KR20010002012A

KR20010002012A - 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물 및 그를 이용한 이형성 진균의 형태전환 제어방법

Info

Publication number: KR20010002012A
Application number: KR1019990021575A
Authority: KR
Inventors: 오기봉; 장일무
Original assignee: 오기봉; 장일무
Priority date: 1999-06-10
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2001-01-05

Abstract

본 발명은 유효성분으로서, 주골격에 화학식 1a의 제라닐기를 한 개 이상 포함하는 테르펜, 또는 그의 이성체 또는 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물 및 그를 이용한 이형성 진균의 형태전환 제어방법에 관한 것이다:

(CH₃)₂C=CH-CH₂-CH₂-C(CH₃)=CH-

Description

이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물 및 그를 이용한 이형성 진균의 형태전환 제어방법{Pharmaceutical composition for morphogenic regulation of dimorphic fungi and method for morphogenic regulation of dimorphic fungi using the same}

본 발명은 효모형(yeast form) 및 균사형(mycelial form)의 양 형태로 생육가능한 이형성 진균(dimorphic fungi)의 형태전환 제어용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 유효성분으로서 주골격에 화학식 1a의 제라닐(geranyl)기를 한 개 이상 포함하는 테르펜, 또는 그의 이성체 또는 유도체를 함유하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물 및 그를 이용한 이형성 진균의 형태전환 제어방법에 관한 것이다:

[화학식 1a]

(CH₃)₂C=CH-CH₂-CH₂-C(CH₃)=CH-

일반적으로, 많은 진균에 있어서 영양성장세포는 전 생활환을 통하여 출아 또는 분열하는 구상의 단세포(효모상 진균), 또는 선단 발육하는 필라멘트(filament)상의 다세포(사상균)중 어느 한 가지의 형태를 택한다. 그러나, 일부 진균은 효모형 세포와 균사형 세포의 양 세포형태를 가역적으로 전환·형성할 수 있다. 이러한 가역적 전환이 특정한 영양적, 물리적 또는 화학적 인자에 의해 일어나는 현상을 이형성(dimorphism)이라 한다. 이형성 진균은 불완전균류(Subdivision Deuteromycotina)에 속하며, 대표적인 예로서 캔디다(Candida) 속을 들 수 있다. 캔디다 속 진균과 같은 이형성 진균은 사람의 체내 및 생활환경에 통상적으로 존재하는 인간의 상재균종이며, 건강한 사람에서는 병을 일으키지 않으나 어떠한 원인으로 신체의 면역기능이 저하된 환자(에이즈 환자, 면역결핍증 환자, 장기치료 환자 등)에서는 진균증을 유발하는 병원균이 될 수 있다(이러한 감염을 "기회감염"이라 한다). 이형성 진균은 또한 대부분의 심재성 진균증의 주요 원인균으로서 환자로부터 분리되고 있다. 예를 들어, 캔디다 속에 속하는 캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 경우, 캔디다증의 감염병과 부위에서효모형 세포와 함께 다수의 균사형 세포가 혼재하고 있음이 알려져 있으며, 균사형 세포가 이 균의 병원인자의 하나로 생각되고 있다(Hiten D. Madhani ＆ Gerald R. Fink, 1998, Trends in Cell Biology, 8:348-353). 그 이유는 균사형 세포는 동물의 조직 내부로의 기계적인 침투가 용이하고 식세포에 의한 식균 작용도 받기 어려울 것으로 추측되기 때문이다.

현재까지 효모형 세포와 균사형 세포간의 가역적 전환인자에 관하여 구체적으로 밝혀진 바는 없는 실정이다. 만약 병원인자로 추정되는 균사형 세포를 효율적으로 효모형 세포로 전환시킬 수 있다면, 이형성 진균에 의한 감염을 개선시킬 수 있을 것이다. 즉, 고령자, 암환자, 장기이식 환자, 에이즈 환자 등 생체 방어기능이 저하된 환자에 있어서 세균 감염을 방어하기 위해 여러 가지 항생제를 투여하고 있으나, 균의 교대 현상으로 인하여 진균에 의한 감염이 문제가 되고 있는 실정이다. 특히, 주요 병원균인 이형성 진균에 의한 감염에 대한 효과적이고도 부작용이 작은 약제의 개발은 의학적으로도 매우 중요한 과제이다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 캔디다 알비칸스가 효모형→균사형→효모형 세포로 복귀함에 주목하여 그의 배양상층으로부터 형태전환 제어활성을 나타내는 인자를 분리하고 그 구조를 규명함과 동시에 그 유사체의 활성을 명확히 밝힘으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 이형성 진균에 의한 감염을 효과적으로 개선할 수 있을 뿐 아니라 부작용이 작은, 주골격에 한 개 이상의 제라닐기를 포함하는 테르펜, 또는 그의 이성체 또는 유도체를 함유하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 또한 상기 조성물을 사용하여 이형성 진균의 형태전환을 제어하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 캔디다 알비칸스의 배양상층으로부터 분리한 파르네소에이트의 고속액체크로마토그래피 결과를 나타낸 도면;

도 2는 파르네소에이트의 GC-MS 스펙트럼을 나타낸 도면;

도 3은 파르네소에이트의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면;

도 4는 파르네소에이트의¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면;

도 5a는 파르네소에이트의 이형성 진균의 효모형 세포로부터 균사형 세포로의 전환에 대한 저해 활성을 나타낸 그래프;

도 5b는 배양 개시로부터 8 시간후 대조군 및 파르네소에이트 첨가 배지에서의 세포 형태를 나타낸 현미경사진;

도 6은 배양 개시로부터 8 시간후 파르네소에이트의 효모형 세포의 증식에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프;

도 7은 배양 개시로부터 2 시간후 파르네소에이트의 균사형 세포로의 전환에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프;

도 8은 배양 개시로부터 8 시간후 β-파르네솔의 효모형 세포의 증식에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프;

도 9는 배양 개시로부터 2 시간후 β-파르네솔의 균사형 세포로의 전환에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프;

도 10은 배양 개시로부터 8 시간후 파르네실 아세테이트의 효모형 세포의 증식에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프;

도 11은 배양 개시로부터 2 시간후 파르네실 아세테이트의 균사형 세포로의 전환에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프;

도 12는 배양 개시로부터 8 시간후 β-파르네센의 효모형 세포의 증식에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프; 및

도 13은 배양 개시로부터 2 시간후 β-파르네센의 균사형 세포로의 전환에 대한 저해 효과를 나타낸 그래프.

본 발명은 유효성분으로서, 주골격에 화학식 1a의 제라닐기를 한 개 이상 포함하는 테르펜(terpene), 또는 그의 이성체 또는 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1a]

(CH₃)₂C=CH-CH₂-CH₂-C(CH₃)=CH-

본 발명에 따른 조성물의 유효성분 화합물은 한 개의 제라닐기를 함유하는 모노테르펜(monoterpene) 또는 세스키테르펜(sesquiterpene), 또는 두 개의 제라닐기를 함유하는 디테르펜(diterpene)인 것이 더욱 바람직하다. 그 대표적인 화합물은 하기와 같다:

트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올(제라니올; 화합물 1);

트랜스-1-메톡시-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(화합물 2);

시스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올(네롤; 화합물 3);

3,7-디메틸-2,6-옥타디에닐 아세테이트(화합물 4);

3,7-디메틸-2,6-옥타디엔산(화합물 5);

트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(화합물 6);

시스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(화합물 7);

3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔-1-올(β-파르네솔; 화합물 8);

3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔산(파르네소에이트; 화합물 9);

3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리에닐 아세테이트(파르네실 아세테이트; 화합물 10);

7,11-디메틸-3-메틸렌-1,6,10-도데카트리엔(β-파르네센; 화합물 11);

3,7,11-트리메틸-1,6,10-도데카트리엔-3-올(네로리돌; 화합물 12); 또는

3,7,11,15-테트라메틸-2,6,10,14-헥사데카테트라엔-1-올(제라닐제라니올; 화합물 13).

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 캔디다(Candida) 속에 속하는 이형성 진균의 효모형 세포로부터 균사형 세포로의 전환을 저해할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 하기와 같다,

본 발명에 따른 조성물은 유효성분으로서 주골격에 화학식 1a로 나타내어지는 제라닐기를 하나 이상 포함하는 테르펜(terpene), 또는 그의 이성체 또는 유도체를 함유한다.

테르펜이란 이소프렌(isoprene; 2-methyl-1,3-butadiene, CH₂=C(CH₃)CH=CH₂)이 머리와 꼬리로 순차결합한 기본골격 (C₃H₈)_n을 갖는 물질의 총칭으로, 테르페노이드 또는 이소프레노이드라고도 하며, 메바론산으로부터 생합성된다. 테르펜은 연결하는 이소프렌의 수에 따라 다음과 같이 분류된다:

(1) n=2; 10개의 탄소원자를 갖는 모노테르펜

(2) n=3; 15개의 탄소원자를 갖는 세스키테르펜

(3) n=4; 20개의 탄소원자를 갖는 디테르펜

(4) n=5; 25개의 탄소원자를 갖는 세스터테르펜

(5) n=6; 30개의 탄소원자를 갖는 트리테르펜

(6) n=8; 40개의 탄소원자를 갖는 테트라테르펜, 그외에

(7) n≥9의 폴리테르펜 등.

본 발명에 있어서 제라닐기는 α- 또는 β- 이성체를 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효성분 화합물의 대표적인 예를 들면 하기와 같다.

주골격에 1개의 제라닐기를 포함하는 모노테르펜(탄소원자수 10, n=2)으로서,

트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올(trans-3,7-dimethyl-2,6-octadiene-1-ol, 제라니올(geraniol); 화합물 1),

화합물 1의 에테르 유도체, 예를 들면, 트랜스-1-메톡시-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(trans-1-methoxy-3,7-dimethyl-2,6-octadiene; 화합물 2),

화합물 1의 이성체, 예를 들면, 시스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올(cis-3,7-dimethyl-2,6-octadiene-1-ol, 네롤(nerol); 화합물 3),

화합물 1의 산 에스테르 유도체, 예를 들면, 3,7-디메틸-2,6-옥타디에닐 아세테이트(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl acetate; 화합물 4),

화합물 1의 산 유도체, 예를 들면 3,7-디메틸-2,6-옥타디엔산(3,7-dimethyl-

2,6-octadienoic acid; 화합물 5),

트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(trans-3,7-dimethyl-2,6-octadiene; 화합물 6) 또는

시스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(cis-3,7-dimethyl-2,6-octadiene; 화합물 7)을 들 수 있으며,

1개의 제라닐기를 함유하는 세스키테르펜(탄소원자수 15, n=3)으로서,

α-파르네솔(α-farnesol) 또는 3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔-1-올

(3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodeca-triene-1-ol, β-파르네솔(β-farnesol); 화합물 8)과 그의 에테르 유도체,

화합물 8의 산 유도체, 예를 들면, 3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔산(3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodeca-trienoic acid, 파르네소에이트(farnesoate); 화합물 9),

화합물 8의 산 에스테르 유도체, 예를 들면, 3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리에닐 아세테이트(3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrienyl acetate, 파르네실 아세테이트(farnesyl acetate); 화합물 10),

3,7,11-트리메틸-1,3,6,10-도데카테트라엔(3,7,11-trimethyl-1,3,6,10-dodec

-atetraene, α-파르네센(α-farnesene)),

7,11-디메틸-3-메틸렌-1,6,10-도데카트리엔(7,11-demethyl-3-methylene-1,6,

10-dodecatriene, β-파르네센(β-farnesene); 화합물 11),

3,7,11-트리메틸-1,6,10-도데카트리엔-3-올(3,7,11-trimethyl-1,6,10-dodec

-atriene-3-ol, 네로리돌(nerolidol); 화합물 12)를 들 수 있으며,

2개 이상의 제라닐기를 함유하는 디테르펜(탄소원자수 20, n=4), 세스터테르펜(sesterterpene; 탄소원자수 25, n=5), 트리테르펜(triterpene; 탄소수 30, n=6) 등을 들 수 있으며, 디테르펜으로서는 3,7,11,15-테트라메틸-2,6,10,14-헥사데카테트라엔-1-올(3,7,11,15-tetramethyl-2,6,10,14-hexadecatetraene-1-ol, 제라닐제라니올(gernylgeraniol), 화합물 13), 또는 그의 이성체 또는 유도체를 들 수 있다.

상기한 대표적 화합물의 구조식을 나타내면 하기와 같다(화합물 n의 구조식은 화학식 n으로 나타냄).

본 발명자들은 이형성 진균의 대표적 예인 캔디다 알비칸스가 효모형 세포로부터 균사형 세포로 전환한 것이 다시 효모형 세포로 형태전환하는 사실에 주목하였다(효모형→균사형→효모형). 이에 캔디다 알비칸스 자체가 형태전환을 제어하는 인자를 분비할 것으로 예상하여, 자기제어 인자의 존재 가능성에 대한 실험을 별도로 수행하였다. 그 결과, 효모형 세포를 파쇄한 균체 추출액에서는 균사형 세포로의 전환에 대한 저해활성이 검출되지 않았으나 균사형에서 효모형으로 복귀한 후의 배양상층에서는 균사형 세포로의 전환을 약 65% 이상 저해하는 결과를 얻을 수 있었다. 이 때의 배양상층의 pH는 4.5였으며, pH 4.5는 캔디다 알비칸스에 있어서 효모형 세포로의 전환조건(＜pH 7.0)이므로, 배양상층에 대하여 균사형 세포로의 전환조건(≥pH 7.0)인 pH 7.0에서 실험한 결과, pH 4.5에서와 동등한 저해효과를 얻었다. 또한 일련의 실험에 사용된 GI(germination-induction) 배지(Oh, K.-B. et al., 1995, J. Med. Vet. Mycol., 33:191-195)에 함유된 각종 배지성분의 영향에 대해 검토한 결과, 어떠한 배지성분도 균사형 세포로의 전환에 대한 저해활성을 나타내지 않음을 확인하였다. 상기와 같은 결과로부터 배양상층의 균사형 세포로의 전환에 대한 저해활성은 캔디다 알비칸스 자체로부터 분비되는 형태전환 제어인자에 의한 것으로 판단되었으며, 상기 물질을 분리하여 동정한 결과, 파르네소에이트(화합물 9)임이 확인되었다. 상기 물질의 분리·동정은 역상 크로마토그래피, 가스 크로마토그램, 질량분석기, 핵자기공명 분석기기 등 각종 분석기기를 사용하여 수행하였다.

본 발명에서는 파르네소에이트(화합물 9) 뿐만 아니라 각종 화합물, 예를 들어 상기 화합물 1∼8 및 10∼13를 선택하여 전환 저해활성을 검토한 결과 모두 균사형 세포로의 전환에 대한 저해활성을 나타냄을 확인하였다. 결과적으로 화합물의 주골격에 한 개 이상의 제라닐기를 함유하는 테르펜, 또는 그의 이성체 또는 유도체가 이형성 진균의 균사형 세포로의 전환에 대한 저해활성을 갖는다는 결론을 얻었다.

상기 화합물을 이형성 진균의 효모형 세포로부터 균사형 세포로의 전환 저해제로 사용하고자 하는 경우, 투여경로로서 경구, 피하주사, 정맥주사, 국소투여 등의 어떠한 방법이라도 무방하다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량형태로 제조하거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조할 수 있다. 이때 제제형태는 오일 또는 수성매질중의 용액, 현탁액 또는 유액 형태이거나 엑기스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제, 현탁제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 각각 당해 기술분야에 공지된 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 인체 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물 활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 1∼1500㎎ 정도를 투여하며, 200∼800㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 단위투여형 제제는 상기한 유효용량 범위를 고려하여 본 발명의 활성물질 5∼500㎎을 함유하도록 제형화하고, 바람직하게는 50∼300㎎을 함유하도록 제형화한다. 이렇게 제형화된 단위투여형제제는 필요에 따라 약제투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정 시간간격으로 수회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 1일 1회 내지 3회 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서 이형성 진균으로는 효모형↔균사형으로 전환하는 것으로서, 예를 들면, 캔디다 속의 캔디다 알비칸스, 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis), 캔디다 스텔라토이디아(C. stellatoidea), 캔디다 글라브라타(C. glabrata), 캔디다 프랩실로시스(C. parapsilosis) 등을 들 수 있으며, 캔디다 속 이외에 크립토코커스 속 (Genus Cryptococcus), 예를 들면, 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 스포르트릭스 속(Geneus Sporothrix), 예를 들면, 스포로트릭스 쇤키 (Sporothrix schenckii), 히스토플라스마 속(Genus Histoplasma), 예를 들면, 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum) 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하고자 하나, 이것은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

분리·정제단계에서 형태전환 제어물질의 활성은 후술하는 활성검색방법에 의하여 평가되었다.

Ⅰ. 캔다다 알비칸스 배양엑기스의 제조 및 형태전환 제어물질의

분리·정제

[실시예 1] 캔디다 알비칸스 배양엑기스의 제조

20㎖의 시험관에 5㎖의 포테이토 덱스트로스 한천(PDA: potato dextrose agar) 사면배지를 제조하여, 캔디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC10231 균주를 접종한후 실온에서 1 주간 배양하여 충분히 생육시킨 효모형 세포를 채취하여 실험에 사용하였다. 이 시험균을 200㎖의 YPD배지(1% yeast extract, 2% bactopeptone, 2% glucose)에 접종하여 25℃에서 48시간동안 진탕하여(120rpm) 전배양한후, 원심분리기로 집균(4℃, 3000rpm)하고 멸균증류수로 3회 세정하였다. 멸균증류수에 재현탁하고 4℃에서 3일간 정치하여 기아상태의 효모형 세포를 조제하였다. 직경 3.5㎝의 패트리디쉬에 GS배지(1000㎖당 조성: glucose, 5g; Na₂HPO₄·12H₂O, 0.2g; KH₂PO₄, 0.66g; NH₄Cl, 0.33g; MgSO₄·7H₂O, 0.88g; biotin, 16㎍; 5N NaOH로 pH 7.0으로 조정)를 2㎖씩 분주하고 여기에 기아상태의 효모형 세포를 혈구계산판으로 1.0×10⁶세포/㎖로 조정하여 접종하였다. 이 효모형 세포를 균사형 세포로 전환시키기 위해 37℃로 이동시키고 3일간 진탕배양한 후 3일간 정치배양하였다. 이후 균체를 여과지를 이용하여 여과제거하고 배양액을 동결건조하여 엑기스를 제조하였다. 이 배양상층 150ℓ로부터 379g의 건조분말을 얻었다.

[실시예 2] 형태전환 제어물질의 추출·정제

실시예 1로부터 얻은 건조분말 379g을 메탄올 1ℓ에 교반하면서 첨가하여 1∼2시간동안 용해시킨후 여과하여 불용물을 제거하였다. 메탄올 용출분획을 감압농축하고 건조시켜 126g의 분말을 얻었다. 이 건조물을 물 500㎖에 교반하면서 첨가하고 2배량의 헥산을 첨가하여 분획하였다. 3회 반복하여 헥산분획을 모으고 감압농축하고 건조시켜 130㎎의 오일상 혼합물을 얻었다.

[실시예 3] 고속액체크로마토그래피를 이용한 형태전환 제어물질의 정제

실시예 2로부터 얻은 130㎎의 오일상 혼합물을 10㎖의 90% 아세토나이트릴에 용해시켜 인젝션하여 분리하였다. 분리용 칼럼으로는 Inertsil ODS-2 (4.6㎜ I.D.×150㎜, 크로마토공업사 제품)를 사용하여 유속 1㎖/min으로 UV 240㎚에서 검출하였고, 용출용매로는 30% 아세토나이트릴에서 시작하여 20분후 100% 아세토나이트릴이 되도록 용매구배법으로 분리하였다. 이를 더욱 정제하기 위하여 2차 고속액체크로마토그래피를 수행하였으며 분리조건은 상기와 동일하나 용출용매로는 50% 아세토나이트릴에서 시작하여 18분후 70% 아세토나이트릴이 되도록 조정하였다. 활성분획을 모으고 감압농축하고 건조시켜 4mg의 오일상의 순수한 형태전환 제어물질을 얻었다(도 1 참조).

[실시예 4] 분광법을 이용한 형태전환 제어물질의 분석

GC-MS (일본분광: SX-102A)를 이용하여 분자량 및 시성식을 측정하였다. 또한, 약 4㎎의 시료를 99.99% 클로로포름(CDCl₃)에 용해시켜 고자장 핵자기공명(NMR)을 이용하여 구조를 분석하였다. NMR은 JEOL사 제품으로 VAX32 컴퓨터가 연결된 500MHz 스펙트로미터를 사용하여 실시하였다. 케미칼 시프트는 내부표준물질인 테르라메틸실란에 대해서 ppm으로 나타내었다. 이차원 COSY, DQF(double quantum-filtered) COSY 및 TQE(triple quantum-filtered) COSY 또한 수행되었다.

GC-MS를 이용하여 측정한 결과 분자량이 236임이 확인되었다(도2 참조). 고분해능분석을 행한 결과, 시성식은 C₁₅H₂₄O₂임이 확인되었다.¹H-NMR에서(도3 참조) 케미칼 시프트가 고자장 부근인 1∼2.2ppm 사이의 피크로부터 본 화합물이 -CH₂또는 -CH₃를 다수 함유함을 알수 있었으며, 5.0ppm 부근의 다중피크로부터 이중결합의 탄소에 결합한 2 개의 수소원자를 알수 있었다. 5.7ppm의 단일피크는 말단에 CH₃가 존재하는 이중결합의 탄소에 결합한 1개의 수소원자를 나타낸다. H와 C의 결합은 C-H COSY NMR로부터 알수 있었다. CDCl₃를 기준으로 하는¹³C-NMR(도4 참조)의 170.7ppm 피크의 탄소로부터 본 물질이 말단에 -COOH 작용기를 가짐을 알수 있었으며, 각 C-C COSY 분석에서 각 탄소의 상대위치를 파악할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 종합하여, 캔디다 알비칸스의 배양상층으로부터 분리정제된 형태전환 제어물질은 3,7,11-트리메틸-2,6,10-도테카트리엔산(3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodeca-trienoic acid, 파르네소에이트(farnesoate):화합물 9)인 것으로 결론내렸다.

Ⅱ. 형태전환 제어물질의 활성검색

[실시예 5] 파르네소에이트의 균사형 세포로의 전환 저해활성 시험

실시예 4로부터 정제·동정한 파르네소에이트(화합물 9)를 25μg/㎖이 되도록 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 배지에 첨가하였다. 이 때 배지중 DMSO의 최종농도는 0.5%(v/v)가 되도록 하였다. 패트리 디쉬를 37℃로의 이동 직후를 0 시간으로 하여 1∼2 시간 마다 현미경(Olympus)을 사용하여 경시적으로 세포 형태를 관찰하였다. 무작위로 세포를 계수하여 그중의 균사형 세포수를 균사형 전환율(%)로 하여 활성평가의 척도로 하였다. 비교 표준으로서 동일한 배지조건에 아무것도 첨가하지 않은 것(대조군)과 DMSO만을 첨가한 것(DMSO 처리군)을 사용하였다. 그 결과를 도 5a에 나타내었다. 또한 8 시간 경과후의 대조군 및 파르네소에이트를 첨가한 배지중의 세포 형태를 나타내는 현미경사진을 도 5b에 나타내었다. 상기 결과로부터 파르네소에이트는 효모형 세포로부터 균사형 세포로의 전환은 어느 정도 허용하지만, 균사형 세포로부터 효모형 세포로의 전환을 촉진함을 확인할 수 있었다.

[실시예 6] 파르네소에이트의 균사형 세포로의 전환 저해활성 및 효모형 세포의 증식 저해활성 시험

실시예 1과 동일한 배지 및 접종균을 사용하여 패트리 디쉬를 제조하고 여기에 DMSO 용액내의 파르네소에이트를 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200μg/㎖의 농도로 실시예 5와 동일한 조건에서 배지에 가하였다. 37℃로 이동하여 효모형 세포의 증식 저해효과(효모형 세포의 증식율) 및 균사형 세포로의 전환 저해효과(균사형 세포로의 전환율)을 측정하였다. 배양 개시로부터 8 시간후 효모형 세포의 증식 저해효과(효모형 세포의 증식율)를 도 6에 나타내었으며, 배양 개시로부터 2 시간후 균사형 세포로의 전환 저해효과를 도 7에 나타내었다. 효모형 세포에 대한 50% 증식 저해농도는 200 μg/㎖ 이상의 농도로 밝혀졌으며(도 6 참조), 배양 개시로부터 2시간후 균사형 세포로의 50% 전환 저해농도는 100μg/㎖(도 7 참조), 배양 개시로부터 5시간후 균사형 세포로의 50% 전환 저해농도는 3.12μg/㎖(하기 표 1 참조)인 것으로 나타났다.

[실시예 7] 파르네솔, 파르네실 아세테이트 및 β-파르네센의 균사형 세포로의 전환 저해활성 및 효모형 세포의 증식 저해활성 시험

실시예 6과 동일한 조건에서 파르네솔(화합물 8), 파르네실 아세테이트(화합물 10) 및 β-파르네센(화합물 11)에 대해 각각 실험(각 시약은 시판시약을 입수)을 수행하여 활성을 평가하였다. 각 화합물의 배양 개시로부터 8 시간후 효모형 세포에 대한 증식 저해효과를 도 8, 도 10 및 도 12에, 배양 개시로부터 2 시간후 균사형 세포로의 전환 저해효과를 도 9, 도 11 및 도 13에, 배양 개시로부터 5 시간후 균사형 세포로의 전환 저해효과를 하기 표 1에 나타내었다. 모든 화합물이 효모형 세포에 대한 50% 증식 저해농도는 200μg/㎖ 이상이었으며 배양 개시로부터 5 시간후 균사형 세포로의 50% 전환 저해농도는 매우 낮은 농도였다. 이로부터 상기 화합물들은 높은 균사형 세포로의 전환 저해활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

[실시예 8] 제라니올 및 제라닐제라니올의 균사형 세포로의 전환 저해활성 및 효모형 세포의 증식 저해활성 시험

실시예 6과 동일한 조건에서 제라니올(화합물 1) 및 제라닐제라니올(화합물 13)에 대해 각각 실험(각 시약은 시판시약을 입수)을 수행하여 활성을 평가하였다(하기 표 1 참조). 상기 화합물 또한 효모형 세포에 대한 증식 저해효과는 낮지만 균사형 세포로의 전환 저해효과(균사형 세포로부터 효모형 세포로의 전환 촉진활성)이 있음이 확인되었다.

하기 표 1은 화합물 1∼13의 배양 개시로부터 8 시간후 효모형 세포의 50% 증식 저해농도 및 배양 개시로부터 2 시간 및 5 시간후 균사형 세포의 50% 전환 저해농도를 나타내는 것이다.

효모형 세포의 증식 및 균사형 세포로의 전환에 영향을 미치는 각 화합물의 농도(㎍/㎖)

화합물 번호	배양개시로부터 8시간후 효모형 세포에 대한 50% 증식 저해농도	균사형 세포로의 50% 전환 저해농도
화합물 번호	배양개시로부터 8시간후 효모형 세포에 대한 50% 증식 저해농도	배양개시로부터 2시간후	배양개시로부터 5시간후
화합물 1	≥200	≥200	100-150
화합물 2	≥200	≥200	100-150
화합물 3	≥200	≥200	100-150
화합물 4	≥200	100-200	50-100
화합물 5	≥200	100-150	10-25
화합물 6	≥200	50-100	25-50
화합물 7	≥200	50-100	25-50
화합물 8	≥200	3.12	0.4
화합물 9	≥200	100	3.12
화합물 10	≥200	200	50-100
화합물 11	≥200	25	≥25
화합물 12	≥200	≥200	100-150
화합물 13	≥200	150-200	50-100

상기한 바와 같이, 본 발명에서는 캔디다 알비칸스의 배양상층으로부터 유래한 파르네소에이트를 비롯한 각종 유사 화합물의 활성을 시험해본 결과, 상기 화합물들이 균사형 세포로의 전환 저해활성(균사형 세포의 효모형 세포로의 전환 촉진기능)를 가짐을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명에 따르면, 화합물의 주골격에 한 개 이상의 제라닐기를 함유하는 테르펜 또는 그의 이성체 또는 유도체가 이형성 진균의 형태전환 저해활성을 가짐이 최초로 확인되었으며 이형성 진균의 형태전환 제어활성을 갖는 신규한 약제학적 조성물을 제공할 수 있게 된다.

[실시예 9] 독성시험

화합물 1∼13에 대하여 독성실험을 하기와 같이 수행하였다.

활성물질을 콘-오일에 용해시켜 마우스(군당 5마리)에 각각 투여한 후 14일 동안 관찰하여 사망률을 측정하였다. 이때 상기 활성물질을 2g/㎏, 1g/㎏, 500㎎/㎏, 250㎎/㎏, 125㎎/㎏, 62.6㎎/㎏의 6 단계로 투여하였고 50% 치사량(LD₅₀)은 어느 화합물에서도 2g/㎏ 이상이었다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 이형성 진균의 형태전환을 효율적으로 제어함으로써 이형성 진균에 의한 감염을 효과적으로 개선할 수 있을 뿐 아니라 부작용도 작다.

Claims

유효성분으로서, 주골격에 화학식 1a의 제라닐기를 한 개 이상 포함하는 테르펜, 또는 그의 이성체 또는 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물:

[화학식 1a]

(CH₃)₂C=CH-CH₂-CH₂-C(CH₃)=CH-
제 1 항에 있어서, 테르펜이 한 개의 제라닐기를 함유하는 모노테르펜 또는 세스키테르펜이거나, 두 개의 제라닐기를 함유하는 디테르펜인 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물.
제 2 항에 있어서, 테르펜이

트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올(화합물 1; 제라니올);

트랜스-1-메톡시-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(화합물 2);

시스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올(화합물 3; 네롤);

3,7-디메틸-2,6-옥타디에닐 아세테이트(화합물 4);

3,7-디메틸-2,6-옥타디엔산(화합물 5);

트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(화합물 6);

시스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔(화합물 7);

3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔-1-올(화합물 8; β-파르네솔);

3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔산(화합물 9; 파르네소에이트);

3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리에닐 아세테이트(화합물 10; 파르네실 아세테이트);

7,11-디메틸-3-메틸렌-1,6,10-도데카트리엔(화합물 11; β-파르네센);

3,7,11-트리메틸-1,6,10-도데카트리엔-3-올(화합물 12; 네로리돌); 및

3,7,11,15-테트라메틸-2,6,10,14-헥사데카테트라엔-1-올(화합물 13; 제라닐제라니올)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 캔디다(Candida) 속에 속하는 이형성 진균의 효모형 세포로부터 균사형 세포로의 전환을 저해하는 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어용 약제학적 조성물.
제 1 항에 따르는 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 이형성 진균의 형태전환 제어방법.