체중 및 상태와 같은 다른 임상적 인자 및 화합물의 투여 경로에 의존할 것이다. 인간 또는 동물을 치료하기 위해, 체중 kg당 약 10 mg 내지 약 20 mg의 단백질을 투여할 수 있다. 치료법들과 병행하여, 예컨대, 본 발명의 단백질들과 방사능치료, 화학요법 또는 면역요법과 함께, 예컨대, 체중 kg당 0.1 mg 내지 약 0.2 mg으로 투여량을 줄일 수 있다.특정 동물 또는 인간에서 항혈관형성 단백질들의 반감기에 따라, 항혈관 단백질을 일주일에 한번씩 하루 당 수차례 투여할 수 있다. 본 발명이 인간과 수의학적 용도 모두를 위해 적용됨이 이해되어야 한다. 본 발명의 방법은 일제히 또는 연장된 기간에 걸쳐, 단독 뿐만 아니라 다중 투여를 고려하였다. 추가적으로, 항혈관형성 단백질들은 다른 형태의 치료법, 예컨대, 화학요법, 방사능치료 또는 면역요법과 함께 투여될 수 있다.

항혈관형성 단백질 제형에는 경구, 직장, 눈(유리체내 또는 전방내를 포함하여), 코, 국소적(협측(頰側) 및 설하를 포함하여), 자궁내, 질 또는 비경구(피하, 복강내, 근육내, 정맥내, 두개내, 기관내 및 경막외) 투여하기에 적합한 제형이 있다. 항혈관형성 단백질 제형은 편리하게는 단위 용량 형태로 제공될 수 있으며 통상적인 약제학적 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술들에는 활성 성분 및 약제학적 캐리어(들) 또는 부형제(들)을 조합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로, 제형은 활성 성분과 액체 캐리어 또는 세밀하게 나누어진 고형 캐리어 또는 둘 모두를 균일하고 직접적으로 조합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형시킴으로써 제조된다.

비경구 투여를 위해 적합한 제형에는 제형이 의도된 피검자의 혈액과 등장이 되도록 하는 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제 및 용매를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 제형은 단위 용량 또는 다중 용량 용기, 예컨대, 밀봉 앰플 및 유리병으로 제공될 수 있으며, 사용하기 바로 전에 멸균 액체 캐리어, 예컨대, 주사용 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기술한 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 단백질의 유효량이 경구적으로 투여될 때, 본 발명의 항혈관형성 단백질들은 정제, 캡슐, 분말, 용액 또는 엘릭서의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여될 때, 본 발명의 약제학적 조성물은 젤라틴 또는 애주번트와 같은 고형 캐리어를 추가로 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 본 발명의 단백질을 약 5 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 90% 함유한다. 액체 형태로 투여될 때, 물, 석유, 땅콩 기름, 미네랄 오일, 콩기름 또는 참기름과 같은 동물 또는 식물에서 유래한 오일 및 합성 오일과 같은 액체 캐리어가 첨가될 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 액체 형태는 생리학적 염수, 덱스트로오스 또는 다른 당용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액체 형태로 투여될 때, 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질을 약 0.5 내지 90 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 50 중량% 함유한다.

본 발명의 단백질의 유효량이 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여될 때, 본 발명의 단백질은 발열물질이 제외된, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등에 대해 적당한 상기 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조는 본 기술분야에 공지되어 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사를 위해 바람직한 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질에 추가적으로 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로오스 주사, 덱스트로오스 및 염화나트륨 주사, 락테이트 링커 주사와 같은 등장 비히클 또는 본 기술분야에 공지되어 있는 다른 비히클을 함유해야 한다. 또한 본 발명의 약제학적 조성물은 안정제, 방부제, 완충액, 산화방지제 또는 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물중의 본 발명의 단백질의 양은 치료중인 질환의 특성 및 심한 정도 및 환자가 받은 이전 치료의 특성에 따를 것이다. 궁극적으로, 주치의는 각 개별 환자를 치료하기 위한 본 발명의 단백질의 양을 결정할 것이다. 처음에, 주치의는 소량의 본 발명의 단백질을 투여하고 환자의 반응을 관찰할 것이다. 환자가 최적의 치료 효과를 나타낼 때까지 본 발명의 단백질의 더 많은 양을 투여할 수 있으며 이 시점에서는 투여량을 추가로 증가시키지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 정맥내 치료 기간은 치료중인 질환의 심한 정도 및 각 개별 환자의 상태 및 잠재적인 특이체질에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 단백질의 각각의 적용의 지속기간은 연속적인 정맥내 투여의 12 내지 24시간의 범위일 것이다. 궁극적으로 주치의는 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 정맥내 치료의 적절한 지속기간을 결정할 것이다.

바람직한 단위 용량 제형은 투여된 성분의 일일용량 또는 유닛, 일일아용량 또는 이들의 적절한 분할량을 함유하고 있다. 상기에 상세히 언급하는 상기 성분에 추가적으로, 본 발명의 제형은 본 제형의 타입을 가진 본 기술분야의 통상적인 다른 약제를 함유할 수 있다. 임의로, 세포독성제가 혼입되거나 아니면 항혈관형성 단백질들 또는 이들의 생물학적으로 기능적인 단백질 단편과 결합되어 환자에게 이중 치료를 제공할 수 있다.

또한 치료 조성물은 현재 수의학적 적용에 유용하다. 특히 인간 뿐만 아니라 가축 및 순혈종 말은 본 발명의 단백질을 사용하는 이러한 치료를 위한 바람직한 환자이다.

리신과 같은 세포독성제는 항혈관형성 단백질 및 이들의 단편에 결합함으로써 항혈관형성 단백질을 결합시키는 세포를 파괴시키기 위한 도구를 제공할 수 있다. 이 세포들은 미소전이 및 일차 종양을 포함하는 많은 위치에서 발견될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 세포독성제에 결합된 단백질은 목적하는 위치로의 운반을 최대화시키기 위해 설계된 방법으로 주입된다. 예를 들어, 리신-결합된 고친화도 단편들은 캐뉼라를 통해 표적 부위를 제공하는 혈관내로 또는 직접적으로 표적내로 운반된다. 또한 상기 약제는 주입 캐뉼라에 연결된 삼투압 펌프를 통해 제어된 방법으로 운반된다. 항혈관형성 단백질에 대한 길항제의 결합은 혈관형성 자극제와 함께 동시적용됨으로써 조직의 혈관신생을 증가시킬 수 있다. 이러한 치료 체제는 전이성 암을 파괴시키는 효과적인 수단을 제공한다.

추가적인 치료 방법에는 세포독성제에 결합된 항혈관형성 단백질, 이들의 단편, 유사체, 항혈청 또는 수용체 촉진제 및 길항제가 포함된다. 항혈관형성 단백질들의 원천은 인간 또는 동물일 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 항혈관형성 단백질은 화학 반응에 의해 또는 발현 시스템과 관련된 재조합 기술에 의해 합성적으로 생성될 수 있다. 또한 항혈관형성 단백질들은 항혈관형성 활성을 가진 단백질을 생성시키기 위해 단리된 타입 IV 콜라겐을 효소적으로 절단시킴으로써 생성될 수 있다. 또한 항혈관형성 단백질은 항혈관형성 단백질에 대해 타입 IV 콜라겐을 절단하는 내생적인 효소의 작용을 모방하는 화합물에 의해 생성될 수도 있다. 또한 항혈관형성 단백질의 생성은 절단 효소의 활성에 영향을 미치는 화합물에 의해 개질될 수도 있다.

또한 본 발명은 유전자 치료법을 포함하며, 여기서 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 또는 이들의 돌연변이체, 단편 또는 융합단백질은 환자에게 도입되어 조절하게 된다. 유전자 산물 단백질을 발현시키기 위해 세포에 DNA를 이동 또는 운반시키는 다양한 방법들, 아니면 유전자 치료법으로써 언급된 방법은 문헌[참조 : Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang (1992) Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356]에 기술되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 인용하였다. 유전자 치료법은 생체외 또는 생체내 치료에 사용하기 위해 체세포 또는 생식세포내로 DNA 서열을 혼입시키는 것을 포함한다. 유전자 치료법은 유전자들을 대체시키고, 정상적이거나 비정상적인 유전자 기능을 증가시키고, 감염성 질환 및 다른 병리에 대항하도록 하는 기능을 한다.

유전자 치료법을 사용하여 이러한 의학적 문제를 치료하기 위한 전략에는 결함 유전자를 동정한 다음 기능적인 유전자를 첨가시켜 결함 유전자의 기능을 대체시키거나 약하게 기능하는 유전자를 증대시키는 것과 같은 치료 전략; 또는 생성 단백질을 위한 유전자의 첨가가 질환을 치료하거나 조직 또는 기관이 치료 체제를 더욱 잘 받아들이도록 하는 예방 전략이 포함된다. 예방 전략의 예로써, 항혈관형성 단백질을 하나 이상 엔코딩하는 유전자를 환자내에 위치시킴으로써 혈관형성의 발생을 방지시키거나; 종양 세포를 방사능에 더욱 민감하도록 만드는 유전자를 삽입시킨 다음 상기 종양을 조사시켜 종양 세포의 사멸을 증가시킨다.

항혈관형성 단백질의 DNA 또는 조절 서열의 이식을 위한 많은 프로토콜들이 본 발명에서 계획되어 있다. 또한 항혈관형성 단백질의 생성을 증가시키는 항혈관형성 단백질과 특이적으로 관련되어 정상적으로 발견된 프로모터 서열 이외의 프로모터 서열 또는 다른 서열들의 트랜스펙션이 유전자 치료법의 방법으로서 계획되어 있다. 이러한 기술의 예는 세포내에서 에리스로포이에틴을 가동시키는 "유전자 스위치"를 삽입시키기 위해 상동성 재조합기술을 사용한 기술(참조 : Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Mass.)에서 발견된다(Genetic Engineering News, Apr. 15, 1994 참조). 상기 "유전자 스위치"는 정상적으로 상기 단백질(또는 수용체)을 발현시키지 않는 세포내에서 항혈관형성 단백질(또는 이들의 수용체)를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다.

유전자 치료를 위한 유전자 이식 방법은 3가지 폭넓은 범주로 나뉜다: 물리적(예컨대, 일렉트로포레이션, 직접적인 유전자 이식법 및 입자 충격법), 화학적(예컨대, 지질계 캐리어 또는 다른 비바이러스성 벡터) 및 생물학적(예컨대, 바이러스-유도된 벡터 및 수용체 업테이크). 예를 들어, DNA로 코팅된 리포좀을 포함하는 비바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 상기 리포좀/DNA 복합체는 환자에게 정맥내로 직접 주사될 수 있다. 리포좀/DNA 복합체는 간에 집중되고 여기서 DNA를 마크로파지 및 쿠퍼세포로 운반시킨다. 추가적으로, 벡터 또는 상기 유전자의 "네이키드(naked)" DNA는 치료적 DNA의 표적화된 운반을 위해 바람직한 기관, 조직 또는 종양내로 직접 주사될 수 있다.

또한 유전자 치료 방법론은 운반 부위에 의해 설명될 수 있다. 유전자를 운반하는 기초적인 방법에는 생체외 유전자 이식법, 생체내 유전자 이식법 및 시험관내 유전자 이식법이 포함된다. 생체외 유전자 이식법에서는, 세포를 환자로부터 취해서 세포 배양액중에 성장시킨다. 상기 DNA를 세포내로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포를 수적으로 부풀린 다음 환자에게 재주입시킨다. 시험관내 유전자 이식법에서는, 형질전환된 세포는 특정 환자로부터의 특정한 세포가 아니라, 조직 배양 세포와 같은 배양액중에 성장중인 세포이다. 이러한 "실험실 세포"를 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포를 선별하고 부풀려서 환자에게 주입시키거나 다른 용도로 사용한다.

생체내 유전자 이식법은 세포가 환자내에 존재할 때 환자의 세포내로 DNA를 도입시키는 것과 관련이 있다. 방법은 비감염성 바이러스를 사용하는 바이러스 매개된 유전자 이식을 사용하여 환자에게 상기 유전자를 운반시키거나 네이키드 DNA를 환자의 부위내로 주사함을 포함하며 상기 DNA는 유전자 생성 단백질이 발현되는 세포의 백분율에 의해 취해진다. 추가적으로, "유전자 총(gene gun)"의 사용과 같은 본 명세서에서 기술하는 다른 방법들을 사용하여 항혈관형성 단백질의 생성을 제어하는 DNA 또는 조절 서열들을 시험관내에서 삽입시킬 수 있다.

유전자 치료의 화학적 방법은 지질을 기재로 하는 화합물(반드시 리포좀은 아님)과 관련되어 있어서 세포막을 통과하여 DNA를 이동시킬 수 있다. 음전하를 띠는 DNA에 결합하는 지질을 기재로 하는 양이온들인 리포펙틴(lipofectin) 또는 사이토펙틴(cytofectin)은 세포막을 통과하여 DNA를 세포의 내부에 제공할 수 있는 복합체를 만든다. 또 다른 화학적 방법은 수용체를 기재로 하는 엔도사이토시스를 이용하며, 이것은 특이적인 리간드를 세포 표면 수용체에 결합시키는 것 및 상기 리간드를 둘러싸서 세포막을 통과하여 이동시키는 것과 관련되어 있다. 상기 리간드는 상기 DNA에 결합하여 전체 복합체를 세포내로 이동시킨다. 상기 리간드 유전자 복합체는 혈류내로 주사된 다음 상기 수용체를 가진 표적 세포는 상기 리간드에 특이적으로 결합하여 상기 리간드-DNA 복합체를 세포내로 이동시킬 것이다.

많은 유전자 치료 방법론들이 세포내로 유전자들을 삽입시키기 위해 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들어, 개질된 레트로바이러스 벡터들은 종양이 침윤중인 림프구, 간세포, 상피세포, 근세포 또는 다른 체세포내 및 이들의 주변으로 유전자들을 도입시키기 위한 생체외 방법에 사용되고 있다. 그런 다음 상기 개질된 세포들은 환자에게 도입되어 삽입된 DNA로부터 유전 산물을 제공하게 된다.

또한 바이러스 벡터들은 생체내 프로토콜을 사용하여 세포내로 유전자를 삽입시키기 위해 사용되고 있다. 외래 유전자의 조직 특이적인 발현을 위해, 조직 특이적이라고 공지되어 있는 시스-액팅(cis-acting) 조절 요소를 사용할 수 있다. 또한, 이것은 생체내 특정 해부학적 부위로 DNA 또는 바이러스 벡터의 동일계내 운반을 사용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 생체내에서의 혈관으로의 유전자 이동은 동맥벽의 선택된 부위에 시험관내에서 형질도입된 내피 세포를 이식함으로써 달성되었다. 바이러스는 상기 유전자 산물을 발현시키는 주위 세포들을 감염시킨다. 바이러스 벡터는 예컨대, 카테터를 통해 생체내 부위로 직접적으로 운반됨으로써 특정 지역만 바이러스에 의해 감염되도록 하여 장기간 부위 특이적인 유전자 발현을 제공할 수 있다. 또한 레트로바이러스 벡터를 사용하는 생체내 유전자 이식은 개질된 바이러스를 혈관내에 주입하여 기관에 이르도록 함으로써 포유류 조직 및 간조직에서 증명되었다.

유전자 치료 프로토콜을 위해 사용되고 있는 바이러스 벡터들에는 레트로바이러스, 폴리오바이러스 또는 신드비스바이르스와 같은 다른 RNA 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, SV 40, 백시니아 및 다른 DNA 바이러스들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 복제 결함 뮤린 레트로바이러스 벡터는 가장 널리 사용되는 유전자 이식 벡터이다. 뮤린 백혈병 레트로바이러스는 핵 코어 단백질 및 중합효소(pol)와 복합체를 이루고 있는 단일 가닥 RNA로 구성되어 있으며, 단백질 코어(gag)에 의해 싸여있고 숙주 범위를 결정짓는 당단백질 엔벨로프(env)에 의해 둘러싸여있다. 레트로바이러스의 지놈 구조에는 5' 및 3' 긴 말단 반복서열(LTR)에 의해 둘러싸인 gag, pol 및 env가 포함된다. 레트로바이러스 벡터 시스템은 5' 및 3' LTR 및 팩키징 신호를 포함하는 최소한의 벡터가 벡터 팩키징, 감염 및 트랜스 방식으로 팩키징 세포주에 공급되는 바이러스 구조단백질을 제공하는 표적 세포내로 통합시키기에 충분하다는 사실을 이용한다. 유전자 이식을 위한 레트로바이러스 벡터의 근본적인 장점에는 대부분의 세포 타입에서의 효율적인 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체 DNA내로의 정교한 단일 복사본 벡터의 통합 및 레트로바이러스 지놈의 조작의 용이성이 포함된다.

아데노바이러스는 코어 단백질과 복합체를 이룬 선형의 이중 가닥 DNA 및 이를 둘러싸고 있는 캡시드 단백질로 구성되어 있다. 분자 바이러스학의 발달로 말미암아 상기 생물체의 생물학을 이용하여 생체내에서 새로운 유전자 서열을 표적 세포내로 형질도입시킬 수 있는 벡터를 제조할 수 있게 되었다. 아데노바이러스를 기본으로 하는 벡터들은 유전자 생성 단백질을 높은 수준으로 발현시킬 것이다. 아데노바이러스 벡터들은 바이러스의 역가는 낮지만 감염성의 효율이 높다. 또한 상기 바이러스는 무세포 비리온으로서 충분히 감염성이기 때문에 생산자 세포주의 주입이 필요치 않다. 아데노바이러스 벡터의 또 다른 잠재적인 장점은 생체내에서 이형 유전자를 장기간 발현시킬 수 있다는 점이다.

DNA를 운반시키는 기계적인 방법에는 리포좀과 같은 푸소제닉(fusogenic) 지질 비히클 또는 막 융합을 위한 다른 비히클, 리포펙틴과 같은 DNA 혼입 양이온 지질의 지질 입자, DNA의 폴리리신-매개된 이식, 생식세포 또는 체세포내로의 DNA의 미세주사와 같은 DNA의 직접적인 주사법, "유전자 총"에 사용되는 금 입자와 같은 DNA 코딩된 입자의 압축공기를 사용한 운반법 및 인산칼슘 트랜스펙션과 같은 무기 화학적 접근법이 포함된다. 입자-매개된 유전자 이식 방법은 식물 조직을 형질전환시키는 데에 최초로 사용되었다. 입자 충격 장치 또는 "유전자 총"에 있어서, 동력을 생성시켜 표적 기관, 조직 또는 세포를 관통할 수 있는 고속으로 DNA-코팅된 고밀도 입자(금 또는 텅스텐과 같은)를 가속시켰다. 입자 충격법은 세포, 조직 또는 기관내로 DNA를 도입시키기 위해 시험관 시스템에서, 또는 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용될 수 있다. 또 다른 방법인 리간드-매개된 유전자 치료법은 특이적인 리간드와 DNA가 복합체를 형성하여 특이적인 세포 또는 조직과 DNA가 직접 리간드-DNA 컨쥬게이트를 형성하는 것과 관련되어 있다.

근육세포내로의 플라스미드 DNA의 주사는 트랜스펙션되어 마커 유전자의 발현을 지속시키는 세포의 백분율을 증가시킴이 밝혀졌다. 플라스미드의 DNA는 세포의 지놈내에 통합되거나 되지 않을 수 있다. 트랜스펙션된 DNA의 비통합은 세포 지놈 또는 미토콘드리아 지놈내의 돌연변이적인 삽입, 결실 또는 변화의 우려없이 연장된 기간 동안 말기에 분화된 비증식성 조직에서의 유전자 생성 단백질의 발현 및 트랜스펙션을 가능하도록 해줄 것이다. 반드시 영구적인 것은 아니지만, 특정 세포내로 치료 유전자의 장기간 이식은 유전자 질환 또는 예방 용도를 위한 치료를 지공할 수 있다. 상기 DNA는 주기적으로 재접종됨으로써 수용세포의 지놈에서 발생하는 돌연변이 없이 유전자 산물의 수준을 유지시킬 수 있다. 외인성 DNA의 비통합은 하나의 세포내의 몇가지 다른 외인성 DNA 제조체와 여러 유전자 산물들을 발현시키는 제조체 모두가 공존하도록 해줄 수 있다.

유전자 이식을 위한 일렉트로포레이션은 전류를 사용하여 세포 또는 조직이 일렉트로포레이션-매개된 유전자 이식에 적합하도록 만든다. DNA 분자들을 세포내로 관통시킬 수 있는 방법으로 막의 투과성을 증가시키기 위해 주어진 장의 세기를 사용하는 짧은 전기적 충격이 사용된다. 이 기술은 세포, 조직 또는 기관내로 DNA를 도입시키기 위해 시험관 시스템에서, 또는 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용될 수 있다.

생체내에서 캐리어 매개된 유전자 이동법은 외래 DNA를 세포내로 트랜스펙션시키기 위해 사용될 수 있다. 캐리어-DNA 복합체를 통상적으로 채액 또는 혈액내로 도입시킨 다음 체내의 표적 기관 또는 조직에 대해 부위특이적으로 처리할 수 있다. 폴리리신, 리포펙틴 또는 사이토펙틴과 같은 리포좀 및 폴리양이온 둘 모두를 사용할 수 있다. 리포좀은 세포 특이적 또는 기관 특이적이 되도록 개발될 수 있어서 리포좀에 의해 운반된 외래 DNA는 표적 세포에 의해 취해질 것이다. 특정 세포상의 특이적인 수용체에 대해 표적화된 면역리포좀의 주사는 상기 수용체를 지닌 세포내로 DNA를 삽입시티는 편리한 방법으로서 사용될 수 있다. 사용되고 있는 또 다른 캐리어 시스템은 생체내 유전자 이식을 위해 간세포에 DNA를 운반시키기 위한 아시알로당단백질/폴리리신 컨쥬게이트 시스템이다.

또한 트랜스펙션된 DNA는 다른 유형의 캐리어와 복합체를 이룬 다음 상기 DNA는 수용세포로 운반됨으로써 세포질 또는 핵질에 존재할 수 있다. DNA는 특별히 유전조작된 비히클 복합체에서 캐리어 핵 단백질과 커플링되어 핵내로 직접 운반될 수 있다.

항혈관형성 단백질의 유전자 조절은 항혈관형성 단백질중 하나를 엔코딩하는 유전자, 상기 유전자와 관련된 제어 영역, 또는 전사 또는 번역의 속도를 변화시키기 위한 이의 상응하는 RNA 전사체에 결합하는 화합물을 투여함으로써 수행될 수 있다. 또한, 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 사용하여 트랜스펙션시킨 세포들은 상기 단백질들의 생체내 공급원을 제공하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포를 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 트랜스펙션시킬 수 있다. 트랜스펙션된 세포들은 환자의 정상 조직, 환자의 질병 조직으로부터 유도된 세포 또는 비환자 세포일 수 있다.

예를 들어, 환자로부터 제거된 종양 세포들은 본 발명의 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터를 사용하여 트랜스펙션되어, 환자에게 재도입될 수 있다. 트랜스펙션된 종양 세포는 환자의 체내에서 종양의 성장을 억제시키는 수준의 단백질을 생성한다. 환자들은 인간 또는 인간 이외의 동물일 수 있다. 또한 세포들은 벡터를 사용하지 않거나 일렉트로포레이션, 이오노포레이션 또는 "유전자 총"을 통한 방법과 같은 본 기술분야에 공지된 물리적 또는 화학적 방법에 의해 트랜스펙션될 수 있다. 또한, 상기 DNA는 캐리어의 도움없이, 환자내로 직접 주사될 수도 있다. 상세하게는, 상기 DNA는 피부, 근육 또는 혈액내로 주사될 수 있다.

환자 체내로 항혈관혈성 단백질을 트랜스펙션시키기 위한 유전자 치료 프로토콜은 세포의 지놈내로, 미니염색체내로 항혈관형성 단백질 DNA를 통합시켜 수행하거나 세포의 세포질 또는 핵질내의 분리된 복제 또는 비복제 DNA 제조체로서 할 수 있다. 항혈관형성 단백질의 발현은 장기간 동안 계속될 수 있거나 주기적으로 재접종되어 세포, 조직 또는 기관 또는 결정된 혈액 수준에서 바람직한 수준의 단백질(들)을 유지시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 항체 및 항혈청을 포함하며, 이것들은 새로운 항혈관형성 단백질을 시험하기 위해 사용될 수 있으며, 항혈관형성 활성 또는 이들의 결여와 관련되거나 이에 의해 특징화되는 질병이나 질환의 진단, 예후(豫後) 또는 치료에 사용될 수도 있다. 또한 상기 항체 및 항혈청은 바람직한 부위, 예컨대, 후경색 심장 조직에서의 혈관형성을 상향조절하기 위해 사용될 수 있고, 본 발명의 단백질에 대한 항체 또는 항혈청은 국부화된 본래의 항혈관형성 단백질 및 과정을 방해하고, 새로운 혈관의 형성을 증가시켜 심장조직의 퇴화를 억제시키기 위해 사용될 수 있다.

상기 항체 및 항혈청은 액제학적으로 허용되는 조성물들과 결합하여 진단적, 예후적 또는 치료적 조성물을 형성할 수 있다. 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 면역글로불린 분자 및/또는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항체 결합 부위 또는 파라토프를 함유하는 분자의 군집을 말한다.

항혈관형성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 수동적 항체 치료법은 생식, 발생 및 상처 치유 및 조직 치료와 같은 혈관형성 의존성 과정을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 항혈관형성 단백질의 항제의 Fab 영역에 직접적인 항혈청을 투여하여 상기 단백질에 결합하는 단백질에 대한 내인성 항혈청의 능력을 방해할 수 있다.

또한 본 발명의 항혈관형성 단백질들은 억제제(들) 및 수용체(들)에 대해 특이적인 항체들을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 항체들은 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항혈관형성 단백질 또는 이들의 수용체에 특이적으로 결합하는 항체들은 체액 또는 조직에서 항혈관형성 단백질 또는 이들의 수용체를 검출하고 정량하기 위해 본 기술분야의 숙련자에게 널리 공지된 진단 방법 및 키트에 사용될 수 있다. 상기 시험으로부터의 결과들은 암 및 다른 혈관형성 매개된 질환들의 발생 또는 재발을 진단하거나 예측하기 위해 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 항혈관형성 단백질, 상기 단백질에 대한 항체 및 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환의 진단 또는 예후에서 상기 단백질 및/또는 이들의 항체를 함유하는 조성물의 용도를 포함한다. 본 명세서에 사용하는 바와 같이, 용어 "예후 방법"은 상기 질환, 상세하게는, 혈관형성 의존성 질환을 가진 것으로 진단된 인간 또는 동물의 질환의 진행에 대한 예측을 가능하도록 해주는 방법을 의미한다. 본 명세서에 사용하는 바와 같은 용어 "진단 방법"은 인간 또는 동물에서 혈관형성 의존성 질환의 존재 및 타입의 결정을 가능하도록 해주는 방법을 의미한다.

상기 항혈관형성 단백질들은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체를 검출하고 정량하기 위한 진단 방법 및 키트에 사용될 수 있다. 상기 키트는 동일계내에서 일차 종양에 의해 분비된 항혈관형성 단백질의 존재하에 미소전이의 분포를 나타내는 항혈관형성 단백질에 대한 순환하는 항체들을 검출할 수 있도록 해줄 것이다. 상기 순환하는 항단백질 항체를 가진 환자들은 다중 종양 및 암이 발생할 가능성이 높을 것 같으며, 치료 또는 완화기간 후에 암이 재발할 수 있는 가능성이 높을 것 같다. 상기 항단백질 항체의 Fab 단편들을 항원으로서 사용하여 항단백질 항체를 중화시키기 위해 사용될 수 있는 항단백질 Fab 단편 항혈청을 생성시킬 수 있다. 이러한 방법은 항단백질 항체에 의해 순환하는 단백질의 제거를 감소시킴으로써 항혈관형성 단백질들의 순환 수준을 효과적으로 상승시킬 것이다.

또한 본 발명은 항혈관형성 단백질에 대해 특이적인 수용체의 단리를 포함한다. 조직에 결합하는 높은 친화도를 가진 단백질 단편들은 친화도 컬럼상에서 항혈관형성 단백질들의 수용체를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 수용체(들)의 단리 및 정제는 항혈관형성 단백질의 작용의 메카니즘을 밝혀내기 위한 근본적인 단계이다. 수용체의 단리 및 촉진체 및 길항제의 동정은 생물학적 활성을 위한 최종 경로인 상기 수용체의 활성을 조절하기 위한 약물의 개발을 촉진시킬 것이다. 수용체의 단리는 누클레오티드 프로브의 제조를 가능하게 함으로써 동일계 및 용액 혼성화 기술을 사용하여 상기 수용체의 위치 및 합성을 모니터링할 수 있도록 한다. 추가로, 상기 수용체에 대한 유전자를 단리시켜, 발현 벡터내에 통합시키고 환자 종양세포와 같은 세포내에 트랜스펙션시켜 항혈관형성 단백질에 결합하는 세포 타입, 조직 또는 종양의 능력을 증가시키고 국부적인 혈관형성을 억제시킬 수 있다.

항혈관형성 단백질들은 배양된 종양 세포로부터의 항혈관형성 단백질에 대한 수용체(들)의 단리를 위한 친화도 컬럼을 개발하기 위해 사용된다. 상기 수용체의 단리 및 정제에 이어서 아미노산 서열분석을 수행한다. 이러한 정보를 사용하여 상기 수용체를 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 동정하고 단리시킬 수 있다. 다음으로, 클로닝된 핵산 서열을 상기 수용체를 발현시킬 수 있는 벡터내로 삽입시키기 위해 개발한다. 이러한 방법들은 본 기술분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 종양 세포내로의 상기 수용체를 코딩하는 핵산 서열(들)의 트랜스펙션 및 트랜스펙션된 종양 세포에 의한 상기 수용체의 발현은 내인성 또는 외인성 항혈관형성 단백질에 대한 상기 세포들의 반응성을 향상시킴으로써 전이성 성장의 속도를 감소시킨다.

본 발명의 혈관형성 억제 단백질들은 표준 미량화학적 설비에서 합성될 수 있으며 순도는 HPLC 및 질량 분광광도법을 사용하여 검사될 수 있다. 단백질 합성의 방법, HPLC 정제 및 질량 분광광도법은 본 기술분야의 숙련자에게 보편적으로 공지되어 있다. 또한 항혈관형성 단백질 및 이들의 수용체 단백질들은 재조합 대장균 또는 효모 발현 시스템에서 생성되어 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제된다.

온전한 항혈관형성 단백질의 다른 단백질 단편들은 특이적인 항혈청의 개발을 위한 항원, 항혈관형성 단백질의 결합 부위에 활성인 촉진제 및 길항제, 항혈관형성 단백질에 결합하는 세포의 표적화된 사멸을 위한 세포독성제에 열결되어 있거나 상기 세포독성제와 함께 사용되는 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 몇가지 적용에 사용하기 위해 합성될 수 있다.

항혈관형성 단백질의 합성 단백질 단편들은 다양한 용도를 가지고 있다. 높은 특이성 및 결합성을 가진 항혈관형성 단백질의 수용체(들)에 결합하는 단백질을 방사능표지시키고 자동방사능사진 및 막결합 기술을 사용하여 결합 부위의 가시화 및 정량을 위해 사용한다. 이러한 응용법은 중요한 진단적 및 연구 도구를 제공한다. 상기 수용체(들)의 결합 특성에 대한 지식은 상기 수용체(들)에 연결된 형질도입 메카니즘의 연구를 촉진시켰다.

항혈관형성 단백질 및 상기 수용체로부터 유도된 단백질은 표준 방법을 사용하여 다른 분자와 커플링될 수 있다. 항혈관형성 단백질의 아미노 및 카복실 말단 둘 모두는 티로신 및 리신 잔기를 포함하고 있고 많은 기술들, 예컨대, 통상적인 기술(티로신 잔기-클로르아민 T, 요오도겐, 락토페록시다제; 리신 잔기-볼튼-헌터 시약)을 사용하는 방사능표지법을 사용하여 동위원소 및 비동위원소로 표지된다. 이러한 커플링 기술은 본 기술분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 또한, 티로신 또는 리신을 상기 잔기들을 가지지 않은 단편들에 첨가함으로써 상기 단백질상에 방사능 아미노 및 하이드록실 기의 표지를 촉진시킨다. 커플링 기술은 아미노, 설프하이드랄, 카복실, 아미드, 페놀 및 이미다졸을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 아미노산상에 이용가능한 기능 기들을 근거로 하여 선택된다. 이러한 커플링을 달성하기 위해 사용된 여러 시약들에는 그 중에서도 글루타르알데히드, 디아조화된 벤지딘, 카보디이미드 및 p-벤조퀴논이 포함된다.

항혈관형성 단백질은 동위원소, 효소, 캐리어 단백질, 세포독성제, 형광성 분자, 화학발광제, 생물발광제 및 여러 적용을 위한 다른 화합물과 화학적으로 커플링된다. 커플링 반응의 효율은 특정 반응에 적합한 다른 기술들을 사용하여 결정된다. 예를 들어,¹²⁵I를 사용한 본 발명의 단백질의 방사능표지는 고특이적 활성의 클로르아민 T 및 Na¹²⁵I를 사용하여 수행된다. 상기 반응은 나트륨 메타바이설피트를 사용하여 종결되며 이 혼합물은 일회용 컬럼상에서 탈염화된다. 표지된 단백질은 컬럼으로부터 용리되고 분획이 수집된다. 분취액은 각 분획으로부터 제거되며 방사능은 감마 계수기중에서 측정된다. 이 방법에서, 반응하지 않은 Na¹²⁵I는 표지된 단백질로부터 분리된다. 가장 높은 특이적인 방사능을 가진 단백질 분핵을 항혈관형성 단백질의 항혈청에 결합하는 능력의 분석과 같은 차후 사용을 위해 보관한다.

추가적으로, 반감기가 짧은 동위원소를 사용하는 항혈관형성 단백질의 표지는 양전자 방출 단층 촬영법 또는 다른 현대 방사능사진 기술을 사용하여 생체내에서 수용체 결합 부위를 가시화시킴으로써 상기 단백질의 결합 부위를 사용하여 종양의 위치를 결정할 수 있다.

상기 합성된 단백질의 범위내에서 아미노산들의 전신적인 치환은 수용체(들)에 대한 결합을 향상시키거나 감소시키는 항혈관형성 단백질들의 수용체(들)에 대한 높은 친화도 단백질 촉진제 및 길항제를 생성시킨다. 상기 촉진제들을 사용하여 미소전이의 성장을 억제시킴으로써 암의 확산을 제한시킨다. 항혈관형성 단백질에 대한 길항제는 불충분한 혈관신생의 상황에 적용됨으로써 항혈관형성 단백질의 억제 효과를 방해하여 혈관형성을 촉진시킨다. 예를 들어, 이러한 치료는 당뇨병에서의 상처 치유를 촉진시키는 치료적 효과를 가질 수 있다.

본 발명은 하기 실시예들에 의해 추가로 예증되며, 실시예들은 이에 의하여 범위를 한정시키는 방식으로 해석됨을 의미하는 것이 아니다. 대조적으로, 본 발명의 의지는 여러 다른 양태, 수정 및 이에 의한 동등물을 가질 수 있으며, 본 명세서의 설명을 읽은 후에는, 본 발명의 사상 및/또는 덧붙인 청구항의 범위로부터 벗어남이 없이 본 기술분야의 숙련자 자신들에게 제안될 수 있음이 명백하게 이해되어야 한다.

실시예 1 : 천연 아레스텐의 단리

아레스텐은 태반 및 양막 조직으로부터 밀리그램 단위의 양으로 생성될 수 있다. 이러한 및 유사한 단백질을 단리해내기 위한 프로토콜은 이미 다른 문헌, 예를 들어 문헌[Langeveld, J.P. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:10481-10488; Saus, J. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13374-13380; Gunwar, S. et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:5466-5469; Gunwar S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15318-15324; Kahsai, T.Z. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:17023-17032]에서 기술되었다. 재조합형 아레스텐의 생성은 문헌[Neilson et al. 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-8406]에 기술되어 있다. 단백질은 또한 예를 들어 문헌[Hohenester, E. et al., 1998, EMBO J. 17:1656-1664]에 기술된 방법에 의해, 293 신장 세포에서도 발현될 수 있다. 아레스텐은 또한 문헌[Pihlajaniemi, T. et al. 1985, J. Biol. Chem. 260:7681-7687]에 기술된 방법에 따라서도 단리될 수 있다.

타입 IV 콜라겐의 NC1 도메인의 α1 사슬의 누클레오티드(SEQ ID NO:1) 및 아미노산(SEQ ID NO:2)은 도 1에 도시되어 있다. 이 도면에는 아레스텐의 대략적인 시작점과 종결점이 표시되어 있다. 아레스텐은 일반적으로 타입 IV 콜라겐의 α1 사슬의 NC1 도메인을 포함하며, 가능하게는 NC1 도메인 바로 앞에 있는 12개의 아미노산인 접합 영역도 포함한다.

천연 아레스텐을 박테리아성 콜라게나아제, 음이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, HPLC 및 친화성 크로마토그래피[참고문헌: Gunwar, S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15318-24; Weber, S. et al., 1984, Eur. J. Biochem. 139:401-10]를 사용하여 인간의 태반으로부터 단리하였다. 인간의 태반으로부터 단리된 타입 IV 콜라겐 단량체를 C-18 소수성 컬럼을 사용하여 HPLC 정제하였다[참고문헌: Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA]. 구성 단백질을 아세토니트릴 구배(32%-39%)로 분배시켰다. 하나의 주피크와 작은 이중 피크가 관찰되었다. SDS-PAGE 분석을 통해 제 1 피크내에 2개의 밴드가 있으며 제 2 피크에 어떠한 관찰 가능한 단백질도 없음을 확인하였다. 면역블로팅을 통해서도 제 2 피크에 면역검출가능한 어떠한 단백질도 관찰되지 않았으며 주피크는 아레스텐인 것으로 확인되었다.

실시예 2 : 대장균내에서의 아레스텐의 재조합 생성

아레스텐을 코딩하는 서열을 정방향 프라이머 5'-CGG GAT CCT TCT GTT GAT CAC GGC TTC-3'(SEQ ID NO:3) 및 역방향 프라이머 5'-CCC AAG CTT TGT TCT TCT CAT ACA GAC-3'(SEQ ID NO:4)를 사용하여 α1 NC1(IV)/pDS 벡터로부터 PCR에 의해 증폭시켰다[참고문헌: Neilson, E.G. et al., 1993, J. Bio. Chem. 268:8402-5]. 생성된 cDNA 단편을 BamHI 및 HindIII로 분해시키고, 미리분해된 pET22b(+)(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 연결시켰다. 이러한 구성은 도 2에 도시되어 있다. 이것은 아레스텐을 pelB 리더 서열의 다운스트림에 프레임적으로 정위시킴으로써, 가용성 단백질을 페리플라즘에 편재화시키고 발현시킨다. 또 다른 벡터 서열을 상기 단백질을 엔코딩하는 아미노산 MDIGINSD (SEQ ID NO:13)에 부가하였다. 서열의 3' 말단을 폴리히스티딘 태그 서열과 프레임내에서 연결시켰다. cDNA의 3' 말단과 his-태그 사이의 추가적인 벡터 서열은 아미노산 KLAAALE (SEQ ID NO:14)를 엔코딩하고 있다. 포지티브 클론을 양 가닥상에서 서열분열하였다.

아레스텐을 코딩하는 플라스미드 구성물을 먼저 대장균 HMS174(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)내로 형질전환시킨 후 발현을 위해 BL21(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)내로 형질전환시켰다. 밤새 배양시킨 박테리아 배양액을 사용하여 LB 배지중의 500ml의 배양액에 접종하였다. 세포의 OD₆₀₀이 0.6에 도달될 때까지 약 4시간 동안 상기 배양액을 성장시켰다. 그런 다음, IPTG를 첨가하여 최종 농도가 1-2mM이 되게 함으로써 단백질을 발현시켰다. 단백질을 2시간 동안 발현시킨 후, 5000×g로 원심분리하여 세포를 얻어내고 6M 구아니딘, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)중에서의 재현탁에 의해 상기 세포를 용해시켰다. 재현탁된 세포를 잠시동안 초음파 처리하고 30분 동안 12,000×g로 원심분리하였다. 상층액 분획을 분당 2ml의 속도로 5ml Ni-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 4회 내지 6회 통과시켰다. 비특이적으로 결합된 단백질은 8M 우레아중의 10mM 및 25mM 이미다졸, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)로 세척하여 제거하였다. 아레스텐 단백질을 8M 우레아중의 이미다졸(50mM, 125mM 및 250mM), 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl (pH 8.0)의 농도를 증가시키면서 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질을 4℃에서 PBS에 대하여 2회 투석시켰다. 전체 단백질중의 소량이 투석 동안에 침전되었다. 투석된 단백질을 수집하고 약 3500×g로 원심분리하여 펠릿과 상층액 분획으로 분리시켰다. 각 분획에서의 단백질 농도는 BCA 검정(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) 및 정량계측용 SDS-PAGE 분석에 의해 결정하였다. 펠릿내의 전체 단백질의 분율은 약 22%였으며, 나머지 78%는 가용성 단백질로서 회수되었다. 단백질의 전체 수율은 약 10mg/ℓ였다.

대장균 발현된 단백질은 주로 가용성 단백질로서 단리되었고, SDS-PAGE는 29kDa에서 단량체 밴드를 나타냈다. 부가적인 3kDa은 폴리링커 및 히스티딘 태그 서열로부터 연유한 것이며, 아레스텐과 6-히스티딘 태그 항체 둘 모두에 의해 면역검출되었다.

실시예 3 : 293 태생신(embryonic kidney) 세포에서의 아레스텐의 발현

리더 신호 서열을 pcDNA 3.1 진핵성 발현 벡터(InVitrogen, San Diego, California, USA)내로 프레임적으로 부가시키는 방식으로, α1(IV) NC1을 함유하는 pDS 플라스미드를 사용하여 아레스텐을 증폭시켰다. 완전한 길이의 α1(IV) 사슬의 5' 말단으로부터의 리더 서열을 NC1 도메인의 5'에 클로닝시켜 배양 배지내로의 단백질 분비를 가능케 하였다. 아레스텐 함유 재조합 벡터를 측면에 위치하고 있는 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 오류가 없는 cDNA 클론을 추가로 정제하고 단백질 발현을 알아보기 위한 시험관내 번역 연구에 사용하였다. 염화칼슘 방법을 사용하여 293 세포를 형질전환시키는데 아레스텐 함유 플라스미드와 대조군 플라스미드를 사용하였다. 형질전환된 클론을 게네티신(geneticin) 항생 처리(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA)에 의해 선별하였다. 어떠한 세포사도 일어나지 않을 때까지 항생물질의 존재하에 상기 세포를 3주 동안 계대배양시켰다. 그런 다음, 클론을 T-225 플라스크내로 퍼뜨리고 컨플루언스(confluence)가 될 때까지 성장시켰다. 그런 다음, 상층액을 수집하고 아미콘 농축기(Amicon)를 사용하여 농축시켰다. 농축된 상층액을 SDS-PAGE, 면역블로팅 및 아레스텐 발현용 ELISA로 분석하였다. 상층액에서의 강한 결합은 ELISA에 의해 검출되었다. SDS-PAGE 분석을 통해 약 30kDa에서 하나의 두드러진 밴드가 나타났음을 확인하였다. 아레스텐 함유 상층액을 아레스텐 특이적 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 처리하였다[참고문헌: Gunwar, S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15318-24]. 아레스텐 항체와 면역반응한 약 30kDa의 단량체를 함유하는 주 피크가 확인되었다. 배양액 1ℓ당 약 1-2mg의 재조합 아레스텐이 생성되었다.

실시예 4 : 내피 세포 증식을 억제하는 아레스텐

C-PAE 세포를 10%의 우태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM에서 성장시켜 컨플루언싱(confluence)시키고 48시간 동안 접촉되지 않게 하였다. 대조군 세포로는 786-0(신장암종) 세포, PC-3 세포, HPEC 세포 및 A-498(신장암종) 세포를 사용하였다. 이들 세포를 37℃에서 5분 동안 트립신(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA)으로 처리하여 수집하였다. 1%의 FCS를 함유하는 DMEM중의 12,500 세포 현탁액을 10㎍/ml 피브로넥틴으로 코팅한 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이들 세포를 5% CO₂및 95% 습도로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 제거하고 0.5% FCS 및 3ng/ml bFGF(R＆D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)를 함유하는 DMEM으로 대체시켰다. 비처리된 대조군은 어떠한 bFGF도 수용하지 않았다. 세포를 0.01 내지 50㎍/ml 범위 농도의 아레스텐 또는 엔도스타틴으로 처리하였다. 모든 웰은 처리시 1μ퀴리의³H-티미딘을 수용케 하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고 이들 웰을 PBS로 세척하였다. 세포를 1N NaOH로 추출해내고 4ml의 신티버스(ScintiVerse) II(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA)를 함유하는 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 첨가하였다. 티미딘 혼입량은 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정하였다. 결과를 가변량의 아레스텐(도 3a)과 엔도스타틴(도 3b)로 처리한 C-PAE 세포내로³H-티미딘이 혼입됨을 보여주는 한쌍의 그래프인 도 3a 및 3b에 도시하였다. 아레스텐은 엔도스타틴과 마찬가지로 C-PAE에의 티미딘 혼입을 억제하는 것으로 보였다. 아레스텐 및 엔도스타틴으로 처리된 대조군 세포의 거동은 도 4a, 4b, 4c 및 4d에 도시되어 있는데, 아레스텐은 786-0 세포(도 4a), PC-3 세포(도 4b) 또는 HPEC 세포(도 4c)에 거의 영향을 미치지 않았다. 엔도스타틴은 A-498 세포(도 4d)에 거의 영향을 미치지 않았다. 도 3 및 4의 모든 그룹은 삼중(triplicate) 샘플을 나타낸다.

실시예 5 : 내피 세포 이동을 억제하는 아레스텐

FBS 유도된 주화성에 대한 아레스텐 및 엔도스타틴의 억제 효과를 알아보기 위해 보이덴(Boyden) 챔버 검정법(Neuro-Probe, Inc., Cabin John, Maryland, USA)을 사용하여 인간의 배꼽 내피 세포(ECV-304 세포, ATCC 1998-CRL, ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, USA)에서 시험하였다. ECV-304 세포를10% FBS와 5ng/㎖의 DiIC18(3) 천연 형광 염색제(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA)가 함유된 M199 배지에서 밤새 성장시켰다. 세포를 트립신으로 처리하고, 세척하고, 0.5% FBS가 함유된 M199 중에 희석시킨 후, 60,000개의 세포를 아레스텐 또는 엔도스타틴(2-40㎍/ml)을 첨가하거나 첨가하지 않으면서 상부 챔버 웰에 시딩(seeding)하였다. 2% FBS가 함유된 M199 배지를 화학주성물질(chemotactant)로서 하부 챔버에 넣었다. 세포 함유 구획을 8㎛ 포어 크기의 폴리카보네이트 필터 (Poretics Corp., Livemore, California, USA)에 의해 화학주성물질와 격리시켰다. 챔버를 5% CO₂및 95% 습도로 37℃에서 4.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 이동되지 않은 세포를 버리고 상부 웰을 PBS로 세척한 후, 필터를 플라스틱 칼날로 긁어내고, PBS 중의 4% 포름알데히드 중에서 고정시키고, 유리 슬라이드 상에 놓았다. 형광성 고성능 필드를 사용하는 경우, 수 개의 독립적인 균일한 이미지가 이미지 프로세싱 소프트웨어(Image Processing Software) PMIS (Roper Scientific/Photometrics, Tucson, Arizona, USA)로 작동되는 디지털 센시스[상표명: SenSys] 카메라에 의해 기록되었다. 대표적인 사진을 도 5a, 5b 및 5c에 도시하였으며, 이들 도면은 2㎍/ml에서 아레스텐이 20㎍/ml에서 엔도스타틴 만큼 효과적임을 보여주고 있다. 세포를 OPTIMIZE 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Rochester, NY)를 사용하여 계수하여 그 결과를 도 6에 도시하였는데, 이 도면에는 현미경 사진으로 보여진 결과가 그래프 형태로 도시된다.

실시예 6 : 내피 튜브 형성을 억제하는 아레스텐

내피 튜브 형성의 억제 효과를 측정하기 위해, 320㎕의 매트리겔 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)을 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 중합반응이 일어나게 하였다[참고문헌: Grant, D.S. et al., 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63]. 항생 물질을 함유하지 않는 EGM-2 배지(Clonetics Corporation, San Diego, California, USA)중에 현탁된 25,000개의 마우스 대동맥 내피 세포(MAE)의 현탁액을 매트리겔로 코팅된 각 웰내로 통과시켰다. 이들 세포를 아레스텐, BSA, 멸균 PBS 또는 7S 도메인 중의 어느 하나의 농도를 증가시키면서 처리하였다. 모든 검정을 삼중으로 수행하였다. 세포를 37℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션시키고 CK2 올림푸스 현미경(3.3 접안렌즈, 10X 대물렌즈)을 사용하여 관찰하였다. 그런 다음, 세포를 400DK 코팅된 TMAX 필름(코닥(Kodak))을 사용하여 사진촬영하였다. 세포를 디프-퀵(diff-quik) 고정제 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 염색시키고, 다시 한번 사진 촬영하였다. 10개의 필드를 관찰하고, 튜브를 계수하고, 평균을 구하였다. 이러한 결과는 도 7에 도시되어 있으며, 이 도면은 아레스텐이 대조군과 비교하여 내피 튜브 형성을 억제함을 보여주고 있다. 대표적인 잘 형성된 내피 튜브는 도 8a에서 관찰할 수 있는데, 이 도면은 7S 도메인으로 처리된 세포(100×배율)를 보여주고 있다. 한편, 도 8b는 0.8㎍/㎖ 아레스텐으로 처리된 MAE 세포에서 불량한 내피 튜브가 형성되거나 내피 튜브가 전혀 형성되지 않음을 보여주고 있다(100×배율).

매트리겔 검정을 또한 C57/BL6 마우스 생체내에서도 수행하였다. 매트리겔을 4℃에서 밤새 용해시켰다. 그런 다음, 이것을 20U/㎖의 헤파린(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA), 150ng/㎖의 bFGF(R＆D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), 및 1㎍/㎖의 아레스텐 또는 10㎍/㎖의 엔도스타틴 중의 어느 하나와 혼합시켰다. 매트리겔 혼합물을 21g 니들을 사용하여 피하로 주입하였다. 대조군은 동일한 혼합물을 수용케 했으나, 혈관형성하여 측정할 수 있는 어떠한 억제제도 수용치 않게 하였다. 14일후, 마우스를 희생시키고 매트리겔 플러그를 제거해냈다. 매트리겔 플러그를 실온에서 4시간 동안 PBS중의 4% 파라포름알데히드중에 고정시킨 후, 24시간 동안 PBS로 전환시켰다. 상기 플러그를 파라핀에 함입시키고, 박편화시키고, H＆E로 착색시켰다. 박편을 광 현미경으로 검사하여 10 고성능 필드로부터 혈관의 수를 계수하고 평균을 구하였다.

매트리겔을, 아레스텐의 농도를 증가시키거나 증가시키지 않으면서 bFGF의 존재하에 있게 하였을 때, 혈관의 수에 있어서 50% 감소가 1㎍/㎖ 아레스텐 및 10㎍/㎖에서 관찰되었다. 이들 결과는 아레스텐이 혈관형성중에 다양한 단계를 억제함으로써 새로운 혈관의 형성에 영향을 미친다는 것을 보여주고 있다. 이들 결과는 또한 1㎍/㎖에서 아레스텐이 생체내에서의 새로운 혈관 형성을 억제하는 10㎍/㎖ 엔도스타틴 만큼 효과적임을 보여주고 있다.

실시예 7 : 생체내에서의 종양 전이를 억제하는 아레스텐

C57/BL6 마우스에게 100만개의 MC38/MUC1을 정맥내로 주입시켰다[참고문헌: Gong, J. et al., 1997, Nat. Med. 3:558-61]. 26일 동안 하루 걸러서, 대조군 마우스에게는 10mM의 멸균 PBS를 주입시키고, 6마리의 실험 마우스에게는 4mg/㎖의 아레스텐을 주입시켰다. 처리 26일 후에, 폐 종양 결절을 각 마우스에 대하여 계수하고, 상기 두 군에 대하여 평균을 구하였다. 각 그룹에서 2마리의 마우스가 희생되었다. 아레스텐은 평균적인 일차 결절수를 대조군 마우스에서 300으로부터 200으로 크게 감소시켰다.

실시예 8 : 생체내에서의 종양 성장을 억제하는 아레스텐

200만개의 786-0 세포를 7주 내지 9주령의 누드 마우스 수컷에게 피하 주사하였다. 6마리의 마우스로 구성된 제 1 그룹에서는, 종양이 약 700mm³이 되게 하였다. 6마리의 마우스로 구성된 제 2 그룹에서는, 종양이 100mm³이 되게 하였다. 멸균 PBS중의 아레스텐을 종양의 부피가 700mm³인 마우스에 대해서는 20mg/kg의 농도로 그리고 종양의 부피가 100mm³인 마우스에 대해서는 10mg/kg의 농도로 10일 동안 매일 복막내 주사하였다. 대조군 마우스에게는 BSA 또는 PBS 비히클중의 어느 하나를 주사하였다. 결과는 도 9a 및 9b에 도시되어 있다. 도 9a는 10mg/kg의 아레스텐 처리된 마우스(□), BSA 처리된 마우스(+) 및 대조군 마우스(●)에 대하여 700mm³에서부터 종양 부피를 증가시키고 있는 그래프를 나타낸다. 아레스텐으로 처리된 마우스에서의 종양 부피는 700mm³에서부터 500mm³로 줄어든 반면, BSA로 처리된 마우스와 대조군 마우스에서의 종양 부피는 10일 경과하였을 때 약 1200mm³로 증가하였다. 도 9b는 100mm³의 종양을 갖는 마우스의 경우, 아레스텐(□)이 종양을 약 80mm³로 축소시킨 반면 BSA로 처리된 마우스의 종양(+)의 크기가 10일 경과하였을 때 거의 500mm³로 증가하였음을 보여주고 있다.

약 500백만의 PC-3 세포(인간의 전립선암종 세포)를 수집하고 7 내지 9주령된 누드 마우스 수컷에게 피하 주사하였다. 종양을 10일 동안 성장시킨 후, 버니어 캘리퍼스로 그 크기를 측정하였다. 표준 공식(폭²×길이×0.52 [참고문헌: O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell 88:277-85; O'Reilly, M/S. et al., 1994, Cell 79:315-28])을 사용하여 종양의 부피를 계산하였다. 동물을 5-6 마리로 구성된 군으로 분할하였다. 실험군에게 아레스텐(10mg/kg/일) 또는 엔도스타틴(10mg/kg/일)을 매일 복막내 주사하였다. 대조군에게는 PBS를 매일 주사하였다. 결과는 도 9c에 도시되어 있으며, 이 도면은 아레스텐(□)이 종양의 성장을 엔도스타틴(▲) 만큼 또는 약간 우수하게 억제시켰음을 보여주고 있다. 이러한 실험을 아레스텐 용량이 4mg/kg/일인 것을 제외하고는 동일하게 반복하였다. 결과는 도 9d에 도시되어 있다. 8일이 경과한 후(도면에서 화살표로 표시된 부분) 이러한 처리를 중단시켰지만, 추가의 아레스텐 처리 없이도 12일 더 현저한 억제가 지속되었다. 어떠한 처리도 하지 않고서 12일이 경과된 후, 종양은 아레스텐의 억제 효과로부터 벗어나기 시작했다.

실시예 9 : 순환하는 아레스텐 반감기

인간의 태반으로부터 단리된 천연 아레스텐을 체중이 200g인 래트에게 정맥내로 주입시켰다. 각각의 래트에게 인간으로부터의 아레스텐을 5mg 주입시켰다. 순환하는 아레스텐의 존재를 알아보기 위해 안티-아레스텐 항체를 사용하여 다양한 시점에서 직접 ELISA에 의해 혈청을 분석하였다. 대조군으로서, 동일량의 혈청이 분석에 사용됨을 보장하기 위해 각 시점에서 혈청 알부민도 평가하였다. 이 실험을 통해 아레스텐은 약 36시간의 반감기로 혈청내에서 순환함이 밝혀졌다.

또 다른 래트 그룹에게는 200㎍의 인간 아레스텐을 복막내 및/또는 피하 주사하고, 폐, 신장, 간, 췌장, 비장, 뇌, 고환, 난소 등에서의 질환 발병기전의 징후에 대하여 평가하였다. 직접 ELISA를 수행시키고, 이들 래트의 혈청에서 아레스텐 항체를 검출하고, 이전에 관찰되었던 바와 같이 일부 내인성 IgG 침착물이 신장 사구체기저막상에서 검출되었다[참고문헌: Kalluri, R, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6201-5]. 신장에서의 항체 침착물은 신장의 염증 또는 신장기능의 악화와 관련된 어떠한 징후도 수반하지 않았다.

실시예 10 : 아레스텐에 의한 MMP-2 효소의 결합 및 억제

MMP-2, MMP-9, 이들 효소들에 대한 항체를 온코진, 인코포레이티드(Oncogene, Inc.)로부터 구입하였다. 이전에 기술된 바와 같은 인간 태반으로부터 단리된 천연 아레스텐을 사용하여 직접 ELISA를 수행하였다[참고문헌: Kalluri, R. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6201-5]. MMP-2 및 MMP-9 둘 모두 아레스텐에 특이적으로 결합되었다. 이들은 7S 도메인에는 결합하지 않았다. 이러한 결합은 TIMP-2 및 TIMP-1 결합에 각각 의존한다.

기저막을 분해시키는 아레스텐의 능력을 평가하기 위해, 매트리겔을 적당하게 흔들어 교반시키면서 37℃에서 6시간 동안 MMP-2 및 MMP-9와 함께 인큐베이션시켰다. 상층액을 SDS-PAGE로 분석하고, 타입 IV 콜라겐의 α2 사슬에 대한 항체로 면역블로팅시켰다. 분해 검정 초기에는, 아레스텐을 농도를 증가시키면서 가하였으며, MMP-2 활성이 억제되었음을 관찰하였다. NC1 도메인을 26kDa의 단량체 및 56kDa의 이합체로서 SDS-PAGE 겔에 용해시켰으며, 이는 타입 IV 콜라겐 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 가시화될 수 있었다. 증가하는 농도의 아레스텐은 MMP-2에 의한 기저막의 분해를 억제하였으며, 이는 아레스텐이 MMP-2에 결합되어 기저막 콜라겐이 분해되지 못하게 할 수 있음을 보여주는 것이다. 유사한 결과가 MMP-9에 대해서도 얻어졌다.

실시예 11 : 대장균내에서의 칸스타틴의 재조합적인 생성

타입 IV 콜라겐의 α2 NC1 도메인에 대한 누클레오티드(SEQ ID NO:5) 및 아미노산(SEQ ID NO:6) 서열은 도 10에 도시되어 있다. 칸스타틴을 코딩하는 서열은 정방향 프라이머 5'-CGG GAT CCT GTC AGC ATC GGC TAC CTC-3'(SEQ ID NO:7) 및 역방향 프라이머 5'-CCC AAG CTT CAG GTT CTT CAT GCA CAC-3'(SEQ ID NO:8)를 사용하여 α2 NC1(IV)/pDS 벡터로부터 PCR에 의해 증폭시켰다[참고문헌: Neilson, E.G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5]. 생성된 cDNA 단편을 BamHI 및 HindIII로 분해시키고 미리 분해시킨 pET22b(+)(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 연결시켰다. 이러한 구성은 도 11에 도시되어 있다. 이것은 칸스타틴을 pelB 리더 서열의 다운스트림에 프레임적으로 정위시킴으로써, 가용성 단백질을 페리플라즘에 편재화시키고 발현시킨다. 또 다른 벡터 서열을 상기 단백질을 엔코딩하는 아미노산 MDIGINSD (SEQ ID NO:13)에 부가하였다. 서열의 3' 말단을 폴리히스티딘 태그 서열과 프레임적으로 연결시켰다. cDNA의 3' 말단과 his-태그 사이의 또 다른 벡터 서열은 아미노산 KLAAALE (SEQ ID NO:14)를 엔코딩하고 있다. 포지티브 클론을 양 가닥상에서 서열분석하였다.

칸스타틴을 코딩하는 플라스미드 구성물을 먼저 대장균 HMS174(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)로 형질전환시킨 후 발현을 위해 BL21(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)로 형질전환시켰다. 밤새 배양시킨 박테리아 배양액을 사용하여 LB 배지중의 500ml의 배양액과 접종시켰다. 세포의 OD₆₀₀이 0.6에 도달될 때까지 약 4시간 동안 상기 배양액을 성장시켰다. 그런 다음, IPTG를 첨가하여 최종 농도가 0.5mM이 되게 함으로써 단백질을 발현시켰다. 단백질을 2시간 동안 발현시킨 후, 5000×g로 원심분리하여 세포를 얻어내고 6M 구아니딘, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)중에서의 재현탁에 의해 상기 세포를 용해시켰다. 재현탁된 세포를 잠시동안 초음파 처리하고 30분 동안 12,000×g로 원심분리하였다. 상층액 분획을 분당 2ml의 속도로 5ml Ni-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 4회 내지 6회 통과시켰다. 비특이적으로 결합된 단백질은 8M 우레아중의 10mM, 25mM 및 50mM 이미다졸, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)으로 세척하여 제거하였다. 칸스타틴 단백질을 8M 우레아중의 이미다졸(125mM 및 250mM), 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl (pH 8.0)의 농도를 증가시키면서 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질을 4℃에서 PBS에 대하여 2회 투석시켰다. 전체 단백질중의 소량이 투석 동안에 침전되었다. 투석된 단백질을 수집하고 약 3,500×g로 원심분리하여 펠릿과 상층액 분획으로 분리시켰다. 각 분획에서의 단백질 농도는 BCA 검정(Pierce Chemical Co. Rockford, Illinois, USA) 및 정량계측용 SDS-PAGE 분석에 의해 결정하였다. SDS-PAGE 분석은 29kDa에서 단량체 밴드를 나타냈고, 부가적인 3kDa은 폴리링커 및 히스티딘 태그 서열로부터 연유한 것이다. 칸스타틴을 함유하는 용리액을 후속적인 검정을 위해 재조합시켜 PBS에 대하여 투석시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석된 칸스타틴 단백질은 폴리-히스티딘 태그 항체에 의해 검출하였다. 또한, 콜라겐 타입 IV NC1 항체로 박테리아 발현된 재조합 칸스타틴 단백질을 검출해냈다.

대장균 발현된 단백질을 가용성 단백질로서 우선적으로 단리시켰다. 펠릿내의 전체 단백질의 분율은 약 40%였으며, 나머지 60%는 가용성 단백질로서 회수되었다. 단백질의 전체 수율은 약 15mg/ℓ였다.

실시예 12 : 293 태생신 세포에서의 칸스타틴의 발현

리더 신호 서열을 pcDNA 3.1 진핵성 발현 벡터(InVitrogen, San Diego, California, USA)내로 프레임적으로 부가하는 방식으로, α2(IV)NC1을 함유하는 pDS 플라스미드[참고문헌: Neilson, E.G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5]를 사용하여 칸스타틴을 PCR 증폭시켰다. 완전한 길이의 α2(IV) 사슬의 5' 말단으로부터의 리더 서열을 NC1 도메인의 5'에 클로닝시켜 배양 배지내로의 단백질 분비를 가능케 하였다. 칸스타틴 함유 재조합 벡터를 측면에 위치하고 있는 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 오류가 없는 cDNA 클론을 추가로 정제하고 단백질 발현을 알아보기 위한 시험관내 번역 연구에 사용하였다. 염화칼슘 방법을 사용하여 293 세포를 형질전환시키는데 칸스타틴 함유 플라스미드와 대조군 플라스미드를 사용하였다[참고문헌: Kingston, R.E., 1996, "Calcium Phosphate Transfection", pp. 9.1.4-9.1.7, in: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., eds., Wiley and sons, Inc. New York, New York, USA]. 형질전환된 클론을 게네티신(geneticin) 항생 처리(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA)에 의해 선택하였다. 어떠한 세포사도 일어나지 않을 때까지 항생물질의 존재하에 상기 세포를 3주 동안 계대배양시켰다. 그런 다음, 클론을 T-225 플라스크내로 퍼뜨리고 컨플루언스가 될 때까지 성장시켰다. 그런 다음, 상층액을 수집하고 아미콘 농축기(Amicon, Inc.)를 사용하여 농축시켰다. 농축된 상층액을 SDS-PAGE, 면역블로팅 및 칸스타틴 발현용 ELISA로 분석하였다. 상층액에서의 강한 결합은 ELISA에 의해 검출되었다. 칸스타틴을 함유하고 있는 상층액을 칸스타틴 특이적 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 처리하였다[참고문헌: Gunwar, S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15318-24]. 칸스타틴 항체(안티-α2 NC1 항체, 1:200으로 희석)와 면역반응한 약 24kDa의 순수 단량체를 함유하는 주 피크가 확인되었다.

실시예 13 : 내피 세포 증식을 억제하는 칸스타틴

송아지 대동맥 내피(CPAE) 세포를 성장시켜 10% 우태아 혈청(FCS)이 함유되어 있는 DMEM에 컨플루언싱시키고 48시간 동안 접촉되지 못하게 하였다. 이들 세포를 37℃에서 5분 동안 트립신(Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA)으로 처리하여 수집하였다. 0.5% FCS가 함유되어 있는 DMEM중에 12,500개의 세포를 현탁시킨 현탁액을 10㎍/㎖ 피브로넥틴으로 코팅된 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO₂및 95% 습도로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 제거해내고, FCS(비자극된) 또는 10% FCS(자극되고 처리된 세포)가 함유되어 있는 DMEM으로 교체하였다. 786-0, PC-3 및 HEK 293 세포를 대조군으로 삼고, 이또한 동일한 방식으로 성장시켜 컨플루언싱시키고, 트립신으로 처리하고 플레이팅시켰다. 세포를 0.025 내지 40mg/㎖ 범위 농도의 칸스타틴 또는 엔도스타틴으로 삼중으로 처리하였다. 티미딘 혼입 실험에서, 모든 웰은 처리시 1μ퀴리의³H-티미딘을 수용케 하였다. 24시간 후, 배지를 제거해내고 웰을 PBS로 3회 세척하였다. 방사성 세포를 1N NaOH로 추출해내고 4ml의 신티버스(ScintiVerse) II(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA)를 함유하는 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 첨가하였다. 티미딘 혼입량은 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정하였다.

결과를 도 12a 및 12b에 도시하였다. 도 12a는 CPAE 세포의 증식에 대한 가변량의 칸스타틴의 효과를 나타내는 막대그래프이다. 분 당 계수한 티미딘 혼입량은 y-축에 도시되어 있다. x-축상의 "0.5%"는 0.5% FCS(비자극된) 대조군을 나타내며, "10%"는 10% FCS(자극된) 대조군을 나타낸다. 칸스타틴의 농도를 증가시키면서 수행한 처리는 티미딘 혼입량을 지속적으로 감소시켰다. 도 12b는 비-내피 세포 786-0, PC-3 및 HEK 293에의 티미딘 혼입량에 대한 칸스타틴의 증가되는 양의 효과를 나타내는 막대 그래프를 나타낸다. 분 당 계수치로 나타내어진 티미딘 혼입량은 y-축에 나타내어져 있으며, x-축은 3개의 세포주 각각에 대하여 0.5% FCS(비자극된) 및 10% FCS(자극된) 대조군을 나타내고 있으며, 이후 칸스타틴의 농도를 증가시킨다. 모든 군은 삼중 샘플이며, 바아(bar)는 분 당 평균 계수 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다.

메틸렌 블루 착색 시험을 또한 수행하였다. 3,100개의 세포를 각 웰에 첨가하고 상기된 바와 같이 처리한 후, 올리버(Oiver) 등의 방법[참고문헌: Oliver, M.H. et al., 1989, J. Cell. Science 92:513-8]을 사용하여 세포의 수를 세었다. 모든 웰을 100㎖의 1X PBS로 1회 세척하고, 실온에서 30분 동안 중성의 완충된 염수(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)중의 10% 포르말린 100㎖를 첨가하여 세포를 고정시켰다. 포르말린을 제거한 후, 세포를 실온에서 30분 동안 0.01M 보레이트 완충액(pH 8.5)중의 1% 메틸렌 블루 용액(Sigma Chemical Co., St. Louis. Missouri, USA)으로 착색시켰다. 착색 용액을 제거한 후, 세포를 0.01M 보레이트 완충액(pH 8.5) 100ml로 5회 세척하였다. 메틸렌 블루를 실온에서 1시간 동안 0.1N HCl/에탄올(1:1 혼합물) 100ml를 사용하여 세포로부터 추출해냈다. 메틸렌 블루에 의해 착색된 양을, 655nm 파장에서의 흡광도를 사용하여 마이크로플레이트 리더(reader)에서 측정하였다.

결과를 도 12c 및 12d에 도시하였다. 도 12c는 CPAE 세포에 의한 착색제의 흡수량에 관하여 칸스타틴의 양을 증가시켰을 때의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. OD₆₅₅에서의 흡광도는 y-축상에 나타내어져 있다. "0.1%"는 0.1% FCS 처리된(비자극된) 대조군을 나타내는 것이며 "10%"는 10% FCS 처리된(자극된) 대조군을 나타내는 것이다. 나머지 바아는 칸스타틴의 농도를 증가시키면서 수행한 처리를 나타낸다. CPAE 세포에서, 착색제 흡수량은 약 0.625-1.25㎍/㎖의 칸스타틴 처리 수준에서 비자극된 세포에서 보여진 수준까지 차츰 떨어졌다. 도 12d는 비-내피 세포 HEK 293 (백색 바아) 및 PC-3(빗금쳐진 바아)에 대하여 칸스타틴의 농도를 변화시켰을 때의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. OD₆₅₅에서의 흡광도는 y-축상에 나타내어져 있다. "0.1%"는 0.1% FCS 처리된(비자극된) 대조군을 나타내는 것이며, "10%"는 10% FCS 처리된(자극된) 대조군을 나타내는 것이다. 바아는 655nm에서의 상대적인 흡광도 단위 ± 처리 농도에 대하여 8개의 웰에 대한 표준 오차를 나타낸다.

10% 혈청 자극된 내피 세포의 용량 의존성 억제는 약 0.5㎍/㎖의 ED₅₀값으로 검출하였다(도 12a 및 12c). 40mg/㎖ 이하의 칸스타틴 용량에서는 신암종 세포(786-0), 전립선암종 세포(PC-3) 또는 인간의 태생신 세포(HEK 293)의 증식에 관하여 어떠한 현저한 효과도 관찰되지 않았다(도 12b 및 12d 참조). 이러한 내피 세포 특이성은 칸스타틴이 특히 효과적인 항혈관형성제일 수 있음을 지시한다.

실시예 14: 내피 세포 이동을 억제시키는 칸스타틴

혈관형성 도중에, 내피 세포는 증식할 뿐만 아니라 이동한다. 따라서, 내피세포 이동에 대한 칸스타틴의 효과를 평가하였다. FBS 유도된 주화성에 대한 칸스타틴과 엔도스타틴의 억제 효과를 보이덴(Boyden) 챔버 검정 (Neuro-Probe, Inc., Cabin John, Maryland, USA)을 이용하여 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)에 대해 시험하였다. HUVEC 세포를 10% FBS와 5ng/㎖의 DiIC18(3) 천연 형광 염색제(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA)가 함유된 M199 (Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA)에서 밤새 성장시켰다. 세포를 트립신처리하고, 세척하고, 0.5% FBS가 함유된 M199 중에 희석시킨 후, 60,000개의 세포를 칸스타틴(0.01 또는 1.00㎎/㎖)을 첨가하거나 첨가하지 않으면서 상부 챔버 웰에 시딩하였다. 2% FBS가 함유된 M199 배지를 화학주성물질로서 하부 챔버에 넣었다. 세포 함유 구획을 8㎛ 포어 크기의 폴리카보네이트 필터 (Poretics Corp., Livemore, California, USA)에 의해 화학주성물질과 격리시켰다. 챔버를 5% CO₂및 95% 습도로 37℃에서 4.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 이동되지 않은 세포를 버리고 상부 웰을 PBS로 세척한 후, 필터를 플라스틱 칼날로 스크랩핑(scrapping)하고, PBS 중의 4% 포름알데히드 중에서 고정시키고, 유리 슬라이드 상에 놓았다. 형광성 고성능 필드를 사용하는 경우, 수 개의 독립적인 균일한 이미지가 이미지 프로세싱 소프트웨어(Image Processing Software) PMIS (Roper Scientific/Photometrics, Tucson, Arizona, USA)로 작동되는 디지털 센시스[상표명: SenSys] 카메라에 의해 기록되었다. 세포를 OPTIMIZE 6.0 소프트웨어-프로그램 (Media Cybernetics, Rochester, NY)(Klemke, R.L. et al., 1994, J. Cell. Biol. 127:859-66)을 사용하여 계수하였다.

결과는 도 13에 도시되어 있으며, 이 도면은 VEGF 없이 (VEGF 또는 혈청 없이) 처리하고 VEGF (1% FCS 및 10ng/㎖ VEGF) 세포를 사용하여 처리한 경우, 및 0.01 칸스타틴 (1% FCS 및 10ng/㎖ VEGF 및 0.01 ㎍/㎖ 칸스타틴) 및 1.0 ㎍/㎖ 칸스타틴 (1% FCS 및 10ng/㎖ VEGF 및 1㎍/㎖ 칸스타틴)으로 처리한 경우에 대한 필드 당 이동된 내피 세포의 개수 (y축)를 나타내는 막대 그래프이다.

칸스타틴은 HUVEC의 이동을 억제시켰으며, 10ng/㎖에서 현저한 효과가 관찰되었다. 내피 세포의 증식 및 이동 둘 모두를 억제시킬 수 있는 칸스타틴의 능력은 이것이 혈관형성 도중에 하나 이상의 단계에서 작용함을 암시한다. 대안적으로, 칸스타틴은 증식 및 이동 둘 모두에 작용할 수 있는 자극된 내피 세포에 대한 세포자멸 신호로서 기능할 수 있다. 세포자멸 유도는 또 다른 혈관형성 억제 분자인 앤지오스타틴(angiostatin)에 대해 보고되어 왔다 [참조: O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28; Lucas, R. et al., 1998, Blood 92:4730-41].

실시예 15: 내피 튜브 형성을 억제시키는 칸스타틴

칸스타틴의 혈관형성 억제력의 첫 번째 시험으로서, 마우스 기저막 단백질의 고형 겔인 매트리겔(matrigel) 중에서 내피 세포에 의한 튜브 형성을 붕괴시킬 수 있는 이것의 능력에 대해 평가하였다. 마우스 대동맥 내피 세포를 매트리겔 상에서 배양시키는 경우, 이들은 신속히 정렬하여 중공 튜브와 같은 구조를 형성하였다.

매트리겔 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)을 24 웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가시키고 (320㎖), 중합시켰다 [참조: Grant, D.S. et al., 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63]. 항생제를 함유하지 않는 EGM-2 (Clonetics Corporation, San Diego, California, USA) 배지 중의 25,000개의 마우스 대동맥 내피 세포 (MAE)의 현탁액을 매트리겔로 코팅된 각각의 웰 내로 옮겨 넣었다. 세포를, 칸스타틴, BSA, 멸균 PBS 또는 α5-NC1 도메인 중의 어느 하나로 농도를 높이면서 처리하였다. 모든 검정을 삼중으로 수행하였다. 세포를 37℃에서 24 내지 48시간 동안 인큐베이션시키고, CK2 올림푸스 현미경(3.3X 접안렌즈, 10X 대물렌즈)을 사용하여 관찰하였다. 그 후, 세포를 400 DK 코팅된 TMAX 필름 (Kodak)을 사용하여 사진 촬영하였다. 세포를 디프-퀵(diff-quik) 고정제 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 염색시키고, 다시 한번 사진 촬영하였다 [참조: Grant, D.S. et al., 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63]. 10개의 필드를 관찰하고, 튜브를 계수하고, 평균을 구하였다.

결과는 도 14에 도시되어 있으며, 이 도면은 BSA(□), 칸스타틴(■) 및 α5NC1(○)의 상이한 처리하에서 튜브 형성의 양을 대조(PBS 처리된 웰) 튜브 형성의 퍼센트 (y축)로서 나타낸 그래프이다. 수직 바아는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 결과는 칸스타틴이 대조표준에 비해 내피 튜브 형성을 현저하게 감소시킴을 나타낸다.

칸스타틴은 내피 튜브 형성을 용량 의존적 방식으로 억제시켰으며, 1g의 칸스타틴 단백질을 첨가한 경우 거의 완전한 억제가 관찰되었다 (도 14). 대조 단백질, 우혈청 알부민 (BSA) 뿐만 아니라 타입 IV 콜라겐 α5 사슬의 NC1 도메인도 내피 튜브 형성에 작용하지 않았으며, 이는 이러한 검정에서의 칸스타틴의 억제 효과가 첨가된 단백질 함량에 기인하는 것이 아니라 칸스타틴에 대해 특이적인 것임을 입증한다.

실시예 16: 생체내에서 종양 성장을 억제시키는 칸스타틴

인간 전립선암 세포 (PC-3 세포)를 배양액으로부터 수집하고, 멸균 PBS 중의 2백만개의 세포를 7주 내지 9주령의 수컷 SCID 마우스에게 피하 주사하였다. 종양을 약 4주간 성장시킨 후, 동물을 네 마리씩 군별로 분류하였다. 실험군에게 전체 부피 0.1㎖의 PBS 중의 10㎎/㎏ 용량의 칸스타틴을 매일 복막내 주사하였다. 대조군에게는 동일한 부피의 PBS를 매일 주사하였다. 처리를 개시했을 때 (0일째), 종양은 대조 마우스의 경우에 부피가 88㎣ 내지 135㎣ 였고, 칸스타틴 처리된 마우스의 경우에는 108㎣ 내지 149㎣ 였다. 각각의 군은 5마리의 마우스를 포함하였다. 특정일에서의 계산된 종양 부피를 0일째 처리시의 부피로 나누어서, 종양 부피 분율 (V/V_O)을 산출하였다. 결과는 도 15a에 도시되어 있으며, 이 도면은 처리일(x축)에 대해 작도된 종양 부피 분율(y축)±표준 오차를 도시하는 그래프이다. 칸스타틴 처리된(■) 종양은 대조표준(□)에 비해 크기가 극미하게 증가할 뿐이었다.

두 번째 PC-3 실험에 있어서, PC-3 세포를 배양액으로부터 수집하고, 3백만개의 세포를 6주 내지 7주령의 무흉선 누드 마우스에게 주입시키고, 종양을 약 2주간 피하적으로 성장시킨 후, 동물을 4마리씩 군별로 분류하였다. 실험군(4마리)에게 전체 부피 0.2㎖의 PBS 중의 3㎎/㎏ 용량의 칸스타틴 또는 동일한 부피의 PBS 중의 8㎎/㎏ 용량의 엔도스타틴을 매일 복막내 주사하였다. 대조군(4마리)에게는 동일한 부피의 PBS를 매일 주사하였다. 종양 길이 및 폭을 버니어 캘리퍼스를 사용하여 측정하고, 다음과 같은 표준식을 이용하여 계산하였다: 길이 x 폭²x 0.52. 종양 부피는 26㎣ 내지 73㎣ 였고, 특정일에서의 계산된 종양 부피를 0일째 처리시의 부피로 나누어서 상기 기술된 바와 같이 종양 부피 분율 (V/V_O)을 산출하였다. 결과는 도 15b에 도시되어 있으며, 이 도면은 처리일(x축)에 대해 작도된 종양 부피 분율(y축)±표준 오차를 나타내는 그래프이다. 대조표준(□)과 비교하여, 칸스타틴 처리된 (■) 종양은 크기가 극미하게 증가할 뿐이었고, 결과는 엔도스타틴(○)을 사용하여 수득한 결과에 필적하였다.

신장 세포암 세포 모델의 경우, 2백만개의 786-0 세포를 7주 내지 9주령의 수컷 무흉선 누드 마우스에게 피하 주사하였다. 종양을 약 100㎣ 내지 약 700㎣으로 성장시켰다. 각각의 군은 6마리의 마우스를 포함하였다. 멸균 PBS 중의 칸스타틴을 10일간 10㎎/㎏의 농도로 매일 복막내 주사하였다. 대조군에게는 동일한 부피의 PBS를 주사하였다. 결과는 도 15c(100㎣ 종양) 및 31d(700㎣ 종양)에 도시되어 있다. 두 군 모두의 경우, 칸스타틴 처리된 (■) 종양은 대조표준(□)에 비해 실제로 작아졌다.

대장균에서 생성된 칸스타틴은 작은(100㎣, 도 15c) 신장 세포암(786-0) 종양 및 큰(700㎣, 도 15d) 신장 세포암(786-0) 종양의 성장을 억제시켰다. 중증복합면역결핍병(SCID)에 걸린 마우스 내의 인간 전립선(PC-3) 종양의 경우, 10㎎/㎏의 칸스타틴은 비히클만 주사한 마우스의 55%까지의 종양 부피 분율을 유지시켰다. 무흉선 (nu/nu) 마우스의 경우, 칸스타틴과 엔도스타틴 둘 모두의 낮은 용량을 사용하였고, 3㎎/㎏의 칸스타틴은 8㎎/㎏의 엔도스타틴과 동일한 억제 효과를 나타냈다. 모든 생체내 실험에 있어서, 마우스는 소모성 징후를 나타냄이 없이 건강한 것으로 여겨졌고, 처리 도중에 한 마리도 죽지 않았다.

실시예 17: 칸스타틴 처리된 마우스에 대한 CD31 면역조직화학

생체내에서의 종양 크기의 감소는 이들 종양에서의 혈관 형성에 대한 억제 효과를 암시하였다. 종양 혈관을 검출하기 위해, 안티-CD31 항체 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이션된 면역세포화학을 파라핀 포매된 종양 절편상에서 수행하였다. 분리된 종양을 스카펠(scapel)로 약 3 내지 4mm 두께의 다수의 조각으로 절개한 후, 4% 파라포름알데히드 중에서 24시간 동안 고정시켰다. 그 후, 조직을 24시간 동안 PBS로 스위칭시킨 후, 탈수시키고 파라핀 포매시켰다. 파라핀에 포매시킨 후, 3mm 조직 절편을 잘라내고 마운팅하였다. 절편을 파라핀 제거하고, 재수화시키고, 300㎎/㎏의 프로테아제 XXIV (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 37℃에서 5분간 전처리하였다. 분해를 100% 에탄올 중에서 정지시켰다. 절편을 공기 건조시키고, 재수화시키고, 10% 토끼 혈청으로 블록킹시켰다. 그 후, 슬라이드를 토끼 안티-마우스 CD31 모노클로날 항체 (PharMingen, San Diego, California, USA)의 1:50 희석액과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 각각 토끼 안티-래트 면역글로불린 (DAKO) 및 래트 APAAP (DAKO)의 1:50 희석액으로 37℃에서 30분간 2회 연속 인큐베이션시켰다. 발색 반응을 새로운 푹신(fuchsin)을 사용하여 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대비염색시켰다.

혈관 개수의 감소가 대조 종양과 비교하여 칸스타틴 처리된 종양에서 나타났다.

실시예 18: 대장균에서의 툼스타틴 및 툼스타틴 변이체의 재조합적 생성

타입 IV 콜라겐의 NC1 도메인의 α3 사슬에 대한 누클레오티드(SEQ ID NO:9) 및 아미노산(SEQ ID NO:10) 서열은 도 16에 도시되어 있다. 툼스타틴을 암호화하는 서열을 정방향 프라이머 5'-CGG GAT CCG GGT TTG AAA GGA AAA CGT-3' (SEQ ID NO:11)과 역방향 프라이머 5'-CCC AAG CTT TCA GTG TCT TTT CTT CAT-3' (SEQ ID NO;12)을 사용하여 α3 NCI(IV)/pDS 벡터 (Neilson, E.G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:8402-5)로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 cDNA 단편을 BamHI과 HindIII로 분해시키고, 미리 분해시킨 pET22b(+) (Novagen, Madison, Wisconsin, USA)로 연결시켰다. 구성물은 도 17에 도시되어 있다. 연결은 툼스타틴을 pelB 리더 서열의 다운스트림에 프레임적으로 정위시킴으로써, 가용성 단백질을 페리플라즘에 편재화시키고 발현시킨다. 추가의 벡터 서열을 단백질 암호화 아미노산 MDIGINSD (SEQ ID NO:13)에 첨가시켰다. 서열의 3' 말단을 폴리-히스티딘-태그 서열과 프레임적으로 연결시켰다. cDNA의 3' 말단과 his-태그 사이의 추가의 벡터 서열은 아미노산 KLAAALE (SEQ ID NO:14)를 엔코딩하고 있다. 포지티브 클론을 양 가닥 상에서 서열분석하였다. 먼저 툼스타틴을 암호화하는 플라스미드 구성물을 대장균 HMS174 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 내로 형질전환시킨 후, BL21 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 내로 형질전환시켜서 발현시켰다. 밤새 배양한 박테리아 배양액을 사용하여 LB 배지 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) 중의 500㎖ 배양액에 접종시켰다. 이러한 배양액을 세포의 OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때까지 약 4시간 동안 성장시켰다. 그 후, IPTG를 최종 농도가 1mM가 되도록 첨가시킴으로써 단백질 발현을 유도시켰다. 2시간 유도 후, 5,000 x g에서 원심분리시킴으로써 세포를 수집하고, 6M 구아니딘, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0 중에 재현탁시킴으로써 용해시켰다. 재현탁된 세포를 간단하게 초음파처리하고, 12,000 x g에서 30분간 원심분리시켰다. 상층액 분획을 1분 당 2㎖의 속도로 4회 내지 6회 5㎖ Ni-NTA 아가로오스 컬럼 (Qiagen, Hilden, Germany)으로 이동시켰다. 8M 우레아, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0 중의 10mM와 25mM 이미다졸 둘 모두를 사용하여 세척함으로써 특이적이지 않게 결합된 단백질을 제거하였다. 툼스타틴 단백질을 8M 우레아, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0 중의 이미다졸의 농도를 높이면서 (50mM, 125mM 및 250mM) 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질을 4℃에서 PBS에 대해 2회 투석시켰다. 전체 단백질의 일부가 투석 도중에 침전되었다. 투석된 단백질을 모아서, 약 3,500 x g로 원심분리시키고, 불용성(펠릿) 및 가용성(상층액) 분획으로 분리시켰다.

대장균 발현된 툼스타틴을 주로 가용성 단백질로서 단리시켰고, SDS-PAGE 분석한 결과, 31kDa에서 단량체 밴드가 나타났다. 추가의 3kDa가 폴리링커 및 히스티딘 태그 서열로부터 나타났다. 이러한 밴드를 함유하는 용리된 분획을 후속 실험에 사용하였다. 각각의 분획 중의 단백질 농도를 BCA 검정 (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) 및 스캐닝 밀도계측을 이용하는 정량적 SDS-PAGE 분석에 의해 측정하였다. 환원 조건 하에서, 밴드는 약 60kDa에서 관찰되며, 이는 31kDa의 단일 밴드로서 분석되는 비환원 조건에서 툼스타틴의 이량체를 나타낸다. 단백질의 전체 수율은 1리터 당 약 5㎎ 이었다.

53개의 N 말단 아미노산이 결여된 트렁케이션(truncation)된 재조합 툼스타틴 (툼스타틴-N53)을 대장균에서 생성시키고, 또 다른 변이체에 대해 이미 공지된 바와 같이 (Kalluri, R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8) 정제시켰다. 이러한 변이체는 도 18에 도시되어 있으며, 이 도면은 α3(IV) NC1 단량체 내의 트렁케이션된 아미노산의 위치를 나타내는 복합 다이어그램이다. 흑색 원은 툼스타틴-N53'을 생성시키도록 툼스타틴으로부터 결실된 N 말단의 53개 아미노산 잔기에 상응한다 (참조: Kalluri, R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8). 짧은 막대에 의해 표시된 이황화물 결합은 이들이 α1(IV)NC1과 α2(IV)NC1에서 나타나는 바와 같이 배열된다 (참조: Siebold, B. et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176:617-24). 정확한 이해를 위해, 두 개의 가능한 이황화물 배열 중의 하나만을 나타내었다.

인간 α3(IV)NC1에 대해 유도시킨 토끼 항체를 이미 공지된 바와 같이 (Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8) 제조하였다. 모노클로날 래트 안티-마우스 CD31 (혈소판 내피 세포 부착 분자, PECAM-1) 항체를 파민겐社(PharMingen, San Diego, California, USA)로부터 구입하였다. FITC 컨쥬게이션된 염소 안티-토끼 IgG 항체, 및 양고추냉이 과산화효소에 컨쥬게이션된 염소 안티 토끼 IgG 항체를 시그마社(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로부터 구입하였다.

상기와 같이 수득되는 농축된 상층액을 이미 공지된 바와 같이 툼스타틴 발현에 대해 SDS-PAGE 및 면역블로팅에 의해 분석하였다 (Kalluri, R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8). 1차원 SDS-PAGE를 12% 분석용 겔과 불연속 완충 시스템을 사용하여 수행하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 2% BSA로 실온에서 30분간 블록킹시켰다. 나머지 결합 부위를 블록킹시킨 후, 막을 세척 완충액으로 철저하게 세척하고, 1% BSA가 함유된 PBS 중에서 1:1000의 희석율로 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션을 진탕기로 실온에서 밤새 수행하였다. 그 후, 블롯을 세척 완충액으로 철저하게 세척하고, 진탕기로 실온에서 3시간 동안 양고추냉이 과산화효소에 컨쥬게이션된 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 블롯을 다시 한번 철저하게 세척하고, 기질 (0.01% 염화 코발트와 니켈 암모늄이 함유된 0.05M 포스페이트 완충액 중의 디아미노벤지딘)을 첨가하고, 실온에서 10분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 기질 용액을 따라내고, 과산화 수소가 함유된 기질 완충액을 첨가하였다. 밴드를 현상시킨 후, 반응을 증류수로 정지시키고, 블롯을 건조시켰다. 31kDa의 단일 밴드가 나타났다.

실시예 19: 293 배 신장 세포에서의 툼스타틴의 발현

인간 툼스타틴을, pcDNA 3.1 진핵생물 벡터를 사용하여 293 배 신장 세포에서 분비된 가용성 단백질로서 또한 생성시켰다. 이러한 재조합 단백질 (임의의 정제 또는 검출 태그가 없는)을 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단리시키고, 순수한 단량체 형태를 SDS-PAGE 및 면역블롯 분석에 의해 주요 밴드로 검출하였다.

리더 신호 서열이 pcDNA 3.1 진핵생물 발현 벡터 (InVitrogen, San Diego, California, USA) 내로 프레임적으로 첨가되도록 하는 방식으로, α3(IV)NCI를 함유하는 pDS 플라스미드 (Neilson, E.G. et al., 1993, J.Biol. Chem. 268:8402-5)를 사용하여 툼스타틴을 PCR 증폭시켰다. 완전한 길이의 α3(IV) 사슬의 5' 말단으로부터의 리더 서열을 NC1 도메인의 5'에 클로닝시켜서 단백질이 배지내로 분비될 수 있도록 하였다. 툼스타틴 함유 재조합 벡터를 플랭킹 프라이머를 사용하여 양 가닥 상에서 서열화시켰다. 오류가 없는 cDNA 클론을 추가로 정제시키고, 시험관내 번역 실험에 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. 툼스타틴 함유 플라스미드 및 대조 플라스미드를 사용하여, 염화 칼슘 방법을 이용하여 293 세포를 트랜스펙션시켰다 [참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, pps. 16.32-16.40]. 트랜스펙션된 클론을 제네티신 (Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) 항생제 처리에 의해 선별하였다. 세포를, 세포 치사가 분명히 나타나지 않을 때까지 항생제의 존재하에서 3주간 패싱(passing)시켰다. 클론을 T-225 플라스크 내로 퍼뜨리고, 컨플루언스(confluence)가 될 때까지 성장시켰다. 그 후, 상층액을 수집하고, 아미콘 농축기 (Amicon, Inc., Beverly, Massachusetts, USA)를 사용하여 농축시켰다. 농축된 상층액을 SDS-PAGE, 면역블로팅 및 ELISA에 의해 툼스타틴 발현에 대해 분석하였다. 상층액에서의 강력한 결합이 ELISA에 의해 검출되었다.

툼스타틴 함유 상층액을 친화성 크로마토그래피시키고, 안티-툼스타틴과 안티-6-히스티틴 태그 항체 (Gunwar, S. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15318-24) 둘 모두로 면역검출하였다. 주요 피크가 확인되었고, 이는 툼스타틴 항체와 면역반응성인 약 31kDa의 단량체를 함유하였다.

실시예 20: 내피 세포 증식을 억제시키는 툼스타틴

C-PAE 세포에 대한 툼스타틴의 증식억제 효과를 대장균 생성된 가용성 단백질을 사용하는³H-티미딘 혼입 검정에 의해 조사하였다.

세포계 및 배양액. 786-0 (신장 청소 세포암 계), PC-3 (인간 전립선암 세포계), C-PAE (소 폐동맥 내피 세포계), MAE (마우스 대동맥 내피 세포계)를 모두 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 입수하였다. 786-0 및 C-PAE 세포계는 DMEM (Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) 중에 유지시키고, ECV-304 세포계는 M199 중에 유지시키고, MAE 세포는 10% 우태아 혈청 (FCS), 100 단위/㎖의 페니실린 및 100㎎/㎖의 스트렙토마이신이 함유된 EGM-2 (Clonetics Corporation, San Diego, California, USA) 중에 유지시켰다.

증식 검정. C-PAE 세포를 10% FCS가 함유된 DMEM 중에서 컨플루언스가 될 때까지 성장시키고, 48시간 동안 접촉 억제시켰다. C-PAE 세포를 2차 및 4차 계대 사이에서 사용하였다. 786-0 및 PC-3 세포를 이 실험에서 내피성이 아닌 대조표준으로서 사용하였다. 세포를 37℃에서 5분간 트립신처리 (Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA)함으로써 수집하였다. 0.1% FCS가 함유된 DMEM 중의 12,500개 세포의 현탁액을 10㎍/㎖ 피브로넥틴으로 코팅된 24웰 플레이트의 각각 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO₂및 95% 습도로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 20% FCS가 함유된 DMEM으로 교환하였다. 자극되지 않은 대조 세포를 0.1% FCS와 인큐베이션시켰다. 세포를 0.01 내지 10㎎/㎖ 범위의 다양한 농도의 툼스타틴으로 처리하였다. 처리를 개시한 지 12시간 째에 모든 웰에 1mCi의³H-티미딘을 공급하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 웰을 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 1N NaOH로 추출하고, 신티버스(ScintiVerse) II (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) 용액 4㎖가 함유된 신틸레이션 바이알에 첨가하였다. 티미딘 혼입을 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정하였다.

결과는 도 19a, 19b 및 19c에 도시되어 있으며, 이 도면은 다양한 농도의 툼스타틴 (x축)으로 처리한 경우의 C-PAE 세포 (도 19a), PC-3 세포 (도 19b) 및 786-0 세포 (도 19c)에 대한³H-히스티딘 혼입 (y축)을 나타내는 히스토그램이다. 모든 군은 삼중 샘플을 나타낸다. 툼스타틴은 20% FCS 자극된³H-티미딘 혼입을 용량 의존성 방식으로 현저하게 억제시켰으며, ED₅₀이 약 0.01㎎/㎖ 였다 (도 19a). 또한, 전립선 암세포 (PC-3) 또는 신장 암세포 (786-0)의 경우 20㎎/㎖ 이하의 툼스타틴 용량에서도 현저한 증식 억제 효과가 관찰되지 않았다 (도 19b 및 19c). 툼스타틴 처리된 (0.1-10㎎/㎖) 군 및 대조표준에서의³H-티미딘 혼입의 평균값 사이의 차는 현저하였다 (P＜0.05). PC-3 세포 또는 786-0 세포를 툼스타틴으로 처리한 경우, 억제 효과는 관찰되지 않았다 (도 19b, 19c). 각각의 컬럼은 삼중 웰의 평균±SE를 나타낸다. 이 실험을 3회 반복하였다. 별표로 표시된 막대가 중요하며, 단측 스투던트 검정에 의한 경우에 P＜0.05 였다.

실시예 21: 내피 튜브 형성을 억제시키는 툼스타틴

매트리겔 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)를 24웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가시키고 (320㎖), 중합시켰다 [참조: Grant, D.S. et al., 1994, Pathiol. Res. Pract. 190:854-63]. 항생제를 함유하지 않는 EGM-2 배지 (Clonetics Corporation, San Diego, California, USA) 중의 25,000개 MAE 세포의 현탁액을 매트리겔 코팅된 각각의 웰 내로 전달하였다 [참조: Grant, D.S. et al., 1994, Pathiol. Res. Pract. 190:854-63]. 세포를 툼스타틴, BSA 또는 7S 도메인으로 농도를 높이면서 처리하였다. 대조 세포를 멸균 PBS와 인큐베이션시켰다. 모든 검정을 삼중으로 수행하였다. 세포를 37℃에서 24 내지 48시간 동안 인큐베이션시키고, CK2 올림푸스 현미경 (3.3x 접안렌즈, 10x 대물렌즈의 배율)을 사용하여 관찰하였다. 그 후, 세포를 400 DK 코팅된 TMAX 필름 (Kodak)을 사용하여 사진 촬영하였다. 세포를 디프-퀵 고정제 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)로 염색시키고, 다시 한번 사진 촬영하였다 [참조: Grant, D.S. et al., 1994, Pathol. Res. Pract. 190:854-63]. 10개의 필드가 관찰되었고, 튜브의 개수는 실험 프로토콜을 모르는 2명의 연구자가 계수하였고, 평균을 구하였다.

결과는 도 20에 도시되어 있다. 마우스 대동맥 내피 세포가 매트리겔 (마우스 기저막 단백질의 고형 겔) 상에서 배양되는 경우, 이들은 신속하게 정렬하여 중공 튜브 모양의 구조를 형성한다 [참조: Haralabopoulos, G.C. et al., 1994, Lab. Invest. 71:575-82]. 293세포에서 생성된 툼스타틴는 BSA 대조표준과 비교하여 용량 의존성 방식으로 MAE 세포에서의 내피 튜브 형성을 현저하게 억제시켰다 (도 20). 1㎎/㎖의 단백질로 처리한 후의 튜브 형성의 퍼센트는 BSA의 경우는 98.0±4.0 이었고, 툼스타틴의 경우는 14.0±4.0 이었다. 대장균에서 생성된 툼스타틴을 사용하는 경우에 유사한 결과가 또한 얻어졌다. 타입 IV 콜라겐의 7S 도메인 (N-말단 비콜라겐성 도메인)은 내피 튜브 형성에 대한 효과를 나타내지 않았다. 툼스타틴에 의한 최대 억제는 800 내지 1000ng/㎖에서 수득되었다. 툼스타틴 처리된 (●, 0.1-10㎎/㎖) 군 및 대조표준 (BSA(□), 7S 도메인(○))의 평균 퍼센트 값 사이의 차는 현저하였다 (P＜0.05). 각각의 지점은 삼중 웰의 평균±SE를 나타낸다. 이 실험을 3회 반복하였다. 별표로 표시된 데이터 지점이 중요하며, 단측 스투던트 검정에 의한 경우 P＜0.05 였다. 형태가 잘 갖추어진 튜브는 7S 도메인 처리의 경우에 관찰되었다. 0.8㎎/㎖ 툼스타틴으로 처리된 MAE 세포는 감소된 튜브 형성을 나타내었다.

새로운 모세관의 형성에 대한 툼스타틴의 생체내 효과를 평가하기 위해, 매트리겔 플러그 검정을 수행하였다 [참조: Passaniti, A. et al., 1992, Lab Invest. 67:519-29]. 5주 내지 6주령의 수컷 C57/BL6 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA)를 구입하였다. 매트리겔 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA)을 4℃에서 밤새 해동시켰다. C57/BL6 마우스 내로 주입시키기 전에, 이것을 20 U/㎖의 헤파린 (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA), 150 ng/㎖의 bFGF (R＆D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) 및 1㎎/㎖의 툼스타틴과 혼합시켰다. 대조군에게는 혈관형성 억제제를 주입시키지 않았다. 매트리겔 혼합물을 21 게이지 니들을 사용하여 피하 주사하였다. 14일 후, 마우스를 희생시키고, 매트리겔 플러그를 분리하였다. 매트리겔 플러그를 4% 파라-포름알데히드 (PBS 중의) 중에 실온에서 4시간 동안 고정시킨 후, 24시간 동안 PBS로 스위칭시켰다. 플러그를 파라핀에 포매시키고, 절개하고, H ＆ E 염색시켰다. 절편을 광학 현미경으로 조사하고, 10개의 고성능 필드로부터의 혈관의 개수를 계수하고, 평균을 구하였다. 모든 절편을 코딩시키고, 실험 프로토콜을 모르는 병리학자가 관찰하게 하였다.

매트리겔이 bFGF 및 헤파린이 존재하고 대장균 생성된 툼스타틴이 있거나 없는 환경하에 정위되는 경우, 혈관 개수의 67% 감소가 1㎎/㎖의 툼스타틴의 처리에 의해 관찰되었다. 고성능 필드 당 혈관의 개수는 툼스타틴의 경우 2.25±1.32 이고, 대조표준의 경우 7.50±2.17 이었다. 각각의 컬럼은 군 당 5 내지 6마리 마우스의 평균±SE를 나타낸다. 툼스타틴(1㎎/㎖)은 PBS로 처리된 대조표준과 비교하여 생체내 혈관신생을 현저하게 억제시켰다. 툼스타틴 처리된 동물과 대조 동물의 평균 퍼센트 값 사이의 차는 유의할 정도였다 (P＜0.05). 툼스타틴 처리는 유의할 정도였고, 단측 스투던트 검정에 의한 경우에 P＜0.05 이었다.

실시예 22: 생체내 종양 성장을 억제시키는 툼스타틴과 툼스타틴 변이체

5백만개의 PC-3 세포를 수집하고, 7주 내지 9주령의 수컷 무흉선 누드 마우스의 등에 피하 주사하였다. 종양을 버니어 캘리퍼스를 사용하여 측정하고, 부피를 표준식 폭²x 길이 x 0.52를 사용하여 계산하였다. 종양을 약 100㎣로 성장시킨 후, 동물을 5 또는 6마리 마우스의 군으로 나누었다. 툼스타틴 또는 마우스 엔도스타틴을 이러한 각각의 실험군에게 멸균 PBS 중에 함유된 형태로 10일간 매일 복막내 주입시켰다 (20㎎/㎏). 대조군에게는 비히클(BSA 또는 PBS)을 주사하였다. 종양 부피를 10일에 걸쳐서 2일 또는 3일 마다 계산하였다. 결과는 도 21a에 도시되어 있으며, 이 도면은 PBS 대조표준(□), 20㎎/㎏ 툼스타틴(●) 및 20㎎/㎏ 엔도스타틴(○)에 대한 처리일(x축)에 대한 종양 부피(㎣)를 나타내는 그래프이다. 대장균에서 생성된 툼스타틴은 PC-3 인간 전립선 종양의 성장을 현저하게 억제시켰다 (도 21a). 20㎎/㎏의 툼스타틴은 20㎎/㎏의 엔도스타틴과 유사한 정도로 종양 성장을 억제시켰다 (도 21a). 종양 성장에 대한 현저한 억제 효과는 10일째에 관찰되었다 (대조표준 202.8±50.0㎣, 툼스타틴 82.9±-25.2㎣, 엔도스타틴 68.9±16.7㎣). 툼스타틴 또는 엔도스타틴을 매일 복막내 주사하면 대조표준과 비교하여 인간 전립선암 세포(PC-3) 종양이 억제되었다. 이 실험은 종양 부피가 100㎣ 보다 작은 경우에 개시하였다.

마우스의 유도된 또 다른 원발성 종양에 대한 툼스타틴의 효과를 실험하였다. 2백만개의 786-0 신장 세포암 세포를 7주 내지 9주령의 수컷 무흉선 누드 마우스의 등에 피하 주사하였다. 종양을 약 600 내지 700㎣로 성장시킨 후, 동물을 6개의 군으로 나누었다. 툼스타틴을 멸균 PBS 중에서 10일간 매일 복막내 주입시켰다 (6㎎/㎏). 대조군에게는 BSA를 주사하였다. 결과는 도 21b에 도시되어 있으며, 이 도면은 PBS 대조표준(□) 및 6㎎/㎏ 툼스타틴(●)에 대한 처리일(x축)에 대한 종양 부피(㎣)(y축)를 나타내는 그래프이다. 6㎎/㎏의 대장균 생성된 툼스타틴은 BSA 대조표준과 비교하여 786-0 인간 신장 세포암의 종양 성장을 억제시켰다 (도 21b). 종양 성장에 대한 현저한 억제 효과는 10일째에 관찰되었다 (대조표준 1096±179.7㎣, 툼스타틴 619±120.7㎣). 툼스타틴을 매일 복막내 주입시키면 대조표준과 비교하여 인간 신장 세포암(786-0)의 종양 성장이 억제되었다. 이 실험은 종양 부피가 600 내지 700㎣인 경우에 개시하였다. 각각의 지점은 군 당 5 내지 6마리의 마우스의 평균±SE를 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 지점이 중요하며, 단측 스투던트 검정에 의한 경우 P＜0.05 였다.

타입 IV 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인(α3(IV) NC1)의 일부는 구드패스츄어 증후군의 병원체성 에피토프이다 [참조: Butkowski, R.J. et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:7874-7; Saus, J. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13374-80; Kalluri, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:24018-24]. 구드패스츄어 증후군은 폐출혈 및/또는 급속 진행성 사구체신염을 특징으로 하는 자가 면역 질병이다 [참조: Wilson, C. ＆ F. Dixon, 1986, The Kidney, W.B. Sanders Co., Philadelphia, Pennsylvania, USA, pps. 800-89; Hudson, B.G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:16033-6]. 이들 증후군은 α3(IV) NC1에 대한 자가항체의 결합을 통해 사구체 및 폐포 기저막의 파괴에 의해 유발된다 [참조: Wilson, 1986, supra; Hudson, 1993, supra). 몇몇 그룹은 α3(IV)에 대한 구드패스츄어 자가항원의 위치를 맵핑하거나 예상하고자 하는 연구를 하였고 [참조: Kalluri, R. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6:1178-85; (Kalluri, R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8; Levy, J.B. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:1698-1705; Kefalides, N.A. et al., 1993, Kidney Int. 43:94-100; Quinones, S. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:19780-4 (erratum in J. Biol. Chem 269:17358); Netzer, K.O. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:11267-74], N-말단, C-말단 및 중간 부분에 있는 잔기가 에피토프 위치인 것으로 보고되었다. 최근에는, 가장 있음직한 질병 관련된 병원체성 에피토프가 N-말단 부분에서 확인되었으며 [참조: Hellmark, T. et al., 1999, Kidney Int. 55:936-44], N-말단 40개 아미노산인 것으로 추가로 한정되었다. 병원체성 구드패스츄어 자가에피토프에 상응하는 N-말단 53개 아미노산 (툼스타틴-N53)이 결여된 트렁케이션된 툼스타틴이 설계되었다. 이러한 변이체 단백질을 하기 실험에 사용하였다.

2백만개의 786-0 신장 세포암 세포를 7주 내지 9주령의 수컷 무흉선 누드 마우스의 등에 피하 주사하였다. 종양을 약 100 내지 150㎣로 성장시켰다. 그 후, 동물을 5개의 군으로 나누고, 53개의 N-말단 아미노산이 결여된 대장균 발현된 트렁케이션된 툼스타틴 (Kalluri, R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8) 20㎎/㎏을 10일간 매일 복막내 주사하였다. 대조군에게는 PBS를 주사하였다. 결과는 도 22에 도시되어 있으며, 이 도면은 대조 마우스(□) 및 툼스타틴 변이체 N26으로 처리된 마우스(●)에 대한 처리일(x축)에 대한 종양 부피의 증가율(y축)을 나타내는 그래프이다. 20㎎/㎏의 대장균 생성된 툼스타틴-N53은 대조표준과 비교하여 제 4일째에서 제 10일째까지 786-0 인간 신장 종양을 현저하게 억제시켰다 (10일째: 툼스타틴-N53 110.0±29.0㎣, 대조표준 345.0±24.0㎣) (도 22). 각각의 지점은 군 당 5 내지 6마리의 마우스의 평균±SE를 나타낸다. 별표로 표시된 데이터 지점이 중요하며, 단측 스투던트 검정에 의한 경우 P＜0.05 였다.

실시예 23: α3(IV) NC1 및 CD31에 대한 면역조직화학적 염색

7주령의 수컷 C57/BL6 마우스로부터의 신장 및 피부 조직을 면역형광 현미경검사법에 의해 평가하기 위해 처리하였다. 조직 샘플을 액체 질소로 동결시키고, 4mm 두께의 절편을 사용하였다. 조직을 이미 공지된 간접 면역형광 기법에 의해 처리하였다 [참조: Kalluri, R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8]. 동결된 절편을 1차 항체, 폴리클로날 안티-CD31 항체 (1:100 희석율) 또는 폴리클로날 안티-α3(IV) NC1 항체 (1:50 희석율)로 염색시킨 후, 2차 항체, FITC 컨쥬게이션된 안티-래트 IgG 항체 또는 FITC 컨쥬게이션된 안티-인간 IgG 항체로 염색시켰다. 면역형광성을 올림푸스 형광 현미경 (Tokyo, Japan)으로 조사하였다. 네거티브 대조표준은 1차 항체를 관련없는 면역전 혈청으로 대체함으로써 수행하였다.

마우스 신장의 경우, α3(IV) NC1의 발현은 GBM 및 혈관 기저막에서 관찰되었다. CD31, PECAM-1의 발현은 사구체 내피 및 혈관 내피에서 관찰되었다. 마우스 피부의 경우, α3(IV) NC1는 표피 기저막 및 혈관 기저막에 존재하지 않았다. CD31의 발현은 피부의 혈관 내피에서 관찰되었다. CD31 발현은 마우스 신장의 사구체 및 작은 혈관의 내피에서 관찰되었고, α3(IV) NC1 발현은 사구체 기저막 및 사구체외의 혈관 기저막에서 관찰되었다. CD31의 발현은 마우스 피부의 진피성의 작은 혈관의 내피에서 관찰되었다. α3(IV) NC1 발현은 표피 기저막에 존재하지 않았고, 진피성의 작은 혈관의 기저막에서 거의 관찰되지 않았다. 이들 결과는 툼스타틴의 제한된 분포의 예를 나타낸다.

실시예 24: 혈관형성 억제 단백질의 돌연변이체 및 단편

아레스텐 및 칸스타틴의 단편 및 돌연변이체를 마리야마(Mariyama) 등의 문헌[1992, J. Biol. Chem. 267:1253-8]의 슈도모나스(Pseudomonas) 엘라스타제 분해에 따라 또한 제조하였다. 분해물을 겔 여과 HPLC에 의해 분석하고, 생성된 단편을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 상기한 바와 같이 내피 튜브 검정으로 평가하였다. 이들 단편은 12kDa 단편의 아레스텐, 8kDa 단편의 아레스텐, 10kDa 단편의 칸스타틴을 포함하였다. 또한, 툼스타틴의 두 개의 단편 ('333' 및 '334')를 PCR 클로닝에 의해 생성시켰다.

도 23에 도시된 바와 같이, 상기 기재된 바와 같이 수행된 내피 튜브 검정에 따르면, 두 개의 아레스텐 단편(12kDa(■) 및 8kDa(□)) 및 칸스타틴 단편(19kDa(▲))은 아레스텐(●) 또는 칸스타틴(○) 보다 더 높은 정도로 내피 튜브의 형성을 억제시켰다. 도 24는 툼스타틴 단편 "333"(●) 및 "334"(○)가 마찬가지로 툼스타틴(▲) 보다 성능이 뛰어났고, BSA(■)와 α6 사슬(□)은 대조표준의 역할을 함을 도시한다.

모든 참조문, 특허 및 특허 출원은 온전히 그대로 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다. 본 발명을 바람직한 구체예를 참조로 하여 상세히 설명하였지만, 당업자라면 첨부된 청구의 범위에 의해 규정되는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 형식적 및 실질적 형태의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING

＜110＞ Beth Israel Deaconess Medical Center

Raghuram Kalluri

＜120＞ ANTI-ANGIOGENIC PROTEINS AND METHODS OF

USE THEREOF

＜130＞ BIDMC98-11pA PCT

＜140＞ PCT/US99/13737

＜141＞ 1999-06-17

＜150＞ US 60/089,689

＜151＞ 1998-06-17

＜150＞ US 60/126,175

＜151＞ 1999-03-25

＜160＞ 18

＜170＞ FastSEQ for Windows Version 3.0

＜210＞ 1

＜211＞ 690

＜212＞ DNA

＜213＞ Homo sapiens

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1)...(687)

＜400＞ 1

tct gtt gat cac ggc ttc ctt gtg acc agg cat agt caa aca ata gat 48

Ser Val Asp His Gly Phe Leu Val Thr Arg His Ser Gln Thr Ile Asp

1 5 10 15

gac cca cag tgt cct tct ggg acc aaa att ctt tac cac ggg tac tct 96

Asp Pro Gln Cys Pro Ser Gly Thr Lys Ile Leu Tyr His Gly Tyr Ser

20 25 30

ttg ctc tac gtg caa ggc aat gaa cgg gcc cat gga cag gac ttg ggc 144

Leu Leu Tyr Val Gln Gly Asn Glu Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly

35 40 45

acg gcc ggc agc tgc ctg cgc aag ttc agc aca atg ccc ttc ctg ttc 192

Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg Lys Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu Phe

50 55 60

tgc aat att aac aac gtg tgc aac ttt gca tca cga aat gac tac tcg 240

Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser

65 70 75 80

tac tgg ctg tcc acc cct gag ccc atg ccc atg tca atg gca ccc atc 288

Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Pro Met Pro Met Ser Met Ala Pro Ile

85 90 95

acg ggg gaa aac ata aga cca ttt att agt agg tgt gct gtg tgt gag 336

Thr Gly Glu Asn Ile Arg Pro Phe Ile Ser Arg Cys Ala Val Cys Glu

100 105 110

gcg cct gcc atg gtg atg gcc gtg cac agc cag acc att cag atc cca 384

Ala Pro Ala Met Val Met Ala Val His Ser Gln Thr Ile Gln Ile Pro

115 120 125

ccg tgc ccc agc ggg tgg tcc tcg ctg tgg atc ggc tac tct ttt gtg 432

Pro Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Val

130 135 140

atg cac acc agc gct ggt gca gaa ggc tct ggc caa gcc ctg gcg tcc 480

Met His Thr Ser Ala Gly Ala Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala Ser

145 150 155 160

ccc ggc tcc tgc ctg gag gag ttt aga agt gcg cca ttc atc gag tgt 528

Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ile Glu Cys

165 170 175

cac ggc cgt ggg acc tgc aat tac tac gca aac gct tac agc ttt tgg 576

His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ala Asn Ala Tyr Ser Phe Trp

180 185 190

ctc gcc acc ata gag agg agc gag atg ttc aag aag cct acg ccg tcc 624

Leu Ala Thr Ile Glu Arg Ser Glu Met Phe Lys Lys Pro Thr Pro Ser

195 200 205

acc ttg aag gca ggg gag ctg cgc acg cac gtc agc cgc tgc caa gtc 672

Thr Leu Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr His Val Ser Arg Cys Gln Val

210 215 220

tgt atg aga aga aca taa 690

Cys Met Arg Arg Thr

225

＜210＞ 2

＜211＞ 229

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 2

Ser Val Asp His Gly Phe Leu Val Thr Arg His Ser Gln Thr Ile Asp

1 5 10 15

Asp Pro Gln Cys Pro Ser Gly Thr Lys Ile Leu Tyr His Gly Tyr Ser

20 25 30

Leu Leu Tyr Val Gln Gly Asn Glu Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly

35 40 45

Thr Ala Gly Ser Cys Leu Arg Lys Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu Phe

50 55 60

Cys Asn Ile Asn Asn Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser

65 70 75 80

Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Pro Met Pro Met Ser Met Ala Pro Ile

85 90 95

Thr Gly Glu Asn Ile Arg Pro Phe Ile Ser Arg Cys Ala Val Cys Glu

100 105 110

Ala Pro Ala Met Val Met Ala Val His Ser Gln Thr Ile Gln Ile Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Val

130 135 140

Met His Thr Ser Ala Gly Ala Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala Ser

145 150 155 160

Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ile Glu Cys

165 170 175

His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ala Asn Ala Tyr Ser Phe Trp

180 185 190

Leu Ala Thr Ile Glu Arg Ser Glu Met Phe Lys Lys Pro Thr Pro Ser

195 200 205

Thr Leu Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr His Val Ser Arg Cys Gln Val

210 215 220

Cys Met Arg Arg Thr

225

＜210＞ 3

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pET22b(+) forward oligonucleotide primer for

Arresten

＜400＞ 3

cgggatcctt ctgttgatca cggcttc 27

＜210＞ 4

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pET22b(+) reverse oligonuceotide primer for

Arresten

＜400＞ 4

cccaagcttt gttcttctca tacagac 27

＜210＞ 5

＜211＞ 684

＜212＞ DNA

＜213＞ Homo sapiens

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1)...(681)

＜400＞ 5

gtc agc atc ggc tac ctc ctg gtg aag cac agc cag acg gac cag gag 48

Val Ser Ile Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu

1 5 10 15

ccc atg tgc ccg gtg ggc atg aac aaa ctc tgg agt gga tac agc ctg 96

Pro Met Cys Pro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu

20 25 30

ctg tac ttc gag ggc cag gag aag gcg cac aac cag gac ctg ggg ctg 144

Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala His Asn Gln Asp Leu Gly Leu

35 40 45

gcg ggc tcc tgc ctg gcg cgg ttc agc acc atg ccc ttc ctg tac tgc 192

Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu Tyr Cys

50 55 60

aac cct ggt gat gtc tgc tac tat gcc agc cgg aac gac aag tcc tac 240

Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys Ser Tyr

65 70 75 80

tgg ctc tct acc act gcg ccg ctg ccc atg atg ccc gtg gcc gag gac 288

Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro Met Met Pro Val Ala Glu Asp

85 90 95

gag atc aag ccc tac atc agc cgc tgt tct gtg tgt gag gcc ccg gcc 336

Glu Ile Lys Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Ser Val Cys Glu Ala Pro Ala

100 105 110

atc gcc atc gcg gtc cac agt cag gat gtc tcc atc cca cac tgc cca 384

Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Asp Val Ser Ile Pro His Cys Pro

115 120 125

gct ggg tgg cgg agt ttg tgg atc gga tat tcc ttc ctc atg cac acg 432

Ala Gly Trp Arg Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Leu Met His Thr

130 135 140

gcg gcg gga gac gaa ggc ggt ggc caa tca ctg gtg tca ccg ggc agc 480

Ala Ala Gly Asp Glu Gly Gly Gly Gln Ser Leu Val Ser Pro Gly Ser

145 150 155 160

tgt cta gag gac ttc cgc gcc aca cca ttc atc gaa tgc aat gga ggc 528

Cys Leu Glu Asp Phe Arg Ala Thr Pro Phe Ile Glu Cys Asn Gly Gly

165 170 175

cgc ggc acc tgc cac tac tac gcc aac aag tac agc ttc tgg ctg acc 576

Arg Gly Thr Cys His Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Ser Phe Trp Leu Thr

180 185 190

acc att ccc gag cag agc ttc cag ggc tcg ccc tcc gcc gac acg ctc 624

Thr Ile Pro Glu Gln Ser Phe Gln Gly Ser Pro Ser Ala Asp Thr Leu

195 200 205

aag gcc ggc ctc atc cgc aca cac atc agc cgc tgc cag gtg tgc atg 672

Lys Ala Gly Leu Ile Arg Thr His Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met

210 215 220

aag aac ctg tga 684

Lys Asn Leu

225

＜210＞ 6

＜211＞ 227

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 6

Val Ser Ile Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu

1 5 10 15

Pro Met Cys Pro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu

20 25 30

Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala His Asn Gln Asp Leu Gly Leu

35 40 45

Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met Pro Phe Leu Tyr Cys

50 55 60

Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys Ser Tyr

65 70 75 80

Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro Met Met Pro Val Ala Glu Asp

85 90 95

Glu Ile Lys Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Ser Val Cys Glu Ala Pro Ala

100 105 110

Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Asp Val Ser Ile Pro His Cys Pro

115 120 125

Ala Gly Trp Arg Ser Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Phe Leu Met His Thr

130 135 140

Ala Ala Gly Asp Glu Gly Gly Gly Gln Ser Leu Val Ser Pro Gly Ser

145 150 155 160

Cys Leu Glu Asp Phe Arg Ala Thr Pro Phe Ile Glu Cys Asn Gly Gly

165 170 175

Arg Gly Thr Cys His Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Ser Phe Trp Leu Thr

180 185 190

Thr Ile Pro Glu Gln Ser Phe Gln Gly Ser Pro Ser Ala Asp Thr Leu

195 200 205

Lys Ala Gly Leu Ile Arg Thr His Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met

210 215 220

Lys Asn Leu

225

＜210＞ 7

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pET22b(+) forward oligonucleotide primer for

Canstatin

＜400＞ 7

cgggatcctg tcagcatcgg ctacctc 27

＜210＞ 8

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pET22b(+) reverse oligonucleotide primer for

Canstatin

＜400＞ 8

cccaagcttc aggttcttca tgcacac 27

＜210＞ 9

＜211＞ 738

＜212＞ DNA

＜213＞ Homo sapiens

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (4)...(735)

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (160)...(735)

＜223＞ Tumstatin N53

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (4)...(375)

＜223＞ Tumstatin 333

＜221＞ misc_feature

＜222＞ (376)...(735)

＜223＞ Tumstatin 334

＜400＞ 9

cca ggt ttg aaa gga aaa cgt gga gac agt gga tca cct gca acc tgg 48

Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp

1 5 10 15

aca acg aga ggc ttt gtc ttc acc cga cac agt caa acc aca gca att 96

Thr Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln Thr Thr Ala Ile

20 25 30

cct tca tgt cca gag ggg aca gtg cca ctc tac agt ggg ttt tct ttt 144

Pro Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser Gly Phe Ser Phe

35 40 45

ctt ttt gta caa gga aat caa cga gcc cac gga caa gac ctt gga act 192

Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr

50 55 60

ctt ggc agc tgc ctg cag cga ttt acc aca atg cca ttc tta ttc tgc 240

Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys

65 70 75

aat gtc aat gat gta tgt aat ttt gca tct cga aat gat tat tca tac 288

Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr

80 85 90 95

tgg ctg tca aca cca gct ctg atg cca atg aac atg gct ccc att act 336

Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr

100 105 110

ggc aga gcc ctt gag cct tat ata agc aga tgc act gtt tgt gaa ggt 384

Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly

115 120 125

cct gcg atc gcc ata gcc gtt cac agc caa acc act gac att cct cca 432

Pro Ala Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp Ile Pro Pro

130 135 140

tgt cct cac ggc tgg att tct ctc tgg aaa gga ttt tca ttc atc atg 480

Cys Pro His Gly Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser Phe Ile Met

145 150 155

ttc aca agt gca ggt tct gag ggc acc ggg caa gca ctg gcc tcc cct 528

Phe Thr Ser Ala Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro

160 165 170 175

ggc tcc tgc ctg gaa gaa ttc cga gcc agc cca ttt cta gaa tgt cat 576

Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His

180 185 190

gga aga gga acg tgc aac tac tat tca aat tcc tac agt ttc tgg ctg 624

Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu

195 200 205

gct tca tta aac cca gaa aga atg ttc aga aag cct att cca tca act 672

Ala Ser Leu Asn Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr

210 215 220

gtg aaa gct ggg gaa tta gaa aaa ata ata agt cgc tgt cag gtg tgc 720

Val Lys Ala Gly Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys

225 230 235

atg aag aaa aga cac tga 738

Met Lys Lys Arg His

240

＜210＞ 10

＜211＞ 244

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜220＞

＜221＞ PEPTIDE

＜222＞ (54)...(245)

＜223＞ Tumstatin N53

＜221＞ PEPTIDE

＜222＞ (2)...(125)

＜223＞ Tumstatin 333

＜221＞ PEPTIDE

＜222＞ (126)...(245)

＜223＞ Tumstatin 334

＜400＞ 10

Gly Leu Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala Thr Trp Thr

1 5 10 15

Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln Thr Thr Ala Ile Pro

20 25 30

Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser Gly Phe Ser Phe Leu

35 40 45

Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Gly Thr Leu

50 55 60

Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn

65 70 75 80

Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp

85 90 95

Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met Ala Pro Ile Thr Gly

100 105 110

Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr Val Cys Glu Gly Pro

115 120 125

Ala Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr Asp Ile Pro Pro Cys

130 135 140

Pro His Gly Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe Ser Phe Ile Met Phe

145 150 155 160

Thr Ser Ala Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ser Pro Gly

165 170 175

Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe Leu Glu Cys His Gly

180 185 190

Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Ala

195 200 205

Ser Leu Asn Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro Ile Pro Ser Thr Val

210 215 220

Lys Ala Gly Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg Cys Gln Val Cys Met

225 230 235 240

Lys Lys Arg His

＜210＞ 11

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pET22b(+) forward oligonucleotide primer for

Tumstatin

＜400＞ 11

cgggatccag gtttgaaagg aaaacgt 27

＜210＞ 12

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pET22b(+) reverse oligonucleotide primer for

Tumstatin

＜400＞ 12

cccaagcttt cagtgtcttt tcttcat 27

＜210＞ 13

＜211＞ 8

＜212＞ PRT

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Additional vector sequence added to protein

＜400＞ 13

Met Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp

1 5

＜210＞ 14

＜211＞ 7

＜212＞ PRT

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Additional vector sequence added to protein

＜400＞ 14

Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu

1 5

＜210＞ 15

＜211＞ 28

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pPICZaA forward oligonucleotide primer for

Arresten

＜400＞ 15

ttcggaattc tctgttgatc acggcttc 28

＜210＞ 16

＜211＞ 35

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pPICZaA reverse oligonucleotide primer for

Arresten

＜400＞ 16

tgctctagag gtgttcttct catacagact tggca 35

＜210＞ 17

＜211＞ 31

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pPICZaA forward oligonucleotide primer for

Canstatin

＜400＞ 17

ttcggaattc gtcagcatcg gctacctcct g 31

＜210＞ 18

＜211＞ 32

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ pPICZaA reverse oligonucleotide primer for

Canstatin

＜400＞ 18

ggggtacccc caggttcttc atgcacacct gg 32

Claims

타입 IV 콜라겐의 α1 사슬의 NC1 도메인, 타입 IV 콜라겐의 α2 사슬의 NC1 도메인 또는 타입 IV 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 단백질 또는 이의 단편, 유사체, 유도체 또는 돌연변이체로서, 상기 단백질의 단편, 유사체, 유도체 또는 돌연변이체가 항혈관형성 특성을 가짐을 특징으로 하는 단백질.
제 1항에 있어서, 단백질이 단량체임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
제 2항에 있어서, 단백질이 아레스텐(Arresten)임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
제 2항에 있어서, 단백질이 칸스타틴(Canstatin)임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
제 2항에 있어서, 단백질이 툼스타틴(Tumstatin)임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
제 1항에 따른 단백질 또는 이의 단편, 유사체, 유도체 또는 돌연변이체의 다량체로서, 항혈관형성 활성을 가짐을 특징으로 하는 다량체.
제 1항에 따른 단백질을 하나 이상 포함하는 키메라 단백질 또는 이의 단편, 유사체, 유도체 또는 돌연변이체로서, 항혈관형성 활성을 가짐을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 7항에 있어서, 엔도스타틴(endostatin) 또는 이의 단편, 앤지오스타틴(angiostatin) 또는 이의 단편, 레스틴(restin) 또는 이의 단편, 아포미그렌(apomigren) 또는 이의 단편, 또는 다른 항혈관형성 단백질 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 분자를 하나 이상 추가로 포함함을 특징으로 하는 키메라 단백질.
생물학적 활성 성분으로서 제 1항에 따른 단백질을 하나 이상 포함하는 조성물.
제 9항에 따른 조성물 및 약제학적으로 적합한 캐리어.
생물학적 활성 성분으로서 제 1항에 따른 단백질 하나 이상 및 엔도스타틴 또는 이의 단편, 앤지오스타틴 또는 이의 단편, 레스틴 또는 이의 단편, 아포미그렌 또는 이의 단편, 또는 다른 항혈관형성 단백질 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 분자를 하나 이상 추가로 포함하는 조성물.
생물학적 활성 성분으로서 제 6항에 따른 다량체를 포함하는 조성물.
생물학적 활성 성분으로서 제 7항에 따른 키메라 단백질을 포함하는 조성물.
제 1항에 따른 단백질 또는 이의 단편, 유사체, 유도체 또는 돌연변이체를 엔코딩하는 단리된 폴리누클레오티드로서, 상기 단백질 또는 이의 단편, 유사체, 유도체 또는 돌연변이체가 항혈관형성 활성을 가짐을 특징으로 하는 단리된 폴리누클레오티드.
제 14항에 있어서, 폴리누클레오티드가 발현 조절 서열에 실시가능하게 연결되어 있음을 특징으로 하는 단리된 폴리누클레오티드.
제 15항에 따른 폴리누클레오티드를 사용하여 형질전환된 숙주 세포.
제 16항에 있어서, 세포가 세균 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 3항에 따른 단백질을 엔코딩하는 단리된 폴리누클레오티드.
제 4항에 따른 단백질을 엔코딩하는 단리된 폴리누클레오티드.
제 5항에 따른 단백질을 엔코딩하는 단리된 폴리누클레오티드.
(a) 제 14항에 따른 폴리누클레오티드를 사용하여 형질전환시킨 숙주 세포의 배양물을 성장시키고(여기서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포로 구성된 군으로부터 선택된다); (b) 상기 배양물로부터 상기 단백질을 정제시키는 것을 포함하여, 제 14항에 따른 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 단백질을 생성시키는 방법.
(a) 적절한 엄중 조건하에서 제 14항에 따른 폴리누클레오티드와 혼성화되는 하나 이상의 폴리누클레오티드 프로브를 제조하는 방법; (b) 상기 프로브(들)를 포유류 DNA와 혼성화시키는 방법; 및 (c) 프로브(들)를 사용하여 검출된 DNA 폴리누클레오티드를 단리시키는 방법에 따라 생성된 단리된 폴리누클레오티드로서, 단리된 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열이 제 14항에 따른 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열에 상응함을 특징으로 하는 단리된 폴리누클레오티드.
시험관내에서 처리하여 제 14항의 폴리누클레오티드를 삽입시킨 포유류 세포를 포유동물내로 도입시키고 상기 포유동물의 생체내에서 혈관형성 활성을 억제시키기에 충분한 양으로 항혈관형성 단백질의 치료적 유효량을 발현시킴을 포함하여 포유동물에게 항혈관형성 단백질을 제공하는 방법.
제 23항에 있어서, 항혈관형성 단백질의 발현이 일시적인 발현임을 특징으로 하는 방법.
제 23항에 있어서, 세포가 혈구, TIL 세포, 골수 세포, 혈관 세포, 종양 세포, 간 세포, 근육 세포, 섬유아 세포로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 폴리누클레오티드가 바이러스 벡터에 의해 세포내로 삽입됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 따른 단리된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이들의 유사체, 동족체 또는 돌연변이체.
포유동물 조직을 i) 제 1항에 따른 하나 이상의 단리된 단백질 또는 이들의 단편, 유사체, 유도체 또는 돌연변이체, ii) 제 1항에 따른 단리된 단백질의 다량체, iii) 제 1항에 따른 단백질의 다량체, iv) 제 1항에 따른 단편의 다량체, v) 제 1항에 따른 단백질을 하나 이상 포함하는 키메라 단백질 또는 vi) 제 1항에 따른 단백질의 단편을 포함하는 키메라 단백질 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여 포유류 조직에서 혈관형성 활성을 억제시키는 방법.
제 28항에 있어서, 질환이 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 류마티스양관절염, 당뇨병 망막병증, 건선, 안구혈관형성 질환, 오슬러-웨버 증후군, 심근 혈관형성, 플라크 신혈관화, 모세혈관확장증, 혈우병 관절증, 혈관섬유종, 외상 과립화, 장 유착증, 동맥경화증, 경피증, 비후성 반흔, 캣 스크래치 질환, 헬리오박터 필로리 궤양, 투석 이식 혈관 통로 협착증, 피임 및 비만으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 29항에 있어서, 질환이 암임을 특징으로 하는 방법.
혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 억제시키기 위해 제 28항에 따른 조성물을 사용하는 방법으로서, 질환을 가진 환자에게 방사능 치료, 화학요법 또는 면역요법과 함께 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
SEQ ID NO:10의 아미노산 2 내지 아미노산 125를 포함하는 폴리펩티드로서, 항혈관형성 활성을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 32항에 따른 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드.
SEQ ID NO:10의 아미노산 125 내지 아미노산 245를 포함하는 폴리펩티드로서, 항혈관형성 활성을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 34항에 따른 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드.
타입 IV 콜라겐의 α1 사슬의 NC1 도메인의 항혈관형성 단편으로서, PCR 클로닝 방법에 의해 제조됨을 특징으로 하는 단편.
타입 IV 콜라겐의 α2 사슬의 NC1 도메인의 항혈관형성 단편으로서, PCR 클로닝 방법에 의해 제조됨을 특징으로 하는 단편.
타입 IV 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인의 항혈관형성 단편으로서, PCR 클로닝 방법에 의해 제조됨을 특징으로 하는 단편.
타입 IV 콜라겐의 α1 사슬의 NC1 도메인의 항혈관형성 단편으로서, 슈도모나스 엘라스타제 분해 방법에 의해 제조됨을 특징으로 하는 단편.
제 39항에 있어서, 단편의 크기가 12 kDa임을 특징으로 하는 항혈관형성 단편.
제 39항에 있어서, 단편의 크기가 8 kDa임을 특징으로 하는 항혈관형성 단편.
타입 IV 콜라겐의 α2 사슬의 NC1 도메인의 항혈관형성 단편으로서, 슈도모나스 엘라스타제 분해 방법에 의해 제조됨을 특징으로 하는 단편.
제 42항에 있어서, 단편의 크기가 10 kDa임을 특징으로 하는 단편.
타입 IV 콜라겐의 α3 사슬의 NC1 도메인의 항혈관형성 단편으로서, 슈도모나스 엘라스타제 분해 방법에 의해 제조됨을 특징으로 하는 단편.