CN1255067A - 一种通过口服接种用于节育的分泌型载体的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过口服接种的节育方法,其使用减毒的沙门氏菌或其它革兰氏阴性减毒接种株,使用能产生特异性MHCII/CD4或MHCI/CD8免疫应答的不同表达系统。

Description

一种通过口服接种用于节育的分泌型载体的应用
本发明涉及一种通过口服接种用于节育的方法，其使用减毒的沙门氏菌或其它革兰氏阴性减毒接种株，使用允许特异性MHCII/CD4或MHCI/CD8免疫应答产生的不同表达系统。现有技术
长期以来已知道，具有显著高的抗人精子抗体效价的女性和男性常常不育或具有降低的生育力(Ingerslev和Ingerslev，1989；Chen和Jones，1981；Menge等人，1982；Bronson等人，1984)。也显示，用全精子提取物对雌性和雄性动物的免疫能导致诱导性不育(Kummerfeld和Foote，1979；Munoz和Metz，1978；Tung等人，1979；Menge等人，1979)。Primakoff等人(1988a)使用一种单克隆抗体分离豚鼠特异的精子表面抗原PH-20，并能显示该纯化抗原在雌性或雄性豚鼠中的注射产生对生育力的持久免疫(1988b)。对于针对射出的人精子或分离的其它种的精子的许多其它单克隆抗体，能显示它们与人精子有交叉反应。某些可与精浆的成分反应，其它的可检测睾丸来源的抗原。已描述了固定或凝集人精子或抑制精子结合和无区(zone-free)仓鼠卵母细胞穿入的单克隆抗体。目前，已知几种人精子抗原，如，例如Mr 95000抗原(Moore等人，1987)；55kDa抗原，用Lee的S36-37mAbs(HSA-63)使其显而易见(Liu等人，1990)；以及ZP-C的精子受体的人类同源物(用Saling和Bliel和Wassarman的方法在小鼠中测定(Bliel，1990；Leyton和Saling，1989))。已部分鉴定的小鼠和人FA-1抗原(Naz，1988)以及源自大鼠睾丸和人睾丸的24kDA抗原(Shaha等人，1990)更令人关心。Moore和Lee鉴定的抗原以及SP-10免疫原被“世界卫生组织”(对于节育疫苗的专门部门)描述为主要的候选疫苗(Anderson等人，1987)。透明带(ZP)(一种包围乳头状突起的细胞外基质)的三种蛋白质成分也适于作为抗原。这些蛋白质通常被称为ZPA、ZPB和ZPC(Wassarmann，1987，科学(Science)235，553-560)。就此而论，免疫阻断将阻断或影响卵子-精子的相互作用。应用重组产生的ZPC的试验也证实了这一点，ZPC是负责精子与带初始结合的带蛋白。然而在迄今报导的所有病例中，卵巢的不可逆损伤导致长期免疫的情况(Skinner等人，1984，内分泌学(Endocrinology)115，2418-2432)。这种卵巢功能丧失的机理直到今天才阐明。
现在已发现，通过适用于节育的基因或基因片段在一种分泌型载体中的插入，该载体
(a)含有完整的溶血素操纵子，包括hly特异的启动子和一种增强
子样调节基因hlyR，并且其中
(b)hlyA基因的主要部分被删除，
(c)合成了适用于节育的蛋白质或蛋白质片段，并且
(d)通过这些抗原由减毒的沙门氏菌或其它革兰氏阴性减毒接种株
的分泌，
(e)引起口服接种。
在本发明的一种优选实施方案中，适用于节育的基因或基因片段编码透明带蛋白。
在本发明的一种优选实施方案中，适用于节育的基因或基因片段编码透明带蛋白。
在另一种优选实施方案中，分泌型载体是pMOhly1。
在另一种优选实施方案中，沙门氏菌株是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)。
在一种特别优选的实施方案中，适用于节育的基因或基因片段编码透明带蛋白，分泌型载体是pMOhly1，并且沙门氏菌株是鼠伤寒沙门氏菌。
适用于节育的基因或基因片段被定义为编码适用于节育的蛋白质或蛋白质片段的所有基因或基因片段。
通过革兰氏阴性细菌的内膜被转运至周质中的大多数蛋白质具有一种氨基端信号肽，该信号肽在sec-依赖的转运过程中被切除(Pugsley，1993)。与此不同，大肠杆菌的溶血素(HlyA)借助于分泌系统通过内膜和外膜分泌至细胞外基质中。与sec-依赖的蛋白质转运的标准N端转运信号相比，HlyA在C端携带一种由50-60个氨基酸组成的转运信号(HlyAs)(Hess等人，1990；Jarchau等人，1994)。该HlyA信号在分泌过程中不被切除，并且它本身几乎没有任何抗原潜能。
大肠杆菌的溶血素分泌系统由三种膜蛋白组成。这些蛋白质中的两种，HlyB(Gentschev和Goebel，1990)和HlyD(Schulein等人，1992)位于内膜中由作为溶血素决定簇一部分的基因所编码。后者包含一种包括四种基因hlyC、hlyA、hlyB和hlyD的操纵子(Wagner等人，1983；Hess等人，1986)。转运系统的第三种蛋白质TolC位于外膜中(Wandersman和Delepelaire，1990)。HlyA通过革兰氏阴性细菌两种膜的转运需要ATP形式的能量和内膜的膜电势(Koronakis等人，1995)。在不同情况中，已经显示，HlyAs与其它蛋白质或蛋白质片段的融合借助于溶血素分泌系统在这些融合蛋白的分泌中进行(Blight和Holland，1994；Gentschev等人，1994)。在该情况下，分泌效率取决于报道蛋白的折叠和构象。大肠杆菌的溶血素分泌系统在作为接种株的减毒沙门氏菌中是有功能的，并能用来输出融合蛋白(Gentschev等人，1992；Su等人，1992)。用于该方面的遗传系统以前基于两种组分：一种携带转运所需基因(hlyB和hlyD)的质粒，和一种允许融合蛋白表达的质粒(Gentschev等人，1992；Hess等人，1990)。
分泌型载体pMOhly1(Gentschev等人，1995)携带完整的溶血素操纵子(Goebel和Hedgpeth，1982)，包括hly特异的启动子和一种“增强子样”调节基因hlyR(Vogel等人，1988)。hlyA基因的主要部分被删除，使得HlyA仅编码34个氨基端和61个羧基端氨基酸(HlyAs)。HlyA的氨基端基团和羧基端基团之间的独特Nsi I酶切位点允许异源基因或基因片段向HlyAs的读框之中的插入。能将大小为10-1000个氨基酸的抗原的遗传信息插入该分泌型载体pMOhly1中，使得这些抗原在减毒沙门氏菌和其它革兰氏阴性减毒接种株(例如，大肠杆菌、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yeresina enterocolitica))中的分泌成为可能。因此，与其它分泌系统不同，它使单个质粒对异源融合蛋白的转运成为可能。与以前用于抗原呈递并且在大多数情况中仅适合于细菌细胞之外相对较短的肽的转运的转运系统(Cardenas和Clements，1992)相比，溶血素分泌系统的另一个重要优点是有更多的多种大小的转运活性(transport-competent)蛋白质。
通过HlyA分泌系统的处理，能在合适的减毒革兰氏阴性接种株中以胞质形式、表面结合形式或以分泌形式呈递相同的抗原。使用在沙门氏菌中可分泌的李斯特菌溶胞素(来源于单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes))，在用产生抗原的沙门氏菌接种株感染后，另外能实现相同抗原在吞噬体中的加工或在抗原呈递巨噬细胞的细胞溶胶中的增强(Gentschev等人，1995)。以此可能性，能实现诱导增强的CD4+或CD8+T细胞应答(Hess等人，1996)。因为，用此载体系统，单独地或与减毒沙门氏菌中产生的抗原结合地分泌细胞因子和可溶性细胞因子受体也是可能的(Schulein，1993；Gentschev，未发表)，另外免疫应答也可变化(例如，对于TH1或TH2)。
适用于节育的蛋白质或蛋白质片段/HlyAs融合体的有效分泌以及载体的高稳定性使借助于减毒沙门氏菌或其它革兰氏阴性减毒接种株的完全新型的、高度特异的避孕接种成为可能。
重组沙门氏菌的口服施用后，通过适用于节育的蛋白质或蛋白质片段/HlyAs融合体的分泌，抗原(适用于节育的蛋白质或蛋白质片段)能够接近宿主的免疫系统，并且依赖于蛋白质表位并根据分泌途径，引起B细胞和/或T细胞的激活。由于HlyAs代表B细胞和T细胞的一种弱抗原，所以抗体和T细胞由HlyAs融合体诱导并且主要针对报道抗原部分。分泌抗原的减毒沙门氏菌和耶尔森氏菌株特别适合于体液、粘膜免疫应答的诱导，因此是优选的。粘膜免疫的诱导也导致远处粘膜表面上抗原特异性抗体的产生。感染部位的B细胞应答因此也会刺激生殖道中的粘膜免疫。
应用在此公开的本发明，可能是第一次不经用于产生相应免疫应答的昂贵的生产方法，直接原位产生重组蛋白质或其部分导致避孕。借助于相应的载体，能使吞噬体中的这些蛋白质或蛋白质部分在细胞内或细胞外表达。因而能有意产生体液或细胞毒性免疫应答。附图描述
图1显示分泌型质粒pMOhly1的载体图谱。
图2显示一种Western印迹，其中检测不同pMOhly1/(hu)ZPA/构建体的表达和分泌。用不同pMOhly1/(hu)ZPA/构建体转化大肠杆菌DH5α后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA(三氯乙酸)在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝酸纤维素膜后，应用针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，检测其表达和分泌。A1泳道为huZPA-1构建体(见图7)；A4泳道为huZPA-4构建体(见图7)；pMO泳道为载体对照以及B4泳道为huZPB-4构建体(见图8)。
图3显示一种Western印迹，其中检测不同pMOhly1/(hu)ZPB/构建体的表达和分泌。用不同pMOhly1/(hu)ZPB构建体转化大肠杆菌DH5α后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA(三氯乙酸)在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝酸纤维素膜后，应用针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，检测其表达和分泌。B1泳道为huZPB-1构建体(见图8)；B2泳道为huZPB-2构建体(见图8)；B3泳道为huZPB-3构建体(见图8)；B4泳道为huZPB-4构建体(见图8)；B5泳道为huZPB-5构建体(见图8)以及pMO泳道为载体对照。
图4显示一种Western印迹，其中检测不同pMOhly1/(hu)ZPC构建体的表达和分泌。用不同pMOhly1/(hu)ZPC构建体转化大肠杆菌DH5α后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA(三氯乙酸)在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝酸纤维素膜后，应用针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，检测其表达和分泌。C1泳道为huZPC-1构建体(见图9)；C2泳道为huZPC-2构建体(见图9)；C3泳道为huZPC-3构建体(见图9)以及pMO泳道为载体对照。
图5显示一种Western印迹，其中检测不同pMOhly1/(m)ZPB/构建体的表达和分泌。用不同pMOhly1/(m)ZPB/构建体转化大肠杆菌DH5α后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA(三氯乙酸)在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝酸纤维素膜后，应用针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，检测其表达和分泌。B1泳道为mZPB-1构建体(见图10)；B2泳道为mZPB-2构建体(见图10)；B3泳道为mZPB-3构建体(见图10)；B4泳道为mZPB-4构建体(见图10)以及pMO泳道为载体对照。
图6显示一种Western印迹，其中检测不同pMOhly1/(hu)ZPB/构建体的表达和分泌。用不同pMO/(hu)ZPB/构建体转化鼠伤寒沙门氏杆菌SL7207后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA(三氯乙酸)在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝酸纤维素膜后，应用针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，检测其表达和分泌。B1泳道为huZPB-1构建体(见图8)；B2泳道为huZPB-2构建体(见图8)；B3泳道为huZPB-3构建体(见图8)；B4泳道为huZPB-4构建体(见图8)；B5泳道为huZPB-5构建体(见图8)以及pMO泳道为载体对照。
图7显示一种Western印迹，其中检测不同pMOhly1/(hu)ZPC/构建体的表达和分泌。用不同pMO/(hu)ZPC/构建体转化小肠结肠炎耶尔森氏菌Wap Yv-515后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA(三氯乙酸)在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝酸纤维素膜后，应用针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，检测其表达和分泌。C1泳道为huZPC-1构建体(见图12)；C2d泳道为含双插入片段的huZPC-2构建体(见图12)；C3d泳道为含双插入片段的huZPC-3构建体(见图12)以及pMO泳道为载体对照。
图8显示huZPA的cDNA的基因图谱。箭头显示为用于PCR扩增的引物(表1)的位置，数字表示该引物5’末端相对于该基因cDNA序列起始密码子的起始点。实心矩形显示氨基端转运信号、推定的融合缺口位点和能作为膜锚着点的C端上的强疏水区。经PCR扩增的片段其起始点和终止点在下半部分中描述，它们是通过PCR产物的Nsi-I限制性内切核酸酶消化而产生的，以下称为huZPA-1、huZPA-2，等等。另外，片段的长度以碱基对(bp)和氨基酸(aa)两者表示。对于带片段得出其计算分子量，括号中为带/HlyA融合蛋白的预测分子量，单位为kDa。最后，表明用针对HlyA部分的抗体是否检测到融合蛋白的分泌。
图9显示huZPB的cDNA的基因图谱。箭头显示为用于PCR扩增的引物(表1)的位置，数字表示该引物5’末端相对于该基因cDNA序列起始密码子的起始点。实心矩形显示氨基端转运信号、推定的融合缺口位点和能作为膜锚着点的C端上的强疏水区。经PCR扩增的片段其起始点和终止点在下半部分中描述，它们是通过PCR产物的Nsi-I限制性内切核酸酶消化而产生的，以下称为huZPB-1、huZPB-2。另外，片段的长度以碱基对(bp)和氨基酸(aa)两者表示。对于带片段得出其计算分子量，括号中为带/HlyA融合蛋白的预测分子量，单位为kDa。最后，表明用针对HlyA部分的抗体是否检测到融合蛋白的分泌。
图10显示huZPC的cDNA的基因图谱。箭头显示为用于PCR扩增的引物(表1)的位置，数字表示该引物5’末端相对于该基因cDNA序列起始密码子的起始点。实心矩形显示氨基端转运信号、推定的融合缺口位点和能作为膜锚着点的C端上的强疏水区。经PCR扩增的片段其起始点和终止点在下半部分中描述，它们是通过PCR产物的Nsi-I限制性内切核酸酶消化而产生的，以下称为huZPC-1、huZPC-2，等等。另外，片段的长度以碱基对(bp)和氨基酸(aa)两者表示。对于带片段得出其计算分子量，括号中为带/HlyA融合蛋白的预测分子量，单位为kDa。最后，表明用针对HlyA部分的抗体是否检测到融合蛋白的分泌。
图11显示mZPB的cDNA的基因图谱。箭头显示为用于PCR扩增的引物(表1)的位置，数字表示该引物5’末端相对于该基因cDNA序列起始密码子的起始点。实心矩形显示氨基端转运信号、推定的融合缺口位点和能作为膜锚着点的C端上的强疏水区。经PCR扩增的片段其起始点和终止点在下半部分中描述，它们是通过PCR产物的Nsi-I限制性内切核酸酶消化而产生的，以下称为mZPB-1、mZPB-2，等等。另外，片段的长度以碱基对(bp)和氨基酸(aa)两者表示。对于带片段得出其计算分子量，括号中为带/HlyA融合蛋白的预测分子量，单位为kDa。最后，表明用针对HlyA部分的抗体是否检测到融合蛋白的分泌。
图12显示huZPC的cDNA的基因图谱。箭头显示为用于PCR扩增的引物(表1)的位置，数字表示该引物5’末端相对于该基因cDNA序列起始密码子的起始点。实心矩形显示氨基端转运信号、推定的融合缺口位点和能作为膜锚着点的C端上的强疏水区。经PCR扩增的片段其起始点和终止点在下半部分中描述，它们是通过PCR产物的Nsi-I限制性内切核酸酶消化而产生的，以下称为huZPC-1、huZPC-2，等等。另外，片段的长度以碱基对(bp)和氨基酸(aa)两者表示。对于带片段得出其计算分子量，括号中为带/HlyA融合蛋白的预测分子量，单位为kDa。最后，表明用针对HlyA部分的抗体是否检测到融合蛋白的分泌。
应假定本领域熟练的技术人员能在基于本说明书的全部范围上施行本发明。操作核酸的许多已知的技术和方案如世代交替、序列测定、细胞中核酸的引入或蛋白质的分析详见《分子生物学简明方案》(ShortProtocols in Molecular Biology)，第二版，Ausrubel等人编，John Wiley& Sons，1992；《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第二版，Sambrook等人，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press。Sambrook等人和Ausrubel等人的内容在此引入作为参考。
本发明包括用于所述所有用途和方法的药物制剂。本发明因此包括，例如，含有减毒细菌的药物制剂，该减毒细菌中含有根据本发明的分泌型载体。优选地以包入胶囊的、生物可降解的多聚体如PLPG的形式进行口服施用。
下列实施例仅用于更详细的描述，并且显示本发明是可行的，这些实施例并不是起限制的作用。实施例1huZPA、huZPB、huZPC和mZPB片段在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中的克隆和表达
质粒pGEX-KG-huZPA、pGEX-KG-huZPB和pGEX-KG-huZPC(Peter Bringmann，Schering AG)是本克隆策略的出发点，它们携带人ZPA、ZPB和ZPC基因的cDNA和小鼠的卵巢mRNA，从而使小鼠ZPB基因的cDNA合成成为可能。从mRNA开始，并从超排卵小鼠(UweEberspacher，Schering AG)的卵巢中分离，如下合成相应的cDNA：将约5μg RNA与3μl Oligo-dT-引物在32μl DEPC-H2O中混合，于65℃温育5分钟。将该批样品在室温下冷却10分钟，加入下列试剂：5μl合成缓冲液、5μl 0.1M DTT、1μl Rnase抑制剂、3μl 25mmol dNTP和1μlMMLV逆转录酶(20U/μl)(第一链合成试剂盒，Stratagene)。于37℃进行温育1小时。借助于特异的寡核苷酸(表1)，通过PCR从相应的cDNA中扩增重叠的基因片段，这些片段具有5’和3’Nsi I限制性酶切位点(图8-12：ZP基因的图谱，表明引物位置和如上产生的基因片段)。在Thermocycler 60/2(bio-med，Theres，德国)中进行PCR扩增(Saiki等人，1988)。为此目的，用相应的5’-和3’-引物(每种1μmol的终浓度)、dNTPs(每种200μmol)和2.5U Taq DNA聚合酶(Promega)及厂商缓冲液在100μl体积中扩增cDNA。第一个循环之前，于91℃进行变性3分钟。然后在下列条件下进行30个循环：91℃变性1分钟，55℃退火1分钟和72℃延伸1分钟。在2％琼脂糖凝胶中电泳分离反应产物，通过用溴化乙锭染色使其可见。首先将这些PCR产物“平端”地插入载体pUC18的Sma I酶切位点中。然后通过Nsi I消化切下ZP片段，并插入表达载体pMOhly1中(图1)。用不同pMOhly1/ZP构建体转化大肠杆菌DH5α后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝酸纤维素膜后检测带/溶血素融合蛋白的分泌。借助于针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，能检测到两种huZPA片段(A1和A4，图2)和四种huZPB片段(B1-B4，图3)的表达和分泌。对于huZPC，鉴定出一种转运活性结构域(C1，图4)。类似地对于huZPB，通过转运系统也能显示mZPB的三种蛋白质片段的分泌(B1-B3，图5)。
然后，在鼠伤寒沙门氏杆菌LB5000株中进行所述pMOhly1衍生物的转化，该菌株中缺少限制系统，使得能将大肠杆菌DNA有效地引入该菌株中。从鼠伤寒沙门氏杆菌LB5000中分离重组表达载体后，可成功地转化鼠伤寒沙门氏杆菌SL7207株。如前数次所述，该菌株适合作为一种接种株。也在该菌株中进行ZP/Hly融合蛋白的分泌。以举例的方式，图6显示huZPB片段在沙门氏菌中的表述和分泌。在小鼠中口服施用后，表达ZP/Hly的这些沙门氏菌将诱导一种粘膜免疫，该免疫也特异性地针对该融合蛋白的ZP部分。
实施例2huZPA、huZPB、huZPC和mZPB片段在小肠结肠炎耶尔森氏菌中的克隆和表达
质粒pGEX-KG-huZPA、pGEX-KG-huZPB和pGEX-KG-huZPC(Peter Bringmann，Schering AG)是本克隆策略的出发点，它们携带人ZPA、ZPB和ZPC基因的cDNA和小鼠的卵巢mRNA，从而使小鼠ZPB基因的cDNA合成成为可能。从mRNA开始，并从超排卵小鼠(UweEberspacher，Schering AG)的卵巢中分离，如下合成相应的cDNA：将约5μg RNA与3μl Oligo-dT-引物在32μl DEPC-H2O中混合，于65℃温育5分钟。将该批样品在室温下冷却10分钟，加入下列试剂：5μl合成缓冲液、5μl 0.1M DTT、1μl Rnase抑制剂、3μl 25mmol dNTPs和1μlMMLV逆转录酶(20U/μl)(第一链合成试剂盒，Stratagene)。于37℃进行温育1小时。借助于特异的寡核苷酸(表1)，通过PCR从相应的cDNA中扩增重叠的基因片段，这些片段具有5’和3’Nsi I限制性酶切位点(图8-12：ZP基因的图谱，表明引物位置和如上产生的基因片段)。在Thermocycler 60/2(bio-med，Theres，德国)中进行PCR扩增(Saiki等人，1988)。为此目的，用相应的5’-和3’-引物(每种1μmol的终浓度)、dNTPs(每种200μmol)和2.5U Taq DNA聚合酶(Promega)及厂商缓冲液在100μl体积中扩增cDNA。第一个循环之前，于91℃进行变性3分钟。然后在下列条件下进行30个循环：91℃变性1分钟，55℃退火1分钟和72℃延伸1分钟。在2％琼脂糖凝胶中电泳分离反应产物，通过用溴化乙锭染色使其可见。首先将这些PCR产物“平端”地插入载体pUC18的Sma I酶切位点中。然后通过Nsi I消化切下ZP片段，并插入表达载体pMOhly1中(图1)。用不同pMOhly1/ZP构建体转化大肠杆菌DH5α后，将过夜培养物的2ml上清液用10％(v/v)TCA在冰上沉淀4小时，经离心形成沉淀，并重悬浮于SDS样品缓冲液中。通过SDS-PAGE在15％聚丙烯酰胺凝胶中分离上清液蛋白质，并在转移至硝化纤维素后检测带/溶血素融合蛋白的分泌。借助于针对该融合蛋白溶血素部分的多克隆抗体，能检测到huZPA片段、huZPB片段和huZPC的表达和分泌(见上)。然后，在小肠结肠炎耶尔森氏菌LB5000株中进行所述pMOhly1衍生物的转化，该菌株中缺少限制系统，使得能将大肠杆菌DNA有效地引入该菌株中。从小肠结肠炎耶尔森氏菌LB5000中分离重组表达载体后，成功地转化小肠结肠炎耶尔森氏菌Wap Yv-515株是可能的。如前数次所述，该菌株适合作为一种接种株。也在该菌株中进行ZP/Hly融合蛋白的分泌。以举例的方式，图7显示huZPC片段在小肠结肠炎耶尔森氏菌中的表达和分泌。在小鼠中口服施用后，表达ZP/Hly的这些耶尔森氏菌将诱导一种粘膜免疫，该免疫也特异性地针对该融合蛋白的ZP部分。
表1：用于通过PCR扩增ZP基因片段的引物序列以及预期的PCR产物值
ZP片段 PCR产物(bp)
huZPA
huZPA1  5′-GAAATGGCATGCATGCATCTGTG-3′ 390
 5′-GCTGAAGC AT GC ATTCATGGCCTC-3′
huZPA2  5′-CTGCCAGA TGC ATTGAAGGAAGGC-3′ 408
 5′-GTCAGCTTGA ATG CA TCTAAGTAGAAC-3′
huZPA3  5′-CGAAATTAT ATG CA TAATGCCTAC-3′ 456
 5′-GAGTAAGGC AT GCA TCGTTGATG-3′
huZPA4  5′-GTGAAGT AT GC ATATAGCAGG-3′ 318
 5′-CATATGCACA TGCATCCACGACAAC-3′
huZPA5  5′-CACCATGGAT GCA TACTCTTTCC-3′ 249
 5′-GCCTAGAGGA TGCA TGGCAGGTCAC-3′
huZPB
huzPB1  5′-GCTTCCAGTATGCATTAAACCTC-3′ 207
 5′-CGCGCCTG AT GC ATCAACTCCAAC-3′
huZPB2  5-GTGGTGTTGGA TGCA TCCTATAGC-3′ 399
 5′-CAGGGTTACA TGCA TTGTCATTCC-3′
huZPB3  5′-CTCTTGGAT GC ATTGCGCTTGGCC-3′ 375
 5′-CTTCACCA ATG CATAGTCACCAAC-3′
huZPB4  5′-GAGACCCAGC ATG CA TCCCTCACTC-3′ 498
 5-GCCTTTGCTAGA TGCA TTAGCAGTAG-3′
huZPB5  5′-GCCAGCCTGCTGA TGCA TCATCCTG-3′ 213
 5′-CAGCCAAGTAGGAT GC ATACAAGGC-3′
ZP片段 PCR产物(bp)
huZPC
huZPC1  5′-GCCAGCCAT GC ATAGACGTCCGTAC-3′ 495
 5′-CAGTGTGGATTT ATGC ATGGAGGTG-3′
huZPC2  5′-GAGAACTGGAA TGC ATAGAAGAGG-3′ 366
 5′CCAGCTGTTGGA TG CATTGCTGAAG-3′
huZPC2′  5-CAATGTGAGCAGCCA TGC ATTCCTGC-3′ 285
 5′-GAATGCAGAAGA TGCATCAGTGAG-3′
huZPC3  5′-CAGGACCCAGATG CA TTCAACAAG-3′ 363
 5′-CACAGGGTGGGA TGCA TTGCGACAC-3′
huZPC3′  5′-GACCAGAATGC ATCCCCTTATCAC-3′ 360
 5′-GGTTACGGGA TGCATACCTGGAC-3′
huZPC4  5′GCCAGCCAT GC ATATACGTCCGTAC-3′ 936
 5′-GGTTACGGGA TGCA TACCTGGAC-3′
mZPB
mZPB1  5′-GAATACAGCTATG CATGTGGGGTAC-3′ 450
 5′-GCAGGAG ATG CATGGATGAAGCTC-3′
mZPB2  5′-CACACCTTGG ATG CATCTGGCCAC-3′ 408
 5′-CATCCGTTGG ATGCATAGGCCAG-3′
mZPB3  5′-GCCTTGACACATG CA TTCCTGCTAG-3′ 339
 5′-CTTATCCG ATGCA TTCCTCAGCTC-3′
mZPB4  5′-GTGACTCAAT ATG CA TCCCTGAGGC-3′ 393
 5′-CAGAGGGTGGCA TGCA TAGGCACTAC-3′
加下划线的碱基表示为了引入克隆所需的Nsi I酶切位点而与各自ZP序列的偏差。

Claims (6)

1.一种分泌型载体的应用，其中
(a)插入了适用于节育的基因或基因片段，其中
(b)含有完整的溶血素操纵子，包括hly特异的启动子和一种增强
子样调节基因hlyR，并且其中
(c)hlyA基因的主要部分被删除，籍此
(d)合成适用于节育的蛋白质或蛋白质片段，并且
(e)通过这些抗原由减毒的沙门氏菌或其它革兰氏阴性减毒接种株
的分泌，
(f)引起口服接种。
2.根据权利要求1的应用，其中适用于节育的基因或基因片段编码透明带蛋白。
3.根据权利要求1的应用，其中该分泌型载体是pMOhly1。
4.根据权利要求1的应用，其中沙门氏菌株是鼠伤寒沙门氏菌。
5.根据权利要求1的应用，其中该菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌。
6.通过使用一种分泌型载体用于节育的方法，该载体中
(a)插入了适用于节育的基因或基因片段，其中
(b)含有完整的溶血素操纵子，包括hly特异的启动子和一种增强
子样调节基因hlyR，并且其中
(c)hlyA基因的主要部分被删除，籍此
(d)合成适用于节育的蛋白质或蛋白质片段，并且
(e)通过这些抗原由减毒的沙门氏菌或其它革兰氏阴性减毒接种株
的分泌，
(f)引起口服接种。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication