KR20010020238A

KR20010020238A - 칼레티쿨린 결핍 세포

Info

Publication number: KR20010020238A
Application number: KR1019997009830A
Authority: KR
Inventors: 쇼우카트 데드하르; 르네 에스티-아르나우드
Original assignee: 버매스 존 디; 슈라이너즈 하스피탈즈 포 칠드런; 래드카우 제이씨; 온타리오 캔서 트리트먼트 앤드 리써치 파운데이션
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2001-03-15
Also published as: CA2287198A1; EP0977831A1; AU7022898A; JP2002501380A; WO1998048003A1; US6461865B1

Abstract

본 발명은 칼레티쿨린 결핍 세포에 관한 것이다. 그 세포는 칼레티쿨린 돌연변이에 대해 동형접합성이거나 또는 이형접합성일 수 있다.

Description

칼레티쿨린 결핍 세포{Calreticulin-Deficient Cells}

포유동물 내의 많은 기관의 생리 기능은 호르몬에 의해 조절된다. 이 호르몬은 스테로이드 호르몬, 갑상선 호르몬, 비타민의 대사산물, 예를 들면 모든 트랜스 레틴산, 9-시스 레틴산, 비타민 D 및 그의 대사산물 1,25 디히드록시비타민 D3을 포함한다. 이 호르몬은 단백질이며 유전자의 발현을 조절하는 세포내 수용체에 결합한다.

호르몬에 반응하는 각종 수용체가 있다. 조골세포 및 파골세포는 스테로이드 호르몬, 비타민 D 및 레틴산에 반응한다. 유방 상피세포 및 유방암 세포는 에스트로겐, 프로게스테론, 레틴산 및 글루코코르티코이드에 반응한다. 임파구는 글루코코르티코이드에 반응한다.

호르몬에 대한 수용체의 반응은 암, 골다공증 및 만성 염증성 질환을 포함한 많은 질병의 발생에 특히 중요하다. 예를 들면, 비타민 D 수용체는 골다공증의 진전에 많은 관련이 있다.

호르몬 수용체족은 핵 호르몬 수용체 족으로 불리우며 리간드가 알려진 수용체 뿐만 아니라 리간드가 알려지지 않은 증가 수의 오르판 수용체를 포함한다.

핵 호르몬 수용체는 호르몬 (리간드) 결합 도메인, DNA-결합 도메인 및 교차활성화 도메인을 포함하는 수개의 도메인으로 구분될 수 있다. DNA-결합 도메인은 2개의 아연 핑거로 이루어지며 그의 발현이 수용체에 의해 조절되는 유전자의 프로모터 및 인핸서 영역들에서 발견되는 DNA 반응 요소에 대한 수용체의 결합의 원인이 된다. 일단 호르몬이 그의 수용체에 결합되면, 그 수용체는 DNA에 결합하고, 그럼으로써 유전자 전사가 유도된다.

호르몬 수용체 유도된 유전자 전사를 조절하는 단백질은 잘 이해되지 않는다. 그러한 단백질은 세포의 핵에 존재하며 그의 수용체에 대한 호르몬의 결합을 억제 또는 촉진시킨다.

칼레티쿨린은 초기에 골격 근육의 근소포체 내의 주요 Ca²⁺저장 단백질로서 확인되었다. 이후의 연구는 그 단백질이 비근육 조직의 소포체에서 검출될 수도 있음을 밝혀냈다. 칼레티쿨린은 그의 고능력 칼슘 결합 특성으로 인해 칼슘 결합 단백질로서 거동하는 것으로 생각되는, 세포의 소포체의 고유 단백질인 것으로 간주되어 왔다. 칼레티쿨린은 고친화력, 저능력- 및 저친화력, 고능력-Ca²⁺결합 부위, C-말단 KDEL 소포체 보유 시그날 및 핵 정위 시그날과 같은 많은 다양한 기능적 도메인을 갖고 있다.

칼레티쿨린은 또한 세포의 핵에 존재하며, 히스톤 단백질의 것과 아주 상동성인 일치 핵 정위 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다. 칼레티쿨린은 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 및 핵 호르몬 수용체 매개된 유전자 전달과 관련이 있다.

칼레티쿨린은 또한 인테그린 활성의 조절에 역할을 한다. 칼레티쿨린은 인테그린 서브유닛의 세포질 도메인과 관련이 있다. 인테그린은 세포외 리간드에 대한 세포 부착의 매개자이다. 그것은 생화학적 시그날을 세포 안으로 또한 밖으로 형질도입할 수 있다. 인테그린의 세포질 도메인은 수개의 구조적 및 시그날링 단백질과 상호 작용하며 세포 형태, 고유운동성, 성장 및 분화의 조절에 참여한다. 칼레티쿨린과 인테그린 서브유닛의 세포질 도메인 사이의 상호작용은 세포외 매트릭스에 대한 인테그린 매개된 세포 부착에 영향을 미칠 수 있다.

특정 질환의 제약 및 요법을 계획하는 것을 돕기 위해서는, 칼레티쿨린과 같은 임의의 세포내 단백질의 기능, 및 호르몬 반응을 조절하는데 있어서의 그의 역할을 이해하여야 한다. 또한, 생화학적 시그날, 세포외 칼슘 유입, 세포 부착 및 세포 이동의 인테그린 매개에 있어서의 칼레티쿨린과 같은 단백질의 역할을 이해하여야 한다. 단백질이 결핍된 세포는 그 결핍의 생리학적 효과를 연구하고 결핍을 치료하기 위한 물질을 확인하는데 이용될 수 있다. 단백질의 생성을 활성화시키거나 또는 억제하거나 또는 단백질이 결핍되지 않은 세포내의 단백질의 활성에 영향을 미치는 물질도 또한 확인될 수 있다. 이 물질은 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 및 핵 호르몬 수용체 유도된 유전자 전사를 억제 또는 활성화시키는데 이용될 수 있다. 그것은 생화학적 시그날, 세포외 칼슘 유입, 세포 부착 또는 세포 이동의 인테그린 매개를 억제 또는 활성화시킬 수 있다. 그러한 펩티드 또는 그의 유사체를 포함한 제약은 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 및 핵 호르몬 수용체 유도된 유전자 전사를 억제 또는 활성화시키는데 이용될 수 있다. 그것은 생화학적 시그날, 세포외 칼슘 유입, 세포 부착 또는 세포 이동의 인테그린 매개를 억제 또는 활성화시킬 수 있다. 유전자 요법은 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 및 핵 호르몬 수용체 유도된 유전자 전사를 억제 또는 활성화시키는데 이용될 수 있다. 그것은 또한 생화학적 시그날, 세포외 칼슘 유입, 세포 부착 또는 세포 이동의 인테그린 매개를 억제 또는 활성화시키는데 이용될 수도 있다.

칼레티쿨린의 생리학적 효과를 확인 및 평가하는 연구 수단으로서 이용될 수 있는 칼레티쿨린 결핍 세포를 확인할 필요가 있다. 이 세포는 칼레티쿨린 결핍을 치료할 수 있는 물질을 확인하는데 이용될 수 있다. 이 세포는 또한 칼레티쿨린 생성 및 활성을 활성화 또는 억제하는 물질을 확인하는데 이용될 수도 있다. 이것은 포유동물 세포 내의 호르몬 수용체 유도된 유전자 전사를 조절함으로써 포유동물의 각종 질병, 질환 및 이상 신체 상태를 치료하는 개선된 방법을 유도할 것이다.

종종 "유전자 낙-아웃(knock-out)"으로 불리우는 유전자 표적화 기술의 출현은 발생 및 분화 중의 특별한 유전자 생성물의 역할 및 기능에 대한 상당한 통찰을 가능하게 하였다. 이 기술은 다능성 배(胚) 유래된 간(ES) 세포의 사용에 의존한다. 불활성화 돌연변이는 표적 유전자의 클로닝된 게놈 단편으로 처리되고 이 돌연변이된 유전자는 시험관내에서 배양된 ES 세포에 도입된다. 형질감염된 돌연변이 유전자가 숙주 세포의 게놈에 무작위적으로 가장 빈번하게 통합되긴 하지만, 상동성 재조합(homologous recombination)을 통하여 대응하는 표적화된 염색체 위치에서 돌연변이 유전자를 삽입한 희유 세포의 확인 및 단리를 가능하게 함으로써 표적 유전자의 특징이 없는 대립유전자를 형성하게 하는 강력한 선택 계획이 도모되었다. 이 세포는 착상 전 마우스 배의 포배강으로 현미 주사되고, 그 포배는 양모의 자궁내에 재이식된다. 다른 외피 색을 가진 마우스의 주는 통상적으로 ES 세포 집단 및 수용자 포배에 대해 선택되므로 모피 색을 기준으로 한 잡종 동물의 간단한 확인이 가능하게 된다. 이후에, 역교배 번식은 ES 세포가 잡종 동물의 배아계에 기여하였는지를 결정할 수 있게 한다. ES 세포 배아계 유전을 나타내는 그 자손은 유전자형이어서 계획된 돌연변이를 따르는 동물을 검출하게 된다. 그후에, 이들 이형접합체 자매 세포는 원하는 돌연변이에 대해 동형접합성인 동물을 얻기 위해 이종 교배된다.

본 발명자는 25-히드록시비타민 D 24-히드록실라아제(24-OHase) 유전자를 성공적으로 표적화하였다(St-Arnaud et al. Targeted inactivation of the 24-hydroxylase gene in embryonic stem(ES) cells. Journal of Bone and Mineral Research 9(Suppl 1): S290 (1994)). 표적화된 ES 세포는 외부 설비인 엠알씨 센터 오브 엑설런스 퍼 트랜스제네시스(MRC Centre of Excellence for Transgenesis)를 이용하여 마우스 포배로 주입된다. 형성된 잡종 마우스 중의 하나는 그의 자손으로 표적화된 대립형질을 유전시켰으며, 계획된 돌연변이에 대해 이형접합성인 동물은 정상적으로 수태되었다. 표적화된 24-OHase 돌연변이에 대해 동형접합성인 동물은 25%(36/154)의 예상된 멘델 빈도로 출생하였지만, 동형접합체의 약 ½은 출생 후 1주 내에 죽었다. 본 발명자는 동형접합성 표현형의 불완전한 표현율은 동물의 혼합된 유전적 배경(129 Sv x C57 BI 6)으로 인한 것일 수 있고 그 돌연변이가 일반적으로 동계 교배 129Sv 배경으로 역교배되고 있지 않은가 생각한다. 준비 데이타는 동형접합성 돌연변이체에서 약한 과칼슘혈증을 암시하며; 조직 검사는 정상적인 골격 구조를 밝혀냈다. 생존한 동형접합성 동물은 수태된다. 흥미롭게, 준비 결과는 골격 발달이 동형접합성 암컷의 동형접합체 태생에서 비정상적었다는 것을 암시한다. 이 분석은 무기질 항상성 및 골격 발달에서의 24,25(OH)₂D₃의 생물학적 역할을 가치있게 통찰하게 해야 한다.

칼레티쿨린은 각종 세포 유형에서의 다기능: 칼슘 결합; 인테그린 수용체와의 그의 상호작용을 통한 세포 부착; 및 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합의 변조를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 칼레티쿨린의 이러한 역할의 일부는 칼레티쿨린 및 그의 표적 단백질 사이의 엄격한 화학양론적 관계에 좌우될 수 있다. 하나의 칼레티쿨린 대립유전자의 불활성화는 유전자 투여 효과를 통해 이 화학양론을 변화시키며 이형접합성 마우스의 발생에 영향을 미친다. 칼레티쿨린이 AR, RAR 및 VDR의 작용을 조절하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명자는 이 호르몬의 표적 조직: 부신, 생식선, 폐 및 뼈의 일부의 형태학 및 기능에 주의를 집중하였다. 또한, 인테그린 수용체를 통한 세포 부착이 이형접합성 동물에서 위태로울 때, 그것은 발암 현상의 더 높은 출현율을 나타낸다.

칼레티쿨린 결핍 세포는 칼레티쿨린의 효과를 연구하는 능력을 크게 증가시킬 것이다. 이 세포는 칼레티쿨린 활성 및 생성에 영향을 미치는 물질의 확인을 가능하게 한다. 이 세포는 또한 칼레티쿨린 결핍의 효과를 반전시키는 물질을 확인하는데 이용될 수도 있다. 현재 연구원에게 이용가능한 칼레티쿨린 결핍 세포가 없다. 안정한 칼레티쿨린 결핍 세포가 필요하다. 이상적으로는, 칼레티쿨린 돌연변이에 대해 동형접합성인 세포 및 이형접합성인 세포가 단리될 것이다.

도 1은 배 간(ES) 세포에서의 칼레티쿨린 유전자의 표적화된 불활성화를 나타낸다.

도 1A에서는 야생형 대립유전자, 표적화 벡터 및 표적화된 대립유전자의 구조가 적당한 제한 부위를 따라 표시된다.

도 1B는 하나의 칼레티쿨린 대립유전자가 파괴된 3개의 표적화된 ES 세포 클론을 나타내는 대표적인 서던 블롯을 나타낸다. 이형접합성 클론은 칼레티쿨린 부재 마우스를 발생시키기 위해 마우스 포배로 접종되었다.

도 1C는 '이중 낙-아웃' ES 세포 클론의 서던 블롯을 나타낸다. 두번 표적화된 칼레티쿨린 대립유전자에 별표가 표시되어 있다.

도 1D는 야생형, 이형접합성(하나의 대립유전자가 표적화됨, #34) 및 동형접합성(두 대립유전자가 모두 표적화됨, #29) ES 세포 클론의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 막의 쿠마시 블루 염색은 모든 레인(도시하지 않음)에서 동일한 단백질 하중을 입증하였다.

도 2는 ES 세포 부착의 특징화를 나타낸다.

도 2A는 피브로넥틴, 항-5 1 항체, 라미닌, 비트로넥틴 및 폴리-L-리신에 대한 ES 세포 클론의 부착을 나타낸다. 비어있는 막대, 야생형 세포; 해치를 넣은 막대, 클론 #34(-/+); 속이 빽빽한 막대, 클론 #29(-/-). 삽입: 피브로넥틴 상의 세포의 사진.

도 2B는 피브로넥틴 및 라미닌에 대한 야생형 ES 세포 부착의 억제를 나타낸다. 항혈청은 10 ㎍/㎖로 사용되었다. NRS, 정상 토끼 혈청. 속이 빽빽한 막대, 피브로넥틴에 대한 부착; 해치를 넣은 막대, 라미닌에 대한 부착. A 및 B에서, 평균 및 SEM은 3회 이상의 독립 실험으로부터 누적된다.

도 2C는 야생형 및 클론 #29(-/-) ES 세포의 유량 혈구계산에 의한 세포 표면 인테그린 발현의 정량화를 나타낸다.

도 3은 칼레티쿨린으로의 형질감염에 의한 '낙-아웃' ES 세포 부착의 구제를 나타낸다.

도 3A는 pRC/CMV-칼레티쿨린으로의 형질감염에 의한 ES 세포 클론 #29에서의 칼레티쿨린의 발현을 나타낸다. 4회의 독립적인 형질감염으로부터의 세포 용해질의 웨스턴 블롯은 상응하는 항-피브로넥틴 수용체 블롯과 함께 나타나있다. 레인 1, 야생형 ES 세포 용해질; 레인 2 및 3, 안티센스 칼레티쿨린으로 형질감염된 클론 #29 세포; 레인 4 및 5, 센스 칼레티쿨린으로 형질감염된 클론 #29 세포. 바닥 패널에서, 용해질 ㎍ 당 칼레티쿨린 발현의 농도계 정량화가 나타나있다.

도 3B는 피브로넥틴에 대한 ES 세포 클론 #29 형질감염체의 부착을 나타낸다. 비어있는 막대, 야생형 ES 세포; 해치를 넣은 막대, 안티센스 칼레티쿨린(AS-CRT)에 의해 형질감염된 ES 세포 클론 #29; 속이 빽빽한 막대, 센스 칼레티쿨린(CRT)에 의해 형질감염된 ES 세포 클론 #29. 평균 및 표준 오차는 5회의 독립 실험으로부터 누적된다. CRT 형질감염체의 부착은 AS-CRT 형질감염체의 것 보다 상당히 더 크다(p<0.05).

도 4는 내막 구획내의 칼슘 저장 및 ES 세포내의 인테그린 매개된 시토졸 [Ca²⁺] 과도현상의 평가를 나타낸다.

도 4A는 부착 ES 세포내의 시토졸 [Ca²⁺]를 나타낸다. 표시된 바와 같이, 탑시가르긴(TG, 100 nM) 및 이어서 1 mM 유리 칼슘은 배지에 첨가되었다. 조사에 의해 알아낸 대표적인 것이 나타나있다. 삽입: 모세포(점각된 막대: n=19) 또는 낙-아웃(클론 29, 비어있는 막대: n=15)에서 얻어진 [Ca²⁺]i의 평균 피이크.

도 4B는 표시된 세포가 리조포스파티드산(LPA, 100 nM)에 이어서 탑시가르긴으로 자극된 것을 제외하고는 A에서와 같이 하였다. 삽입: 모세포(점각된 막대: n=18) 또는 낙-아웃 세포(클론 29, 비어있는 막대: n=19)에서 얻어진 [Ca²⁺]i의 평균 피이크..

도 4C는 모세포 및 낙-아웃 ES 세포에서의 시토졸 칼슘 완충력의 비교를 나타낸다. 탑시가르긴에 의해 유도된 피이크 [Ca²⁺]i는 푸라-2의 아세톡시메틸 에스테르 전구체의 표시된 농도로 배양된 세포로 측정되었다.

도 4D는 피브로넥틴(9 야생형 및 9 낙-아웃 세포의 대표) 또는 항-피브로넥틴 수용체 항혈청(16 야생형 및 9 낙-아웃 세포의 대표) 상에 평판 배양된 ES 세포 내의 [Ca²⁺]i의 일시적인 증가를 나타낸다.

도 4E는 도 6에서와 같이 피브로넥틴에 대한 부착 분석을 나타낸다. 표시된 바와 같이, 100 nM LPA 또는 100 nM Tg 및 안티-FNR 항혈청(10 ㎍/㎖)이 첨가되었다. 비어있는 막대, 모세포 ES 세포; 속이 빽빽한 막대, 낙-아웃 ES 세포. 모든 데이타는 3회 이상의 실험의 평균 +/- SEM이다.

도 5는 각 유전자형의 48 배상체를 기록한 2회의 독립 실험의 결과를 나타낸다.

<발명의 요약＞

본 발명은 단리된 칼레티쿨린 결핍 세포로 이루어진다. 본 발명의 세포는 칼레티쿨린의 효과를 연구하는데 이용될 수 있는 칼레티쿨린 결핍 세포에 대한 필요를 충족시킨다. 이 세포는 칼레티쿨린 활성 및 생성에 영향을 미치는 물질의 확인을 가능하게 한다. 이 세포는 또한 칼레티쿨린 결핍의 효과를 반전시키는 물질을 확인하는데 이용될 수도 있다. 그 세포는 안정하다. 본 발명은 칼레티쿨린 돌연변이에 대해 동형접합성인 세포 및 이형접합성인 세포를 포함한다.

그 세포는 배 간세포 또는 배 섬유아세포일 수 있다. 그 세포는 포유동물로부터 단리될 수 있다. 그 세포는 칼레티쿨린 유전자 돌연변이에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다. 본 발명의 한 실시태양에서, 칼레티쿨린 돌연변이는 칼레티쿨린 유전자 출발 부위에서 카세트를 삽입시킴으로써 실행될 수 있다. 그 카세트는 PGKneo 선택 카세트일 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양은 단리된 칼슘 결핍 세포를 이용하여 인테그린 매개된 부착, 인테그린 개시된 시그날링, 인테그린 매개된 세포 이동, 세포외 칼슘의 인테그린 매개된 유입, 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 또는 핵 호르몬 수용체 매개된 유전자 전달에 영향을 미치는 물질을 확인하기 위한 분석이다. 본 발명은 또한 칼슘 결핍 세포를 포함하는, 인테그린 매개된 부착, 인테그린 개시된 시그날링, 인테그린 매개된 세포 이동, 세포외 칼슘의 인테그린 매개된 유입, 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 또는 핵 호르몬 수용체 매개된 유전자 전달에 영향을 미치는 물질을 확인하기 위한 키트로 이루어진다.

그 세포는 이종 유전자로 형질전환 또는 형질감염될 수 있다. 그 세포는 또한 칼레티쿨린 활성에 관련된 유전자, 단백질 또는 다른 화합물을 단리하는데 이용될 수도 있다.

본 발명의 또다른 실시태양은 인테그린 매개된 부착, 인테그린 개시된 시그날링, 인테그린 매개된 세포 이동, 세포외 칼슘의 인테그린 매개된 유입, 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 또는 핵 호르몬 수용체 매개된 유전자 전달에 영향을 미치는 물질을 칼레티쿨린 결핍 세포에 도입하고, 그 세포가 상기 물질의 존재에 의해 영향받는지를 결정하는 것을 포함하는, 상기 물질을 확인하는 방법이다.

본 발명자는 칼레티쿨린 유전자의 하나의 대립유전자가 표적화된 ES 세포 클론을 이미 단리하였다. 이 클론은 팽창되고, 그후에 표준 기술을 이용하여 포배 단계에서 C57BL/6 배로 주입된다. 이 마지막 단계는 상기한 바와 같이(St. Arnaud et al.) 몬트리올 종합 병원에서 엠알씨 센터 오브 엑설런스 퍼 트랜스게네시스 (MRC Centre of Excellence for Transgenesis)에 의해 비용 기준으로 수행된다.

인테그린은 세포외 리간드에 대한 세포 부착의 중요한 매개자이며, 생화학적 시그날을 세포 안과 밖 둘다로 형질도입할 수 있다^1,2. 인테그린의 세포질 도메인은 수개의 구조적 및 시그날링 단백질과 상호 작용하고, 따라서 세포 형태, 고유운동성, 성장 및 분화의 조절에 참여한다³. 칼레티쿨린은 인테그린 서브유닛의 세포질 도메인과 관계가 있으며, 이 상호작용은 세포외 매트릭스에 대한 인테그린 매개된 세포 부착에 영향을 미칠 수 있다는 것이 이미 밝혀졌다^4,5. 본 발명자는 칼레티쿨린 돌연변이 마우스로부터 칼레티쿨린 결핍 배 간(ES) 세포 및 단리된 배 섬유아세포를 발생시켰다. 둘다의 세포 유형에서, 인테그린 발현은 변화되지 않았지만, 인테그린 매개된 부착은 심각하게 손상되었다. cDNA 형질감염에 의한 '이중 낙-아웃' ES 세포 내의 재조합 칼레티쿨린의 발현은 인테그린 매개된 부착을 보호하였다. 야생형 세포에서, 표면 인테그린의 결합은 세포외 칼슘의 유입으로 인해 시토졸 칼슘 농도 ([Ca²⁺]i)의 일시적인 상승을 유도하였다. 이러한 칼슘 과도현상은 칼레티쿨린 결핍 세포에 존재하지 않았다. 대조적으로, 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트- 및 탑시가르긴-감수성인 내막 저장소 내의 칼슘의 양은 두 세포 유형에서 구별될 수 없다. 이 결과는 칼레티쿨린이 인테그린 부착 기능 및 인테그린 개시된 시그날링 둘다의 필수적인 매개자이지만, 그것은 관강 칼슘의 저장에 중요한 역할을 할 수 없음을 증명한다.

그 세포는 칼레티쿨린 결핍의 치료를 위한 또한 칼레티쿨린 발현을 향상 또는 억제하는 세포를 위한 약물을 확인하는데 유용하다. 잠재성 약물 또는 공지된 약물은 약물의 효능을 확인하기 위해 그 세포로 선별 검사될 수 있다. 다른 치료 절차 및 투약량도 그 세포로 시험될 수 있다. 약물에 대한 선별 검사는 당 업계에 공지된 기술에 따라 행해진다. 예를 들면, 잠재성 약물은 다른 투약량으로 세포에 투여될 수 있다. 그후에, 그 세포는 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 세포에 대한 약물의 효과에 대해 분석된다.

실시예 1 - 칼레티쿨린 결핍 배 간세포의 발생

하나의 칼레티쿨린 대립유전자에서 표적화된 ES 세포는 상동성 재조합을 통하여 칼레티쿨린 출발 위치에서 안티센스 배향으로 PGKneo⁶선택 카세트를 삽입함으로써 처리되었다(도 1a)⁷. 다른 선택 카세트 또는 PGKneo 카세트의 변이체도 또한 칼레티쿨린 대립유전자를 표적화하는데 이용될 수 있다. 칼레티쿨린 표적화된 ES 세포를 증가된 G418 농도로 배양하여 칼레티쿨린 돌연변이(이중 낙-아웃)에 대해 동형접합성인 ES 세포를 단리하였다. 이형접합성 및 동형접합성 유전자형은 서던 블롯팅에 의해 증명되었으며(각각 도 1b 및 1c), 특징이 없는 칼레티쿨린 표현형은 칼레티쿨린 항체에 의한 면역블롯팅에 의해 확인되었다(도 1d). 여기에 설명된 연구에 대해 ES 세포의 3가지 클론이 광범위하게 이용되었다: 모세포(WT), 이형접합성 클론(#34) 및 동형접합성 클론(#29).

실시예 2 - ES 세포의 성장 속도

ES 세포 클론의 성장 특성을 10% 혈청을 함유하는 배지에서 평가한 결과 모든 클론이 유사한 성장 속도를 갖는 것을 밝혀냈다(데이타는 나타내지 않음). ES 세포 클론의 부착 능력은 무혈청 조건하에서 피브로넥틴 및 라미닌에 대한 정량적인 세포 부착 분석에 의해 평가하였다. WT 세포는 피브로넥틴 및 라미닌에 부착된 반면, 칼레티쿨린 결핍 세포(클론 #29)의 부착은 이 기질 상에서 상당히 감소되었다(도 2a). 칼레티쿨린 결핍 ES 세포는 또한 안티-알파5 베타1 인테그린 항체에 결합하는 그들의 능력 면에서 손상되었다(도 2a). 이형접합성 클론(#34)는 일반적으로 그의 부착 수준에서 중간이었다. 시험된 클론은 비트로넥틴에 부착되지 않았다(도 2a). GRGDSP 펩티드 및 기능 차단 폴리클로날 항-피브로넥틴 수용체 혈청이 둘다 피브로넥틴에 대한 부착을 억제하고, 라미닌에 대한 세포 부착은 인테그린 6 서브유닛에 대한 모노클로날 항체(GoH3)에 의해 억제되었기 때문에 ECM 단백질에 대한 야생형 ES 세포 부착은 인테그린 매개되는 것이다(도 2b). 세포 부착 사이의 관찰된 차이가 관련 인테그린의 발현의 정도의 차이로 인한 것이 아니라는 것을 확실하게 하기 위하여, 알파₅베타₁, 알파₄, 알파₆및 알파_v베타₃인테그린의 세포 표면 농도를 유량 혈구계산법으로 평가하였다. 시험된 모든 클론은 비슷한 수준의 인테그린 서브유닛을 발현시켰다(도 2c).

실시예 3 - 단리된 칼레티쿨린 결핍 섬유아세포

본 발명자는 또한 칼레티쿨린 결핍된 마우스 배로부터 섬유아세포를 단리할 수 있었다. 낙-아웃 섬유아세포는 알파₅베타₁및 알파_v베타₃의 발현의 정도를 변화시키지 않고 피브로넥틴 및 비트로넥틴에 대한 인테그린 매개된 부착력을 크게 손상시켰다.

실시예 4 - 칼레티쿨린은 ES 세포 내의 인테그린 기능을 조절한다

ES 세포내의 인테그린 기능을 조절하는데 있어서의 칼레티쿨린의 역할을 밝혀내기 위하여, 본 발명자는 1.8 kb 완전 길이 칼레티쿨린 cDNA를 함유하는 pRC/CMV 발현 벡터로의 일시적인 형질감염에 의해 칼레티쿨린 부재 ES 세포(클론 29)에 칼레티쿨린을 도입하였다. 대조용으로서, 안티센스 배향으로 칼레티쿨린 cDNA를 함유하는 pRC/CMV로 형질감염을 실시하였다. 클론 29 형질감염체 내의 칼레티쿨린 발현을 면역블롯팅으로 확인하였다(도 3a). 이 세포는 칼레티쿨린이 발현되지 않은 안티센스 형질감염된 세포에 비해 피브로넥틴에 대한 부착을 상당히 증가시켰음을 증명하였다(도 3b).

실시예 5 - 야생형 및 칼레티쿨린 녹아웃 ES 세포내의 칼슘 조절

칼레티쿨린이 특히 소포체내의 칼슘 시그날링을 조절하는데 관련이 있기 때문에^8-10, 본 발명자는 야생형 및 칼레티쿨린 '낙-아웃' ES 세포내의 칼슘 조절을 조사하였다. 모세포 및 칼레티쿨린 결핍 세포의 휴면 [Ca²⁺]i 수준은 비슷하였다. 더욱 중요하게는, 소포체내에 저장된 칼슘의 척도인, 무 Ca²⁺배지에 채워진 세포로의 탑시가르긴의 첨가에 의해 유도되는 시토졸 [Ca²⁺] 과도현상은 또한 두 세포 유형에서 구분될 수 없었다(도 4a). 세포외 칼슘의 이후의 첨가는 시토졸 [Ca²⁺]를 상당히 계속하여 증가시켰다(도 4a). 내막 저장소의 부족에 반응하는 플라스말레말 채널의 개방에 기인하는 이러한 증가는 야생형 및 칼레티쿨린 결핍 세포에서 비교되는 정도였다(도 4a). 두 세포 유형의 시토졸 칼슘 완충력(외생 칼슘 킬레이터의 투여량을 달리하며 시토졸을 부하시킴으로써 결정됨¹¹)이 비슷하였기 때문에(도 4c), 이러한 발견은 칼레티쿨린이 원형질 막을 통한 시그날 용량성 칼슘 유입에 필요하지 않으며 그것이 ES 세포의 소포체 내의 관강 칼슘 저장에 결정적이지 않다는 것을 의미한다.

실시예 6 - InsP₃-감수성 저장소로부터 칼슘의 저장 및 가동에 있어서의 칼레티쿨린의 역할

칼레티쿨린은 제노퍼스(Xenopus) 난모세포에서의 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트(InsP₃) 매개된 칼슘 시그날링을 조절할 수 있는 것으로 보고되어 있다⁹. InsP₃-감수성 저장소로부터 칼슘의 저장 및 가동에 있어서의 칼레티쿨린의 역할을 더욱 특별하게 조사하기 위하여, 본 발명자는 포스포리파아제 C의 이종삼합체 G-단백질 매개된 활성화를 통해 InsP₃방출¹²을 유도하는 리조포스파티드산(LPA, 100 nM)으로 ES 세포를 챌린지시켰다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 무 Ca²⁺배지내의 세포에 첨가될 때, LPA는 빠른 [Ca²⁺]i 과도현상을 유도하였다. 이 과도현상의 크기는 모세포 및 클론 29 세포에서 구분될 수 없었다(도 4b). 탑시가르긴의 이후의 첨가는 도 4a에 보고된 것 보다 상당히 더 적은 최종적인 Ca²⁺방출의 제2의, 더 적은 폭발을 유도하였다. 이러한 관찰은 LPA에 의해 부족하게 된 저장소가 탑시가르긴-감수성 구획의 부분집합을 나타냄을 암시한다. LPA 후에 탑시가르긴에 의해 방출된 Ca²⁺의 양은 또한 모세포 및 칼레티쿨린-부재 세포에서 크게 다르지 않았다(도 4b). 이러한 발견은 칼레티쿨린이 초기의 InsP₃-감수성 Ca²⁺방출에 필요하지 않음을 암시하는 것이며, 클론 29 세포 내의 Ca²⁺방출의 감소 상이 ES 세포에서 보다 더 느린 것 같긴 하지만(도 4b), 이것이 시험된 모든 세포에서 일치하는 것으로 밝혀지지는 않았다. 본 발명자의 발견은 브래디키닌에 대한 Ca²⁺반응이 칼레티쿨린 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 하향 조절의 결과로서 감소된다는 이전의 보고와 대조적이지만¹³, 본 발명자의 데이타는 ER 내의 Ca²⁺저장 및 InsP₃-매개된 Ca²⁺방출이 칼레티쿨린의 부재에 의해 영향받지 않음을 분명하게 입증한다. 본 발명자의 발견이 칼레티쿨린의 농도가 InsP₃-감수성 Ca²⁺방출의 초기 피이크에 영향을 미치지 않음을 발견한 바스티아누또(Bastianutto) 등의 발견¹⁴과 부분적으로 일치하긴 하지만, 이들 연구자들은 Ca²⁺의 이후의 변동은 칼레티쿨린의 과발현에 의해 영향받을 수 있음을 발견하였다. 본 발명자의 결과는 또한 InsP₃-매개된 Ca²⁺방출이 칼레티쿨린에 의해 조절될 수 있지만, 칼레티쿨린의 이 기능이 Ca²⁺를 저장하는 그의 능력과 연관이 없으므로 단순한 격리를 넘어선 Ca²⁺대사에서의 칼레티쿨린에 대한 '시그날링' 기능을 제시함을 발견한 카마초(Camacho) 및 레클리터(Lechleiter)⁹의 결과와 일반적으로 일치한다.

인테그린 매개된 세포 확산을 수반하는 것으로 보고된 초기의 반응 중의 하나는 Ca²⁺유입의 자극이다^15,16. 칼레티쿨린 결핍 ES 세포가 ECM 기질 상으로의 정상적인 부착 및 확산을 경험하지 못하였므로, 본 발명자는 항-알파₅베타₁인테그린 항체로 또는 피브로넥틴으로 코팅된 커버 유리와 상호작용할 때 푸라-2-부하된 세포의 형광을 모니터하여 인테그린 매개된 칼슘 시그날링을 조사하였다(도 4d). 연구된 대부분의 야생형 세포에서, 표면 인테그린의 결합은 원질 상의 세포의 분명한 확산에 의해 종종 수반되는 시토졸 [Ca²⁺]의 상승(예를 들면, 도 4d)을 유도하였다. 이러한 상승은 주로 세포외 Ca²⁺의 유입으로 인한 것인데, 그 이유는 세포가 무 Ca²⁺배지에서 부착되었을 때(n=12, 데이타는 나타내지 않음) 그것이 배출되었기 때문이다. 대조적으로, 칼레티쿨린 부재 세포의 대부분은 확산되지 못하였고 시토졸 [Ca²⁺]에서의 검출가능한 변화를 나타내지 않았다(도 4d).

인테그린 리간드 결합 직후의 시토졸 [Ca²⁺]의 일시적인 증가는 정상적인 수용체 점유후 이벤트(예를 들면, 결합성의 증가, 세포체질 재구성)의 중요한 부분임을 상상할 수 있다. 이 가능성을 시험하기 위하여, 본 발명자는 칼레티쿨린 부재 세포내의 인테그린 '아웃사이드-인' 시그날링에서의 다운-스트림 이벤트의 자극이 부착 결함을 보상할 수 있는지를 시험하였다. 본 발명자는 칼레티쿨린 낙-아웃 세포를 100 nM LPA로 처리하였을 때 피브로넥틴에 대한 그의 부착력이 상당히 회복되었음을 발견하였다(도 4e). 도 4에 나타내지는 않았지만, LPA에 대한 반응은 투여량 의존적이었다. 칼레티쿨린 -/- 세포가 탑시가르긴으로 처리되었을 때 유사한 결과가 얻어졌다(도 4e). 이 결과들은 함께 어쩌면 시토졸 [Ca²⁺] 단독의 일시적인 증가를 통해 인테그린 점유의 세포내 시그날링에서의 다운-스트림 이벤트의 자극이 칼레티쿨린 의존적인 부착력의 상실을 보상할 수 있음을 의미한다.

실시예 7 - 칼레티쿨린 결핍된 배 간세포의 손상된 분화

배 간(ES) 세포는 조혈, 신경외배엽 및 심근세포를 포함한, 시험관내의 수개의 계통을 따라 분화하도록 유도될 수 있다(30). 심장 근육 세포의 적당한 분화에서의 다기능성 단백질인 칼레티쿨린의 관련을 확인하기 위하여, 본 발명자는 칼레티쿨린 유전자의 두 대립유전자가 결핍된 ES 세포주를 사용하였다(31).

이형접합체 및 돌연변이 동형접합체 세포는 1% 디메틸 술폭시드(DMSO)의 존재하에 현적 배양액에서 배상체로서 그것을 배양시킴으로써 심근세포로 분화되도록 유도되었다(33). 현적 배양액에서 5일 후에, 배상체를 DMSO 없이 배양 등급 멀티웰 평판 상에서 개별적으로 다시 평판 배양하고, 5일 후(배양 개시로부터 10일)에 수축 심근세포의 존재에 대해 기록하였다.

도 5는 각각의 유전자형의 48 배상체를 기록한 2회의 독립 실험의 결과를 나타낸다. 칼레티쿨린이 결핍된 ES 세포(-/- 유전자형)는 심근세포의 박동 중심으로 분화하는 그의 능력이 크게 손상되었다(각각, 34 ± 5% 대 67 ± 6% - 평균 ± -/- 및 +/-의 SEM). 이 결과는 크게 감소된 수의 심근세포에 의한 이상 심장 발달을 포함하는 칼레티쿨린 결핍 마우스의 관찰된 표현형과 일치한다(데이타는 나타내지 않음).

따라서, 칼레티쿨린 결핍 ES 세포는 심장 발달의 분자 결정 인자를 이해하는 것을 목표로 하는 연구에서 유용한 실험 시스템이다. 심근 세포 괴사에 의한 심장 근육의 상실이 심기능부전을 일으킬 때 심근세포는 마지막에는 분화된 세포이며, 따라서 재생될 수가 없다. 심장 세포 분화와 관련된 분자 경과의 이해는 유전자 요법 또는 약리학적 조정에 의해 인체 심근을 재생시키기 위한 미래의 노력에 중요할 것이다. 심근세포 생존을 조절하는 것을 목표로 하는 약물을 칼레티쿨린 결핍 세포의 시스템으로서 시험하였다. 이 세포는 심장 근육 세포로 분화하는 능력면에서 이미 손상되었기 때문에, 그것은 심근세포의 분화, 성장 또는 생존을 증가시킬 수 있는 약물의 효능을 시험하기 위한 실험적 모델을 제공한다. 또한, 유전자 요법을 위한 벡터는 칼레티쿨린 결핍 배 간세포의 심근 세포로의 분화를 개선시키는데 대한 그의 효과에 대해 시험될 수 있다.

실시예 8 - 칼레티쿨린 결핍 간세포로부터 유래된 신경외배엽 세포의 손상된 이동

본 발명자는 칼레티쿨린 결핍 배 간세포가 인테그린 수용체를 통한 결함이 있는 시그날링을 나타냄을 밝혀냈다. 다른 기능 중에서, 인테그린은 세포 이동과 관련이 있다. 그러므로, 본 발명자는 칼레티쿨린 결핍 간세포로부터 유래된 분화된 세포가 조직 배양 등급의 플라스틱 원질 상으로 이동하는 능력을 시험하엿다.

간 세포는 인듀서의 부재하에 현적 배양액에서 4일 동안 배양시키고, 이어서 추가의 4일 동안 0.5 μM 레틴산으로 현적을 처리함으로써 신경외배엽 계통을 따라 분화되었다. 배상체를 약한 트립신 처리로 해리시키고 조직 배양 등급의 접시 상에서 평판 배양하였다. 전면 배양액(신경 및 교 세포를 포함함)을 피펫 팁으로 자국을 남기고 그 자국에 걸친 세포의 이동을 현미경으로 모니터하였다. 칼레티쿨린 결핍 간세포로부터 유래된 세포는 자국의 갭에 걸쳐 이동하는 능력면에서 일치되게 손상되었다. 경계가 정해진 원질(피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌 등) 상을 이동하는 세포의 능력을 분석하였다. 이동은 원질 의존 방식으로 영향받는다.

그 결과는 칼레티쿨린 단백질의 부재하에 손상된 인테그린 수용체 기능의 본 발명자의 이전의 발견을 지지하는 것이다.

칼레티쿨린은 소포체내의 기능을 조절하는 칼슘으로 지정된 철저하게 연구된 단백질이며^8,9또한 세포질, 핵 및 세포외 구획내의 단백질과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다^17-20. 여기서, 본 발명자는 현재 칼레티쿨린의 세포 기능에 대한 약간의 새로운 통찰력을 제공한다. 본 발명자는 다음과 같이 결론지었다: 1) 칼레티쿨린은 세포외 매트릭스 기질에 대한 정상적인 인테그린 매개된 부착에 필수적이고, 2) 칼레티쿨린의 칼슘 저장 기능을 필수적이지 않으며, 3) 칼레티쿨린의 결핍은 어쩌면 인테그린 매개된 세포 부착의 상실에 기여하는, 세포외 Ca²⁺의 인테그린 매개된 유입을 교란시킨다. 이러한 세번째 결론에 관해서, 칼레티쿨린 부재 세포에서 인테그린 리간드 결합 자체는 손상되지 않지만 감소된 부착력은 Ca²⁺유입과 같은 초기 다운스트림 시그날의 혼란으로부터 이어질 수 있다. LPA가 칼레티쿨린의 결핍을 보상할 수 있다는 본 발명자의 발견은 이러한 개념을 지지한다. 칼레티쿨린이 빈쿨린의 발현 수준의 변화를 통해 세포 부착에 영향을 줄 수 있다는 다른 사람의 보고가 있긴 하지만²¹, 본 발명자는 야생형 또는 칼레티쿨린 -/- ES 세포내의 빈쿨린 발현 수준에서 차이가 없음을 확인하였다. 오히려, 본 발명자는 이제 칼레티쿨린이 인테그린 매개된 아웃사이드-인 시그날링에서의 초기 이벤트를 포함하여, 몇가지 인테그린 수용체의 정상적인 기능에 필수적인 역할을 함을 확증하였다. 칼레티쿨린 부재 세포는 또한 스테로이드 호르몬 수용체 기능의 조절과 같은 칼레티쿨린의 다른 가정된 역할의 연구에 유용할 것이다^22-24.

재료 및 방법

표적화 벡터

완전 길이 1.9 kb 인간 칼레티쿨린 cDNA²⁵를 129 Sv 주(Stratagene Corp.)의 DNA로부터 작제된 라이브러리로부터 14 kb 마우스 칼레티쿨린 게놈 클론을 단리하기 위해 프로브로서 사용하였다. PGKneo 선택 카세트²⁶를 평활 말단 클로닝에 의해 해독 출발 부위의 바로 다운스트림인 특유의 Sfi I 부위에서 대향 배향으로 삽입하였다. 그후에, PGKtk 카세트²⁶를 5'-Hind III 부위에서 클로닝하였다. 결과의 표적화 벡터는 짧은 팔 상의 상동 서열의 2 kb 및 긴 팔 상의 상동 서열의 5 kb를 특징으로 하였다(도 1a).

ES 세포 배양 및 형질감염

R1 ES 세포주를 호간(Hogan) 등²⁷에 의해 설명된 바와 같이 배양시키고 전기천공시켰다. 다른 문헌에 설명된 바와 같이²⁷8일 후에 콜로니를 선택 배지 내에 집어넣고 팽창시켰다. 표적화된 대립유전자에 대해 동형접합성인 세포를 단리하기 위하여, 이형접합성 클론 2F(클론 #34)를 4 ㎎/㎖ G418내의 공급 세포 상에서 성장시켰다²⁸. 9일 후에 내성 콜로니를 고농도 선택 배지내에 집어넣었다. 동형접합성 돌연변이 ES 세포내의 칼레티쿨린의 발현을 얻기 위하여, 센스 또는 안티센스 배향의 1.8 kb 완전 길이 칼레티쿨린 cDNA를 함유하는 pRC/CMV 발현 벡터²³를 제조업자의 지시(Gibco/BRL)에 따라 리포펙틴을 이용하여 ES 세포 클론 #29로 일시적으로 형질감염시켰다.

서던 블롯 분석

DNA를 이미 설명한 바와 같이²⁷배양된 세포로부터 단리하고 Bam HI-분해물의 서던 블롯팅에 의해 표적화된 위치에서 완전성에 대해 시험하였다. 사용된 프로브는 표적화 벡터의 상동 영역의 바로 다운스트림에 위치한 1 kb Xba I 게놈 단편이었다.

인테그린 발현의 부착 검정 및 분석

무혈청 부착 검정은 다른 문헌에 기재되어 있다⁵. 0.5-1 ㎎/㎖ GRGDSP 또는 GRGESP 펩티드(Gibco/BRL), 10 ㎍/㎖ 토끼 항-피브로넥틴 수용체(Gibco/BRL) 또는 10 ㎍/㎖ 쥐 항-알파₆(GoH3, AMAC, Inc.)를 표시된 곳에 첨가하였다. 인테그린 발현의 유량 혈구계산 분석을 위하여, 1x10⁶세포를 PBS/0.1% 소듐 아지드/2.0% 태내 소 혈청 중의 1차 항체; 항-FNR, 항-VNR(Gibco/BRL), 항-알파₈(GoH3) 또는 항-알파₄ ²⁹와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 그후에 2차 항체; FITC-콘쥬게이트된 염소 항-토끼 또는 FITC-콘쥬게이트된 염소 항-쥐(Jackson ImmunoResearch)와 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS/1.0% 파라포름알데히드에 고정시키고, 펠릿화하고, PBS에 재현탁시키고 FACScan 상에서 분석하였다(Becton Dickinson Immunocytometry Systems).

시토졸 칼슘 측정

시토졸의 유리 칼슘을 측정하기 위하여, 세포를 37 ℃에서 20분 동안 전구체 아세톡시메틸 에스테르 0.5-10 μM와 함께 인큐베이션시켜 푸라-2로 부하시켰다. 12 비트 A/D 보드(Labmaster, National Instruments)를 통해 386 컴퓨터(NEC)에 사이틀로 접속된 100W 크세논 램프, 셔터/회전 거울/광학 섬유 어셈블리(RatioMaster, Photon Technologies), 플루오르 40x/1.3 유침 대물렌즈 및 고감도 광도계(D-104, PTI)가 장치된 니콘 디아포트 티엠디(Nikon Diaphot TMD) 현미경(Nikon Canada) 상에서 푸라-2 형광비 측정을 수행하였다. 세포를 340 ㎚ 및 380 ㎚에서 교대로 여기시키고 510 ㎚에서 발광을 기록하였다. 오스카 소프트웨어(PTI)를 이용하여 10 Hz에서 광도계 데이타를 얻었다. 현미경에 장파장 트랜스조명 (＞620 ㎚)을 위한 단리 광원, 580 ㎚ 발광 색선별 거울 및 단리 비데오 카메라(MTI 72, Dage-MTI)를 장치하여 형광 측정 동안에 세포의 연속적인 호프만-강화된 가시화를 가능하게 하였다. 푸라-2 농도를 증가시키며 부하시킨 세포내의 칼슘 과도현상의 정도를 측정하여 시토졸 칼슘 완충력을 평가하였다¹¹. 푸라-2의 세포내 농도를 등흡광 파장(360 ㎚)에서 측정하고 표준과 비교하였다. 달리 명시되어 있지 않으면, 시토졸 [Ca²⁺]의 모든 측정치는 무 Ca²⁺배지에서 이루어졌다. 인테그린 매개된 Ca²⁺유입을 평가하기 위하여, 커버 유리를 폴리클로날 항-알파5 베타1 항혈청으로 또는 피브로넥틴(각각 10 ㎍/㎖)으로 코팅하였다. 1 mM Ca²⁺를 함유하는 배지에서, 현탁된 ES 세포를 [Ca²⁺]i로서 커버 유리 상에 침강시키고 세포 형태를 연속적으로 동시에 모니터하였다. 단세포와 코팅된 커버 유리와의 접촉시에 조사를 개시하였다.

본 발명은 그의 실시를 위한 바람직한 형태를 포함하기 위하여 본 발명자에 의해 발견되거나 또는 제안된 특별한 실시태양 면에서 설명되었다. 본 발명의 명세서의 관점에서 본 발명의 의도된 영역으로부터 벗어나지 않고 예시된 특별한 실시태양에서 수많은 변형 및 변화가 이루어질 수 있음을 당업계의 숙련인은 이해할 것이다. 그러한 모든 변형은 첨부된 청구 범위의 영역내에 포함되는 것으로 계획된다. 예를 들면, 그 설명은 당업계의 숙련인이 다른 조직으로부터 얻은 칼레티쿨린 부재 세포의 다른 유형을 어떻게 확인하고 단리하는지를 증명한다.

모든 공보, 특허 및 특허 출원은 개개의 공보, 특허 또는 특허 출원이 전체적으로 참고로 인용되도록 특별하게 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 전체적으로 참고로 본 명세서에 인용되었다.

<참고 문헌＞

하기 목록의 서류들은 본 명세서에 이용된 방법, 기술 및(또는) 조성물을 보충하거나, 설명하거나, 그에 대한 배경을 제공하거나 또는 교시하는 정도로 참고로 본 명세서에 인용되어 있다.

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33. Rudnicki, M.A., and M.W. McBurney. 1987. Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinomal cell lines. In: Robertson, E.J., ed., Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford, pp. 19-49.

Claims

단리된 칼레티쿨린-결핍 세포.
제1항에 있어서, 세포가 배 간세포 또는 배 섬유아세포인 세포.
제1항에 있어서, 세포가 포유동물로부터 단리된 것인 세포.
제1항에 있어서, 세포가 칼레티쿨린 유전자 돌연변이에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 세포.
제4항에 있어서, 칼레티쿨린 돌연변이가 칼레티쿨린 유전자 출발 부위에 카세트를 삽입시킴으로써 실행되는 것인 세포.
제5항에 있어서, 카세트가 PGKneo 선택 카세트인 세포.
제1항의 세포를 포함하는, 인테그린 매개된 부착, 인테그린 개시된 시그날링, 인테그린 매개된 세포 이동, 세포외 칼슘의 인테그린 매개된 유입, 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 또는 핵 호르몬 수용체 매개된 유전자 전달에 영향을 미치는 물질을 동정하기 위한 분석 방법.
제1항의 세포를 포함하는, 인테그린 매개된 부착, 인테그린 개시된 시그날링, 인테그린 매개된 세포 이동, 세포외 칼슘의 인테그린 매개된 유입, 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 또는 핵 호르몬 수용체 매개된 유전자 전달에 영향을 미치는 물질을 동정하기 위한 키트.
제1항에 있어서, 이종 유전자로 형질전환 또는 형질감염된 세포.
제1항에 있어서, 칼레티쿨린 활성에 관련된 유전자, 단백질 또는 다른 화합물을 단리하는데 사용하기 위한 세포.
인테그린 매개된 부착, 인테그린 개시된 시그날링, 인테그린 매개된 세포 이동, 세포외 칼슘의 인테그린 매개된 유입, 핵 호르몬 수용체에 의한 DNA 결합 또는 핵 호르몬 수용체 매개된 유전자 전달에 영향을 미치는 물질을 제1항의 세포에 도입하고, 그 세포가 상기 물질의 존재에 의해 영향받는지를 결정하는 것을 포함하는, 상기 물질의 동정 방법.