KR20010015915A

KR20010015915A - 증강된 유전자 송달을 위한 핵산과 혈관작용제의 조합

Info

Publication number: KR20010015915A
Application number: KR1020007008781A
Authority: KR
Inventors: 커크해몬드에이취.
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 1998-02-11
Filing date: 1999-02-09
Publication date: 2001-02-26
Also published as: EA019099B1; EP1695719A1; CA2320302A1; JP2002502885A; CN101186928A; CN100350979C; WO1999040945A3; AU2663799A; NZ545047A; WO1999040945A2; EA200000828A1; EP1053025A2; ZA991102B; CN1301181A; IL137765A0

Abstract

트랜스유전자-삽입된 벡터는, 바람직하게는 벡터의 송달 전이나 벡터의 송달과 동시에 동맥안으로 주입되는 혈관작용제와 조합하여, 표적화된 조직을 배급하는 동맥안으로 그 벡터를 직접적으로 주사함으로써, 말초혈관질환, 심질환 및 다른 질환을 위한 생체내 유전자 요법을 위하여 효과적으로 사용된다.

Description

증강된 유전자 송달을 위한 핵산과 혈관작용제의 조합{COMBINATION OF A NUCLEIC ACID AND A VASOACTIVE AGENT FOR ENHANCED GENE DELIVERY}

미국에 관상동맥심질환을 가진 천백만명의 성인을 포함하여 심혈관질환을 가진 약 6천만명의 성인이 있다는 것이 미국심장학회(American Heart Association)(1995 통계적인 보충)에 의하여 보고되었다. 심혈관질환은, 미국내의 연간 거의 1백만명의 사망에 대하여 책임을 지는데, 이것은 모든 사망의 40% 이상을 나타낸다. 1995년에 미국에 있는 150만명의 성인이, 가슴통증이 생기게하는 일시적인 주기의 심근허혈을 경험하여 협심증의 진단을 받았다. 약 350,000개의 협심통의 새로운 증례가 미국에서 매년 발생한다.

심근허혈은, 심근이 적당한 혈액 공급을 받지 않아서 필수적인 수준의 산소와 영양분이 없을 때 발생한다. 심근허혈의 가장 흔한 원인은 죽상경화증인데, 이것은 혈류를 심근에 제공하는 혈관(관상동맥)에서 차단을 일으킨다. 본 치료법에는, 약리학적인 요법, 관상동맥 우회로(bypass) 수술 및, 풍선혈관형성술과 같은 기술을 이용한 경피의 재혈관화가 포함된다. 표준적인 약리학적인 요법은, 심근으로의 혈액 공급을 증가시키거나 산소와 영양분에 대한 심근의 수요을 감소시키는 것을 포함하는 전략에 입각한다. 심근층으로의 증가된 혈액 공급은 칼슘 채널 차단제 또는 니트로글리세린과 같은 약제에 의하여 이루어진다. 이 약제들은, 동맥의 벽에 있는 평활근의 이완을 일으킴으로써 병에 걸린 동맥의 지름을 증가시킨다고 생각된다. 산소와 영양분에 대한 심근의 감소된 수요는, 동맥 혈관확장제와 같이 심장상의 혈행역학적 부담을 감소시키는 약제 또는 베타-아드레날린성 수용체 길항제와 같이 주어진 혈행역학적 부담에 대한 심장의 수축성 반응을 감소시키는 약제에 의하여 이루어진다. 허혈성 심질환의 외과요법은, 전략적으로 배치된 우회로 이식편(보통, 복재정맥 또는 유방동맥 이식편)을 이용한 병에 걸린 동맥 분절의 바이패스에 기초한다. 경피 재혈관화는, 병에 걸린 관상동맥에서의 폭줄임을 감소시키기 위한 도자 (catheters)의 사용에 기초한다. 이 모든 전략들은 허혈성 발작(episodes)의 수를 감소시키거나 허혈성 발작을 근절하기 위하여 사용되지만, 모두가 다양한 한계를 가진다.

예비 보고서는, 심근허혈을 치료하기 위하여 맥관형성 단백질이나 펩티드의 직접적인 주사를 통하여 심장에 새로운 혈관을 발달시키는 것을 설명한다. 섬유아세포 성장인자(FGF) 패밀리의 몇몇 일원들(즉, 산성의 섬유아세포 성장인자, aFGF; 염기성의 섬유아세포 성장인자, bFGF; 섬유아세포 성장인자-5, FGF-5 및 다른 것들)이 성장과 발생동안 맥관형성의 조절에 연관되어 왔다. 성숙한 동물에서의 맥관형성을 촉진하는데 있어 aFGF 단백질의 역할은, 예를 들어 최근의 보고서의 주제이다. 그것은, 성숙한 래트의 복강내에 배치된, 콜라겐-코팅된 기질내의 aFGF 단백질이 잘 혈관화되고 정상적으로 관류된(perfused) 구조를 생기게 했다는 것을 설명한다 (Thomson, 등, PNAS 86:7928-7932, 1989). 전하는 바에 의하면, 관상동맥폐색증인 동안 성숙한 개과의 관상동맥안으로 bFGF 단백질을 주사하는 것이 감소된 심근의 기능장애, 보다 작은 심근경색, 및 위험한 층에서의 증가된 혈관질(vascularity)에 이르게 하였다(Yanagisawa-Miwa, 등, Science 257:1401-1403, 1992). 유사한 결과들이 bFGF 단백질을 이용한 심근허혈의 동물 모델에서 보고되어 왔다(Harada, 등, J Clin Invest 94:623-630, 1994, Unger, 등, Am J Physiol 266:H1588-H1595, 1994).

그러나, 이 단백질들을 이용하여 맥관형성의 효과를 달성하기 위한 필요조건은 그 단백질의 반복되거나 장기간의 송달의 필요성이었는데, 이것이 임상적인 배경에서 맥관형성을 자극하기 위하여 이 단백질들을 사용하는 효용을 제한한다. 바꾸어 말하면, 인간에서의 성공적인 요법은 하나이상의 이러한 맥관형성 펩티드나 단백질의 지속적이고 장-기간의 주입을 필요로 할 것인데, 이 펩티드나 단백질은 그자체로서 금지나 다름없이 과중하게 비싸고 관상동맥안에 배치된 도자에 의하여 송달될 필요가 있어서 치료의 비용과 어려움을 추가적으로 증가시킬 것이다.

최근에, 다양한 출판물이, 유전자 전달의 사용에 근거하여 심질환을 포함하는 질환의 치료와 예방을 가정해왔다. 예를 들어, Mazur 등, "Coronary Restenosis and Gene Therapy," Molecular and Cellular Pharmacology, 21:104-111, 1994; French, "Gene Transfer and Cardiovascular Disorders," Herz 18:222-229, 1993; Williams, "Prospects for Gene Therapy of Ischemic Heart Disease," American Journal of Medical Sciences 306:129-136, 1993; Schneider와 French, "The Advent of Adenovirus: Gene Therapy for Cardiovascular Disease," Circulation 88:1937-1942, 1993을 참고하라. 또하나의 출판물, "Adenovirus-Mediated Gene Transfer to Cardiac and Vascular Smooth Muscle,"이라는 제목의 Leiden 등, 국제특허출원 번호 PCT/US93/11133은 심장 혈관의 평활근 세포에서의 기능을 조절할 목적으로 아데노바이러스-매개된 유전자 전달의 사용에 대하여 보고한다. Leiden 등은, 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합체 아데노바이러스가 심장의 또는 혈관의 평활근 세포로 송달될 수 있고 그 유전자 산물이 발현될 때까지 그 세포가 유지될 수 있음을 설명한다. Leiden 등에 의하면, 근세포 기능은 유전자의 전사를 변화시킴으로써 조절되고 폴리뉴클레오티드나 폴리펩티드와 같은 유전자 전사 산물의 생산에 있어서 변화한다.

아데노바이러스 및 다른 벡터를 이용한 심장과 같은 기관으로의 성공적인 유전자 전달에는 방해물이 있다. 예를 들어, 신속하게 분열하는 세포집단안으로 트랜스유전자를 삽입하는 것은 트랜스유전자 발현의 지속기간을 실질적으로 감소시킬 것이다. 그런 세포의 예에는, 모든 혈관의 안쪽 층을 구성하는 내피세포, 및 심장 전체에 걸쳐서 퍼져있는 섬유아세포가 포함된다. 원하는 세포가 트랜스유전자를 받아서 발현하고 그 트랜스유전자가 전신에 분배되지 않도록 트랜스유전자를 표적화하는 것(targetting)도 역시 결정적으로 중요한 고려사항이다. 만약 이것이 성취되지 않는다면, 트랜스유전자의 전신성 발현과 거기에 따르는 문제들이 생길 것이다. 예를 들어, 간에서의 아데노바이러스-매개된 유전자 전달후 염증 침윤물이 상세히 기록되어 왔다(Yang, 등 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 91:4407, 1994).

본원에서 설명되고 청구된 발명은 이전 기술과 연관된 이 문제와 다른 문제를 제기하고 극복한다. .

본 발명은 유전자 요법, 더욱 명확히 말하면, 바이러스-매개된 형태의 유전자 요법 및 다른 형태의 유전자 요법에 관한 것이고, 아데노 바이러스 구성체를 포함하는 일정한 벡터 구성체 및 원하는 유전자의 송달에 유용한 기술에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 심장에서의 맥관형성의 촉진에 유용한 유전자의 벡터-매개된 송달에 관한 것이고, 말초혈관질환 및 심근허혈을 포함하는 심장의 질환 및 다른 질환을 그러한 벡터와 유전자 송달 기술을 이용하여 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

도 1은 아데노바이러스를 암호화하는 트랜스유전자의 구출 재조합 구성 (rescue recombination construction)을 보여주는 도식적인 그림이다.

도 2는, lacZ(대조표준 유전자) 및 FGF-5를 이용한 유전자 전달전 및 14±1일후 확장말기의 벽 두께(EDWTh) 및 수축말기의 벽 두께(ESWTh)를 측정함으로써 계산되는, 우심방 조율(right atrial pacing)(HR=200 bpm)동안의 허혈성 층에서의 퍼센트 벽 농후화(%WTh)를 보여준다. 허혈성 층에서의 기능은 FGF-5를 이용한 전달후에 2.6-배 증가되었지만(p=0.0001) 대조표준 유전자에 의해서는 영향을 받지 않았다.

도 3은, lacZ(대조표준 유전자) 및 FGF-5를 이용한 유전자 전달전 및 14±1일후 심방 조율(200 bpm)동안 컴퓨터-기초의 비데오 분석 프로그램을 이용한 비데오 영상으로부터 측정된, 심실간중격(IVS)에서의 피크 비데오 강도에 의하여 나누어진 허혈성 영역(LCx층)에서의 피크 비데오 강도의 비율로서 표현되는 피크 대비율(혈류의 상관물)를 보여준다. 허혈성 층으로의 혈류는 FGF-5를 이용한 유전자 전달후에 정상보다 2-배 증가되었지만(p=0.0018) 대조표준 유전자를 이용한 후에는 정상의 50%로 남아있었다.

도 4는 심근의 조영심초음파사진(제시않됨)에 상응하는 그림을 보여준다. 흰 구역은 조영증강(보다 많은 혈류)을 나타내고 어두운 구역은 감소된 혈류를 나타낸다. 도 4a는 정상적인 돼지에서의 급성 LCx 폐색을 보여주고, 도 4b는 lacZ 유전자 전달 14±1일후를 보여주고, 도 4c는 FGF-5를 이용한 유전자 전달 14±1후를 보여준다.

도 5는 FGF-5 및 lacZ를 이용한 유전자 전달후 허혈성 영역과 비허혈성 영역에서 현미경 분석을 함으로써 정량화된 섬유 수에 대한 모세혈관 수의 비율을 보여준다. FGF-5 유전자 전달후에 맥관형성이 증가되었다(p<0.038).

발명의 개요

본 발명은, 다른 질환은 물론, 심근허혈과 같은 심질환 및 말초혈관질환의 치료에 있어서 유용한 유전자 치료법 접근방법으로 향해지고, 이 유전자 치료에서 유전자 요법 벡터가 혈관내 송달에 의하여 도입된다. 본 발명의 한 목적은 심질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것인데, 이 방법에서 맥관형성 단백질 또는 펩티드를 위한 유전자를 포함하는 벡터 구성체, 바람직하게는 복제-결함있는 아데노바이러스 구성체가, 관내(intracoronary) 주사를 통하여, 바람직하게는 하나 또는 둘 다의 관상동맥 또는 하나이상의 복재정맥 또는 내부의 유방동맥 이식편의 소공을 넘어 실질적으로(전형적으로 적어도 약 1cm) 도입된 도자에 의하여 송달되도록 하여, 심장을 표적화함으로써 지속적인 주기동안 계속적으로 심근층에서 치료상으로 의미있는 정도까지 맥관형성 단백질 또는 펩티드(FGF-5 또는 FGF-4와 같은)가 생산된다. 그러므로, 하나의 관상도맥 또는 이식동맥안으로의 주사가 고려된다. 우측의 관상순환과 좌측의 관상순환 둘 다의 안으로의 주사가 바람직하다. 좌측의 전하행(LAD) 및 좌측의 궁상만곡(LCx) 관상동맥안으로 각각 한번씩, 및 우측의 관상동맥안으로 한번으로 된 세번의 주사에 의한 송달이 특히 바람직하다.

본원에서 설명된 대로, 유전자 송달을 추가적으로 증강하기 위하여, 유전자 송달 벡터는, 바람직하게는 혈관작용제(예를 들어, 히스타민, 히스타민 아고니스트 (agonist) 또는 혈관 내피 성장인자(VEGF) 단백질)의 주입과 결합하여 혈관내 송달에 의하여 표적화되는 부위에서 투여되고; 가장 바람직하게는 벡터의 도입전 몇분내에 혈관작용제를 주입함으로써 투여된다.

본 발명의 또하나의 양태는, 트랜스유전자-삽입된 벡터를 환자의 심근층에 관내 주사에 의하여, 바람직하게는 벡터를 하나 또는 둘 다의 관상동맥 (또는 이식편)안으로 직접 주사함으로써 병에 걸린 심근층안에 심장근세포를 형질전환시키되, 상기 벡터가 맥관형성 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 FGF-5, FGF-4, aFGF, bFGF 또는 VEGF(혈관 내피 성장인자)를 코딩하는 트랜스유전자를 포함하는 것을 포함하고, 그 트랜스유전자를 심장안에서 발현시킴으로써 심근층의 병에 걸린 영역에서 맥관형성을 촉진시키는 것을 포함한다. β-아드레날린성 신호 단백질(β-adrenergic signaling proteins)을 암호화하는 트랜스유전자와 같은 다른 트랜스유전자도 또한 하기에서 설명된 대로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 벡터는 플라스미드 또는 바람직하게는 바이러스 벡터, 예를 들어 복제-결함있는 아데노바이러스 또는 아데노-연관된 바이러스(AAV)일수 있다. 야생형 바이러스를 포함하지 않는 것과 같은 바이러스의 벡터 스톡(stock)을 하나 또는 둘 모두의 관상동맥 (또는 이식편)의 관강안으로, 바람직하게는 우측 및 좌측의 관상동맥 (또는 이식편)안으로, 그리고 바람직하게는 광학 밀도측정법에 의하여 측정될 때 10⁷-10¹³개의 바이러스 입자의 양으로(보다 바람직하게는 10⁹-10¹¹개의 바이러스 입자) 깊히 주사함으로써, 맥관형성 단백질 또는 펩티드-암호화 유전자를 이용하여 병에 걸린 심근층에 있는 원하는 수의 세포, 특히 심장근세포를 국부적으로 형질전환시켜서 유전자 전달의 치료상의 효능을 최대화하고 심장외 부위에서의 원하지 않은 맥관형성과 바이러스 단백질에 대한 염증 반응의 가능성을 최소화하는 것이 가능하다. 예를 들어, 만약 심실의 근세포-특이적인 프로모터가 사용된다면, 그 프로모터는 심장근세포에한정된 발현을 보다 더 확실하게 가능하게 하여 망막과 같은 비-심장 조직에서의 맥관형성의 잠재적으로 유해한 효과를 피하도록 해준다. 본 발명에 따라서 유전자 송달 벡터의 국부화된 송달을 추가적으로 증강하기 위하여, 혈관작용제, 바람직하게는 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장인자(VEGF) 단백질이 본원에서 설명된 대로의 방법으로 도자를 이용하여 심근층으로 주입될 수 있다.

또하나의 양태에서, 본 발명은, 바람직하게는 10⁷-10¹³개의 바이러스 입자의 최종 바이러스 역가로 재조합체 아데노바이러스 벡터 및 제약적으로 허용가능한 운반체(carrier)를 포함하는, 여과된 주사가능한 아데노바이러스 벡터 조제물을 제공하는데, 상기 벡터는 야생형 바이러스를 포함하지 않고, 복제 능력을 부여하는 하나이상의 요구되는 아데노바이러스 유전자, 예를 들어 E1A/E1B유전자가 삭제되어진 부분적인 아데노바이러스 서열, 및 그 부분적인 아데노바이러스 서열의 측면에 접한 프로모터에 의하여 조종되는 맥관형성 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5 및 VEGF를 코딩하는 트랜스유전자를 포함한다. 본원에서 설명된 대로의 유전자 송달을 증강시키기 위하여, 선택적으로 혈관작용제, 예를 들어 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장인자(VEGF) 단백질과 조합하여 이 주사가능한 아데노바이러스 벡터 조제물을 사용함으로써, 원하지 않는 효과 없이 심질환 예를 들어 임상적인 심근허혈, 또는 말초혈관질환의 치료를 위해, 효과적인 아데노바이러스-매개된 FGF 유전자 전달을 실행하는 것이 가능하다.

추가적인 양태에 있어서, 본 발명은, 심근층에서 생체내에서 맥관형성 단백질 또는 펩티드를 발현할 수 있는 재조합체 벡터를 포함하는 바이러스 스톡을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 바람직하게는 FGF-4, FGF-5, aFGF, bFGF 및 VEGF와 같은 맥관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스유전자를, 복제 능력을 부여하는 하나이상의 요구되는 유전자, 예를 들어 E1A/E1B 유전자가 삭제되어진 인간의 아데노바이러스 5 게놈의 좌측 말단의 부분적인 아데노바이러스 서열의 측면에 접한 프로모터와 폴리링커를 포함하는 플라스미드안으로 삽입하는 단계와; 상기의 플라스미드를 없어진 복제-요구성(replication-requiring) 유전자로 형질전환된 포유동물 세포안으로, 플라스미드가 너무 커서 캡슐에 넣어지지 못하게 하는 전체적인 인간의 아데노바이러스 5 게놈과 추가적인 삽입물을 포함하는 플라스미드와 함께 공동-형질전환시키는 단계로, 이것에 의하여 트랜스유전자-삽입된 플라스미드와 전체적인 아데노바이러스 게놈을 가진 플라스미드사이에 구출 재조합이 일어나서 복제-요구성 유전자없이 트랜스유전자를 포함하는 재조합체 게놈을 창조하게 되는데, 상기의 재조합 게놈은 캡슐에 넣어질 수 있을 만큼 충분히 작고; 세포배양물안에서 성공적인 재조합을 확인하는 단계; 그 결여된 복제-요구성 유전자로 형질전환된 포유동물 세포안에서 결과적인 재조합체를 증식시키는 단계; 및 증식된 재조합체를 정제하여 야생형 바이러스가 그 안에 없는 재조합체 벡터를 포함하도록 하는 단계와, 선택적으로 정제된 벡터를 필터, 바람직하게는 10-50마이크론 필터, 더욱 바람직하게는 30마이크론 필터를 통하여 통과시키는 단계를 포함한다.

또하나의 양태에서, 맥관형성 펩티드 또는 단백질을 발현하는 재조합체 아데노바이러스는, 바람직하게는 혈관작용제, 예를 들어 본원에서 설명된 대로의 히스타민 또는 히스타민 아고니스트와 조합하여, 대퇴동맥 또는 동맥들의 근위부분안으로 도자에 의하여 송달될 것이고, 그럼으로써 대퇴동맥으로부터 혈류를 받는 골격근의 세포안으로의 유전자 전달을 실행할 것이다. 이것은, 다리의 골격근안에서 맥관형성을 생기게 하는 맥관형성의 자극을 제공할 것이고, 다리 근육으로의 불충분한 혈액 공급을 특징으로 하는 질환인 말초혈관질환을 위한 치료법으로서 이바지할 것이다.

본 발명의 추가적인 양태에 있어서, 혈관작용제, 예를 들어 본원에서 설명된 대로의 히스타민 또는 히스타민 아고니스트, 또는 맥관 내피 성장인자(VEGF) 단백질을 이용하여 공동-주입되거나 이전-주입된 동맥과 같은 혈관안으로 벡터를 송달 함으로써, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 또는 아데노-연관된 바이러스)와 같은 벡터를 이용한 유전자 송달의 효율이 증강된다. 가장 바람직하게는, 혈관작용제는 벡터의 도입전 몇분내에 혈관안으로 주입된다.

본 발명의 트랜스유전자

본 발명에 있어서, 다른 트랜스유전자는 물론, 심장의 허혈성 영역 (또는 말초혈관질환의 경우에는 골격근)으로의 심근의 혈류를 개선시킬 수 있는 다양한 단백질 또는 펩티드 성장인자가 사용될 수 있다. 발현될 맥관형성 단백질 또는 펩티드로서 aFGF, bFGF, FGF-4 및 FGF-5와 같은 맥관형성 단백질 또는 펩티드가 예시될 수 있다. FGF 패밀리의 맥관형성 활성은 단백질 주입의 설정에 있어서 합리적으로 잘 확립되어 있다(Yanagisawa-Miwa, 등, Science 257:1401-1403, 1992, Harada, 등, J Clin Invest 94:623-630, 1994, Unger, 등, Am J Physiol 266:HI588-HI595, 1994). 새로운 혈관 형성의 유력한 자극제인 VEGF(혈관 내피 성장인자)를 위한 유전자가 또한 사용될 수 있다. 유전자 전달 접근방법의 성공은 유전자 산물의 합성 및 형질전환된 세포로부터의 분비 둘 다를 필요로 한다. 이 관점으로부터, FGF-5 또는 FGF-4를 암호화하는 유전자가 바람직하고 바람직하게는 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하도록 선택되는데, 그렇게 함으로써 일단 발현된 유전자 산물이 심장 (또는 골격근) 간질로의 접근을 얻고 맥관형성을 유도하도록 지시한다. 그러므로, 사용될 수 있는 맥관형성 단백질에는, 섬유아세포 성장인자(FGF), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 혈소판-유도된 성장인자(PDGF), 인슐린-유사 성장인자(IGF), 및 다른 것들의 패밀리의 일원들이 포함된다. FGF 패밀리의 일원들은 aFGF(FGF-1), bFGF(FGF-2), FGF-4 ("hst/KS3"으로도 알려짐), FGF-5, FGF-6을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. VEGF는 생체외 및 생체내에서 허혈에 반응하여 심장근세포에 의하여 발현되는 것으로 보여져 왔고; 그것은 병적인 상태에 대해 적응성 반응을 하는 동안은 물론 생리학적인 조건하에서 맥관형성의 조절기이다((Banai 등 Circulation 89:2183-2189, 1994). VEGF 패밀리는 VEGF-B 하위-패밀리의 일원(예를 들어, VEGF-167과 VEGF-186)과 VEGF-C 하위-패밀리의 일원은 물론, VEGF-A 하위-패밀리의 일원(예를 들어, VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-189 및 VEGF-206)을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. PDGF는 PDGF A와 PDGF B를 포함한다. 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 당업계에서 잘 알려져 있다(예를 들어, 이 서열 및 다른 서열을 위한 GENBANK 서열 데이타베이스를 참고하라). FGF 패밀리에 대하여는, 예를 들어 Burgess, Ann. N.Y. Acad. Sci. 638:87-97, 1991; Burgess 등 Annu. Rev. Biochem 58:575-606, 1989; Muhlhauser 등 Hum. Gene Therapy 6:1457-1465, 1995; Zhan 등, Mol. Cell. Biol., 8:3487, 1988; Seddon 등 Ann. N.Y. Acad. Sci. 638:98-108, 1991을 참고하라. 인간의 hst/KS3(즉, FGF-4)에 대해서는 Taira 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2980-2984, 1987을 참고하라. 인간의 VEGF에 대해서는, 예를 들어 Tischer 등 J. Biol. Chem. 206:11947-11954, 1991과 그안의 참고문헌; Muhlhauser 등, Cir. Res. 77:1077-1086, 1995를 참고하라. 그러한 유전자와 암호화된 폴리펩티드를 위한 서열 정보는 GenBank 또는 EMBL과 같은 서열 데이타베이스로부터 쉽게 얻어질 수 있다. 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 또한 유전자 라이브러리로부터, 예를 들어 당업계에서 일상적인 PCR 또는 혼성화 기술을 이용함으로써 얻어질 수 있다. FGF-4, FGF-5 또는 FGF-6을 암호화하는 유전자들이 바람직한데, 이 단백질들이 기능적인 분비 신호서열을 포함하고 세포로부터 쉽게 분비되기 때문이다. 대부분이 아니라면 많은 인간의 VEGF 단백질(VEGF-121과 VEGF-165를 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는)이 또한 쉽게 분비되고 분비후에 확산될 수 있다. 그러므로, 발현될 때, 이 맥관형성 단백질은 심장의 간질에 쉽게 접근하고 맥관형성을 유도할 수 있다. 자연적인 분비 신호서열이 없는 aFGF(FGF-1)와 bFGF(FGF-2)와 같은 다른 맥관형성 단백질에 있어서, 분비 신호서열을 가진 융합 단백질이 당업계에서 숙련된 사람에 친숙한 표준적인 재조합 DNA 방법을 이용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. aFGF와 bFGF는 둘 다가 어느정도까지 자연적으로 분비된다고 믿어지지만; 추가적인 분비 신호서열의 포함은 그 단백질의 분비를 증강시키기 위하여 사용될 수 있다. 분비 신호서열은 전형적으로는 원하는 단백질의 N-말단에 위치하게 될 것이지만 맥관형성 인자의 분비를 허용하기 위한 어떠한 위치에라도 배치될 수 있다. 예를 들어, 적당한 신호서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 선택된 맥관형성 단백질 유전자의 최초의 코돈에 5'으로 융합될 수 있다. 적당한 분비 신호서열에는, FGF-4, FGF-5, FGF-6 유전자의 신호서열 또는 IL-1β와 같은 다른 분비되는 단백질의 신호서열이 포함된다. 맥관형성 단백질은, 다른 하나의 단백질로부터의 신호서열을 포함하도록 변형될 수 있는데, 예를 들어 본원에서 참고에 의해 연합된 1997년 5월 6일에 제출된 공동-보류중인 출원 U.S. 일련번호 08/852,779에서 설명되는 대로, 분비되는 두번째 단백질의 분비를 지시하는 잔기를 이용하여 맥관형성 단백질안의 잔기를 대치시킴에 의한다. 심장근세포로부터 정상적으로 분비되는 단백질로부터 유도된 신호서열을 사용할 수 있다. 인간을 치료하기 위하여, 교차-종(cross-species) 활성을 보여주는 즉, 인간안에서 맥관형성 활성을 가지는 다른 포유동물 기원의 맥관형성 단백질도 사용될 수 있지만, 인간 기원의 맥관형성 단백질을 암호화하는 유전자가 바람직하다.

맥관형성 인자에 부가하여, 심장 기능을 증강시키는 β-아드레날린성 신호 단백질(β-ASPs)이 또한 사용될 수 있다. 1997년 9월 5일에 제출된 PCT/US97/15610은 물론 1997년 9월 5일에 제출된 공동-보류중인 출원 U.S. 일련번호 08/924,757(1997년 6월 16일에 제출된 U.S. 60/048,933 및 1996년 9월 5일에 제출된 U.S. 08/708,661에 기초함) 및 1998년 1월 16일에 제출된 U.S. 진행중인 사건 일련번호 08/ 에서 상세하게 보여지는 대로, 그런 β-ASPs의 예에는 β-아드레날린성 수용체(β-ARs), G-단백질 수용체 키나제 억제제(GRK 엑제제) 및 아데닐릴시클라제 (ACs)가 포함된다. 이 특허출원에서 인용된 이러한 특허출원 및 다른 특허출원이 참고에 의하여 본원에 연합된다.

유전자 송달을 위한 벡터

본 발명의 방법에서, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터와 비-바이러스 벡터를 둘다 포함하는 다양한 벡터의 구성과 사용을 설명하는 참고문헌이 하기에서 제공된다.

실례로서, 관심있는 유전자가 심장근세포(및 골격근세포)를 포함하는 심장(또는 골격근)으로 생체내에서 전달되고 암호화된 단백질의 구성적인 생산을 지시한다. 몇가지 다른 유전자 전달 접근방법이 실행될 수 있다. 보조(helper)-독립적인 복제 결함있는 인간의 아데노바이러스 체계가 바람직하다. 이 체계를 이용하여, 본 발명자들은 단일의 관내 주사에 의하여 생체내에서 심근세포의 60%이상이 형질전환된다는 것을 증명해왔다(Giordano와 Hammond, Clin. Res. 42:123A, 1994). 비-복제적 재조합체 아데노바이러스 벡터는 관상의 내피와 심장근세포를 형질전환하는데 있어서 특히 유용해서, 관내 주사후 고도로 효율이 있는 형질전환이 생긴다. 동일한 것이 말초혈관계의 원하는 세포를 형질전환하는데 대하여 사실일 것이다.

인간의 아데노바이러스 5(Virology 163:614-617, 1988)에 기초한 재조합체 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스의 게놈으로부터 본질적인 초기 유전자(보통 E1A/EIB)를 빼놓으므로, 그 없어진 유전자를 제공하는 허용적인 셀라인에서 인트랜스로(in trans) 생장되지 않으면 복제할 수 없다. 없어진 아데노바이러스의 게놈 서열을 대신하여, 관심있는 트랜스유전자가 복제 결함있는 아데노바이러스를 이용하여 형질전환된 조직/세포안에서 클로닝되고 발현될 수 있다. 아데노바이러스-기초한 유전자 전달의 결과로 숙주 게놈안으로의 트랜스유전자의 통합이 생기는 것은 아니므로(0.1% 미만의 아데노바이러스-매개된 형질전환이 숙주 DNA안으로의 트랜스유전자 통합을 생기게 한다) 안정하지 않음에도 불구하고, 아데노바이러스 벡터는 높은 역가로 증식될 수 있고 복제하지 않는 세포를 형질전환시킬 수 있다. 트랜스유전자가 딸세포로 전달되지는 않지만, 이것은 분열하지 않는 성숙한 골격근 및 심장근세포로의 유전자 전달을 위하여 허용가능하다. 레트로바이러스 벡터는 안정한 유전자 전달을 제공하고 높은 역가가 이제 레트로바이러스 유사타이핑(pseudotyping)을 통하여 얻어질 수 있지만(Burns, 등, Proc Natl Acad Sci (USA) 90:8033-8037, 1993), 현행의 레트로바이러스 벡터는 복제하지 않는 세포(성숙한 골격근과 심장근세포)를 효과적으로 형질도입시킬 수 없다. 추가적으로, 단-기간의 유전자 전달이 충분하다면, 숙주 DNA안으로의 트랜스유전자 통합의 잠재적인 유해성이 장담되지 않는다. 실제로, 맥관형성 단백질의 한정된 지속기간 발현이 실질적인 맥관형성을 위하여 충분하며 심혈관질환과 말초질환과정을 위한 일시적인 유전자 전달이 치료상으로 적당하는 것을 본 발명자들은 발견했다.

아데노바이러스 E1A/E1B 유전자를 이용하여 형질전환된 인간의 배아 신장세포인 인간의 293 세포는 유용한 허용적인 셀라인의 전형이 된다. 그러나, HeLa 세포를 포함하여, 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터가 그 안에서 증식하는 것을 허용하는 다른 셀라인이 사용될 수 있다.

유전자 송달을 위한 재조합체 아데노바이러스 벡터 및 다른 벡터의 구성

본 발명에서 사용되는 모든 아데노바이러스 벡터는, Graham, Virology 163:614-617, 1988에서 설명된 구출 재조합 기술에 의하여 구성될 수 있다. 간단히 말해서, 관심있는 트랜스유전자는 프로모터, 폴리링커 및, E1A/E1B 유전자가 삭제되어진 부분적인 측면의 아데노바이러스 서열을 포함하는 셔틀벡터안으로 클로닝된다. 셔틀벡터로서, 바이러스의 복제에 필수적인 E1A와 E1B서열을 암호화하는 초기 단백질을 뺀 인간의 아데노바이러스 5 게놈(Virology 163:614-617, 1988)의 좌측 말단의 부분을 암호화하는 플라스미드 pAC1(Virology 163:614-617, 1988)(또는 유사체), 및 E1A/E1B 유전자가 삭제되어진 부분적인 아데노바이러스 서열의 측면에 접한 폴리링커, CMV 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는 ACCMVPLPA(J Biol Chem 267:25129-25134, 1992)가 예시될 수 있다. 플라스미드 pAC1 또는 ACCMVPLA의 사용은 클로닝과정을 용이하게 한다. 그리고나서 셔틀벡터는, 캡슐안에 넣어지기에는 너무 큰 길이를 가진 전체적인 인간의 아데노바이러스 5 게놈을 포함하는 플라스미드와 함께 293세포안으로 공동-형질전환된다. 공동-형질전환은 인산칼슘 침전이나 리포펙션(lipofection)에 의하여 수행될 수 있다(Biotechniques 15:868-872, 1993). 플라스미드 JM17은, 전체적인 인간의 아데노바이러스 5 게놈 더하기 암피실린 저항성을 위한 유전자를 포함하는 벡터 pBR322의 부분을 암호화한다(4.3 kb). JM17은 성숙한 바이러스 입자를 만드는데 필수적인 모든 아데노바이러스 단백질을 암호화하지만, 그것은 캡슐에 넣어지기에는 너무 크다(40 kb 대 야생형을 위한 36 kb). 형질전환된 세포의 작은 하위세트에서, 플라스미드 pAC1과 같은 셔틀벡터를 포함하는 트랜스유전자와 플라스미드 pJM17과 같이 전체적인 아데노바이러스의 5 게놈을 가진 플라스미드사이에서의 구출 재조합이, E1A/E1B 서열에 결함이 있고 관심있는 트랜스유전자를 포함하지만 재조합하는 동안 pBR322와 같은 추가적인 서열을 2차적으로 상실함으로써 캡슐에 넣어질만큼 충분히 작은 재조합체 게놈을 제공한다(도 1 참고). 상기의 방법에 관하여, 본 발명자들은 성공적인 결과를 보고하여 왔다(Giordano, 등 Circulation 88:1-139, 1993, 및 Giordano와 Hammond, Clin Res 42:123A, 1994). CMV 조종된 β-갈락토시다제 암호화 아데노바이러스 HCMVSP1lacZ(CLIN RES 42:123A, 1994)는 X-갈(X-gal)처리를 이용하여 유전자 전달의 효율을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.

유전자 전달의 초기 양식은 상기에서 서술된 대로 아데노바이러스 벡터를 이용한다. 이 벡터의 장점에는, 높은 효율의 유전자 전달(생체내에서 형질전환된 표적 기관세포의 60% 보다 많이)를 성취하는 능력, 높은 역가의 바이러스 스톡을 얻는 용이함 및 분열하지 않는 심장근세포와 같은 세포로의 유전자 전달을 성취하는 이 벡터의 능력이 포함된다.

다양한 다른 유전자 전달 벡터를 설명하는 참고문헌이 당업계에서 잘 알려져 있고, 그중 몇몇은 본원에서 인용된다. 그런 다른 벡터에는, 예를 들어 다른 바이러스 벡터(아데노-연관된 바이러스(AAV)와 같은), 리포좀 및 다른 지질-포함하는 복합체, 및 숙주세포로의 폴리뉴클레오티드의 송달을 매개할 수 있는 다른 거대분자의 복합체가 포함된다. 상기와 인용된 참고문헌에서 설명되는 대로, 벡터는, 유전자 송달 및/또는 유전자 발현을 추가적으로 조정하거나 다른 방법으로 표적화된 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분이나 기능성을 또한 포함한다. 그러한 다른 성분에는, 예를 들어, 세포와의 결합 또는 세포에의 표적화에 영향을 주는 성분(세포-유형 또는 조직-특이적인 결합을 매개하는 성분을 포함하여); 세포에 의한 벡터 핵산의 취함(uptake)에 영향을 주는 성분; 취함후 세포안에서의 폴리뉴클레오티드의 국부화에 영향을 주는 성분(핵의 국부화를 매개하는 약제와 같은); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 주는 성분이 포함된다. 그런 성분은 또한, 그 벡터에 의하여 송달된 핵산을 취해서 발현하고 있는 세포를 탐지하거나 선택하기 위하여 사용될 수 있는 탐지가능한 및/또는 선택가능한 표지와 같은 표지도 포함할 수 있을 것이다. 그러한 성분은 벡터의 자연적인 특징으로서 제공될 수 있거나(결합 및 취함을 매개하는 성분이나 기능성을 가진 일정한 바이러스 벡터의 사용과 같이), 벡터가 그러한 기능성을 제공하도록 변형될 수 있다. 선택가능한 표지는 양성적이거나 음성적이거나 두 기능을 가질 수 있다. 양성적인 선택가능한 표지는 그 표지를 운반하는 세포가 선택되게 하지만, 음성적인 표지는 그 표지를 운반하는 세포가 선택적으로 제거되도록 한다. 두 기능을 가진(즉 양성적인/음성적인) 표지를 포함하여, 다양한 그러한 표지 유전자가 설명되어 왔다(예를 들어, 1992년 5월 29일에 공개된 Lupton, S., WO 92/08796; 및 1994년 12월 8일에 공개된 Lupton, S., WO 94/28143을 참고하라). 그러한 표지 유전자는, 유전자 요법 전후관계에서 유익할 수 있는 조절의 추가된 측정을 제공할 수 있다. 매우 다양한 그러한 벡터가 당업계에서 알려져 있으며 일반적으로 이용가능하다(예를 들어 상기에 인용된 다양한 참고문헌을 참고하라).

본 발명의 방법에서 사용될 수 있을 아데노바이러스 벡터 및 다른 바이러스 벡터를 설명하는 추가적인 참고문헌은 다음을 포함한다: Horwitz, M.S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B., 등 (eds.) Virology, Vol.2, Raven Press New York, pp.1679-1721, 1990); Graham, F., 등, pp.109-128 in Methods in Molecular Biology, Vol.7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Humana Press, Clifton, N.J. (1991); Miller, N., 등, FASEB Journal 9:190-199, 1995; Schreier, H. Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159, 1994; Schneider와 French, Circulation 88:1937-1942, 1993; Curiel D.T., 등, Human Gene Therapy 3:147-154, 1992; Graham, F.L., 등, WO 95/00655(1995년 1월 5일); Falck-Pedersen, E.S., WO 95/16772(1995년 6월 22일); Denefle, P. 등, WO 95/23867(1995년 9월 8일); Haddada, H. 등, WO 94/26914(1994년 11월 24일); Perricaudet, M. 등, WO 95/02697(1995년 1월 26일); Zhang, W., 등, WO 95/25071 (1995년 10월 12일). 다양한 아데노바이러스 플라스미드도, 예를 들어 Microbix Biosystems of Toronto, Ontario(예를 들어, Micobix Product Information Sheet: Plasmids for Adenovirus Vector Contruction, 1996을 참고하라)를 포함하는 상업적 공급원으로부터 역시 이용가능하다. 또한, 유전자 송달을 위하여 사용될 수 있는 아데노바이러스/레트로바이러스 키메라 벡터의 구성 및 사용을 설명하는 Vile 등, Nature Biotechnology, 15:840-841, 1997, Feng 등, Nature Biotechnology, 15:866-870, 1997에 의한 논문을 참고하라.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있을 AAV 벡터를 설명하는 추가적인 참고문헌은 다음을 포함한다: Carter, B., Handbook of Parvovirus, vol.I, pp.169-228, 1990; Berns, Viology, pp.1743-1764 (Raven Press 1990); Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3:533-539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:92-129, 1992; Flotte, T.R., 등, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Chatterjee 등, Ann. NY Acad. Sci., 770:79-90, 1995; Flotte, T.R., 등, WO 95/13365(1995년 5월 18일); Trempe, J.P., 등, WO 95/13392(1995년 5월 18일); Kotin, R., Human Gene Therapy, 5:793-801, 1994; Flotte, T.R., 등, Gene Therapy 2:357-362, 1995; Allen, J.M., WO 96/17947(1996년 6월 13일); 및 Du 등, Gene Therapy 3:254-261, 1996.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있을 비-바이러스 벡터를 설명하는 추가적인 참고문헌은 다음을 포함한다: Ledley, FD, Human Gene Therapy 6:1129-1144, 1995; Miller, N., 등, FASEB Journal 9:190-199, 1995; Chonn, A., 등, Curr. Opin. in Biotech. 6:698-708, 1995; Schofield, J.P., 등, British Med. Bull. 51:56-71, 1995; Brigham, K.L., 등, J. Liposome Res. 3:31-49, 1993; Brigham, K.L., WO 91/06309(1991년 5월 16일); Felgner, P.L., 등, WO 91/17424(1991년 11월 14일); Solodin 등, Biochemistry 34:13537-13544, 1995; WO 93/19763(1993년 10월 14일); Debs 등, WO 93/25673; Felgner, P.L., 등, U.S. 특허 제5,264,618호(1993년 11월 23일); Epand, R.M., 등, U.S. 특허 제 5,283,185호(1994년 2월 1일); Gebeyehu 등, U.S. 특허 제5,334,761호(1994년 8월 2일); Felgner, P.L., 등, U.S. 특허 제5,459,127호(1995년 10월 17일); Overell, R.W., 등, WO 95/28494(1995년 10월 26일); Jessee, WO 95/02698(1995년 2월 26일); Haces와 Ciccarone, WO 95/17373(1995년 6월 29일); Lin 등, WO 96/01840(1996년 1월 25일).

조직 특이적인 프로모터

본 발명은 또한, 관상동맥 또는 예를 들어 대퇴동맥안으로의 트랜스유전자의 송달에 의하여 뿐만 아니라 조직-특이적인 프로모터의 사용에 의해서 세포 표적화를 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 좌심실의 미오신 경쇄-2(MLC_2V) 또는 미오신 중쇄(MHC)의 조직-특이적인 전사 조절 서열을 아데노바이러스 구성체내의 FGF-5 유전자와 같은 트랜스유전자에 융합시킴으로써, 트랜스유전자 발현은 심실의 심장근세포에 제한된다. lacZ를 가진 MLC_2V및 MHC 프로모터에 의하여 제공되는 유전자의 발현의 효율과 특이성의 정도는, 본 발명의 재조합체 아데노바이러스 체계를 이용하여 측정되어 왔다. 심장-특이적인 발현은 이전에 Lee, 등(J Biol Chem 267:15875-15885, 1992)에 의하여 보고되었다. MLC_2V프로모터는 250bp로 구성되고, 아데노바이러스-5 패키징 속박(packaging constraints)내에 용이하게 맞다. 전사의 강력한 프로모터로 알려진 미오신 중쇄 프로모터는 합리적인 양자택일적 심장-특이적인 프로모터를 제공하고 300bp 미만으로 구성된다. 트로포닌-C 프로모터와 같은 다른 프로모터는 고도로 효과적이고 충분히 작지만, 적당한 조직 특이성이 더 부족하다. MLC_2V또는 MHC 프로모터를 사용하고 생체내에서 트랜스유전자를 송달함으로써, 심장근세포만(심장내의 내피세포, 평활근세포, 및 섬유아세포에서 부수적인 발현이 없는)이 FGF-5와 같은 맥관형성 단백질의 적당한 발현을 제공하여 맥관형성을 촉진할 것이라고 믿어진다. 심장근세포로 발현을 제한하는 것은 또한, 임상적인 심근허혈의 치료를 위한 유전자 전달의 효용에 관해서 장점을 가진다. 발현을 심장에 제한함으로써, 망막과 같은 비-심장 조직에서의 맥관형성의 잠재적으로 유해한 효과를 피한다. 추가하여, 심장에 있는 세포중에서, 근세포는 가장 긴 트랜스유전자 발현을 제공할 것 같은데, 왜냐하면 그 세포가 빠른 교체를 겪지 않으므로; 내피세포의 경우에 발생할 것과 같은, 세포 분열 및 사멸에 의한 발현의 감소는 발생하지 않을 것이기 때문이다. 내피-특이적인 프로모터는 이 목적을 위하여 이미 이용가능하다(Lee, 등, J Biol Chem 265:10446-10450, 1990).

본 발명에서, 심질환의 치료에 관하여, 높은 역가의 벡터를 이용한 관내 주사에 의하여 심장을 표적화하고 모든 세포 유형을 형질전환하는 것이 현재 바람직하다.

아데노바이러스 벡터의 증식과 정제

성공적인 재조합체 벡터는, 표준적인 방법에 따라 플라크 정제된다. 결과적인 바이러스 벡터는, 바람직하게는 10¹⁰-10¹²개의 바이러스 입자/ml 범위의 역가까지 E1A와 E1B 기능을 제공하는 293 세포상에서 인트랜스로 증식된다. 세포를 80% 군집(confluence)으로 감염시키고 48시간후에 수확할 수 있다. 3회의 냉각-해동 주기후에 세포파편을 원심분리에 의하여 펠렛으로 만들고 바이러스를 CsCl 기울기 초원심분리에 의하여 정제한다(이중의 CsCl 기울기 초원심분리가 바람직하다). 생체내로 주사하기 전에, G25 Sephadex와 같은 Sepharose 칼럼을 통한 겔 여과에 의하여 바이러스의 스톡을 탈염한다. 그리고나서, 산물을 30 마이크론 필터를 통하여 여과함으로써, 여과되지 않은 바이러스의 관내 주사의 유해 효과(생명 위협하는 심장 부정맥)를 감소시키고 효율적인 유전자 전달을 촉진한다. 결과적인 바이러스의 스톡은 10¹¹-10¹²개의 바이러스 입자/ml의 범위에서 최종의 바이러스 역가를 가진다. 재조합 아데노바이러스는 야생형(잠재적으로 복제적인) 바이러스 없이 고도로 정제되어야 한다. 불순물이 섞인 구성체는 숙주동물안에서 강한 면역반응을 일으킬 수 있다. 이 관점으로 부터, 예를 들어, 적당한 프라이머를 사용한 PCR을 이용하여 성공적인 재조합체임을 확인하고 2회의 플라크 정제, 및 이중의 CsCl 기울기 초원심분리를 수행함으로써 오염물과 야생형 바이러스를 배제하기 위하여 증식과 정제가 수행될 수 있을 것이다. 추가적으로, 본 발명자들은, 환자안으로의 아데노바이러스 벡터 주사에 의하여 유도되는 심장 부정맥과 연관된 문제들이 관내 주사하기전에 적당한-크기의 필터를 통하여 재조합체 아데노바이러스를 여과함으로써 피해질 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 전략은 또한, 유전자 전달과 발현을 실질적으로 개선한다고 여겨진다.

재조합체 벡터의 송달

비-바이러스 벡터는 물론 바이러스 벡터를 포함하는 본 발명의 벡터는, 필요하다면 예를 들어 식염수와 같이 약제적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 주사가능한 조제물의 형태일 수 있다.

바람직한 벡터는 상기에 설명된 대로 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터이다. 주사가능한 조제물안의 그러한 벡터의 최종 역가는 바람직하게는, 효율적인 유전자 전달을 허용하는 10⁷-10¹³개의 바이러스 입자의 범위이다. 다른 약제적인 운반체, 제제형 및 용량은 하기에서 설명된다. 벡터 트랜스유전자 구성체는, 표준적인 경피 도자 기초한 방법을 이용하여 형광현미경적 안내하에서 트랜스유전자가 고도로 효과적인 요법을 허용하는 정도로 발현되기에 충분한 양으로 하나 또는 둘 다의 관상동맥 (또는 이식 혈관)을 주입함으로써 심근층으로 송달된다.

관상동맥(또는 이식 혈관)의 관강안으로 깊히(동맥의 관강내 약 1cm) 주사되어야하고, 바람직하게는 둘 다의 관상동맥에서 주사되어야 하는데, 부측 혈관의 성장이 개개의 환자내에서 매우 변하기 쉽기 때문이다. 그러므로, 하나의 관상동맥이나 이식 동맥으로의 주사가 고려되지만; 우측 및 좌측 관상 순환 둘 다로의 주사가 바람직하다. 좌측의 전하행(LAD) 및 좌측의 궁상만곡(LCx) 관상동맥안으로 각각 한번씩, 및 우측의 관상동맥안으로 한번으로 된 세번의 주사가 특히 바람직하다. 관상의 도자에 의하여 관상동맥의 관강안으로 직접 물질을 주사함으로써(바람직하게는, 증강된 유전자 요법이 원해지는 곳에서 혈관작용제, 예를 들어 히스타민, 히스타민 아고니스트 또는 VEGF 단백질과 조합하여), 보다 효과적으로 유전자를 표적화하고 주사하는 동안 근위의 대동맥으로 재조합체 벡터를 상실하는 것을 최소화하는 것이 가능하다. 본 발명자들은, 이 방법으로 송달될 때 유전자 발현이 간세포에서 발생하지 않고 바이러스의 RNA가 관내 주사후 언제이건 소변에서 발견될 수 없다는 것을 밝혔다. 예를 들어 어떤 다양한 관상 도자 또는 Stack 관류 도자든지 본 발명에서 사용될 수 있다. 추가하여, 당업계에서 보통의 기술을 가진 사람들에게 알려진 다른 기술이 동맥벽으로의 유전자의 전달을 위하여 사용될 수 있다.

표적 조직에 배급하는 동맥안으로의 동맥내 주입을 통한 다른 기관이나 조직으로의 유전자 송달은, 바람직하게는 본원에서 설명되고 예시된 대로의 유전자 송달을 증강시키기 위하여 혈관작용제, 예를 들어 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장인자(VEGF) 단백질의 주입과 조합하여, 유사한 방법으로 수행될 수 있다.

실레로서, 말초혈관질환(다리로의 불충분한 혈액 공급이 특징인)의 치료를 위하여, 맥관형성 단백질 또는 펩티드를 발현하는 재조합체 벡터를, 대퇴동맥 또는 동맥들의 근위 부분안으로 삽입된 도자에 의하여, 바람직하게는 혈관작용제, 예를 들어 히스타민 또는 히스타민 아고니스트와 조합하여 송달함으로써, 대퇴동맥으로부터 혈류를 받는 골격근의 세포안으로의 유전자 전달을 실행할 수 있다. 이것은 맥관형성의 자극을 제공하는데, 그 결과로서, 맥관형성이 생기고 다리의 치료된 골격근에서의 혈류가 부수적으로 증가한다.

본원에서 사용될 때, 혈관작용제는, 증가된 혈관 투과성을 유도하고 유전자 송달 벡터와 같은 거대분자의 모세관 벽을 가로지른 전달을 증강시키는 자연적 또는 합성적 물질이다. 거대분자에 대한 혈관 투과성을 증가시키거나, 다른 방법으로 동맥에 의하여 관류된 모세혈관층으로의 거대분자의 전달을 용이하게 함으로써, 혈관작용제는 표적화된 부위로의 이 벡터의 송달을 증강시켜서 표적화된 조직에서의 트랜스유전자의 전체적인 발현을 효과적으로 증강시킬 수 있다. 하기의 예시적인 실시예에서(예를 들어, 실시예 5 참고), 히스타민은 혈관작용제로서 사용되었고, 심근층과 같은 주입된 부위로의 벡터의 송달을 실질적으로 증강시키는 것으로 밝혀졌다. 사용될 수 있는 히스타민 유도체(및 히스타민 H₁수용체와 상호작용하는 아고니스트와 같은 아고니스트들)에는, 예를 들어 2-메틸히스타민, 2-피리딜에틸아민, 베타히스틴, 및 2 티아졸릴에틸아민이 포함된다. 이러한 히스타민 아고니스트 및 추가적인 히스타민 아고니스트는, 예를 들어 Garrison JC., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(8th Ed:Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P, eds) Pergamon Press, 1990, pp 575-582에서 설명된다.

혈관작용제로서 사용될 수 있는 히스타민과 히스타민 아고니스트에 추가하여, 혈관 내피 성장인자(VEGFs)와 VEGF 아고니스트(상기와 인용된 참고문헌에서 설명된 대로의)가 또한 증가된 혈관 투과성을 유도할 수 있어서 본원에서 설명된 조성물과 방법의 전후관계에서 유전자 송달을 증강시키기 위하여 혈관작용제로서 이용될 수 있다. 히스타민을 이용할 때처럼, VEGF는 바람직하게는, 벡터의 주입 몇분전에 표적 부위에 배급하는 혈관안으로 주입된다. 인간의 VEGF는, 예를 들어 Tischer 등, J. Biol. Chem. 206:11947-11954, 1991와 그안의 참고문헌; 및 Muhlhauser 등, Cir. Res. 77:1077-1086, 1995에 의하여 설명되어 왔다.

혈관작용제는 벡터의 투여와 동시에 도입될 수 있지만, 바람직하게는 벡터의 도입 몇분전에 표적 부위로 도입되어(예를 들어, 이전-주입에 의하여), 세포가 벡터에 노출되기 전에 혈관작용제가 주입된 세포안에서 반응을 일으킬 수 있도록 한다. 이론에 의하여 결합되는 것을 바라지 않고, 그러한 혈관작용제의 투여는 모세혈관의 내피세포벽을 가로질러 모세혈관통과의 낭 수송(vesicular transport)을 증강시킴으로써 바이러스 벡터와 같은 거대분자 복합체의 전달을 용이하게 할 수 있다고 믿어진다.

심근허혈의 동물 모델

유전자 치요법에 대한 성공적인 연구를 위한 중요한 필요조건은, (a)심근허혈의 설정에 있어서의 맥관형성의 기전에 관하여 유용한 자료를 제공할 수 있는 임상적인 심근허혈에 적용가능한 동물 모델의 구성 및 (b)유전자 전달의 효과에 대한 정확한 평가이다. 이 관점으로부터, 어떠한 이전 기술도 만족스럽지 않다. 본 발명자들은 임상적인 관상동맥질환을 모방하는 심근허혈의 돼지 모델을 이용하였다. 좌측의 궁상만곡(LCx) 관상동맥주위에 아메로이드 수축기(ameroid constrictor)를 배치하면 그 결과로 최소한의 경색(좌심실의 1%. LCx층의 4±1%)을 일으키는 점진적인 완전한 폐쇄(배치후 7일내)가 생긴다(Roth, 등 Circulation 82:1778, 1990, Roth, 등 Am J Physiol 235:H1279, 1987, White, 등 Circ Res 71:1490, 1992, Hammond, 등 Cardiol 23:475, 1994 및 Hammond, 등 J Clin Invest 92:2644, 1993). 심근의 기능과 혈류는, 부측혈관 발달때문에, 폐색된 동맥에 의하여 이전에 관류된 영역(허혈성 영역이라 불림)에서 휴식하여 정상적이지만, 심근의 산소 수요가 증가할 때 허혈을 막기에는 혈류 저장이 불충분하다. 그러므로, LCx층은 임상적인 협심증에 유사한 발작적 허혈에 처한다. 부측혈관 발달과 유동-기능 관계는 아메로이드 배치후 21일내에는 안정하고 네달동안 변화하지 않고 유지된다(Roth, 등 Circulation 82:1778, 1990, Roth, 등 Am J Physiol 235:H1279, 1987, White, 등 Circ Res 71:1490, 1992). 급식동안의 심장박동수에 있어서의 가파른 증가, 직원에 의한 중단등에 관련하여, 동물들이 그 날에 걸쳐서 위험한 층안에서 주기 허혈성 기능장애를 가진다는 것이 원격측정법에 의하여 상세히 보고되어 왔다(공개되지 않는 자료). 그러므로, 그 모델은 안정하지만 부적절한 부측혈관을 가지고 주기적인 허혈에 처한다. 그 모델의 또하나의 뚜렷한 장점은, 비정상적으로 관류되고 기능하는 영역(LCx층)에 근접하여 정상적으로 관류되고 기능하는 영역(LAD층)이 있어서 각각의 동물내에서 대조표준 층을 제공한다는 것이다.

심근의 조영심초음파검사가 영역적인 심근의 관류를 측정하기 위하여 사용되었다. 조영물질은 갈락토스의 미세집합체로 구성되고 영상의 반사성(백색부분)을 증가시킨다. 미세집합체는, 혈류에 비례하는 방식으로 관상동맥과 심근의 벽안으로 분배된다(Skyba, 등 Circulation 90:1513-1521, 1994). 대조의 피크 강도는, 미세구에 의하여 측정될 때의 심근의 혈류와 밀접하게 상호연관된다(Skyba, 등 Circulation 90:1513-1521, 1994). 본 발명에서 사용된 조영심초음파검사 영상이 정확하게 LCx층임을 확인한다는 것과, 심근의 조영심초음파검사법이 심근의 혈류를 평가하기 위하여 사용될 수 있을 것이라는 것을 보고하기 위하여, 아메로이드에 인접한 근위의 LCx 주위에 수력학적 낭대 폐색기(hydraulic cuff occluder)를 배치하였다.

본 연구에서, 동물을 희생시킬 때 현미경에 의하여 모세혈관 성장을 정량화하기 위하여 심장을 관류-고정하였다(글루타르알데히드, 생리학적인 압력, 인시튜). 유전자 전달을 받았던 동물로부터의 심근층에 있는 맥관형성 단백질 DNA 및 mRNA를 탐지하기 위하여 PCR을 사용하였다. 추가하여, 하기에서 설명되듯이, 유전자 전달 2주후에, 모든 다섯마리의 lacZ-감염된 동물로부터의 심근 샘플은 조직학적인 조사상에서 실질적인 β-갈락토시다제 활성을 보인다. 마지막으로, 맥관형성 단백질에 대한 다각형의 항체를 이용하여, 유전자 전달을 받았던 동물로부터의 세포와 심근층에서의 맥관형성 단백질 발현을 증명하였다.

치료상의 연구를 위한 전략에는, 트랜스유전자 송달의 타이밍, 트랜스유전자의 투여의 경로, 및 맥관형성 유전자의 선택이 포함된다. 심근허혈의 아메로이드 모델에서, 안정하지만 불충분한 부측혈관이 발달되어진 후에 유전자 전달을 수행하였다. 아메로이드 모델을 이용한 이전의 연구는, 허혈과 부측혈관의 발달전에 아메로이드의 폐쇄동안 맥관형성 펩티드를 송달하는 것을 포함했다. 그러나, 이 전략은 몇가지 이유로 사용되지 않았다. 첫째, 이전의 연구는, 계속되는 심근허혈의 설정안에서 유전자 전달이 주어질 임상적인 심근허혈의 치료에 있어서 존재할 조건들을 엄밀히 복제하기 위하여 적당하지 않으며; 이전의 연구는 허혈을 예상하여 펩티드를 제공하는 것에 유사하기 때문에 덜 적절하다. 둘째, 세포 배양에서의 이전의 연구에 근거하여, 펩티드에 관련한 허혈의 자극이 맥관형성을 자극하기 위한 최적의 환경일 것임이 가정되었다. 이것은, 심근허혈이 이미 존재하는 때에 트랜스유전자를 송달함으로써 최적으로 성취될 수 있을 것이다. 트랜스유전자 송달을 달성하기 위한 방법의 선택은 이러한 결정에 연결되었다. 기술이 관상질환을 가진 환자의 그다음의 치료를 위하여 적용될 수 있어야한다는 속박이 몇가지 접근방법을 지지하기 어렵게 만들었다(관상동맥안으로의 펩티드의 계속적인 주입, 심장안으로의 직접적인 플라스미드 주사, 장기간의 느린 방출을 제공하기 위하여 펩티드를 포함하는 수지를 이용하여 심장을 코팅하는 것). 마지막으로, 돼지 모델은, 유전자 송달 전과 후에 영역적인 혈류 및 기능의 다음에 오는 훌륭한 방법을 제공했다. 리포터(reporter) 유전자를 가진 것을 제외하고는 동일한 재조합체 아데노바이러스 구성체를 받은 대조표준 동물의 사용은 이 연구를 위한 대조표준을 제공했다. 당업계에서 숙련된 사람은, 돼지에서 얻은 하기에 설명된 결과가 인간에서의 결과를 예견한다는 것을 이해할 것이다. 돼지는, 자연적인 관상의 부측혈관이 없는 것을 포함하여, 인간의 자연적인 관상 순환과 매우 유사한 자연적인 관상 순환을 가진다.

치료상의 적용 .

복제-결함있는 아데노바이러스와 같은 본 발명의 벡터는, 유전자 발현의 구역에서의 세포병변효과 또는 염증없이 생체내에서 매우 효율적인 유전자 전달을 허용한다. 이러한 결과에 기초하여, 하기의 실시예들에서 추가적으로 설명되는 대로, 생체내에서 기능적인 변화를 달성하기 위한 충분히 높은 정도의 생체내 유전자 전달이 성취되는 것이 보여진다. 심질환을 치료하는 경우에, 관내 주사에 의한 맥관형성 단백질의 유전자 전달은 맥관형성을 촉진하고 심장 기능을 증강시킬 것이다. 그러므로, 최초의 허혈성 발작이 관찰된 후에 심장 허혈의 치료가 수행될 수 있다. 추가하여, 유전자 전달후에, 모세혈관 수, 혈류 및 기능이 허혈성 영역에서 증가할 것이다. 이 기술의 적용은, 특히 효력이 없는 관상동맥질환 및 불구로 만드는 협심증에 걸린 사람들에 있어서 초기에 임상적으로 큰 유용성을 가질 것이다. 본 발명의 자료는, 심근허혈을 실질적으로 감소시키는데 있어서 섬유아세포 성장인자(예를 들어, FGF-5)를 발현하는 재조합체 아데노바이러스의 유전자 전달이 효과적이라는 것을 증명한다. 맥관형성 단백질과 트랜스유전자는 또한, 본원에 참고에 의하여 연합된 1997년 5월 6일에 제출된 공동-보류중인 출원 U.S. 일련번호 08/852,779에서 설명된 조성물과 치료의 방법으로 사용될 수 있다. 본원에서 설명된 대로, 혈관작용제, 예를 들어 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 VEGF 단백질이, 혈관내 주사에 의하여 표적화되는 부위에서의 유전자 송달을 추가적으로 증강하기 위하여, 이러한 조성물과 방법과 함께 사용될 수 있다.

상기에서 주목된 바와 같이, β-아드레날린성 신호 단백질(β-ASPs), 예를 들어 β-아드레날린성 수용체(β-ARs), G-단백질 수용체 키나제 억제제(GRK 억제제) 및 아데닐릴시클라제(ACs)가, 그 각각이 참고에 의하여 본원에 연합된 1997년 9월 5일에 제출된 PCT/US97/15610은 물론 1997년 9월 5일에 제출된 공동-보류중인 출원 U.S. 일련번호 08/924,757(1997년 6월 16일에 제출된 U.S. 60/048,933 및 1996년 9월 5일에 제출된 U.S. 08/708,661에 기초) 및 1998년 1월 16일에 제출된 U.S. 진행중인 사건 일련번호 08/ 에서 상세하게 설명되고 예시되는 대로, 심장 기능을 증강시키시 위하여 또한 사용될 수 있다. 본원에서 설명된 대로, 혈관작용제, 예를 들어 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 VEGF 단백질이, 혈관내 주사에 의하여 표적화되는 부위에서의 유전자 송달을 추가적으로 증강하기 위하여, 이러한 조성물과 방법과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이나 산물은 관내 투여에 적합한 제제형의 형태로서 편리하게 제공될 수 있을 것이다. 적당한 투여 형식은 각각의 환자를 위한 개업의사에 의하여 개별적으로 가장 잘 결정될 수 있을 것이다. 적당한 제약적으로 허용가능한 운반체 및 그것의 제제형은 표준적인 제제형 논문, 예를 들어 E.W. Martin에 의한 Remington's Pharmaceuticals Sciences에서 설명된다. 또한, Wang, Y.J.와 Hanson, M.A."Parental Formulations of Proteins and Peptides:Stability and Stabilizers," Journals of Parental Sciences and Technology, 기술 보고서 No.10, Supp.42:2S (1988)을 참고하라. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 중성의 pH, 예를 들어 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 더욱 바람직하게는 약 pH 7 내지 8의 용액안에서, 용액을 등장도 정도로 만드는 부형제, 예를 들어 일반적으로 안전하다고 여겨지는 인산나트륨과 같은 업계-기지의 완충용액을 이용하여 pH 완충된 4.5% 만니톨 또는 0.9% 염화나트륨과 함께, 메타크레솔 0.1% 내지 0.75%, 더욱 바람직하게는 0.15% 내지 0.4% 메타크레솔과 같은 허용되는 보존제와 함께 제제화되어야 한다. 원하는 등장도는, 염화나트륨 또는, 덱스트로스, 붕산, 소듐 타르트레이트(Sodium tartrate), 프로필렌 글리콜, 폴리올(만니톨 및 소르비톨과 같은), 또는 다른 무기용질 또는 유기용질과 같은 다른 제약적으로 허용가능한 약제를 이용하여 성취될 수 있을 것이다. 염화나트륨은 나트륨 이온을 포함하는 완충용액을 위하여 특히 바람직하다. 원한다면, 상기 조성물의 용액은 또한 저장 수명 및 안정성을 증강시키기 위하여 조제될 수 있을 것이다. 본 발명의 치료상으로 유용한 조성물은 일반적으로 허용가능한 절차를 따라 성분을 혼합함으로써 조제된다. 예를 들어, 선택된 성분을 섞어서 농축된 혼합물을 생산한 후, pH를 조절하기 위하여 물 및/또는 완충용액을 첨가하고 장도를 조절하기 위하여 추가적인 용질을 첨가함으로써 그 농축된 혼합물은 최종 농도 및 점성으로 조정된다.

내과의사에 의한 사용을 위하여, 선택된 수준에서 맥관형성을 유도하기 위하여 하나 또는 다수의 용량에 있어서 효과적일 본 발명의 벡터의 양을 포함하는 제형으로 조성물이 제공될 것이다. 그 분야에 있는 사람에 의하여 인식될 것과 같이, 치료 약제의 효과적인 양은, 환자의 연령과 중량, 환자의 신체조건, 및 얻어질 맥관형성의 수준, 및 다른 요인을 포함하는 많은 요인들에 따라 변할 것이다.

복제-결함있는 아데노바이러스와 같은 이 발명의 바람직한 화합물의 효과적인 용량은, 전형적으로 적어도 약 10⁷개의 바이러스 입자, 바람직하게는 약 10⁹개의 바이러스 입자, 및 더욱 바람직하게는 약 10¹¹개의 바이러스 입자의 범위일 것이다. 바이러스 입자의 수는 10¹³개를 초과할 수 있을 것이지만, 바람직하게는 10¹³개를 초과하지 않는다. 주목되듯이, 투여될 정확한 용량은 주치의에 의하여 결정되지만, 바람직하게는 1ml의 인산염 완충된 식염수안에서 이다.

심질환의 경우에 현재 바람직한 양식의 투여는, 적당한 관상 도자를 이용하여 하나 또는 둘 다의 관상동맥(또는 하나이상의 복재정맥 또는 내부의 유방동맥 이식편)으로의 관내 주사에 의한 것이다. 본원에서 설명되는 대로, 우측 및 좌측의 관상 순환으로의 주사가 바람직하다. 좌측의 전하행(LAD) 및 좌측의 궁상만곡(LCx) 관상동맥안으로 각각 한번씩, 및 우측의 관상동맥안으로 한번으로 된 세번의 주사에 의한 송달이 특히 바람직하다. 두번의 좌측의 관상 주사를 연속하여 실행하는 것이 물론 편리하지만, 이 두번의 주사는 우측의 관상동맥으로의 주사 전 또는 그에 이어서 실행될 수 있다. 우측의 관상동맥이 쉽게 접근가능하지 않은 상황에서(예를 들어, 부측을 연결함없이 폐색이 일어난 결과 또는 선택적인 주사를 하기에는 우측의 관상동맥이 너무 작기 때문에), 벡터의 전체적인 용량은 좌측의 관상순환안으로의 주사를 통하여 송달될 수 있다(상기에서 주목된 대로 바람직하게는 LAD 및 LCx). 각각의 주사는 일반적으로 1분 내지 몇분의 주기, 전형적으로는 약 1분 30초에 걸쳐서 실행된다. 말초혈관질환의 경우에 현재 바람직한 양식의 투여는, 적당한 동맥의 도자를 이용하여 대퇴 동맥 또는 동맥들의 근위 부분안으로 주사하는 것에 의한다.

본원에서 설명되는 대로, 혈관작용제는, 예를 들어 도자를 이용하여 벡터의 송달과 동시에 또는 벡터의 송달 전에 표적 부위에 주입되어 유전자 전달을 촉진할 수 있다. 그러한 약제 사용의 결과로 유전자 송달의 효율이 증강되는데, 이것은 그 트랜스유전자를 발현하는 표적화된 부위안의 세포의 백분율이 증가함에 의하여 증명되었다. 히스타민 및 다른 혈관작용제의 생리학적 및 약리학적인 효과에 관하여, 예를 들어, Altura BM과 Halevy S. Cardiovascular actions of histamine. In: Histamine II and Anti-Histaminics: Chemistry, Metabolism and Physiological and Pharmacological Actions(Rocha e Silva M, ed) Handbuch der Experimentellen Pharmakologie, Vol 18, Part 2. Springer Verlag, Berlin, 1978, pp 1-39를 참고하라. 사용될 수 있는 히스타민 유도체(및 히스타민 H₁수용체와 상호작용하는 아고니스트와 같은 아고니스트)에는, 예를 들어 2-메틸히스타민, 2-피리딜에틸아민, 베타히스틴 및 2 티아졸릴에틸아민이 포함된다. 이러한 히스타민 아고니스트 및 추가적인 히스타민 아고니스트는, 예를 들어 Garrison JC., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (8th Ed: Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P, eds) Pergamon Press, 1990, pp 575-582에서 설명된다.

본 발명의 이해에 있어 도움을 주기 위하여, 일련의 실험들의 결과를 설명하는 다음의 실시예들이 제공된다. 물론, 이 발명에 관한 실험은 본 발명을 특정하게 한정하는 것으로 해석되어서는 않되고, 당업계에서 숙련된 사람의 범위내에 있을, 지금 알거나 후에 전개될 본 발명의 그러한 변화는 본원에서 설명되고 하기에 청구된 대로의 본 발명의 범위에 드는 것으로 고려된다.

실시예 1: 아데노바이러스 구성체

보조 독립적인 복제 결함있는 인간의 아데노바이러스 5 체계가 사용되었다. 관심있는 유전자는 lacZ 및 FGF-5였다. 인간의 FGF-5를 위한 전 길이 cDNA를, 그 유전자의 오픈 리딩 프레임의 981bp를 포함하는 1.1kb EcoRI 단편으로서 플라스미드 pLTRI22E(Zhen, 등 Mol Cell Biol 8:3487, 1988)로부터 방출시켰고, E1A와 E1B 유전자(바이러스의 복제를 위하여 필수적)가 삭제되어진 부분적인 아데노바이러스의 서열의 측면에 접한 CMV 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는 플라스미드 ACCMVPLPA의 폴리링커안으로 클로닝하였다. 이 플라스미드는, pJM17을 캡슐에 넣어지기에는 너무 크게 만드는 추가적인 4.3kb 삽입물을 가진 전체적인 인간의 아데노바이러스 5 게놈을 포함하는 플라스미드 JM17과 함께 293 세포안으로 공동형질전환 (리포펙션)되었다. 상동적인 구출 재조합의 결과로 E1A/E1B 서열이 없이 트랜스유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터가 생겼다. 이 재조합체가 포유동물의 세포안에서 비복제적이었지만, 그것은 E1A/E1B로 형질전환되어 있어서 이 필수적인 유전자 산물을 인트랜스로 제공하는 293 세포안에서는 증식할 수 있었다. 형질전환된 세포는, 형질전환 후 10-14일에 보통 발생하는 세포병변효과의 증거에 대하여 모니터되었다. 성공적인 재조합체임을 확인하기 위하여, 세포병변효과를 보이는 플레이트로부터의 세포상청액을 56℃에서 60분동안 프로테이나제 K(0.5% 소듐 도데실 설페이트와 20mM EDTA를 포함하는 50mg/ml)를 이용하여 처리하였고, 페놀/클로로포름 추출했고 에탄올 침전시켰다. 그리고나서 성공적인 재조합체임을, 삽입물(예상되는 1.1kb 단편)을 증폭하기 위하여 CMV 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 서열에 상보적인 프라이머(Biotechniques 15:868-872, 1993) 및 아데노바이러스의 서열을 부수적으로 증폭하기 위하여 고안된 프라이머(Biotechniques 15:868-872, 1993)를 사용한 PCR을 이용하여 확인하였다. 그리고나서 성공적인 재조합체는 2회의 플라크 정제를 겪었다. 바이러스의 스톡을 10¹⁰과 10¹²개의 바이러스 입자사이의 범위의 역가까지 293 세포안에서 증식시켰고, 사용전에 이중의 CsCl 기울기 원심분리에 의하여 정제하였다. β-갈락토시다제 또는 FGF-5를 암호화하는 재조합체 아데노바이러스는, 전 길이 cDNA를 이용하여 구성되었다. 재조합체 아데노바이러스를 발생시키기 위하여 사용된 체계는 트랜스유전자 삽입물을 위하여 5kb의 패킹(packing) 한계를 부과했다. CMV 프로모터에 의하여 조종되고 SV40 폴리아데닐화 서열을 가지는 제안된 유전자는 4kb 미만으로 패키징 속박내에 충분히 든다. 재조합체 벡터를 표준적인 절차에 의하여 플라크 정제했다. 결과적인 바이러스 벡터는 293 세포상에서 10¹⁰-10¹²개의 바이러스 입자 범위의 역가까지 증식되었다. 세포를 80% 군집으로 감염시켰고 36-48시간째에 수확하였다. 냉각-해동 주기후에 세포파편을 표준적인 원심분리에 의하여 펠렛으로 만들고 바이러스를 이중의 CsCl 기울기 초원심분리(비연속적인 1.33/1.45 CsCl 기울기;5mM Tris, ImM EDTA(pH 7.8)안에 조제된 세슘; 90,000 x g(2시간), 105,000 x g(18시간))에 의하여 추가적으로 정제하였다. 생체내로 주사하기 전에, G25 Sephadex와 같은 Sepharose 칼럼을 통한 겔 여과에 의하여 바이러스의 스톡을 탈염했다. 결과적인 바이러스의 스톡은 10¹¹-10¹²개의 바이러스 입자의 범위에서 최종의 바이러스 역가를 가졌다. 아데노바이러스 구성체는 야생형(잠재적으로 복제적인) 바이러스 없이 고도로 정제되었다.

실시예 2: 세포 배양안의 성숙한 래트 심장근세포

성숙한 래트 심장근세포는, 표준적인 방법에 따라 관류액(perfusate)을 포함하는 콜라게나제를 이용하여 Langendorf 관류에 의하여 조제되었다. 막대 모양의 세포를 라미닌 코팅된 플레이트상에서 배양하였고, 24시간째에 상기의 실시예 1에서 얻어진 β-갈락토시다제-암호화 아데노바이러스를 이용하여 1:1의 감염의 다중도로 감염시켰다. 추가적인 36시간 주기후에, 세포를 글루타르알데히드로 고정하였고 X-갈과 함께 인큐베이션하였다. 재조합체 아데노바이러스로 감염된 후, 일관되게 70-90%의 성숙한 근세포가 β-갈락토시다제 트랜스유전자를 발현시켰다. 1-2:1의 감염의 다중도에서는 세포독성이 관찰되지 않았다.

실시예 3: 생체내에서의 돼지의 심근층

실시예 1에서 얻어진 β-갈락토시다제-암호화 아데노바이러스 벡터를 허용적인 293 세포안에서 증식시켰고, 실시예 1의 절차에 근거하여 1.5 x 10¹⁰개의 바이러스 입자의 최종 역가를 이용한 CsCl 기울기 초원심분리에 의하여 정제하였다. 마취되고 환기된 40kg 돼지가 개흉술을 겪었다. 26 게이지 나비형 바늘을 중간의 좌측의 전하행(LAD) 관상동맥안으로 삽입하였고, 벡터(1.5 x 10¹⁰개의 바이러스 입자)를 2ml 부피로 주사하였다. 흉부를 닫고 동물이 회복하도록 하였다. 주사후 네째날에 동물을 죽였다. 심장을 글루타르알데히드로 고정하고 절편으로 자르고 X-갈과 함께 16.5시간동안 인큐베이션하였다. 포매하고 절편으로 자른 후에, 조직을 에오신으로 대조염색하였다.

조직 절편(lacZ를 포함하는 아데노바이러스의 관내 주사 96시간후의 LAD층의 전층의 절편들)의 현미경 분석은, 많은 조직 절편을 이용하여 50-60%보다 많은 세포가 β-갈락토시다제에 대하여 양성적으로 염색되는 것을 증명하여, LAD 관상층에서 관찰되는 유전자 전달의 유의한 크기를 보여주었다. 유전자의 흩어진 발현이 근세포와 내피세포에서 관찰되었던 반면, LAD 순환층으로부터 떨어져 있는 심근층의 구역은 X-갈 염색을 증명하지 않았고 음성적인 대조표준으로서 이바지하였다. 대부분의 근세포는 β-갈락토시다제 활성(푸른 염색)을 보여주었고, 닫힌-흉부 관내 주사를 이용한 그후의 연구에서 유사한 활성이 유전자 전달 14일후에 존재하였다(n=8). 유전자 발현의 구역에서 염증 또는 괴사의 증거는 없었다.

실시예 4: 돼지의 허혈 모델

동물은 18마리의 가축(domestic) 돼지(30-40 kg)를 포함하였다. 기계사용을 위한 멸균된 조건하에서 좌측의 개흉술을 실행하였다(Hammond, 등. J Clin Invest 92:2644-2652 및 Roth, 등 J Clin Invest 91:939-949, 1993). 도자를 좌심방과 대동맥에 배치하여, 영역적인 혈류를 측정하고 압력을 모니터하기 위한 수단을 제공하였다. 전선을 좌심방위에 봉합하여 ECG 기록과 심방 조율(pacing)을 가능하게 하였다. 마지막으로, 근위의 LCx 주위에 아메로이드를 배치하였다. 안정한 정도의 허혈이 발생된 후에, 치료 집단(n=11)은, CMV 프로모터에 의하여 조종되는 FGF-5(맥관형성 유전자)를 포함하는 아데노바이러스 구성체를 받았다. 대조표준 동물(n=7)은 CMV 프로모터에 의하여 조종되는 리포터 유전자, lacZ를 포함하는 아데노바이러스 구성체를 이용하여 유전자 전달을 받았다.

부측혈관 발달 및 조율-유도된 기능장애가 안정되는 때인 아메로이드 배치 35±3일후에, 연구를 시작하였다(Roth, 등 Am J Physiol 253:H1279-1288, 1987, 및 Roth, 등 Circulation 82:1778-1789). 의식이 있는 동물을 슬링(sling)에 매달고 LV, LA 및 대동맥으로부터의 압력과 심전도를 디지탈 포맷에서 온-라인으로 (휴식기 및 200bpm으로 심방 조율하는 동안) 기록하였다. 이차원적이고 M-양식의 영상이 Hewlett Packard 초음파 영상체계를 이용하여 얻어졌다. 영상은, 중간의-유두근 수준에서 우측의 복늑골의 접근방법으로부터 얻어졌고, VHS 테이프상에 기록되었다. 기저 상태에 있는 동물과 다시 우심방 조율(HR=200bpm)하는 동안의 동물을 이용하여 영상을 기록하였다. 이러한 연구는, 유전자 전달 하루전에 수행되었고 14±1일 후에 반복되었다. 속도-압력 산물(rate-pressure products)과 좌심방 압력은 유전자 전달 전과 후에 두 집단 모두에서 유사하여, 유사한 심근의 산소수요 및 로딩 조건을 나타내었다. 심초음파도의 측정은 표준화된 기준을 이용하여 이루어졌다(Sahn, 등 Circulation 58:1072, 1978). 확장말기의 벽 두께(EDWTh) 및 수축말기의 벽 두께(ESWTh)는, 5번의 연속적인 박동으로부터 측정되었고 평균내어졌다. 퍼센트 벽 농후화(%WTh)는 [(EDWTh-ESWTh)/EDWTh] X 100으로 계산되었다. 동물이 어떤 유전자를 받았는지에 대한 지식없이 자료를 분석하였다. 심초음파도의 측정의 재현성을 증명하기 위하여, 연속적인 2일에 동물(n=5)을 영상화하였고 높은 상관관계를 보여주었다(r²=0.90; p=0.005).

아메로이드 배치 35±3일후에, 아메로이드가 폐쇄되고 충분히 지난 후이지만 유전자 전달전에, 심방 조율(200 bpm)동안 좌심방안으로 주사된 조영물질 (Levovist)를 사용하여 조영심초음파검사 연구를 수행하였다. 유전자 전달 14±1일후에 연구를 반복하였다. 피크 조영강도는, 컴퓨터-기초의 비데오 분석 프로그램(Color Vue II, Nova Microsonics, Indianapolis, Indiana)을 이용한 비데오 영상으로부터 측정되었는데, 이것은 비데오 강도의 객관적인 측정기준을 제공하였다. 조영연구는 동물이 어떤 유전자를 받았는지에 대한 지식없이 분석되었다.

연구를 완료하면서, 동물을 마취시켜서 중심선 개흉술을 실행하였다. 단두동맥을 분리하고, 삽관(cannula)을 삽입하고, 다른 큰 혈관을 연결하였다. 동물은 정맥내의 헤파린(10,000IU)과 파파베린(60mg)을 받았다. 염화칼륨을 받아서 확장기의 심정지를 유도하였고 대동맥을 교차하여-죄었다(cross-clamped). 단두동맥 삽관을 통하여 식염수를 송달함으로써(120mmHg 압력) 관상동맥을 관류하였다. 심장이 잘 고정될 때까지(10-15분) 글루타르알데히드 용액(6.25%, 0.1M 카코딜레이트 완충용액)를 관류하였다(120mmHg 압력). 그리고나서 심장을 제거하였고, 좌측의 전하행(LAD), 좌측의 궁상만곡(LCx), 및 우측의 관상동맥을 통하여 전행성 주사된 색-코딩된 염료를 이용하여 층을 확인하였다. 폐쇄를 확인하기 위하여 아메로이드를 검사하였다. 정상적으로 관류된 영역 및 허혈성 영역으로부터 취한 샘플을 3등분으로 나누고 심내막 및 심외막의 3등분을 플라스틱-포매하였다. 모세혈관의 수를 정량하기 위한 현미경 분석을 이전에 설명된 대로 실행하였다(Mathieu-Costello, 등 Am J Physiol 369:H204, 1990). 네개의 1㎛ 두께의 횡단면을 각각의 하위샘플(각각의 영역의 심내막과 심외막)로부터 취하고, 400X 배율에서 섬유수당 모세혈관의 수 비율을 측정하기 위하여 점집계를 사용하였다. 20 내지 25개의 높은 파워필드(power fields)가 하위샘플당 세어졌다. 각각의 영역내에서, 모세혈관수 대 섬유수 비율은 심내막과 심외막에서 유사하여서 영역당 40-50개의 필드가 전층의 모세혈관 대 섬유수 비율을 제공하는 것으로 평균내어졌다.

트랜스유전자 발현으로부터 개선된 영역적인 기능과 혈류가 생긴다는 것을 확립하기 위하여, FGF-5 유전자 전달을 받았던 동물로부터의 심근층안에 있는 트랜스유전자의 FGF-5 DNA와 mRNA를, PCR과 RT-PCR을 이용하여 탐지하였다. CMV 프로모터에 대한 센스 프라이머[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC](SEQ ID NO.:1)와 내부의 FGF-5 서열에 대한 안티센스 프라이머[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID NO.:2)를 이용하여, PCR이 예상되는 500bp 단편을 증폭하였다. FGF-5 서열의 처음에 대한 센스 프라이머 [ATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC](SEQ ID NO:3) 및 내부의 FGF-5 서열에 대한 안티센스 프라이머[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID NO:2)를 이용하여, RT-PCR은 예상되는 400bp 단편을 증폭하였다.

마지막으로, FGF-5에 대항하여 지시된 다각형의 항체(Kitaoka, 등 Science 35:3189, 1994)를 이용하여, FGF-5를 이용한 유전자 전달을 받았던 동물로부터의 세포와 심근층에서 FGF-5 유전자 전달 14±1일후는 물론 48시간후의 FGF-5 단백질 발현이 증명되었다.

실시예 1에서 구성된 보조 독립적인 복제 결함있는 인간의 아데노바이러스 5 체계가, 트랜스유전자 포함하는 벡터를 조제하기 위하여 사용되었다. 관심있는 유전자는 lacZ와 FGF-5였다. 생체내로 주사되는 물질은 고도로 정제되었고 야생형(복제할 수 있는) 아데노바이러스를 포함하지 않았다. 그렇게, 심장에서의 아데노바이러스 감염과 염증성 침윤을 최소화하였다. 관상 도자에 의하여 관상동맥의 관강안으로 물질을 직접 주사함으로써, 유전자를 효과적으로 표적화하는 것이 가능했다. 이 방법으로 송달될 때, 간세포에서는 트랜스유전자 발현이 없었고, 관내 주사후 어떤 시기에서도 소변에서 바이러스의 RNA가 발견될 수 없었다.

구성체(약 10¹¹개의 아데노바이러스의 바이러스 입자를 포함하는 4.0ml)의 주사는, 좌측 및 우측의 관상동맥 둘 다의 안으로 2.0ml을 주사함으로써 이루어졌다(LCx층으로의 부측의 유동은 두 혈관 다로부터 나오는 것으로 여겨진다). 동물을 마취시켰고, 동맥의 접근은 혈관절개술에 의하여 우측의 경동맥을 통하여 얻어졌고; 5F Cordis 초(sheath)를 배치하였다. 5F Multipurpose (A2) 관상 도자를 사용하여 관상동맥을 끌어들였다. LCx 아메로이드의 폐쇄는, 좌측의 주요한 관상동맥으로의 대조 주사에 의하여 확인되었다. 그리고나서 도자 끝을 동맥의 관강내 1cm에 배치하여, 주사하는 동안 최소한의 물질을 근위의 대동맥으로 상실되도록 한다. 이 절차는 각각의 돼지에 대하여 수행되었다.

일단 유전자 전달이 수행되면, 유전자의 성공적인 연합과 발현을 확립하기 위하여 세개의 전략이 사용되었다. (1)몇몇의 구성체는 리포터 유전자(lacZ)를 포함했고; (2)적절한 층으로부터 심근층을 샘플링하였고 FGF-5의 존재를 정량화하기 위하여 면역블로팅을 수행하였고; (3)FGF-5 mRNA와 DNA를 탐지하기 위하여 PCR을 사용하였다.

도 2에서의 영역적인 수축성 기능 자료는, lacZ를 받은 돼지가 유전자 전달전과 유전자 전달 14±1일후 허혈성 영역에서 유사한 정도의 조율-유도된 기능장애를 보여주었다는 것을 나타낸다. 대조적으로, FGF-5 유전자 전달을 받은 돼지는, 조율동안 허혈성 영역에서의 벽 농후화에 있어서 2.6배 증가를 보여주었다(p=0.0001). 이러한 자료는, 본 발명에 따르는 FGF-5 유전자 전달이 조율동안의 허혈성 영역에서의 개선된 수축과 연관된다는 것을 증명했다. 정상적으로 관류된 영역(심실간중격)에서의 벽 농후화는 조율하는 동안 정상이었고 유전자 전달에 의하여 영향을 받지 않았다(% 벽 농후화: lacZ 집단: 유전자전, 56±11%, 유전자-후, 51±9%; FGF-5 집단:유전자-전, 63±7%, 유전자후, 58±5%; 차이 없음, 2-방법 분산분석). 개별적인 측정으로부터 얻은 자료는 고도로 재현가능하였다(측면의 벽 농후화: r2=0.90; p=0.005). 흉막을 통한 심초음파도에 의하여 측정된 기능에서의 퍼센트 감소는, 동일한 모델에서의 심방 조율동안의 음파측미법(sonomicrometry)에 의하여 측정된 백분율 감소에 매우 유사하여서(Hammond, 등 J Clin Invest 92:2644, 1993), 허혈성 기능장애의 평가를 위한 심초음파도의 정확성을 보고하였다. 도 2의 막대는 평균값을 나타내고 오차막대는 1 SE를 나타낸다. 도 4a-4c는 심근의 조영심초음파사진에 상응하는 그림이다. 도 4a는 격벽(IVS)이 증강되는(흰색) 동안 LCx층(검은색)안에서 아무런 유동이 표시되지 않는 정상적인 돼지에서의 급성의 LCx 폐색을 설명하고, 영상이 LCx층임을 정확하게 확인하고 감소된 혈류가 감소된 조영증강과 연관된다는 것을 확실하게 하였다. 도 4b는, lacZ를 이용한 유전자 전달 14일 후 IVS 및 LCx층사이의 조영증강에 있어서의 차이를 설명하고, 심방 조율동안(200bpm) 두 영역에서의 다른 혈류를 표시한다. 도 4c에서, FGF-5를 이용한 유전자 전달 14일 후 IVS 및 LCx층에서 조영증강이 등가인 것으로 나타나는데, 심방 조율동안의 두 영역에서의 유사한 혈류를 표시한다.

도 3은 모든 동물로부터의 그 두 영역에서의 비데오 강도의 컴퓨터 분석을 요약한다. 도 3에서, 심실간중격(IVS, 폐쇄되지 않은 좌측의 전하행 관상동맥을 통하여 정상적인 혈류를 받는 영역)에서의 피크 비데오 강도에 의하여 나누어진 허혈성 영역(LCx층)에서의 피크 비데오 강도(심근의 혈류의 상관물)의 비율로서 자료가 표현되었다. 두 영역에서의 동일한 유동은 1.0의 비율을 산출할 것이다. 유전자 전달전의 평균 0.5인 비율은, 격벽에서 보다 LCx층에서의 유동이 실질적으로 더 작다는 것을 표시한다. 도 3은, lacZ 유전자 전달을 받은 동물이 허혈성 영역에서 지속적인 혈류 부족을 가졌다는 것을 보여준다. FGF-5 유전자 전달을 받은 동물은 두 영역에서 균일한 조영증강을 보여주어서, 심근의 혈류에서의 2-배 증가가 허혈성 영역에서의 유동을 개선시켰다(p=0.0018, 2-방법 분산분석)는 것을 표시했다. 막대는 평균값을 나타내고 오차막대는 1 SE를 나타낸다.

도 5에서의 막대그래프는 현미경 분석을 요약하여, FGF-5를 이용한 유전자 전달을 받은 동물의 허혈성 영역 및 비허혈성 영역에서의 모세혈관수 대 섬유수 비율이, lacZ를 이용한 유전자 전달을 받았던 동물의 심장의 동일한 영역에 비교되었을 때 증가했다는 것을 보여준다. 막대는 각각의 집단안의 5-6마리의 동물로부터 얻은 평균값을 나타낸다. 오차막대는 1 SE, 유전자 효과에 대한 2-방법 분산분석으로부터의 p값을 나타낸다. 치료 집단에 대한 지식없이 분석을 수행하였다.

PCR 증폭 직후의 일렉트로페로그램(electropherograms)은, FGF-5를 이용한 유전자 전달 14일 후 세마리의 돼지의 LAD 및 LCx층에서의 JM17-CMV-FGF-5 DNA(예상되는 500bp 단편)의 존재를 확인하였다. RT-PCR 증폭 직후의 일렉트로페로그램은 FGF-5를 이용한 유전자 전달 14일 후 LAD 및 LCx층에서의 심장의 FGF-5 mRNA(예상되는 400bp 단편)의 존재를 확인하였지만, lacZ를 이용한 유전자 전달에서는 확인되지 않았다. 추가하여, 유전자 전달 2주후에, 모든 5마리의 lacZ-감염된 동물로부터의 심근의 샘플은 조직학적인 조사에 있어서 실질적인 β-갈락토시다제 활성을 보여주었다.

마지막으로, FGF-5에 대한 다각형의 항체를 사용한, 배양된 섬유아세포로부터의 세포 배지의 면역블로팅은 FGF-5의 유전자 전달 2일 후 단백질 발현과 세포외의 분비를 확인하였지만(n=4 플레이트), lacZ의 유전자 전달에서는 확인되지 않았다. 단백질 발현도 또한, FGF-5의 유전자 전달 14±1일 후 심근의 샘플안에서 확인되었지만, lacZ의 유전자 전달후에는 확인되지 않았다(n=4).

상기에 설명된 대로, 당업계에서 알려진 아데노-연관된 바이러스 벡터 및 다른 유전자 송달 벡터가 유사한 방법으로 사용될 수 있다.

실시예 5: 유전자 송달을 증강시키기 위한 혈관작용제의 사용

본 발명의 한 양태에서, 상기에서 설명된 대로, 바이러스 벡터와 같은 벡터를 이용한 유전자 전달의 효율은, 히스타민과 같은 혈관작용제를 이용하여 공동-주입되거나 이전-주입된 혈관안으로 벡터를 송달함으로써 증강된다.

이 예시적인 실시예에서, 본 발명자들은, lacZ 리포터 유전자(실시예 1에서와 같은)를 발현하는 앞서 언급된 아데노바이러스 벡터를 사용한 유전자 송달에 미치는 히스타민(전형적인 혈관작용제로서)의 효과를 검사하였다. 본 발명자들은 관상동맥의 히스타민 주입이 유전자 전달 효율을 극적으로 증가시킨다는 것을 밝혀냈다.

간단히 말해서, 돼지를 마취시키고 우측의 경동맥을 통하여 동맥의 접근을 얻었다. A 5 French 다목적 도자를 우측의 관상동맥(RCA)안에 배치하였고, 소공내로 2cm 삽입하였다. 약 3ml의 식염수를 3분에 걸쳐서 송달한 후 신속하게 이어서, lacZ를 발현하는 3 x 10¹¹개의 아데노바이러스의 바이러스 입자("vp")를 포함하는 2ml의 약 1.5분 주입을 하였다. 그리고나서 RCA로부터 도자를 제거하였고, 도자 끝을 좌측의 전하행 관상동맥(LAD)안에 배치하고, 다시 도자 끝을 LAD 관강내로 2cm 삽입하였다. 삽입후에, ml당 25㎍ 히스타민의 농도인 3ml의 히스타민을 3분에 걸쳐서 송달한 후 신속하게 이어서, lacZ를 발현하는 4.5 x 10¹¹개의 vp 아데노바이러스를 포함하는 3ml 용액의 2.25분 주입을 하였다. 전형적으로, 히스타민 주입은 벡터를 송달하기 전 몇분내에 수행되었다. 히스타민 주입을 하는 동안이나 한 후, 전신성 혈압, 심장박동수, 또는 심박에는 실질적인 변화가 없었다. 도자를 제거하고, 경부를 폐쇄하고, 동물이 회복하도록 하였다. LAD층안으로 주입된 바이러스 입자의 총 수가 RCA층의 바이러스 입자의 총 수의 약 1.5배(돼지 심장에 있는 이 층들의 상대적인 크기때문에)임에도 불구하고, LAD층이 RCA층보다 약 2 내지 3배 더 크기 때문에 바이러스 입자의 총 수에서의 증가가 표적화된 층의 상대적인 크기에 의한 상쇄보다 더 크다는 것이 주목되어야 한다.

5일 후에 동물을 희생시키고 심장을 파라포름알데히드를 이용하여 관류하였다. RCA 영역과 LAD 영역으로부터 전층의 절편들을 얻었다. β-갈락토시다제를 위한 기질인 X-갈 용액과 함께 샘플을 인큐베이션하고, 16시간후에 물질을 포매하고 절편으로 자르고 유리 슬라이드에 설치하고 에오신을 이용하여 염색하였다.

현미경 분석은, RCA층에 비교하여 LAD층에서의 유전자 전달 효율이 현저하게 증가했음을 드러냈다. 특히, 히스타민 처리의 부재하에서, 심장근세포의 약 30%가 관내 주입후 lacZ를 발현했다. 대조적으로, LAD 영역에 있는 거의 모든 근세포가 트랜스유전자 lacZ를 발현하여서, 대조표준 영역에 대조될 때 혈관작용제로 처리된 영역에서 유전자 전달의 효율이 몇배 증가된다는 것을 나타냈다. 실제로, 본원에서 예시된 대로의 혈관작용제의 사용은 표적화된 조직으로의 거의 완전한 유전자 송달이 생기게 한다.

Claims

조직이나 기관을 배급하는 동맥안으로 직접적으로 동맥내 주사를 함으로써 벡터를 송달하는 것을 포함하는 생체내에서의 표적화된 유전자 발현을 위한 방법으로서, 벡터는 동맥에 의하여 배급되는 혈관층에서 발현될 단백질을 암호화하는 트랜스유전자를 포함하고, 상기 동맥내 주사는 혈관작용제를 이용한 동맥의 주입과 동시에 또는 그 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기의 혈관작용제가, 상기 벡터를 주사하기 적어도 약 2분전에 동맥안으로 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장인자(VEGF) 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노-연관된 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 약 10⁷내지 약 10¹³개의 아데노바이러스 벡터 입자가 주사에서 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 약 10¹¹개의 아데노바이러스 벡터 입자가 주사에서 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트랜스유전자가 구성적인 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트랜스유전자가 조직-특이적인 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트랜스유전자가 심실의 근세포-특이적인 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 심실의 근세포-특이적인 프로모터가 심실의 미오신 경쇄-2의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 심실의 근세포-특이적인 프로모터가 미오신 중쇄 프로모터의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트랜스유전자가 맥관형성 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 맥관형성 단백질 또는 펩티드가 aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트랜스유전자가 맥관형성 단백질 또는 펩티드를 암호화하고, 하나 또는 둘 다의 관상동맥안으로 직접적으로 관내 주사(들)에 의하여 벡터가 환자의 심근층으로 송달됨으로써 상기 환자의 심근층에서 관상 부측혈관의 발달을 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 맥관형성 단백질 또는 펩티드가 aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 혈관 내피 성장인자 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 관내 주사가 좌측 또는 우측의 관상동맥의 관강안으로 적어도 약 1cm에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 관내 주사가 관상동맥에 추가하여 복재정맥 이식편 또는 내부의 유방동맥 이식편의 관강안으로 적어도 1cm에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 방법이 좌측의 전하행(LAD) 관상동맥 및 좌측의 궁상만곡(LCx) 관상동맥 및 우측의 관상동맥안으로 각각 한번씩, 세번의 주사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트랜스유전자가 β-아드레날린성 신호 단백질을 암호화하고, 하나 또는 둘 다의 관상동맥안으로 직접적으로 관내 주사에 의하여 환자의 심근층으로 벡터가 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 β-아드레날린성 신호 단백질이 β-아드레날린성 수용체(β-AR), G-단백질 수용체 키나제 억제제(GRK 억제제) 및 아데닐릴시클라제 (AC)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 VEGF인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 관내 주사가 좌측 또는 우측의 관상동맥의 관강안으로 적어도 약 1cm에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 관내 주사가 관상동맥에 추가하여 복재정맥 이식편 또는 내부의 유방동맥 이식편의 관강안으로 적어도 1cm에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 방법이 좌측의 전하행(LAD) 관상동맥 및 좌측의 궁상만곡(LCx) 관상동맥 및 우측의 관상동맥안으로 각각 한번씩, 세번의 주사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 벡터가 하나 또는 둘 다의 대퇴동맥안으로 직접적으로 대퇴동맥내 주사에 의하여 환자의 말초혈관계에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 벡터가 맥관형성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 트랜스유전자를 포함하고 말초혈관계에서 트랜스유전자를 발현함으로써 말초혈관계안의 부위에서 맥관형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 맥관형성 단백질 또는 펩티드가 aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트 또는 VEGF인 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 혈관작용제가 히스타민 또는 히스타민 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 복제-결함있는 아데노-연관된 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.