상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 항염증 및 피부자극 완화효과를 갖는 외용제 조성물은 버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 또는 이들의 저분자화된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼10중량%의 양으로 함유함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
버섯은 진균류에 속하는 담자균과 자낭균류중 자실체를 형성하는 고등균류로서, 이들이 생산하는 특정구조를 가진 다당류, 즉 베타 글루칸은 기원에 따라서 베타-1,3-결합, 베타-1,4-결합, 베타-1,6-결합 등 다양한 결합 유형이 존재할 뿐만 아니라 구성당의 균일성, 분지도, 분자량, 3차 구조 등에서 많은 차이가 있어, 그 물리화학적 특성 및 생체기능도 완전히 다른 경우가 많다. 그러나, 본 발명자들은 자실체로부터 추출되며 베타-1,3 주당쇄의 매 5개의 잔기내에 2개씩 베타-1,6-잔기를 갖는 표고버섯의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸, 베타-1,3 주당쇄의 매 3개의 잔기당 베타-1,6-잔기를 갖는 치마버섯(Schizopyllum commune)과 균핵균의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸이 항염증 효과 및 피부자극 완화 효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 아울러, 상기한 글루칸의 기본 3차 구조를 유지하면서 저분자화한 경우, 항염증 효과 및 피부자극 완화 효과가 향상된다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 치마버섯, 균핵균 및 표고버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 또는 이들의 저분자화 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부자극 완화 효과를 갖는 외용제 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다. 한편, 고분자 글루칸을 저분자화하는 방법으로는 일반적으로 효소적인 방법, 화학적인 방법, 물리적인 방법이 사용될 수 있는데, 물리적인 방법이 글루칸의 주쇄인 베타 1,3 결합만을 효율적으로 절단하여 3차 구조를 변경하지 않는 것으로 보고되었기 때문에 물리적 방법으로 저분자화 한다. 그러나, 주로 사용되는 초음파 처리 방법은 소음이나 경제성을 고려해 볼 때 대량생산화 하기에는 부적합하므로, 본 발명에서는 마이크로플루다이저(Microfluidizer(Micorfludisc, USA))를 이용하여 저분자화 된 글루칸을 얻는다. 즉, 치마버섯(Schizophyllum commune), 균핵균(Sclerotinia glucanicum) 및 표고버섯(Lentinus edodes) 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 용액을 마이크로플루다이저(Microfluidizer)를 이용하여 5000-25,000 PSI의 압력으로 1~5회 반복 통과시켜 얻어진 용액을 분획 분자량이 10K인 초여과막에 통과시킨 후, 이 액을 다시 분획 분자량 300K를 통과시켜 분자량 10K~300K의 저분자화된 글루칸 용액을 분획하여 얻어진 용액에 에틸알코올을 3~4배량 첨가하여 저분자 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 결집시켜 회수하고, 회수된 저분자 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 열풍건조 및 동결건조한 후 분쇄하는 방법으로 저분자화 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 얻는다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물에 있어서, 치마버섯, 균핵균 및 표고버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 또는 이들의 저분자화 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 사용량은 그 제형에 따라 적당량으로 선정될 수 있으며, 바람직하게는 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼10중량%의 양으로 함유된다.
본 발명의 항염증 및 피부자극완화효과를 갖는 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩 또는 젤의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 갖는 외용제 조성물일 수 있다.
또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 수용성 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
이하, 제조예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 제조예에만 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1]
1) 치마버섯(Schizophyllum commune) 및 균핵균(Sclerotinia glucanicum)을 통상의 방법으로 액체 배양하고, 배양완료 후 배양액에 활성탄 분말(제일화학) 1.0%를 첨가하고 30분간 교반하여 색소 및 단백질 성분을 흡착시켜 제거한 후, 압축여과장치(press filter)로 여과하고 다시 1㎛ 및 0.45㎛의 미세공을 가진 여과막에 차례로 통과시켜 균사체와 활성탄이 완전히 제거된 청정한 무색 또는 연갈색의 배양액을 얻었다.
2) 상기 용액에 3.5배량의 에틸알코올을 서서히 가하고 실온에서 하룻밤동안 방치하여 침전시킨 다음 회수한 후, 다시 초기 액량과 동량의 물에 용해시켰다. 동일한 방법으로 2배량의 에틸알코올을 서서히 가한 후 실온에서 하룻밤동안 방치하여 침전시킨 다음 회수한 후, 다시 초기 액량과 동량의 물에 용해시켰다. 동일한 방법으로 동량의 에틸알코올을 서서히 가한 후 실온에서 하룻밤동안 방치하여 침전시킨 다음 회수하였다.
3) 회수된 침전물을 수거하여, 80℃ 온도로 열풍건조하여 알코올 성분을 휘발시킨 후, -70℃에 동결시키고 동결건조기를 이용하여 건조한 후, 분쇄기로 분쇄하여 분말의 화합물을 얻었다.
[제조예 2]
제조예 1의 1) 과정을 거쳐 얻은 용액을 마이크로플루다이저(Microfludisc, USA)를 이용하여 5,000-25,000 PSI의 압력으로 1-5회 반복통과 시켰다. 마이크로플루다이저를 통과한 액을 분획 분자량이 10K인 초여과막에 통과시켜 분자량 10K 이하인 저분자 물질을 제거하고, 이 액을 다시 분획 분자량 300K를 통과시켜 300K이하의 저 분자화된 글루칸 용액을 분획한 후 제조예 1의 2)-3)과 동일한 방법으로 침전 및 건조하여 저분자화 된 분말을 얻었다.
[제조예 3]
표고버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸인 렌티난을 10% NaOH용액에 0.5% 농도로 녹인 후, 제조예 2와 동일한 방법으로 저분자화, 분획, 침전 및 건조 과정을 거쳐 저분자화된 렌티난 분말을 얻었다.
〈시험예 1〉 생체내 항염증 효과
본 실험은 SD 생쥐(rat)을 이용한 카라기난 발 부종(Carrageenan foot edema)법을 사용했다.
제조예 1에 의해 얻은 치마버섯 및 균핵균의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸, 제조예2에 의해 얻는 치마버섯 및 균핵균의 저분자화 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸, 표고버섯(Lentinus edodes) 유래의 베타-글루칸인 렌티난(Lentinan) 및 제조예 3에 의해 얻은 저분자화 된 렌티난 각각 30mg/kg을 복강으로 투여한 후 1시간 뒤, 0.1%의 카라기난 용액 0.5㎖를 실험 동물의 뒷발바닥에 주입하여 염증을 유발했다. 카라기난 주입 직후와 주입 후 4시간 뒤의 쥐의 발부피의 변화를 측정하여 하기 수학식 1에 의해 % 억제율을 산출하여, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시 료 |
투여용량 |
% 억제율 |
아스피린 |
30 mg/kg |
34±7 |
제조예 1(치마버섯 글루칸) |
30 mg/kg |
58±12 |
제조예 1(균핵균 글루칸) |
30 mg/kg |
45±8 |
제조예 2(치마버섯의 저분자화 글루칸) |
30 mg/kg |
72±15 |
제조예 2(균핵균의 저분자화 글루칸) |
30 mg/kg |
65±10 |
렌티난 |
30 mg/kg |
48±12 |
제조예 3(저분자화 렌티난) |
30 mg/kg |
62±5 |
<시험예 2〉 마우스 국소 항염증 효능
테트라데카노일포르볼 아세테이트(Tetradecanoylphorbol acetate; TPA) 2㎍을 20㎕ 아세톤에 녹이고 ICR 쥐의 귀에 도포하여 부종을 유발하였다. 부종유발 후 15분, 6시간 뒤에 각각의 시료를 도포했다. 최초 TPA 도포 후 24시간 뒤에 마우스 귀의 일정 부분을 펀치로 도려낸 후 귀의 무게를 측정하고 또한 부종 부위로 몰려든 뉴트로필(neutrophil)수를 평가하기 위해 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 활성을 측정하여 각 시료의 항염증 효능을 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
시 료 |
시료농도 |
귀무게 억제율(%) |
마이엘로퍼옥시다제활성억제율(%) |
아스피린 |
0.3mg/ear |
52 |
40 |
제조예 1(치마버섯 글루칸) |
0.3mg/ear |
54 |
40 |
제조예 1(균핵균 글루칸) |
0.3mg/ear |
45 |
32 |
제조예 2(치마버섯의 저분자화 글루칸) |
0.3mg/ear |
62 |
49 |
제조예 2(균핵균의 저분자화 글루칸) |
0.3mg/ear |
52 |
40 |
렌티난 |
0.3mg/ear |
43 |
30 |
제조예 3(저분자화 렌티난) |
0.3mg/ear |
54 |
46 |
상기 표 1과 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 처리한 군은 양성대조구로 사용한 아스피린 처리군 보다 우수한 효과를 보였으며, 마이크로플루다이저를 이용하여 저분자화 했을 때 훨씬 더 우수한 항염증 효능을 보였다. 특히 치마버섯유래의 저분자화된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 경우는 카라기난 발 부종(Carrageenan foot edema)법 및 국소 항염증 효능에서 양성대조구와 비교했을 때 각각 200%와 120%정도의 우수한 효능을 나타내어 시험군 중에서 가장 우수하였다.
〈시험예 3〉동물 피부누적자극시험
실험동물로는 2 ~ 2.5Kg 의 웅성 뉴질랜드 산 흰색 토끼(New Zealand White Rabbit)를 사용했고, 피부 자극 물질로 레티놀(Retinol) 2000IU를 사용하였다. 실험 동물을 1주일간 적정한 환경(23 ±2 ℃, 상대습도 50 ±10 %)에서 음수와 고형 사료를 자유로이 섭취시킨 다음 실험용 토끼의 등 피부는 실험 24시간 전에 토끼의 등 피부를 제모하였다. 피부 자극물질을 처리하고 20분 후 제조예 1의 치마버섯 글루칸, 제조예 2의 치마버섯의 저분자화 글루칸, 효모 글루칸(Yeast Glucan) 및 레티놀 2000IU 각각을 50㎕씩 도포하고, 그 후 1일 2회 간격으로 4~5일간 반복적으로 50㎕씩 도포하였다. 피부자극지수는 표 3의 방법으로 평점을 매겨 값을 합한 다음 총 도포횟수로 나눈 값으로 나타내었고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
피부 반응의 정도 |
평점 |
1) 홍반과 가피 형성홍반이 없음아주 경도의 홍반 (육안으로 겨우 식별할 정도)명료한 홍반중등도에서 강한 홍반심홍색의 강항 홍반과 가피 형성 |
01234 |
2) 부종형성부종 없음매우 가벼운 부종 (육안으로 겨우 식별할 정도)명료한 부종 (주위와 명료한 구분이 됨)중등도의 부종 (1mm 정도 부어 올랐을 경우)강한 부종 (1mm 이상 부어 오르고 노출 부위밖에까지 확장된상태) |
01234 |
도 1에 나타난 바와 같이 치마버섯 유래의 글루칸은 우수한 피부 자극 완화능을 보였으며, 특히 저분자화된 글루칸은 레티놀 단독 처리군의 자극을 약 40% 정도 저하시키는 것으로 나타났다. 이에 비해 효모 글루칸은 전혀 효능을 보이지 않았다.
이하, 제형예 1∼9를 들어 상기 제조예 1~3 에서 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 함유하는 화장료 조성물의 구성을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명의 조성물이 이들 제형예에 한정되는 것은 아니다.
(제형예 1) 유연화장수(스킨로션)
배합성분 |
중량% |
제조예 1(치마버섯 글루칸) |
0.1 |
글리세린 |
3.0 |
부틸렌글리콜 |
2.0 |
프로필렌글리콜 |
2.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.1 |
피이지-12 노닐페닐에테르 |
0.2 |
폴리솔베이트 80 |
0.4 |
에탄올 |
10.0 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
방부제, 색소, 향료 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
(제형예 2) 영양화장수(밀크로션)
배합성분 |
중량% |
제조예 2(치마버섯의 저분자화 글루칸) |
0.1 |
스쿠알란 |
5.0 |
밀납 |
4.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
1.5 |
유동파라핀 |
0.5 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
5.0 |
글리세린 |
3.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.1 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
방부제, 색소, 향료 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
(제형예 3) 영양크림
배합성분 |
중량% |
제조예 1(균핵균 글루칸) |
0.1 |
밀납 |
10.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
피이지 60 경화피마자유 |
2.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
유동파라핀 |
10.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
5.0 |
글리세린 |
5.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
방부제, 색소, 향료 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
(제형예 4) 마사지크림
배합성분 |
중량% |
제조예 2(균핵균의 저분자화 글루칸) |
0.1 |
밀납 |
10.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
피이지 60 경화피마자유 |
2.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.8 |
유동파라핀 |
40.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
4.0 |
글리세린 |
5.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
방부제, 색소, 향료 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
(제형예 5) 팩
배합성분 |
중량% |
제조예 3(표고버섯의 저분자화 렌티난) |
0.1 |
폴리비닐알콜 |
13.0 |
소듐카르복시메틸셀룰로오스 |
0.2 |
글리세린 |
5.0 |
알란토인 |
0.1 |
에탄올 |
6.0 |
핑지-12 노닐페닐에테르 |
0.3 |
폴리솔베이트 60 |
0.3 |
방부제, 색소, 향료 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
(제형예 6) 젤
배합성분 |
중량% |
제조예 2(치마버섯의 저분자화 글루칸) |
0.1 |
에틸렌디아민초산나트륨 |
0.05 |
글리세린 |
5.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.3 |
에탄올 |
5.0 |
피이지-60 경화피마자유 |
0.5 |
트리에탄올아민 |
0.3 |
방부제, 색소, 향료 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
(제형예 7) 연고
배합성분 |
중량% |
제조예 2(치마버섯의 저분자화 글루칸) |
1.0 |
밀납 |
10 |
폴리솔베이트 60 |
5.0 |
피이지 60 경화피마자유 |
2.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
바셀린 |
5.0 |
유동파라핀 |
10.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
쉐어버터 |
3.0 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
5.0 |
글리세린 |
10.0 |
프로필렌글리콜 |
10.2 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
방부제, 색소, 향료 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
(제형예 8) 국소투여용 약제(겔 연고제)
배합성분 |
중량% |
제조예 2(치마버섯의 저분자화 글루칸) |
3.0 |
폴리아크릴산(Carbopol 940) |
1.5 |
이소프로판올 |
5.0 |
헥실렌글리콜 |
25.0 |
트리에탄올아민 |
1.7 |
탈이온수 |
to 100 |
(제형예 9) 국소 투여용 약제(패취제)
배합성분 |
중량% |
제조예 2(치마버섯의 저분자화 글루칸) |
1.2 |
헥실렌글리콜 |
20.0 |
디에틸아민 |
0.7 |
폴리아크릴산(Carbopol 934P) |
1.0 |
아황산나트륨 |
0.1 |
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9) |
1.0 |
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르(Cetomacrogol 1000) |
1.0 |
점성의 파라핀 오일 |
2.5 |
카프릴산에스테르/카프르산에스테르(Cetiol LC) |
2.5 |
폴리에틸렌글리콜 400 |
3.0 |
탈이온수 |
to 100 |