CN1301181A - 基因转移介导的血管生成疗法和血管内基因传递技术 - Google Patents

Abstract

通过将插入了转基因的载体直接注射到为所靶向组织供血的动脉内,优选结合应用在传递载体之前或同时将血管活性剂灌注到该动脉内,可以对外周血管病、心脏病和其它状况进行有效的体内基因治疗。

Description

基因转移介导的血管生成疗法和血管内基因传递技术

背景

发明领域

本发明涉及基因疗法，更具体地涉及病毒介导的和其它形式的基因疗法，还涉及某些载体构建体，包括腺病毒构建体，以及用于传递所需基因的技术。本发明更具体地涉及载体介导的基因传递，所述基因可用于促进心脏血管生成，还涉及使用所述载体和基因传递技术治疗外周血管病和心脏病，包括心肌缺血和其它疾病的方法。

技术背景

据美国心脏联合会(1995年统计副刊)报道，美国约有6000万成人患有心血管病，其中有1100万成人患有冠心病。心血管病每年造成约100万美国人死亡，占总死亡率的40％。1995年，美国有150万成人被诊断为心绞痛，因心肌短暂缺血而感到胸痛。美国每年新出现约350,000例心绞痛。

当心肌不能接受足够的血液供给因此缺乏必需水平的氧和营养物质时会出现心肌缺血。心肌缺血最常见的病因是动脉硬化，动脉硬化使得为心肌提供血流的血管(冠状动脉)堵塞。目前的治疗包括药理学疗法，冠状动脉分流术和使用如气囊血管成形术的技术进行的经皮换血管术。标准药理学疗法依据的策略是增加心肌的血液供给或降低心肌对氧和营养物质的需求。增加心肌的血液供给可通过如钙通道阻滞剂或硝酸甘油的药剂来实现。据认为这些药剂可通过使动脉壁的平滑肌松弛来增加患病动脉的直径。降低心肌对氧和营养物质的需求可通过降低心脏血液动力学负荷的药剂，如动脉血管舒张药或降低心脏对给定血液动力学负荷的收缩反应的药剂，如β-肾上腺素能受体拮抗剂来实现。缺血性心脏病的外科疗法基于用精心放置的分流移植物(通常是隐静脉或乳房内部的动脉移植物)来分流患病的动脉区段。经皮换血管术基于使用导管来降低患病冠状动脉的狭窄程度。所有这些策略都被用来降低心肌缺血发作的次数或根除此病，但它们都有这样那样的局限性。

初步报告描述了通过直接注射血管生成蛋白质或肽在心脏中生成了新血管，从而可治疗心肌缺血。生长和发育过程中血管生成的调节涉及成纤维细胞生长因子(FGF)家族的几个成员(即酸性成纤维细胞生长因子，aFGF；碱性成纤维细胞生长因子，bFGF；成纤维细胞生长因子-5,FGF-5等)。aFGF蛋白促进成年动物血管生成的作用是一个最新报道的主题。该报道中提到将被胶原包被的基质中的aFGF蛋白置于成年大鼠的腹腔中可导致血管分布良好并能正常灌注的结构(Thompson等，PNAS 86:7982-7932,1989)。据报道，将bFGF蛋白注入成年犬冠状血管闭塞的冠状动脉中会导致心肌功能障碍降低，心肌梗塞面积变小，危险区域的血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，科学257:1401-1403,1992)。使用bFGF蛋白在心肌缺血的动物模型中也可得到类似结果(Harada等，J Clin Invest 94:623-630,1994,Unger等，美国生理学杂志，266：H1588-H1595,1994)。

然而，用这些蛋白质达到血管生成效果的前提条件是：需要重复地或长期地传递该蛋白质，这就限制了在临床环境使用这些蛋白质刺激血管生成的实用性。换句话说，对人的成功疗法需要持续地和长期地灌注一种或多种这些血管生成肽或蛋白质，所述肽或蛋白质本身的价格高得让人不敢问津，而且需要通过置于冠状动脉中的导管来传递，这进一步抬高了价格并增加了治疗难度。

最近，多篇文献都致力于使用基因转移来治疗或预防疾病，包括心脏病，例见Mazur等，“冠状动脉再狭窄和基因治疗”，分子和细胞药理学，21:104-111,1994；French，“基因转移和心血管疾病”，Herz 18:222-229,1993；Williams，“缺血性心脏病基因疗法展望”，美国医学科学杂志，306:129-136,1993；Schneider和French，“腺病毒的出现：心血管病的基因疗法”，循环88:1937-1942,1993。另一篇文献，即Leiden等，题为“针对心脏和血管平滑肌的腺病毒介导的基因转移”的国际专利申请PCT/US93/11133中报道了使用腺病毒介导的基因转移来调节心血管平滑肌细胞的功能。Leiden等提到：可将含有编码基因产物之DNA序列的重组腺病毒传递至心脏或血管平滑肌细胞并维持细胞直至基因产物得以表达。根据Leiden等的报道，通过改变基因转录和改变基因转录产物，如多核苷酸或多肽的产生可调节肌细胞的功能。

使用腺病毒和其它载体成功地将基因转移至如心脏的器官仍有一定的困难。例如，将转基因插入快速分裂的细胞群体会导致转基因表达的时间大大缩短。这种细胞的例子包括构成所有血管内层的内皮细胞和分散在整个心脏中的成纤维细胞。还需着重考虑的是：靶向转基因以使仅有所需细胞能接受并表达转基因，而转基因不会全身性地分布。如果不能做到这一点，就会导致转基因的全身性表达并引发一系列问题。例如，经记载，肝脏中由腺病毒介导的基因转移会导致炎性渗入(Yang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)91:4407,1994)。

本文描述和要求的发明致力于解决和克服与现有技术有关的这样或那样的问题。

附图简述

图1显示了编码转基因之腺病毒的获救重组构建。

图2显示了用lacZ(对照基因)和FGF-5进行基因转移之前和14±1天之后，在右心房起博(HR=200bpm)过程中缺血血管床壁增厚的百分比(％WTh)，该百分比是通过测定舒张结束时血管壁的厚度(EDWTh)和收缩结束时血管壁的厚度(ESWTh)计算出的。用FGF-5转移之后，缺血血管床的功能增加了2.6倍(p=0.0001)，而对照基因却不起作用。

图3显示了用lacZ(对照基因)和FGF-5进行基因转移之前和14±1天之后，心房起博(200bpm)过程中的峰对比率(与血流相关)，该对比率以缺血区域(LCx床)的峰视频强度除以室间隔(IVS)的峰视频强度的比率表示，是使用基于计算机的视频分析程序由视频影像测得的。用FGF-5转移之后，流向缺血床的血流比正常情况下增加2倍(p=0.0018)，但用对照基因转移之后，血流只为正常情况下的50％。

图4显示了心肌对比超声心动描记图(未显示)的对应图，白色区域表示对比增强(更多血流)，黑色区域表示血流减少。图4A表示正常猪的急性LCx闭塞，图4B表示LacZ基因转移后14±1天，图4C表示FGF-5基因转移后14±1天。

图5显示了用FGF-5和lacZ基因转移之后，通过对缺血和非缺血区域进行显微分析而定量测定的毛细血管数目与纤维数目的比率。FGF-5基因转移之后，血管生成增加(p＜0.038)。

发明简述

本发明涉及用于治疗心脏病，如心肌缺血和外周血管病以及其它疾病的基因疗法，其中通过血管内传递导入基因治疗载体。本发明的一个目的是提供治疗心脏病的方法，其中通过用含有血管生成蛋白或肽(如FGF-5或FGF-4)基因的载体构建体，优选为病毒载体，如复制缺损的腺病毒构建体靶向心脏而持续地在心肌中产生治疗有效量的所述血管生成蛋白或肽，所述构建体是通过冠内注射传递的，优选通过导管传递，所述导管位于一个或两个冠状动脉或者一个或多个隐静脉或乳房内部动脉移植物(internal mammary artery graft)开口下较远的位置(一般至少约1cm)。因此，希望注射到一个冠状动脉或移植物动脉，优选注射到右和左冠状循环中。特别优选通过三次注射进行传递，一次注射至左前降(left anterior descending,LAD)动脉，一次注射至左旋(left circumflex,LCx)冠状动脉，一次注射至右冠状动脉。

如本文所述，为了进一步增强基因传递，优选在施用基因传递载体的同时在血管内传递所靶向的位点处灌注血管活性剂(例如组胺，组胺激动剂或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白)；最优选在导入载体之前的几分钟内灌注血管活性剂。

本发明的另一方面是治疗患有心肌缺血之患者的心脏病的方法，所述方法包括通过冠内注射，优选通过将载体直接注射至一个或两个冠状动脉(或移植物)中而将含有转基因的载体传递至患者的心肌中，以转染患病心肌的心肌细胞，所述载体含有编码血管生成蛋白或肽(例如FGF-5,FGF-4,aFGF,bFGF或VEGF(血管内皮生长因子))的转基因，并在心脏中表达转基因，籍此促进患病心肌区域的血管生成。如下文所述，也可使用其它转基因，例如编码β-肾上腺素能信号传导蛋白的基因。本发明所用载体可以是质粒，或优选为病毒载体，例如复制缺损的腺病毒或腺伴随病毒(AAV)。通过以10⁷-10¹³个病毒颗粒的优选量(经光密度测定法测定，更优选为10⁹-10¹¹个病毒颗粒)，将病毒载体原种，例如不含有野生型病毒的上述原种深深注射至一个或两个冠状动脉(或移植物)的腔中，优选注射至右和左冠状动脉(或移植物)中，可以用编码血管生成蛋白或肽的基因局部转染患病心肌内所需数目的细胞，尤其是心肌细胞，从而使基因转移的治疗效力最大化，并使心脏外位点不必要的血管生成和对病毒蛋白质之炎症反应的可能性最小化。如果使用的是心室肌细胞特异性的启动子，启动子能更可靠地确保只在心肌细胞中进行表达从而避免非心组织，如视网膜中血管生成的潜在有害的影响。为了进一步增强本发明基因传递载体的局部传递，可以按本文所述的方式利用导管在心肌中灌注血管活性剂，优选灌注组胺或组胺激动剂或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白。

另一方面，本发明提供了经过滤可以注射的腺病毒载体制品，其含有重组腺病毒载体和药学可接受的载体，优选最终的病毒滴度为10⁷-10¹³个病毒颗粒，所述载体不含野生型病毒，但含有部分腺病毒序列，其中一个或多个赋予复制能力所需的腺病毒基因，例如EIA/EIB基因已缺失，还含有侧翼为部分腺病毒序列的启动子驱动的编码血管生成蛋白或肽(如aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5或VEGF)的转基因。通过使用这一可注射的腺病毒载体制品，任选同时使用血管活性剂如组胺或组胺激动剂或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白增强本文所述的基因传递，可以进行有效的腺病毒介导的FGF基因传递以治疗心脏病，如临床心肌缺血或外周血管病，而没有任何有害的副作用。

另一方面，本发明提供了生产含有重组载体的病毒原种的方法，其中所述载体能在心肌中体内表达血管生成蛋白或肽，所述生产方法包括将转基因(优选编码血管生成蛋白或肽，如FGF-4,FGF-5,aFGF,bFGF或VEGF)克隆至含有启动子、多接头以及位于侧翼的人腺病毒5基因组左末端的部分腺病毒序列的质粒中，其中赋予复制能力的一个或多个所需的腺病毒基因，例如EIA/EIB基因已缺失；用所述质粒与含有整个人腺病毒5基因组和另外的插入物使得质粒太大以致于不能被包裹的质粒共转染用缺失的复制所需基因转化的哺乳动物细胞，籍此在含有转基因的质粒和具有整个腺病毒基因组的质粒之间发生获救重组，从而产生含有转基因而不含复制所需基因的重组基因组，所述重组基因组小得足以被包裹；鉴定细胞培养物中成功的重组子；在被缺失的复制所需基因转化的哺乳动物细胞中增殖所得重组子；纯化增殖的重组子使其中含有重组载体，而不含野生型病毒，任选将纯化的载体穿过滤器，优选为10-50微米的滤器，更优选为30微米的滤器。

另一方面，可通过插入股动脉近侧部分的导管来传递表达血管生成肽或蛋白质的重组腺病毒，优选同时使用血管活性剂，如组胺或组胺激动剂，从而将基因转移至接受来自股动脉之血流的骨骼肌细胞中。籍此提供血管生成刺激物，导致腿骨骼肌中的血管生成，从而治疗特征在于腿肌肉供血不足的外周血管病。

在本发明的另一方面，通过将载体传递至用血管活性剂，如组胺或组胺激动剂或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白共灌注或预灌注的血管(如动脉)中，可增强使用载体，如病毒载体(如腺病毒或腺伴随病毒)进行基因传递的效力。最优选在导入载体之前的几分钟内将血管活性剂灌注至血管中。

优选实施方案的详细描述本发明的转基因

在本发明中，可使用多种能促使心肌血流向心脏(对外周血管病而言为骨骼肌)缺血区域的蛋白质或肽生长因子以及其它转基因。至于待表达的血管生成蛋白或肽，可例举如aFGF,bFGF,FGF-4和FGF-5的血管生成蛋白或肽。在蛋白质灌注的过程中合理地确定了FGF家族的血管生成活性(YanagisawaMiwa等，科学，257:1401-1403,1992,Harada等，J Clin Invest 94:623-630,1994,Unger等，美国生理学杂志，266:H1588-H1595,1994)。也可使用VEGF(血管内皮生长因子，它是新血管生成的有效刺激物)基因。基因转移方法的成功需要合成基因产物并由转染细胞分泌该产物。由此看来，编码FGF-5或FGF-4的基因是优选的，优选选择的基因中包括信号肽编码序列，该序列使得基因产物(一旦被表达)可进入心脏(或骨骼肌)间质组织并诱导血管生成。可以使用的血管生成蛋白包括成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板-衍生的生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF)等家族的成员。FGF家族成员包括但不限于aFGF(FGF-1),bFGF(FGF-2),FGF-4(也称为“hst/KS3”),FGF-5,FGF-6。体外和体内的心肌细胞对缺血所作的反应是表达VEGF；VEGF是生理状况下以及对病理状况的适应反应过程中血管生成的调节剂(Banai等，循环89:2183-2189,1994)。VEGF家族包括但不限于VEGF-A亚族的成员(如VEGF-121,VEGF-145,VEGF-165,VEGF-189和VEGF-206)以及VEGF-B亚族的成员(如VEGF-167和VEGF-186)和VEGF-C亚族。PDGF家族包括PDGF A和PDGF B。编码这些蛋白质之基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列是本领域已知的(例见这些和其它序列的GENBANK序列数据库)。有关FGF家族，例见Burgess,Ann,N.Y.Acad.Sci.638:89-97,1991；Burgess等，生物化学年评，58:575-606,1989；Muhlhauser等，人类基因治疗6:1457-1465,1995；Zhan等，分子细胞生物学，8:3487,1988；Seddon等，Ann,N.Y.Acad.Sci.638:98-108,1991。有关人hst/KS3(即FGF-4)，例见Taira等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2980-2984,1987。有关人VEGF，例见Tischer等，生物化学杂志，206:11947-11954,1991和其中的参考文献；Muhlhauser等，Cir.Res.77:1077-1086,1995。从诸如GenBank或EMBL的序列数据库中易于得到所述基因和所编码多肽的序列资料。也可使用例如PCR或本领域的常规杂交技术从基因文库中得到编码这些蛋白质的多核苷酸。编码FGF-4,FGF-5或FGF-6的基因是优选的，因为这些蛋白质含有功能性的分泌信号序列，易于从细胞中分泌出来。很多(如果不是大多数)人VEGF蛋白(包括但不限于VEGF-121和VEGF-165)也是易于分泌的，并且在分泌之后可以扩散。因此，这些血管生成蛋白一旦表达，即易于进入心脏间质组织并诱导血管生成。至于缺乏天然分泌信号序列的其它血管生成蛋白，如aFGF(FGF-1)和bFGF(FGF-2)，使用本领域技术人员熟知的标准重组DNA方法学可重组产生具有分泌信号序列的融合蛋白。据信aFGF和bFGF天生具有一定的分泌水平；然而，可再包含另外的分泌信号序列以增强蛋白质的分泌。分泌信号序列一般位于所需蛋白质的N末端，但也可位于适于分泌血管生成因子的任何位置。例如，含有适当信号序列的多核苷酸可与选定血管生成蛋白基因的第一个密码子5’端融合。适当的分泌信号序列包括FGF-4,FGF-5,FGF-6基因的信号序列或不同分泌蛋白，如IL-1β的信号序列。血管生成蛋白经修饰可含有另一种蛋白质的信号序列，所述修饰如用介导分泌第二种分泌型蛋白质的残基取代血管生成蛋白中的残基，例见1997年5月6日提交的共同悬而未决的美国流水号08/852,779(列入本文作为参考)。可使用心肌细胞正常分泌之蛋白质的信号序列。为了治疗人，优选使用来源于人的编码血管生成蛋白的基因，但也可使用来源于其它哺乳动物，并表现出种间交叉反应性，即在人中具有血管生成活性的血管生成蛋白。

除了血管生成因子以外，也可使用能增强心脏功能的β-肾上腺素能信号传导蛋白(β-ASP)。这种β-ASP的例子包括β-肾上腺素能受体(β-AR),G-蛋白受体激酶抑制剂(GRK抑制剂)和腺苷酸环化酶(AC)，其详细描述于1997年9月5日提交的共同悬而未决的美国流水号08/924,757(基于1997年6月16日提交的美国申请60/048,933和1996年9月5日提交的美国申请08/708,661)以及1997年9月5日提交的PCT/US97/15610和1998年1月16日提交的美国继续申请流水号08/…。这些和所有其它专利申请以及专利申请中提及的参考文献都列入本文作为参考。基因传递所用的载体

在本发明的方法中，载体可以是质粒载体或病毒载体，例如复制缺损的腺病毒载体或腺伴随病毒载体。下文提供了描述多种载体(包括病毒和非病毒载体)的构建和使用的参考文献。

作为实例，将所需基因体内转移至心脏(或骨骼肌)，包括心肌细胞(和骨骼肌细胞)并介导所编码蛋白质的组成型产生。可以使用几种不同的基因转移方法，优选使用不依赖于辅助病毒的复制缺损的人腺病毒系统。通过使用该系统，我们证明通过单次冠内注射可体内转染60％以上的心肌细胞(Giordano和Hammond，临床研究，42:123A,1994)。非复制型重组腺病毒载体对转染冠状内皮细胞和心肌细胞并在冠内注射后获得高度有效的转染特别有用。对转染外周血管系统的靶细胞也特别有用。

基于人腺病毒5(病毒学，163:614-617,1988)的重组腺病毒载体缺乏腺病毒基因组中必需的早期基因(通常是E1A/E1B)，因此不能复制，除非在可反式提供缺失基因产物的允许细胞系中生长时才能复制。替代缺失的腺病毒基因组序列，可克隆所需的转基因并在被该复制缺损的腺病毒感染的组织/细胞中表达。尽管基于腺病毒的基因转移不会使转基因整合至宿主基因组(低于0.1％的腺病毒介导的转染会导致转基因掺入宿主DNA)，因此是不稳定的，但腺病毒载体可以高滴度增殖并转染非复制细胞。尽管转基因不能传递至子代细胞，但基因转移至不分裂的成年骨骼肌和心肌细胞是可以接受的。逆转录病毒载体提供了稳定的基因转移，目前经由逆转录病毒假型化可以得到高滴度的病毒载体(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)90:8033-8037,1993)，但最新的逆转录病毒载体不能有效转导非复制细胞(成年骨骼肌和心肌细胞)。另外，如果只需进行短期基因转移即已足够的话，转基因掺入宿主DNA的潜在危害就不复存在。实际上，我们已发现在有限的时间内表达血管生成蛋白就足以生成大量血管，对心血管病和外周血管病进程进行瞬时基因转移即可进行充分的治疗。

被腺病毒E1A/E1B基因转化的人胚肾细胞，即人293细胞是有用的允许细胞系的典型代表。然而，也可使用允许复制缺损的腺病毒载体在其中增殖的其它细胞系，包括HeLa细胞。构建基因传递所用的重组腺病毒载体和其它载体

通过Graham，病毒学163:614-617,1988所述的获救重组技术可构建本发明中所用的所有腺病毒载体。简单地说，将所需转基因克隆至含有启动子、多接头和部分侧翼腺病毒序列的穿梭载体中，该部分腺病毒序列中已缺失了EIA/EIB基因。作为穿梭载体，可例举质粒pAC1(病毒学，163:614-617,1988)(或类似物)，其编码人腺病毒5基因组左末端部分(病毒学，163:614-617,1988)，并缺失了对病毒复制至关重要的编码早期蛋白质的E1A和E1B序列；和质粒ACCMVPLPA(生物化学杂志，267:25129-25134,1992)，其含有多接头，CMV启动子和SV40聚腺苷酸化信号，以及位于侧翼的EIA/EIB基因已缺失的部分腺病毒序列。质粒pAC1或ACCMVPLA的使用便于克隆过程。然后用穿梭载体与含有整个人腺病毒5基因组，因长度太大以致于不能被包裹的质粒共转染293细胞。通过磷酸钙沉淀或脂转染法(生物技术，15:868-872,1993)可进行共转染。质粒JM17编码整个人腺病毒5基因组及载体pBR322的一部分，其中包括氨苄青霉素抗性基因(4.3kb)。尽管JM17编码获得成熟的病毒颗粒所必需的所有腺病毒蛋白质，但它太大以致于不能被包裹(40kb，而野生型为36kb)。在共转染细胞的一小群中，含有转基因的穿梭载体(如质粒pAC1)和具有整个腺病毒5基因组的质粒(如质粒pJM17)之间的获救重组提供了E1A/E1B序列缺损的重组基因组，其含有所需转基因，但在重组过程中失去了额外的序列，如pBR322序列，因而小得足以被包裹(见图1)。关于上述方法，我们已报道了成功的结果(Giordano等，循环88:1-139,1993和Giordano和Hammond，临床研究，42:123A,1994)。可使用CMV驱动的编码β-半乳糖苷酶的腺病毒HCMVSP1lacZ(CLIN RES 42:123A,1994)，利用X-gal处理来评价基因转移的效力。

最初的基因转移模式使用了上文所述的腺病毒载体。这些载体的优点包括能实现高效基因转移(体内转染60％以上的靶器官细胞)，易于得到高滴度的病毒原种，并且这些载体还能对如心肌细胞的不分裂细胞进行基因转移。

描述多种其它基因传递载体的文献是本领域已知的，本文提到了其中的一些文献。所述其它载体包括例如其它病毒载体(如腺伴随病毒(AAV))，脂质体和其它含有脂质的复合物，和其它能介导多核苷酸传递至宿主细胞的大分子复合物。如上文和所述参考文献中所述，载体也可含有其它能进一步调节基因传递和/或基因表达，或要不然能为靶细胞提供有利特性的组分或功能元件。所述其它组分包括例如可影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取后多核苷酸在细胞中的定位的组分(如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。所述组分也可包括标记物，如可用于检测或选择已吸收并表达由载体传递之核酸的细胞的可测的和/或可选择的标记物。所述组分可作为载体的天然特征被提供(例如使用某些具有介导结合和摄取的组分或功能元件的病毒载体)，或者对载体进行修饰以提供所述功能元件。选择标记可以是阳性，阴性或双功能的。阳性选择标记可选择携有标记物的细胞，而阴性选择标记可选择标记物被选择性消除的细胞。已描述了多种标记基因，其中包括双功能(即阳性/阴性)标记(例见Lupton,S.,WO92/08796,1992年5月29日公开；和Lupton,S.,WO94/28143,1994年12月8日公开)。这种标记基因另外还可作为对照，这对基因治疗过程而言是有利的。多种此类载体是本领域已知的，并且一般是可以得到的(例见上述多篇文献)。

描述本发明方法中可用的腺病毒载体和其它病毒载体的其它文献包括下列：Horwitz,M.S.，腺病毒科及其复制，Fields,B等(编)，病毒学，Vol.2,Raven出版社，纽约，p1679-1721,1990；Graham,F等，p109-128，分子生物学方法，Vol.7:基因转移和表达方法，Murray,E(编)，Humana出版社，Clifton,N.J(1991)；Miller,N等，FASEB Journal 9:190-199,1995；Schreier,H.PharmaceuticaActa Helvetiae 68:145-159,1994；Schneider and French，循环，88:1937-1942,1993；Curiel D.T等，人类基因治疗，3:147-154,1992；Graham,F.L等，WO 95/00655(1995年1月5日)；Falck-Pedersen,E.S.,WO 95/16772(1995年6月22日)；Denefle,P等，WO 95/23867(1995年9月8日)；Haddada,H等，WO94/26914(1994年11月24日)；Perricaudet,M等，WO 95/02697(1995年1月26日)；Zhang,W等，WO 95/25071(1995年10月12日)。多种腺病毒质粒也可以商购自，包括例如Microbix Biosystems ofToronto,Ontario(例见Microbix产品目录：腺病毒载体构建所用质粒，1996)，也可参见Vile等的论文，天然生物技术，15:840-841,1997,Feng等，天然生物技术，15:866-870,1997，其中描述了可用于基因传递的腺病毒/逆转录病毒嵌合载体的构建和使用。

描述本发明方法中可用的AAV载体的其它文献包括下列：Carter,B，细小病毒手册，vol.1,p169-228,1990；Berns，病毒学，p1743-1764(Raven出版社，1990)；Carter,B.，生物技术最新观点，3:533-539,1992；Muzyczka,N.，微生物学和免疫学最新论题，158:92-129,1992；Flotte,T.R等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7:349-356,1992；Chatterjee等，Ann.NY Acad.Sci.,770:79-90,1995；Flotte,T.R等，WO 95/13365(1995-5-18)；Trempe,J.P等，WO 95/13392(1995-5-18)；Kotin.R.，人类基因治疗，5:793-801,1994；Flotte,T.R等，基因治疗，2:357-362,1995；Allen,J.M.,WO 96/17947(1996-6-13)；和Du等，基因治疗，3:254-261,1996。

描述本发明方法中可用的非病毒载体的其它文献包括下列：Ledley,FD，人类基因治疗，6:1129-1144,1995；Miller,N等，FASEB Journal 9:190-199,1995；Chonn.A等，生物技术最新观点，6:698-708,1995；Schofield,J.P等，British Med.Bull.51:56-71,1995；Brigham,K.L等，脂质体研究杂志，3:31-49,1993；Brigham,K.L.,WO 91/06309(1991-5-16)；Felgner,P.L等，WO 91/17424(1991-11-14)；Solodin等，生物化学34:13537-13544,1995；WO 93/19768(1993-10-14)；Debs等，WO 93/25673；Felgner,P.L等，美国专利5,264,618(1993-11-23)；Epand,R.M等，美国专利5,283,185(1994-2-1)；Gebeyehu等，美国专利5,334,761(1994-8-2)；Felgner,P.L等，美国专利5,459,127(1995-10-17)；Overell,R.W等，WO95/28494(1995-10-26)；Jessee,WO 95/02698(1995-1-26)；Haces和Ciccarone,WO 95/17373(1995-6-29)；Lin等，WO 96/01840(1996-1-25)。组织特异性启动子

本发明也希望不仅通过将转基因传递至冠状动脉或股动脉，还使用组织特异性启动子进行细胞靶向。通过将左心室肌球蛋白轻链-2(MLC_2v)或肌球蛋白重链(MHC)的组织特异性转录控制序列与腺病毒构建体内的转基因，如FGF-5融合，可将转基因的表达局限于心室心肌细胞。针对lacZ，使用本发明的重组腺病毒系统测定了由MLC_2v和MHC启动子提供的基因表达的效力以及特异性程度。Lee等以前曾报道过心脏特异性表达(生物化学杂志，267:15875-15885,1992)。MLC_2v启动子由250bp组成，容易符合腺病毒-5的包装限制范围。已知肌球蛋白重链启动子是强有力的转录启动子，它是另一个合理的心脏特异性启动子，由低于300bp组成。尽管其它启动子(如肌钙蛋白-C启动子)是高效的并且足够小，但却缺乏足够的组织特异性。通过使用MLC_2v或MHC启动子并在体内传递转基因，据信只有心肌细胞(即在心脏内的内皮细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞中不相伴表达)中足量表达了血管生成蛋白，如FGF-5以促进血管生成。将表达局限于心肌细胞对利用基因转移治疗临床心肌缺血是有利的。通过将表达局限于心脏，避免了非心脏组织(如视网膜)中血管生成的潜在有害的影响。另外，在心脏细胞中，由于肌细胞不会快速转换，因而可能提供最长的转基因表达；因此表达不会因内皮细胞可能会发生的细胞分裂和死亡而降低。已得到了内皮细胞特异性的启动子可用于此目的(Lee等，生物化学杂志，265:10446-10450,1990)。

在本发明中，关于治疗心脏病，目前优选通过冠内注射高滴度的载体靶向心脏并转染所有细胞类型。增殖并纯化腺病毒载体

可根据标准方法噬斑纯化成功的重组载体。在反式提供E1A和E1B功能的293细胞上增殖所得的病毒载体至滴度的优选范围为10¹⁰-10¹²个病毒颗粒/ml。然后感染80％铺满的细胞，48小时后收获病毒。3次冻融循环之后，离心沉淀细胞碎片，通过CsCl梯度超离心(优选双CsCl梯度超离心)纯化病毒。体内注射之前，通过Sepharose柱(如G25Sephadex)进行凝胶过滤使病毒原种脱盐。然后将产物流经30微米的滤器以过滤，籍此降低冠内注射未经过滤的病毒的有害影响(对生命有威胁的心率失常)并促进有效的基因传递。所得病毒原种最终的病毒滴度范围为10¹¹-10¹²个病毒颗粒/ml。重组的腺病毒必需是高度纯化的，不含野生型(可能会复制的)病毒。不纯的构建体可导致宿主动物强烈的免疫应答。由此看来，可通过例如使用适当引物经PCR鉴定成功的重组子，进行两轮噬斑纯化和双CsCl梯度超离心进行增殖和纯化以排除污染物和野生型病毒。另外，我们发现通过在冠内注射之前将重组腺病毒流经适当大小的滤器进行过滤即可避免因将腺病毒载体注射至患者体内而诱导的心率失常的相关问题。此策略似乎可大大改善基因转移和表达。重组载体的传递

本发明的载体，包括病毒载体以及非病毒载体可以是(例如，必要时)含有药物可接受的载体，如盐水的可注射制剂形式。

优选的载体是上文所述的复制缺损的腺病毒载体。可注射制剂中该载体最终滴度的优选范围为允许有效基因转移的10⁷-10¹³个病毒颗粒。下文描述了其它药物学载体，制剂和剂量。通过在荧光镜的指导下，使用基于标准经皮导管的方法，灌注一个或两个冠状动脉(或移植血管)可将载体转基因构建体传递至心肌，灌注的量足以使转基因的表达水平可达到高效治疗。

注射应深入冠状动脉(或移植血管)的腔内(动脉腔内约1cm)，优选在两个冠状动脉内进行，因为各个患者的侧血管生长是高度可变的。因此，也包括注射至一个冠状动脉或移植动脉；然而，优选注射至右和左冠状动脉循环。特别优选通过三次注射进行传递，一次注射至左前降动脉(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠状动脉，一次注射至右冠状动脉。通过用冠状导管直接将治疗物质注射至冠状动脉腔内(当需要增强基因治疗时，优选与血管活性剂联合，如组胺或组胺激动剂或VEGF蛋白)，可以更有效地靶向基因，并使注射过程中流向近侧主动脉的重组载体损失最小化。我们发现当以此方式传递时，基因表达不会在肝细胞中发生，在冠内注射后任何时间的尿液中也未曾发现病毒RNA。本发明可使用任一种冠状导管或使用例如Stack灌注导管。另外，也可使用本领域技术人员已知的其它技术将基因转移至动脉壁。

可以类似的方法经由动脉内灌注至供给靶组织的动脉内而将基因传递至其它器官或组织，优选按本文所述联合灌注血管活性剂，如组胺或组胺激动剂或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白以增强基因传递。

作为实例，为了治疗外周血管病(其特征在于腿部供血不足)，可通过插入股动脉近侧部分的导管来传递表达血管生成肽或蛋白质的重组载体，优选联合使用血管活性剂，如组胺或组胺激动剂，从而将基因转移至接受来自股动脉之血流的骨骼肌细胞中。籍此提供血管生成刺激物，导致欲治疗的腿骨骼肌中的血管生成，同时使血流增加。

本文所用的血管活性剂指的是可诱导血管通透性增加并增强大分子(如基因传递载体)转移穿过毛细血管壁的天然或合成的物质。通过增加血管对大分子的通透性或要不然便于大分子转移至被动脉灌注的毛细血管床中，血管活性剂可增强这些载体至靶位点的传递，因而有效地增强转基因在靶组织中的全面表达。在下文说明性的实施例中(例见实施例5)，将组胺用作血管活性剂，发现它能大大增强载体至灌注位点如心肌的传递。可以使用的组胺衍生物(和激动剂，如与组胺H1受体相互作用的那些化合物)包括例如2-甲基组胺，2-吡啶基乙胺，培他司汀(betahistine)和2-噻唑基乙胺。这些和其它组胺激动剂描述于例如Garrison JC.,Goodman和Gilman，治疗剂的药物学基础(第8版:Gilman AG,Rall TW,Nies AS,Taylor P编)Pergamon出版社，1990,p575-582。

除了组胺和组胺激动剂可用作血管活性剂以外，血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF激动剂(如上文和提到的参考文献中所述)也可使血管通透性增加，因此在本文所述的组合物和方法中也可用作血管活性剂以增强基因传递。与组胺一样，优选在灌注载体之前的几分钟内将VEGF灌注至供给靶位点的血管中。关于人VEGF，可参见例如Tischer等，生物化学杂志，206:11947-11954,1991和其中的参考文献；和Muhlhauser等，循环研究，77:1077-1086,1995。

可在施用载体的同时导入血管活性剂，但优选在导入载体前的几分钟内将血管活性剂导入靶位点(例如通过预灌注)以使血管活性剂能在细胞暴露于载体之前在灌注细胞中引发反应。不希望受理论的束缚，据信施用这种血管活性剂可增强穿过毛细血管内皮细胞壁的跨毛细血管囊转运，从而便于转移大分子复合物，如病毒载体。心肌缺血的动物模型

成功地研究基因治疗的重要前提条件是(a)组建适用于临床心肌缺血的动物模型，该模型可提供有关心肌缺血情况下血管生成机理的有用数据，和(b)准确评价基因转移的效果。由此看来，现有技术无一令人满意。我们已使用了模拟临床冠状动脉病的猪心肌缺血模型。将ameroid缩窄器置于左旋(LCx)冠状动脉的周围会导致逐步完全的闭塞(在置入7天内)，而梗塞的程度最低(左心室1％,LCx床4±1％)(Roth等，循环，82:1778,1990,Roth等，美国生理学杂志，235:H1279,1987,White等，循环研究，71:1490,1992,Hammond等，Cardiol23:475,1994和Hammond等，J Clin Invest 92:2644,1993)。由于生成了侧血管，先前被闭塞动脉灌注的区域(指的是缺血区域)的心肌功能和血流在休息时是正常的，但是当心肌对氧的需求增加时，血流储备不足以防止缺血。因此，LCx床遭遇类似于临床心绞痛的阵发性缺血。在放置ameroid后21天内，侧血管生成和流动-功能的关系是稳定的，在4个月内保持不变(Roth等，循环，82:1778,1990,Roth等，美国生理学杂志，235:H1279,1987,White等，循环研究，71:1490,1992)。经远距测定法证实，动物体内处于危险之中的血管床在整个白天表现出周期性的缺血机能异常，这与饲喂过程被管理员中断时心率的突然增加有关(数据未公开)，因此，该模型所具有的血管床具有稳定但不充足的侧血管，因而会发生周期性的心肌缺血。该模型的另一个与众不同的优点是有一个正常灌注和起作用的区域(LAD床)与异常灌注并起作用的区域(LCx床)相邻，籍此在每个动物体内提供一个对照床。

使用心肌对比超声心动描记法估计区域性心肌灌注。对比材料由半乳糖的微聚集体组成，可增加影像的回波产生(白色)。微聚集体以同血流成比例的方式分布于冠状动脉和心肌壁(Skyba等，循环，90:1513-1521,1994)。经微球体测定，已证明对比峰的强度与心肌血流密切相关(Skyba等，循环，90:1513-1521,1994)。为了证明本发明所用的超声心动描记法可准确地鉴定LCx床，而且可使用心肌对比超声心动描记法评价心肌血流，可将液压套闭塞器置于LCx近侧周围，与ameroid相邻。

在本研究中，当处死动物时，(在生理压力下，用戊二醛原位)灌注固定心脏以通过显微镜定量毛细血管的生长。使用PCR检测已接受基因转移的动物心肌中的血管生成蛋白DNA和mRNA。另外，如下文所述，基因转移2周后，取自所有5只lacZ感染动物的心肌样品都在组织学检查中显示出显著的β-半乳糖苷酶活性。最后，使用针对血管生成蛋白的多克隆抗体阐明了取自已接受基因转移的动物的细胞和心肌中血管生成蛋白的表达。

治疗研究的策略包括转基因传递的时机，转基因施用的途径和血管生成基因的选择。在心肌缺血的ameroid模型中，在生成了稳定但不充足的侧血管之后进行基因转移。使用ameroid模型的先前研究包括在发生心肌缺血和产生侧血管之前，在闭塞ameroid的过程中传递血管生成肽。然而，因下列几个原因不使用该策略。首先，以前的研究不适于准确地再现治疗临床心肌缺血时(其中在不断发展的心肌缺血状态下进行基因转移)所处的状态；以前的研究类似于在心肌缺血之前提供肽，因此相关性较差。第二，根据以前对细胞培养物的研究，推测缺血刺激与肽联合可能是刺激血管生成的最佳环境。在心肌缺血已经发生时传递转基因可以最好地达到上述目的。与这些决定相关的是选择获得转基因传递的方法。技术应适用于随后进行的对冠状动脉病患者的治疗这一限制因素使得几种方法站不住脚(不断将肽灌注至冠状动脉，直接将质粒注射至心脏，用含有肽的树脂包被心脏以提供长期缓慢的释放)。最后，猪模型提供了极好的方法，可以在基因传递之前和之后追踪区域性血流和功能。接受相同重组腺病毒构建体但具有报道基因的对照动物的使用为这些研究提供了对照。本领域技术人员应懂得下文中所描述的猪的结果可以预测人的结果。猪天生具有与人非常类似的冠状动脉循环，包括缺乏天生的冠状侧血管。治疗应用

本发明的载体，如复制缺损的腺病毒可以在体内进行高效基因转移而不会在基因表达区域引起细胞病变或炎症。根据下文实施例中将进一步描述的这些结果，可以看出水平足够高的体内基因转移在体内进行，获得了功能上的改变。在治疗心脏病时，通过冠内注射对血管生成蛋白进行基因转移可促进血管生成并增强心脏功能。因此，可在观察到最初的心肌缺血发作之后对心肌缺血进行治疗。另外，在基因转移之后，缺血区域的毛细血管数目、血流和功能会增加。将这些技术应用于临床将十分有用，对不能手术的冠状动脉病和致人死地的心绞痛尤其有用。本发明的数据证明表达成纤维细胞生长因子(如FGF-5)的重组腺病毒的基因转移能有效地大大降低心肌缺血的发病率。血管生成蛋白和转基因也可用于1997年5月6日提交的共同悬而未决的美国申请流水号08/852,779(列入本文作为参考)中所述的组合物和治疗方法。如本文所述，血管活性剂，如组胺或组胺激动剂或VEGF蛋白可与这些方法和组合物联合使用以进一步增强血管内注射所靶向位点的基因传递。

如上文所述，也可使用β-肾上腺素能信号传导蛋白(β-ASP)，例如β-肾上腺素能受体(β-AR),G-蛋白受体激酶抑制剂(GRK抑制剂)和腺苷酸环化酶(AC)来增强心脏功能，其详细描述于1997年9月5日提交的共同悬而未决的美国流水号08/924,757(基于1997年6月16日提交的美国申请60/048,933和1996年9月5日提交的美国申请08/708,661)以及1997年9月5日提交的PCT/US97/15610和1998年1月16日提交的美国继续申请流水号08/…，这些参考文献都列入本文作为参考。如本文所述，血管活性剂，如组胺或组胺激动剂或VEGF蛋白可与这些方法和组合物联合使用以进一步增强血管内注射所靶向位点的基因传递。

本发明的组合物或产物可以适于冠内给药的制剂形式方便地提供。适当的给药方式最好由医务人员根据各个患者的情况来确定。适当的药物可接受的载体及其制剂描述于标准的有关制剂的论文中，例见E.W.Martin的Remington药物科学，也可参见Wang,Y.J和Hanson,M.A.蛋白质和肽的胃肠外制剂：稳定性和稳定剂”，Journals ofParental Science and Technology,Technical Report No.10,Supp.42:2S(1988)。应优选在中性pH，例如约pH6.5至约pH8.5，更优选在约pH7至8的溶液中配制本发明的载体，加入赋形剂，如4.5％甘露糖醇或0.9％氯化钠使溶液大致等渗，用本领域已知的一般被认为是安全的缓冲溶液，如磷酸钠来缓冲pH，另外还可加入可接受的防腐剂，如0.1％至0.75％的间甲酚，更优选为0.15％至0.4％的间甲酚。使用氯化钠或其它药物可接受的试剂，如葡萄糖，硼酸，酒石酸钠，丙二醇，多元醇(如甘露糖醇和山梨糖醇)或其它无机或有机溶质可获得所需的等渗性。对于含有钠离子的缓冲液，特别优选氯化钠。必要时，也可制备上述组合物溶液以增强贮存期限和稳定性。根据通常可接受的方法混合成分即可制备本发明的治疗有用的组合物。例如，可混合选定的成分以产生浓缩的混合物，再通过加入水调整至最终的浓度和粘度和/或加入缓冲液以控制pH或加入其它溶质控制张力。

为了便于医师使用，所提供的组合物的剂量形式中所含本发明载体的量应能在一个或多个剂量中有效诱导一定水平的血管生成。本领域技术人员应理解，治疗剂的有效量因多个因素的不同而不同，所述因素包括患者的年龄和体重，患者的生理状况和想达到的血管生成水平和其它因素。

本发明优选化合物，如复制缺损的腺病毒的有效剂量一般至少约为10⁷个病毒颗粒，优选约为10⁹个病毒颗粒，更优选约为10¹¹个病毒颗粒。病毒颗粒的数目可以达，但优选不超过10¹³个。需说明的是，给药的精确剂量由临床护理医生决定，但优选于1ml磷酸缓冲盐水中。

为了治疗心脏病，本发明优选的给药模式是使用适当的冠状导管冠内注射一个或两个冠状动脉(或一个或多个隐静脉或乳房内部动脉移植物)。如本文所述，优选注射至右和左冠状动脉循环。特别优选通过三次注射进行传递，一次注射至左前降动脉(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠状动脉，一次注射至右冠状动脉。尽管两次左冠状动脉进行系列注射比较方便，但这应在注射右冠状动脉之前或之后进行。在右冠状动脉不易进入的情况下(不具有搭桥并行血管因而闭塞的结果或因为太小而不能进行选择性注射)，全部的载体剂量可都通过注射至左冠状动脉循环(优选为上述的LAD和LCx)来传递。每次注射一般都在1至几分钟内进行，一般约为1.5分钟。为了治疗外周血管病，本发明优选的给药模式是使用适当的动脉导管注射股动脉的近侧部分。

如本文所述，可在传递载体的同时或之前通过导管将血管活性剂灌注至靶位点以促进基因传递。使用这种试剂可导致基因传递效力增强，这一点可由靶位点处表达转基因的细胞的百分比增加来证实。有关组胺和其它血管活性剂的生理学和药物学作用，例见Altura BM和Halevy S.组胺对心血管的作用，《组胺Ⅱ和抗-组胺剂：化学，代谢和生理学及药物学作用》(Rocha e Silva M编)Handbuch derExperimentellen Pharmakologie,Vol 18,Part 2,Springer Verlag,Berlin,1978,p1-39。可以使用的组胺衍生物(和激动剂，如与组胺H1受体相互作用的那些化合物)包括例如2-甲基组胺，2-吡啶基乙胺，培他司汀和2-噻唑基乙胺。这些和其它组胺激动剂描述于例如Garrison JC.,Goodman和Gilman，治疗剂的药物学基础(第8版：Gilman AG,Rall TW,Nies AS,Taylor P编)Pergamon出版社，1990,p575-582。

为了有助于理解本发明，提供了下列实施例来描述一系列实验的结果。当然，不应认为与本发明相关的实验特别地限制了本发明，目前已知的或以后产生的对本发明的改动是本领域技术人员易于做到的，落在本文所述和下文所要求的本发明的范围之内。实施例1：腺病毒构建体

使用了不依赖于辅助病毒的复制缺损的人腺病毒5系统。目的基因是lacZ和FGF-5。以1.1kb EcoRI片断的形式从质粒pLTRI22E(Zhen等，分子细胞生物学，8:3487,1988)上释放人FGF-5的全长cDNA，其包括981bp的基因开放阅读框，将该片断克隆至质粒ACCMVPLPA的多接头中，所述质粒含有CMV启动子和SV40聚腺苷酸化信号，以及位于侧翼的其中EIA和EIB基因(病毒复制所必需的)已缺失的部分腺病毒序列。用该质粒和质粒JM17共转染(脂转染)293细胞，质粒JM17含有整个人腺病毒5基因组以及另外的4.3kb插入物，从而使pJM17太大以致于不能被包裹。同源获救重组导致腺病毒载体含有转基因而缺乏EIA/EIB序列。尽管这些重组子在哺乳动物细胞中不能复制，但它们在被EIA/EIB转化并反式提供这些必需基因产物的293细胞中可以增殖。监测转染细胞中通常在转染后10至14天发生的细胞病变效应的表现。

为了鉴定成功的转化子，于56℃用蛋白酶K(50mg/ml，含0.5％十二烷基硫酸钠和20mM EDTA)将表现出细胞病变效应的培养板中的细胞上清液处理60分钟，用苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀。通过PCR鉴定成功的转化子，PCR使用了与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列互补以扩增插入物(预期为1.1kb片断)的引物(生物技术15:868-872,1993)，和经设计可同时扩增腺病毒序列的引物(生物技术15:868-872,1993)。然后对成功的重组子进行两轮噬斑纯化。在293细胞中增殖病毒原种直至滴度为10¹⁰-10¹²个病毒颗粒，使用前通过两次CsCl梯度离心进行纯化。使用全长cDNA构建编码β-半乳糖苷酶或FGF-5的重组腺病毒。用于产生重组腺病毒的系统最多可包装5kb转基因插入物。建议由CMV启动子驱动并含SV40聚腺苷酸化序列的基因小于4kb，刚好处于包装限制的范围内。通过标准方法噬斑纯化重组载体，在293细胞中增殖所得病毒载体直至滴度为10¹⁰-10¹²个病毒颗粒，感染80％铺满的细胞，36至48小时之后收获细胞，冻融循环之后，通过标准离心方法沉淀细胞碎片，通过两次CsCl梯度超离心(不连续的1.33/1.45 CsCl梯度：在5mM Tris,1mM EDTA(pH7.8)中制备的铯；90,000×g(2小时)，105,000×g(18小时))进一步纯化病毒。体内注射之前，通过Sepharose柱(如G25 Sephadex)进行凝胶过滤使病毒原种脱盐。所得病毒原种最终的病毒滴度范围为10¹¹-10¹²个病毒颗粒。腺病毒构建体被高度纯化，不含野生型(可能会复制的)病毒。实施例2：细胞培养中的成年大鼠心肌细胞

根据标准方法，通过用含有胶原酶的灌注液进行Langendorf灌注制备成年大鼠心肌细胞。在覆盖有层粘连蛋白的培养板上培养杆状细胞，24小时后用实施例1所得的编码β-半乳糖苷酶的腺病毒感染细胞，感染复数为1:1。再过36小时之后，用戊二醛固定细胞并与X-gal保温。用重组腺病毒感染之后，一般有70-90％成年心肌细胞表达β-半乳糖苷酶转基因。当感染复数为1-2:1时，未观察到细胞毒性。

实施例3：猪体内心肌

根据实施例1的方法，在293允许细胞中增殖实施例1所得的编码β-半乳糖苷酶的腺病毒载体，通过CsCl梯度超离心纯化使最终的病毒滴度为1.5×10¹⁰个病毒颗粒。对经麻醉，通风的40kg猪进行胸廓切开术，将26号蝴蝶形针头插入左前降(LAD)冠状动脉中部，注射2ml载体(1.5×10¹⁰个病毒颗粒)。缝合胸部，使动物恢复。在注射后第4天，杀死动物。用戊二醛固定心脏，切片并与X-gal保温16.5小时。包埋和切片之后，用伊红复染组织。

对组织切片进行显微分析(冠内注射含有lacZ的腺病毒96小时之后，LAD床的透壁切片)，结果表明在LAD冠状动脉床中观察到大量基因转移，很多组织切片中50-60％以上细胞的β-半乳糖苷酶染色呈阳性。离LAD循环床很远的心肌区域未见X-gal染色，可用作阴性对照，而在肌细胞和内皮细胞中观察到基因的扩散表达。大多数肌细胞显示出β-半乳糖苷酶活性(染成蓝色)，在随后使用闭胸冠内注射的研究中，基因转移(n=8)14天后也发现类似活性。在基因表达的区域未见炎症或坏死。

实施例4：猪缺血模型

动物包括18只家猪(30-40kg)。在无菌操作条件下进行左胸廓切开术(Hammond等，J Clin Invest 92:2644-2652和Roth等，J.ClinInvest 91:939-949,1993)。将导管置入左心房和主动脉，提供测定区域性血流和监测压力的装置。用线缝合左心房以进行ECG记录和心房起博。最后，在近侧LCx周围放置ameroid，当稳定水平的缺血状态建立之后，给治疗组(n=11)施用包括由CMV启动子驱动的FGF-5(血管生成基因)的腺病毒构建体。对照动物(n=7)接受包括由CMV启动子驱动的报道基因lacZ的腺病毒构建体的基因转移。

放置ameroid后35±3天开始研究，其时侧血管生成和起博诱导的功能异常是稳定的(Roth等，美国生理学杂志，253:H1279-1288,1987和Roth等，循环，82:1778-1789)。将清醒的动物吊在悬带上，以数字的形式在线记录LV,LA和主动脉的血压以及心电图(休息时和心房以200bpm起博的过程中)。使用Hewlett Packard超声显像系统得到二维和M-模式图像。在中乳头肌肉水平上由右胸骨旁方法得到图象并记录在VHS磁带上。记录处于基础状态和右心房起博过程中(HR=200bpm)的动物的图象。在基因转移前1天进行这些研究，14±1天之后重复这一研究。基因转移之前和之后，两组的速率-压力乘积和左心房压力类似，这表明心肌氧需求和负荷状况类似。使用标准化标准进行超声心动图的测定(Sahn等，循环58:1072,1978)。由5次连续的心跳测定舒张结束时血管壁的厚度(EDWTh)和收缩结束时血管壁的厚度(ESWTh)并取平均值。计算壁增厚的百分比(％WTh)[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100。在不知道动物接受了何种基因的情况下分析数据。为了阐明超声心动测定结果的可重复性，连续2天对动物(n=5)进行显像研究，结果显示出高度的相关性(r²=0.90；p=0.005)。

放置ameroid后35±3天，在ameroid闭塞之后，但在基因转移之前，使用在心房起博(200bpm)过程中注射至左心房的对比材料(Levovist)进行对比超声心动研究。基因转移后14±1天重复该研究。使用基于计算机的视频分析程序(Color Vue Ⅱ,Nova Microsonics,Indianapolis,Indiana)由视频影像测得峰对比强度，这样可以客观地测定视频强度。在不知道动物接受了何种基因的情况下分析对比研究的数据。

研究结束时，麻醉动物，进行中线胸廓切开术。分离短头动脉，插入插管，连接其它大血管。给动物静脉内施用肝素(10,000IU)和罂粟碱(60mg)。施用氯化钾以诱导舒张心停滞，交叉夹住主动脉。通过短头动脉插管(120mmHg压力)传递盐水，籍此灌注冠状动脉。灌注戊二醛溶液(6.25％,0.1M二甲胂酸盐缓冲液)(120mmHg压力)直至心脏被很好地固定(10-15分钟)。然后取出心脏，使用顺行注射至左前降动脉(LAD)，左旋动脉(LCx)和右冠状动脉的颜色编码染料鉴定血管床。检查ameroid以证实闭塞，将取自正常灌注和缺血区域的样品分成三份，用可塑性材料包埋取自心内膜和心外膜的三份样品。按上文所述(Mathieu-Costello等，美国生理学杂志，369:H204,1990)进行显微分析以定量毛细血管的数目。4个1微米厚的横切片取自各个次生样品(各个区域的心内膜和心外膜)，以400倍的放大倍数，使用点计数测定毛细血管数目/纤维数目的比率。每个次生样品计数20至25个高强视野。在各个区域中，心内膜和心外膜的毛细血管与纤维数目的比类似，因此每个区域40至50个视野的平均值可提供跨壁毛细血管与纤维数目的比率。

为了确定改善的区域性功能和血流是由转基因表达引起的，使用PCR和RT-PCR检测接受FGF-5基因转移的动物心肌中的转基因FGF-5DNA和mRNA。使用针对CMV启动子的有义引物[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC](SEQ ID NO:1)和针对内部FGF-5序列的反义引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID NO:2),PCR扩增预期的500bp片断。使用针对FGF-5序列起始部分的有义引物[ATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC](SEQ ID NO:3)和针对内部FGF-5序列的反义引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID NO:2),RT-PCR扩增预期的400bp片断。

最后，使用针对FGF-5的多克隆抗体(Kitaoka等，科学，35:3189,1994)，在FGF-5基因转移48小时以及14±1天之后，阐明接受FGF-5基因转移的动物的细胞和心肌中的FGF-5蛋白表达。

使用按实施例1构建的不依赖于辅助病毒的复制缺损的人腺病毒5系统制备含有转基因的载体。所需基因是lacZ和FGF-5。体内注射的制剂是高度纯化的，不含野生型(有复制能力的)腺病毒。因此，心脏中的腺病毒感染和炎症浸润被最小化了。通过用冠状动脉导管将制剂直接注射至冠状动脉腔中，可以有效地靶向基因。当以此方式传递时，在肝细胞中未见转基因表达，在冠内注射之后任何时间的尿液中都未发现病毒RNA。

在左和右冠状动脉(流向LCx床的侧血流似乎来自这两个血管)中注射2.0ml以进行构建体注射(4.0ml含有约10¹¹个腺病毒颗粒)。麻醉动物，通过切开右颈动脉获得动脉入口；放置5F Cordis鞘。使用5F多用(A2)冠状动脉导管插入冠状动脉。通过对比注射至左主冠状动脉进一步证实LCx ameroid的闭塞。然后将导管头置入动脉腔内1cm以使注射过程中最少的制剂流失至近侧主动脉。对每只猪实施这一方法。

一旦进行基因转移，可使用3个策略建立成功的基因掺入和表达，(1)一些构建体包括报道基因(lacZ)；(2)取相关血管床的心肌样品，并进行免疫印迹以定量FGF-5的存在；和(3)使用PCR测定FGF-5 mRNA和DNA。

图2中的区域性收缩功能数据表明：基因转移之前以及14±1天之后，接受lacZ的猪的缺血区域显示出类似程度的起博诱导的功能异常。相反，接受FGF-5基因转移的猪的缺血区域在起博过程中血管壁的厚度增加了2.6倍(p=0.0001)。这些数据表明根据本发明的FGF-5基因转移与起博过程中缺血区域改善的收缩有关。起博过程中正常灌注区域(室间隔)的壁厚度是正常的，不受基因转移的影响(％壁增厚：LacZ组：基因转移前，56±11％，基因转移后，51±9％；FGF-5组：基因转移前，63±7％，基因转移后，58±5％；没有差异，方差的双向分析)。独立测定的数据重复性很高(侧壁增厚：r²=0.90；p=0.005)。相同模型的心房起博过程中通过经胸廓超声心动描记法测定的功能降低的百分比与通过声波测微法(sonomicrometry)测定的百分比降低非常类似(Hammond等，J Clin Invest 92:2644,1993)，显示出超声心动描记法评价缺血功能异常的准确性。图2中的柱表示平均值，误差柱表示1 SE。图4A-4C是对应于心肌对比超声心动描记法的图。图4A阐明了正常猪的急性LCx闭塞，其中LCx床中未见血流(黑色)，而膈(IVS)中血流增强(白色)，这表明影像准确地鉴定了LCx床，减少的血流与降低的对比增强有关。图4B阐明了用lacZ基因转移后14天IVS和LCx床之间对比增强的差异，显示出心房起博过程中(200bpm)两个区域中不同的血流。图4C阐明了用FGF-5基因转移后14天IVS和LCx床的对比增强近乎相同，显示出心房起博过程中两个区域中有类似的血流。

图3概述了对所有动物的两个区域的视频强度进行的计算机分析。在图3中，数据被表示为缺血区域(LCx床)峰视频强度(心肌血流的相关值)/室间隔(IVS，通过未闭塞的左前降冠状动脉接受正常血流的区域)峰视频强度的比率。两个区域血流相等时，该比率为1.0。基因转移之前，该比率平均为0.5，表明LCx床的血流比室间隔中的血流显著较少。图3表明接受lacZ基因转移的动物的缺血区域总是血流缺乏，而接受FGF-5基因转移的动物的两个区域显示出均一的对比增强，增加了2倍的心肌血流改善了缺血区域的血流(p=0.0018，方差双向分析)。柱表示平均值，误差柱表示1 SE。

图5中的柱形图概述了显微分析数据，显示出与接受lacZ基因转移的动物心脏的缺血区域和非缺血区域相比，接受FGF-5基因转移的动物的相同区域中毛细血管数目/纤维数目的比率增加。柱表示每组5至6只动物的平均值，误差柱表示1 SE,p值得自基因作用的方差双向分析。在对治疗组一无所知的情况下进行分析。

PCR扩增产物的电泳图证实了用FGF-5基因转移后14天，3只猪的LAD和LCx床中JM17-CMV-FGF-5 DNA(预期为500bp片断)的存在。RT-PCR扩增产物的电泳图证实了用FGF-5基因转移后14天的LAD和LCx床中有心脏FGF-5 mRNA(预期为400bp片断)的存在，而用lacZ基因转移后没有。另外，基因转移2周后，经组织学检查，所有5只lacZ感染动物的心肌样品显示出显著的β-半乳糖苷酶活性。

最后，使用抗FGF-5的多克隆抗体对经培养的成纤维细胞的培养基进行免疫印迹，证实了用FGF-5(n=4个培养板)基因转移之后2天有蛋白质表达和细胞外分泌，而用lacZ基因转移之后没有。还证实了在用FGF-5基因转移之后14±1天心肌样品中有蛋白质表达，而用lacZ(n=4)基因转移之后却没有。

如上所述，可以类似的方法使用本领域已知的腺伴随病毒载体和其它基因传递载体。实施例5：使用血管活性剂增强基因传递

如上所述，在本发明的一个方面，通过在用血管活性剂，如组胺共灌注或预灌注的情况下将载体传递至血管中，即可增强使用载体，如病毒载体进行基因传递的效力。

在例举的实施例中，我们检查了组胺(血管活性剂的一个例子)对使用上述表达lacZ报道基因的腺病毒载体(实施例1)进行的基因传递的作用。我们发现用组胺灌注冠状动脉可显著增加基因转移的效力。

简单地说，麻醉猪，经由右颈动脉得到动脉入口。将5个French多用导管置入右冠状动脉(RCA)，并插入口内2cm。3分钟内传递约3ml盐水，然后快速地在约1.5分钟内灌注2ml含有3×10¹¹个病毒颗粒(vp)的表达lacZ的腺病毒。然后从RCA中取出导管，置入左前降冠状动脉(LAD)中，再将导管头插入LAD腔内2cm。插入之后，在3分钟内传递3ml浓度为25微克组胺/ml的组胺，然后快速地在约2.25分钟内灌注3ml含有4.5×10¹¹个vp的表达lacZ的腺病毒溶液。一般情况下，在传递载体之前的几分钟内进行组胺灌注。组胺灌注过程中或之后，全身血压、心率或心律基本上不变。取出导管，缝合颈部，使动物苏醒。应指出的是，尽管灌注至LAD床的病毒颗粒的总数约为RCA床中的1.5倍(因为猪心脏中这些床的相对大小所致)，但病毒颗粒总数的增加更倾向于被靶床的相对大小抵销，因为LAD床比RCA床约大2至3倍。

5天后，杀死动物。用低聚甲醛灌注心脏，由RCA区域和LAD区域得到透壁切片，将样品与X-gal溶液(β-半乳糖苷酶的底物)保温。16小时之后包埋材料，切片，放在载玻片上，用伊红进行染色。

显微分析揭示出LAD床比RCA床的基因转移效力要高得多。尤其是，在不用组胺处理的情况下，约30％心肌细胞在冠内灌注之后表达lacZ。与之形成对照的是，LAD区域的几乎所有的肌细胞都表达转基因lacZ，这表明相对于对照区域而言，用血管活性剂处理过的区域中基因转移的效力增加了几倍。实际上，如本文所述，血管活性剂的使用导致基因几乎完全传递至靶组织。

Claims (42)

1．体内靶向基因表达的方法，所述方法包括通过动脉内直接注射至供给组织或器官的动脉以传递载体，其中载体含有编码欲在该动脉供给的血管床中表达的蛋白质的转基因，其中所述动脉内注射与用血管活性剂灌注动脉同时进行或在用血管活性剂灌注动脉之后进行。

2．权利要求1的方法，其中在注射所述载体之前至少约2分钟将所述血管活性剂灌注至动脉中。

3．权利要求1的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白。

4．权利要求1的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂。

5．权利要求1的方法，其中所述载体是病毒载体。

6．权利要求5的方法，其中所述病毒载体是复制缺损的腺病毒载体。

7．权利要求5的方法，其中所述病毒载体是腺伴随病毒载体。

8．权利要求6的方法，其中通过注射传递约10⁷至10¹³个腺病毒载体颗粒。

9．权利要求8的方法，其中通过注射传递约10¹¹个腺病毒载体颗粒。

10．权利要求1的方法，其中所述转基因与组成型启动子可操作相连。

11．权利要求1的方法，其中所述转基因与组织特异性启动子可操作相连。

12．权利要求1的方法，其中所述转基因与心室肌细胞特异性启动子可操作相连。

13．权利要求12的方法，其中所述心室肌细胞特异性启动子具有心室肌球蛋白轻链-2的序列。

14．权利要求12的方法，其中所述心室肌细胞特异性启动子具有肌球蛋白重链启动子的序列。

15．权利要求1的方法，其中所述转基因编码血管生成蛋白或肽。

16．权利要求15的方法，其中所述血管生成蛋白或肽选自aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5和VEGF。

17．权利要求1的方法，其中所述转基因编码血管生成蛋白或肽，其中通过冠内直接注射至一个或两个冠状动脉将载体传递至患者的心肌中，籍此促进所述患者心肌中冠状侧血管的生成。

18．权利要求17的方法，其中所述血管生成蛋白或肽选自aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5和VEGF。

19．权利要求17的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂或血管内皮生长因子蛋白。

20．权利要求17的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂。

21．权利要求17的方法，其中所述载体是病毒载体。

22．权利要求17的方法，其中所述病毒载体是复制缺损的腺病毒载体或腺伴随病毒载体。

23．权利要求17的方法，其中所述冠内注射深入至左和右冠状动脉腔内至少约1cm。

24．权利要求17的方法，其中除了冠状动脉外，所述冠内注射还深入至隐静脉移植物或乳房内部动脉移植物腔内至少约1cm。

25．权利要求17的方法，其中所述方法包括三次注射，一次注射至左前降冠状动脉(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠状动脉，一次注射至右冠状动脉。

26．权利要求1的方法，其中所述转基因编码β-肾上腺素能信号传导蛋白，其中通过冠内直接注射至一个或两个冠状动脉将载体传递至患者的心肌中。

27．权利要求26的方法，其中所述β-肾上腺素能信号传导蛋白选自β-肾上腺素能受体(β-AR)，G-蛋白受体激酶抑制剂(GRK抑制剂)和腺苷酸环化酶(AC)。

28．权利要求26的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂或VEGF。

29．权利要求26的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂。

30．权利要求26的方法，其中所述载体是病毒载体。

31．权利要求26的方法，其中所述病毒载体是复制缺损的腺病毒载体或腺伴随病毒载体。

32．权利要求26的方法，其中所述冠内注射深入至左和右冠状动脉腔内至少约1cm。

33．权利要求26的方法，其中除了冠状动脉外，所述冠内注射还深入至隐静脉移植物或乳房内部动脉移植物腔内至少约1cm。

34．权利要求26的方法，其中所述方法包括三次注射，一次注射至左前降冠状动脉(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠状动脉，一次注射至右冠状动脉。

35．权利要求1的方法，其中通过直接进入一个或两个股动脉的股动脉内注射将载体导入外周血管系统。

36．权利要求35的方法，其中所述载体含有编码血管生成蛋白或肽的转基因，并在外周血管系统表达转基因，籍此促进外周血管系统位点的血管生成。

37．权利要求35的方法，其中所述血管生成蛋白或肽选自aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5和VEGF。

38．权利要求35的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂或VEGF。

39．权利要求35的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂。

40．权利要求35的方法，其中所述载体是病毒载体。

41．权利要求35的方法，其中所述病毒载体是复制缺损的腺病毒载体。

42．权利要求35的方法，其中所述病毒载体是复制缺损的腺伴随病毒载体。

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