KR20000075919A - 이소프레노이드와 스타틴의 배합물로 종양 성장을 억제하는 방법 - Google Patents

이소프레노이드와 스타틴의 배합물로 종양 성장을 억제하는 방법 Download PDF

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챠알스 이. 엘슨
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리차드 에이취 리저
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Abstract

본 발명은 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 종양을 토코트리에놀, 스타틴 및 이오논으로 구성된 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 유효량의 조성물에 노출시키는 단계를 포함한다.

Description

이소프레노이드와 스타틴의 배합물로 종양 성장을 억제하는 방법 {METHOD OF SUPPRESSING TUMOR GROWTH WITH COMBINATIONS OF ISOPRENOIDS AND STATINS}
과일, 채소 및 곡물의 잡다한 메발로네이트 유도 성분(이소프레노이드)는 화학적으로 개시되는 발암을 억제한다. 이러한 작용은 해독 활성의 이소프레노이드 중개 유도 및 일부 이소프레노이드의 산화방지 활성으로 인한 것이었다. 화학적으로 개시되는 발암의 촉진/진행 단계에서도, 화학적으로 생성되고 이식된 종양에 대해서도, 효능있는 이소프레노이드가 갖는 작용은 설명되지 않는다 [참조 : Elson, 1995; Elson and Yu, 1994]. 이소프레노이드는 종양 성장에 대해 이들이 갖는 영향이 실질적으로 상이하다. 이소프레노이드는 이식후 작용을 통해[Correll, et al., 1994; Parker, et al., 1993; D.M. Peffley and A.K. Gayen, personal communication], 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A (HMG-CoA) 환원효소 활성을 억제하며, 이 활성은 콜레스테롤의 합성에 대해 속도 제한적인 것으로 여겨진다. 스타틴은 HMG-CoA 환원효소의 경쟁적 억제제이다. 다양한 이소프레노이드의 말기 종양 억제 잠재성과 HMG-CoA 환원효소 활성에 대한 이들의 영향 사이의 상관관계가 단일성에 접근한다. 종양의 환원효소 활성은 스테롤 재생 조절에 대한 저항성에 있어서 간의 환원효소 활성과 상이하다. 그러나, 종양 활성은 다양한 이소프레노이드에 의해 자극되는 바와 같이 이식후 조절에 대해 고민감성을 유지한다. HMG-CoA 환원효소 활성의 이소프레노이드 중개 억제의 결과로서, 메발로네이트 경로 중간생성물의 푸울이 성장 관련 단백질의 이식후 처리를 제한하게 된다 [참조 : Elson, 1995; Elson and Yu, 1994].
최근의 한 개관은 메발로네이트 합성을 억제하기 위한 능력이 변동된 구조적으로 다양한 이소프레노이드의 리스트를 제공하였다 [Elson, 1995].
본 발명은 종양 세포 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 흑색종 B16 세포의 증식에 대한 토콜의 용량-의존성 작용을 나타내는 그래프이다.
도 2A 및 도 2B는 흑색종 세포군에 대한 γ-토코트리에놀, β-이오논 및 카르바크롤의 배합물의 효과를 예시하는 도면이다. 도 2A는 γ-토코트리에놀 및 β-이오논의 효과를 예시하고 있다. 도 2B는 카르바크롤 및 β-이오논의 효과를 예시하고 있다.
도 3은 고형물 이식된 B16 흑색종의 검출 후에 이소프레노이드 강화 식이물을 섭취한 숙주 마우스에 대한 생존율 곡선이다.
발명의 요약
하나의 구체예에서, 본 발명은 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 스타틴, 이오논 및 토코트리에놀으로 구성된 군으로부터 선택된 메발로네이트 경로의 2종 이상의 생성물의 배합물로 처리하는 것을 포함한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 이오논은 β-이오논; 6-10-디메틸-운데크-3,5-엔-2,9-디온; 6,10-디메틸-9,10-에폭시-운데크-3,5-엔-2-온; 9,10-디아세톡시-6,10-디메틸-운데크-3,5-엔-2-온; 6,10-디메틸-9,10-디온-운데크-3,5-엔-2-온; 6,10-디메틸-9,10-디올-운데크-3,5-엔-2-온 및 α-이오논으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 토코트리에놀로는, d-γ-토코트리에놀, 2-데스메틸토코트리에놀, d-δ-토코트리에놀 및 d-토코트리에놀이 있다. 바람직한 스타틴으로는, 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴 및 플루바스타틴이 있다.
또 다른 형태에서, 본 발명은 토코트리에놀, 스타틴 및 이오논으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 제제를 유효량 투여하는 것을 포함하여, 종양을 치료하거나 예방하는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 성장 및 대사를 예방하거나 감소시키는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양의 검출 후에 종양 환자의 생존 기간을 증가시키는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 생성을 에방하는 데에 있다.
본 발명의 기타 목적, 장점 및 특징은 본 명세서, 청구의범위 및 도면을 고찰한 후에 당업자에게 자명해질 것이다.
발명의 설명
하나의 구체예에서, 본 발명은 종양 세포를 이소프레노이드의 배합물에 노출시킴으로써 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 구체예에서, 배합물은 1종 이상의 토코트리에놀 및 1종 이상의 스타틴을 포함한다. 본 발명의 제 3 구체예에서, 배합물은 1종 이상의 스타틴 및 1종 이상의 이오논을 포함한다. 본 발명자들은 본 발명의 또 다른 적합한 구체예가 메발로네이트 경로의 3가지 생성물을 모두 포함하는 배합물임을 가정하였다.
"토코트리에놀"은 한 부류의 하기의 군을 의미한다 : 비타민 E 패밀리는 광범위하게 토코페롤 및 토코트리에놀로 구성된 비타머의 혼합물로 구성된다. 하기의 리스트는 대표적 토코페롤 및 토코트리에놀을 기재한 것이다.
d-α-토코페롤 d-α-토코트리에놀 d-β-토코페롤 d-β-토코트리에놀 d-γ-토코페롤 d-γ-토코트리에놀 d-δ-토코페롤 d-δ-토코트리에놀 d-토코페롤 d-토코트리에놀 2-디메틸토코트리에놀 2,5,7,8-테트라메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-올2,5,7,8-테트라메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데카-3,7,11-트리에닐)-크로만-6-올2,5,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-올2,5,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데카-3,7,11-트리에닐)-크로만-6-올2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-올2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데카-3,7,11-트리에닐)-크로만-6-올2,8-디메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-올2,8-디메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데카-3,7,11-트리에닐)-크로만-6-올2-메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-올2-메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데카-3,7,11-트리에닐)-크로만-6-올2-(4,8,12-트리메틸트리메틸트리데카-3,7,11-트리에닐)-크로만-6-올
바람직한 토코트리에놀로는, d-γ-토코트리에놀 및 2-데스메틸토코트리에놀이 있다. 다른 바람직한 토코트리에놀로는, d-β-토코트리에놀, d-δ-토코트리에놀 및 d-토코트리에놀이 있다.
"이오논"은 한 부류의 하기의 군을 의미한다 : 이오논은 자연적으로 광범위하게 분포된 카로테노이드 관련 화합물이다. α-이오논 및 β-이오논 및 많은 산소 첨가 유도체가 자유 형태 및 콘쥬게이트 형태로 식물 중에 광범위하게 존재한다. 생물학적 활성은 피토알렉신으로서의 역할로 제한되는 것으로 보인다. 이오논은 또한 카로텐의 열적 및 광화학적 중개 산화에 의해 생성된다.
바람직한 이오논으로는, β-이오논 (4-2,6,6-트리메틸-1-시클로헥센-1-일)-3-부텐-2-온; 6-10-디메틸-운데크-3,5-엔-2,9-디온; 6,10-디메틸-9,10-에폭시-운데크-3,5-엔-2-온; 9,10-디아세톡시-6,10-디메틸-운데크-3,5-엔-2-온이 있다. 다른 바람직한 이오논으로는 α-이오논 (4-(2,6,6-트리메틸-2-시클로헥센-1-일)-3-부텐-2-온이 있다.
"스타틴"은 한 부류의 하기의 군을 의미한다 : 스타틴은 피티움 울티뭄(Pythium ultimum), 모나쿠스 고무(Monacus ruber), 페니실리움 시트리눔 (Penicillium citrinum), 페니실리움 브레비콤팍툼(Penicillium brevicompactum) 및 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터 단리된 균류 대사물의 유도체(ML-236B/콤팍틴/모노칼린 K)이다. 3-히드록시-3-메틸글루타르산(HMG)의 이들 유사체가 HMG-CoA 환원효소 상의 기질 결합 부위에 대해 HMG-CoA와 경쟁한다. 스타틴은 미국에서의 법규에 의해 입수할 수 있으며, 그 예로는 로바스타틴(Mevacor/Merck), 심바스타틴(Zocor/Merck), 프라바스타틴(Pravachol/ Bristol-Meyers Squibb) 및 플루바스타틴(Lescol/Sandoz)이 있다. 임상 연구하에서, 워너-람버트(Warner-Lambert)에서의 말기 실험에서의 한가지를 포함하는 수가지 더 있다. 더욱 친유성인 스타틴은 일부 골격근 질환(근육염, 횡문근변성)과 관련되지만, 임상 실험에서 보고된 부작용 중 대부분(두통, 비정상 동통, 변비, 고장 및 설사)은 원만하고 허용될 수 있다 [참조 : Pedersen, T.R., N. Engl. J. Med. 333:1350-1351, 1995; Kobashigawa, J.A., et al., N. Engl. J. Med. 333:621-627, 1995.]. 하기의 리스트는 일부 바람직한 스타틴을 기재한 것이다.
균류 유도체로바스타틴프라바스타틴심바스타틴 상표명MevacorPravacholZocor 용량 (mg/d)10-8010-405-40 규정 용량 (mg/ml)20-4020-405-10
합성 화합물플루바스타틴 Lescol 20-80 20-40
하기의 리스트는 바람직한 스타틴의 화학식을 기재한 것이다.
로바스타틴 :[1S(1a(R),3α,7β,8β(2S,4S),8aβ)]-1,2,3,7,8,8a-헥사히드로-3,7-디메틸-8-[2-(테트라히드로-4-히드록시-6-옥소-2H-피란-2-일)에틸]-1-나프탈렌일-2-메틸부타노에이트
프라바스타틴 나트륨 :1-나프탈렌-헵타노산,, 1,2,6,7,8a-헥사히드로-β,δ,6-트리히드록시-2-메틸-8-(2-메틸 -1-옥시부톡시)-1-, 모노나트륨염 [1S-(1α(βs,δS),2α,6α,8β(R),8aα
심바스타틴 :부타노산, 2,2-디메틸-, 1,2,3,7,8,8a-헥사히드로-3,7-디메틸-8-[2-(테트라히드로-4-히드록시-6-옥소-2H-피란-2-일)에틸]-1-나프탈렌일 에스테르 [1S-(1α,3α,7β,8β.(2S,4S),-8aβ
나트륨 플루바스타틴 :[R,S-(E)]-(±)-7-[3-(4-플루오로페닐)-1-(1-메틸에틸)-1H-인돌-2-일]-3,5-디히드록시-6-헵타노산, 모노나트륨염
바람직한 스타틴으로는, 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴 및 플루바스타틴이 있다.
하기의 실시예는 B16 흑색종 세포를 토코트리에놀, 로바스타틴 및 이오논의 배합물로 처리하였을 때의 상승 효과를 설명하는 것이다.
하기의 하나의 실시예에서는, B16 흑색종 세포의 68% 감소(48시간 후에 측정함)가 얻어진다. 이는 개별적 효과의 첨가제 전체보다 9%의 상승 효과를 나타내는 것이다. 흑색종 함유 마우스의 이식후 생존율을 측정하는 생체내 시험에서, 배합물 처리에 대한 이소프레노이드 3가지 비교에 대한 P 값은 0.66 내지 0.16 범위 내에 있는 반면, 이소프레노이드 처리에 대한 이소프레노이드의 3가지 비교에 대한 P 값은 0.88보다 크다. 본 발명자들은 첫번째로, 모든 처리가 생존 기간을 증가시킴을 알았다 (P〈0.03). 단일 처리 효과의 차이는 현저하지 않다. 비-파라메트릭 시험 P 값은 0.64 내지 0.95 범위 내에 있다. 단일 처리와 배합물 효과 사이의 차이의 유의성을 시험하였을 때, 비-파라메트릭 P 값은 0.16 내지 0.64이었다. 더 낮은 P 값을 향하는 경향은 가능한 상승 작용을 시사하는 것이다.
"상승"은 개별적 효과의 첨가제 전체보다 추가의 5% 이상의 세포수의 감소율(%) 또는 개별적 효과의 첨가제 전체보다 5% 의 숙주 생존율의 증가를 의미한다.
본 발명을 이루기 위해, 본 발명자들은 생체외에서의 많은 다양한 이소프레노이드의 종양 억제 가능성, 및 생체내에서의 d-γ-토코트리에놀 및 β-이오논의 가능성을 평가하였다. 본 발명자들은 공통적인 전구물질인 이소펜텐일 피로포스페이트를 공유하는 것과는 상이한 작은 공통성을 갖는 이소프레노이드가 흑색종 세포 증식을 억제하고, 이성분 혼합물 중에서 시험된 개별적 이소프레노이드의 효과가 더해짐을 발견하였다. 본 발명자들은 d-γ-토코트리에놀의 식이 관련 흡수가 이식된 종양의 성장을 억제함을 추가로 보고하였다.
하기의 실시예에 기술된 연구는 48시간 인큐베이션 동안 쥐과동물 B 16(F10) 흑색종 세포의 개체군의 증가를 50% 까지 감소시키기 위해 필요한 구조적으로 다양한 이소프레노이드의 농도(IC50값)를 평가하였다. 단계 I 실험에서 d-리모넨 및 페릴릴 알코올, 모노테프펜에 대한 IC50값은 각각 450 및 250μmol/L이며; 관련된 고리형 모노테르펜(페릴알데히드, 카르바크롤, 티몰), 비고리형 모노테르펜(게라니올) 및 β-카로텐의 말단 고리 유사체(β-이오논)은 120 내지 150μmol/L의 IC50값을 갖는다. 토코트리에놀의 측쇄 유사체인 파르네졸에 대해 평가된 IC50값 (50μmol/L)은 α-토코트리에놀의 IC50값(110μmol/L)과 γ-토코트리에놀 (20μmol/L) 및 δ-토코트리에놀(10μmol/L)에 대해 평가된 값 사이의 중간에 있다. 토콜 고리 상에서 메틸기가 결여된 신규한 토코트리에놀이 매우 효능이 있는 것으로 입증되었다 (IC50, 0.9μmol/L). 2가지 식이 연구 중 첫번째에서, 실험 식이물을 활동적으로 성장하고 고도로 대사성인 B16(F10) 흑색종의 이식 전 10일 동안 및 이식 후 26일 동안 이유 C57BL 마우스 암컷에 공급하였다. AIN-76A 식이물에서 dl-α-토코페롤을 d-γ-토코트리에놀로 이소몰량(116μmol/kg 식이물) 및 비타민 E-당량(928μmol/kg 식이물)로 치환시켰을 때, 종양 성장에서 각각 36% 및 50%의 억제가 발생하였다 (P〈0.05). 두번째 연구에서, 2mmol/kg d-γ-토코트리에놀 및 β-이오논으로 개별적으로 그리고 배합하여 제형화시킨 실험적 식이물을 마우스에 공급하기 전에, 흑색종을 확립하였다. 4번째 식이물은 숙주 생존 기간을 증가시켰다 (P〈0.03). 본 발명은 일부 개별적 이소프레노이드의 효과가 추가적이며, 다른 개별적 이소프레노이드의 효과가 상승적이라는 발견을 기초로 한다. 이러한 발견은 이소프레노이드의 특정 배합물이 화학치료 분야에 매우 적합함을 시사하는 것이다.
본 발명의 방법은 수가지 구체예에서 실현될 수 있다. 한 구체예에서, 사람 또는 동물 피검체에 안전하고 효과적인 용량을 함유하는 약제 또는 수의 조성물로 이소프레노이드 배합물을 투여하였다. 또 다른 구체예에서는, 피검체에 이소프레노이드 배합물이 풍부한 음식물을 공급하였다. 스타틴은 법규에 의해서만 입수할 수 있으며, 음식물에 첨가하는 것은 바람직하지 않다.
본 발명에 사용하기 위한 사람 및 동물 음식물 및 약제 제조물은 동물 사료, 사람 음식 보충물 및 승인된 약제학적 희석제 및 부형제와 추가로 배합된 선택된 이소프레노이드 배합물을 함유하는 것들이다.
고활성 토코트리에놀로는 d-γ-토코트리에놀, d-δ-토코트리에놀 및 2-데스메틸토코트리에놀이 있으며, 이들은 모두 천연 생성물이다. d-γ-토코트리에놀 및 d-δ-토코트리에놀은 공개된 방법에 의해 쌀겨 기름 또는 야자 기름의 토코트리에놀 부화 분획으로부터 추출할 수 있다. 2-데스메틸토코트리에놀은 공개된 방법에 의해 쌀겨 기름의 토코트리에놀 부화 분획으로부터 추출할 수 있다.
β-이오논은 다양한 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, β-이오논은 카탈로그 번호 W25950-0, 알드리치 플래버즈 앤드 프라그런시즈 (Aldrich Flavors and Fragrances)에서 발견할 수 있으며; β-이오논은 또한 알드리치 파인 케미컬 앤드 시그마 카탈로그(Aldrich Fine Chemical and Sigma catalogs)에 기재되어 있다. 다른 이오논은 상기 카탈로그 및 베도우키안 리서치 디스팅티브 퍼퓸 앤드 플래버 인그레디언츠(Bedoukian Research Distinctive Perfume ＆ Flavor Ingredients)에 기재되어 있다.
로바스타틴은 상업적으로 가장 용이하게 입수할 수 있다.
이소프레노이드 배합물은 피검체의 음식물에 첨가되는 것 이외에, 장피복정, 캡슐, 분말, 용액 또는 에멀션과 같은 약제 또는 수의 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 투여되는 정확한 양은 사용되는 이소프레노이드, 투여 경로, 피검체의 체중 및 질환 상태에 따라 달라질 것이다. 본 발명자들은 하기의 실시예에 사용되는 흑색종 세포주가 화학치료 방법에 매우 저항성인 것으로 공지되어 있음을 유의하였다. 따라서, 환자 치료에 사용되는 정확한 투여량은 본 발명자들의 실험 모델로부터 제안된 것보다 낮을 수 있다.
일반적으로, 약제학적 배합물에 필요한 제제의 양은 제제를 개별적으로 투여하는 경우에 필요한 양보다 현저히 낮은 매일 흡수를 제공할 것이다. 항종양제 치료제로서 효능에 대한 임상적 평가에서 페릴릴 알코올, 이소프레노이드는 8g/일을 초과하는 수준으로 투여되며; 로바스타틴은 약 2g/d의 용량(과콜레스테롤 혈증에 대해 투여되는 용량의 20 배보다 많음)에서 뇌종양을 치료하는 데에는 임상적으로 효과적이지만, 저항성이 불량하다. 토코트리에놀은 300mg/일 미만의 용량으로 투여될 때에 콜레스테로 수준을 효과적으로 저하시킨다. 제제의 상승 작용으로 인해, 본 발명자들은 바람직한 배합물이 하루에 250mg 토코트리에놀/2000mg 이오논/ 150mg 스타틴(약 2mg/kg 체중)을 함유할 것으로 예상하였다. 바람직한 최대 용량은 하루에 500mg 토코트리에놀/4000mg 이오논/3000mg 스타틴을 함유할 것이다.
대표적인 약제학적 장피복정은 하기의 처방을 갖는다 :
활성 성분 :
d-γ-토코트리에놀 50mg
6,10-디메틸-9,0-에폭시-운데크-3,5-엔-2-온 400mg
스타틴 30mg
부형제/충전제
미소결정 셀룰로오스
나트륨 전분 글리콜레이트
옥수수 전분
수소화된 식물유 왁스
마그네슘 스테아레이트
탈크
디엠(diem) 용량에 대한 바람직한 규정 용량은 정제 5개이다.
활성 성분, 즉 d-γ-토코트리에놀 150mg 및 6,10-디메틸-9,0-에폭시-운데크-3,5-엔-2-온 400mg을 함유하는 소량의 액체로 먼저 제조되고 나중에 투여되는 임의의 바람직한 형태는 바아 또는 쿠키일 수 있다.
적합한 향미제가 바아 또는 쿠기 중에 존재하여 허용될 수 있는 수준의 기호성을 부과하는 것이 바람직하다. 활성 성분이 임의의 베이킹 또는 가열 과정이 발생하고 냉각이 완결된 후에 첨가되는 것이 필수적이며, 그 이유는 토코트리에놀이 열 불안정성이기 때문이다. 이러한 바아 또는 쿠키는 기밀적으로 밀봉된 패킷 중에 포장되는 것이 유리할 수 있다.
토코트리에놀 및 이오논은 비교적 비독성이기 때문에, 상기 규정된 높은 수치보다 더 높은 용량이 필요에 따라, 장피복 조성물로 투여될 수 있다. 그러나, 더 높은 용량은 소화관 세균을 현저히 감소시킬 수 있다. 본 발명의 조성물이 투여되었을 때, 비타민 E의 매일 흡수는 제한되는 것으로 추천되었다. 더욱 친유성(지방 친화성)인 스타틴은 일부 골격근 질환(근육염, 횡문근변성)과 관련되지만, 임상 실험에서 보고된 부작용 중 대부분(두통, 비정상 동통, 변비, 고장 및 설사)은 원만하고 허용될 수 있다. 저항성이 있는 환자[Thibault, et al., Clinical Cancer Research 2:483-491, 1996]의 흡수량은 2g/d(25mg/kg 체중)에 이른다.
많은 변형 및 변경이 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음은 당업자들에게는 자명해질 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부하는 청구의범위에 의해서 제한될 뿐이다.
실시예
사용되는 약어 : HMG CoA, 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A; IC50, 흑색종 세포의 개체군의 증가를 50% 까지 증가시키는 데에 필요한 농도; TRF, 야자 기름의 토코트리에놀 부화 분획; TRF25, 쌀겨 기름의 오리자놀 비함유 토코트리에놀 부화 분획.
A. 재료 및 방법
이소프레노이드 : d-리모넨(97%), 페릴릴 알코올(99%), 페릴릴알데히드 (92%), 카르바크롤(98%), 티몰(98%), β-이오논(96%), 게라니올(98%), 파르네졸(96%) 및 dl-α-토코페롤(97%)를 위스콘신, 밀워키에 소재하는 알드리치 케미컬로부터 입수하였다. 이들 이소프레노이드의 농축된 천연 공급원 및 방향 특징의 요약된 리스트를 하기의 표 1에 기재하였다. 예비 연구로, 분자 증류에 의해 제조되는 쌀겨 오일의 오리자놀 비함유 토코트리에놀 부화 분획(TRF25)의 매우 효능있는 종양 억제 작용을 확인하였다 [참조 : Dr. Laxman Singh, Viyamins, Inc., Chicago, IL]. 분획은 6% d-α-토코페롤, 12.5% d-α-토코트리에놀, 21% d-γ-토코트리에놀, 10% d-δ-토코트리에놀, 4.5% d-토코트리에놀, 17% d-2-데스메틸 토코트리에놀, 18% 비확인 토코트리에놀 이성질체 및 10% 스테롤 및 트리글리세라이드로 구성된다 [참조 : Qureshi, et al., 비공개 데이터]. 주요 성분인 d-α-토코트리에놀, d-γ-토코트리에놀, d-δ-토코트리에놀 및 17% d-2-데스메틸 토코트리에놀을 위스콘신 매디슨에 소재하는 어드번스드 메디칼 리서치(Advanced Medical Research)에 의해 단리시켰다. 말레이지아, 쿠알라룸프르에 소재하는 파암 오일 리서치 인스티튜트 오브 말레이지아(Palm Oil Research Institute of Malaysia)에서 제공하는 야자 기름의 토코트리에놀 부화 분획(TRF)(36% d-γ-토코트리에놀, 18% d-α-토코트리에놀, 12% d-δ-토코트리에놀 및 22% d-α-토코페롤)로부터 d-γ-토코트리에놀을 분리시키기 위한 클로마토그래피 방법을 개발하였다. 헥산 중에 현탁된 실리카 겔(머크(Merck), 60μ, 150g)을 맞춰진 디스크를 갖는 350mL 유리 깔대기 내로 부었다. 겔을 20mL 헥산 중의 TRF 5g을 충전시키기 전에 1L의 헥산으로 세척하였다. 토콜을 헥산 중의 디에틸 에테르의 500mL 혼합물(5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 25% 및 30%)의 순차적 적용으로 용리시켰다. 필터 플라스크 내로의 용매의 적용 각각의 용리를 물의 흡출로에 의해 형성된 진공의 적용에 의해 가속시켰다. 용리물을 진공하에 건조시키고, 잔류물을 헥산 중에 재용해시키고, 분석용 HPLC 시스템을 사용하여 체류 시간 및 흡수 프로파일에 따라 확인하였다. 18% 디에틸 에테르로 용리시킨 분획은 우세하게는 (98%) d-γ-토코트리에놀이다.
IC50 측정 : 윌리엄 비. 에르쉴러 박사(Dr. William B. Ershlier)로부터 입수한 대사성 효능이 높은 종양 세포주인 쥐과동물 B16(F10)[Tsukamoto, et al., 1999]을 10% 신생 송아지 혈청[뉴욕 그랜드아일랜드에 소재하는 GIBCOBRL] 및 80mg/L 젠타마이신[미주리 세인트루이스에 소재하는 시그마]로 보충한 3mL RMP1 1640 배지(시그마) 중의 단층 배양액 중에서 성장시켰다. 1-1.5x105개 세포를 뿌린 배양액을 5% CO2의 습식 분위기하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 무수 에탄올 중에 용해시킨 이소프레노이드를 24시간째(0회)에 첨가하였으며; 모든 배양액은 5mL 에탄올/L(85μmol/L)를 함유하였다. 배양액을 추가로 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 제거하고, 단층을 행크스 균형 염 용액(시그마)로 2회 세척한 후, 2분 동안 37℃에서 트립신-EDTA 용액(시그마)으로 인큐베이션시켰다. 트립신을 세포를 10% 태아 소 혈청(시그마)을 함유하는 배지 중에 현탁시킴으로써 비활성화시켰다. 세포를 250xg로 펠릿화시키고, 행크스 균형 염 용액 중에 재현탁시켰다. 0.4% 트립판 블루(GIBCOBRL)을 제외시킨 세포인 생존 세포를 혈구계를 사용하여 계수하고; 24시간 세포수를 최종 세포수로부터 빼어 세포수의 순수한 증가의 평가를 제공하였다. 48시간 세포수의 순수한 증가를 50% 까지 억제하는 데에 필요한 이소프레노이드의 농도(IC50)의 계산은 3회 이상의 평가로부터의 데이터의 플롯에 기초한다.
동물 연구 : 다양한 이소프레노이드의 종양 억제 효능의 평가를 2가지 식이 연구로 확대하였다. 첫번째로, 숙주 마우스에서의 B16(F10) 흑색종의 성장에 대한 d-γ-토코트리에놀의 식이 관련 흡수의 영향을 시험하였다. 두번째 연구로, 흑색종 함유 마우스의 이식후 생존율에 대한 d-γ-토코트리에놀과 β-이오논의 약리학적 흡수의 영향을 평가하였다. 본 발명자들은 먼저, 기본 식이 혼합물을 준비하고, 옥수수 오일 및 dl-α-토코트리에놀을 함유하지 않는 AIN-76A 제형화[아메리칸 인스티튜트 오브 누트리션(American Institute of Nutrition), 1977] 후에 패턴화시켰다. 이들 성분 및 비타민 E 스트립핑 옥수수 오일을 위스콘신 매디슨에 소재하는 테클래드 테스트 다이어츠(Teklad Test Diets)로부터 구입하였다. dl-α-토코트리에놀(80μmol/g) 및 d-γ-토코트리에놀(80μmol/g)의 원액을 비타민 E 스트립핑 옥수수 오일로 제조하였다. 비타민 E 스트립핑 옥수수 오일로 희석시킨 토콜의 원액을 기본 식이물과 혼합시켜서 5% 옥수수 오일 및 특정 토콜 농축물을 함유하는 최종 식이물을 제공하였다. 특별한 경우, β-이오논을 오일에 첨가하였다. 약하게 혼합된 식이물을 냉장하에 저장하였다. 음식물 컵을 매일 세척하고 재충전시켰다.
실험 1 : 이유 C57BL 마우스 암컷[위스콘신 매디슨에 소재하는 하알렌-스프라그 돌리(Harlan-Sprague Dawley)]를 4마리의 군으로 플라스틱 우리 내의 목재 톱밥 상에 넣었다. 마우스의 4개의 군(20/군)에 B16 흑색종 세포의 이식 전 10일 동안 그리고 이식 후 28일 동안 실험 식이물을 공급하였다. 스플릿 플롯 디자인을 각각 2가지 수준, 즉 116 및 924μmol/kg 식이물로 제공된 2가지 토콜, 즉 dl-α-토코트리에놀 및 d-γ-토코트리에놀로 구성된 4가지 치료로 구성하였다. 상기 디자인은 토콜 함량이 동일한 식이물의 2가지 비교, 및 d-α-토코페롤 당량이 거의 동일한 식이물의 1가지 비교를 제공하였다. d-γ-토코트리에놀의 생물학적 활성의 결정적 평가의 결여에 대해, 본 발명자들은 d-α-토코페롤이 최소로 d-γ-토코트리에놀의 생물학적 활성의 6배를 갖는다는 대략적 평가를 개발하는 데에 있어서, 2, 5, 8 (d-β-) 및 2, 7, 8 (d-γ-) 트리메틸 토코페롤이 유사한 산소 스캐빈징 활성(최대로, 2, 5, 7, 8 (d-α-) 테트라메틸 토코페롤의 활성의 66%)을 갖고, 한 부류로서, 토코트리에놀이 토코페롤의 생물학적 활성(Karnal-Eldin and Appelqvist)의 5-30%를 갖는다는 것을 보고하는 것을 고려하였다. 본 발명자들은 실험 식이물을 제형화시키는 데에 사용되는 8:1 토코트리에놀/토코페롤 비에 도달하는 데에 있어서 dl-α-토코페롤 혼합물의 생물학적 활성(d-α-토코페롤의 활성의 70%)을 보정하였다. 이미 기술된 바와 같이 배양하고 수득한 흑색종 세포(Shoff, et al., 1991)를 10% 태아 보 혈청(GIBCOBRL)을 함유하는 RPMI 1640으로 2회 세척하였다. 펩릿화된 세포를 RPMI 1640 중에 현탁시키고, 0.4% 트립판 블루 중에서의 1:20 희석 후에 계수하였다 (98% 생존율). 세포를 RPMI 1640(1x108개 세포/l) 중에서 추가로 희석시키고, 1ml의 현탁액(1x104개 세포)을 각각의 마우스의 측복부 내에 피하 주사하였다. 연구를 대조군의 마우스 중 첫번째 마우스가 죽었을 때인 28일 째에 종결시켰다. 마우스를 CO2과투여로 죽이고, 종양을 절제하고 중량을 측정하였다. 프로토콜을 콜리지 오브 애그리컬쳐럴 앤드 라이프 사이언시즈 애니멀 케어 코미티(College of Agricultural and Life Sciences Animal Care Committee)에 의해 검토하고 승인하였다.
실험 2 : 이유 C57BL 마웃 암컷(n=60, 하알렌 스프라그-돌리)를 상기 기술한 바와 같이 우리에 넣고 AIN-76A 식이물(116μmol의 dl-α-토코페롤/kg 식이물)을 공급하여 순응시켰다. 종양을 이식하고, 마우스에 AIN-76A 식이물을 계속 공급하였다. 이식후 8일째에 시작하여, 마우스를 종양의 존재에 대해 매일 만져보았다. 종양을 먼저 14일째에 검출하였다. 식이물에 대해 5개의 순차적 서브세트로 각각의 마우스를 분할하기 위한 불규칙한 수가 발생하였다. 실험적 처리로, 2 및 4 mmol d-γ-토코트리에놀/kg 식이물을 제공하였다. 본 발명자들은 추가로, 마우스의 생존율에 대한 β-이오논의 영향 및 2가지 이소프레노이드(각각 2mmol/kg 식이물)의 영향을 시험하였다. 마우스를 각각의 실험적 식이물에 대해 계속 시험하고; 실험 디자인에 대해 리서치 애니멀 리소오스(Research Animal Resource)에서 훈련시킨 눈이 먼 통제자에 의해 확인된 모리번드 마우스를 CO2과투여에 의해 죽이고, 종양을 절제하고 중량을 측정하였다. 콜리지 오브 애그리컬쳐럴 앤드 라이프 사이언시즈 애니멀 케어 코미티에 의해 검토하고 승인하였다.
통계적 방법 : StatView 및 SuperANOVA 소프트웨어(Abacus Concepts, Berkeley, CA)를 처리 중개 효과의 평가를 위해 사용하였다. 종양이 나타날 때까지의 일수 및 발병할 때까지의 일수에서의 체내 및 종양 중량의 처리 중개 차이를 최소 스퀘어 평균의 변동 및 쌍을 이룬 t-시험의 스프릿 플롯 분석에 의해 확인하였다. 발병할 때까지의 일수에 질병이 처리 중개 차이를 또한 파라메트릭 시험(쌍을 이룬 t-시험) 및 비파라메트릭 시험(윌콕슨 사인 랭크)을 사용하여 또한 평가하였다 (Haycock, et al., 1992).
B. 결과
도 1은 흑색종 B16 세포의 증식에 대한 5가지 상이한 토콜의 용량 의존성 영향의 대표적 평가를 나타낸다. 1-1.5x105개 세포를 뿌린 배양액(3mL)를 토콜의 도입 전에 24시간 동안 배양하였다. 생존 세포를 토콜의 첨가 48시간 후에 계수하엿다. 24시간 째의 세포 계수(0회)를 대시 라인에 의해 나타내었다. 수평 실선과 각각의 토콜에 대해 플롯팅된 라인의 교차점은 토콜이 인큐베이션 동안 세포수를 50% 까지 감소시키는 농도(IC50값)를 나타낸다. 시험된 모든 이소프레노이드에 대한 IC50값(평균, SD 및 n)을 표 1에 기재하였다. 도 1과 관련하여, dl-α-토코페롤은 세포수에 영향을 미치지 않았다. 개별적 토코트리에놀의 성장 억제 효능은 6-크로마놀 고리 상의 메틸기의 수의 역수이다 : d-α-토코트리에놀 (탄소 5, 7, 8 및 2에서 메틸기 함유) 〈〈 d-γ-토코트리에놀 (탄소 7, 8 및 2에서 메틸기 함유) 〈 d-δ-토코트리에놀 (탄소 8 및 2에서 메틸기 함유) 〈〈 d-2-데스메틸 토코트리에놀 (메틸기 비함유) (표 1)
상기 계열의 토코트링놀 내에서, IC50값은 6-크로마놀 고리 상의 메틸기의 수에 대해 역수이다. 유사하게, 더 극성인 모노테르페노이드 알코올, 페릴릴 알코올 ([R]-4-이소프로펜일-1-메탄올-시클로헥산), 페릴릴알데히드 ([R]-4-이소프로펜일-1-카르복스알데히드 시클로헥센), 티몰 (5-메틸-2-이소프로필페놀), 카르바크롤 (5-이소프로필-2-메틸페놀) 및 게라니올 (트랜스 3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올)에 대한 플롯으로부터 계산된 IC50값은 d-리모넨 ([R]-4-이소프로펜일-1-메틸-1-시클로헥센)에 대한 값보다 훨씬 더 낮다. β-카로텐의 말단 고리 유사체인 β-이오논에 대한 IC50값은 더욱 극성인 모노테르펜의 값과 매치된다 (표 1). 파르네졸 (트랜스, 트랜스 3,7,11-트리메틸-2,6,10 도데카트리엔-1-올), 세스퀴테르펜, 및 토코트리에놀의 측쇄에 대한 구조적 유사체에 대한 IC50값은 d-α-토코트리에놀과 d-γ- 및 d-δ-토코트리에놀의 값 사이의 중간에 있다.
첫번째 식이 연구로, 고형 종양 및 이식된 B16 흑색종의 성장이 검출될 때까지의 일수에 대한 d-γ-토코트리에놀과 dl-α-토코페놀의 영향을 평가하였다. 상기 기재된 바와 같이, 디자인은 동일한 토콜 농도(116 및 928μmol/kg 식이물)를 제공하는 처리의 2가지 비교 및 약 80μmol의 d-α-토코페롤 당량(35mg/kg 식이물)을 제공하는 처리의 1가지 비교를 제공하였다. 종양 이식시에, 고토코페롤 식이물을 섭취한 마우스의 체중은 저토콜 식이물을 섭취한 마우스의 체중보다 현저히 더 가벼웠다 (표 2). 이식후 28일째에, 흑색종은 AIN-76A 식이물을 섭취한 마우스의 중량의 15%인 것으로 계산되었다. 2가지 토콜을 각각 2가지 수준으로 시험하였다. 변수의 스플릿 플롯 분석은 28일째 종양 중량에 대한 토콜(P〈0.001) 및 농도(P〈0.04)의 효과가 상당하고; 2가지 인자 사이의 상호작용(P〈0.77)의 징후가 없음을 보여주었다. 최소한의 평균 스퀘어 분석으로 γ-토코트리에놀의 종양 성장 억제 작용을 확인하였다 (표 2). 종양 성장의 나머지 측정값인, 이식후부터 종양 검출 까지의 일수는 토콜(P〈0.03), 농도(P〈0.01) 및 상호작용(P〈0.02)가 현저함을 보여주었다. 최소한의 평균 스퀘어 분석은 종양의 상기 측정값에 대한 928 μmol/kg 식이물을 제공하는 처리의 효과가 나머지 처리의 효과와는 현저히 상이함을 보여주었다.
본 발명자들은 배양액 중의 B16 흑색종 세포의 성장에 대한 이소프레노이드의 효과가 추가적이며, 일부 경우에, 상승적임을 측정하였다. 도 2A는 B16 흑색종 세포 개체군에 대한 γ-토코트리에놀 및 β-토코트리에놀의 추가적 효과를 예시하는 것이다. 값은 평균 ±SD, n=8이며; SEM=36(x104)으로 푸울링된다. 대조군에 대해 감소된 개체군을 보여주는 것으로 계산된 세포수를 표에 기재하였다.
도 2B는 B16 흑색종 세포 개체군에 대한 카르바크롤 및 β-이오논의 효과를 예시하는 것이다. 값은 ±SD, n=8이며; SEM=62(x104)으로 푸울링된다. 대조군에 대해 감소된 개체군을 보여주는 것으로 계산된 세포수를 표에 기재하였다.
슈퍼스크립트를 공유하지 않는a-h평균값(a〉b〉c〉d〉d〉e〉f〉g〉h)은 상이하다 (P〈0.001). 도 2와 관련하여, B16 흑색종 세포를 하나의 시험에서 β-이오논 및 d-γ-토코트리에놀과 인큐베이션시켰다. d-γ-토코트리에놀(7.5μmol/L) 및 β-이오논(50μmol/L)은 각각 48 세포수를 19 % 및 10% 까지 감소시켰다 (도 2A). 쌍을 이룬 이소프레노이드로 달성된 세포수의 34% 감소는 개별적 효과의 합에 의해 예측된 29% 감소를 초과한다 (도 2A). 더 높은 농도에서, d-γ-토코트리에놀 (15μmol/L) 및 β-이오논(100μmol/L)은 각각 48시간 세포수를 34% 및 16% 까지 감소시켰으며, 추가의 효과로서, 세포수의 68% 감소는 또한 개별적 효과의 합(59%)보다 더 크다 (도 2A).
상기 결과는 d-γ-토코트리에놀 및 β-이오논의 상승 효과를 나타내는 반면, 쌍을 이룬 β-이오논의 연구는 추가의 효과만을 나타내었다 (도 2B). 카르바크롤 (100μmol/L) 및 β-이오논(150μmol/L)은 각각 세포수를 35% 및 65% 까지 감소시켰으며; 추가의 효과로서, 세포수의 84% 감소는 개별적 효과의 합에 의해 예측되는 것보다 더 낮다 (도 2B). 이소프레노이드의 개별적 효과의 합에 의해 예측되는 세포수의 감소는 쌍을 이룬 이소프레노이드로 달성되는 것과 고도로 상관된다 (r=0.91, n=8, P〈0.01).
그 다음, 본 발명자들은 식이 d-γ-토코트리에놀 또는 β-이오논이 이식된 흑색종을 함유하는 마우스의 생존을 연장시키는 지를 연구하였다. 식이 처리는 고형 종양의 검출 후에 개시하였다. 본 발명자들은 또한, 이들 구조적으로 다양한 이소프레노이드가 생존율에 대해 추가의 효과를 갖는 지를 연구하였다. 실험군을실험적 식이물 중 하나에 대한 5마리의 마우스의 연속적 서브세트의 각각의 구성원의 불규칙한 분할에 의해 구성하였다. 종양이 검출될 때까지의 시간은 군들 사이에서 변동하지 않았다 (표 3). 처리는 중간 생존 기간을 42±4.5% 까지 증가시키고, 평균 생존 기간을 30%까지 증가시켰으며(P〈0.005); 실험군의 평균 생존 기간 사이의 차는 상당하지 않았다 (표 3). 도 3은 이식된 고형 B16 흑색종의 검출 후에 이소프레노이드 부화 식이물을 섭취한 숙주 마우스에 대한 생존 곡선이다. 평균 생존 기간은 표 4에 기재되어 있다. β-이오논 및 γ-토코트리에놀1처리는 2mmol의 이소프레노이드/kg 식이물을 제공하였고; 배합물은 2mmol의 각각의 이소프레노이드/kg 식이물을 제공하였으며; γ-토코트리에놀2는 4mmol의 γ-토코트리에놀 /kg 식이물을 제공하였다.
실험 설게에 따라, 5개의 서브세트 내에서의 각각의 동물을 시험을 위해 서브세트의 또 다른 구성원으로 쌍을 이루게 하였다. 정상 및 비정상 분포를 가정하여, 쌍을 이룬 비교를 위한 P-값을 표 4에 기재하였다. 모든 분석으로, 대조군과 처리군 평균 사이의 매우 현저한 차이를 확인하였으며; 처리군 평균 사이의 차이는 현저하지 않았다. 2가지 이소프레노이드의 최소한의 추가 효과를 나타내는 생체외 분석의 결과에 대한 추가의 신뢰성을 표 4에 기재하였다. 이소프레노이드 대 이소프레노이드 처리의 3가지 비교에 대한 P-값은 0.88보다 크며, 이소프레노이드 대 배합물 처리의 3가지 비교에 대한 P-값은 0.66 내지 0.16이다.
C. 논의
B16(F10) 흑색종은 약제의 효능을 생체외 및 생체내에서 평가하기 위한 엄격한 모델을 제공한다 [참조 : Gruber, et al., 1992; Kuwashima et al., 1990; Mac Neil, et al., 1992; Tsukamoto et a;., 1991; Shoff, et al., 1991]. 본 발명자들은 0.4μmol d-γ-토코트리에놀 또는 β-이오논/d의 흡수를 제공하는 식이물이 숙주 세포의 측복부에 이식된 B16 흑색종의 성장을 억제함을 보고하였다. 본 발명자들의 더욱 엄격한 시험에서, 7μmol d-γ-토코트리에놀 또는 β-이오논/d의 흡수를 제공하는 식이물이 생성된 B16 흑색종의 성장을 억제하였다. 생체외 시험은 이들 2가지 이소프레노이드의 추가 효과의 증거를 제공하였다 (도 2A, B). 7μmol d-γ-토코트리에놀/d의 흡수를 제공하는 식이물은 생존 기간을 35% 까지 증가시켰다. d-γ-토코트리에놀의 흡수를 14μmol로 배가시키면, 생존 기간이 더 증가하지 않는 반면(-0.21 d, P=0.95), 7μmol d-γ-토코트리에놀/d의 흡수에 β-이오논의 흡수를 더하면, 생존 기간이 증가하려는 경향이 있다 (+0.83 d, P=0.65, 표 3, 4). 이 연구로, 종양 억제 작용을 갖는 것으로 최근에 입증된 2가지 산화방지 영양물질에 대한 구조적 관계를 갖는 2가지 이소프레노이드인 β-이오논 및 d-γ-토코트리에놀에 대한 생성된 이식된 흑색종의 반응을 평가하였다 (Greenberg and Sporn, 1996). 2가지 이소프레노이드 모두 생존 기간을 상당히 증가시켰다 (표 4). 본 발명자들은 아스코르브산(733 μmol/d)의 대규모 흡수가 이식된 B16 흑색종의 성장을 억제한다는 발견을 유의하였다 (Meadows, et al., 1991). 본 발명자들의 연구는 d-α-토코페롤 당량의 8배 증가를 제공하는 식이물이 종양 성장에 대해 최소 영향을 미치는 반면, AIN-76A 식이물의 d-α-토코페롤 당량만을 제공하는 d-γ-토코트리에놀 식이물은 종양 성장의 매우 현저한 억제를 제공함을 입증하였다.
D. 로바스타틴, 토코트리에놀 및 이오논의 상승 작용
i. 배경
균류 항생제인 로바스타틴은 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG CoA) 환원효소 활성을 경쟁적으로 억제시킨다 (J.L. Goldstein and M.S. Brown, Nature 343:425-430, 1990). 순수한 이소프레노이드인 β-이오논(S.G. Yu, et al., J. Agric, Food Chem, 42:1493-1496, 1994) 및 관련된 제제는 이것의 활성의 억제를 통해 HMG CoA 환원효소 활성을 억제한다 (H. Mo. et al., Nutritional Oncology, D. Huber ＆ G. Blackburn, eds. Academic Press, NY, in press; C.E. Elson, et al., Amer. Asdsoc. Cancer Res., in press). 일군의 혼합된 이소프레노이드인 토코트리에놀은 효소의 단백질 분해를 자극함으로써 환원효소 활성을 억제한다 (C.E. Elson, supra, in press). 억제된 환원효소 작용의 결과로서, 로바스타틴 및 후기 유도체(J.L. Goldstein and M.S. Brown, supra, 1990; R.A. Parker, et al., J. Biol. Chem. 268:11230-11238, 1993), β-이오논 및 관련된 순수 이소프레노이드 (S.G. Yu, et al., supra, 1994; H. Mo, et al., supra, in press), 및 토코트리에놀(H. Mo, et al., supra, in press; R.A. Parker, et al., supra, 1993; A.A. Qureshi, et al., J. Biol. Chem. 261:10544-10550, 1986; A. A. Qureshi, et al., Proceedings of the 1996 PORIM International Palm Oil Conference, Kuala Lumpur, Malaysia, pp. 168-180, 1996)은 혈청 콜레스테롤 농도를 저하시킨다. 로바스타틴으로 처리된 세포는 HMG CoA 환원효소의 수배 증가를 나타내며, 이러한 증가는 억제제의 제거 후에 환원효소 활성의 증가를 유발시킨다 (J.L. Goldstein and M.S. Brown, supra, 1990). 환원효소 질량의 감소를 일으키는 세포 활성은 HMG CoA 환원효소 mRNA의 전사 및 처리 효율의 증가 및 효소의 단백질 분해의 감소를 포함한다. β-이오논(S.G. Yu, et al., supra, 1994) 및 토코트리에놀(R.A. Parker, et al., supra, 1993)은 로바스타틴 처리에 의해 작용되는 환원효소 활성(S.G. Yu, et al., supra, 1994) 및 질량(R.A. Parker, et al., supra, 1993)의 증가의 정도를 약화시킨다.
메발로네이트 경로 중간생성물은 세포 증식에서 필수적 역할을 하는 단백질의 이식후 개질에 필수적이다 (H. Mo, et al., supra, in press). 스타틴에 의해 제공되는 메발로네이트 합성의 경쟁적 억제는 배양된 세포의 증식(J.L. Goldstein and M.S. Brown, supra, 1990) 및 이식된 종양의 성장(W. Maltese, et al., J. Clin. Invest. 76:1748-1754, 1985; J.P. Jani, et al., Invasion Metastasis 13:314-324, 1993)을 억제한다. 80mg/d 이하의 로바스타틴을 섭취한 고콜레스테로 혈증 환자의 5년 후 상태는 암 발병율의 33% 감소를 나타내었다(14명이 관찰되고, 21명이 예측됨)(J.A. Tolbert, Arch. Intern. Med. 153-1079-1087, 1993). 단계 I 실험으로, 고형 종양을 갖는 88명의 환자(39명은 뇌종양에 걸리고, 24명은 호르몬 무관성 전립선암에 걸림)를 포함하여, 점점더 고용량으로 투여되는 로바스타틴(한달에 7일 동안의 3 내지 43주기)의 내성을 평가하였다. 용량 범위는 2 내지 45mg/kg이었다 (고콜레스테롤 혈증에 대한 최대 용량은 80mg/d임). 60명의 환자에게 총 128건의 독성 에피소드를 경험시켰으며; 중독의 발생 및 심도는 25mg/kg 용량 수준에 도달하였을 때 현저히 증가하였다. 근육 중독을 예방하고, 로바스타틴의 내성의 개선시키기 위해, 30mg/kg 용량 이상의 로바스타틴을 투여한 일단의 환자에게 우비퀴논을 투여하였다. 우비퀴논은 근골격 중독의 발생을 감소시키지 않았지만, 이것의 심도를 현저히 감소시켰다. 본 발명자들은 고도의 신경교종이 단계 II 실험에 대한 적합한 표적임을 결로지었고, 메발로네이트 합성의 지속된 억제에 도움을 주는 대안적 치료 계획이 연구되었음을 제시하였다 (A. Thibault, et al., Clin. Cancer Res. 2:483-491, 1996).
ii. 이오논, 토코트리에놀 및 로바스타틴은 종양 세포 성장을 억제하는 데에 상승적으로 작용한다.
β-이오논, γ-토코트리에놀 및 로바스타틴은 개별적으로 쥐과동물 흑색종 B16/F10 세포의 증식을 억제하는 것으로 공지되어 있다. β-이오논 및 γ-토코트리에놀에 대한 IC50값은 140μmol(L. He, et al., J. Nutr. 127:668-674, 1997) 및 20μmol/l(L. He, et al., supra)이다. 문헌[He, et a;., supra]에 개시된 프로토콜을 사용하여, 본 발명자들은 1.9±0.3μmol/l 로바스타틴과 인큐베이션시킨 B 세포가 대조군의 61.4±4.6% 비율로 성장함을 결정하였다. 이 값으로, 콜로니 형성 검정을 사용하여 결정된 값을 확인하였다 (J.P. Jani, et al., supra, 1993). 생체내 연구는 교호적 일수로 복강내 투여된 로바스타틴(50mg/kg)(J.L. Goldsrein and M.S. Brown, supra, 1990), β-이오논(2mmol/kg 식이물)(L. He, et al., supra, 1997) 및 γ-토코트리에놀(116-2000μmol/kg 식이물)이 개별적으로 이식된 쥐과동물 흑색종 B16F10 종양을 억제함을 보여주었다.
본 발명자들의 생체외 검정은 3가지 제제의 성장 억제 작용 사이의 상승 효과를 보고하였다. 각각의 배합물의 성장 억제 작용은 개별적 효과의 합에 의해 예측되는 것보다 더 크다 (표 5).
표 5는 본 발명자들의 생체외 검정의 결과를 기재한 것이다. 표 5는 로바스타틴, β-이오논 및 γ-토코트리에놀의 다양한 농도 및 각각의 처리의 성장 억제 능력을 기재한 것이다. 처리된 세포의 성장을 대조군 성장의 %로서 기록하였다. 표 5에서, 본 발명자들은 2μM 로바스타틴 및 150μM β-이오논이 각각 세포 성장을 50% 및 32%(대조군 성장의 50% 및 68%) 까지 감소시키고, 2가지 화합물의 결합 작용이 성장을 82%(50% + 32%) 까지 억제하거나 세포 성장을 대조군의 18%로 감소시킴을 보여주었다. 로바스타틴을 이소프렌(토코트리에놀 또는 이오논)과 결합시킨 일련의 시험에서, 본 발명자들은 세포수의 66% 감소(대조군의 13±5%)를 예측하였다. 그러나, 본 발명자들은 87% 감소(대조군의 13±4%)를 관찰하였다. 이소프레노이드의 배합물은 세포 성장의 50% 감소를 제공하였으며, 예측된 감소는 57(대조군의 50%가 예측되고, 대조군의 43%가 얻어짐)이었다.
로바스타틴, β-이오논 및 γ-토코트리에놀의 각각의 배합물에서, 배합물은 예측되는 추가의 값보다 세포 성장을 저하시켰다.
표 5와 관련하여, 본 발명자들은 2μM 로바스타틴, 5μM β-이오논 및 50μM γ-토코트리에놀을 제공하는 배합물에 의한 성장의 완전 억제를 예측하였다.
표 1
흑색종 세포의 개체군의 증가를 48시간 인큐베이션 동안 50% 까지 억제시키는 데에 필요한 선택된 이소프레노이드의 농도. 각각의 이소프레노이드의 대표적 공급원 및 방향 특성이 기재되어 있음.
이소프레노이드 클라스 nμmol/L IC50 대표적 공급원 방향
모노테르펜d-리모넨페릴릴 알코올게라니올페릴알데히드카르바크롤티몰 333333 450±43250±28150±19120±17120±15120±15 감귤류 껍질, 박하감귤류 껍질, 박하, 세이지, 라벤더감귤류 껍질, 나륵 풀, 로즈메리감귤류, 나륵 풀, 로즈메리백리향, 마요라나, 박하, 나도고수백리향, 오레가노, 탕헤르오렌지 레몬향라일락향과일향과일향박하향백리향
세스퀴테르펜파르네졸β-이오논 25 50140±23 장미, 노란양국, 라벤더, 라일락포도, 옥수수, 살구, 서양자두 라일락향나무향
토콜d-α-토코트리에놀d-γ-토코트리에놀d-δ-토코트리에놀d-2-데스메틸 토코트리에놀 4633 110±1520±310±30.9±0.2 보리, 벼, 귀리, 야자과 식물, 올리브유보리, 벼, 귀리, 야자과 식물, 올리브유보리, 벼, 귀리, 야자과 식물, 올리브유쌀겨 유질유질유질유질
dl-α-토코페롤 4 〉1600 콩, 옥수수, 밀, 보리, 벼, 귀리, 야자유 유질
1값은 평균 ± SD이다.
표 2
마우스의 측복부 내에 이식된 B16 흑색종의 검출 및 28-d 성장 까지의 일수에 대한 d-γ-토코트리에놀의 영향1
토콜 μmmol 체중 종양 간
식이물 10 d 38 d 검출 중량 중량
(g) (g) (d) (g) (g)
dl-α-토코페롤d-γ-토코트리에놀dl-α-토코페롤d-γ-토코트리에놀푸울링된 SEM 116116928928 17.33a17.02a17.02b17.02a b0.10 23.3022.4322.5322.560.19 19.55b19.88b19.75b22.90a0.35 3.59a2.31bc2.89ab1.78c0.17 1.18a1.12b1.06b1.03b0.02
a〉b a〉b a〉b〉c a〉b
a-c슈퍼스크립트를 공유하지 않는 평균갑은 상이하다 (P〈0.05).1값은 평균, n=20.2분명한 종양이 나타날 때까지의 이식후 일수.
표 3
생성된 흑색종을 함유하는 숙주 마우스의 생존 기간에 대한 이소프레노이드 부화 식이물의 영향1
군 d-γ토코트리에놀 β-이오논 일수 생존기기간(일)
mmol/kg 식이물 종양 평균 중간
대조군d-γ-토코트리에놀d-γ-토코트리에놀β-이오논배합물푸울링된 SEM 0 02 04 00 22 2 15.0014.9214.9214.9214.92 13.83b18.67a18.46a18.27a19.50a0.547a〉b 15.020.022.023.020.5
a-b슈퍼스크립트를 공유하지 않는 평균값은 상이하다 (P〈0.03).1값은 평균, n=12이다.
표 4
마우스의 측복부에서의 B16 흑색종의 검출 후의 생존기간에 대한 이소프레노이드 효과의 쌍을 이룬 비교
쌍을 이룬 t-시험 윌콕슨 사인 랭크
군 비교 t-값 P-값 Z-값 P-값
대조군 대d-γ-토코트리에놀1d-γ-토코트리에놀2β-이오논3배합물4 5.742.702.813.27 0.010.020.020.01 -2.93-2.22-2.18-2.45 0.010.030.030.01
d-γ-토코트리에놀1대d-γ-토코트리에놀2β-이오논3배합물4 0.460.060.46 0.660.950.66 -0.47-0.150.47 0.640.880.64
d-γ-토코트리에놀2대β-이오논3배합물4 0.111.36 0.920.21 -0.06-1.42 0.950.16
β-이오논3대배합물4 0.93 0.37 -0.83 0.41
12mmol d-γ-토코트리에놀/kg 식이물24mmol d-γ-토코트리에놀/kg 식이물32mmol β-이오논/kg 식이물42mmol d-γ-토코트리에놀 + 2mmol β-이오논/kg 식이물
표 5
로바스타틴 β-이오논 γ-토코트리에놀 성장율 예측값
μmmol 대조군의 %
202 150150 0 506810 18
20022 0 510510 6090853220 5045
1.53001.51.533 0 00102010201020 71537265201000 43362518
0 50100005010050100 007.5157.57.51515 9084816666645132 71655650
0 1500150 1515 32770 9

Claims (24)

  1. 종양을 종양 성장을 억제하는 데에 효과적인 양의 토코트리에놀, 스타틴 및 이오논으로 구성된 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하여, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조성물이 토코트리에놀 및 이오논을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 조성물이 토코트리에놀 및 스타틴을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조성물이 스타틴 및 이오논을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 조성물이 스타틴, 이오논 및 토코트리에놀을 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 토코트리에놀이 d-γ-토코트리에놀, 2-데스메틸토코트리에놀, d-δ-토코트리에놀 및 d-토코트리에놀로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 토코트리에놀이 d-γ-토코트리에놀인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 이오논이 β-이오논 및 α-이오논으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 이오논이 β-이오논인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 스타틴이 로바스타틴인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 노출 단계가 조성물을 음식물의 형태로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 노출 단계가 조성물을 약제의 형태로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  13. 환자를 종양 성장을 억제하는 데에 효과적인 양의 토코트리에놀, 스타틴 및 이오논으로 구성된 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하여, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  14. 종양 성장을 억제하는 데에 효과적인 양의 토코트리에놀, 스타틴 및 이오논으로 구성된 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 약제 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 1종 이상의 토코트리에놀 및 1종 이상의 이오논을 포함하는 약제 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 1종 이상의 토코트리에놀 및 1종 이상의 스타틴을 포함하는 약제 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 1종 이상의 스타틴 및 1종 이상의 토코트리에놀을 포함하는 약제 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 1종 이상의 스타틴, 1종 이상의 이오논 및 1종 이상의 토코트리에놀을 포함하는 약제 조성물.
  19. 제14항에 있어서, β-이오논 및 d-γ-토코트리에놀을 포함하는 약제 조성물.
  20. 제14항에 있어서, 조성물이 음식물의 일부인 약제 조성물.
  21. 제14항에 있어서, 토코페롤의 매일 흡수량이 250mg 내지 500mg인 약제 조성물.
  22. 제14항에 있어서, 이오논의 매일 흡수량이 2000mg 내지 4000mg인 약제 조성물.
  23. 제14항에 있어서, 스타틴의 매일 흡수량이 150mg 내지 300mg인 약제 조성물.
  24. 제18항에 있어서, 토코페롤의 매일 흡수량이 250mg 내지 500mg이고, 이오논의 매일 흡수량이 200mg 내지 400mg이고, 스타틴의 매일 흡수량이 150mg 내지 300mg인 약제 조성물.
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