JP2001500011A - 細胞内システイン及びグルタチオン濃度の評価 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 リンパ球を培養する培地及び方法は、酸化ストレスに対処する個体の能力の生化学分析を供給するために、ヒトリンパ球におけるグルタチオン及びシステインの細胞内濃度の決定に使われる。培地はpHは約6.8から7.6でグルコース及びリンパ球内でグルコース生産が可能な生物学的化合物が構成する群から選択された炭水化物、生物学的使用可能形式パントテン酸、コリンあるいはリンパ球内でコリン生産可能な生物学的使用可能形式基質、塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムで構成される無機イオン生物学的利用可能形式の鉄及びＬ−ブチオニン−［Ｓ.Ｒ.］−スルフォキシマイン、脱イオン水、及び分析されるリンパ球を刺激する効果的な量のマイトジェンを含むの緩衝化無血清溶液である。システインの濃度を決定する場合には、培地にはそれらに加え、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、及びクメンヒドロペルオキシドが含まれる。本方法は細胞培養培地への個体由来のリンパ球の植え付け、植え付け細胞培養培地のインキュベーション、及びリンパ球の応答とコントロール群の個体由来のリンパ球の平均的な応答と比較によって行われる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 細胞内システイン及びグルタチオン濃度の評価 発明の背景発明の分野 本発明は栄養学及び生化学及び細胞性グルタチオン代謝の分野に広く関する。 さらに具体的には言えば、本発明は、退行疾病の予防及び酸化的ストレスの対処 の個体の能力の測定を提供するための、システイン及びグルタチオンの細胞内機 能レベルの測定に関する。関連技術の説明 老化、動脈炎、がん、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、発作、ウイルス感 染、肺の異常、腸の病気及び神経退行疾病を含む多くの人間の健康上の異常が、 一般的にフリーラジカルと呼ばれる反応性酸素分子の存在により、発生あるいは 悪化することが,現在では広く認められている。これらの敵対分子は生理的な反 応での通常の副産物で、酸素の代謝、たとえば、細胞呼吸、あるいは免疫系機能 （外的異物の殺害）及び代謝に不可欠な非常に多くの酵素反応によって生産され る。さらに、フリーラジカルは一般環境中に普通に見い出すことができる。フリ ーラジカルの周囲の発生源には煙、電離性放射線、大気汚染、化学薬品（発がん 物質、多くの石油化学製品、生物致死剤、色素、溶媒、静細胞薬剤、その他）、 毒性重金属、及び酸化あるいは酸敗脂肪が含まれる。最も一般的なフリーラジカ ルの中には超過酸化物、水酸基、一重項酸素 及び過酸化水素を含む過酸化物がある。ある原子価の鉄及び銅は、短い存在期間 ではあるが、生物分子の変形、損傷の誘発に続いて、ラジカルの形成の連鎖反応 を促進する、フリーラジカルの形成を触媒することができる。 フリーラジカルは生命有機体に対しすべての生物分子の構造的損傷の原因とな る毒性を持つ。分子上の損傷は遺伝子コードの変更、細胞膜形状の分裂、神経学 的障害、内分泌不安定、アレルギーの増加、血管内皮破壊、及び関節破壊と炎症 の原因となることがある。 フリーラジカルによる有毒な影響からの防護は酸化防止剤と呼ばれる多様な領 域の分子において見いだされる。フリーラジカル及びそれらが関連した副産物は 、酸化防止剤により中和され、害の少ない生産物に変換されることができる。酸 化防止剤は酵素（超過酸化物不均化酵素、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシ ターゼのような）、必須栄養素（ベータカロチン、ビタミンＣ及びＥ、セレンの ような）、非常に多くの内生物質（グルタチオンのような）あるいは食品化合物 （ビオフラボノイドのような）であることもある。したがって、人間の体内には フリーラジカルに対するのいくつかの天然の抑制物を保持している。 ヒトでの調査では栄養物酸化防止剤の摂取の欠乏が、がん、心臓血管の病気、 関節炎、白内障、その他の病気の高い発生危険性と関連していることを示してい る。奨励研究により酸化防止剤の栄養的補充を含む作用がヒトにおいて治療上の 利 点を持つといってもよい事が示される。 酸化防止剤状態の実験室レベルでの分析は多様な理由から定まった手順では行 えなかった。フリーラジカルは著しく短期間で消え去り、一般に直接の測定を行 うことができない。フリーラジカル損傷の副産物が血清あるいは尿中ではマロン ジアルデイド（ＭＡＤ）、チオバルビーツール酸反応基質（ＴＢＡＲＳ）あるい は脂質ペルオキシターゼとして測定できるが、しかしながら、これらの検査はあ る形式の生物分子（大部分は過不飽和脂肪及び核酸）に対する損傷のみを反映す る酸化的ストレスの指示物と思われる。それでも血清あるいは細胞中の酸化防止 剤栄養物レベル、及び酸化防止剤酵素活性の測定方法は特異的な構成物の不足レ ベルを決定することができる。 グルタチオンは細胞質、核、ミトコンドリアに豊富に存在する卓越した細胞性 酸化防止剤物質である。グルタチオンは強力な酸化防止機能に加え、体内から多 くの外生物的発がん物質成分を除去することができる強力な抗毒素でもある。さ らに、グルタチオンは細胞介在免疫機能に不可欠なもので、赤血球の正常な状態 の維持に重要なものである。そのうえ、グルタチオン系の欠乏は著しい細胞老化 及び、最終的には細胞病を導くことが一般に認識されている。 細胞性グルタチオンの濃度は酸化防止剤機能に重大な影響を与え、また、栄養 制限、運動及び酸化的ストレスは細胞性グルタチオンの濃度に重大な影響を与え る。酸化的条件下で は、グルタチオンの機能が外生物的物質への結合、影響を受けた細胞からグルタ チオン結合物及びグルタチオンジスルフィドの排出で相当失われることがある。 しかしながら、幸いにも、Ｎ−アセチル−システインのような物質は細胞内グル タチオン機能の増大に有効な働きをする。 グルタチオンはＡＴＰ、マグネシウム及びグリシン、グルタミン酸、システイ ンの３種のアミノ酸を使用する一連の生化学反応において合成される。一般に、 ガンマ−グルタミルシステインの合成速度はグルタミン生成速度を規定し、シス テインのスルフヒドリル基はグルタチオンにその生物学的活性を与える。したが て、グルタチオンの機能的有効性の決定及び酸化防止剤機能の評価にはシステイ ン有効性の測定が必要である。 システイン及びグルタチオンの評価はまた、セレン欠乏の評価に役立つ。グル タチオンが酸化防止剤として機能する場合、グルタチオンペルオキシダーゼが触 媒することにより過酸化水素と反応してグルタチオンジスルフィドを形成する。 グルタチオンペルオキシダーゼは機能的コファクターとしてセレンを必要とする 。したがって、ＳＰＥＣＴＲＯＸの結果が平均以下である適したシステインの機 能は、細胞性セレンの欠乏を示し、それ以上の検査が必要とされる。 従来の技術はヒトにおけるシステイン及びグルタチオンの細胞内機能レベルの 生化学的分析の単純で安価な方法を欠く点で不完全である。本発明はこの技術の 長期間にわたる必要 性と要望を満たすものである。 発明の要約 本発明の一つの目的は、リンパ球におけるグルタチオン細胞内機能レベルの測 定及び酸化防止剤機能の生化学分析の使用に有用な細胞培養培地の提供であり、 当該培地は、次の成分を含む緩衝化無血清溶液を含む：グルコースあるいは細胞 内で生物学的にグルコース生産が可能な化合物が構成する群から選択された炭水 化物、生物学的使用可能形式パントテン酸、コリンあるいは細胞内のコリン生産 可能な生物学的使用可能形式基質、生物学的使用可能形式の塩素、リン酸、カル シウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び鉄を含む無機イオン、Ｌ−ブ チオニン−［Ｓ.Ｒ.］−スルホキシマイン、脱イオン水、及び分析されるリンパ 球を刺激する効果的な量のマイトジェン；当該緩衝化無血清溶液のpHはおおよそ 6.8から7.6である；ここにおいて、当該細胞培養培地はリンパ球内のグルタチオ ンの細胞内機能のレベルの決定、栄養学的欠乏、不適切、及び不均衡状態の決定 、及びリンパ球の酸化防止機能の生化学的分析に効果的なものとして特徴付けさ れる。 本発明の一つの具体例は、本発明の細胞培養培地に対する生物的利用可能形式 のアミノ酸及びビタミンで構成される群から選ばれた補充栄養素の補充が含まれ 、栄養素は栄養素補充での制限量あるいは阻害量から外れているかその範囲内に あるかを検査される。 本発明の別の目的は、個体内におけるグルタチオンの細胞内機能レベルの測定 及び細胞内酸化防止剤機能の生化学的分析の方法の供給で、以下の段階を含む： 本発明の細胞培養培地に検査する個体からのリンパ球の植え付け；植え付けられ た細胞培養培地のインキユベーション；コントロール群の個体からのリンパ球の 平均的な反応とそのリンパ球の反応との比較。 本発明のさらに別の目的は、ヒトリンパ球におけるシステインの細胞内機能レ ベルの測定及び酸化防止剤機能の生化学分析の使用に有用な細胞培養培地の提供 であり、当該培地は、次の成分を含む緩衝化無血清溶液を含む：グルコースある いは細胞内で生物学的にグルコース生産が可能な化合物が構成する群から選択さ れた炭水化物、生物学的使用可能形式パントテン酸、コリンあるいは細胞内のコ リン生産可能な生物学的使用可能形式基質、生物学的使用可能形式の塩化物、リ ン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び鉄を含む無機イ オン、クメンヒドロペルオキサイド、脱イオン水、Ｎ−アセチルＬ−システイン 及び分析されるリンパ球を刺激する効果的な量のマイトジェン；pHがおおよそ6. 8から7.6である当該緩衝化無血清溶液。栄養学的欠乏、不適切、及び不均衡状態 の決定、及びリンパ球の酸化防止機能の生化学的分析に効果的なものとして特徴 付けされる当該細胞培養培地。 本発明の一つの具体例は、本発明の細胞培養培地に対する 生物的利用可能形式のアミノ酸及びビタミンで構成される群から選ばれた補充栄 養素の補充が含まれ、栄養素は栄養素補充での制限量あるいは阻害量から外れて いるかその範囲内にあるかを検査される。 本発明の別の具体例は、個体内でのシステインの細胞内機能レベルの測定及び 細胞内酸化防止剤機能の生化学的分析の方法の提供で、以下の段階が含まれる： 本発明の細胞培養培地に検査する個体からのリンパ球の植え付け；植え付けられ た細胞培養培地のインキユベーション；コントロール群の個体からのリンパ球の 平均的な反応とそのリンパ球の反応との比較。 本発明の他の及びそれ以上の方向、特徴及び利点は説明書のために与えられた 発明のここに提出された実施態様の以下の記載から明らかにされるであろう。 発明の詳細な説明 本発明はヒトリンパ球でのシステイン及びグルタチオンの細胞内機能レベルの 生化学分析に有効な方法を導く。このような分析は末梢リンパ球内で個体の酸化 防止剤システムの生理的状態を反映する。本発明の方法論によりヒトリンパ球で のシステイン及びグルタチオンの細胞内機能の正確な評価をすることができ、そ れゆえ、臨床上の測定は個人の酸化防止剤プロフィール改善に用いることができ る。 リンパ球を利用する本発明は顕著な利点を提供している、なぜならリンパ球は ：（１）細胞媒介免疫系の主役を占め容 易に成長を簡単に刺激できる（マイトジェネシス）；（２）時間的に平均化した 、長期間の栄養素状態を反映する（１個のリンパ球の生存期間は約６カ月である ）；（３）別の細胞と共通の代謝経路を所有する；（４）標準的な静脈穿刺によ って容易に採取されるからである。 システイン及びグルタチオンの細胞内機能を評価するためのリンパ球成長の測 定により、本発明の方法は、変化に富む個々の患者の独特のプロフィールを反映 する。さらに、臨床上の治療法を標準法により決定されたいわゆる「平均」患者 以上に個人の特異的な生化学的要求に適応させることができる。 様々な代用及び変更がここで説明された本発明に対し、発明の範囲及び精神の 範囲内で起こり得ることは、この技術の技能を持つ人には認知されるであろう。 以下の実施例は発明の様々な実施形態を説明する目的で示しており、いかなる やり方でも本発明を制限する意味の物ではない。 実施例１ 患者血液の採血 酸−クエン酸−デキストローズに保存された２つの10mlの全血液サンプルが本 発明の方法には必要とされる。絶食は必要でない。必要とされるすべてのことは 採血だけで与えられる。本発明の分析は適する実験室で室温で行うことができ、 あるいは患者の血液はそこに移すべきである。血液の遠心分 離は必要とされない。総合的な検査結果は患者のグルタチオン及びシステインの プロフィールの健全な科学的に基づいた分析結果を与える。 実施例２ サンプル処理：細胞分離 すべての処理はサンプルの無菌状態を保持するために層流フードのもとで無菌 操作によって行われる。それぞれの患者の血液は実験室で受領書の登録番号で割 り当てる。この割り当て番号は処理、データ収集及びデータ分析の期間を通じて 追跡に使用できるサンプル番号として使用される。患者のサンプル処理に含まれ るすべての試験管、遠心管およびデータ印刷物にはこのサンプル（登録）番号を 記す。 それぞれの患者サンプルは８mlの全血液を入れた（２）二本の酸−クエン酸− デキストロース（黄色キャップ）バックタイナー型管で構成される。受け入れ（ サンプル）番号の割り当て後、全血液は６回ひっくり返して混合された。二本の チューブの全血液は50mlディスポーザブル遠心管の中で混合した。 500μｌアリコートがそれぞれのサンプルから無菌的に取り除かれ、12×17mm 管に入れられた。このアリコートはCoulter細胞計数器、Model Ｔ54Oを使った全 血液細胞数計測を行うことに使用された。計数器からの全血液数の出力データに は登録番号を記し、その患者のワークシートに添付した。 それぞれのサンプルに対して二つの（２）フィコール勾配 チューブが5.0mlのHistopaque 1077（フィコール／ナトリウムジアトリゾエート 、Sigma chemicals，St．Louis，Missouri）をそれぞれの15ml円錐形の遠心管に 加えることにより準備された。10mlピペット及び電子ピペットエイドを使用し、 ８mlの全血液がそれぞれのフィコール勾配チューブの表面にゆっくりとおかれた 。フィコール勾配チューブはキャップがされ、2160ＲＰＭで20分間遠心分離され た。 遠心分離が終了後、勾配が乱れることを避けるために遠心分離機から遠心管が 注意深く取り外された。中間フィコール層の界面に見いだされるバッフイーコー ト（リンパ球を含む）は５mlピペットを使用して15mlディスポーザブル円錐形遠 心管に移された。バッフィーコートはリン酸緩衝化塩−0.72％グルコース溶液（ ＰＢＳ−Ｇ）に最終的に12mlとなるように加えられた。管はキャップがされ、バ ッフィーコートとＰＢＳ−Ｇを混合させるために６回ひっくり返された。 バッフィーコートとＰＢＳ−Ｇを含む管は2160ＲＰＭで５分間遠心分離された 。遠心分離後、上清は細胞ペレットから吸引されて捨てられた。細胞ペレットは 12mlのＰＢＳ−Ｇに再懸濁され、細胞ペレットの十分な分散が確実となるように ６回ひっくり返された。サンプルはその後、上記条件で再び遠心分離された。 ２回目の遠心分離の後、上清は吸引されて捨てられた。細胞ペレットは６mlの ＰＢＳ−Ｇに再懸濁された。細胞ペレットは電子ピペットエイドを取り付けた５ mlピペットを使用し ＰＢＳ−Ｇに分離混合された。同質の細胞懸濁液が得られた後、懸濁液の200μ ｌアリコートが12×75mm管に移された。このアリコートはCoulter細胞計数器Mod el Ｔ540を使用する初期細胞懸濁（ＩＣＳ）計数に使用された。 このアリコートの出力データはサンプル番号が記され、ワークシートに添付さ れた。リンパ球数が立方ミリメーター当り3.9から1.2千細胞（ＴＨＳＤ/mm³）の 間にあるならば、サンプルはプレート植え付け用に調製される。加えられるべき 細胞懸濁液量は表Ｉ及びIVに示めされている。リンパ球数が3.9THSD/mm³を越え ているならば、サンプルは再希釈しなけれまならい。一方、リンパ球数が1.2THS D/mm³未満の場合、サンプルは破棄された。 適切な再希釈に必要な加えられるＰＢＳ−Ｇ量は以下の計算式によって決定さ れた。 Ｃ₁，Ｖ₁＝Ｃ₂Ｖ₂ Ｃ＝リンパ球濃度（ＴＨＳＤ/mm³） Ｖ＝容量 Ｃ₂＝3.0ＴＨＳＤ/mm³ならば、これが最終細胞懸濁液に求められるリンパ球濃 度である。例えば初期細胞懸濁計数が6.0ml＝（ＬＹ＃ of 5.6ＴＨＳＤ/mm³とさ れた場合 Ｃ₁，Ｖ₁＝Ｃ₂Ｖ₂ (5.6)(6.0ml)＝(3.0)（Ｘ） Ｘ＝11.2ml最終容量 最終容量が11.2mlになるように適切量のＰＢＳ−Ｇが加えられた。この実施例 では、最終容量が11.2mlになるように原液6.0mlに5.2mlが加えられる。その（Ｉ ＣＳ）に必要量のＰ ＢＳ−Ｇが加えられると最終細胞懸濁液（ＦＳＣ）になった。 ＬＹ＃計測数及びＰＢＳ−Ｇ容量はSPECTROX検査ワークシートに記録された。 再希釈後、再希釈細胞懸濁液の200μｌアリコートが新しい12×75mm管に移さ れた。再希釈細胞懸濁液出力データ（最終細胞懸濁液ＬＹ＃）はワークシートに 添付され、植え付け容量が記録された。 実施例３：グルタチオン濃度の評価 Ａ．プレート植え付け 最終細胞懸濁液は無菌容器に入れられ、培地を含んだミクロチッタープレート は層流フードの内に置かれた。無菌処理０−50μｌ境界チップを付けた12チャン ネル手動式マイクロピペットを使用して、指定量（表Ｉに従う）の最終細胞懸濁 液がプレートのそれぞれの穴に分け与えられた。 表 Ｉ 以下の容量は記入された最終細胞懸濁液リンパ球数（ＬＹ＃）に基づきプレー ト植え付けに使用される。 培地への細胞の添加の後、プレートにカバーがかけられ、37℃のＣＯ₂インキ ュベーター内に96時間入れられた。Ｂ．標識 すべての標識作業はラジオアイソトープ室で行われた。三重水素チミジン（Ｈ³ −ＴｄＲ）作業溶液が冷蔵保存庫から出され、湯槽で37℃に暖められた。96時 間後、ミクロチッタープレートはインキュベーターから出される。Ｈ³−ＴｄＲ 作業 溶液は無菌容器に入れられ、無菌処理０−50μｌ境界チップを付けた12チャンネ ル手動式マイクロピペットを使い10μｌＨ³−ＴｄＲ作業溶液がミクロチッター プレートのそれぞれの穴に分け与えられた。プレートは37℃のインキュベーター に24時間入れられた。データ及び標識作業を行った技術者のイニシャルがサンプ ル記録用紙に記された。Ｃ．収穫 すべての収穫作業はラジオアイソトープ室で行われた。シングルグラスファイ バーフィルターマット（Packard Part ＃6005416）は＃２鉛筆を使用してサンプ ル番号を記した。真空ポンプを作動させ、乾燥炉を100℃にセットした。ハーベ スターに取り付けた蒸留水容器を充填した。Ｈ³−ＴｄＲ添加の24時間後にイン キュベターからミクロチッタープレートを取り出した。データ及び収穫作業を行 った技術者のイニシャルがサンプル記録用紙に記された。 細胞ハーベスター（Packard Model ＃ Ｃ9619）を開放状態にして、Ｏ−リン グを露出させる、グラスファイバーフィルターマットを荒面側をＯ−リングに接 着させる形でハーベスターに装着した。細胞ハーベスターの蓋を閉め、リンスト レイからの蒸留水で湿らせる。ハーベスターは真空周期（ＶＡＣ）にしておく。 ミクロチッタープレートの蓋を取り除き、プレートをハーベスタープローブチッ プの下に置いた。プローブのチップがプレートの底に接触するまで、プレートが ハーベストプローブに向けてゆっくり上昇された。培地の吸引 とともに、穴の底がプローブチップをゆっくり円形に動かすことによりこすり落 とされた。こすり落としは10秒間継続して行われた。ミクロチッタープレートは ハーベスタープローブチップと連携した状態で、こすり落としが継続され、「ウ オッシュ」ボタンを10秒間押した。液体が穴から吸引除去され、上記のこすり落 とし作業が繰り返された。プレートが取り外され、リンストレイがメタノールで 充填され、トレイが洗われ、メタノールが吸引されそしてトレイが下ろされた。 フィルターマットが上断面に付着したＶＡＣの操作が５秒間継続された状態で 、ハーベスターが開放された。５秒後、ＶＡＣは停止され、同時にフィルターマ ットはハーベスター表面から取り除かれた。フィルターマットは荒面側を上に乾 燥炉で10分間放置された。フィルターマットは炉から取り除かれ、室温に冷やさ れた。Ｄ．放射能計数 すべての測定作業はラジオアイソトープ室で実施された。フィルターマットは 荒面を上に計数カセット内に積載された。フィルターマットを保持する薄いステ ンレス板のコリメーターがフィルターマット上に置かれた。カセットがPackard Matrix 9600 Beta Particles Radioactivity Counterに積載された。Ｑ−ガス（ 1.3パーセントｎ−ブタンを含むヘリウム）のMatrix 9600への流入が開始された 。それぞれの穴に対して３分間の総放射能を計数する計数プロトコールを動かす 「スタート」ボタンが押された。それぞれのサンプル計測 数はMatrix 9600のハードドライブに記憶された。加えて、生の放射能測定数ハ ードコピーが印刷された。Ｅ．データ変換 データはMatrix 9600のハードドライブから3.5ディスクに移された。生データ はMicrosoft Excelのマクロ実行により報告形式に変換された。このマクロはそ れぞれのデータ点からプレートのバッググラウンドを取り去り、３つの穴の値の 平均を計算し、この値をプレートのコントロールの値を100％とする場合に対す るパーセンテージで表す。Ｆ．データ分析（標準化） グルタチオン（ＧＳＨ）の酸化防止剤機能はリンパ球成長反応分析により調査 した。細胞は５μＭ Ｌ−ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシマイン（ＢＳＯ ）を含む化学的に定義された無血培地に置かれ、その細胞はマイトジェニック成 分の添加により成長を刺激された。³Ｈ−チミジン取り込み量の測定された成長 反応はコントロールの成長に対するパーセンテージで表示される。ＢＳＯはグル タチオン合成に要求されるグルタチオントランスフェラーゼの合成を抑制する。 したがって、培地に対するＢＳ０の添加及びグルタチオン合成に対するその抑制 は細胞成長における変化に反映され、リンパ球中のグルタチオンの状況を示す。 ＢＳＯ使用量(５μＭ)は1995年に確立されている。 個体のリンパ球成長は培地でのＢＳＯの有無における成長のパーセンテージと して表現される。Microsoft Excelをし ようして100％成長（ＢＳＯ無し）に対する＋ＢＳＯ％成長の比率を計算した。1 000人以上の患者の検査結果が入力され、その比率の平均、メジアン、範囲及び 分散を計算するために標準Excelプログラムを使用して統計分析を行った。±２ 標準偏差の範囲外にある「部外」データは患者データベースから除去した。残っ たデータは参照点及び集団参照範囲を決定するために使用した。この集団参照範 囲はスカッタープロット分布によりグラフで示される。グルタチオンに関する通 常あるいは参照値は85％（＞85％）以上と決定されている。その結果、グルタチ オン値が85％以下の人はグルタチオン欠乏であるものとして分類される。Ｇ．器具、試薬及び溶液 以下の器具を本発明の分析で使用した。：層流フード；遠心分離機、Beckman ＧＳ−６；細胞計数機(Coulter Model Ｔ540)；12チャンネルピペット（５−5 0μｌ）；電子ピペットポンプ(Drummond）；キャップ付無菌50ml円錐形プラスチ ックチューブ；12×75mmポリプロピレンチューブ；キャップ付無菌15ml円錐形プ ラスチッグチューブ；ピペット（０−20，０−200，０−100μｌ範囲）；無菌ガ ラスディスポーザブルピペット−5.0ml，10.0ml、試験管ラック及びエアロソー ルバリアピペットチップ（０−50μｌ）。 表IIは本発明で使用された様々な試薬及びそれらの出所を示している。 表 II試薬 Ｈ．溶液 すべての溶液は組織培養用グレード脱イオン水(tcd Ｈ₂Ｏ)で調製された。１．リン酸緩衝化塩 リン酸緩衝化塩（ＰＢＳ）＋0.72％グルコース（ＰＢＳ− Ｇ）溶液を調製するために、ＰＢＳをtcｄ Ｈ₂Ｏを使用した一連の指針にしたが って調製した。十分量の10％グルコース溶液が、最終的なグルコース濃度が0.72 ％になるように加えられた。溶液は濾過により殺菌されて（２−８℃）の冷蔵庫 中に保管された。 ２．貯蔵培地 濃縮（２Ｘ）貯蔵培地調製のため以下の方法で調製された：（１ ）23.80ｇ ＨＥＰＥＳ；（２）14.02ｇ塩化ナトリウム；（３）1.05ｇリン酸二 塩基カリウム；（４） 0.241ｇ硫酸マグネシウム；（５）1.0ml（10μＭ）塩酸アデニン；（６）30.0ml （100mM）ピルビン酸ナトリウム；（７）0.5ml 0.5％フェノールレッド；（８） 5.0ml抗生物質混合物；（９）8.0ml ５Ｎ水酸化ナトリウム；（10）20.0ml Fe/E DTA（1.0mM ＦｅＳＯ₄/0.4mM Ｎａ₂ＥＤＴＡ）、以上の物質をtcd Ｈ₂Ｏに加え た。すべての物質を完全に混合した後、５Ｎ水酸化ナトリウムを使用してpHを7. 60に調整した。tcd Ｈ₂Ｏを使用して最終的な容量を1.0Ｌにした。溶液は0.2μ Ｍフィルターで濾過することにより殺菌され、そして４℃の冷蔵庫に保存されて いた。これらの環境下で、安定性は約４週間保たれた。 ３．基礎培地 100％プレートコントロール及び本発明の新方法に使用する基礎 培地は下記に示すように調製した。濾過後は無菌的技法を使うべきである。基礎 培地は層流フードの下で調製され、表IIIで示される成分を混合し、tcd Ｈ₂Ｏに より最終的な希望容量にされた。溶液は無菌ボトル内で真空濾過で殺菌された。 適する容量のＰＨＡ貯蔵溶液が添加された。 表 III ４．Ｌ−ブチオニン−［Ｓ.Ｒ.］−スルホキシマイン（ＢＳ）作業溶液調製（５ μＭ/Ｌ） 0.2223ｇ ＢＳＯ（Sigma Ｂ 2515）を20mlのＰＢＳ−Ｇに溶解し50m M ＢＳＯ貯蔵溶液を作成する。溶液は吸引手法を使用し、無菌ボトル内へ真空濾 過で殺菌され入れられる。第二のＢＳＯ貯蔵溶液（500μＭ）は900μｌの無菌Ｐ ＢＳ−Ｇに100μｌの50mM ＢＳＯを添加する ことにより調製する。５μＭ ＢＳＯ作業溶液は2.5mlの第二の500μＭ ＢＳＯを 247.5mlの基礎培地に加えて十分に混合することによって調製される。 この溶液の安定性は１週間保たれる。 ５．チミジン（ＴｈＹ）貯蔵溶液 冷却チミジン（ＴｈＹ）貯蔵溶液（1.33mM ＴｈＹ，0.322ｇ/Ｌ）は以下のように調製された。：0.161ｇ ＴｈＹ（Sigma Ｔ 9250）は重量を測定して、tcd Ｈ₂Ｏに最終的な容量が500mlになるように溶解 される。溶液は吸引手法を使用し、無菌ボトル内へ真空濾過により殺菌され入れ られた。溶液は50ml遠心管に分別された。短期間の貯蔵では、冷蔵状態で（４℃ ）で１カ月間安定性を保って保存できる。長期間の貯蔵では、冷凍状態で（−70 ℃）で６カ月間安定性を保って保存できる。チミジン作業溶液は細胞標識に使う 放射性チミジン（Ｈ³ ＴｄＲ）を希釈するのに使用される。 チミジン作業溶液（ＴｈＹ＋³Ｈ−ＴｄＲ）調製のため、脱気した無菌tcd Ｈ₂ Ｏを次の薬品を添加した：1.15mlの1.33mM ＴｈＹ（冷却）、1.70mlの³Ｈ−Ｔｄ Ｒ（ＩＣＮ Part ＃ 24066）及び300μCi/mmol特異的活性。一度作成すれば、冷 蔵状態（４℃）で１週間要望される安定性を保って保存できる。 実施例４：システイン濃度の評価 Ａ．プレート植え付け 最終細胞懸濁液は無菌容器に入れられ、培地を含んだミクロチッタープレート は層流フードの内に置かれた。無菌処理 理０−50μｌ境界チップを付けた12チャンネル手動式マイクロピペットを使用し て、指定量（表IVに従う）の最終細胞懸濁液がプレートのそれぞれの穴に分注さ れた。 表 IV 以下の容量は記入された最終細胞懸濁液リンパ球数（ＬＹ＃）に基づきプレー ト植え付けに使用される。 培地に細胞を加えた後、10μｌのＮ−アセチル−Ｌ−システイン溶液（最終濃 度が150mM）がプレートの３列の１−９カラムに加えられた。 プレートの別の６列の１−３カラムには10μｌの200μＭクメンヒドロペルオ キサイド（ＣｕＯＯＨ）が加えられた。プ レートの６列の４−６カラムには10μｌの300μＭクメンヒドロペルオキサイド （ＣｕＯＯＨ）が加えられた。プレートの６列の７−９カラムには10μｌの400 μＭクメンヒドロペルオキサイド（ＣｕＯＯＨ）が加えられた。プレートにＣｕ ＯＯＨが加えられた後、プレートはカバーが掛けられ、37℃のＣＯ₂インキュベ ーターに96時間入れられた。Ｂ．標識 すべての標識作業はラジオアイソトープ室で行われた。三重水素チミジン（Ｈ³ −ＴｄＲ）作業溶液が冷蔵保存庫から出され、湯槽で37℃に暖められた。96時 間後、ミクロチッタープレートはインキュベーターから出される。Ｈ³−ＴｄＲ 作業溶液は無菌容器に入れられ、無菌処理０−50μｌ境界チップを付けた12チャ ンネル手動式マイクロピペットを使い10μｌＨ³−ＴｄＲ作業溶液がミクロチッ タープレートのそれぞれの穴に分け与えられた。プレートは37℃のインキュベー ターに24時間入れられた。データ及び標識作業を行った技術者のイニシャルがサ ンプル記録用紙に記された。Ｃ．収穫 すべての収穫作業はラジオアイソトープ室で行われた。シングルグラスファイ バーフイルターマット（Packard Part ＃6005416）は＃２鉛筆を使用してサンプ ル番号を記した。真空ポンプを作動させ、乾燥炉を100℃にセットした。ハーベ スターに取り付けた蒸留水容器を充填した。Ｈ³−ＴｄＲ添加の24時間後にイン キュベターからミクロチッタープレート を取り出した。データ及び収穫作業を行った技術者のイニシャルがサンプル記録 用紙に記された。 細胞ハーベスター（Packard Model ＃ Ｃ9619）を開放状態にして、Ｏ−リン グを露出させ、グラスファイバーフイルターマットを荒面側をＯ−リングに接着 させる形でハーベスターに装着した。細胞ハーベスターの蓋を閉め、リンストレ イからの蒸留水で湿らせる。ハーベスターは真空周期（ＶＡＣ）にしておく。ミ クロチッタープレートの蓋を取り除き、プレートをハーベスタープローブチップ の下に置いた。プローブのチップがプレートの底に接触するまで、プレートがハ ーベストプローブに向けてゆっくり上昇された。培地の吸引とともに、穴の底を プローブチップをゆっくり円形に動かすことによりこすり落とされた。こすり落 としは10秒間継続して行われた。ミクロチッタープレートはハーベスタープロー ブチップと連携した状態で、こすり落としが継続され、「ウオッシュ」ボタンを 10秒間押した。液体が穴から吸引除去され、上記のこすり落とし作業が繰り返さ れた。プレートが取り外され、リンストレイがメタノールで充填され、トレイが 洗われ、メタノールが吸引されそしてトレイが下ろされた。 フィルターマットが上断面に付着し、ＶＡＣの操作が５秒間継続された状態で 、ハーベスターが開放された。５秒後、ＶＡＣは停止され、同時にフィルターマ ットはハーベスター表面から取り除かれた。フィルターマットは荒面側を上に乾 燥炉で10分間放置された。フイルターマットは炉から取り除 かれ、室温に冷やされた。Ｄ．放射能計数 すべての測定作業はラジオアイソトープ室で実施された。 フィルターマットは荒面を上に計測カセット内に積載された。フィルターマット を保持する薄いステンレス板のコリメーターがフィルターマット上に置かれた。 カセットがPackard Matrix 9600 Beta Particles Radioactivity Counterに積載 された。Ｑ−ガス（1.3パーセントｎ−ブタンを含むヘリウム）のMatrix 9600へ の流入が開始された。それぞれの穴に対して３分間の総放射能を計数する計数プ ロトコールを動かす「スタート」ボタンが押された。それぞれのサンプル計測数 はMatrix 9600のハードドライブに記憶された。加えて、生の放射能測定数ハー ドコピーが印刷された。Ｅ．データ変換 データはMatrix 9600のハードドライブから3.5ディスクに移された。生データ はMicrosoft Excelのマクロ実行により報告形式に変換された。このマクロはそ れぞれのデータ点からプレートのバックグラウンドを取り去り、３つの穴の値の 平均を計算し、この値をプレートのコントロールの値を100％とする場合に対す るパーセンテージで表す。Ｆ．データ分析（標準化） この検査は酸化防止剤能力の一つの決定要因である細胞内システイン濃度の評 価である。マイトジェンにより成長を刺激されたリンパ球を使用することにより 、酸化防止剤機能は クメンヒドロペルオキサイド（ＣｕＯＯＨ）の存在下で、システインの有無によ るリンパ球の成長反応の差を比較することで示される。ＣｕＯＯＨは個々の患者 の全般的な酸化防止剤状況を測定するために使用される酸化ストレスを作り出す 。培地へのシステインの添加はＣｕＯＯＨが原因の酸化ストレスによる損傷を修 復する能力を与える。与えられるＣｕＯＯＨ及びシステインの量はそれぞれ300 μＭ及び150μＭである。 個体のリンパ球成長は培地にＣｕＯＯＨあるいはシステイン＋ＣｕＯＯＨ含ま れる場合の成長のパーセンテージとして表現される。Microsoft Excelを使用し てＣｕＯＯＨ％成長に対するシステイン＋ＣｕＯＯＨ成長の比率を計算した。10 00人以上の患者の検査結果が入力され、その比率の平均、メジアン、範囲及び分 散を計算するために標準Excelプログラムを使用して統計分析を行った。±２標 準偏差の範囲外にある部外データは患者データベースから除去した。残ったデー タは参照点及び集団参照範囲を決定するために使用した。この集団参照範囲はス カツタープロツト分布によりグラフに示される。システインに関する通常あるい は参照値は127％（＜127％）以下と測定され、その結果、システイン値が127％ 以上の人はシステイン欠乏であるものとして分類される。Ｇ．器具及び試薬 以下の器具を本発明の分析で使用した。：層流フード；遠心分離機、Beckman ＧＳ−６；細胞計数機(Coulter Model Ｔ540)；12チャンネルピペット（５−500 μｌ）；電子ピペッ Ｈ．溶液 すべての溶液は組織培養用グレード脱イオン水（tcd Ｈ₂Ｏ）で調製された。 １．リン酸緩衝化塩 リン酸緩衝化塩（ＰＢＳ）＋0.72％グルコース（ＰＧＥ− Ｇ）溶液を調製するために、ＰＢＳをtcd Ｈ₂Ｏを使用した一連の指針にしたが って調製した。十分量の10％グルコース溶液が、最終的なグルコース濃度が0.72 ％になるように加えられた。溶液は濾過により殺菌されて（２−８℃）の冷蔵庫 中に保管された。 ２．貯蔵培地 濃縮（２Ｘ）貯蔵培地調製のため以下の方法で調製された：（１ ）23.80ｇ ＨＥＰＥＳ；（２）14.02ｇ塩化ナトリウム；（３）1.05ｇリン酸二 塩基カリウム；（４）0.241ｇ硫酸マグネシウム；（５）1.0ml（10μｌ）塩酸ア デニン；（６）30.0ml（100mM）ピルビン酸ナトリウム；（７）0.5ml 0.5％フェ ノールレッド；（８）5.0ml抗生物質混合物；（９）8.0ml ５Ｎ水酸化ナトリウ ム；（10）20.0ml Fe/ＥＤＴＡ（1.0mM ＦｅＳＯ₄/0.4mM Ｎａ₂ＥＤＴＡ）、以 上の物質をtcd Ｈ₂Ｏに加えた。すべての物質を完全に混合した後、５Ｎ水酸化 ナトリウムを使用してpHを7.60に調整した。tcd Ｈ₂Ｏを使用して最終的な容量 を１Ｌにした。溶液は0.2μＭフィルターで濾過することにより殺菌され、そし て４℃の冷蔵庫に保存されていた。これらの環境下で、安定性は約４週間保たれ た。 ３．基礎培地 100％プレートコントロール及び本発明の新方法に使用する基礎 培地は下記に示すように調製した。濾過後は無菌的技法を使うべきである。基礎 培地は層流フードの下で調製され、表・で示される成分を混合し、tcd Ｈ₂Ｏに より最終的な希望容量にされた。溶液は無菌ボトル内で真空濾過で殺菌された。 適する容量のＰＨＡ貯蔵溶液が添加された。 表 VI４．クメンヒドロペルオキサイド（ＣｕＯＯＨ）貯蔵溶液 クメンヒドロペルオキサイド（Sigma Ｃ 0524）は有効期限が限られている。 物質の使用期限日はSigmaからの領収書 の日付から３カ月である。容器からＣｕＯＯＨをピペットで取る際には、ＣｕＯ ＯＨの粘性が増加することを承知することが必要である。ピペットチップへの液 体の吸引が完全であるあることを注意しなければならない。これには正確な時間 及び適切量のチップであることに注意しなければならない。また、ピペットチッ プの外側にある余剰なＣｕＯＯＨを取り除くためにチップをふき取らなければな らない。同様に、ＣｕＯＯＨの分注も完全に行わなければならない。この過程に 従うと、冷蔵状態（２−８℃）で３カ月間安定性が保たれる。 第一ＣｕＯＯＨ貯蔵溶液（1.0Ｍ ＣｕＯＯＨのＰＢＳ−Ｇ）は、9.5μｌのク メンヒドロペルオキサイド（ＣｕＯＯＨ）を990.5μｌ ＰＢＳ−Ｇと混合して作 られる。 この過程に従うと、冷蔵状態（２−８℃）で３カ月間安定性が保たれる。 第二ＣｕＯＯＨ貯蔵溶液（100mM ＣｕＯＯＨのＰＢＳ−Ｇ）は、細胞分離の前 に日ごと調製しなければならず、一晩以上蓄えておくべきではない。第二ＣｕＯ ＯＨ貯蔵溶液は、200μｌの第一ＣｕＯＯＨ貯蔵溶液と1800μｌ ＰＢＳ−Ｇを混 合して作られる。 クメンヒドロペルオキサイド作業溶液では、４種の作業溶液が細胞分離の前に 日ごとされた。溶液は患者のプレート積載に関しＣｕＯＯＨ移送プレート（分離 ミクロチッタープレート）に添加された。溶液は一晩以上おいてはならない。作 業溶液は300μＭ ＣｕＯＯＨで、330μｌの第二ＣｕＯＯＨ貯蔵 溶液と4670μｌ ＰＢＳ−Ｇを混合して作られる。 ５．チミジン（ＴｈＹ）貯蔵溶液 冷却チミジン（ＴｈＹ）貯蔵溶液（1.33mM ＴｈＹ，0.322ｇ/Ｌ）は以下のように調製された。：0.161ｇ ＴｈＹ（Sigma Ｔ 9250）は重量を測定して、tcd Ｈ₂Ｏに最終的な容量が500mlになるように溶解 される。溶液は吸引手法を使用し、無菌ボトル内へ真空濾過により殺菌され入れ られた。溶液は50ml遠心管に分別された。短期間の貯蔵では、冷蔵状態で（４℃ ）で１カ月間安定性を保って保存できる。長期間の貯蔵では、冷凍状態で（−70 ℃）で６カ月間安定性を保って保存できる。チミジン作業溶液は細胞標識に使う 放射性チミジン（Ｈ³ ＴｄＲ）を希釈するのに使用される。 ＴｈＹ＋³Ｈ−ＴｄＲのチミジン作業溶液調製のため、300mlの脱気した無菌tc d Ｈ₂Ｏを次の薬品を添加した：1.15mlの1.33mM ＴｈＹ（冷却）、1.70mlの³Ｈ −ＴｄＲ（ＩＣＮ Part ＃24066）及び300μCi/mmol特異的活性を持つ。一度作 成すれば、冷蔵状態（４℃）で１週間要望される安定性を保って保存できる。 ６．Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）作業溶液 0.0702ｇのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Sigma Ａ 8199）を最終濃度が0.1 Ｍの貯蔵溶液を作成するために４ml ＰＢＳ−Ｇ溶液に溶解した。溶液は12×75 無菌管に１mlアリコートとして分注し、これらのアリコートは−70℃の冷凍庫で １週間まで保存することができる。作業溶液調製のため、 0.1Ｍ ＮＡＣ貯蔵溶液の990μｌのアリコートを29.01mlのＰＢＳ−Ｇ溶液に加え て十分に混合した。溶液は吸引手法を使用し、無菌ボトル内へ真空濾過により殺 菌され入れられた。最終的に、10μｌのこの溶液を３組検査穴に入れられる。Ｎ −アセチル−Ｌ−システイン作業溶液は検査を行う前に毎日新鮮な状態で調製す べきであることは重要である。 この明細書で記述されている特許あるいは出版物は発明に関係する技術のこれ らの技能の水準で示す。これらの特許及び出版物はそれぞれ個々の出版物が特異 的に個別に参照により具体化されたのと同様の範囲でここにおいて具体化される 。 この技術の一つの技能を持つ人はこの発明が目的を実行し、結果を得て利点を 述べることによく適応していることを、それらがそこに本来備わっているものと 同様に容易に評価するだろう。本実施例はここにおいて記載した方法、手順、処 理、分子、及び特異的な化合物とともに選ばれた具体化例の現在の代表であり、 典型例であり、また、発明の範囲制限を意図するものではない。その中の変更及 び他の使用法は請求の範囲で定義されるように発明の趣旨の範囲内の技術の中の これらの技能を持つ人には考え出されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. リンパ球におけるグルタチオンの細胞内機能のレベルの決定及びリンパ球に おける酸化防止剤機能の生化学分析で使用に有用な細胞培養培地であって、以下 のものを含み： 次の成分を含む緩衝化無血清溶液： グルコース及びリンパ球内で生物学的にグルコース生産が可能な化合物が構 成する群から選択された炭水化物生物学的使用可能形式パントテン酸、コリンあ るいはリンパ球内でコリン生産可能な生物学的使用可能形式基質 塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び 鉄を含む生物学的利用可能形式の無機イオン Ｌ−ブチオニンー［Ｓ.Ｒ.］−スルホキシマイン脱イオン水、及び 分析されるリンパ球を刺激する効果的な量のマイトジェン； pHは約6.8から7.6の当該緩衝化無血清溶液、 リンパ球におけるグルタチオンの細胞内機能レベルの決定及び、リンパ球の 酸化防止剤機能の生化学分析に効果的なものとして特徴付けされる当該細胞培養 培地。 2. 請求項１の細胞培養培地で、培地は生物学的に利用可能な形式のアミノ酸及 びビタミンで構成される群から選 択された栄養素補充物が補充されていて、栄養素が栄養素補充において制限ある いは阻害濃度の範囲外に存在するか、その範囲内に存在するのかを検査される。 3. 請求項１の細胞培養培地で、ビタミンは、ビオチン、フォリニン酸あるいは 生物学的に利用可能な形式のフォリニン酸、ニコチンアミドあるいはニコチン酸 、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ₆及びビタミンＢ₁₂及び細胞内でそれら を作り出す能力をもつ化合物で構成される群から選択され；アミノ酸あるいは生 物学的にアミノ酸を細胞内で生産する能力をもつ化合物は、Ｌ−アルギニン、Ｌ −システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン 、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セ リン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトフアン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンを 含み、アミノ酸は群として存在し、それぞれの総量は阻害濃度を越えることはな い培地。 4. 請求項１の細胞培養培地で、Ｌ−ブチオニンー［Ｓ．Ｒ.］−スルフォキシ マインが約50μｌから約500μｌの濃度で存在する培地。 5. 請求項１の細胞培養培地で、ピルビン酸、アデニン、及びイノシトールある いはそれらをリンパ球内で生産することのできる化合物で構成される群から選択 された１種以上の刺激性栄養素をほぼ最大の反応を起こす濃度以 外の濃度で補充されている細胞培養培地。 6. 個体におけるグルタチオンの細胞内機能のレベルの測定及び細胞性酸化防止 剤機能の生化学分析の方法で以下の段階を含む方法： 請求項１の細胞培養培地への固体由来のリンパ球の植え付け； 植え付け細胞培養培地のインキュベーション；及び リンパ球の応答とコントロール群の個体由来のリンパ球の平均的な応答と比 較。 7. ヒトリンパ球におけるシステインの細胞内機能のレベルの決定及びリンパ球 における酸化防止剤機能の生化学分析での使用に有用な細胞培養培地であって、 以下のものを含み： 次の成分を含む緩衝化無血清溶液： グルコース及びリンパ球内で生物学的にグルコース生産が可能な化合物が構 成する群から選択された炭水化物生物学的使用可能形式パントテン酸、コリンあ るいはリンパ球内でコリン生産可能な生物学的使用可能形式基質 塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び 鉄を含む生物学的利用可能形式の無機イオン クメンヒドロペルオキシド、 脱イオン水、 Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、及び 分析されるリンパ球を刺激する効果的な量のマイトジェン； pHが約6.8から7.6である当該緩衝化無血清溶液、 栄養素欠乏、不適合、及び不均衡の決定及び、リンパ球の酸化防止剤機能の 生化学分析に効果的なものとして特徴付けされる当該細胞培養培地。 8. 請求項７の細胞培養培地で、培地は生物学的に利用可能な形式のアミノ酸及 びビタミンで構成される群から選択された栄養素補充物が補充されていて、栄養 素が栄養素補充において制限あるいは阻害濃度の範囲外に存在するか、その範囲 内に存在するのかを検査されるもの。 9. 請求項７の細胞培養培地で、ビタミンが、ビオチン、フォリニン酸あるいは 生物学的に利用可能な形式のフォリニン酸、ニコチンアミドあるいはニコチン酸 、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ₆及びビタミンＢ₁₂及び細胞内でそれら を作り出す能力をもつ化合物で構成される群から選択される；アミノ酸あるいは 生物学的にアミノ酸を細胞内で生産する能力をもつ化合物は、Ｌ−アルギニン、 Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシ ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ− セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリン を含み、アミノ酸は群として 存在し、それぞれの総量は阻害濃度を越えることはない培地。 10. 請求項７の細胞培養培地で、クメンヒドロペルオキシドが約50μＭから約5 00μＭの濃度で存在する培地。 11. 請求項７の細胞培養培地で、最大の反応を起こす濃度以外の濃度のピルビ ン酸、アデニン、及びイノシトールあるいはそれらをリンパ球内で生産すること のできる化合物で構成される群から選択された１種以上の刺激性栄養素で補充さ れている培地。 12. 個体におけるシステインの細胞内機能のレベルの測定及び細胞性酸化防止 剤機能の生化学分析の方法で以下の段階を含む方法： 請求項７の細胞培養培地への個体由来のリンパ球の植え付け； 植え付け細胞培養培地のインキュベーション；及び リンパ球の応答とコントロール群の個体由来のリンパ球の平均的な応答と比 較。