KR20000070713A

KR20000070713A - 비정상적 상피세포의 박리를 측정하는 방법

Info

Publication number: KR20000070713A
Application number: KR1019997006963A
Authority: KR
Inventors: 다다마사히로
Original assignee: 파노스 테크놀로지즈 인코포레이티드
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 1997-02-04
Publication date: 2000-11-25
Also published as: EP0969878B1; IL130842A0; AU730646B2; KR100502440B1; DE69738808D1; ATE399568T1; EP0969878A1; AU1858297A; IL130842A; CA2280133A1; CA2280133C; HK1025050A1

Abstract

본 발명은 위장관 또는 결장의 분비선과 같은 항온 동물의 성숙한 상피세포의 비정상적인 세포 박리속도를 측정하기 위한 방법이다. 시아닌 염료와 같은 염료를 함유하는 라벨링 조성물을 상피세포에 적용한 후 그 부위를 시간에 따라 관찰한다. 비정상적인 세포의 박리속도는 악성 종양과 같은 질병 상태를 나타내는 지표이다.

Description

비정상적 상피세포의 박리를 측정하는 방법{Method for detecting abnormal epithelial cell shedding}

상피세포의 동력학적 변화는(세포의 증식, 이동, 분화, 노쇠 및 손실과 같은 것에 관련된 현상을 포함하는) 염증과 악성종양(상피세포의 악성종양)을 포함하는 다양한 질병 상태와 관련되어 있다는 것은 알려져 있는 바이다. 그러므로, 세포 동력학을 측정하기 위한 정확한 방법의 확립은 의약 및 그 관련 분야에서는 매우 중요한 것이다. 트리티에티드(tritiated) 티미딘(3H-thymidin)을 이용한 자기방사기록법이 개발되기 전에는, 일반적으로 세포 동력학은 세포 유사분열의 검사, 위장관의 분비선의 크기 측정(예를 들어 현미경에 의한 카운팅 또는 측정) 및 실험관내 방법으로(in vitro) 세포를 배양하여 세포 수를 단순히 카운팅하는 방법을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 측정되었다.

세포 동력학을 분석하기 위한 통상적인 방법은 DNA 합성과 관련된 마커를 증식하고 있는 세포에 사용하는 것이다. 증식하고 있는 세포는, DNA 합성 동안에 빠르게 세포 내의 DNA로 통합되는 3H-티미딘 또는 브로모데옥시유리딘(BrdU)와 같은 티미딘 유사물질로 라벨링될 수 있다. 그러나, 이 방법으로는 단지 DNA 합성속도를 측정할 수 있을 뿐, 체내에서의 세포 성장, 이식 또는 박리를 직접 측정할 수는 없다.

DNA 합성에 관련된 마커를 사용하여 측정하는 방법들은 상대적으로 쉽기 때문에, 비정상적인 동력학을 나타낼 것으로 의심되는 상피세포를 분석하기 위해서 일반적으로 선택되어 왔다. 이 방법들을 사용하는 것에는 확정된 시간 동안 증식세포를 3H-티미딘 및 BrdU 하에서 배양하는 것이 필요하다는 한계가 있다. 더더욱, 3H-티미딘 및 BrdU로 라벨링하는 것은 생체내 방법으로 인체에 대해서는 실시할 수 없다. 인간의 상피세포 샘플을 환자로부터 떼어내어 3H-티미딘 및 BrdU를 함유하는 배지에서 조직 배양해야 한다.

증식세포 핵 항원(PCNA) 및 티미딘키나제와 같은 특정 효소의 농도를 측정하는 것 역시 세포의 동력학을 측정하기 위해 사용되어 왔다. 이 방법들은 조직 배양이 필요없는 반면에, 세포의 이동 및 박리를 포함하는 세포 동력학을 분석하기 위한 생체내 측정방법으로는 이용할 수 없다.

시아닌 염료는 생물학 분야에서 다양하게 사용되어 왔다. 디옥사카보시아닌 염료는 증식 백혈구의 분화 수를 측정하는데 사용되어 왔다. 군터 발레트 및 막스 플랑크 게스 비센쉬에 의한 특허 출원 제 84-102307/17호는 선택적 염색 및 부피와 형광의 측정에 의한 혈액 세포의 동시 정량 분석에 관한 것이다. 이러한 연구에 있어서, 사용되는 시아닌 염료는 단쇄 카보시아닌 염료(탄소 수 10개 이하)이고, 막 전위의 변화에 상응한다. 단쇄 카보시아닌 염료는 세포의 미토콘드리아에 들어가 세포독성을 나타내고, 세포를 세척할 때 세포막 전위의 변화와 관계없이 세포로부터 쉽게 누출된다.

트리카보시아닌 염료(Fox, I.J., et al., Proc, May Clinic, 32: 478-484, 1957)와 에반스-블루 염료(Schad, H., et al., Pfluegers Arch. Eur. J. Physiol., 370(2): 139-144,1979)는 심박출량을 희석법에 의해 생체내 방법으로 측정하는데 이용되어 왔다. 문헌(Dow, P., Physol. Rev., 36: 77-102, 1956)에서 다우는 폐의 정맥 부분에 기지의 양의 지시약을 혈관 주사하고 장시간에 걸쳐 지시약의 동맥 내 농도를 측정하여 주사 부위와 샘플링 부위 사이의 부피를 측정하는 것을 포함하는 것과 같은 방법을 기재하고 있다. 그러나. 이 염료들은 세포를 염색하는데는 사용되지 않는다.

미국 특허 제 4,762,701호는 본 명세서에 전체로서 통합되어 지는데, 이 미국 특허는 생체내에서 시아닌 염료에 의해 라벨링된 세포를 추적하는 방법 및 시험 객체에 투여되는 시아닌 염료에 의해 라벨링된 세포의 소실속도를 측정하여 세포의 수명을 결정하는 방법에 관한 것이다.

미국 특허 제 4,783,401호는 본 명세서에 전체로서 통합되어 지는데, 이 미국 특허는 생존 가능한 세포를 시아닌 염료로 라벨링하여 많은 것들 중에서 특히 배양 세포들의 성장 속도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

미국 특허 제 4,859,584호는 본 명세서에 전체로서 통합되어 지는데, 이 미국 특허는 시험관내 및 생체내에서 시아닌 염료에 라벨링된 성장하는 세포의 성장속도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명보다 선행하는 기술에서는, 생체내에서 성숙한한 표면 상피세포의 박리속도를 측정하는 방법에 의하여 세포 동력학이 연구된 바는 없었다. 그러므로, 출판된 문헌에는, 예를 들어 위장관 또는 다른 점막 표면 상의 정상적인 또는 비정상적인 성숙한 상피세포의 박리속도에 관한 데이타가 거의 기재되어 있지 않다. 위에서의 세포 박리는 고정된 길이의 시간에 따라 걸쳐 위장 라인을 세척하고 세척 용액 내에 존재하는 세포 DNA를 측정하여 세포 손실량을 측정하는 방법에 의해 분석되어 왔다. 이 방법은, 시험 과정이 복잡하여 표준화하기 어렵고, 세척하는 동안에 수득되는 세포에 대해서는 DNA 분석이 부적절하고, 지정된 표적 부위 외의 다른 부위의 세포가 세척하는 동안에 우연히 수득될 수 있기 때문에 부정확한 것으로 판명되었다.

본 발명은 진단 방법으로서의 용도를 가지는, 비정상적 상피세포의 박리속도를 생체내 방법으로(in vivo) 측정하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 위장 점막 부분의 개략도이다.

도 2는 결장 점막 부분의 개략도이다.

발명의 요약

따라서, 본 발명의 목적은 생체내에서 비정상적 상피세포의 박리속도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 항온 동물의 표적 부위의 상피세포의 박리속도가 정상적인지 또는 비정상적인지를 생체내 방법으로 측정하여, 세포 박리속도가 비정상적인 세포가 성숙한 상피세포들 중에 존재하는 것이 특징인 질병을 생체내에서 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 위암 또는 결장암과 같은 악성종양, 및 상피세포의 박리속도가 비정상적인 것이 특징인 다른 질병을 진단하는 개량된 방법을 제공하는 것이다.

이들 목적 및 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 항온동물의 점막 표면 상피세포와 같은 성숙한 상피세포 중에서 비정상적인 세포 박리속도를 생체내에서 측정하는 방법에 있어서, 표적 부위에서 성숙한 표면 상피세포를 라벨링하는 단계 및 상기 라벨의 존재 또는 부존재 여부을 상기 표적 부위에서 모니터링하는 단계를 포함하는 측정방법을 제공한다. 본 방법의 바람직한 실시예에 있어서, 라벨링되는 세포는 점막 표면에 존재하는데, 위장관 점막 표면 중의 세포가 특히 바람직하다.

또한, 본 발명은, 성숙한 상피세포들 중에 세포 박리속도가 비정상적으로 존재하는 것이 특징인 질병을 진단하는데 있어서, 성숙한 상피세포를 라베링하는 단계, 상기 라벨링된 세포의 박리속도를 측정하는 단계 및 라벨링된 세포의 박리속도와 유사한 위치에 있는 건강한 상피세포의 기지의 박리속도를 비교하는 단계를 포함하는 진단방법을 제공한다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.

본 발명은 인간을 포함하는 항온동물의 성숙한 상피세포에서 비정상적인 세포 박리속도를 생체내에서 측정하는 개량된 방법을 제공한다. 표적 부위의 점막 표면과 같은 성숙한 표면 상피세포를 라벨링 조성물로 라벨링한다. 시아닌 염료, 결정 바올레이트 아세테이트, 호우치스다이(Hoechsdye) H33342, 에오신 및 플록신과 같은 다른 화학 염료, 및 항체-기초된 라벨(예를 들어, 항체에 공유결합적으로 링크된 형광체 분자, 방사성 동위원소 및 X레이가 투과되지 않는 화합물과 같이 검출가능한 성분)를 포함하는 다양한 라벨링 조성물이 생체내 방법으로 상피세포를 라벨링하기 위한 적합한 것으로 알려져 있다. 시아닌 염료 성분을 함유하는 라벨링 조성물을 사용하는 것이 바람직하다. 라벨링 조성물 중에 유일하게 검출가능한 성분으로 시아닌 염료 성분이 포함될 수 있다. 다른 방법으로는, 다른 화학 염료 또는 X레이가 투과되지 않는 화합물(즉, X레이 콘트라스트제)과 같은 다른 검출가능한 성분을 라벨링 조성물에 부가할 수 있다. 이 부가되는 검출가능한 성분은 시아닌 염료 성분과 화학적으로 결합되어 있거나, 시아닌 염료나 다른 라벨링 조성물에 단지 혼합되어 있을 수 있다.

본 발명에 따라서 라벨링되는 세포 집단은 배타적이 아니라 지배적으로 성숙한 상피세포로 구성되는 것이 바람직하다. 유사분열이 완성된 성숙한 상피세포는 증식 능력이 상실된 세포이다. 그러므로, 표적 부위에서 검출가능한 라벨이 손실되는 것은 세포 분열에 의한 라벨링된 세포의 희석에 기인하는 것이 아니라, 상피로부터 라벨링된 세포가 박리(손실)되는 것에 기인한다.

예정된 시간 동안의 검출가능한 라벨의 손실로서 표시되어지는 표적 부위로부터 라벨링된 세포가 박리되는 속도는 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 라벨링된 세포의 존재 또는 부존재의 여부를 측정하는 다른 방법(예를 들어 X레이 사용 또는 X레이 콘트라스트제 라벨과 함께 방사성 이미지 관찰)이 적용가능하더라도, 의사에 의한 표적 부위의 직접적인 육안 관찰 방법이 바람직하다.

본 명세서에서, "비정상적인 세포 박리속도"라는 용어는 정상 세포 박리속도보다 크거나(하이퍼-) 작은(하이포-) 속도를 의미한다. 본 발명은 성숙한 표면 상피세포의 박리속도를 생체내 방법으로 직접 측정하여 세포 동력학을 분석하고 질병을 진단한다는 점에서 독특하다.

조직의 기능과 형태의 완전성은 세포의 재생없이는 유지될 수 없다. 인간의 위장과 결장 점막은 세포의 손실(관강내부의 박리 및 세포의 사멸을 통해)과 재생이 빠르게 계속적으로 일어나는 조직의 예이다. 특정 세포 수가 유지되도록 세포의 재생이 일정하게 일어나는 기관 내의 건강한 조직에서는 세포의 생산과 손실의 속도가 거의 일치한다. 위장 점막에 있어서, 고정된 수명을 가진 위장 점막의 상피세포는 소와(pit)의 기저와 분비선의 인접 상부 부위에 위치한 증식 구역에서 생성된다. 이러한 세포들은 점막세포를 보충하기 위하여 분화와 성숙한의 과정을 통해 상피의 표면으로 올라가고, 또한 위장 분비선의 세포를 대체하기 위하여 하부로 이동한다. 위장의 상피세포는 연접 복합체(junction complex)를 형성하기 때문에, 세포간의 질서는 이동하는 동안에 변화되지 않는다. 결과적으로, 오랜된 상피세포가 먼저 관강(lumen)내로 박리된다. 세포 나이에 기초한 관강 내로의 이 계층적인 박리는 "파이프 라인 시스템"라는 용어로 언급되어 진다. 결장의 상피세포에 있어서, 증식 구역은 선와(crypt)의 하부 2/3 지점에 위치하고 있다. 이 세포들은 계층적인 박리인 "파이프 라인 시스템"을 보여주나, 위장의 상피세포와는 달리 상부로만 이동한다. 일반적으로 건강한 상피 조직 및 비정상적인 상피 조직 모두에 있어서 세포의 재생과 손실로 특징지워지는 이 과정은 본 명세서에서 "세포박리"라는 용어로 집중적으로 언급되어 진다.

본 발명자들은, 내장 기관의 점막 표면과 같은 표면 상의 성숙한 상피세포를 라벨링하였을 때, 세포가 점막 표면으로부터 박리되는 속도를 측정하면 세포 동력학을 분석할 수 있음을 발견하였다. 측정된 박리속도는 (1) 동일한 기관 상의 다른 부위의 성숙한 상피세포의 박리속도 및/또는 (2) 평가되고 있는 세포의 특정 형태와 위치의 표준 박리속도값과 비교될 수 있다. 그러므로, 세포 동력학을 측정하기 위해 전에 실시된 방법들과는 달리, 본 발명은 증식하고 있는 세포의 성장속도를 측정하는 것이 아니라 분화되고 성숙한 표면 상피세포의 박리속도를 측정한다. 이 성숙한 상피세포의 박리속도의 측정은 상피세포 집단의 간강상태의 진단 및/또는 모니터링에 유용한 정보를 의사에게 제공한다. 특히, 이 정보는 과대- 및 과소-증식 장애 및 위장과 대장의 악성종양을 포함하는 비정상적 세포 동력학이 특징인 질병의 진단 및 모니터링에 도움이 된다.

본 발명에 따른 표면 상피세포의 비정상적 박리속도를 측정하기 위하여, 바람직한 실시예에서 세포들을 시아닌 염료를 검출가능한 성분으로 하여 라벨링한다. 본 방법은 특정 표적 기관(들) 또는 특정 라벨링 조성물에 한정되지 않고, 체내의 상피 조직에 대한 세포 박리속도의 측정에 일반적으로 적용가능하다. 이러한 표면들에는 위장, 담도, 결장, 요도, 혈관, 비강을 포함하는 폐기도, 각막, 식도, 췌장관, 소장 및 질, 난관과 전립선을 포함하는 생성 기관의 표면이 포함된다. 위장(위장 점막)과 대장(결장 점막)의 상피조직은 특히 일반적인 악성종양 부위이고, 이 악성종양에 의해 세계인구의 많은 수가 죽음과 질병에 처하게 된다. 따라서, 본 발명은 이 두가지의 표적 부위에 관한 것을 상세하게 설명하고 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 세포 라벨은, 표적 상피 표면에 결합되어 있을 때, 라벨링 여부가 쉽게 확인가능한가 하는 관점에서 선택되어 진다. 라벨은 상피세포의 특성에 부정적인 변화없이 상피에 부착되어야 한다. 라벨은 충분히 긴 시간 동안 부착이 유지되어야 하고, 진단이 실시되는 시간 동안 자발적으로 퇴화되어서는 안된다.

본 발명의 방법에 있어서, 바람직한 라벨링 조성물은 다음의 화학식의 시아닌 염료를 함유한다:

[화학식]

상기 화학식에서 Y는 산소, 황, 메틸렌 또는 알킬 치환 메틸렌이고;

m은 0-3이고; 및 n은 12-22임.

본 명세서에서 사용되는 알킬 치환 메틸렌이란 용어는 메틸, 에틸 또는 프로필 치환기의 임의의 조합을 가진 모노 또는 디-치환 메틸렌을 의미한다. 상술한 구조의 화합물은 일반적으로 이해되는 간략한 화학식, 즉 DiYC_n(2m+1)으로 표시할 수 있다(Sims, P.J., et al., Biochem., 13;3315 (1974)). 그러므로, 예를 들어 Y가 황이고, 링을 연결하는 3개의 탄소가 벤젠링이 있고, 탄소원자 14개의 지방족 체인 두개를 가진 화합물은 DiSC₁₄(3)로 표시된다. 유사하게 DiIC₁₄(5)은 Y가 이소프로필이고, 링을 연결하는 5개의 탄소가 있고, 탄소원자 14개의 지방족 체인 두개를 가진 화합물을 의미한다.

시아닌 염료로서 본 명세서에서 언급되는 화합물에는 하나 이상의 치환기를 가진 상기 구조의 화합물이 포함되고, 이러한 치환 화합물은 라벨링을 하는데 필요한 만큼 세포 라벨링 배지에 용해되고, 세포막과 연결되어 잔류하도록 충분히 높은 세포막 분배 계수를 가진다. 또한, 이러한 화합물은 라벨링에 필요한 농도에서 세포의 생존능력에 바람직하지 않는 영향을 미쳐서는 안된다. 또한, 요오드 염이 아닌 다른 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 시아닌 염료의 다른 형태가 사용될 수 있다.

라벨링은 하기의 화학식의 시아닌 염료를 포함하는 조성물로 실시되는 것이 가장 바람직하다.

또는

"PKH2"(1-docosanyl-1'-propyloxacarbonocyanineiodide)인 화학식 1과 "PKH26"(1-docosanyl-1' tetradecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbandcyanine iodide)인 화학식 2의 염료는 시그마 바이오사이언스(Sigma BioScienences)로부터 상업적으로 입수가능하고, 파노스 테크날리지스사(Phanos Technologies, Inc)에 의해 제조된다. PKH2와 PKH26은 생체내 방법으로 세포막을 특이적이고, 선태적으로 염색하고, 세포의 특성에 바람직하지 않은 영향은 미치지 않는다. 상기 염료들은 그것들이 방출하는 형광에 의해 쉽게 확인된다. 또한 이 화합물들은 다른 진단 화합물 또는 치료 화합물이 부착될 수 있도록하는 친유성을 가진 결합제로서의 역할을 할 수 있다.

상술한 이로운 특징뿐만 아니라, PKH2와 PKH26은 비항원성이고, 세포독성이 없으며, 긴 반감기를 가졌고, 세포를 안정적이고 일정하게 염색할 수 있는 능력을 가졌다. 이 염료들은 단지 몇분 동안만 표면 상피세포에 도포시킴으로써 적정한 염색이 가능하다.

다른 시아닌 염료는 다양한 구입처에서 구입하거나 입수가능한 출발물질로부터 공지의 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 인터사이언스에서 출간한 문헌(Hamer, F.M., The Cyanine Dyes and Related Compound)을 참조하기 바란다. 인체에 생체내 방법으로 사용할 때에는, PKH2 또는 PKH26의 용액은 수용성 자당 용액에 염료의 유효량을 용해시켜서 제조할 수 있다. PKH2와 PKH26은 파노스 테크날리지스사에서 제조한 염료 키트 고체로 입수가능한데, 이 키트는 희석제 60㎖와 염료 덩어리 500㎕로 이루어져 있다. 그러므로, 이 키트 하나를 사용하여 염료 용액을 제조할 때에는 희석제에 대한 염료의 농도는 1:120이 될 것이다.

본 발명에 따른 용도를 위한 조성물에 있어서, PKH2 또는 PKH26의 농도는 이러한 염료로 시험관내 방법으로 세포를 염색할 경우에 적용되는 이미 알려진 농도와 유사하다. 투여되는 정확한 농도는 변화를 줄 수 있으며, 쉽게 최적화할 수 있다. 투여되는 염료 조성물의 양은 조성물 내의 시아닌 염료의 농도와 표적 부위의 크기에 따라 다양할 수 있다. 투여량은 예를 들어 1 내지 100㎖로 다양할 수 있고, 많은 경우에 투여량을 10㎖로 사용할 수 있다. 정확한 투여량은 변화를 줄 수 있으며, 쉽게 최적화할 수 있다.

라벨링 조성물은, 안정성하게 투여할 수 있고 세포라벨링을 재생가능하게 하는 배지(희석제)를 함유한 시아닌 염료를 포함한다. 전형적으로 시아닌 염료가 적어도 라벨링위하여 필요한 시간 동안에는 안정한 용액을 형성할 수 있게 하는 삼투압 조절제가 사용된다. 적용가능한 삼투압 조절제에는 포도당, 과당, 소르보오스, 자일로오스 및 리보오스와 같은 단당류 및 자당과 같은 다당류를 포함하는 슈가; 만니톨, 글리세롤, 이노시톨, 자일리톨 및 아도니톨을 포함하는 슈가-알코올; 글리신과 아르기닌를 포함하는 아미노산; 및 N-트리스(하이드록메틸)-메틸-3-아미노프로판술폰산과 같은 굿'스 완충제를 포함한다. 수소이온 농도(pH)를 조절하여 조절하게 하기 위하여 소량의 완충제도 라벨링 배지에 첨가될 수 있다. 항생제와 보존제같은 다른 통상적인 삼투압 조절제도 사용할 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 시험 대상의 준비는 내시경 검사를 위해 요구되는 통상적인 방법을 사용한다. 내시경 검사 전에 금식시키는 것과 같은 일반적 준비 방법을 할 수 있다.

PKH2와 PKH26같은 시아닌 염료의 상피 점막에의 부착력을 증진시키기 위해, 카켄 세이야쿠에서 제조한 단백분해효소(프로네이즈)를 이용하여 점액을 제거하는 단계를 실시할 수 있다. 이러한 점액 제거단계는 문헌(K. Ida et al., "Endoscopic Diagnosis of Gastric Cancer with Dye Scattering," Amer. J. Gastroenterology, Vol. 63, No. 4, pp. 316-320(April 1975))에 기재되어 있는데, 이 문헌은 본 명세서에 전체로서 포함된다. 간략하게 말해서, 검사 20분 전에 진경제를 투여하고, 다음으로 NaHCO₃1g과 단백분해효소(프로네이즈) 20,000 p.u.가 혼합된 디메틸폴리실록산(Gason) 10배 희석 용액 80㎖를 경구투여한다.

표적 부위의 표면 상피세포에 라벨링 조성물을 투여하는 경로는 다양할 수 있다. 라벨링 조성물은 서방형 경구투여제제로 투여될 수 있다. 용액 형태의 조성물을 내시경 관측 하에서 상피 점막의 표면에 적접 적용하는 투여방식(예를 들어, 스프레이) 또는 조성물 용액을 음료 형태로 하여 경구투여하는 방식이 바람직하다. 표면 상피에 용액을 직접 스프레이하는 방식이 점막에 가장 잘 부착될 것으로 기대되어 바람직하고, 용액의 경구투여방식은 시험 대상에게 부담을 줄여준다는 점에서 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 라벨링 조성물은 표면 상피의 특정 구역에 적용된다. 의사는 내시경 검사를 통해 특정구역이 비정상적일 것 같은지에 따라서, 본 발명의 박리속도의 측정방법에 좋은 대상인지를 쉽게 확인할 수 있다. 또한, 의사는 인접한 정상적 부위에 라벨링 화합물을 적용하여 두개의 부위을 비교할 수 있다.

점막 표면의 실질적인 전체에 적용하는 것이 아니라 세포들의 특정 구역에 라벨링 조성물을 적용하는 것의 장점은 염료 물질, 및 투여와 진단 시간을 현실적으로 절약할 수 있다는 것이다. 그러나, 바람직한 방법은 라벨링 조성물을 표적 기관 내부의 점막 표면의 실질적인 전체 부분을 덮을 수 있도록 적용하는 것이다. 예를 들어, 시아닌 염료가 위장 라인의 실질적인 전체 부분에 적용될 때, 상피세포의 염색 부위의 형광강도를 검사하여 성숙한 상피세포의 비정상적인 박리의 관찰이 가능하다.

다른 기관의 상피세포와는 달리, 본 발명에 따라 위장 상피세포를 라벨링할 때, 라벨링 조성물의 투여 후 관찰까지의 시간은 위장 표면 점막 세포의 수명이 약 2일이라는 사실에 의존한다. 그러므로, 위장의 상피세포의 박리속도(악성종양일 경우 정상 박리속도보다 느려지는)를 측정할 경우에는 적어도 한 번의 검사는 라벨링 조성물의 투여 후 2일 이상이 지나서 실시되어야 할 것이다. 반대로, 위장 점막 세포의 과대증식을 초래하는 질병의 존재 여부를 진단할 경우에는 적어도 한 번의 검사는 투여 후 최초 2일 이내에 실시되어야 한다. 이 시간 동안 시험 대상은 아스피린과 알코올과 같이 위장 및 다른 기관의 상피세포의 박리속도를 빠르게 하는 물질을 피해야하는 것을 제외하고는 정상적인 생활 및 음식 섭취를 유지할 수 있다.

결장의 소낭 전체의 수명은 동물 및 인체 실험에서 측정한 결과 약 4 내지 7일이다. 일반적으로, 염료 용액의 투여 후 4 내지 7일이 지난 후에 결장암의 존재 여부의 진단이 실시된다.

본 발명의 실시에 있어서, 라벨링된 표면 상피세포는 직접 육안으로 관찰된다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 이러한 세포의 박리속도는 투여 부위에 라벨링된 성숙한 상피세포가 존재하는지 또는 존재하지 않는 지를 직접 육안으로 관찰하는 것에 의해 정상 또는 비정상 여부가 측정된다. 표적 부위에서 관측가능한 형광 정도는 라벨링된 세포가 박리됨에 따라 감소한다. 라벨링된 부위의 정상 상피세포가 박리되는 시간이 지난 후의 라벨이 존재하는 것은 세포의 과소증식을 가르킨다. 마찬가지로, 정상 상피세포가 박리되는 시간 전에 라벨의 존재하지 않는 것은 세포의 과대증식을 가르킨다. 라벨의 존재 또는 부존재 여부를 단지 정성적으로 검출하는 경우에는 단지 라벨링 과정을 거진 후에 미리 선택된 시간에 실시하는 것이 바람직하다. 라벨의 양을 정량적으로 검출할 수는 있으나, 본 발명의 진단 방법을 수행하는데 필요한 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 방법에 있어서, 시아닌 염료 라벨은 라벨링된 세포에 여기 광선을 조사하여 형광 정도를 관찰 및/또는 측정하는 방법에 의해 검출된다. 예를 들어, PKH2와 PKH26은 흡수 파장과 형광 파장이 정해져 있다. PKH2은 최대 형광을 관측하기 위해서는 약 490nm 내지 약 504nm의 여기 광선이 필요한 반면에, PKH26은 최대 형광의 관측을 위해서는 약 551nm 내지 약 567nm의 여기 광선이 필요하다. 형광은, 예를 들어 적절한 필터와 광학 검출기 구비하는 내시경 장치에 의해 관측할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 보통의 파이버스코프(fiberscope)를 사용할 수 있다. 구체적으로, 전체 스펙트럼에서 원하는 부분만을 선택적으로 통과시킬 수 있는 필터를 구비한 파이버스코프를 이용하여 특정 파장의 빛에 선택적으로 상피점막을 노출시킬 수 있다. 광원(할로겐 램프와 같은)으로부터 PKH2에 대해서는 약 490nm 내지 약 504nm의 파장을 가진 빛을, PKH26에 대해서는 551nm 내지 약 567nm의 파장을 가진 빛을 통과시키는 필터가 바람직하다. 라벨링된 세포에서 방출된 빛을 적절한, 좁은 밴드패스 필터와, 선택적으로 이미지 강화기와 검출되는 빛의 강도에 상응하는 시그널을 생산하는 광학 검출기에 이르게 하여 형광을 검출할 수 있다. 고해상도 CCD 검출기와 같은 다른 장치도 표적 부위를 관측하는데 사용될 수 있다.

위장관 점막에서 성숙한 상피세포의 박리속도에 관한 입수가능한 공개된 데이타는 위관강을 세척한 후, 세척한 용액에서 DNA를 측정하고, 위액에서 떨어져 나온 세포의 수를 측정하여 얻어지는 세포 손실량을 측정하여 얻은 것이다. 이 데이타에 의하면, 약 500,000개의 세포가 매분 위장 점막으로부터 박리된다. 이 세포 손실은 위축성 위장염의 경우에 증가되는 것으로 인식되어 진다.

비록 박리속도에 관한 데이타가 제한되어 있다할지라도, 일반적으로 종양의 세포 동력학은 알려져 있다. 일반적으로, 세포 전환(turnover)의 동력학이 느린 건강한 조직의 기관에서 악성종양이 진행될 때, 악성종양 세포의 세포 동력학은 증가한다. 반면에, 상피의 세포 동력학이 높은 건강한 기관에서 악성종양이 진행되고 있다면, 세포 동력학은 감소할 것이다. 예를 들어, 건강한 간세포는 세포분열을 거의 하지 않는다. 간암 세포에서는 세포 동력학이 증가한다. 위장관 점막의 건강한 세포에 있어서는 통상 세포 동력학이 매우 빠르다. 악성종양이 존재할 때에는 세포 동력학이 극도로 감소된다.

건강한 인체의 위장관 점막의 S과정(DNA 합성과정)의 길이는 약 10 내지 11시간이다. 인체에 있어서, 세포주기(T)는 위장 점막의 경우 약 24 내지 약 48시간, 내장 이형성(metaplasia)의 경우는 약 37시간, 결장 점막의 경우는 약 40시간, 직장 점막의 경우는 약 24 내지 약 48시간이다. 이에 비해, 인체의 위장암의 경우에는 T가 약 2.5 약 13일, 결장암의 경우에는 약 4.2 내지 7.0일 이다.

그러므로, 암이 존재하는 경우에 세포 증식이 현저하게 느려진다는 것은 명백하다. 게다가, 인체의 악성종양에 있어서, 종양 세포의 더블링 타임(D)(즉, 세포수가 두배가 되는 시간)은 약 30 내지 120일 인 반면에, 위장관 악성종양의 경우에는 매우 느려지는데, 초기 위암의 경우에는 약 555 내지 약 3,706일, 결장암의 경우에는 약 636일이다.

건강한 세포와 종양 세포 사이의 세포주기(T)의 차이는 약 10배이다. 성장속도에 있어서, 이러한 차이는 정상적인 세포 및 종양 점막 상피세포가 나타내는 박리속도를 반영하는 것이다. 위장 표면 점막 세포의 정상적인 수명은 약 1 내지 2일이다. 결장 점막 상피세포의 정상적인 수명은 약 4 내지 7일이다. 종양세포의 박리속도가 이러한 정상적 전환과 동일하다면, 이것은 암세포의 T보다 암세포의 박리속도가 빠르다는 것으로 암세포가 체내에서 사라지는 것을 본질적으로 의미한다. 그러므로, 종양 세포가 체내에 남게하기 위해서는 종양 세포의 박리속도가 정상세포의 박리속도보다 10배(종양 세포와 정상세포와의 T의 차이는 유사함) 느려야한다는 것을 의미한다. 그러므로, 정상 점막과 종양 점막의 박리속도의 뚜렷한 차이가 있다는 것은 명백하다. 본 발명의 독특한 방법은 이 박리속도의 차이를 이용한 것이다.

본 발명의 실시에 있어서, 관측(즉, 정상세포와 악성종양을 구별하는 것)에 사용되는 특정 장치의 정확도가 중요하다. 가장 일반적으로 사용되는 두 가지의 내시경은 파이버스코프와 전자 내시경이다. 파이버스코프와 전자 내시경의 해상도는 제조자에 따라 넓은 범위를 가지고 있는데, 일반적으로 파이버스코프는 약 600μ, 전자 내시경은 약 100μ의 해상도를 갖는다. 본 발명은 목적은 직경이 약 5 내지 약 10㎚인 범위 내에서 상피세포의 박리속도가 정상인지 비정상인지를 구별하는 것이다. 따라서 상술한 목적에 따라 적절한 장치를 선택해야 한다.

정상 위장 표면 점막 세포의 박리속도가 약 2일이기 때문에, 2일 전에 시아닌 염색이 상당히 사라진다는 것은 박리속도가 정상보다 빠른 상태를 나타내다. 시아닌 염색을 2일이 넘어서도 상당히 볼 수 있다면, 이것은 박리속도가 느려져있다는 것이므로 (위암같은)질병이 존재한다는 것을 나타낸다.

일반적으로 위축성 위염은 시간이 지남에 따라 위장 점막으로 진행된다. 세포 전환이 위축성 위염 동안에 증가한다는 것은 알려져 있기 때문에, 박리속도는 증가할거라고 생각된다.

위궤양에 있어서, 세포 전환은 일반적으로 정상 위장 조직보다 빠르다. 이에 대한 박리속도에 관한 데이타는 없으나, 점막 손실을 보충하기 위하여 정상적 성장이 이루어진다. 그러므로, 세포 손실이 느려지지 않을 것이라고 생각된다. 그러므로, 위궤양 상태와 세포 전환이 감소되는 위암 사이에는 분명한 차이가 있다고 생각된다.

다음의 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 상세하게 설명하고자 하는데, 이 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

PKH2와 PHK26으로 래트의 위장 점막의 상피세포를 염색하여, 세포 동력학이 라벨링된 상피세포의 박리속도의 검사로 분석될 수 있는가를 조사하였다. 본 연구의 목적은, 증식세포에 있어서 DNA 합성를 조사하는 방법을 제공하는 것이 아니라, 성숙한 상피세포의 박리속도와 이동을 토대로 세포 동력학을 평가하가는 것이다. 본 실시예에서는 생 후 2주된(160 내지 200g) 위스타(Wistar) 종 래트 수컷을 사용했다.

래트에게 2일 동안 자당 7%와 NaCl 0.5%를 함유하는 용액을 먹여 위 내의 잔류물을 감소시켰다. BrdU[5-브로모-2-데옥시우리딘(시그마 케미칼사)] 50mg/kg(마리당 약 10mg)를 복막 내로 6시간마다 1회씩 4회 투여하여, 위장 점막의 생성 세포 구역을 라벨링하였다. BrdU의 4회 투여 직후에 프로네이즈 용액(물 80ml에 프로네이즈 20,000유니트와 중탄산나트륨 1g을 함유하는) 3ml을 래트에게 구강삽관(oral intubation) 방법에 의해 투여하여 위장 점막에 부착된 점액을 제거했다. 프로네이즈 용액 투여 30분 후에 PKH2 또는 PHK26 3ml을 구강삽관 방법을 사용하여 동일하게 투여했다. 마지막으로 BrdU를 투여하고 1, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 60 및 72시간 간격으로 래트에서 위장을 적출하여 액체질소로 즉시 냉동하였다.

냉동된 조직을 크리오스타트(cryostat)로 각각 5㎛ 두께로 4개의 일련의 절편으로 절단했다.

첫번째 냉동 절편은 PKH2와 PHK26의 존재 여부를 입증하는데 사용했다. 이 절편을 시아노아크릴 수지(Toa Gousei Kagaku사에서 제조한 상표명 Bond Aron Alpha)를 이용하여 즉시 적재하여 염색되지 않은 절편을 만들었다. 나머지 3개의 냉동 절편은 3분동안 10% 완충 포르말린에 넣었다. 그 중 하나의 절편은 헤모톡실린-에오신으로 염색했다. 나머지 두 개의 절편은 아래에 개시하는 항-BrdU 모노클로날 항체를 사용하여 효소-항체 방법으로 염색했다.

상기 절편들을 0.1M PBS(Experimental Bio Medical Research사)로 씻은 후 DNA를 절단하기 위해 37℃에서 30분 동안 2N 염산에서 배양하였다. 그리고나서 샘플들을 0.1M PBS로 3번 세척하였다. 다음으로 내인성 퍼옥시다아제를 차단하기 위해 샘플들을 실온에서 0.3% 과산화수소 용액으로 10분 동안 처리한 후 0.1M PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 비특이적 반응을 차단하기 위해 샘플들을 두 배로 희석된 블록-에이씨이(Block-ACE)(스노우 브랜드 프로덕트 주식회사)에서 10분 동안 배양한 후 0.1M PBS로 3회 세척했다. 하나의 절편은 실온에서 BAS를 1% 함유하는 0.1M PBS에 의해 50배 희석된 제1차 항체(항-BrdU, 마우스 모노크로날, 벡톤 딕킨손)로 10분 동안 배양했다. 음성 대조표준을 위해, 다른 절편은 실온에서 BAS를 1% 함유하는 0.1M PBS로 10,000배 희석한 정상 마우스 혈청으로 1시간 동안 배양했다. 그 다음으로 상기 절편들을 0.1M PBS로 3회 세척한 후에 실온에서 바이오틴화된 마우스 IgG로 30분간 배양하였다. 0.1M PBS로 3회 세척한 후에 상기 절편들을 실온에서 ABC 시약(벡터)으로 30분간 반응시킨 다음 다시 0.1M PBS로 3회 세척하고나서, DAB 용액(도진도)로 1분 동안 배양했다. 흐르는 물로 세척한 후에 상기 절편들을 메이어 헤마토실린 염색시약(머크)를 사용하여 1분 동안 염색하고나서, 다시 흐르는 물로 10분 동안 세척하였다. 그리고나서 상기 샘플들을 에탄올로 수분을 제거한 후 자일렌으로 세척하고나서 HSR에 침지하였다.

다음의 연구들은 점막 표면에서 수직으로 절제한 절편에 대해 수행되어 졌다. 도 1은 위장 점막의 다양한 절제 부위를 나타낸다. 생성 세포 구역(G)는 4회의 BrdU 투여 1시간 후 증식 구역에서 최상부의 BrdU-염색된 세포로부터 최하부의 BrdU-염색된 세포까지의 거리를 나타낸다. 점막 표면에서 최상부의 BrdU-염색된 세포의 위쪽을 표면 점막 세포 구역(S)로 부른다. 생성 세포 구역의 총 세포 수에 대한 BrdU-양성 세포의 비율을 증식 구역 라벨링 지수라고 부른다. 상피세포가 BrdU-양성 세포로부터 점막 표면까지의 거리를 이동하는데 걸리는 시간을 측정했다. BrdU-양성 세포가 점막 표면에 도달하는데 걸리는 시간은 표면 점막 세포의 재생 시간을 의미한다. 또한, 도 1에서 표시된 거리(A)는 점막 표면으로부터 PKH2로 염색된 가장 하부의 세포까지의 거리에 상응하고, 거리(B)는 점막 표면으로부터 PKH26으로 염색된 가장 하부의 세포까지의 거리에 상응한다.

형광 현미경을 사용하여 염색되지 않은 절편에서 PKH2 또는 PKH26이 존재하는 가를 검사했다. PKH2는 FITC에 대해 사용되는 필터를 이용하여 검사하였고, PKH26은 로다민(rhodamine)에 대해 사용되는 필터를 이용하여 검사하였다. PKH2 및 PKH26으로 염색된 표면 점막으로부터의 거리를 측정하였다. 염색된 세포의 손실은 전환을 의미한다. 각각의 샘플들에 있어서, 조직학적 거리 측정은 오브젝티브 마이크로미터를 사용하여 측정했다.

6시간 간격으로 BrdU 50mg/kg를 4회 투여 후 첫 1시간은 대조표본으로 간주된다. BrdU-양성 세포들은 분비선의 상부 지역에 지배적으로 위치했다. 생성 세포 구역의 98.2%가 BrdU-양성 세포였다. 그러므로, 대부분의 BrdU는 생성 세포 구역의 세포에 부착된 것이다.

표면 점막 세포의 이동은 BrdU-양성 세포의 이동을 연속적으로 조사하는 방법에 의해 관찰하였다. 투여 후 1시간에 채취한 첫번째 샘플에 있어서, 최상부의 BrdU-양성 세포는 약 110μ에서 볼 수 있다(즉, 110μ의 표면 세포 구역은 생성 세포 구역의 상부에서 볼 수 있다). 그러므로, BrdU-양성 세포가 시간이 경과함에 따라 상부로 이동한다는 것는 분명하고, 투여 후 60시간이 경과하면 BrdU-양성 세포는 점막 표면에서 볼 수 있다. 그러므로, 래트의 표면 점막 세포의 수명은 약 60시간으로 계산된다.

보고된 바에 의하면, 인간의 표면 점막 세포의 수명은 약 72시간이다. BrdU로 라벨링된 세포가 점막 표면까지 도달하는데 걸리는 시간에 관한 본 연구에서 얻어지는 데이타와 문헌에서 보고되는 것과 거의 일치한다.

염료 PKH2는 점막 표면으로부터 깊이 약 75μ에 있는 표면 점막 세포를 염색했다. PKH2의 염색 깊이는 경과 시간보다 얕게되었고, 40시간 후에 염색이 사라졌다. PKH26은 PKH2보다 더 얕은 깊이인 점막 표면으로부터 약 45μ까지 염색했다. 이 경우에 염색된 세포의 깊이는 경과시간보다 얕게되었고, 24시간 후에 염색이 사라졌다. BrdU에 의해 약 110μ 깊이에서 염색된 경우, 표면 점막 세포가 박리하는데 걸리는 시간은 60시간, PKH2에 의해 점막 세포로부터 약 75μ 깊이에서 염색된 경우에는 40시간 그리고 PKH26에 의해 약 45μ 깊이인 경우에는 24시간이였다. 박리속도가 다른 것은 각각의 마커의 염색 깊이의 차이때문이라는 것을 알 수 있다. 본 연구의 결과로서, PKH2와 PKH26은 표면 점막 세포의 박리를 분석하는게 마커로서 사용될 수 있다는 것이 명백해졌다.

실시예 2

PKH2와 PKH26를 래트의 결장 점막을 염색하여, 세포 동력학이 라벨링된 상피세포의 박리속도를 검사로 분석될 수 있는 가를 조사하였다. 다음의 실험에서는 생 후 2주된(160 내지 200g) 위스타(Wistar) 종 래트 수컷을 사용했다.

래트에게 2일 동안 자당 7%와 NaCl 0.5%를 함유하는 용액을 먹여 결장 내의 잔류물을 감소시켰다. BrdU[5-브로모-2-데옥시우리딘(시그마 케미칼사)] 50mg/kg(마리당 약 10mg)를 복막 내로 6시간마다 1회씩 4회 투여하여, 결장 점막의 생성 세포 구역을 라벨링하였다. BrdU의 4회 투여 직후에 프로네이즈 용액(물 80ml에 프로네이즈 20,000유니트와 중탄산나트륨 1g을 함유하는) 3ml을 래트에게 항문을 통하여 의해 투여하여 결장 점막에 부착된 점액을 제거했다. 프로네이즈 용액 투여 30분 후에 PKH2 또는 PHK26 3ml를 항문을 통하여 동일하게 투여했다. 마지막으로 BrdU를 투여하고 1, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 60 및 72시간 간격으로 래트에서 결장을 적출하여 액체질소로 즉시 냉동하였다.

상기 절편을 0.1M PBS(Experimental Bio Medical Research사)로 세척한 후 DNA를 절단하기 위헤 37℃에서 30분 동안 2N 염산에서 배양하였다. 그리고나서 샘플들을 0.1M PBS로 3번 세척하였다. 다음으로 내인성 퍼옥시다아제를 차단하기 위해 샘플들을 실온에서 0.3% 과산화수소 용액으로 10분 동안 처리한 후 0.1M PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 비특이적 반응을 차단하기 위해 샘플들을 두 배로 희석된 블록-에이씨이(Block-ACE)(스노우 브랜드 프로덕트 주식회사)에서 10분 동안 배양한 후 0.1M PBS로 3회 세척했다. 하나의 절편은 실온에서 BAS를 1% 함유하는 0.1M PBS에 의해 50배 희석된 제1차 항체(항-BrdU, 마우스 모노크로날, 벡톤 딕킨손)로 10분 동안 배양했다. 음성 대조표준을 위해, 다른 절편은 실온에서 BAS를 1% 함유하는 0.1M PBS로 10,000배 희석한 정상 마우스 혈청로 1시간 동안 배양했다. 그 다음으로 상기 절편들을 0.1M PBS로 3회 세척한 후에 실온에서 비오틴화된 마우스 IgG로 30분간 배양하였다. 0.1M PBS로 3회 세척한 후에 상기 절편들을 실온에서 ABC 시약(벡터)으로 30분간 반응시킨 다음 다시 0.1M PBS로 3회 세척하고나서, DAB 용액(도진도)로 1분 동안 배양했다. 흐르는 물로 세척한 후에 상기 절편들을 메이어 헤마토실린 염색시약(머크)를 사용하여 1분 동안 염색하고나서, 다시 흐르는 물로 10분 동안 세척하였다. 그리고나서 상기 샘플들을 에탄올로 수분을 제거한 후 자일렌으로 세척하고나서 HSR에 침지하였다.

다음의 연구들은 소낭에서 수직으로 절제한 절편에 대해 수행되어 졌다. 도 2는 결장 점막의 다양한 절제 부위를 나타낸다. 생성 세포 구역(G)는 소낭에서 4회의 BrdU 투여 1시간 후 증식 구역에서 최상부의 BrdU-염색된 세포로부터 최하부의 BrdU-염색된 세포까지의 거리를 나타낸다. 점막 표면에서 최상부의 BrdU-염색된 세포의 상부 구역을 표면 점막 세포 구역(S)로 부른다. 생성 세포 구역의 총 세포 수에 대한 BrdU-양성 세포의 비율을 증식 구역 라벨링 지수라고 부른다. 상피세포가 BrdU-양성 세포로부터 점막 표면까지의 거리를 이동하는데 걸리는 시간을 측정했다. BrdU-양성 세포가 점막 표면에 도달하는데 걸리는 시간은 표면 점막 세포의 재생 시간을 의미한다. 또한, 도 2에서 표시된 거리(A)는 점막 표면으로부터 PKH2로 염색된 가장 하부의 세포까지의 거리에 상응하고, 거리(B)은 점막 표면으로부터 PKH26으로 염색된 가장 하부의 세포까지의 거리에 상응한다.

형광 현미경을 사용하여 염색되지않은 절편에서 PKH2 또는 PKH26이 존재하는 가를 검사했다. PKH2는 FITC에 대해 사용되는 필터를 이용하여 검사하였고, PKH26은 로다민(rhodamine)에 대해 사용되는 필터를 이용하여 검사하였다. PKH2 및 PKH26으로 염색된 표면 점막으로부터의 거리를 측정하였다. 염색된 세포의 손실은 전환을 의미한다. 각각의 샘플들에 있어서, 조직학적 거리 측정은 오브젝티브 마이크로미터를 사용하여 측정했다.

6시간 간격으로 BrdU 50mg/kg를 4회 투여 후 첫 1시간은 대조표본으로 간주된다. BrdU-양성 세포들은 소낭 바닥의 7/10에 지배적으로 위치했다. 상부 3/10은 표면 세포 구역이고, 약 60μ 깊이로 측정되었다. 생성 세포 구역의 98.2%가 BrdU-양성 세포였다. 그러므로, 대부분의 BrdU는 생성 세포 구역에 부착된 것이다.

표면 점막 세포의 이동은 BrdU-양성 세포의 이동을 연속적으로 조사하는 방법에 의해 관찰하였다. 투여 후 1시간에 채취한 첫번째 샘플에 있어서, 최상부의 BrdU-양성 세포는 약 60μ에서 볼 수 있다(즉, 60μ의 표면 세포 구역은 생성 세포 구역의 상부에서 볼 수 있다). 그러므로, BrdU-양성 세포가 시간이 경과함에 따라 상부로 이동한다는 것는 분명하고, 투여 후 32시간이 경과하면 BrdU-양성 세포는 점막 표면에서 볼 수 있다. 그러므로, 표면 점막 세포의 수명은 약 32시간으로 계산된다. 래트에 있어서, 소낭의 상부 3/10을 차지하는 BrdU-양성 결장 표면 점막 세포의 수명이 약 32시간이기 때문에, 소낭 전체의 수명은 약 107시간 또는 4.5일로 계산된다.

보고된 바에 의하면 인간의 표면 점막 세포의 수명은 약 4 내지 7일이다. BrdU로 라벨링된 세포가 점막 표면까지 도달하는데 걸리는 시간에 관한 본 연구에서 얻어지는 데이타와 문헌에서 보고되는 것과 거의 일치한다.

염료 PKH2는 점막 표면으로부터 깊이 약 40μ에 있는 표면 점막 세포를 염색했다. PKH2 라벨의 깊이는 경과 시간보다 얕게되었고, 16시간 후에 PKH2 라벨이 사라졌다. PKH26은 PKH2보다 더 깊은 깊이인 점막 표면으로부터 약 50μ까지 염색했다. 이 경우에 염색된 세포의 깊이는 경과시간보다 얕게되었고, 32시간 후에 염색이 사라졌다. BrdU에 의해 약 60μ 깊이에서 염색된 경우, 표면 점막 세포가 박리하는데 걸리는 시간은 32시간, PKH2에 의해 점막 세포로부터 약 40μ 깊이에서 염색된 경우에는 16시간 그리고 PKH26에 의해 약 50μ 깊이인 경우에는 32시간이였다. 박리속도가 다른 것은 각각의 마커의 염색 깊이의 차이때문이라는 것을 알 수 있다.

실시예 3

인간의 결장 및 위장의 정상 세포와 종양 세포와의 박리속도의 차이를 확인함으로써 종양 부분이 정상 점막으로부터 구별될 수 있는 가를 결정하기 위하여 생체내 방법으로 검사를 실시하였다. 본 실시예에서 얻어진 결과로 인간의 결장암 및 위암이 박리속도의 측정을 통해 진단될 수 있음을 알 수 있다.

PKH2- 및 PKH26-함유 세포 라벨링 조성물을 내시경으로 직접 관찰하면서 표적 부위에 스프레이한 후 질병 부분과 이를 둘러싼 정상 점막을 절제하였다. 냉동 절편을 형광 현미경으로 관찰하여 PKH2 또는 PKH26이 존재하는가의 확인 및 박리속도의 측정을 하였다. 본 방법을 실시하기 위한 위장을 준비하기 위하여, 우선 물 80ml 내에 프로네이즈 20,000유니트와 중탄산나트륨 1g을 함유하는 용액을 사용하여 위장의 점액을 제거하였다. 이러한 점액 제거에 이어서, PKH2 또는 PKH26 용액을 내시경에 의한 직접 관찰 하에 표적부위외 그 주변 부위에 스프레이하는 통상적인 결장경 검사(colonoscopic examination)을 실시하였다.

결장에 대해서는 결장경 검사를 실시한 후, 폴리에틸렌 글리콜 약 137g을 가한 물 2 내지 4리터를 이용하여 통상적인 결장경에 의한 절제 준비를 한 후에 질병 부위를 절제하였다. 처음의 검사 4일 후에 실시되는 추가적 검사 전에 환자에게 세포의 동력학에 영향을 줄 잠재성을 가지고 있는 음식, 약물, 및 스테로이드, 아스피린 과 알코올과 같은 다른 물질의 섭취를 삼가하도록 하였다.

본 연구에 악성종양의 초기 단계가 포함되기 때문에, 표적 부위의 절제를 위해 내시경 절제술(strip biopsy)을 실시했다. 절제된 절편은 즉각적으로 액체 질소 내에 보존되었다. 크리오스타트로 조직을 엷게 절제하여 5㎛의 두 개의 절편을 만들었다. 내동 절편의 조제 후에 절편들 중의 하나는 즉각적으로 적재하여 PKH2 또는 PKH26의 존재 여부를 검사하기 위한 염색되지 않은 절편을 만들었다. 두번째 절편은 3분 동안 10% 완충 포르말린에 넣고나서 헤모톡실린-에오신으로 염색했다. 질병의 진단은 헤모톡실린-에오신 염색된 절편으로 실시했다. 형광 현미경과 FITC를 위해 사용되는 필터를 사용하여 PKH2의 존재 여부를 확인하였고 형광 현미경과 로다민을 위해 사용되는 필터를 사용하여 PKH26의 존재 여부를 확인했다.

환자 1

환자 1은 앤트럼(antrum) 내에 직경 20nm의 초기 위암(활성 형태, 형태 Ⅱa)을 가진 60세의 남성이었다. 물 80ml에 프로네이즈 20,000유니트와 중탄산나트륨 1g을 함유하는 용액으로 점액을 제거한 후에 통상의 내시경 검사를 하였다. 내시경으로 질병의 존재를 육안으로 확인한 후에 PKH2 용액의 10ml을 스프레이하여 질병부분을 염색하였다. 내시경 검사 4일 후에 내시경 절제술(strip biopsy)을 이용하여 형태 Ⅱa 초기 위암 부위를 절제하였다. 전술한 방법을 사용하여 조직 절편을 냉동시킨 후 현미경으로 검사했다. 헤모톡실린-에오신 염색된 조직의 이미지로부터, 잘 분화된 선암종 부분이 주변에 정상 점막을 가진 점막에 위치한다는 것을 명백히 알 수 있었다. FITC 필터를 사용하는 형광 현미경으로 종양 부위를 관찰한 것을 기초로 하면, 종양 조직의 표면으로부터 30μ의 깊이까지 PKH2에 의해 염색되는 것으로 나타났다.

대조적으로, 장관의 이형성과 유문부의 분비선은 주위의 정상 세포 내에서 인식되지만, PKH2 형광은 검출되지 않는다. 그러므로, PKH2에 의해 염색된 암세포는 손실되지않는 반면에, PKH2에 의해 염색된 정상 점막 상피세포는 박리에 의해 손실되었다.

환자 2

환자 2는 직경 10nm의 직장암(활성 형태 Ⅰ의 직장암)을 가진 63세의 남성이었다. 폴리에틸렌 글리콜로 결장을 세척한 후 결장경을 실시하였다. 내시경을 사용하여 질병의 존재를 육안으로 확인한 후 질병부위와 그 주변을 PKH26 용액 10ml로 스프레이하였다. 결장경 검사 4일 후에 내시경을 사용하여 직접 육안으로 질병 부위를 절제하였다. 절제된 조직은 환자 1에서 설명한 것과 동일한 과정으로 준비하였다. 헤모톡실린-에오신 염색된 조직은 점막에 위치한 잘 분화된 선암종으로 나타났고, 형광 현미경 검사에 의해 종양 조직의 표면이 PKH26에 의해 60μ의 깊이 까지 염색되는 것을 알 수 있었다. 또한, 주위의 점막에서 PKH26으로 염색된 상피세포가 박리되는 것으로 나타났다. 그러므로, PKH26으로 염색된 정상 점막은 박리되는 반면에, PKH26으로 염색된 종양 점막은 남았다. 그러므로, 종양 결장 점막과 정상 결장 점막 사이의 박리속도의 차이가 있음이 명백하다.

결장 점막에 있어서, 증식세포 구역은 소낭의 바닥 2/3을 포함한다. 생체내 방법으로 측정될 때, S단계는 9 내지 20시간 사이였고, 총 세포주기는 24 내지 48시간 사이였다. 생체내 방법에 의한 검사에 의하면, 대장(또는 라벨링 지수(L.I.))의 경우, S단계에 있는 세포 집단이 12 내지 25% 사이에서 변하였다. 이러한 값으로부터 계산되어지는 이 조직에 대한 대체 시간은 4 내지 8시간이다. 일반적으로 시험관내 방법에 의한 연구에 의하면, 더 짧은 S 단계 시간(7.2-11.2시간)과 더 낮은 라벨링 지수(1.5-7%)를 보인다. 결과적으로, 총 세포시간에 대한 계산은 생체내 방법으로 얻어진 값(시험관내 77.2-129.9시간 대 생체내 24-48시간)보다 더 긴것으로 나타났다.

본 명세세에서 상술한 설명과 도면은 단지 본 발명의 장점, 태양 및 목적을 달성하기 위한 바람직한 실시예를 설명하기 위한 것이지, 본 발명을 제한하는 것으로 의도된 것은 아니다. 다음의 청구범위의 정신과 범위 내에 들어오는 본 발명의 변형은 본 발명의 일부로 간주된다.

Claims

항온동물의 성숙한 표면 상피세포의 비정상적 세포 박리속도를 생체내에서 검출하는 방법에 있어서,

동물의 표적 부위에서 성숙한 표면 상피세포를 라벨링하는 단계 및 상기 라벨링 단계 후에 상기 표적에서 라벨의 존재 또는 부존재 여부를 모니터링하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포가 시아닌 염료에 의해 라벨링되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 2항에 있어서, 상기 시아닌 염료가 하기의 화학식인 것을 특징으로 하는 검출방법

[화학식]

상기 화학식에서, Y는 산소, 황, 메틸렌 또는 알킬 치환된 메틸렌;

m은 0 내지 3; 및 n은 12 내지 22임.
제 2항에 있어서, 상기 시아닌 염료가 하기의 화학식 1 또는 화학식 2인 것을 특징으로 하는 검출방법.

[화학식 1]

[화학식 2]
제 1항에 있어서, 상기 표적 부위가 점막 표면인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1항에 있어서, 상기 표적 부위가 위장의 점막 표면인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1항에 있어서, 상기 표적 부위가 결장의 점막 표면인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1항에 있어서, 세포 박리가 상기 라벨링 단계 후에 미리 선택된 시간에 상기 표적 부위에서 라벨의 존재 정도의 변화를 관측하여 검출되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 8항에 있어서, 상기 라벨이 시아닌 염료이고, 상기 라벨의 존재 정도의 변화는 여기 광선을 표적 부위에 조사하고, 그에 의해 생성되는 형광의 강도를 측정하여 검출되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 9항에 있어서, 상기 여기 광선이 약 490nm 내지 약 504nm 또는 약 551nm 내지 약 567nm의 파장을 가진 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1항에 있어서, 라벨링 조성물을 표적 부위에 직접 적용함으로써 상기 상피세포가 라벨링되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1항에 있어서, 라벨링 조성물을 항온동물에게 경구투여함으로써 상기 상피세포가 라벨링되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1항에 있어서, 라벨링 조성물을 항온동물에게 직장투여함으로써 상기 상피세포가 라벨링되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
항온동물의 점막 표면상의 성숙한 상피세포의 박리속도를 측정하는 방법에 있어서,

검출가능한 라벨을 함유하는 라벨링 조성물을 표적 부위의 표면 상피세포에 적용하는 단계 및 상기 표적 부위로부터 손실되는 라벨의 속도를 관측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 14항에 있어서, 상기 라벨링 조성물을 적용하기 전에 상기 표적 부위로부터 점액을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 14항에 있어서, 상기 라벨이 시아닌 염료인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 16항에 있어서, 상기 시아닌 염료가 하기의 화학식인 것을 특징으로 하는 검출방법.

[화학식]

상기 화학식에서, Y는 산소, 황, 메틸렌 또는 알킬 치환된 메틸렌;

m은 0 내지 3; 및 n은 12 내지 22임.