KR20000068398A - 세포내 시스테인 및 글루타티온 농도 분석 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산화성 스트레스의 개인별 능력의 생화학적 분석법을 제공하기 위해, 사람의 임파구내에서 글루타티온 또는 시스테인의 세포내 농도를 측정하기 위한 임파구 배양 배지 및 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 배지는, pH가 약 6.8 내지 7.6이고, 글루코오스 또는 임파구내에서 글루코오스를 생성할 수 있는 화합물인 탄수화물; 판토텐산, 콜린 또는 상기 임파구에서 콜린을 생성할 수 있는 물질; 염화물, 인산염, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 철을 포함하는 무기 이온; L-부티오닌-[S.R.]-설폭스이민; 탈이온수; 및 임파구를 자극하기 위한 유사분열물질을 함유하는 무혈청 완충 용액이다. 시스테인 농도를 측정할 경우에는, 배지는 N-아세틸-L 시스테인과 큐멘 하이드로퍼옥사이드를 추가로 함유한다. 본 발명의 방법은, 개인의 임파구를 배양 배지에 접종하고, 배지에서 임파구를 항온처리하고, 상기 임파구의 반응을 개인의 대조 그룹의 임파구의 평균 반응과 비교함으로써 수행한다.

Description

세포내 시스테인 및 글루타티온 농도 분석{Assessment of intracellular cysteine and glutathione concentrations}
본 발명은 일반적으로는 영양학 및 생화학 분야와 세포내 글루타티온 대사에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 퇴행성 질환을 예방하고 산화성 스트레스를 다루는 개인의 능력을 측정하기 위해, 시스테인 및 글루타티온의 세포내 작용 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
노화, 관절염, 암, 아테롬성 동맥경화증, 심근 경색증, 발작, 바이러스 감염, 폐 질환, 장 질환 및 신경퇴행성 질환을 포함하는 사람의 수많은 건강 상태는, 통상 자유 라디칼이라고 언급되는 반응성 산소 분자의 존재에 의해 진전되거나 악화될 수 있음이 현재 널리 공지되어 있다. 이러한 적대적인 분자들은 생리적 과정의 통상적인 부산물이며, 예를 들어 세포 호흡 또는 (이물질을 죽이는) 면역계 기능을 통한 산소의 대사 및 대사에 필수적인 수많은 효소 반응에 의해 생성된다. 또한, 자유 라디칼은 이러한 통상적인 환경에서 발견된다. 자유 라디칼의 환경적인 근원은 매연, 전리선, 대기 오염, 화학 약품[발암 물질, 여러 가지 석유화학 물질, 바이오사이드(biocide), 염료, 용매, 세포증식억제(cytostatic) 약물 등], 독성 중금속 및 산화되거나 부패된 지방을 포함한다. 대부분의 통상적인 자유 라디칼의 일부는 수퍼 옥사이드(super oxide), 하이드록실 라디칼, 단일 산소, 및 과산화수소를 포함한 퍼옥사이드(peroxide)이다. 철과 구리의 특정 원자가는 단시간 존재하더라도 라디칼 형성의 연쇄 반응을 촉진시켜 일순간에 변화되어 생체 분자를 손상시키는 자유 라디칼의 형성을 촉매할 수 있다.
자유 라디칼은 생체 분자에 구조적인 손상을 일으키기 때문에 살아있는 유기체에게 유독하다. 분자의 손상은 유전적 암호의 변화, 세포막의 고유성 파괴, 신경계 질환, 내분비계 불균형, 알러지 반응 증가, 혈관 내피 파괴, 및 관절 퇴화 및 염증을 일으킬 수 있다.
자유 라디칼의 유해한 영향으로부터의 보호는 항산화 물질이라 불리는 다양한 범위의 분자에서 발견된다. 자유 라디칼 및 이들의 연쇄 부산물은 항산화 물질에 의해 중화되고 보다 덜 해로운 생성물로 전환될 수 있다. 항산화 물질은 효소(예를 들어, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제), 필수 영양소(예를 들어, 베타 카로틴, 비타민 C 및 E, 셀레늄) 또는 다양한 내인성 화합물(예를 들어, 글루타티온) 또는 식이 화합물(예를 들어, 바이오플라바노이드)일 수 있다. 따라서, 신체는 자유 라디칼의 수개의 자연적인 퀀처(quencher)를 가지고 있다.
사람에서의 연구는, 항산화성 영양물 섭취 부족이 암, 심혈관 질환, 관절염, 백내장 등의 위험성을 상승시키는 것과 관련이 있음을 나타낸다. 또한, 항산화성 영양물을 보다 더 많이 섭취하는 것은 만성 퇴행성 질환의 발병율을 낮추는 것과 관련이 있다. 고무적인 한 연구는 항산화성 영양물 공급을 겸비하면 사람의 치료에 유리할 수 있다고 지적한다.
항산화 상태의 실험실 분석은 여러 가지 이유 때문에 정형화되어 있지 않다. 자유 라디칼은 매우 순간적이므로 일반적으로는 직접 측정을 할 수 없다. 혈청 또는 뇨중에 있는 과산화지질, 말론디알데히드(MDA) 또는 티오바비투르산-반응 물질(TBARS)과 같은 자유 라디칼 손상의 부산물은 측정할 수 있다. 그러나, 이러한 시험은(대부분 다중 불포화 지질 및 핵산과 같이) 특정 종류의 생분자에 대한 손상만을 반영하는 산화성 스트레스의 지시물일 수 있다. 그러나, 혈청 또는 세포내에 있는 항산화성 영양물 농도 및 세포에서의 항산화 효소 활성의 측정 방법으로 특정 화합물의 농도가 불충분한 것을 확인할 수 있다.
글루타티온은 세포질, 핵 및 미토콘드리아 내에 풍부하게 들어있는 뛰어난 세포내 항산화 물질이다. 글루타티온은 강력한 항산화 기능 외에도, 수많은 생체이물(xenobiotic) 및 발암 화합물을 신체가 제거할 수 있도록 하는 강력한 항독소로서 작용한다. 또한, 글루타티온은 세포-매개된 면역 기능에 필수적이고, 적혈구의 고유성을 유지하는데 중요하다. 또한, 글루타티온 시스템에서의 결핍은 심각한 세포내 노화를 초래하여 결국 세포 치사를 일으키는 것으로 일반적으로 인지되어 있다.
세포내 글루타티온의 농도는 항산화 기능에 중요한 영향을 미치며, 영양 제한, 운동 및 산화성 스트레스는 세포내 글루타티온 농도에 상당한 영향을 미친다. 산화 조건하에서, 글루타티온 기능은 생체이물과의 결합을 통해 상당히 저하되고, 병에 걸린 세포로부터의 글루타티온 결합체 및 글루타티온 디설파이드의 분비에 의해 상당히 저하될 수 있다. 상당량의 글루타티온은 심한 산화성 스트레스 과정 동안에 단백질에 결합될 수 있다. 그러나, 다행히도 N-아세틸-시스테인과 같은 화합물이 세포내 글루타티온 기능을 증가시키는 데에 유용하다.
글루타티온은 ATP, 마그네슘, 및 글리신, 글루타메이트 및 시스테인의 세 가지 아미노산을 이용하는 일련의 생화학 반응으로 합성된다. 일반적으로, 감마-글루타밀시스테인의 합성 속도는 글루타티온의 합성 속도를 결정하고, 시스테인의 설프하이드릴 그룹은 생물학적 효능을 갖는 글루타티온을 제공한다. 따라서, 시스테인 이용가능성의 측정은, 글루타티온의 기능적 이용가능성을 측정하고 항산화 기능을 분석하는데 필수적이다.
시스테인 및 글루타티온의 분석은 셀레늄 결핍을 분석하는데에도 유용하다. 글루타티온이 항산화제로서 작용할 경우, 이는 과산화수소와 반응하여, 글루타티온 퍼옥시다제에 의해 촉매된 반응에서 글루타티온 디설파이드를 형성한다. 글루타티온 퍼옥시다제는 기능성 보조 인자로서 셀레늄을 필요로한다. 따라서, 결핍되었거나 평균적인 SPECTROXTM결과와 결합된 적절한 시스테인 기능은 세포내 셀레늄 결핍을 나타내고 추가의 시험을 요하게 된다.
선행 기술에서는, 사람에 있어서 시스테인 및 글루타티온의 세포내 기능의 수준을 생화학적으로 분석하기 위한, 간단하고 비용면에서 효율적인 수단이 부족하기 때문에, 산화성 스트레스를 다루는 개인의 능력을 분석하는 수단이 부족하다. 본 발명은 당 업계의 이러한 오래지속되어온 필요성 및 욕구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명의 목적은, 임파구에서 글루타티온의 세포내 기능 수준, 영양 결핍, 부적절성 및 불균형을 측정하고, 임파구의 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는데 효과적임을 특징으로하는, 글루코오스 또는 세포내에서 글루코오스를 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 탄수화물; 생물학적으로 이용가능한 형태의 판토텐산(pantothenic acid), 콜린 또는 세포에서 콜린을 생성할 수 있는 생물학적으로 이용가능한 형태의 물질; 생물학적으로 이용가능한 형태의 염화물, 인산염, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 철을 포함하는 무기 이온; L-부티오닌-[S.R.]-설폭스이민; 탈이온수; 및 분석될 임파구를 자극하기 위한 유효량의 유사분열물질을 포함하고 pH가 약 6.8 내지 7.6인 무혈청 완충 용액(buffered, serum-free solution)을 함유하는, 상기 임파구에서 글루타티온의 세포내 기능의 수준을 측정하고 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는데 유용한 세포 배양 배지(cell culture medium)를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 가지 양태는, 본 발명의 세포 배지를, 생물학적으로 이용가능한 형태의 아미노산 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보충 영양물로 보충하는 것을 포함하고, 여기서 시험될 영양물은 상기 보충 영양물에 존재하기 않거나 한정량 또는 억제량으로 존재한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 세포 배양 배지에 시험될 개인의 임파구를 접종하는 단계; 접종된 세포 배양 배지를 항온처리하는 단계; 및 임파구의 반응을 개인의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 개인의 글루타티온의 세포내 기능의 수준을 측정하고 세포 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 영양 결핍, 부적절성 및 불균형을 측정하고 임파구의 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는데 효과적임을 특징으로하는, 글루코오스 또는 세포내에서 글루코오스를 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 탄수화물; 생물학적으로 이용가능한 형태의 판토텐산, 콜린 또는 상기 세포에서 콜린을 생성할 수 있는 생물학적으로 이용가능한 형태의 물질; 생물학적으로 이용가능한 형태의 염화물, 인산염, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 철을 포함하는 무기 이온; 큐멘 하이드로퍼옥사이드; 탈이온수; N-아세틸-L-시스테인; 및 분석될 임파구를 자극하기 위한 유효량의 유사분열물질을 포함하고 pH가 약 6.8 내지 7.6인 무혈청 완충 용액을 함유하는, 사람의 임파구에서 시스테인의 세포내 기능의 수준을 측정하고 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는데 유용한 세포 배양 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 가지 양태는, 본 발명의 세포 배지를 생물학적으로 이용가능한 형태의 아미노산 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보충 영양물로 보충하는 것을 포함하고, 여기서 시험될 영양물은 상기 보충 영양물에 존재하지 않거나 한정량 또는 억제량으로 존재한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 세포 배양 배지에 시험될 개인의 임파구를 접종하는 단계; 접종된 세포 배양 배지를 항온처리하는 단계; 및 임파구의 반응을 개인의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 개인의 시스테인의 세포내 기능의 수준을 측정하고 세포 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태, 특징 및 이점은 하기하는 본 발명의 바람직한 양태의 설명으로부터 명백해질 것이다. 이들 양태는 본 발명을 구체화할 목적으로 주어진 것이다.
본 발명은 사람 임파구내의 시스테인 및 글루타티온의 세포내 기능 수준을 생화학적으로 분석하기에 유용한 방법에 관한 것이다. 이러한 분석은 주변 임파구내의 개인의 항산화 시스템의 생리학적 건강 상태를 반영한다. 본 발명의 방법은 사람 임파구내에서 시스테인 및 글루타티온의 세포내 기능의 정밀한 분석을 가능하게 하여 개인의 항산화 측면을 개선시킬 수 있는 치료 수단을 수득할 수 있게 한다.
임파구를 이용하는 본 방법은, 임파구가 (1) 세포-매개 면역계에서 주도적이고, 이의 성장을 자극하는 것이 용이하고(마이토제네시스, mitogenesis); (2) 시간 평균적인, 장기간 영양 상태를 반영하고(임파구의 수명은 약 6개월이다); (3) 다른 세포와 공통적인 대사 경로를 가지고 있으며; (4) 표준 정맥천자에 의해 용이하게 수집되기 때문에 뛰어난 이점을 제공한다.
시스테인 및 글루타티온의 세포내 기능을 분석하기 위해 임파구 성장을 측정함으로써, 본 발명의 방법은 매우 다양한 각 환자의 독특한 측면을 반영한다. 따라서 소위 표준으로 측정된 "평균" 환자가 아닌 개인의 특정한 생화학 요건에 맞게 치료를 조절할 수 있다.
본 발명의 범위와 요지로부터 벗어나지 않고 설명되는 발명에 다양한 치환 및 개질을 수행할 수 있음은 당 업계의 숙련가에게는 자명할 것이다.
본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위해서, 아래에서 실시예를 들어 설명하지만, 어떠한 방법으로도 본 발명이 한정되지는 않는다.
실시예 1
환자의 혈액 채취
본 발명의 방법에는, 산-시트레이트-덱스트로오스로 보존된 2개의 10ml 전혈 샘플이 필요하다. 금식은 요하지 않는다. 혈액 채취 공급처만 있으면 된다. 본 발명의 검정을 수행하거나, 환자의 혈액을 실온에서 적합한 실험실로 운반해야 한다. 혈액을 원심분리시킬 필요는 없다. 종합적인 시험 결과는 환자의 글루타티온 또는 시스테인 측면의 과학적으로 기본을 둔 확실한 분석법을 제공한다.
실시예 2
샘플 처리: 세포 분리
샘플 멸균을 확실히 하기 위해서 층류 후드하에서 멸균 기술을 사용하여 모든 절차를 수행한다. 각 환자의 혈액 샘플은 실험실에서 접수하자마자 수납 번호를 정한다. 이 수납 번호는 처리를 통한 추적, 데이타 수집 및 데이타 분석 단계를 수행하기 위한 샘플 번호로 사용한다. 환자 샘플을 처리하는 것에 관여한 모든 시험관, 원심분리관, 미세역가 플레이트 및 데이타 인쇄물에 이 샘플 (수납) 번호로 표시한다.
각 환자 샘플은 각각 8ml의 전혈을 함유한 두 개의 산-시트레이트-덱스트로오스(노란색 상부) 바큐테이너(bacutainer) 유형의 관으로 이루어져 있다. 수납(샘플) 번호를 지정한 후, 전혈을 6회 역으로 혼합한다. 전혈 시험관 2개를 50ml짜리 일회용 원심분리관에서 혼합한다.
각 샘플로부터 분취량 500㎕를 무균적으로 꺼내어 12×17mm 관에 넣는다. 이 분취량을 사용하여 쿨터(Coulter) 세포 계수기(Model T540)에서 전혈 세포 수를 측정한다. 쿨터 세포 계수기로부터 인쇄되어 나온 전혈 세포 수에 수납 번호를 표시하고 그 환자의 작업 계획표에 부착한다.
각각의 15ml의 원뿔형 원심분리관에 히스토파크(Histopaque) 1077[미국 미조리주 세인트 루이스 시그마 케미칼 사(Sigma Chemical Company) 제품, 피콜(Ficoll)/나트륨 다이아트리조에이트] 5.0ml를 첨가함으로써 각 샘플에 대한 피콜 구배관 2개를 준비한다. 10ml 피펫과 전기 피펫의 보조물을 사용하여, 전혈 8ml를 각 피콜 구배관에서 서서히 층상으로 분리한다. 피콜 구배관의 뚜껑을 덮고 2160RPM으로 20분 동안 원심분리시킨다.
원심분리가 완료된 후, 구배가 흐트러지지 않도록 구배관을 원심분리기로부터 조심스럽게 꺼낸다. 중간 피콜층의 경계면에서 발견된 (임파구를 함유하는) 담황색 막을 15ml 일회용 원뿔형 원심분리관으로 5ml 피펫을 사용하여 옮긴다. 담황색 막을 인산염 완충된 염수-0.72% 글루코오스 용액(PBS-G)과 혼합하여 최종 용적이 12ml가 되게한다. 시험관의 뚜껑을 덮고 6회 역으로 혼합하여 상기 담황색 막과 PBS-G를 혼합한다.
상기 담황색 막과 PBS-G를 함유하는 시험관을 2160RPM으로 5분 동안 원심분리한다. 원심분리 후, 상층액을 세포 펠릿으로부터 흡입하고 버린다. 세포 펠릿을 PBS-G 12ml에 재현탁시킨 다음, 세포 펠릿의 적절한 분산을 위해서 6회 역으로 혼합한다. 그 다음, 샘플을 상기 설명한 바와 같이 다시 원심분리시킨다.
두 번째 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 버린다. 세포 펠릿을 PBS-G 6.0ml에 재현탁시킨다. 세포 펠릿을 파쇄하여, 전기 피펫 보조물에 부착된 5ml 피펫을 사용하여 PBS-G와 혼합한다. 균질한 세포 현탁액을 수득한 후, 200㎕의 현탁액 분취량을 12×75mm 관으로 옮긴다. 쿨터 세포 계수기(T540 모델)를 사용하여 초기 세포 현탁액(ICS) 계수를 수행하기 위해 이 분취량을 사용한다.
이 분취량의 계수 결과 인쇄물에 샘플 번호를 표시하고 작업 계획서에 부착한다. 임파구 수가 1입방 mm당 3.9 내지 1.2×103개의 세포(THSD/mm3)이면, 이 샘플을 플레이트에 접종할 준비를 한다. 첨가될 세포 현탁액의 용적은 표 1 및 표 4에 나타내었다. 임파구 수가 3.9 THSD/mm3보다 많으면, 그 샘플은 다시 희석시켜야 한다. 그러나, 임파구 수가 1.2 THSD/mm3보다 적으면, 그 샘플은 불합격시킨다.
아래의 수학식을 사용하여 적절한 재희석에 필요한 추가의 PBS-G의 양을 결정한다:
C1'V1= C2V2
C = 임파구 농도 (THSD/mm3)
V = 용적
상기식에서, C2는 3.0 THSD/mm3이며, 이는 최종 세포 현탁액의 목적하는 임파구의 농도이다. 예를 들면, 6.0ml의 초기 세포 현탁액 계수(count)인 LY#가 5.6 THSD/mm3일 경우,
C1'V1= C2V2에서
(5.6)(6.0ml) = (3.0)(X)
X = 11.2ml (최종 용적).
PBS-G의 적절한 용적을 11.2ml의 최종 용적을 수득하기 위해 재현탁 세포에 가한다. 상기한 예에서, 5.2ml를 초기의 6.0ml에 첨가하여 11.2ml를 수득한다. ICS에 PBS-G의 필요한 용적을 첨가하여 최종 세포 현탁액(FCS)을 만든다. LY# 계수 및 PBS-G 용적을 SPECTROXTM시험 계획표에 기록한다.
재희석시킨 후, 재희석된 세포 현탁액의 분취량 200㎕를 새로운 12×75mm 시험관에 옮기고 상기 설명한 바와 같이 세포 계수를 수행한다. 재현탁된 세포 현탁액 인쇄물(최종 세포 현탁액 LY#)을 작업 계획표에 부착하고 접종 용적을 기록한다.
실시예 3
글루타티온 농도의 분석
A. 플레이트 접종
최종 세포 현탁액을 멸균 트로프(trough)에 넣고 배지를 함유하는 미세역가 플레이트를 층류 후드 안에 넣는다. 멸균된 0 내지 50㎕ 배리어 팁이 장착된 12채널 수동 마이크로피펫터를 사용하여, 최종 세포 현탁액의 규정량(표 1에 따름)을 플레이트의 각 웰에 분산시킨다.
열거된 최종 세포 현탁액 임파구 수(LY#)를 기준으로 하여 플레이트 접종을 위해 하기의 용적을 사용함
최종 세포 현탁액 LY# 접종을 위해 조절된 용적
3.9-3.73.62.5-3.52.42.32.22.12.01.91.81.71.61.51.41.3〈=1.2 8.0㎕8.5㎕10.0㎕12.5㎕13.0㎕14.0㎕14.5㎕15.0㎕16.0㎕17.0㎕18.0㎕19.0㎕20.0㎕21.5㎕23.0㎕25.0㎕
배지에 세포를 첨가한 후, 플레이트를 덮고 37℃에서 96시간 동안 유지된 CO2항온기에 넣는다.
B. 표지(labeling)
방사성 동위원소실에서 모든 표지 절차를 수행한다. 삼중수소화 티미딘(H3-TdR) 작업 용액을 냉장고로부터 꺼내고 수욕에서 37℃로 가온시킨다. 96시간 후, 미세역가 플레이트를 항온기로부터 꺼낸다. H3-TdR 작업 용액을 멸균 트로프에 넣고, 0 내지 50㎕ 멸균 배리어 팁이 장착된 12채널 수동 마이크로피펫터를 사용하여 H3-TdR 작업 용액 10㎕를 미세역가 플레이트의 각 웰에 분산시킨다. 이 플레이트를 37℃ 항온기로 24시간 동안 반환시킨다. 날짜와 표지를 수행하는 작업자 이름 머릿 글자를 샘플 작업지 위에 기록한다.
C. 수거
방사성 동위원소실에서 모든 수거 절차를 수행한다. 단일 유리섬유 필터 매트(패커드 파트 번호 6005416호)에, 2호 연필을 사용하여 샘플 번호를 표시한다. 진공 펌프를 켜고 100℃로 셋팅된 오븐에서 건조시킨다. 수거기에 부착된 증류수 대형 유리병을 채운다. H3-TdR을 첨가한 지 24시간 후 항온기로부터 미세역가 플레이트를 꺼낸다. 날짜와 수거를 수행하는 작업자 이름 머릿 글자를 샘플 작업지 위에 기록한다.
O-링의 노출된 개방 위치에 있는 세포 수거기(패커드 모델 번호 C9619)를 사용하여, O-링이 접촉하는 조면의 수거기 위에 유리섬유 필터 매트를 놓는다. 세포 수거기를 폐쇄하고, 세정 트레이로부터의 증류수를 사용하여 필터 매트를 적신다. 수거기를 진공 사이클(VAC) 상에 놓는다. 미세역가 플레이트로부터 뚜껑을 제거하고, 플레이트를 수거기 프로브 팁에 놓는다. 프로브의 팁이 플레이트의 바닥에 닿을 때까지, 수거기 프로브 위로 플레이트를 서서히 들어올린다. 미세역가 플레이트를 서서히 원 운동시킴으로써 프로브 팁을 사용하여 흡입된 배지가 있는 웰의 바닥을 세척한다. 10초 동안 계속 세척한다. 수거기 프로브 팁과 접하는 미세역가 플레이트에서 계속 세척하고 10초 동안 "세척(WASH)" 단추를 누른다. 웰로부터 액체를 흡입하고 상기 세척 단계를 반복한다. 플레이트를 제거하고, 세정 트레이를 메탄올로 채우고, 세정 트레이를 들어올리고 메탄올을 흡입하고 그 세정 트레이를 내려놓는다.
상부에 부착된 필터 매트를 사용하여 수거기를 개방하고, 5초 동안 VAC를 계속 작동시킨다. 5초 후에, VAC를 끄면서 동시에 수거기 표면으로부터 필터 매트를 제거한다. 필터 매트를 10분 동안 건조 오븐에서 조면이 위로 가도록 놓는다. 오븐으로부터 필터 매트를 제거하고 실온으로 냉각시킨다.
D. 방사능 계수(counting)
방사성 동위원소실에서 모든 계수 절차를 수행한다. 필터 매트를 조면이 위로 가도록 계수 카세트에 장치한다. 제자리에서 필터 매트를 고정하는 얇은 스테인레스강판의 콜리메이터(collimater)를 필터 매트 위에 놓는다. 카세트를 패커드 매트릭스 9600 베타 입자 방사능 계수기에 장착하고, Q-가스(헬륨 중 1.3% n-부탄)를 매트릭스 9600으로 유입시킨다. "시작(START)" 단추를 눌러서 측정 프로토콜을 작동시키고, 3분 동안 각 웰 내에서의 총 방사능을 계수한다. 각 샘플의 계수 결과를 매트릭스 9600의 하드 드라이브에 저장한다. 또한, 원래 방사능 계수값의 하드 카피를 인쇄한다.
E. 데이타 변환
3.5디스켓 상에 매트릭스 9600 하드 드라이브로부터 데이타를 다운로드받는다. 마이크로소프트 엑셀에서 실행되는 마크로를 사용하여 보고할 수 있는 포맷으로 원래의 데이타를 변환시킨다. 이 마크로로, 각 데이타 지점으로부터 플레이트 배경값을 빼고, 삼중 웰 값의 평균값을 계산하고, 100%에 상응하게 셋팅된 플레이트 대조값의 백분율 값으로서 상기한 값을 나타낸다.
F. 데이타 분석(정규화)
임파구 성장 반응 검정에 의해 글루타티온의 항산화 기능(GSH)을 측정한다. 5μM의 L-부티오닌-(S,R)-설폭스이민(BSO)을 함유하는, 화학적으로 정해진 무혈청 배지에 세포를 두고, 세포에 유사분열물질성 화합물을 첨가함으로써 성장을 자극한다.3H-티미딘 혼입에 의해 측정된 성장 반응은 대조군 성장의 백분율로서 표현한다. BSO는 글루타티온 합성에 필요한 글루타티온 트랜스퍼라제의 합성을 억제한다. 따라서, 배지에 BSO를 첨가하면, 임파구 내의 글루타티온의 상태를 나타내는 세포 성장의 변화에 의해 글루타티온 합성을 억제하는 것이 반영된다. 사용되는 BSO의 용량(5μM)은 1995년 설정되었다.
개인의 임파구 성장은 BSO가 있거나 없는 배지에서의 성장 백분율로서 표현한다. 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 100% 성장(BSO 부재시)에 대한 +BSO% 성장의 비를 계산한다. 1000명 이상의 환자의 결과 비를 입력하고, 표준 엑셀 프로그램으로 통계 분석을 수행하여 그 비의 평균값, 중간값, 범위 및 편차를 결정한다. ±2 표준편차 범위이외의 "영역외" 데이타를 집단 기준으로부터 제거한다. 나머지 데이타를 사용하여 기준점을 결정하고 집단 참조 범위를 설정한다. 이러한 집단 참조 범위는 산포도 분포로서 그래프로 나타낸다. 글루타티온에 대한 정규값/참조값을 85%보다 크게(〉85%) 결정하여, 85% 미만의 글루타티온 값을 갖는 사람을 글루타티온 결핍으로 분류한다.
G. 장치 및 시약
본 발명의 검정에 다음 장치를 사용한다: 층류 후드; 원심분리기(베크만 GS-6); 세포 계수기(Coulter 모델 T540); 12채널 피펫터(5-500㎕); 전기 피펫 펌프(드럼몬드); 마개가 있는 멸균된 50㎖ 원뿔형 플라스틱관; 12×75mm 폴리프로필렌 시험관; 마개가 있는 멸균된 15ml 원뿔형 플라스틱 원심분리관; 피펫(0-20㎕, 0-200㎕, 0-100㎕ 범위); 멸균된 일회용 유리 피펫(5.0ml, 10.0ml); 시험관 랙 및 에어로졸 배리어 피펫 팁(0-50㎕).
표 2a 및 2b는 본 발명의 방법에 사용된 다양한 시약 및 그들의 공급처를 나타낸 것이다.
시약
아데닌 하이드로클로라이드 시그마 A 8751
항생제 용액(PSF) 깁코 15245-012
아르기닌 하이드로클로라이드 시그마 A 5131
L-부티오닌-[S.R]-설폭스이민 시그마 B2515
d-비오틴 시그마 B 4501
염화칼슘 무수물 시그마 C 4901
콜린 클로라이드 시그마 C1879
큐멘 하이드로퍼옥사이드 시그마 C 0524
시아노코발아민(비타민B12) 시그마 V 2876
시스테인 하이드로클로라이드 무수물 시그마 C 1276
이나트륨EDTA 시그마 E 4884
황화제일철 5수화물 시그마 F 8633
폴린산, 칼슘염 시그마 F 7878
글루코오스 시그마 G 5767
글루코오스 용액(10%) 시그마 G 3126
L-글루타민 시그마 G 3126
글리신 시그마 G 7126
HEPES, 유리산 시그마 H 3375
L-히스티딘(HCL 1수화물) 시그마 H 8125
히스토파크(피콜/디아트리조에이트) 시그마 1077-1
하이드록소코발아민(HCI B12) 시그마 H 7126
미오-이노시톨 시그마 I 5125
L-이소류신 시그마 I 2752
L-류신 시그마 L 8000
L-라이신 시그마 L 5626
황산마그네슘 무수물 시그마 M 7506
무수 메탄올 VWR VWR4300-7
L-메티오닌 시그마 M 9625
시약
니아신아미드(비타민 B3) 시그마 N 3376
D-판토테네이트, 칼슘 시그마 P 0290
페놀 레드 용액, 0.5% PBS 시그마 P 0290
L-페닐알라닌 시그마 P 2126
인산염 완충된 염수 pH 7.4 시그마 P 3813
피토헤마글루티닌 PHA-P 시그마 L 8754
인산칼륨, 2염기 시그마 P 3786
피리독신(HCI(비타민 B6)) 시그마 P 9755
리보플라빈(비타민 B2) 시그마 R 4500
L-세린 시그마 S 4500
염화나트륨 시그마 S 9625
수산화나트륨, 5.0N 용액 VWR RS 415 1
나트륨 피루베이트 시그마 P 2256
나트륨 피루베이트 용액(100mM) 시그마 S8636
티아민(비타민 B1) 시그마 T 4625
L-트레오닌 시그마 T 8625
티미딘 시그마 T 9250
[3H]-티미딘 ICN 24066
L-트립토판 시그마 T 0254
L-티로신 시그마 T 3754
L-발린 시그마 V 0500
H. 용액
모든 용액은 조직 배양 등급 탈이온수(tcd H2O)를 사용하여 제조한다.
1. 인산염 완충된 염수
인산염 완충된 염수(PBS)+0.72% 글루코오스(PBS-G) 용액을 제조하기 위해서, tcd H2O를 사용하여 패키지 지침서에 따라 PBS를 제조한다. 충분한 10% 글루코오스 용액을 첨가하여 0.72%의 최종 글루코오스 농도를 수득한다. 이 용액을 여과하여 멸균시키고, 냉장고(2 내지 8℃)에 저장한다.
2. 스톡 배지
다음과 같은 방법으로 농축된(2배) 스톡 배지를 제조한다: (1) HEPES 23.80g ; (2) 염화나트륨 14.02g; (3) 2염기성 인산칼륨 1.05g; (4) 황산마그네슘 0.241g; (5) 아데닌 하이드로클로라이드(10μM) 1.0ml ; (6) 나트륨 피루베이트(100mM) 30.0ml; (7) 0.5% 페놀 레드 0.5 ml; (8) 항생제 혼합물 5.0ml; (9) 5N 수산화나트륨 8.0ml; (10) Fe/EDTA(1.0mM FeSO4/0.4mM Na2EDTA) 20.0ml를 tcd H2O와 혼합한다. 모든 물질을 완전히 혼합한 후, 5N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.60으로 조절한다. tcd H2O를 사용하여 최종 용적을 1.0리터로 만든다. 용액을 0.2μM 필터를 통해서 여과시킴으로써 멸균시키고 4℃ 냉장고에 보관한다. 용액의 안정성은 4주일이다.
3. 기본 배지
100% 플레이트 대조용으로 사용되는 기본 배지 및 본 발명의 신규한 방법은 다음과 같이 제조한다: 여과시킨 후, 멸균 기술을 사용해야한다. 층류 후드 하에서 기본 배지를 제조하고, 표 3에 기재된 성분을 혼합하고 tcd H2O를 사용하여 원하는 최종 용적으로 만든다. 이 용액을 진공 여과시킴으로써 멸균 병으로 멸균시킨다. 적정 용적의 PHA 원액을 첨가한다.
최종 용적 기본 배지(㎖)
원액 100㎖ 250㎖ 500㎖ 1000㎖ 1500㎖ 2000㎖
2x 스톡 배지(㎖) 50 125 250 500 750 100
티아민(B1) 스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
리보플라빈(B2) 스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
니아신아미드(B3) 스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
피리독신(B6) 스톡(㎕) 10 25 50 100 50 200
비타민 B12스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
제2 스톡 폴린(㎕) 10 25 50 100 150 200
판토테네이트 스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
비오틴 스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
글루코오스 스톡(㎖) 0.72 1.8 3.6 7.2 10.8 14.4
Chol/Ino 스톡(㎖) 1.0 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0
모든 아미노 스톡(㎖) 1.0 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0
CaCl2스톡(㎖) 0.5 1.25 2.5 5.0 7.5 10.0
PHA(㎖) 0.2 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
4. L-부티오닌-[S.R.]-설폭스이민(BS) 작업 용액 제조(5μM/ℓ)
PBS-G 20ml에 BSO(시그마 B 2515) 0.2223g을 용해시켜 50mM의 BSO 원액을 제조한다. 이어서, 무균 기술을 사용하여 용액을 멸균 병으로 진공 여과시킴으로써 멸균시킨다. 멸균 PBS-G 900㎕에 50mM BSO 100㎕를 첨가하여 제2 BSO 원액(500μM)을 제조한다. 기본 배지 247.5ml에 500μM의 제2 BSO 원액 2.5ml를 첨가하고 잘 혼합하여 5μM의 BSO 작업 용액을 제조한다.
이 용액의 안정성은 1주일이다.
5. 티미딘(ThY) 원액
다음과 같이 차가운 티미딘 (ThY) 원액(1.33mM ThY, 0.322g/ℓ)을 제조한다: ThY(시그마 T 9250) 0.161g을 칭량하고, tcd H2O에 용해시켜서 최종 용적을 500ml로 만든다. 이 용액을 무균 기술을 사용하여 멸균 병으로 진공 여과시킴으로써 멸균시킨다. 이 용액을 50ml 원심분리관에 나눠넣는다. 단기간 저장하기 위해서, 용액은 1달 동안 안정하게 냉장시킬 수 있다(4℃). 장기간 보관할 경우에는, 용액을 6개월 안정하게 냉동보관(-70℃)할 수 있다. 세포의 표지를 위해 방사능 티미딘(H3TdR)을 희석시키는데는 티미딘 작업 용액을 사용해야 한다.
티미딘 작업 용액, ThY +3H-TdR을 제조하기 위해서, 다음의 화학 물질을 멸균되고 탈기된 tdc H2O 300ml에 첨가한다: 1.33mM ThY(냉각) 1.15ml, 300μCi/mmol의 비방사능을 갖는3H-TdR(ICN 파트 번호 24066) 1.70ml. 일단 제조한 용액은 1주일 동안 냉장 조건(4℃)에서 보관할 수 있다.
실시예 4
시스테인 농도 분석
A. 플레이트 접종
최종 세포 현탁액을 멸균 트로프에 넣고, 배지를 함유하는 미세역가 플레이트를 층류 후드 안에 넣는다. 멸균된 0 내지 50㎕ 배리어 팁이 장착된 12채널 수동 마이크로피펫터를 사용하여, 최종 세포 현탁액의 규정량(표 4에 따름)을 플레이트의 각 웰에 분산시킨다.
열거된 최종 세포 현탁액 임파구 수(LY#)를 기준으로 하는 플레이트 접종을 위해 하기한 용적을 사용함
최종 세포 현탁액 LY# 접종을 위해 조절된 용적
3.9-3.73.62.5-3.52.42.32.22.12.01.91.81.71.61.5.41.3〉=1.2 8.0㎕8.5㎕10.0㎕12.5㎕13.0㎕14.0㎕14.5㎕15.0㎕16.0㎕17.0㎕18.0㎕19.0㎕20.0㎕21.5㎕23.0㎕25.0㎕
배지에 세포를 첨가한 후, 3줄의 플레이트에 1열 내지 9열에, 10㎕의 N-아세틸-L-시스테인 (최종 농도로서 150mM) 용액을 첨가한다.
또 다른 6줄의 플레이트의 1열 내지 3열에서, 200μM 큐멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH) 10㎕를 첨가한다. 6줄의 플레이트의 4열 내지 6열에 300μM 큐멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH) 10㎕를 첨가한다. 6줄의 플레이트의 7열 내지 9열에 400μM의 큐멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH) 10㎕를 첨가한다. 플레이트에 CuOOH를 첨가한 후, 플레이트를 덮고, 37℃에서 96시간 동안 유지된 CO2항온기에 넣는다.
B. 표지
방사성 동위원소실에서 모든 표지 절차를 수행한다. 삼중수소화 티미딘(H3-TdR) 작업 용액을 냉장고로부터 꺼내고 수욕에서 37℃로 가온시킨다. 96시간 후, 미세역가 플레이트를 항온기로부터 꺼낸다. H3-TdR 작업 용액을 멸균 트로프에 넣고, 0 내지 50㎕ 멸균 배리어 팁이 장착된 12채널 수동 마이크로피펫터를 사용하여 H3-TdR 작업 용액 10㎕를 미세역가 플레이트의 각 웰에 분산시킨다. 이 플레이트를 37℃ 항온기로 24시간 동안 반환시킨다. 날짜와 표지를 수행하는 작업자 이름 머릿 글자를 샘플 작업지 위에 기록한다.
C. 수거
방사성 동위원소실에서 모든 수거 절차를 수행한다. 단일 유리섬유 필터 매트(패커드 파트 번호 6005416호)에, 2호 연필을 사용하여 샘플 번호를 표시한다. 진공 펌프를 켜고 100℃로 셋팅된 오븐에서 건조시킨다. 수거기에 부착된 증류수 대형 유리병을 채운다. H3-TdR을 첨가한 지 24시간 후 항온기로부터 미세역가 플레이트를 꺼낸다. 날짜와 수거를 수행하는 작업자 이름 머릿 글자를 샘플 작업지 위에 기록한다.
O-링이 노출된 개방 위치에 있는 세포 수거기(패커드 모델 번호 C9619)를 사용하여, O-링이 접촉하는 조면의 수거기 위에 유리섬유 필터 매트를 놓는다. 세포 수거기를 폐쇄하고, 세정 트레이로부터의 증류수를 사용하여 필터 매트를 적신다. 수거기를 진공 사이클(VAC) 상에 놓는다. 미세역가 플레이트로부터 뚜껑을 제거하고, 플레이트를 수거기 프로브 팁하에 둔다. 프로브의 팁이 플레이트의 바닥에 닿을 때까지, 수거기 프로브 위로 플레이트를 서서히 들어올린다. 미세역가 플레이트를 서서히 원운동시킴으로써 프로브 팁을 사용하여 흡입된 배지가 있는 웰의 바닥을 세척한다. 10초 동안 계속 세척한다. 수거기 프로브 팁과 접하는 미세역가 플레이트에서 계속 세척하고, 10초 동안 "세척(WASH)" 단추를 누른다. 웰로부터 액체를 흡입하고 상기 세척 단계를 반복한다. 플레이트를 제거하고, 세정 트레이를 메탄올로 채우고, 세정 트레이를 들어올리고 메탄올을 흡입하고 그 세정 트레이를 내려놓는다.
상부에 부착된 필터 매트가 있는 수거기를 개방하고 5초 동안 VAC를 계속 작동시킨다. 5초 후에, VAC를 끄면서 동시에 수거기 표면으로부터 필터 매트를 제거한다. 필터 매트를 10분 동안 건조 오븐에서 조면이 위로 가도록 놓는다. 오븐으로부터 필터 매트를 제거하고 실온으로 냉각시킨다.
D. 방사능 계수(counting)
방사성 동위원소실에서 모든 계수 절차를 수행한다. 필터 매트를 조면이 위로 가도록 계수 카세트에 장치한다. 제자리에서 필터 매트를 고정하는 얇은 스테인레스강판의 콜리메이터를 필터 매트 위에 놓는다. 카세트를 패커드 매트릭스 9600 베타 입자 방사능 계수기에 장착하고, Q-가스(헬륨 중 1.3% n-부탄)를 매트릭스 9600으로 유입시킨다. "시작(START)" 단추를 눌러서 측정 프로토콜을 작동시키고, 3분 동안 각 웰 내에서의 총 방사능을 계수한다. 각 샘플의 계수 결과를 매트릭스 9600의 하드 드라이브에 저장한다. 또한, 원래 방사능 계수값의 하드 카피를 인쇄한다.
E. 데이타 변환
3.5 디스켓 상에 매트릭스 9600 하드 드라이브로부터 데이타를 다운로드받는다. 마이크로소프트 엑셀에서 실행되는 마크로를 사용하여 보고할 수 있는 포맷으로 원래의 데이타를 변환시킨다. 이 마크로로, 각 데이타 지점으로부터 플레이트의 배경값을 빼고, 삼중 웰 값의 평균값을 계산하고, 100%에 상응하게 셋팅된 플레이트 대조값의 백분율 값으로서 상기한 값을 나타낸다.
F. 데이타 분석(정규화)
이 시험은 세포의 항산화 능력의 한 가지 측정 방법인 세포내 시스테인 농도를 분석하는 것이다. 유사분열물질에 의해 성장하도록 자극받은 임파구를 사용하여 큐멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH)의 존재하에, 시스테인의 존재 또는 부재하에, 임파구 성장 반응에서의 차이를 비교함으로써 항산화 기능을 표현한다. CuOOH는 개인 환자에서 전체 항산화 상태를 측정하는데 사용되는 산화성 스트레스를 생성한다. 배지에 시스테인을 첨가하여 CuOOH에 의해 발생된 산화성 스트레스로 야기되는 손상을 치유하는 능력을 갖는 항산화제를 제공한다. CuOOH 및 시스테인의 양은 각각 300μM 및 150μM이다.
개인의 임파구 성장을 CuOOH 또는 시스테인 + CuOOH를 갖는 배지에서의 성장 백분율로서 표현한다. 마이크로 엑셀을 사용하여 CuOOH % 성장에 대한 시스테인 + CuOOH 성장의 비를 계산한다. 1000명 이상의 환자의 결과 비를 입력하고, 표준 엑셀 프로그램으로 통계 분석을 수행하여 그 비의 평균값, 중간값, 범위 및 편차를 결정한다. ±2 표준편차 범위 이외의 "영역외" 데이타를 집단 기준으로부터 제거한다. 나머지 데이타를 사용하여 기준점을 결정하고 집단 참조 범위를 설정한다. 이러한 집단 참조 범위를 산포도 분포로서 그래프로 나타낸다. 시스테인에 대한 정규값/참조값을 127%보다 크게(〉127%) 결정하여, 127% 미만의 시스테인 값을 갖는 사람을 시스테인 결핍으로 분류한다.
G. 장치 및 시약
본 발명의 검정에 다음 장치를 사용한다: 층류 후드; 원심분리기(베크만 GS-6); 세포 계수기(Coulter 모델 T540); 12채널 피펫터(5-500㎕); 전기 피펫 펌프(드럼몬드); 마개가 있는 멸균 50㎖ 원뿔형 플라스틱관; 12×75mm 폴리프로필렌관; 마개가 있는 멸균 15ml 원뿔형 플라스틱 원심분리관; 피펫(0-20㎕, 0-200㎕, 0-100㎕ 범위); 멸균 유리 일회용 피펫(5.0ml, 10.0ml); 시험관 랙 및 에어로졸 배리어 피펫 팁(0-50㎕).
표 5a 및 5b는 본 발명의 방법에 사용된 다양한 시약 및 그들의 공급처를 나타낸 것이다.
시약
아데닌 하이드로클로라이드 시그마 A 8751
항생제 용액(PSF) 깁코 15245-012
아르기닌 하이드로클로라이드 시그마 A 5131
N-아세틸-L-시스테인 시그마 A 8199
d-비오틴 시그마 B 4501
염화칼슘 무수물 시그마 C 4901
콜린 클로라이드 시그마 C 1879
큐멘 하이드로퍼옥사이드 시그마 C 0524
시아노코발아민(비타민 B12) 시그마 V 2876
시스테인 하이드로클로라이드 무수물 시그마 C 1276
이나트륨 EDTA 시그마 E 4884
황화제일철 5수화물 시그마 F 8633
폴린산, 칼슘염 시그마 F 7878
글루코오스 시그마 G 5767
글루코오스 용액(10%) 시그마 G 3126
L-글루타민 시그마 G 3126
글리신 시그마 G 7126
HEPES, 유리산 시그마 H 3375
L-히스티딘(HCl 1수화물) 시그마 H 8125
히스토파크(피콜/디아트리조에이트) 시그마 1077-1
하이드록사코발아민(HCI(B12)) 시그마 H 7126
미오-이노시톨 시그마 I 5125
L-이소류신 시그마 I 2752
L-류신 시그마 L 8000
L-라이신 시그마 L 5626
황산마그네슘 무수물 시그마 M 7506
무수 메탄올 VWR VWR4300-7
L-메티오닌 시그마 M 9625
시약
니아신아미드(비타민 B3) 시그마 R 3376
D-판토테네이트 칼슘 시그마 P 0290
페놀 레드 용액, 0.5% PBS 시그마 P 0290
L-페닐알라닌 시그마 P 2126
인산염 완충된 염수 pH 7.4 시그마 P 3813
피토헤마글루티닌 PHA-P 시그마 L 8754
인산칼륨, 이염기 시그마 P 3786
피리독신(HCI(비타민 B6)) 시그마 P 9755
리보플라빈(비타민 B2) 시그마 R 4500
L-세린 시그마 S 4500
염화나트륨 시그마 S 9625
수산화나트륨, 5.0N 용액 VWR RS 4151
나트륨 피루베이트 시그마 P 2256
나트륨 피루베이트 용액(100mM) 시그마 S 8636
티아민(비타민 B1) 시그마 T 4625
L-트레오닌 시그마 T 8625
티미딘 시그마 T 9250
[3H]-티미딘 ICN 24066
L-트립토판 시그마 T 0254
L-티로신 시그마 T 3754
L-발린 시그마 V 0500
H. 용액
모든 용액은 조직 배양 등급 탈이온수(tcd H2O)를 사용하여 제조한다
1. 인산염 완충된 염수
인산염 완충된 염수(PBS)+0.72% 글루코오스(PBS-G) 용액을 제조하기 위해서, tcd H2O를 사용하여 패키지 지침서에 따라 PBS를 제조한다. 충분한 10% 글루코오스 용액을 첨가하여, 0.72%의 최종 글루코오스 농도를 수득한다. 이 용액을 여과에 의해 멸균시키고, 2 내지 8℃의 냉장고에 저장한다.
2. 스톡 배지
다음과 같은 방법으로 농축된(2배) 스톡 배지를 제조한다: (1) HEPES 23.80g; (2) 염화나트륨 14.02g; (3) 2염기 인산칼륨 1.05g; (4) 황산마그네슘 0.241g; (5) 아데닌 하이드로클로라이드(10μM) 1.0ml ; (6) 나트륨 피루베이트(100mM) 30.0ml; (7) 0.5% 페놀 레드 0.5ml ; (8) 항생제 혼합물 5.0ml; (9) 5N 수산화나트륨 8.0ml; (10) Fe/EDTA(1.0mM FeSO4/0.4mM Na2EDTA) 20.0ml를 tcd H2O와 혼합한다. 모든 물질을 완전히 혼합한 후, 5N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.60으로 조절한다. tcd H2O를 사용하여 최종 용적을 1.0리터로 만든다. 용액을 0.2μM의 필터를 통해서 여과에 의해 멸균시키고 4℃ 냉장고에 보관한다. 용액의 안정성은 4주일이다.
3. 기본 배지
100% 플레이트 대조용으로 사용된 기본 배지 및 본 발명의 신규한 방법은 다음과 같이 만들었다: 여과시킨 후, 멸균 기술을 사용해야한다. 층류 후드 하에서 기본 배지를 제조하고, 표 6에 기재된 성분을 혼합하고 tcd H2O를 사용하여 목적하는 최종 용적으로 만든다. 그 용액을 진공 여과에 의해 멸균시킴으로써 멸균 병에 넣는다. 적정 용적의 PHA 원액을 첨가한다.
최종 용적 기본 배지(ML)
원액 100ml 250ml 500ml 1000ml 1500ml 2000ml
2×스톡 배지(㎖) 50 125 250 500 750 1000
티아민(B1)스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
리보플라빈(B2)스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
니아신아미드(B3)스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
피리독신(B6)스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
비타민 B12스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
제2 스톡 폴린(㎕) 10 25 50 100 150 200
판토테네이트 스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
비오틴 스톡(㎕) 10 25 50 100 150 200
글루코오스 스톡(㎖) 0.72 1.8 3.6 7.2 10.8 14.4
chol/Ino 스톡(㎖) 1.0 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0
모든 아미노산 스톡(㎖) 1.0 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0
CaCl2스톡(㎖) 0.5 1.25 2.5 5.0 7.5 10.0
PHA(㎖) 0.2 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
4. 큐멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH) 원액
큐멘 하이드로퍼옥사이드(시그마 C 0524)는 제한된 수명을 갖는다. 이 물질의 수명 종료일은 시그마로부터 접수한 날짜로부터 3개월이다. 이 병으로부터 CuOOH를 피펫으로 담을 때 CuOOH의 점도가 증가되지 않도록 해야 주의해야 한다. 피펫 팁으로 액체를 완전히 흡입했는지 확인해야 한다. 피펫 팁을 적절히 채웠는지 확인하기 위해서는 주의와 시간을 요한다. 또한, 피펫 팁의 외부에 있는 과량의 CuOOH를 제거하기 위해 팁을 닦아내야 한다. 마찬가지로, CuOOH를 완전히 처치해야 한다. 이 방법에 따라, 3달 이하의 안정성을 갖는 냉장 조건(2 내지 8℃) 하에 용액을 저장할 수 있다.
제1 CuOOH 원액(PBS-G 중의 1.0M CuOOH)의 경우, 큐멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH) 9.5㎕를 PBS-G 990.5㎕와 혼합한다.
이 방법에 따라, 용액을 1개월 이하의 안정성을 가지는 냉장 조건(2 내지 3℃)하에서 저장할 수 있다.
세포를 분리시키기 전에, 제2 CuOOH 원액(PBS-G 중의 100mM)을 매일 제조해야 한다. 환자용 플레이트에 담기 위해 용액을 CuOOH 이동 플레이트(별도의 미세역가 플레이트)에 첨가한다. 용액을 밤새 보관해서는 안 된다. 제2 CuOOH 원액을 제조하기 위해서, 제1 원액을 PBS-G 1800㎕와 혼합한다. 작업 용액은 300μM의 CuOOH이며, 제2 CuOOH 원액 330㎕를 PBS-G 670㎕와 혼합한다.
5. 티미딘(ThY) 원액
다음과 같이 차가운 차가운 티미딘(ThY) 원액(1.33mM ThY, 0.322g/ℓ)을 제조한다: ThY(시그마 T 9250) 0.161g을 칭량하고, tcd H2O에 용해시켜서 최종 용적을 500ml로 만든다. 그 용액을 무균 기법을 사용하여 멸균 병으로 진공 여과시킴으로써 멸균시킨다. 그 용액을 50ml 원심분리관에 나눠넣는다. 단기간 저장하기 위해서, 용액을 1달 동안 안정하게 4℃ 냉장고에 보관한다. 장기간 보관할 경우에는, 용액은 6개월 동안 안정하게 냉동보관(-70℃)한다. 세포의 표지를 위해 방사능 티미딘(H3TdR)을 희석시키는데 티미딘 작업 용액을 사용해야 한다.
티미딘 작업 용액, ThY +3H-TdR을 제조하기 위해서, 300ml 멸균시킨 탈기시킨 tdc H2O에 다음의 화학물질을 첨가한다: 1.33mM ThY(냉각) 1.15ml, 300μCi/mmol의 비방사능을 갖는3H-TdR(ICN 파트 번호 24066) 1.70ml. 일단 제조하면, 이 용액을 1주일 동안 냉장 조건(4℃)에서 보관할 수 있다.
6. N-아세틸-L-시스테인(NAC) 작업 용액
PBS-G 용액 4ml에 N-아세틸-L-시스테인 (시그마 A8199) 0.0702g을 용해시켜서 최종 농도가 0.1M인 원액을 제조한다. 이 원액을 분취량 1ml로 나누어 12×75 멸균 시험관에 넣고, 이 분취량은 -70℃의 냉동실에서 1주일 이하 동안 저장할 수 있다. 작업 용액을 만들기 위해서, 0.1M NAC 원액 1분취량 990㎕씩을 취하여 PBS-G 용액 29.01ml에 첨가하고, 잘 혼합한다. 작업 용액은 무균 기술을 사용하여, 진공 여과에 의해 멸균시켜서 멸균 병에 넣는다. 최종적으로, 이 용액 10㎕를 삼중 시험 웰에 첨가한다. N-아세틸-L-시스테인 작업 용액은 시험을 수행하기 전에 매일 신선하게 만들어야 하는 것이 중요하다.
본 명세서에서 언급된 특허나 공보는 어느 것이나 본 발명이 이 속하는 업계의 숙련가의 수준을 나타내는 것이다. 또한, 이들 특허와 공보는 각 공지데이타가 특별히 및 각각 참고로 인용된 것과 같은 범위로 여기서 참고로 인용되었다.
여기에 언급된 목적, 목표 및 이점과 그밖에 다른 목적을 이행하고, 목표와 이점을 달성하기 위해, 본 발명을 개질할 수 있음을 당 업계의 숙련가는 이해할 것이다. 본원에 기재된 방법, 절차, 처리, 분자, 및 특정 화합물과 함께 설명한 본 발명의 실시예는 단지 예로서만 기술한 것이지, 본 발명의 범위을 한정하려는 의도는 결코 아니다. 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 구성 내에서 포함된 업계의 숙련가들에게는 본 발명의 또다른 변경 및 용도가 발생할 것이다.

Claims (12)

  1. 임파구에서 글루타티온의 세포내 기능의 수준을 측정하고 임파구의 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는데 효과적임을 특징으로하는, 글루코오스 및 임파구에서 글루코오스를 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 탄수화물; 생물학적으로 이용가능한 형태의 판토텐산, 콜린 또는 임파구에서 콜린을 생성할 수 있는 생물학적으로 이용가능한 형태의 물질; 생물학적으로 이용가능한 형태의 염화물, 인산염, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 철을 포함하는 무기 이온; L-부티오닌-[S.R.]-설폭스이민; 탈이온수; 및 검정될 임파구를 자극하기 위한 유효량의 유사분열물질을 포함하고 pH가 약 6.8 내지 7.6인 무혈청 완충 용액을 함유하는, 임파구에서 글루타티온의 세포내 기능의 수준을 측정하고 상기 임파구의 항산화 기능의 생화학적 분석을 수행하는데 유용한 세포 배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, 배지가 생물학적으로 이용가능한 형태의 아미노산 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 영양 보충물로 보충되고, 시험될 영양물이 상기 영양 보충물에 존재하지 않거나 한정량 또는 억제량으로 존재하는 세포 배양 배지.
  3. 제1항에 있어서, 비타민이 비오틴, 폴린산(folinic acid) 또는 생물학적으로 이용가능한 형태의 폴산, 니코틴아미드 또는 니코틴산, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B6및 비타민 B12, 및 세포내에서 이들을 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 상기한 아미노산들 또는 상기 아미노산들을 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물이 L-아르기닌, L-시스테인, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린을 포함하며, 상기 아미노산들이 각각 억제 농도를 초과하지 않는 양의 그룹으로서 존재하는 세포 배양 배지.
  4. 제1항에 있어서, L-부티오닌-[S.R.]-설폭스이민이 약 5μM 내지 약 500μM의 농도로 존재하는 세포 배양 배지.
  5. 제1항에 있어서, 피루베이트, 아데닌 및 이노시톨 또는 임파구내에서 이들을 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 자극성 영양물과 거의 최대 반응을 유도하는 농도로 보충되는 세포 배양 배지.
  6. 제1항의 세포 배양 배지에 개인의 임파구를 접종하는 단계;
    접종된 세포 배양 배지를 항온처리하는 단계; 및
    임파구의 반응을 개인의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 개인에서 글루타티온의 세포내 기능의 수준을 측정하고 세포 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는 방법.
  7. 영양 결핍, 부적절성 및 불균형을 측정하고 임파구의 항산화 기능을 분석하는데 효과적임을 특징으로하는, 글루코오스 및 임파구에서 글루코오스를 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 탄수화물; 생물학적으로 이용가능한 형태의 판토텐산, 콜린 또는 임파구에서 콜린을 생성할 수 있는 생물학적으로 이용가능한 형태의 물질; 생물학적으로 이용가능한 형태의 염화물, 인산염, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 철을 포함하는 무기 이온; 큐멘 하이드로퍼옥사이드, 탈이온수, N-아세틸-L-시스테인; 및 검정될 임파구를 자극하기 위한 유효량의 유사분열물질을 포함하고 pH가 약 6.8 내지 7.6인 무혈청 완충 용액을 함유하는, 사람의 임파구에서 시스테인의 세포내 기능의 수준을 측정하고 항산화 기능의 생화학적인 분석을 수행하는데 유용한 세포 배양 배지.
  8. 제7항에 있어서, 배지가 생물학적으로 이용가능한 형태의 아미노산 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 영양 보충물로 보충되고, 시험될 영양물이 상기 영양 보충물에 존재하지 않거나 한정량 또는 억제량으로 존재하는 세포 배양 배지.
  9. 제7항에 있어서, 비타민이 비오틴, 폴린산(folinic acid) 또는 생물학적으로 이용가능한 형태의 폴산, 니코틴아미드 또는 니코틴산, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B6및 비타민 B12, 및 세포내에서 이들을 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 상기한 아미노산들 또는 상기 아미노산들을 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물이 L-아르기닌, L-시스테인, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린을 포함하며, 상기 아미노산들이 각각 억제 농도를 초과하지 않는 양의 그룹으로서 존재하는 세포 배양 배지.
  10. 제7항에 있어서, 큐멘 하이드로퍼옥사이드가 약 50μM 내지 약 500μM의 농도로 존재하는 세포 배양 배지.
  11. 제7항에 있어서, 피루베이트, 아데닌 및 이노시톨 또는 임파구에서 이들을 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 자극성 영양물과 거의 최대 반응을 유도하는 농도로 보충되는 세포 배양 배지.
  12. 제7항의 세포 배양 배지에 개인의 임파구를 접종하는 단계;
    접종된 세포 배양 배지를 항온처리하는 단계; 및
    임파구의 반응을 개인의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 개인에서 시스테인의 세포내 기능의 수준을 측정하고 세포 항산화 기능을 생화학적으로 분석하는 방법.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW517089B (en) * 1996-09-03 2003-01-11 Res Dev Foundation Assessment of intracellular cysteine and glutathione concentrations
DE60212717T2 (de) * 2002-03-13 2007-06-28 Borealis Technology Oy Inspektionsapparat für deformierte rohre
US20030177850A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-25 The Washington Post Company System and method for verifying the roll roundness of rolls of paper used for newspapers
US20050202521A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-15 Albert Crum Methods of assessing the need for and the effectiveness of therapy with antioxidants
MX2007014624A (es) * 2005-05-26 2008-03-24 Pediatrix Medical Group Inc Formulaciones nutriconales y metodos para proporcionar formulaciones nutricionales.
JP5409015B2 (ja) 2006-02-14 2014-02-05 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
US20100266501A1 (en) * 2006-11-07 2010-10-21 University Of Vermont and State Agricltural College Methods and compositions for organ protection
US8053236B2 (en) 2007-05-11 2011-11-08 Amgen Inc. Feed media
US8135824B2 (en) * 2007-10-01 2012-03-13 Ebay Inc. Method and system to detect a network deficiency
RU2557292C2 (ru) * 2010-04-05 2015-07-20 Федеральное государственное унитарное предприятие государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) Дрожжи, имеющие повышенное содержание серосодержащего соединения, способ отбора таких дрожжей и способ их культивирования
RU2506579C1 (ru) * 2012-09-18 2014-02-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" Способ определения глутатиона в модельных водных растворах методом циклической вольтамперометрии на графитовом электроде, модифицированном коллоидными частицами золота
CN105831769A (zh) * 2015-02-04 2016-08-10 张亚武 一种细胞内/细胞间对癌症抑制之食物
US20160367620A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Harry B. Demopoulos Glutathione

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4499064A (en) * 1982-06-03 1985-02-12 Clayton Foundation For Research Assessment of nutritional status of individuals
US4927762A (en) * 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
FI892006A (fi) * 1988-04-29 1989-10-30 Phil Gold Lactalbumin saosom tillaeggsaemne i mat.
CA1339070C (en) * 1989-01-26 1997-07-29 Wulf Droge Treatment of diseases associated with cysteine deficiency
US5171885A (en) * 1989-06-01 1992-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. L-buthionine-S-sulfoximine and L-buthionine-R-sulfoximine
JPH0789908B2 (ja) * 1991-02-28 1995-10-04 倉敷紡績株式会社 動物細胞培養用無血清培地
US5686436A (en) * 1993-05-13 1997-11-11 Hiv Diagnostics, Inc. Multi-faceted method to repress reproduction of latent viruses in humans and animals
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5985665A (en) * 1996-06-19 1999-11-16 Research Development Foundation Biochemical analysis of antioxidant function of lymphocytes in culture
TW517089B (en) * 1996-09-03 2003-01-11 Res Dev Foundation Assessment of intracellular cysteine and glutathione concentrations
US6896899B2 (en) * 1996-12-31 2005-05-24 Antioxidant Pharmaceuticals Corp. Pharmaceutical preparations of glutathione and methods of administration thereof
US6262019B1 (en) * 1998-04-30 2001-07-17 Vit-Immune, L. C. Method of treatment of glutathione deficient mammals

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Publication number Publication date
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