KR20010012257A - 분비 벡터의 경구 백신접종에 의한 수정 조절 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 감독(減毒)된 살모넬라 또는 그밖의 그램음성 감독 백신접종 균주를 사용하여 경구 백신접종함으로써 수정을 조절하는 방법에 관한 것이다. 특이적 MHCII/CD4또는 MHCI/CD8면역 반응을 발생시킬 수 있는 여러 다른 발현계를 사용했다.
Description
본 발명은 감독(減毒)된 살모넬라 또는 그밖의 그램음성 감독 백신접종 균주를 사용하여 경구 백신접종함으로써 수정을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이를 위해 특이적 MHCII/CD4또는 MHCI/CD8면역 반응을 발생시킬 수 있는 여러 다른 발현계를 사용한다.
사람 정자에 대한 항체 적정농도가 현저하게 높은 남성과 여성은 간혹 불임이거나 임신 능력이 떨어진다는 것이 오랫동안 알려져 왔다 (Ingerslev and Ingerslev 1989, Chen and Jones, 1981, Menge et al., 1982, Bronson et al., 1984). 온전한 정자의 추출물로 동물 암컷과 숫컷을 면역접종하면 불임이 유도될 수 있다는 것도 밝혀졌다 (Kummerfeld and Foote, 1979, Munoz and Metz, 1978, Tung et al., 1979, Menge et al., 1979). 문헌 (Primakoff et al., 1988a)에서는 모노클로날 항체를 써서 돼지쥐 (guinea pig) 특이적 정자-표면-항원 PH-20을 단리했는데, 이 정제된 항원을 돼지쥐 암컷 또는 숫컷에게 주입하면 수정을 억제하는, 오래 지속되는 면역접종이 유발되었다 (1988b). 사정된 사람 정자 또는 다른 종의 단리된 정자에 대한 다른 많은 모노클로날 항체의 경우는 이들이 사람 정자와 상호 반응한다는 것이 밝혀졌다. 일부는 정액 플라스마의 성분과 반응하며, 다른 것들은 고환에서 유래한 항원을 검출한다. 사람 정자를 고정시키거나 또는 사람정자에 응집하거나 또는 대역 없는 (zone-free) 햄스터 난모세포로의 정자의 결합 및 침입을 억제하는 모노클로날 항체도 이미 규명된 바 있다. 현재는 여러 사람 정자 항원이 알려져 있으며, 예를 들면 분자량이 95,000인 항원 (Moore et al., 1987), Lee의 S36-37 mAb (HSA-63)에 의해 알려진 55 kDa 항원 (Liu et al., 1990), ZP-C의 정자 수용체의 사람 동족체 (Saling 및 Bleil 및 Wassarman에 의해 생쥐에서 결정됨) (Bliel, 1990, Leyton and Saling, 1989) 등이 있다. 부분적으로 동정된 생쥐 및 사람의 FA-1 항원 (Naz, 1988) 및 쥐 고환 및 사람 고환에서 얻은 24 kDa 항원 (Shaha et al., 1990)은 유독 관심의 대상이 되고 있다. 무어 (Moore) 및 리 (Lee)가 동정한 항원 및 SP-10 면역유발원은 세계보건기구 (WHO) (수정 조절 백신의 전문 분야)에 의해 1차 백신 후보로서 설명되었다 (Anderson et al., 1987). 또한 돌출부 (nipple)를 감싸는 세포외 매트릭스인 투명대 (zona pellucida (ZP))의 단백질 성분 3개도 항원으로 적합하다. 이들 단백질은 ZPA, ZPB, ZPC로 일반적으로 불린다 (Wassarman, 1987, Science 235, 553-560). 이와 관련해서 난자-정자 상호작용은 면역 차단에 의해 차단되거나 또는 영향을 받을 것이다. 이것은 재조합적으로 생성된 ZPC (투명대로의 정자의 초기 결합을 유발하는 투명대 단백질)를 사용한 시험 결과 확인되었다. 그러나 지금까지 보고된 모든 경우에는 장기간 면역화로 인해 난소의 비가역적인 손상이 초래되었다 (Skinner et al., 1984, Endocrinology 115, 2418-2432). 난소 기능의 이러한 손상 기전은 아직까지 완전히 풀리지 않았다.
본 발명에 이르러서는
hly-특이적 프로모터 및 인핸서 유사 조절인자 hlyR을 포함하는 헤몰리신 오페론 전체를 포함하고, hlyA 유전자의 대부분이 결실된 분비 벡터 내로 수정 조절에 적합한 유전자 또는 유전자 단편이 삽입하면,
수정 조절에 적합한 단백질 또는 단백질 단편이 합성되며, 이들 항원이 감독(減毒)된 살모넬라 또는 그밖의 그램음성 감독 접종 균주에 의해 분비되어 경구 백신접종이 발생된다는 것이 발견되었다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서는 수정 조절에 적합한 유전자 또는 유전자 단편이 투명대 단백질을 코딩하는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서는 수정 조절에 적합한 유전자 또는 유전자 단편이 투명대 단백질을 코딩하는 것이다.
다른 바람직한 실시태양에서는 분비 벡터가 pMOhly1이다.
다른 바람직한 실시태양에서는 살모넬라 균주가 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)이다.
특히 바람직한 실시태양에서는 수정 조절에 적합한 유전자 또는 유전자 단편이 투명대 단백질을 코딩하는 것이고, 분비 벡터가 pMOhly1이며, 살모넬라 균주가 살모넬라 티피무리움이다.
수정 조절에 적합한 유전자 또는 유전자 단편은 수정 조절에 적합한 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 모든 유전자 또는 유전자 단편으로 정의된다.
그램음성 세균의 내막을 통과하여 주변세포질 (periplasm)로 운반되는 단백질 대부분은 아미노 말단 신호 펩티드를 갖고 있다. 이 신호 펩티드는 이 sec-의존적 운반 과정에서 절단된다 (Pugsley, 1993). 이와 반대로 이. 콜라이 (Escherichia coli)의 헤몰리신 (HlyA)은 분비 체계의 도움으로 내막 및 외막을 지나 세포외 배지로 분비된다. sec-의존성 단백질 운반의 표준적인 N-말단 운반 신호와 달리, HlyA는 아미노산 50-60 개로 이루어진 C-말단 운반 신호 (HlyAs)를 보유한다 (Hess et al., 1990, Jarchau et al., 1994). 이 HlyA 신호는 분비 경로에서 절단되지 않으며, 그 자체로는 거의 어떠한 항원 잠재력도 없다.
이. 콜라이의 헤몰리신 분비 체계는 막 단백질 3개에 의해 이루어진다. 이 단백질 가운데 둘, 즉 HlyB (Gentschev ＆ Goebel, 1990) 및 HlyD (Schuelein et al., 1992)는 내막에 위치하며, 헤몰리신 결정인자의 일부인 유전자에 의해 코딩된다. 후자는 4개의 유전자 즉, hlyC, hlyA, hlyB, hlyD를 포함하는 오페론으로 구성된다 (Wagner et al., 1983, Hess et al., 1986). 위치이동 체계 (분비 체계)의 세번째 단백질은 TolC로서 외막에 위치한다 (Wandersman ＆ Delepelaire, 1990). 그램음성 세균의 양 막을 지나는 HlyA의 위치이동은 ATP 및 내막의 막 전위 형태의 에너지를 필요로 한다 (Koronakis et al., 1995). HlyAs와 다른 단백질 또는 단백질 단편과의 융합체가 헤몰리신 분비 체계의 도움으로 분비될 수 있다는 것은 여러 사례를 통해 이미 밝혀져 있다 (Blight ＆ Holland 1994, Gentschev et al., 1994). 이런 경우 분비 효율은 리포터 단백질의 폴딩 및 구조에 따라 달라진다. 이. 콜라이의 헤몰리신 분비체계는 접종 균주로서 작용하는 감독(減毒) 살모넬라 내에서 기능을 가지며, 융합 단백질을 배출하는데 사용될 수 있다 (Gentschev et al., 1992, Su et al., 1992). 여기에 사용된 유전자 시스템은 사전에 두 가지 성분 즉, 운반에 필요한 유전자 (hlyB 및 hlyD)를 보유한 플라스미드와 융합 단백질을 발현시키는 플라스미드를 기재로 한 것이었다 (Gentschev et al., 1992, Hess et al., 1990).
분비 벡터 pMOhly1 (Gentschev et al., 1995)는 hly-특이적 프로모터 및 "인핸서" 유사 조절인자 hlyR을 포함하는 완벽한 헤몰리신 오페론을 보유한다 (Vogel et al., 1988). hlyA 유전자의 대부분을 결실시켜 오직 34 아미노 말단 및 61 카르복시 말단 아미노산 (HlyAs)만이 HlyA에 의해 코딩되도록 했다. HlyA의 아미노 말단 라디칼 및 카르복시 말단 라디칼 사이의 단일한 Nsi I 제한 위치는 HlyAs의 리딩 프레임 내로 이종 유전자 또는 유전자 단편의 삽입을 가능케 한다. 10-1000 아미노산 크기의 항원에 대한 유전 정보가 이 분비 벡터 pMOhlyl로 삽입될 수 있으며, 이 분비 벡터는 감독 살모넬라 및 다른 그램음성 감독 접종 균주 (예를 들면, 이. 콜라이, Vibrio choerae, Yeresina enterocolitica)내에서 상기 항원이 분비되게 할 수 있다. 따라서 다른 분비 체계와 반대로 하나의 플라스미드에 의한 이종 융합 단백질의 운반이 가능해진다. 이전에 항원 제시 (presentation)에 사용되었던 운반 체계는 세균 세포의 바깥쪽의 펩티드가 상대적으로 짧은 경우에만 대체로 그 운반에 적합했던 것에 비하면 (Cardenas ＆ Clements, 1992), 헤몰리신 분비 체계는 운반 가능 단백질의 크기가 훨씬 더 다양하다는 것이 또다른 중요한 이점이다.
HlyA 분비 체계를 조작하면, 동일한 항원을 적절한 감독 그램음성 접종 균주에게서 세포질 형태 또는 표면 결합 형태 또는 분비 형태로 제시할 수 있다. 살모넬라에게서 분비될 수 있게 만들어진 리스테리오리신 (Listeria monocytogenes에서 유래)을 사용하면, 항원 생산 살모넬라 접종 균주로 접종한 후에, 상기 동일한 항원이 항원 제시 거대세포의 식포 내에서 프로세싱되며, 시토졸 내에 증가되는 것을 추가로 이루어낼 수 있다 (Gentschev et al., 1995). 이런 가능성을 통해, 개선된 CD4+ 또는 CD8+ T-세포 반응을 유도할 수 있다 (Hess et al., 1996). 이런 벡터계를 사용하면 감독된 살모넬라에서 생산된 항원과 함께 또는 별도로 사이토킨 및 가용성 사이토킨 수용체를 분비시킬 수 있도 있기 때문에 (Schuelein, 1993, Gentschev, 미공개), 면역 반응도 또한 변화될 수 있다 (예를 들면 TH1또는 TH2와 관련해서).
감독 살모넬라 또는 다른 그램음성 감독 접종 균주를 쓰면 수정 조절에 적합한 단백질 또는 단백질 단편/HlyAs융합체의 효과적인 분비 및 벡터의 높은 안정성으로 인해 완전히 새롭고 매우 특이적인 피임 백신접종이 가능하다.
재조합 살모넬라의 경구 투여 후에, 항원 (수정 조절에 적절한 단백질 또는 단백질 단편)은 수정 조절에 적절한 단백질 또는 단백질 단편/HlyAs융합체의 분비로 인해 숙주의 면역계에 접근할 수 있으며, 단백질 에피토프에 따라서 또한 분비 경로에 따라서 B 세포 및(또는) T 세포를 활성화시킨다. HlyAs는 B 세포 및 T 세포에 대한 약한 항원이기 때문에, 항체 및 T 세포는 HlyAs-융합체에 의해 유도되며, 주로 리포터 항원의 부분에 대해 유도된다. 항원을 분비하는 감독 살모넬라 및 예르시니아 (Yersinia) 균주가 체액성 점막 면역 반응의 유도에 특히 적합하며, 따라서 이들이 바람직하다. 점막 면역성이 유도되면 결과적으로 원거리 점막 표면 상에 항원 특이적 항체가 생산된다. 따라서 감염 위치에서의 B 세포 반응도 생식관에서 점막 면역성을 자극하게 된다.
본 명세서에 공개된 본 발명을 이용하면, 피임을 초래하는 상응하는 면역 반응의 유발을 위해 과도한 유발 과정없이도 직접 계내 (in situ) 재조합 단백질 또는 이의 일부를 생성시키는 것이 최초로 가능해 진다. 상응하는 벡터를 사용하면 식포 내의 이들 단백질 또는 단백질 단편을 세포내 또는 세포외로 발현시킬 수 있다. 이렇게 하면 체액성 또는 세포독성 면역 반응을 의도적으로 유발할 수 있다.
도면에 대한 설명
도 1은 분피 플라스미드 pMOhly1의 벡터 지도이다.
도 2는 각종 pMOhly1/(hu)ZPA/제작물을 발현 및 분비에 대해 시험한 웨스턴 블롯이다. 각종 pMOhly1/(hu)ZPA/제작물로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA (트리클로로아세트산)을 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 폴리클로날 항체를 써서 발현 및 분비 여부를 시험했다. 여기서 폴리클로날 항체는 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 항체이다. A1은 huZPA-1 제작물 (도 8 참조)에 대한 것이고, A4는 huZPA-4 제작물 (도 8 참조)을 나타내고, pMO는 벡터 대조구를 나타내며, B4는 huZPB-4 제작물 (도 9 참조)을 나타낸다.
도 3은 각종 pMOhly1/(hu)ZPB/제작물을 발현 및 분비에 대해 시험한 웨스턴 블롯이다. 각종 pMOhly1/(hu)ZPB/제작물로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA (트리클로로아세트산)을 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 폴리클로날 항체를 써서 발현 및 분비 여부를 시험했다. 여기서 폴리클로날 항체는 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 항체이다. B1은 huZPB-1 제작물 (도 9 참조)에 대한 것이고, B2는 huZPB-2 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, B3는 huZPB-3 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, B4는 huZPB-4 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, B5는 huZPB-5 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, pMO는 벡터 대조구를 나타낸다.
도 4는 각종 pMOhly1/(hu)ZPC/제작물을 발현 및 분비에 대해 시험한 웨스턴 블롯이다. 각종 pMOhly1/(hu)ZPC/제작물로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA (트리클로로아세트산)을 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 폴리클로날 항체를 써서 발현 및 분비 여부를 시험했다. 여기서 폴리클로날 항체는 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 항체이다. C1은 huZPC-1 제작물 (도 10 참조)에 대한 것이고, C2는 huZPC-2 제작물 (도 10 참조)을 나타내고, C3는 huZPC-3 제작물 (도 10 참조)을 나타내고, pMO는 벡터 대조구를 나타낸다.
도 5는 각종 pMOhly1/(m)ZPB/제작물을 발현 및 분비에 대해 시험한 웨스턴 블롯이다. 각종 pMOhly1/(m)ZPB/제작물로 이. 콜라이 DH5α를 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA (트리클로로아세트산)을 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 폴리클로날 항체를 써서 발현 및 분비 여부를 시험했다. 여기서 폴리클로날 항체는 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 항체이다. B1은 mZPB-1 제작물 (도 11 참조)에 대한 것이고, B2는 mZPB-2 제작물 (도 11 참조)을 나타내고, B3는 mZPB-3 제작물 (도 11 참조)을 나타내고, B4는 mZPB-4 제작물 (도 11 참조)을 나타내고, B5는 mZPB-5 제작물 (도 11 참조)을 나타내고, pMO는 벡터 대조구를 나타낸다.
도 6은 각종 pMOhly1/(hu)ZPB/제작물을 발현 및 분비에 대해 시험한 웨스턴 블롯이다. 각종 pMOhly1/(hu)ZPB/제작물로 S. 티피무리움 (S. typhimurium) SL7207을 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA (트리클로로아세트산)을 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 폴리클로날 항체를 써서 발현 및 분비 여부를 시험했다. 여기서 폴리클로날 항체는 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 항체이다. B1은 huZPB-1 제작물 (도 9 참조)에 대한 것이고, B2는 huZPB-2 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, B3는 huZPB-3 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, B4는 huZPB-4 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, B5는 huZPB-5 제작물 (도 9 참조)을 나타내고, pMO는 벡터 대조구를 나타낸다.
도 7은 각종 pMOhly1/(hu)ZPC/제작물을 발현 및 분비에 대해 시험한 웨스턴 블롯이다. 각종 pMOhly1/(hu)ZPC/제작물로 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) WapYv-515를 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA (트리클로로아세트산)을 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 폴리클로날 항체를 써서 발현 및 분비 여부를 시험했다. 여기서 폴리클로날 항체는 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 항체이다. C1은 huZPC-1 제작물 (도 12 참조)에 대한 것이고, C2d는 이중 삽입체를 갖는 huZPC-2 제작물 (도 12 참조)을 나타내고, C3d는 이중 삽입체를 갖는 huZPC-3 제작물 (도 12 참조)을 나타내고, C4는 huZPC-4 제작물 (도 12 참조)을 나타내고, pMO는 벡터 대조구를 나타낸다.
도 8은 huZPA의 cDNA의 유전자 지도이다. 화살표는 PCR 증폭을 위해 선택된 프라이머 (표 1)의 위치를 보여주며, 번호는 유전자의 cDNA 서열의 개시 코돈에 대한 프라이머의 5'-말단 상의 개시점을 지시한다. 사각형(□)은 아미노 말단 운반 신호, 추정 융합 간극 위치 및 C 말단 상의 강력한 소수성 영역 (막 앵커로서 기능)를 보여준다. 그 아래에는 PCR에 의해 증폭시킨 단편을 개시점 및 종료점과 함께 나타냈으며, 이는 PCR 생성물을 Nsi-I 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 생성된 것으로서, 이하에서는 huZPA-1, huZPA-2 등으로 불린다. 또한 단편의 길이는 염기쌍 (bp) 및 아미노산 (aa) 둘 다로 표시했다. 분자량 계산치는 투명대 단편에 대해 구한 값이며, 괄호 안의 값은 투명대/HlyA 융합 단백질에 대한 것이고, 단위는 kDa이다. 마지막으로 HlyA 부분에 대한 항체를 써서 융합 단백질의 분비가 검출되었는지 여부를 나타냈다.
도 9는 huZPB의 cDNA의 유전자 지도이다. 화살표는 PCR 증폭을 위해 선택된 프라이머 (표 1)의 위치를 보여주며, 번호는 유전자의 cDNA 서열의 개시 코돈에 대한 프라이머의 5'-말단 상의 개시점을 지시한다. 사각형(□)은 아미노 말단 운반 신호, 추정 융합 간극 위치 및 C 말단 상의 강력한 소수성 영역 (막 앵커로서 기능)를 보여준다. 그 아래에는 PCR에 의해 증폭시킨 단편을 개시점 및 종료점과 함께 나타냈으며, 이는 PCR 생성물을 Nsi-I 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 생성된 것으로서, 이하에서는 huZPB-1, huZPB-2 등으로 불린다. 또한 단편의 길이는 염기쌍 (bp) 및 아미노산 (aa) 둘 다로 표시했다. 분자량 계산치는 투명대 단편에 대해 구한 값이며, 괄호 안의 값은 투명대/HlyA 융합 단백질에 대한 것이고, 단위는 kDa이다. 마지막으로 HlyA 부분에 대한 항체를 써서 융합 단백질의 분비가 검출되었는지 여부를 나타냈다.
도 10은 huZPC의 cDNA의 유전자 지도이다. 화살표는 PCR 증폭을 위해 선택된 프라이머 (표 1)의 위치를 보여주며, 번호는 유전자의 cDNA 서열의 개시 코돈에 대한 프라이머의 5'-말단 상의 개시점을 지시한다. 사각형(□)은 아미노 말단 운반 신호, 추정 융합 간극 위치 및 C 말단 상의 강력한 소수성 영역 (막 앵커로서 기능)를 보여준다. 그 아래에는 PCR에 의해 증폭시킨 단편을 개시점 및 종료점과 함께 나타냈으며, 이는 PCR 생성물을 Nsi-I 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 생성된 것으로서, 이하에서는 huZPC-1, huZPC-2 등으로 불린다. 또한 단편의 길이는 염기쌍 (bp) 및 아미노산 (aa) 둘 다로 표시했다. 분자량 계산치는 투명대 단편에 대해 구한 값이며, 괄호 안의 값은 투명대/HlyA 융합 단백질에 대한 것이고, 단위는 kDa이다. 마지막으로 HlyA 부분에 대한 항체를 써서 융합 단백질의 분비가 검출되었는지 여부를 나타냈다.
도 11은 mZPB의 cDNA의 유전자 지도이다. 화살표는 PCR 증폭을 위해 선택된 프라이머 (표 1)의 위치를 보여주며, 번호는 유전자의 cDNA 서열의 개시 코돈에 대한 프라이머의 5'-말단 상의 개시점을 지시한다. 사각형(□)은 아미노 말단 운반 신호, 추정 융합 간극 위치 및 C 말단 상의 강력한 소수성 영역 (막 앵커로서 기능)를 보여준다. 그 아래에는 PCR에 의해 증폭시킨 단편을 개시점 및 종료점과 함께 나타냈으며, 이는 PCR 생성물을 Nsi-I 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 생성된 것으로서, 이하에서는 mZPB-1, mZPB-2 등으로 불린다. 또한 단편의 길이는 염기쌍 (bp) 및 아미노산 (aa) 둘 다로 표시했다. 분자량 계산치는 투명대 단편에 대해 구한 값이며, 괄호 안의 값은 투명대/HlyA 융합 단백질에 대한 것이고, 단위는 kDa이다. 마지막으로 HlyA 부분에 대한 항체를 써서 융합 단백질의 분비가 검출되었는지 여부를 나타냈다.
도 12는 huZPC의 cDNA의 유전자 지도이다. 화살표는 PCR 증폭을 위해 선택된 프라이머 (표 1)의 위치를 보여주며, 번호는 유전자의 cDNA 서열의 개시 코돈에 대한 프라이머의 5'-말단 상의 개시점을 지시한다. 사각형(□)은 아미노 말단 운반 신호, 추정 융합 간극 위치 및 C 말단 상의 강력한 소수성 영역 (막 앵커로서 기능)를 보여준다. 그 아래에는 PCR에 의해 증폭시킨 단편을 개시점 및 종료점과 함께 나타냈으며, 이는 PCR 생성물을 Nsi-I 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 생성된 것으로서, 이하에서는 huZPC-1, huZPC-2 등으로 불린다. 또한 단편의 길이는 염기쌍 (bp) 및 아미노산 (aa) 둘 다로 표시했다. 분자량 계산치는 투명대 단편에 대해 구한 값이며, 괄호 안의 값은 투명대/HlyA 융합 단백질에 대한 것이고, 단위는 kDa이다. 마지막으로 HlyA 부분에 대한 항체를 써서 융합 단백질의 분비가 검출되었는지 여부를 나타냈다.
당업자라면 본 명세서의 설명에 기초해서 본 발명의 전 범위를 실시할 수 있을 것이다. 핵산을 조작하는 공지된 많은 기술 및 프로토콜, 그 중 예를 들면 돌연변이유발법, 서열분석법, 세포내 핵산 도입법 또는 단백질 분석법 등은 문헌 (Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausrubel et al. Eds., John Wiley ＆ Sons, 1992, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd Ed., Sambroock et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 상세하게 기재되어 있다. 아우스루벨 (Ausrubel) 등의 문헌과 샘부룩 (Sambrook) 등의 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
본 발명은 모든 용도의 제약 제제 및 설명된 방법을 포함한다. 따라서 본 발명은 본 발명에 따른 분비 벡터를 갖는 감독(減毒) 세균 함유 제약 제제 등을 포함할 수 있다. 경구 투여는 캡슐화된 생분해성 중합체, 예를 들면 PLPG의 형태로 수행하는 것이 바람직하다.
다음의 실시예는 보다 상세한 설명을 위해서만 이용되어야 하며, 본 발명이 실행가능하다는 것을 입증하는 것이며, 어떠한 식으로는 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
〈실시예 1〉
이. 콜라이 및 S. 티피무리움에서 huZPA, huZPB, huZPC 및 mZPB 단편의 클로닝 및 발현
플라스미드 pGEX-KG-huZPA, pGEX-KG-huZPB 및 pGEX-KG-huZPC (Peter Bringmann, Schering AG)를 써서 클로닝을 시작했다. 이들 플라스미드는 사람 ZPA, ZPB, ZPC 유전자의 cDNA, 및 생쥐의 난소 mRNA (생쥐 ZPB-유전자의 cDNA 합성을 가능하게 함)를 보유한다. 과배란 (superovulating) 생쥐 (Uwe Eberspaecher, Schering AG)의 난소로부터 단리한 mRNA로부터 시작해서 상응하는 cDNA를 다음과 같이 합성했다. RNA 약 5 ㎍을 올리고-dT-프라이머 3 ㎕가 들어 있는 DEPC-H2O 32 ㎕에 혼합하고, 65 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. 이 반응물을 실온에서 10 분 동안 냉각시키고, 합성 완충액 5 ㎕, 0.1 M DTT 5 ㎕, RNase 억제제 1 ㎕, 25 mmol dNTP 3 ㎕, MMLV 역전사효소 (20 U/㎕) 1 ㎕를 첨가한다 (1st Strand Synthesis Kit, Stratagene). 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 특이적 올리고뉴클레오타이드 (표 1)를 써서 해당하는 cDNA로부터 겹쳐지는 유전자 단편을 PCR을 통해 증폭시켰으며, 이 단편은 5' 및 3' Nsi I 제한 위치를 갖는다 (도 8 내지 12는 이 결과 생성된 프라이머 위치 및 유전자 단편이 표시된 ZP-유전자의 지도임). PCR 증폭 (Saiki et al., 1988)을 Thermocycler 60/2 (Bio-med, 독일 테레스)로 수행했다. 이를 위해서 상응하는 5'- 및 3'-프라이머 (최종 농도가 각각 1 μmol), dNTP들 (각각 200 μmol) 및 2.5 U Tag DNA 중합효소 (Promega) 및 제조자의 완충액 100 ㎕를 써서 cDNA를 증폭시켰다. 제1 주기 전에 91 ℃에서 3 분 동안 변성화를 수행했다. 그 다음 91 ℃에서 1 분 변성, 55 ℃에서 1 분 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장 (extension)의 조건으로 30 주기를 돌렸다. 반응 생성물을 2 % 아가로오즈 겔에서 전기영동에 의해 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 가시화했다. 이들 PCR 생성물을 우선 벡터 pUC18의 Sma I 위치로 "블런트 (blunt)" 삽입했다. 그 다음 ZP 단편을 Nsi I 소화에 의해 절단하고, 발현 벡터 pMohly1으로 삽입했다 (도 1). 이. 콜라이 DH5α를 각종 pMOhly1/ZP 제작물로 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA를 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 투명대/헤몰리신-융합 단백질의 분비에 대해 시험했다. 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 폴리클로날 항체를 써서 huZPA 단편 2개 (A1 및 A4, 도 2) 및 huZPB 단편 4개 (B1-B4, 도 3)의 발현 및 분비 여부를 검출할 수 있었다. huZPC의 경우에는 운반 능력(transport-competent) 도메인을 동정했다 (C1, 도 4). huZPB와 마찬가지로, mZPB로부터 유래한 3개의 단백질 단편의 분비도 운반 체계에 의해 입증될 수 있었다 (B1-B3, 도 5).
그 다음, 제한 시스템이 없어서 이. 콜라이 DNA를 효율적으로 도입할 수 있는 균주인 S. 티피무리움 LB5000 균주를 상기한 pMOhly1 유도체로 형질전환하였다. 재조합 발현 벡터를 S. 티피무리움 LB5000에게서 단리한 후, S. 티피무리움 SL7207 균주를 성공적으로 형질전환할 수 있다. 이미 여러 차례 설명한 바와 같이 이 균주는 접종 균주로서 적합하다. 또한 이 균주에서 ZP/Hly-융합 단백질이 분비된다. 그 예로서 도 6은 살모넬라의 huZPB 단편의 발현 및 분비를 보여준다. 생쥐에서 경구 투여한 후, ZP/Hly를 발현하는 살모넬라는 융합 단백질의 ZP 부분에 대해 특이적인 점막 면역성을 유도했다.
〈실시예 2〉
Y. 엔테로콜리티카에서 huZPA, huZPB, huZPC 및 mZPB 단편의 클로닝 및 발현
플라스미드 pGEX-KG-huZPA, pGEX-KG-huZPB 및 pGEX-KG-huZPC (Peter Bringmann, Schering AG)를 써서 클로닝을 시작했다. 이들 플라스미드는 사람 ZPA, ZPB, ZPC 유전자의 cDNA, 및 생쥐의 난소 mRNA (생쥐 ZPB-유전자의 cDNA 합성을 가능하게 함)를 보유한다. 과배란 생쥐 (Uwe Eberspaecher, Schering AG)의 난소로부터 단리한 mRNA로부터 시작해서 상응하는 cDNA를 다음과 같이 합성했다. RNA 약 5 ㎍을 올리고-dT-프라이머 3 ㎕가 들어 있는 DEPC-H2O 32 ㎕에 혼합하고, 65 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. 이 반응물을 실온에서 10 분 동안 냉각시키고, 합성 완충액 5 ㎕, 0.1 M DTT 5 ㎕, RNase 억제제 1 ㎕, 25 mmol dNTP 3 ㎕, MMLV 역전사효소 (20 U/㎕) 1 ㎕를 첨가한다 (1st Strand Synthesis Kit, Stratagene). 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 특이적 올리고뉴클레오타이드 (표 1)를 써서 해당하는 cDNA로부터 겹쳐지는 유전자 단편을 PCR을 통해 증폭시켰으며, 이 단편은 5' 및 3' Nsi I 제한 위치를 갖는다 (도 8 내지 12는 이 결과 생성된 프라이머 위치 및 유전자 단편이 표시된 ZP-유전자의 지도임). PCR 증폭 (Saiki et al., 1988)을 Thermocycler 60/2 (Bio-med, 독일 테레스)로 수행했다. 이를 위해서 상응하는 5'- 및 3'-프라이머 (최종 농도가 각각 1 μmol), dNTP들 (각각 200 μmol) 및 2.5 U Tag DNA 중합효소 (Promega) 및 제조자의 완충액 100 ㎕를 써서 cDNA를 증폭시켰다. 제1 주기 전에 91 ℃에서 3 분 동안 변성화를 수행했다. 그 다음 91 ℃에서 1 분 변성, 55 ℃에서 1 분 어닐링, 72 ℃에서 1 분간 연장의 조건으로 30 주기를 돌렸다. 반응 생성물을 2 % 아가로오즈 겔에서 전기영동에 의해 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 가시화했다. 이들 PCR 생성물을 우선 벡터 pUC18의 Sma I 위치로 "블런트 (blunt)" 삽입했다. 그 다음 ZP 단편을 Nsi I 소화에 의해 절단하고, 발현 벡터 pMohly1으로 삽입했다 (도 1). 이. 콜라이 DH5α를 각종 pMOhly1/ZP 제작물로 형질전환한 후, 밤새 배양한 배양물로부터 상층물 2 ml를 얻고, 이를 10 % (v/v) TCA를 써서 4 시간 동안 얼음 상에서 침전시키고, 원심분리를 통해 펠렛화하고, SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 15 % 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE를 통해 상층물 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 옮긴 후에 투명대/헤몰리신-융합 단백질의 분비에 대해 시험했다. 융합 단백질의 헤몰리신 부분에 대한 폴리클로날 항체를 써서 huZPA 단편, huZPB 단편 및 huZPC의 발현 및 분비를 검출할 수 있었다 (상기 참조). 그 다음, 제한 시스템이 없어서 이. 콜라이 DNA를 효율적으로 도입할 수 있는 균주인 Y. 엔테로콜리티카 LB5000 균주를 상기한 pMOhly1 유도체로 형질전환하였다. 재조합 발현 벡터를 Y. 엔테로콜리티카 LB5000에게서 단리한 후, Y. 엔테로콜리티카 Wap Yv-515 균주를 성공적으로 형질전환할 수 있다. 이미 여러 차례 설명한 바와 같이 이 균주는 접종 균주로서 적합하다. 또한 이 균주에서 ZP/Hly-융합 단백질이 분비된다. 그 예로서 도 7은 Y. 엔테로콜리티카의 huZPC 단편의 발현 및 분비를 보여준다. 생쥐에서 경구 투여한 후, ZP/Hly를 발현하는 예르시니아(Y. 엔테로콜리티카)는 융합 단백질의 ZP 부분에 대해 특이적인 점막 면역성을 유도했다.
밑줄 친 염기는 클로닝에 필요한 Nsi I 제한 위치를 도입하기 위한 각 ZP 서열의 변이를 나타낸다.
Claims (6)
- 수정 조절에 적절한 유전자 또는 유전자 단편이 삽입되어 있고, hly-특이적 프로모터 및 인핸서 유사 조절인자 hlyR을 포함하는 헤몰리신 오페론 전체를 포함하며, hlyA 유전자의 대부분이 결실된 분비 벡터의,수정 조절에 적합한 단백질 또는 단백질 단편의 합성을 유발하고, 이 항원들이 감독(減毒)된 살모넬라 또는 다른 그램음성 감독 접종 균주에 의해 분비되게 하여 경구 백신접종을 유발하는 용도.
- 제1항에 있어서, 수정 조절에 적합한 상기 유전자 또는 유전자 단편이 투명대 단백질을 코딩하는 것인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 분비 벡터가 pMOhly1인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 균주가 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 균주가 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica)인 용도.
- 수정 조절에 적절한 유전자 또는 유전자 단편이 삽입되어 있고, hly-특이적 프로모터 및 인핸서 유사 조절인자 hlyR을 포함하는 헤몰리신 오페론 전체를 포함하며, hlyA 유전자의 대부분이 결실된 분비 벡터를 사용하여 수정 조절에 적합한 단백질 또는 단백질 단편의 합성을 유발하며, 이 항원이 감독된 살모넬라 또는 다른 그램음성 감독 접종 균주에 의해 분비되게 하여, 경구 백신접종을 유발하는,분비 벡터를 사용하는 수정 조절 방법.
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