KR20000068213A - 합성 티로이드 호르몬 조성물을 사용하는 눈 치료법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 합성 티로이드 호르몬이 생체내 안압을 감소시키기 위한 조성물로서 사용될 수 있는 발견에 관한 것이다. 안압, 안구방수 압력, 수력학적 전도성, 히알루론산 분비, 및 세포외 매트릭스 조합에 영향을 미치는 합성 티로이드 호르몬을 스크리닝시키는 방법이 제공된다. 또한, 합성 티로이드 호르몬 및 조성물을 제공하는 방법이 제공된다.

Description

합성 티로이드 호르몬 조성물을 사용하는 눈 치료법 {EYE TREATMENTS USING SYNTHETIC THYROID HORMONE COMPOSITIONS}

기술분야

본 발명은 합성 티로이드 호르몬 조성물, 및 증가된 안압 및 녹내장을 치료하는 방법에 관한 것이다.

배경기술

미국에서는 약 200만명, 그리고 세계적으로는 약 1500만명이 녹내장으로 고생하고 있다. 35세 이상의 사람들 중 약 2%가 녹내장의 일부 형태를 앓고 있으며, 모든 경우의 맹인 중 약 12%가 녹내장으로 인한 것이다. 녹내장은 진단이 용이함에도 불구하고, 녹내장에 걸린 환자의 안압(intraocular pressure: IOP)을 저하시키는 치료는 종종 불충분하다. 안압을 저하시키고자 국소용 및 경구용 약물을 사용하는 것은 종종 약물의 부작용에 의해 제한된다. 다른 경우에, 녹내장을 치료하는데 약물 치료를 이용하는 것은 시신경에 대한 진행성 손상을 방지하기에 충분하게 안압을 저하시키는데 그다지 효과적이지 않다.

결과적으로, 녹내장 및 눈 또는 상피의 다른 의학적 증상들을 치료하기 위한 방법, 화합물 및 조성물이 요구되고 있다.

발명의 요약

본원에 설명된 발명 전에는, 티로이드 호르몬 수준의 전신 변화로 인한 IOP의 변화는 간접적인 것으로 가정되거나, 직접적인 경우에는, 상기 티로이드 호르몬으로 유도된 IOP의 변화가 안구에 놓인 아드레날린성 α 또는 β 수용체를 통해 중재되는 것으로 간주되어 왔다. 따라서, 본 발명의 일면은 눈의 생리에 있어서 티로이드 호르몬 수용체의 가장 중요한 역할을 인식하는 것이다. 눈의 티로이드 수용체는 눈 세포에서 티로이드 호르몬 영향을 직접 중재할 기회를 제공한다. 특히, 사람 소주 망구조(human trabecular meshwork: "HTM") 세포의 티로이드 수용체는 HTM 세포에 의해 유지되는 세포외 히알루론산(hyaluronic acid: "HA")의 양을 잠재적으로 중재할 수 있으며, 안구방수 유출에 영향을 줄 수 있다.

본 발명은 티로이드 호르몬 수용체를 함유하는 세포 및 글리코스아미노글리칸(GAG) 생성에 관여하는 세포 작용이 치료제로서 유용한 화합물, 예컨대 GAG 생성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 생체외 또는 생체내 방법의 유용한 성분이 되는 것을 인정하고 있다. 치료제로서 유용한 화합물을 확인하는 방법은 1) 화합물을 소주 망구조 세포와 같이, GAG를 분비하는 세포와 접촉시키는 단계, 및 2) 화합물이 상기 세포에 결합된 것을 검출하는 단계를 포함하며, 화합물의 농도는 10μM 미만이다.

또한, 본 발명은 티로이드 호르몬 및 합성 티로이드 호르몬(STH)이 GAG 생성 또는 세포, 예컨대 소주 망구조 세포로부터의 HA 분비를 직접 조절할 수 있는 것을 인정하고 있다. 따라서, 본 발명은 원하는 세포 또는 조직에서 세포 작용 또는 상기 기질의 양 또는 활성을 감소시키는 화합물, 특히 STH를 사용하여 GAG 생성 또는 HA 분비를 조절하는 것에 관한 것이다. 바람직한 상기 세포로는 소주 망구조 세포, 눈의 섬모 세포, 눈의 내피 세포, 눈외의 내피 세포, 및 피부 및 내부 기관의 섬유아 세포가 있다. 대부분의 경우에, STH는 전신으로도 투여될 수 있을 지라도, STH의 비전신 투여가 바람직하다.

본 발명은 또한 합성 티로이드 호르몬을 필요로 하는 눈에 합성 티로이드 호르몬을 안과적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다. 투여 방법으로는 국소, 안구내 이식 또는 주입, 및 전신 투여 방법이 있다. 눈에 STH를 투여하는 바람직한 방법은 눈에 적합한 약물학적 담체를 이용한 국소 투여 방법 또는 외과적으로 이식가능하거나 주입가능한 장치를 통한 비전신 투여 방법이며, 상기 장치는 안구내로 STH를 지속 방출시킬 수 있는 생분해성 또는 비생분해성 중합체를 포함할 수 있다. 지속 방출 중합체중에 STH를 함유하는 안구 삽입물이 사용될 수 있다.

도면의 간단하 설명

도 1은 T₃보강 배지 또는 T₃제거 배지(T_x없음)에서 배양되는 HTM 세포에 의한 HA 생성을 비교하는 그래프를 도시한 것이다. T₃보강 세포에서의 HA 분비가 상대적으로 적었으며, 2일째 까지 그 차이는 57% 였다. 4일째 까지는, 그 차이가 66%로 증가하였다.

도 2는 배양된 HTM 세포에 의한 HA 생성에 있어서 T₃농도의 영향을 도시한 것이다. HA 생성이 최대로 억제되는 T₃농도는 10^-7내지 10^-6M 이다.

도 3은 10^-7M T₃를 사용하거나 T₃를 사용하지 않고서 4일 동안 인큐베이트된 HTM 세포의 수력학적 전도성을 도시한 그래프이다. T₃로 처리되지 않은 대조 세포는 적당한 양의 에탄올 비이클로 처리되었다.

도 4는 10^-7M T₃를 사용하거나 T₃를 사용하지 않고서 4일 동안 인큐베이트된 HTM 세포의 수력학적 전도성을 도시한 그래프이다.

도 5 내지 9는 여러 가지 STH 구조를 도시하고 있다.

구체예의 상세한 설명

약어

HA는 히알루론산(hyaluronic acid)을 의미한다.

GAG는 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)을 의미한다.

HTM은 사람 소주 망구조(human trabecular meshwork)를 의미한다.

IOP는 안압(intraocular pressure)을 의미한다.

STH는 합성 티로이드 호르몬(synthetic thyroid hormone)을 의미한다.

정의

안압("IOP")는 보편적으로 안구내의 수성 구역, 특히 안구 전방과 관련된 압력을 의미한다. 안압은 본원에 설명된 바와 같이 압평 또는 쉬외쯔(Schiøtz) 안압측정에 의해 측정될 수 있다. 비녹내장성인 사람들 집단에서는, IOP가 정상적으로 분포하는 것으로 나타난다. 압평 안압측정에 의해 측정하는 경우, IOP 평균값은 15.4(±2.5^*)mm Hg(앉았을 때) 및 16.5(±2.6)mm Hg(누웠을 때)이다. 쉬외쯔 안압측정에 의해 측정하는 경우, IOP 평균값은 16.1(±2.8)mm Hg이다. 비녹내장성 환자의 IOP 값은 단지 근사치이다. 집단에 있어서 안압의 실제 도수 분포는 일반적인 집단에서 상이한 부집단(예를 들어, 녹내장 및 연령에 따른 집단)으로 인해 더 높은 수준으로 비대칭될 수 있다.

녹내장은 보편적으로 시신경에 손상을 일으키거나 시각 장애를 일으키는 개개인의 눈의 IOP에 관한 것이다. 일반적인 지침으로서, 21 mm Hg (평균 + 2)를 넘는 IOP는 일반적 집단 중 2.5% 미만에서 발생하며, 24 mm Hg (평균 + 3)를 넘는 IOP는 일반적 집단 중 0.15% 미만에서 발생한다. 21 mm Hg를 넘는 IOP는 종종 녹내장이 전개되고 있는 것을 나타내고, 24 mm Hg를 넘는 IOP는 녹내장이 심한 것을 나타낸다. 개개인의 눈은 증가된 IOP로부터의 시신경 또는 시간에 따른 시각 장애에 대한 감수성이 다르기 때문에, 증가된 IOP 값은 녹내장의 진단 보다는 암시로서 간주되어야 한다. 시야 및 시신경을 사전 평가하는 것이 또한 개개인이 비정상적으로 높은 IOP를 갖지 않는 것을 확실하게 하기 위해서 바람직하다. 녹내장은 또한 폐쇄 우각 녹내장 또는 개방 우각 녹내장 모두를 포함한다. 폐쇄 우각 녹내장은 홍채에 소주 망구조의 부착에 관한 것이다. 개방 우각 녹내장은 소주 망구조 내 또는 그 위로 안구방수 유출에 대한 저항에 관한 것이다. 녹내장에는 또한 정상적인 IOP에서의 시신경 손상에 관한 저긴장성 녹내장이 있다.

합성 티로이드 호르몬("STH")는 보편적으로 티로이드 수용체에 결합하고, 정상적인 티로이드 수용체 호르몬 작용의 효능제, 부분적 효능제 또는 길항체로서 작용하는 분자에 관한 것이다. 효능제는 수용체에 결합할 때 정상적으로 발생하는 분자의 작용을 자극하는 분자에 관한 것이다. 일반적으로, STH는 T₃작용의 효능제 또는 부분적 효능제이며, 화학적 합성에 의해 생성된다. 화학적으로 합성된 T₃및 T₄의 순수한 제조물이 쉽게 이용될 수 있기 때문에, STH는 일반적으로 천연 조직으로부터 단리된 T₃및 T₄를 함유하지 않는다. 세포로부터의 히알루론산("HA") 분비, 특히 눈에서의 HA 분비를 감소시키는데 유용한, 당해 분야에 공지된 STH 또는 신규 STH가 추가로 본원에 설명되어 있다. 바람직하게는, STH는 티로이드 호르몬이 제거된 배지내에서나 티로이드 호르몬의 부재하에서의 HA 분비와 비교하여 사람의 배양된 소주 망구조로부터의 HA 분비를 10μM 미만으로 감소시킬 것이다. STH는 STH의 에스테르 유도체를 포함한다.

본 발명의 목적상, 본원에 교대로 사용되는 용어 "티로이드 호르몬" 또는 "티로이드 호르몬형 화합물"은 쥐 핵과 같은 제조물을 함유하는 티로이드 호르몬 수용체 또는 리간드 결합 영역을 함유하는 순수 또는 실질적으로 순수한 천연 또는 재조합 티로이드 호르몬 α 또는 β 수용체를 사용하여, 결합 검정으로 시험하는 경우 화학 친화도 상수, KD가 1μN 보다 작은 티로이드 호르몬 수용체 TR-α 또는 β에 최소한 부분적으로 결합되는 펩티드를 포함하는 화학 부분이다 [참조 문헌: Lavin, T.N. Mechanisms of Thyroid Hormone action, In the textbook of Endocrinology (DeGroot, Ed.), 2nd Edition, W.B. Saunders, pub. (1989) and Apriletti J. et al J. Biol. Chem. 263 p.9409-9417, 1988]. 상기 리간드는 천연 호르몬과 유사한 작용 효과를 갖는 경우 호르몬으로 간주될 수 있거나 화합물이 천연 호르몬의 효과를 상쇄시키는 경우 효능제로 간주될 수 있다. 부분적 효능제/길항제가 또한 존재할 수 있다. (적합한 리간드는 효능제 또는 길항제일 수 있다).

세포 작용을 설명하는 문맥에서 사용되는 분비는 보편적으로 세포의 내부로부터 세포외 위치까지 분자를 수송하는 세포 작용(들)에 관한 것이다. 글리코스아미노글리칸("GAG")의 경우에, 분비는 수많은 세포 작용, 예컨대 번역후 작용 및 세포 밖으로의 이동을 위한 적당한 세포 부위에의 운반을 포함할 수 있다. 그러나, 분비는 분자의 전체 수송에 관한 것이며 분자의 분비 과정에서 특정 단계에 한하는 것이 아니다.

세포 작용을 설명하는 문맥에서 사용되는 합성은 보편적으로 GAG, 예를 들어 HA와 같은 분자를 생성하는데 관여하는 세포 작용(들)에 관한 것이다. 합성은 분자를 생성하는 세포 밖으로의 분자 이동에 관여할 수 있기 때문에, 용어 "합성"은 본원에 설명된 용어 "분비"를 포함한다.

세포 작용을 설명하는 문맥에서 사용되는 생성은 보편적으로 GAG, 예를 들어 HA와 같은 분자의 정상 상태 수준을 유지시키는데 관여하는 세포 작용(들)에 관한 것이다. 결과적으로, 생성은 합성 및 분비에 관련된 세포 작용에 관한 것이다. 생성은 또한 분자의 정상 상태 수준, 상기 퇴화 경로 및 세포외 매트릭스내에 또는 세포에 분자를 고정시키는 세포외 구조 요소를 유지시키는 세포 및 세포외 작용에 관한 것이다.

STH와 같은 치료 작용제가 일부 조성물 및 상응하는 투여 기술로 치료를 필요로 하는 눈 조직에 운반되는 경우에, 안과적으로 유효한 양은 보편적으로 눈에서 IOP를 감소시키거나 IOP의 상승을 방지하는데 충분한 STH와 같은 치료 작용제의 양에 관한 것이다. 보편적으로, 증가된 IOP는 안내압항진(시신경의 손상 없이 IOP가 지속적으로 증가), 원발 녹내장, 속발 녹내장(예를 들어, 전신 스테로이드 처리) 또는 갑상선저하증과 관련될 것이다. 본원에 설명된 STH는 상기의 의학적 증상들과 관련된 IOP 증가를 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 안과적으로 유효한 양은 시신경 손상 또는 시각 장애를 방지하는데 충분하도록 IOP를 감소시킬 것이며 이러한 IOP의 감소 정도는 증가된 IOP 수준의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상 및 가장 바람직하게는 50% 이상일 것이다. 예상되는 정상적 IOP는 보편적으로 22 mm Hg 미만, 예컨대 15 mm Hg(앉은 위치에서, 압평 안압측정으로 측정)이다. 예상되는 정상적 IOP는 시신경 손상을 방지하기 위해서는 충분히 낮아야 한다. IOP를 감소시키기 위한 성공적인 STH 치료법은 또한 다른 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 환자는 증가된 IOP가 34 mm Hg이고 목표 IOP가 17 mm Hg이라고 하자. 이러한 환자의 시신경 손상을 방지하기 위해서는 IOP를 50% 감소시켜 상기의 목표 IOP를 달성하는 것이 요구될 것이다. IOP에서의 상기 감소율은 간단하게 하기 공식으로 설명될 수 있다: IOP의 감소율(%) = 100 - 100×(치료후 IOP)/(치료전 IOP). IOP의 측정은 눈의 STH 치료를 모니터하고 투여량을 변화시켜 안과적으로 유효한 양을 서로 다른 개개인의 치료에 대한 반응에 맞추기 위한 방법으로서 본원에 더욱 완전하게 설명된다. 상이한 지시 및 운반 기술에 대해 추천되는 안과적으로 유효한 양이 본원에서 더욱 완전하게 설명된다.

도입

본 발명 전에는 티로이드 호르몬이 눈내에서의 히알루론산("HA") 합성 및 안압("IOP")을 직접 조절할 수 있는 것이 인식되지 않았다. 이전에는, 눈 생리에 있어서의 티로이드 호르몬의 역할이 이해되지 않았다. 티로이드 호르몬이 혈뇌 장벽을 충분한 양으로 통과하여 눈에서의 관련 생리학적 효과에 영향을 미치는 것, 눈 세포, 예컨대 소주 망구조 세포가 필요한 티로이드 수용체를 포함하여 티로이드 호르몬 시그날을 구체적으로 중재하는 것, 및 티로이드 호르몬이 소주 망구조 세포에 의한 HA 분비 또는 합성을 직접 조절하거나 IOP를 조절할 수 있는 것이 평가되지 않았다.

본원에 설명된 발명 전에는, 티로이드 호르몬 수준의 전신 변화로 인한 IOP의 변화가 간접적인 것으로 가정되거나, 직접적인 경우에는, 상기 티로이드 호르몬으로 유도된 IOP의 변화가 안구에 놓인 아드레날린성 α 또는 β 수용체를 통해 중재되는 것으로 간주되어 왔다. 따라서, 본 발명의 일면은 눈의 생리에 있어서 티로이드 호르몬 수용체의 가장 중요한 역할을 인식하는 것이다. 눈의 티로이드 수용체는 눈 세포에서 티로이드 호르몬 영향을 직접 중재할 기회를 제공한다. 특히, 사람 소주 망구조("HTM") 세포의 티로이드 수용체는 HTM 세포에 의해 유지되는 세포외 HA의 양을 잠재적으로 중재할 수 있으며, 안구방수 유출에 영향을 줄 수 있다.

정상적으로, IOP의 유지는 소주 망구조를 통해 모양체 및 수성 배출에 의한 수성 분비를 조절하는 것을 필요로 한다. IOP의 가장 중요한 결정 인자 중 하나는 안구방수 유출이다. 안구방수 유출의 대부분은 소주 망구조를 통해 슐렘관내로 이루어지며, 수집관을 통해 공막 맥관내로 배출된다. 유체가 눈에서 방출되어 슐렘관으로 유입되기 전에, 유체는 소주 망구조를 통과한다. 소주 망구조는 상이한 물질 중에서, 분비된 글리코스아미노글리칸("GAG"), 예컨대 분비된 HA의 망구조로 이루어지고, 비틀린 배출 영역을 이루는 소주 망구조 세포는 슐렘관으로 확장된다. HTM 세포는 GAG, 예컨대 HA를 생성하거나 분비한다. HA가 용액의 수력학적 내성을 증가시켜, 한정된 거리로 유체를 수송하는데 필요한 힘을 증가시킬 수 있기 때문에, HA는 잠재적으로 IOP, 특히 증가된 IOP의 중요한 결정 인자로서 작용한다. 이와 같이, 본 발명의 한 가지 구체예는 HA 분비 또는 합성을 감소시키기 위해, 사람의 소주 망구조 세포에 STH를 안과적 유효량으로 투여함으로써 눈에서 소주 망구조 세포로부터의 HA 분비를 유용하게 조절하도록 설정된다. 본 발명의 또 다른 구체예는 녹내장 치료에 유도되는 방법과 같이, HA 분비를 억제하는 것을 그다지 필요로 하지 않는다.

본 발명의 전반에 걸쳐서, 본 발명은 다음과 같이 5가지 이상의 범주의 유용한 방법, 화합물 및 조성물을 제공한다:

1) 티로이드 호르몬 또는 GAG 생성 또는 작용과 관련된 의학적 증상들을 치료하기 위한 치료학적 화합물을 확인하는 방법;

2) GAG 또는 히알루론산에 관련된 의학적 증상에서 GAG 또는 히알루론산 생성 또는 작용을 조절하는 방법;

3) STH를 사용하여 녹내장을 치료하는 방법;

4) 눈에 STH를 표적화시키는 것과 관련된 조성물, 예컨대 합성 티로이드 호르몬의 에스테르 및 디에스테르 유도체; 및

5) 상기 1) 내지 3)에 기재된 방법 및 4)에 기재된 화합물에 관련된 조성물.

예를 들어, 본 발명의 한 가지 구체예는 치료 작용제, 예컨대 안과적 치료 작용제로서 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다:

1) GAG 또는 HA를 분비하는 세포, 예컨대 HTM 세포를 사용하는 화합물을 스크리닝시키는 단계;

2) 시험 화합물의 부재의 경우와 비교하여 시험 화합물의 존재하에서의 GAG 또는 HA 생성의 변화를 측정하는 단계; 및

3) GAG 또는 HA 생성과 관련된 의학적 증상, 예컨대 녹내장을 치료하는데 유용한 화합물을 선택하는 단계.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포, 예컨대 HTM 세포에 STH를 유효량으로 투여함으로써, 세포에 의한 GAG의 생성을 조절하는 방법을 제공한다. 투여된 STH가 티로이드 호르몬의 효능제 또는 부분적 효능제인 경우에, GAG의 생성은 일반적으로 감소될 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 각막 투과를 증가시키는 에스테르 유도체를 사용하여 눈에 표적화될 수 있고 투여되는 STH의 전신 영향을 최소화하기 위해 국부적으로 투여된 후에 눈에서 대사되는 STH에 관한 것이다. 상기 방법, 화합물 및 조성물의 조합이 또한 숙고된다. 다른 방법, 화합물 및 조성물이 본원에서 더욱 완전하게 설명된다.

약물 발견: 히알루론산 분비 또는 IOP를 조절하기 위해 스크리닝시키는 방법

본 발명은 티로이드 호르몬 수용체를 함유하는 세포 및 GAG 생성에 관여하는 세포 작용이 치료제로서 유용한 화합물, 예컨대 GAG 생성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 생체외 또는 생체내 방법의 유용한 성분이 되는 것을 인정하고 있다. 일반적으로 상기 확인 방법은 고산출성의 자동화된 스크리닝을 허용하는 스크리닝 검정 시스템과 관련된다. 치료제로서 유용한 화합물을 확인하는 방법은 1) 화합물을 소주 망구조 세포와 같이, GAG를 분비하는 세포와 접촉시키는 단계, 및 2) 화합물을 상기 세포에 결합된 것을 검출하는 단계를 포함하며, 화합물의 농도는 10μM 미만이다. 상기의 결합 검출 단계는 당해 분야에서 개발되거나 본원에 설명된 바와 같이 관련 작용(예를 들어, HA 생성)을 검정하는 방법을 포함할 수 있다.

HTM 세포가 안과적으로 활성이 있는 화합물에 대한 스크리닝에 바람직할 지라도, 다른 세포 유형이 HTM 세포 대신 쉽게 대체될 수 있는데, 특히 이들 세포가 1) 전달된 유전자로부터 발현되거나 내인적으로 발현되는 티로이드 수용체 및 2) GAG의 생성에 관여하는 단백질, 예컨대 HA 합성 효소를 함유하는 경우에 그러하다. 예를 들어, 피부 섬유아 세포가 상기 검정에 사용될 수 있으며, 이것은 피부에서의 GAG의 과생성을 억제하는 화합물에 대해 스크리닝하는 경우에, 또는 HTM 세포가 표본으로부터 이용될 수 없는 경우의 HTM 세포에 대한 편리한 대체물로서 특히 바람직한 선택이다. 부가적으로, 비 HTM, GAG 생성 세포가 상기 스크리닝 검정에 사용되는 경우, GAG의 생성에서 α 및 β 티로이드 수용체 서브 타입간의 가능한 인터-플레이를 모방하기 위해, 재조합 기술을 통해 HTM 세포와 같은 티로이드 수용체 유형을 갖는 세포를 선택하거나 발생시키는 것이 바람직하다.

사람 소주 망구조(HTM) 세포가 STH와 같은 화합물을 스크리닝하는데 사용되는 경우, HTM 세포는 본원 또는 각각 본원에 참고 문헌으로서 인용되는 하기 문헌에 설명되는 바와 같이 제조될 수 있다 [참고문헌: Polansky et al., Trabecular meshwork cell culture in glaucoma research, Ophthalmology, 1984; 91:580-595; Polansky et al., Human trabecular cells I: Establishment in tissue culture and growth characteristics, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1979; 18:1043-1049; Alvarado et al., Human trabecular cells II: Ultrastructural characteristics of cultured trabecular cells, Invest. Ophthalmol, Vis. Sci., 23:464-478 (1982); and Polansky et al., Studies on human trabecular cells propagated in vitro, Vision Res., 1981; 21:155]. 본원에 설명되는 스크리닝 검정에 있어서, 3번째 내지 5번째 통과 HTM 배양물은 냉동 보존된 원액으로부터 사용되고, 약 10,000 세포/cm²로 플레이팅되고, 예컨대 10% 우태아 혈청(FCS)을 갖는 둘베코 변형 이글스(Dulbecco's modified Eagle: DME) 배지에서 후융합으로 7일 내지 10일 동안 성장되어 안정한 내피형 단일층이 수득된다. 예컨대 GAG, HA 또는 단백질 합성, 또는 전사 검정은 이러한 안정한 HTM 단일층 배양물을 사용하여 수행될 수 있다. 소주 망구조 세포는 또한 토끼, 쥐, 마우스, 피그, 고양이 또는 원숭이의 눈으로부터 단리되어 본원에 설명되는 검정에 사용될 수 있다.

HTM 세포 분열에 대한 STH의 검정은 또한 10% FCS를 갖는 DME 배지를 사용하여 성장 배양물상에서 평가될 수 있다. STH 치료법은 HTM 세포가 2,500 세포/cm²로 플레이팅 된 후 시작할 수 있다. 효과는 성장(7일)의 로그 단계 동안 및 대조 배양물이 융합(배양 배지에서 혈청 및 HTM 세포선에 따라, 3 내지 6주임)에 도달한 후에 측정된다.

스크리닝 검정에 사용되는 세포, 예컨대 HTM 세포에의 STH와 같은 화합물의 결합은 다양한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 세포에 결합된 화합물의 양을 직접 검출하는 방법은 예컨대 동위 원소, 분광 또는 형광 표지를 갖는 화합물을 이용하는 결합 검정과 같이, 사용될 수 있다. 직접적인 검출은 전체 세포, 단리 핵 또는 염색질 또는 이것의 조합체를 사용하여, 사람 소주 망구조 세포 내부의 세포내 수용체, 예컨대 티로이드 수용체에의 화합물의 특이적 결합을 측정하는 것을 포함한다. 티로이드 호르몬 결합 또는 유사체 결합의 정량화는 당해 분야에 공지된 방법 또는 본원에 참고 문헌으로서 인용되는 하기 문헌에 의해 설명되는 방법을 포함하여, 앞으로 개발되는 방법을 사용하여 수행될 수 있다 [참고 문헌: Schwartz, H.L. et al., J. Biol. Chem. 17:11794-11799 (1992)]. 직접적인 검출 방법은 합성 티로이드 호르몬의 수용체에 대한 이 호르몬의 친화도, 티로이드 수용체에 결합되는 에스테르화 또는 비에스테르화된 유도체의 능력, 및 STH 흡수의 평가 표준을 결정하는데 유용할 것이다.

대안적으로, 화합물의 결합량을 간접적으로 검출하는 방법이, 예컨대 보고 유전자 구성, DNA 전사, RNA 수준, 단백질 분해 또는 합성, 복잡한 당 분해 또는 합성 및 GAG 합성 또는 분해에 대한 STH 영향을 검출하는 기능 검정과 같이 사용될 수 있다. 본원에 설명되는 다른 기능 측정이 또한 기능 검정에 사용될 수 있다. 생체외 및 생체내 방법 모두가 화합물의 결합을 검정하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 눈의 소주 망구조에서 안구방수 유출 저항을 조절하는 STH와 같은 화합물을 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시험되는 화합물의 존재 및 부재하에 소주 망구조 세포로부터의 GAG 생성 또는 히알루론산 분비의 변화를 측정함으로써 소주 망구조 세포, 예컨대 HTM(사람 소주 망구조) 세포에의 화합물의 결합을 검출하는 것이 유용할 것이다. 상기 대조군이 본원에 설명되는 검정에 사용될 수 있고, 다른 대조군이 쉽게 교체되어, 예컨대, 검출가능한 수준의 기능적 티로이드 수용체 없이 세포를 사용하거나 부가된 STH의 작용을 차단시킴으로써, 특이적 검출을 달성할 수 있음이 인지될 것이다. 부가적으로, 대조값 및 대조값의 변동이 잘 한정됨이 인지될 것이다. 이러한 경우에, 대조값 및 대조값의 변동이 확인되고 실험값이 대조군의 부재하에 적당하게 측정될 수 있기 때문에 대조군을 정기적으로 유도하는 것이 그다지 필요하지 않을 것이다.

STH와 같은 화합물이 세포, 예컨대 HTM 세포에 결합하는 것이 측정되면, 세포 기능, 예컨대 GAG 생성의 유용한 조절 인자가 선택될 수 있다. 선택 기준은 일반적으로 시험되는 화합물에 의해 생성되는 조절의 범위를 기준으로 한다. GAG 생성 또는 HA 분비(또는 생성)의 경우에, 화합물은 일반적으로 GAG의 세포 생성을 억제하거나 감소시킬 수 있는 능력에 따라 선택될 것이다. 상기 화합물은 부적당한 GAG 생성 또는 HA 분비에 의해 유발되는 의학적 증상의 치료에 유용하다. 상기 화합물은 또한 눈 또는 녹내장에서의 감소된 안구방수 유출을 치료하는데 유용하다. 보편적으로, 대조군 GAG 생성과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상 및 더욱 바람직하게는 70% 이상까지 GAG 생성을 억제하는 화합물이 유용한 화합물로서 선택될 것이다. 상기 비율의 억제 기준이 본원에 설명된 검정에 사용되는 다른 측정, 예컨대 HA 분비, HA 결합의 검출, IOP의 측정에 적용될 수 있다.

더욱 구체적인 선택 기준이 세포 작용을 더욱 구체적으로 조절하는 화합물을 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다. 화합물의 수용체에 대해 시험되는 화합물의 친화도는 종종 화합물의 특이성을 규정할 수 있음이 인지될 것이다. 결과적으로, 매우 명백하거나 실제적인 친화도를 이용하여 기능을 조절하거나 수용체에 결합하는 화합물을 선택하는 것이 바람직하다. STH의 경우에, 친화도는 티로이드 수용체에 대한 T₃(생리학적 조건하에서 0.024nM) 또는 T₄(생리학적 조건하에서 0.26nM)의 친화도에 가깝다. 장기간 지속되고 선택적인 효과가 있는 STH에 있어서, 기능 검정으로부터 유도되는 명백한 친화도 또는 티로이드 수용체에 대한 더 높은 친화도, 예컨대 생리학적 조건하에 0.1nM 이하의 친화도를 갖는 STH를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 원하는 결과를 달성하기 위해, 새로운 화합물 또는 공지된 STH가 사전 결정된 농도에서 합성되거나 스크리닝될 수 있다. 보편적으로, 합성 티로이드 호르몬은 1.0μM 이하, 바람직하게는 0.1μM 이하 및 가장 바람직하게는 0.01μM 이하에서 GAG 생성 또는 히알루론산 분비를 감소시킬 것이다. 특히 STH가 높은 ED50을 갖는 경우에는, 10 내지 75μM과 같은 더 높은 농도도 사용될 수 있다. 본원에 설명되는 억제도 기준이 이러한 농도 선택 기준에 적용될 수 있다.

GAG 생성과 같은 세포 작용을 조절하는데 유용한 화합물을 확인하는 것은 생체외 및 생체내 스크리닝 검정 모두를 포함할 수 있다. 보편적으로, 화합물은 생체외 검정을 사용하여 먼저 스크리닝된 다음, 생체내 검정을 사용하여 스크리닝될 것이다. 본원에 설명되는 생체내 검정 및 측정은 STH와 같이 유용한 화합물을 추가로 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체외 검정은 10nM의 명백한 친화도를 이용하여 HA 분비의 40%를 억제하는 STH를 확인할 것이며 STH는 포유류의 눈에 합성 티로이드 호르몬을 국소적으로 투여함으로써 추가로 검정된다. 대안적으로, 생체내 검정은 화합물을 확인하는데 단독으로 사용될 수 있다.

GAG 생성 및 히알루론산 분비와 관련된 의학적 증상 및 녹내장을 치료하는 방법

본 발명은 티로이드 호르몬 및 STH가 세포, 예컨대 소주 망구조 세포로부터의 GAG 생성 또는 HA 분비를 직접 조절할 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 원하는 세포 또는 조직에서 세포 작용 또는 상기 물질의 활성 또는 양을 감소시키는 화합물, 특히 STH를 사용하여 GAG 생성 또는 HA 분비를 조절하는 것에 관한 것이다. 바람직한 상기 세포로는 소주 망구조 세포, 눈의 섬모 세포, 눈의 내피 세포, 눈외의 내피 세포, 및 피부 및 내부 기관의 섬유아 세포가 있다. 대부분의 경우에, STH는 전신으로도 투여될 수 있을 지라도, STH의 비전신 투여가 바람직하다.

예를 들어, 본 발명은 히알루론산을 분비하는 세포로부터 히알루론산 분비를 억제하는 합성 히알루론산을 유효량으로 비전신 투여하는 것을 포함하여 히알루론산 분비를 억제시키는 방법을 포함하며, 이 방법에서 농도가 10μM 이하인 합성 티로이드 호르몬은 37℃에서의 3일간 배양 후 합성 티로이드 호르몬의 부재하에 배양된 사람 소주 망구조 세포와 비교하여, 37℃에서의 3일간 배양 후 배양된 사람 소주 망구조 세포로부터의 전체 히알루론산 분비를 10% 이상 억제한다. 바람직하게는, 세포가 살아있는 눈의 사람 소주 망구조 내에 또는 단리된 눈 조직내에 있든지, STH는 0.1 내지 1μM 농도에서 소주 망구조 세포에 의해 HA 분비를 10% 이상 억제할 것이다. 보편적으로, HA 분비 억제 방법은 천연 조직으로부터 단리되는 T₃의 결막하 주사 또는 안내 주사(1), 또는 T₃또는 T₄의 국소 투여(2)를 포함하지 않을 것이다. 비전신 투여는 국소 및 안내 투여 모두를 포함한다. 국소 투여는 예를 들어, 이식, 접촉, 웨이퍼 또는 정제를 포함하여, 눈에 적용가능한 식염수 용액과 같은 용액 및 의도된 세포 또는 조직 표적물, 및 다른 안외 운반 시스템과 생체 적합 및 조직 적합될 수 있는 다른 용액과 기질의 국부 적용, 연고 또는 크림의 국부 적용, 눈꺼풀 아래에 삽입되는 안구 삽입물을 포함하는 비외과적으로 장착된 지속 방출 수단 및 국부적으로 적용되는 중합체로부터의 지속 방출을 포함한다. 안내 투여는 예를 들어, 생분해가능하거나 생분해가능하지 않는 지속 방출 중합체를 포함할 수 있는, 외과적으로 이식가능하거나 주입가능한 안내 지속 방출 수단을 포함한다. 비전신 투여되는 유효량 및 유효한 국부 농도의 활성 화합물 및 눈에 적합한 약물학적 조성물(담체 포함)이 본원에 설명되어 있다.

본 발명은 또한 치료제로서 효과가 있는, GAG 생성 또는 HA 분비의 억제에 의존할 필요가 그다지 없는 본 발명의 구체예를 포함한다. 본 발명의 이러한 구체예는 녹내장 치료법, 광질 코르티코이드 또는 스테로이드 치료와 관련된 IOP 증가와 같이, IOP 증가를 감소시키거나 방지하는 방법 및 눈에서의 안구방수 유출과 같이, 조직 유체 흐름 또는 배수를 증가시키는 방법을 포함한다. 바람직하게 이러한 방법들은 포유류, 바람직하게는 사람에게서 치료를 필요로 하는 조직 또는 세포에 활성 화합물을 치료학적 유효량으로 비전신 투여하는 것에 의존한다.

예를 들어, 본 발명은 합성 티로이드 호르몬을 필요로 하는 눈에 합성 티로이드 호르몬을 안과적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다. 눈에 국부 투여하는 것은 천연 조직으로부터 단리되는 T₃의 결막하 주사(1), T₃또는 T₄의 국소 투여(2), 또는 백내장에 걸린 눈에 T₃또는 T₄를 투여(3)하는 것을 포함하지 않는다. 눈에의 STH의 바람직한 투여 방법은 안내로 STH의 지속 방출을 제공하는 중합체를 임의로 함유할 수 있는 이식물을 사용하는 비전신 투여 또는 눈에 적합한 약물학적 담체를 국소 투여하는 것이다. 상기의 STH의 조절된 방출은 6개월 내지 1년간 지속될 수 있다. 상기 이식물은 매트릭스를 생분해할 수 있는 삼투 펌프 또는 안내의 지속 방출 수단일 수 있다. 이식물은 또한 접촉으로부터 합성 티로이드 호르몬의 확산을 허용하는 합성 티로이드 호르몬으로 포화된 안 접촉물을 포함한다. 녹내장 치료에 있어서, 각각의 눈에 대한 유효량은 일반적으로 0.01 내지 40㎍/day, 바람직하게는 10 내지 1,000ng/day, 및 더욱 바람직하게는 10 내지 50ng/day 이다. 바람직하게는, 국소 적용은 눈에 적합한 약물학적 담체를 포함하는 용액을 1방울 이상(예를 들어, 30 내지 50㎕)를 투여하는 것을 포함한다. 운반 시스템에 따라 달라지는 다른 용량, 유효량 및 유효 농도가 본원에 완전히 상세하게 설명된다. 일반적으로 소주 망구조의 소주 망구조 세포에서 1 내지 50pM의 STH 농도를 달성하는 것이 바람직하다. 눈에서 티로이드 수용체 대한 STH의 명백한 친화도가 각각 10 내지 100nM(kd) 및 100 내지 1,000nM(kd)인 경우에, 10 내지 1,000 nM 및 100 내지 10,000nM의 더 높은 농도가 바람직하게 달성된다.

보편적으로, 눈에 (비전신으로 또는 전신으로) 투여되는 STH는 일반적으로 본원에 설명되는 검정과 같이, 생체외 또는 생체내 검정에서 활성일 것이다. 녹내장에 있어서, 농도가 10μM 이하인 합성 티로이드 호르몬으로의 치료는 일반적으로 투여되는 합성 티로이드 호르몬의 부재하에 배양되는 소주 망구조 세포로부터의 히알루론산 분비와 비교하여, 소주 망구조 세포로부터의 히알루론산 분비를 10% 이상 감소시킬 것이다. 원하는 경우, 국소적으로 투여되는 STH의 효능은 STH를 국소적으로 투여하기 전 및 후 또는 치료 과정 동안에의 안압 및 본원에 설명되는 치료에 대한 개개인의 반응으로 조절되는 용량을 측정함으로써 모니터될 수 있다. STH의 혈청 수준은 또한 원하지 않는 전신 효과를 피하기 위해 측정될 수 있다.

녹내장 치료의 경우에, 전신으로 정위되는 티로이드 호르몬의 활성화 또는 탈활성화로 인한 전신 효과를 피하기 위해 STH를 비전신으로 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명은 비전신 투여되는 STH로 치료된 조직을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 소주 망구조 세포 내부의 합성 티로이드 호르몬을 포함하는 조성물을 제공하는 것이며, 여기에서 합성 티로이드 호르몬은 혈안 장벽을 통과하지 않는다. 세포 내부는 세포질, 세포핵 또는 다른 세포 기관 같이, 세포외 환경과 유체 접촉하지 않는 세포내의 위치를 의미한다. 혈안 장벽은 혈액으로부터 눈의 조직을 분리하는 조직을 의미한다. 바람직하게는, 각막 상피 내부의 STH는 합성 티로이드 호르몬의 에스테르화된 유도체이다. 세포는 살아있는 눈 내 또는 외식편으로부터의 소주 망구조 세포, 눈의 섬모 세포 및 상피 세포, 또는 본원에 언급된 다른 세포 및 조직을 포함한다. 보편적으로, 세포 내부의 STH의 농도는 0.04ng/dl^-1이상일 것이다. 세포내의 STH의 양(방출 및 결합된 양) 및 농도는 당해 분야에 공지된 방법 또는 본원에 참고 문헌으로서 인용되는 하기 문헌에 의해 설명되는 방법을 포함하여, 앞으로 개발되는 방법을 사용하여 측정될 수 있다 [참고 문헌: Oppenheimer, J. H. et al., J. Clin. Invest., 75:147-154 (1985); Schwartz, H. L., et al., Endrocrinology, 113:1236 (1983)]. 세포 내부에 있는 방출 STH의 농도는 일반적으로 1pM 이상, 바람직하게는 10pM 이상 및 가장 바람직하게는 100pM 이상일 것이다.

눈의 스테로이드 치료 및 구강 스테로이드의 사용이 더욱 빈번해짐에 따라, 잠재적인 부작용, 예컨대 IOP 증가가 초래되었다. 이러한 부작용에 대한 우려로 효능있는 스테로이드 및 활성이 덜한 스테로이드 모두를 눈에 장기간 사용하는 것이 제한되었는데, 특히 인식하지 못하는 IOP의 증가로 인해 고칠 수 없는 실명이 일어나는 수많은 경우가 보고되었기 때문이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 IOP의 부적당한 증가가 측정되거나 상기 증가가 예상되는, 스테로이드 치료를 받는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.

증가된 IOP는 또한 예컨대 안내의 외과적 상처 이후, 레이저 치료 후, 또는 외상 후의 다른 의학적 증상으로 발생할 수 있다. IOP는 본원에 설명되는 다른 방법을 사용하여 예방적으로나 치료후 또는 외상후에 STH에 의해 조절될 수 있다.

IOP(P_O: mm Hg 단위)는 안구 방수의 분비 속도(F: ㎕/min 단위)에 비례하고 안구방수 유출률(C)에 반비례한다:

P_O= F/C + P_e

상기식에서, P_e는 공막 정맥압(mm Hg)이다. P_e는 공막 정맥압에 대한 더욱 구체적인 약자로서 P_v보다 바람직하다. 눈에 대한 STH의 투여, 특히 비전신 투여는 필요로 하는 환자에게서 임상 학자가 안구방수 유출률(C)를 증가시키고 IOP 증가를 감소시킬 수 있게 한다. 이러한 치료는, 본원에 설명되는 다른 치료와 더불어, 녹내장, 외상, 또는 외과적 상처의 발명과 관련되는 IOP의 증가를 방지하기 위해 예방학적으로 사용될 수 있다. STH는 다른 치료를 위해 본원에 설명되는 바와 같이 투여될 수 있다.

녹내장의 전신 치료가 또한 숙고된다. 이러한 전신 치료는 혈액 T₃및 T₄수준이 당해 분야에 공지된 비독성 수준으로 유지되는 것을 확인하기 위해 모니터되는 T₃및 T₄혈액 수준과 관련될 수 있으며 하기 문헌에 기재된 방법과 같이, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 모니터될 수 있다 [참고 문헌: Murphy, B.P. et al., J. Lab and Clin. Med., 66:161-167 (1965)]. 일반적으로, 갑상선 저하증 환자 또는 티로이드-호르몬 대체 치료법 환자에게서 IOP 증가와 관련된 의학적 증상이 확인되지 않고 상기 치료를 필요로 하지 않는 한, 상기 치료는 상기 환자들에게는 적용되지 않을 것이다. 바람직하게는, 증가된 IOP에 대해 STH 치료를 필요로 하는 상기 환자는 갑상선 항진 환자일 것이다. 또한, STH를 이용한 전신 치료를 필요로 하는 환자는 증가된 IOP를 제거하기 위해, 갑상선 항진와 유사한 T₃및 T₄또는 다른 STH의 전신 수준의 주기를 견딜 수 있다. 전신으로 투여되는 티로이드 호르몬의 하루 용량은 T₃에 대해서는 0.2 내지 2.5㎍/kg/day(바람직하게는 0.2 내지 1㎍/kg/day)이고, T₄에 대해서는 0.1 내지 10㎍/kg/day(바람직하게는 1 내지 4㎍/kg/day)이다. STH는 T₃및 T₄의 분자량에 따라 달라질 수 있기 때문에, 투여되는 STH의 양을 조절하는 것이 적합하다. 또한 IOP를 감소시키는 STH의 능력은 적당한 투여 계획을 설정하기 위해 생체외 및 생체내에서의 T₃및 T₄와 비교될 수 있다.

본원에 설명되는 치료는 또한 IOP 증가와 과련된 의학적 증상, 예컨대 녹내장 및 안구 고혈압을 방지하는데 사용될 수 있다. IOP 증가에 민감한 환자들은 우려되는 IOP의 증가가 일어나기 전에 효과적으로 치료될 수 있다. 이러한 환자들로는 안내 외과 수술 또는 레이저 치료를 경험한 환자들이 포함된다.

합성 티로이드 호르몬

본 발명은 2가지 부류의 신규 화합물을 포함한다. 제 1 부류의 화합물로는 STH의 모노에스테르 및 디에스테르 유도체를 포함하는 공지된 합성 티로이드 호르몬의 에스테르 유도체가 포함된다. 이러한 제 1 부류의 화합물은 본 발명의 방법에 사용될 수 있을지라도, 당해 분야에 이미 공지된 STH의 에스테르 유도체를 포함하지 않는다. 제 2 부류의 화합물로는 신규 STH 및 이들의 에스테르 유도체가 포함된다. 보편적으로, 에스테르 유도체는 하기 화학식에서 1, 2 또는 3개 이상의 위치에서 에스테르기를 갖는 STH이다:

X₁-O-C(O)-Y

상기식에서,

X₁은 하기에 정의된 것이며,

Y는 X₁의 측기 및 에스테르와 양립할 수 있는 기, 예를 들어 탄소수가 2 내지 20개인 알킬, 알케닐 또는 아릴기이다. 보편적으로, 상기 Y기는 크기면에서 원자수가 40개 미만, 일반적으로는 30개 미만이며, 바람직하게는 소수성이고 전하를 갖지 않는다. 디에스테르 유도체는 보편적으로 X₁-O-C(O)-B-C(O)-O-X₂(이 식에서, B는 일반적으로 길이면에서 탄소수가 6개 미만인 결합체이다)이며, X₁및 X₂는 화학식(I)의 STH이다:

(I)

상기식에서,

R₂는 H, 할로겐, CF₃, OH, NH₂, SH, CH₃, Et이고,

R₃는 H, 할로겐, CF₃, OH, NH₂, N₃, SH, CH₃, Et이고,

R₅는 H, 할로겐, CF₃, OH, NH₂, N₃, SH, CH₃, Et이고,

R₆는 H, 할로겐, CF₃, OH, NH₂,SH, CH₃이고,

'R₂는 H, 할로겐, CF₃, OH, NH₂, N₃, SH, CH₃, Et이고,

'R₃는 H, 할로겐, CF₃, SH, 아킬, 아릴, 5원 또는 6원 헤테로고리 방향족 또는 시아노이고,

'R₄는 H, 할로겐, CF₃, OH, NH₂, SH, CH₃, Et, 알킬, 아릴, R'₄위치에서 O, N 또는 S에 우레아 또는 카르바메이트 결합기를 통해 결합되는 5원 또는 6원 헤테로고리 방향족이고,

'R₅는 알킬, 아릴, 5원 또는 6원 헤테로 고리 방향족, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 알킬, 폴리방향족, 폴리헤테로 방향족이며, 극성기 또는 하전된 기로 치환될 수 있고,

'R₆는 H, 할로겐, CF₃, OH, NH₂, SH, CH₃, Et이고,

X는 O, S, SO₂, NH, NR₇, CH₂, CHR₇, CR₇R₇(여기에서, R₇는 알킬, 아릴, 5원 또는 6원 헤테로고리 방향족이다)이며,

'R₁내지 'R₆및 R₁내지 R₆기 중 어느 하나는 B에 대한 결합으로 대체될 수 있다. 일반적으로 R 내지 R₇기는 원자수가 30개 미만이다. 바람직하게는 디에스테르 유도체는 세포내에서 가수분해 효소에 의해 가수분해되는 경우 2개의 동일한 분자를 생성한다.

바람직하게는, STH는 하기 화학식(II)로 표현된다:

(II)

상기식에서, Y는 상기에 정의한 바와 같다.

일반적으로, 녹내장 환자 또는 눈 치료를 필요로 하는 다른 유형의 환자에게 점안제로서 STH를 국부적으로 투여할 것이다. 그러나, STH가 상기 방식으로 투여되는 경우, 투여량의 단지 약 0.1 내지 1.0%가 눈에 국소적으로 흡수되고 투여량의 상당량은 혈류내로 이동할 수 있다. 눈에서의 STH의 낮은 흡수율은 하기의 3가지 이상의 인자에 의해 초래될 수 있는데, 이것은 STH 에스테르 유도체를 사용함으로써 감소될 수 있다: 1) 점안제는 눈의 표면으로부터 빠르게 흘러내림, 2) 결막 및/또는 코점막을 통해 혈류내로 STH의 빠른 흡수, 및 3) STH의 불량한 각막 투과량. STH는 각막을 통해 눈내로 흡수된다. 각막에서 STH는 먼저 세포막 지질을 함유하는 눈 표면상의 상피층내로 흡수된다. 하전된 기를 갖는 STH의 지방 용해도가 감소하며, 이것은 각막 상피를 통한 확산을 감소시킬 수 있다. STH의 지방 용해도가 개선되는 경우(예를 들어 에스테르화를 통해 개선됨), STH의 각막 상피 투과가 증가하여, 안내의 표적 조직 세포에 대한 전달이 더 증가하게 된다. 각막은 또한 각각의 상피 및 기질을 통해 안구 전방의 유체내로, 및 소주 망구조 세포와 섬모 세포에 STH를 전달하기 위한 저장 부위로서 작용할 수 있다. 부가적으로, 세포, 예컨대 소주 망구조 세포에서의, STH 에스테르의 가수분해는 세포내로 가수분해되지 않은 STH 에스테르 유도체에 대한 일정한 확산 구배가 이루어지게 한다. 세포내에서의 가수분해되지 않은 STH 에스테르 유도체의 농도가 에스테르 가수분해 및 약물 형성으로 인해 낮게 유지되는 경우, 가수분해되지 않은 STH 에스테르 유도체는 세포내로 연속적으로 확산되는 반면, 가수분해된 형태의 STH는 세포 내부에 축적된다. 이와 같이, STH의 에스테르 유도체는 STH의 투과도를 증가시킬 것이고 표적 조직 및 세포에의 STH의 축적을 촉진시킬 것이다.

STH 에스테르 유도체의 안정성은 완충 가수분해 시스템에서 시험될 것이다. 완충액의 이온 세기(μ)는 일반적으로 0.5 이다. 4.0, 6.0, 7.4 및 9.0의 pH가 37℃, 50℃, 60℃ 및 70℃를 포함하는 온도와 함께 사용될 수 있다. 반감 시간(T_1/2)은 특정 pH의 완충 용액에서 연구되는 화합물 각각에 대해 수득되는 분해 상수 k에 대해 계산될 수 있다(T_1/2=0.693/k; k=2.303×kk, 여기에서 kk는 시간에 대한 함수로서 남아있는 에스테르의 로그값을 예시하는 도시의 각도 계수이다).

상이한 저장 조건하에 STH의 에스테르 유도체의 저장 안정성은 상이한 온도에서 분해 상수를 측정하고, 분해 온도를 계산하고, 하기 아레니우스 방정식(1)에 상응하는 도시 방정식으로부터 원하는 온도에서 분해 상수 k를 계산함으로써 평가될 수 있으며, log k는 [I/T]의 함수로서 주어진다:

원하는 온도에서 수득되는 분해 상수(k)로부터 약물의 10%가 분해되는 동안의 시간을 나타내는 보장 기간 시간 t_10%(t_10%=0.104/k)이 계산될 수 있다.

STH 에스테르 유도체의 친유성은 pH 7.40에서 화합물에 대한 분배 계수(P)를 측정함으로써 연구될 수 있다. 측정은 HPLC에 의한 수성 완충액 경우에 연구되는 화합물의 농도를 측정함으로써 옥탄올-수성 완충액 혼합물에서 또한 수행될 수 있다. 그러나, 친유성 화합물의 분배 계수는 보유 시간으로부터 가역상(RP) 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정된다(베크만 116 펌프 및 166UV 검출기; 마라톤 자동 샘플 공급기).

신규 STH 에스테르 유도체의 효소 가수분해의 반감 시간은 당해 분야에 공지된 바와 같이 37℃에서 pH 7.4의 플라즈마/완충액 혼합물(80%-20%)에서 측정될 수 있다. STH 에스테르 유도체의 각막 투과율은 각막을 통해 전단상(상피면)으로부터 확산실의 수용면(상피면)으로의 이동을 모니터함으로써 평가될 수 있다. 예컨대, 토끼 눈의 각막이 사용될 수 있다. 확산실의 수용부로부터 얻은 샘플은 HPLC로 측정되는 바와 같이, 전구 약물 및 방출된 약물의 2가지 농도 모두를 제공한다. 이와 같이, 각막에서 전구 약물의 분해 속도가 전구 약물의 각막 투과와 같이 측정될 수 있다.

약제학적 조성물

본 발명은 또한 당해 분야에 공지되고 본원에 설명된 방법들에 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 포함한다. 보편적으로, 조성물은, STH, 특히 STH 에스테르 유도체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 것이다. 조성물은 종종 당해 분야에 공지되고 본원에 기재된 특정 방식의 운반과 종종 결부된다. 본 발명에 사용하기 위한 STH의 정확한 유형 및 양은 예컨대, 선택되는 특이 약물, 이것의 투약 형태, 즉 표준에 대한 지속 방출, 약물이 투여되는 조건 및 시험되는 포유류의 크기와 종류에 따라 변할 것이다. 본원에 설명되는 바와 같이, 본원에 설명되는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 예컨대, IOP의 증가를 방지하거나 증가된 IOP를 실질적으로 감소시키기 위해, 세포 및 생리학적 작용을 조절하기 위해 선택될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 상기 화합물은 눈의 수성 또는 처리되는 조직에 1×10^-7M 이하, 바람직하게는 약 1×10^-11M 내지 약 1×10^-8M, 및 더욱 바람직하게는 약 1×10^-11M 내지 약 1×10^-9M의 유효 농도를 제공하기에 충분한 양으로 사용되는 경우 IOP의 증가를 감소시키거나 방지하는 STH를 포함한다.

예를 들어, 본 발명은 합성 티로이드 호르몬 및 눈에 적합한 약제학적 담체를 포함하여, 눈에 바람직하게 적용되는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 리포좀을 사용하거나 사용하지 않는 완충 식염수 용액으로 임의로 투여될 수 있는 합성 티로이드 호르몬의 에스테르화된 유도체를 포함한다. 또한 눈에 적합한 약제학적 담체가 생분해가능한 합성 중합체를 포함할 수 있다. 티로이드 호르몬 및 STH는 생분해가능한 중합체를 사용하는 안내 지속 방출로 전달될 수 있다. 사람 사용이 인정되는 생분해가능한 중심체 조성물로는 폴리락티드류, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 폴리(락티-코글리콜)산이 포함된다. 추가 생분해가능한 제형으로는 폴리(안히드리데-코-이미드), 폴리(락트-글리콜산), 폴리에틸-2-시아노아크릴레이트, 폴리카프로락톤, 폴리히드록시부티레이트 발레이트, 폴리오르토에스테르 및 폴리에틸렌옥사이드/폴리부틸렌 테레프탈레이트가 포함되며, 이들로 제한되지는 않는다. 지속 방출되는 티로이드 호르몬 조성물의 안내 이식 또는 주입은 안압의 장기간(수개월에서 수년) 조절을 제공하여, 국소 제조물에 대한 요구를 필요없게 하거나 감소시키는 것이 가능하다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 합성 티로이드 호르몬, 바람직하게는 합성 티로이드 호르몬이 에스테르화된 유도체로 포화된 눈 접촉 수단(예를 들어, 콘택트 렌즈)를 포함한다. 예를들어, 건조 STH 또는 이것의 에스테르화된 유도체는 정제로서 공급되고 재사용 또는 일회용 접촉물의 존재하에 용해되어 전구 약물 또는 약물로 접촉물을 포화시킬 수 있다. 적합한 인큐베이트 시간, 예컨대 1 내지 6시간 후에, 접촉물은 인큐베이트 용액으로 세정되고 눈에 적용되어 STH가 접촉물로부터 눈으로 확산되게 한다. 또한 하기 문헌에 설명된 수단을 포함하여, 안내 지속 방출 수단을 사용하는 것이 유용하다 [참고 문헌: Ashton, P. et al., J. of Occ. Pharm. 10:691-701 (1994)].

일반적으로, 국소 및 안내 투여에 적합한 안과적 제형은 당업자들에게 공지된 기술에 따라 제형화되고 투여될 수 있다. 산화될 수 있는 제형이 불활성 기체하에 모든 제형을 제조함으로써 혐기성 환경하에 제조되는 것이 바람직하다. 완성된 제형은 불투명하거나 갈색인 용기에 저장하여 광 노출, 불활성 대기하에 이 제형을 보호하는 것이 바람직하다.

중합체 수용액, 수성 현탁액, 연고 및 겔이 국소 제형으로 바람직하게 사용된다. 수성 제형은 또한 용해된 치료 작용제의 병원소를 생성하는 리포좀을 함유할 수 있다. 국소 제형중에 특히 바람직한 것은 연고와 관련된 시각의 손상 및 불편함이 없이 전각 보유를 향상시키는 겔이다.

국소 안과용 제형 또는 다른 국소용 제형은 일반적으로 적합한 중합성 담체중에 치료 작용제 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량% 및 가장 바람직하게는 0.05 내지 0.6 중량%를 포함하여야 한다. 다른 바람직한 제형은 치료 작용제 0.001 내지 0.009 중량%를 함유한다. 당업자들에게 인지되는 바와 같이, IOP 또는 녹내장을 감소시키는데 요구되는 STH의 양은 눈이 흡수하지 않는 약물 또는 전구 약물로부터 상당한 전신 효과를 유발하지 않는 양이다.

적합한 중합성 담체는 약하게 가교된 카르복시 함유 중합체(예컨대 폴리카르보필), 덱스트란, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜 400 및 다른 중합성 진통제를 포함한다.

적합한 시스템은 당해 분야에 널리 공지된, 약하게 가교된 아크릴산 중합체 등을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 중합체는 존재하는 단량체의 전체 중량을 기준으로 하여, 하나 이상의 카르복실 함유 모노에틸렌계 불포화 미스노머 약 90 중량% 이상, 및 바람직하게는 약 95 내지 약 99.9 중량%로부터 제조되는 것이지만, 다른 불포화 중합성 카르복실 함유 단량체, 예컨대 메타아크릴산, 에트아크릴산, β-메타아크릴산(크로톤산), 시스-α-메타아크릴산(안젤산), 트랜스-α-메틸크로톤산(티글산), α-부틸크로톤산, α-페닐아크릴산, α-벤질아크릴산, α-시클로헥실아크릴산, β-페닐아크릴산(신남산), 쿠마르산(o-히드록시신남산), 엠벨산(p-히드록시쿠마르산) 등이 아크릴산과 함께 또는 아크릴산 대신에 사용될 수 있다.

상기 중합체는 존재하는 단량체의 전체 중량을 기준으로 하여, 다작용성 가교제를 소량, 즉 약 0.01 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 2 중량%를 사용함으로써 가교된다. 상기 가교제에는 비폴리알레닐 폴리에테르 이작용성 가교 단량체, 예컨대 디비닐 글리콜, 2,3-디히드록스헥사-1,5-디엔, 2,5-디메틸-1,5-헥사데온, 디비닐벤젠, N,N-디알릴아크릴아르나이드, N,N-디알릴메타크릴아미드 등이 포함된다. 또한 분자당 2개 이상의 알케닐 에테르기, 바람직하게는 분자당 2개 이상의 알케닐 에테르 기, 바람직하게는, 4개 이상의 탄소 원자 및 3개 이상의 히드록실기를 함유하는 다가 알코올을 알릴 브로마이드 등과 같은 알케닐, 예를 들어 폴리알릴 수크로오스, 폴리알릴 펜타에리트리톨 등으로 에테르화시킴으로써 제조된 H, C=C〈 말단기를 함유하는 알케닐 에테르 기를 함유하는 폴리알케닐 폴리에테르 가교제가 포함된다 [참고 문헌: 브라운(Brown)의 미국 특허 제 2,798,053호]. 분자량이 약 400 내지 약 8,000인 디올레핀 비친수성 거대성 가교제, 예컨대 디올 및 폴리올의 불용성 디아크릴레이트, 폴리아크릴레이트 및 메타아크릴레이트, 디이소시아네이트-히드록시알킬 아크릴레이트 또는 메타아크릴레이트 반응 생성물, 및 폴리에스테르 디올, 폴리에테르 디올 또는 폴리실록산 디올로부터 유도된 이소시아네이트 종결 사전 중합체와 히드록시알킬메타아크릴레이트 등의 반응 생성물이 가교제로서 사용될 수 있다 [참조 문헌: 뮬러(Mueller) 등의 미국 특허 제 4,192,827호 및 제 4,136,250호].

물론 약하게 가교된 중합체는 존재하는 단독의 모노에틸렌계 불포화 단량체로서의 카르복실 함유 단량체(들)과 함께 가교제(들)로부터 제조될 수 있다. 이들은 또한 약 40 중량%, 및 바람직하게는 약 0 내지 약 20 중량%의 카르복실 함유 모노에틸렌계 불포화 단량체(들)이 메틸 메타아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 2-에틸헥실아크릴레이트, 옥틸 메타크릴레이트, 2-히드록시메틸-메타크릴레이트, 3-히드록시프로필아크릴레이트 등과 같은 아크릴산 및 메타아크릴산 에스테르, 비닐 아세테이트, N-비닐피로딜로돈 등을 포함하여, 생리학적 및 안과적으로 해가 없는 치환기만을 함유하는 하나 이상의 비카르복실 함유 모노에틸렌계 불포화 단량체에 의해 치환되는 중합체일 수 있으며, 상기 추가 모노에틸렌계 불포화 단량체의 더욱 광범위한 예를 위해서 뮬러(Mueller) 등의 미국 특허 제 4,548,990호를 참조한다. 특히 바람직한 중합체는 가교 단량체가 2,3-디히드록시헥사-1,5-디엔 또는 2,3-디메틸헥사-1,5-디엔인 약하게 가교된 아크릴산 중합체이다.

본 발명의 실시에 사용되는 약하게 가교된 중합체는 통상적인 자유 라디칼 중합 반응 촉매를 사용하여, 단량체를 현탁 또는 유화 중합시킴으로써 제조하여, 등가 구 직경이 약 50㎛ 이하인 건조 입자 크기를 제공하는 것, 예를 들어 크기면에서 등가 구 직경이 약 1 내지 약 30㎛, 및 바람직하게는 약 3 내지 약 20㎛인 건조 중합체 입자를 제공하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 상기 중합체의 분자량은 2,000,000을 초과하는 것으로 추정된다.

건조 입자 크기에 있어서 등가 구 직경이 약 50㎛ 보다 상당히 큰, 현탁 또는 유화 중합에 의해 제조된 중합체 입자를 함유하는 본 발명에 따라 제형화된 수성 현탁액은 눈에 투여되는 경우에, 등가 구 직경이 평균적으로 약 50㎛ 미만인 중합체 입자를 함유하는 조성물중에의 다른 것은 동일한 현탁액 보다 덜 편안하다. 등가 구 직경이 약 50㎛ 보다 상당히 큰 크기의 건조 입자로 제조된 다음, 예컨대 기계적 밀링 또는 분쇄에 의해 등가 구 직경이 약 50㎛ 이하인 건조 입자로 크기가 감소된, 아크릴산 등의 약하게 가교된 중합체는 수성 현탁액으로부터 제조된 중합체 만큼 잘 작용하지 않는다. 존재하는 단독의 미립자 중합체로서 상기의 기계적으로 밀링 또는 분쇄된 중합체 입자의 차이에 대한 한 가지 가능한 설명은 분쇄가 중합체 쇄로부터 가교되지 않은 측쇄를 제거하거나, 날카로운 에지 또는 돌출부를 갖는 입자를 생성하거나, 만족스러운 운반 시스템 성능을 제공하기에는 너무 광범위한 범위의 입자 크기를 일반적으로 제공함으로써, 50㎛을 초과하는 약하게 가교된 중합체 입자의 공간 구조 또는 배열을 분해하는 것이다. 광범위한 입자 크기 분포는 점도와 겔화의 관계를 손상시킬 것이다. 어느 경우에나, 상기의 기계적으로 크기가 감소된 입자는 현탁 또는 유화 중합 반응에 의해 적당한 크기로 제조된 입자보다 수성 현탁액에서 덜 쉽게 수화될 수 있고, 또한 누액의 영향하에 충분한 정도로 눈에서 겔화될 수 있는 정도가 더 적으며, 일단 겔화되는 경우 본 발명의 수성 현탁액을 사용하여 눈에서 생성되는 겔보다 덜 편안하다. 그러나, 존재하는 약하게 가교된 입자의 전체 중량을 기준으로 하여, 상기의 밀링 또는 분쇄된 중합체 입자 약 40 중량% 이하, 예를 들어 약 0 내지 20 중량%는 본 발명을 실시하는 경우 건조 입자 직경이 약 50㎛ 이하로 되는, 용액 또는 유화 중합된 중합체 입자와 혼합될 수 있다. 이러한 혼합물은 또한 투여하기가 쉽고 편안한 안과적 약제 운반 시스템내의 만족스러운 점도 수준 및 눈에 대한 약제의 만족스러운 지속 방출을 제공하는데, 특히 건조 형태의 상기 밀링 또는 분쇄된 중합체 입자의 등가 구 직경이 평균 약 0.01 내지 약 30㎛, 및 바람직하게는 약 1 내지 약 10㎛인 경우에 그러하다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 입자의 입자 크기 분포는 한정적다. 단일 분산 입자를 사용하면 주어진 입자 크기에 대한 안과적 약제 운반 시스템의 점도는 최대가 되며 눈 잔류 시간은 증가하게 된다. 입자 크기가 30㎛ 미만인 단일분산 입자가 가장 바람직하다. 양호한 입자 패킹은 한정된 입자 크기 분포에 의해 촉진된다.

입자는 상기에 설명된 크기 상한선 뿐만 아니라 한정한 입자 크기 분포에 의해 영향을 받는다. 양호한 입자 패킹을 촉진시키는 단일 분산 입자의 사용으로 현탁액과 눈물의 접촉시에 점도가 최대고 증가하며 눈 잔류 시간이 증가한다. 입자의 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상이 주요 입자 크기 분포의 약 10㎛ 미만의 띠내에 있어야 하며, 전반적으로(즉, 상기 띠의 내부 및 외부 모두의 입자를 고려하는 경우) 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 미립자(즉, 크기가 1㎛ 미만인 입자)가 있어야 한다. 또한 평균 입자 크기가 50㎛, 더욱 바람직하게는 30㎛의 상한선으로부터 예컨대 6㎛ 크기로 작아지기 때문에, 주요 입자 분포의 띠가 또한 예컨대 5㎛로 한정되는 것이 바람직하다. 주요 입자 분포의 띠 내부에 있는 입자의 바람직한 크기는 약 30㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 약 20㎛, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 5㎛ 이다.

본 발명의 수성 현탁액은 수성 현탁액의 전체 중량을 기준으로 하여, 약하게 가교된 중합체 입자 약 0.1 내지 약 6.5 중량%, 및 바람직하게는 약 0.5 내지 약 4.5 중량%를 함유하는 것이 바람직하다. 이들은 생리학적 및 안과적으로 유해한 성분을 갖지 않는, 순수한 물, 살균된 물, 바람직하게는 탈이온수 또는 증류수를 사용하여 제조되는 것이 바람직하고, 생리학적 및 안과적으로 허용가능한, pH를 조절하는 산, 염기 또는 완충액, 예를 들어 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산, 염산 등과 같은 산, 수산화 나트륨, 인산 나트륨, 붕산 나트륨, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 락트산 나트륨, THAM(트리스히드록시메틸아미노-메탄) 등과 같은 염기 및 시트레이트/덱스트로스, 중탄산 나트륨, 염화 암모늄 및 상기에 언급된 산과 염기의 혼합물과 같은 염 및 완충액을 사용하여 pH는 약 7.0 내지 약 7.4로, 즉 중성으로 조절될 것이다. 그러나, 눈은 중성 범위를 벗어난 pH를 견딜것이고, 더욱 산성이거나 염기성인 pH가 약물 용해를 촉진시키는데 사용될 수 있다.

수성 현탁액은 보존제를 함유하지 않는 단일 용량의, 다시 밀폐시킬 수 없는 보존성 자유 용기내에 포장될 수 있다. 이것은 단일 용량의 약제가 한번에 한 방울씩 눈에 운반되게 하며, 그 다음 용기는 사용후에 폐기된다. 상기 용기는 특히 수은 보존제를 함유하는 안과적 약제로부터 발생하는 것으로 관찰되는 보존과 관련된 각막 상피의 자극 및 증감에 대한 가능성을 제거한다.

다중 용량 용기가 또한 원하는 경우에 사용될 수 있는데, 특히 본 발명의 수성 현탁액의 비교적 낮은 점도가 매일 필요한 만큼 수회 일정하고 정확한 용량으로 눈에 한방울씩 투여되게 하기 때문에 그러하다. 보존제가 포함되어야 하는 현탁액에서, 적합한 보존제로는 클로로부탄올, 폴리퀘트(Polyquat), 염화 벤즈알코늄, 세틸-브로마이드 등이 있다.

국소용 제형중에 바람직하게 포함되는 첨가제로는 염화 나트륨, EDTA(에데트산 이나트륨), 계면활성제 및 BAK(염화 벤즈알코늄)와 같은 보존제가 포함된다. 보편적으로, 눈에 제형을 투여하는 것은 치료하려는 특정 증상에 따라 하루에 1회 내지 4회 수행된다.

안내 주사를 위한 제형은 2가지로 분류된다. 결막하 주사에 있어서는, 제형은 일반적으로 치료 작용제 0.0001 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량%를 포함하여야 한다. 어떠한 적합한 담체나 사용될 수 있는데, 덱스트란 또는 폴리소르베이트 80과 같은 중합성 담체가 바람직하다. 바람직하게 제형중에 포함될 수 있는 다른 첨가제로는 에데트산 이나트륨, 아황산 나트륨 및 황산 나트륨이 있다. 제형은 인산염 완충 염수, 시트르산 완충 염수, 황산 콘드로이틴, 또는 중합성 담체, 예컨대 히알루론산 나트륨(또는 히알루론산), 정제된 폴리아크릴아미드 또는 폴리소르베이트 80을 포함하여야 한다. 안내 주사가능한 제형중에 포함될 수 있는 다른 첨가제로는 염화 나트륨, 수산화 나트륨 및 염화 수소가 있으며, 수산화 나트륨 및 염화 수소는 pH의 조절에 사용된다. 보편적으로, 제형은 특히 용액으로 사용되는 경우에, 작용제 0.001 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량%를 함유한다.

활성 화합물 또는 전구 약물이 용액중에 상당량 존재하는 경우, 이것은 치료제로서 작용하는데 빠르게 이용되어서, 낮은 농도로 투여되어 조직의 불내성을 유발하지 않으면서 유효 수준을 달성할 수 있다. 활성 화합물 또는 전구 약물이 현탁액중에 상당량 존재하는 경우, 이것은 높은 농도로 투여되어, 다시 조직 내성을 유발하지 않으면서, 지속적인 유효 수준을 달성할 수 있다. 그러므로, 용액을 사용하는 경우, 낮은 농도의 활성 화합물 또는 전구 약물이 국부적인 조직 상처를 피하는데 사용된다. 현탁액을 사용하는 경우에는, 용해되는 소량이 즉시 활성에 도입되기 때문에 높은 농도의 활성 화합물 또는 전구 약물이 사용된다.

특정 개개인에게의 특정 처치를 위한 치료에 바람직한 유효 농도를 수득하기 위한 용량 및 유효량은 바람직한 임상적 종점을 따르고 투여 계획을 적당하게 조절함으로써 용이하게 수득될 수 있다. 예를 들어, 눈에 비전신으로 투여되는 STH의 경우에 화합물의 생체 적합성은 전신 효과에 덜 영향받는다. 결과적으로, 하루 용량 및 적용량에 대한 조절은 간, 장 및 신장와 같이, 약물 생체적합성을 간섭받는 기관으로부터의 잠재적인 영향을 그다지 받지 않으면서 변화될 수 있다.

본원에 설명되고 당해 분야에 공지된 바와 같이, 임상적 종점은 용이하게 모니터되어 정상적인 비교 피검자로부터의 임상적 종점 또는 치료 이전에 측정된 임상적 종점과 비교될 수 있다. 예를 들어, 정상적인 눈에서는, 수성 분비물에서의 변형은 안압의 변화를 초래하는 주간 변동, 노화, 내분비 장애, 수화, 약물 및 외과 수술와 같은 요소에 관련될 수 있다. 그러나, 상기 수성 분비물의 변형은 일반적으로 유량률에서의 약간의 추가 조절으로서 나타나, 안압을 비교적 일정하게 유지시키고 치료 과정 동안에 걸쳐 측정되는 IOP에 약간을 영향을 미친다. 본원에 설명되는 바와 같이, 정상적인 IOP 값은 기준점으로 사용되어 눈이 적당한 IOP 수준으로 되는 경우에 STH의 투여 또는 STH 치료의 완화나 감소를 보장하는 증가된 IOP 값을 나타낼 수 있다. 녹내장의 경우에 IOP는 증가하고, 개방 우각 녹내장의 경우에 유량률은 감소한다. 이에 따라 IOP가 증가하며 수성 분비물의 변형에 따라 안압의 변동이 증가하게 된다. IOP는 눈에 기력을 낮추거나 동일하게 하는 힘을 가함으로써 측정될 수 있다. 임상학자는 IOP의 변화를 측정함으로써 STH 치료 과정을 평가할 수 있다.

IOP는 압평 안압 측정기를 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게 압력은 각막의 표준 영역(3.06mm 직경)의 기력을 낮추는데 필요한 힘을 직접 측정하는 안압 측정기를 사용하여 치료 전 및 후에 눈에서 측정될 수 있다. 압평 안압 측정기는 많은 유체(약 0.5㎕)를 여과시키거나 눈에서의압력을 상당히 감소시키지 않기 때문에, 이 방법은 안구 경직과 거의 무관하다. 보편적으로, 눈에는 0.5% 프로파라카인(오프타인), 0.4% 베녹시네이트(도르사카인), 또는 유사한 국소용 마취제(테트라카인(폰토카인)은 제외)의 점안제가 투여되고, 누액은 등장성 염화나트륨 용액 또는 증류수로 축축해진 무균의 형광지 조각에 의해 형광을 낸다. 그 다음 IOP가 안압 측정기를 사용하여 측정된다. 피검자는 수평으로 눕히거나 똑바로 세운다. 여러 가지 다른 안압 측정기 및 방법이 IOP를 측정하는데 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1 - 재료 및 방법

하기 재료 및 방법들이 본원에 설명되는 실시예에서 수득되는 결과들을 달성하는데 사용될 수 있다. 또한 당해 분야에 공지된 다른 실험 재료 및 방법이 유사한 결과를 달성하는데 사용될 수 있다.

세포 배양물

일차적으로, 3 내지 5회 통과시킨 사람 소주 망구조("HTM") 세포 배양물을 모든 실험에 사용하였다. 37℃에서 11% CO₂중의 15% FCS(우태아 혈청), 겐타마이신, 글루타민(2mm), 펀지존(2.5㎍/ml), 페니실린/스트렙토마이신(UCSF 세포 배양 수단)으로 보충된 DME-H16 1 g/L에서 세포를 배양시켰다 (표준 배지). 외식편을 장애 없이 1 내지 2주 동안 10% CO₂로 습화된 인큐베이터내에서 인큐베이트시켰다. 배양물에서 3주째까지, 세포가 자발적으로 조직으로부터 이동하였다. 이때, 배지를 2일마다 교체하였고 섬유아 세포 성장 인자(1ng/ml)를 각각의 배지 교체 후에 첨가하였다. 세포 매질의 전체 수가 1000 내지 2000으로 되는 때에, 외식편을 제거하고, 세포를 STV(0.1% 트립신, 0.02% EDTA)로 처리하고 60mm 접시상에서 플레이팅시켰다. 세포가 융합될 때까지, 일반적으로 최기 플레이팅 후 7-8 일째에 배지를 2일 마다 교체하였다. 융합 배양물을 다음 사용을 위해서 액체 질소에서 샘플당 1×10^-6세포로 냉동시키거나, 실험 사용 또는 연속 배양을 위해 1:32의 분할비로 통과시켰다. HTM 세포는 20회 통과에 걸쳐 형태를 유지하였다. 그러나, 대부분의 실험에서, 3 내지 5회 통과시킨 HTM 세포를 사용하였다. 이러한 세포들은 실질적으로 순수하고 하기 문헌에 기재된 방법과 같이, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 [참고 문헌: Alvarado, et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 82:464-478 (1982)]. 바람직하게 세포를 실험에 사용하기 전에 융합되게 성장시켜, 세포 성장과 관련된 영향을 감소시킨다. 비융합 세포는 보편적으로 융합이 80% 미만인 것이다.

10^-2원액 3, 3'-5-트리요도-L-티로닌(T₃)(미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마(Sigma)사 제품)를 10% DMSO/90% EtOH중에 제조하고 -20℃에서 저장하였다. 공유결합 NH 마이크로웰 플레이트(일리노이 나퍼빌에 소재하는 눈크(Nunc)사 제품), N-히드록시술포숙신이미드(S-NHS)(일리노이 록포드에 소재한 피어스 (Pierce)사 제품), 히알루론산(캘리포니아 코스타 메사에 소재한 ICN사 제품), 1-에틸-3-(3 디메틸아미노-프로필)카르보디이미드(EDC)(시그마사 제품), O-페닐렌디아민(OPD)(캘리포니아 샌디에고에 소재하는 칼바이오켐(Calbiochem)사 제품, 벡타스테인 표준 ABC 키트(캘리포니아 버링검에 소재하는 벡터(Vector)사 제품)을 히알루론산 분해효소 및 HA ELISA 유형 검정에 사용하였다.

히알루론산 검정

HTM 세포를 10^-7M T₃을 첨가하거나 첨가하지 않고 티로이드 호르몬이 제거된 10% 우태아 혈청 배지로 보충된 2ml DME-H16 1g/L 글루코오스에서 6웰 또는 12웰(뉴욕 코닝에 소재하는 코닝(Corning)사 제품) 플레이트에서 배양시켰다. 배지를 매일 또는 다르게 지시되는 바대로 교체하고 수집하였다. 상층액을 농축시킨 후 비오틴화된 히알루온산 결합 단백질 HABP를 사용하는 ELISA 유형 검정에 의해 히알루론산("HA")에 대해 3번 검정하였다. 하기 문헌에 기재된 바와 같은 검정을 이용하였다 [참고 문헌: Stern ＆ Stern, Matrix, 12(5):397-403 (1992)].

히알루론산 분해효소 검정

도면 범례에 지시된 일수 동안에 10^-7M T₃를 첨가하거나 첨가하지 않는 인슐린-트랜스퍼린-셀레늄으로 보충된 10ml 혈청 유리 DME-H 16이 있는 100mm 접시(펜실바니아 피츠버그에 소재한 피셔(Fisher)사 제품)에서 HTM 세포를 배양시켰다. 세륨 유리 배지를 히알루론산 분해효소 억제 단백질 및 혈청내에서 정상적으로 발견되는 히알루론산 분해효소의 간섭을 방지하는데 사용하였다. 상청액을 센트리콘(아미콘사 제품)에서 농축시키고, 직접 비오틴화된 HA를 사용하여 ELISA 유형 검정(본원에 참고 문헌으로서 인용된 하기 문헌에 설명된 방법)의 변형에 의해 시트르산-인산염 완충액(pH 3.7)의 히알루론산 분해효소 활성에 대해 3번 검정하였다 [참고 문헌: Stern ＆ Stern, Matrix, 12(5): 397-403 (1992)]. 모든 샘플은 3번 검정하였다.

실시예 2 - T₃와 같이, 합성 티로이드 호르몬은 HTM 세포로부터의 HA 분비를 억제한다

HA 분비가 합성 티로이드 호르몬에 의해 조절될 수 있는 지를 조사하기 위해, HTM("HTM") 세포를 T₃의 존재 및 부재하에 배양시켰다. T₃보충 배지에 배양된 HTM 세포는 T₃가 제거된 배지에서 성장한 세포에 비해 전체 히알루론산 분비가 점차적으로 감소하였다. 도 1을 참조한다. "제거" 배지는 T₃가 하기 문헌에 설명된 음이온 교환 수지 방법을 사용하여 제거된 배지를 의미한다 [참고 문헌: Samuel H.H., Stanley, Cananova J: Endocrinology, 1979 Jul, 105(1): 80-5]. 보편적으로, 제거 배지내의 T₃농도는 0.1M 미만이다. T₃보충 배지와 대조 배지 배양물(융합 세포)간의 분비된 HA 농도의 차이는 도 1에 도시된 바와 같이 보충 T₃(최종 배지 농도: 10^-7M)에 대한 노출 3일째에 관찰될 수 있다. 5일째까지는, 대조 배양물로부터의 상청액과 비교하여, T₃보충 배양물로부터의 상청액에서의 분비된 HA 농도는 2.95배 감소하였다. HA 수준의 차이는 배양한 후로 10일(실험 마지막날) 동안 계속되었다. T₃처리된 비융합(융합되는 정도가 75% 미만임) 세포가 또한 융합 T₃처리된 세포(각각의 웰은 약 250,000 세포를 함유한다)와 비교하여 배지중의 HA 농도가 더 많이 감소하였다. T₃에 의한 HA 농도 감소에 대한 반감 최대 농도는 약 5nM였으며, 융합 세포에 대해서는 도 2의 용량 반응 곡선을 참조한다.

실시예 3 - T₃는 분비된 히알루론산 분해효소 활성을 증가시킨다

HA의 분비량이 T₃의 존재하에 분비된 HA의 분해가 증가함으로써 최소한 부분적으로 조절될 수 있는지를 조사하기 위해, HTM 세포에 의한 분비된 히알루론산 분해 효소 활성을 T₃의 존재 및 부재하에 측정하였다. HTM 세포를 히알루론산 분해효소 활성 실험을 위해 혈청 유리 배지에서 배양시켜 혈청중에 발견되는 히알루론산 분해효소 및 히알루론산 분해효소 억제 단백질의 결합을 제거한다. 분비된 히알루론산 분해효소 활성은 T₃첨가가 부족한 대조군에 비해 T₃보충 비융합 배양물로부터의 상청액에서 증가하였다. 10일째까지는, 혈청 유리 조건하에서 HA 생성의 낮은 조절에도 불구하고, T₃보충 배양물에서의 분비된 히알루론산 분해효소 활성이 상대적으로 1.9배 증가하였다.

실시예 4 - 분비되는 HA 수준을 조절할 수 있는 CD44 동형체가 HTM 세포상에 존재한다

CD44 수용체가 HTM 세포에 의해 발현되는지를 조사하기 위해, 4개의 CD44 동형체는 CD44s, CD44E, CD44v1 및 CD44-v3에 대한 프로브를 사용한 RT-PCR 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 모든 동형체는 선택적인 분할 부위를 갖는 9개의 외부 축삭내에서 발생하는 스플라이스 변형물이다. 4개의 모든 동형체는 HTM 세포에서 발현시킨다. RT-PCR 실험에 있어서, 세포(1-3×106)을 스크래핑에 의해 수확하고, 펠릿화시키고, 액체 질소내에 바로 냉동시키고, RNA 및 cDNA가 생성될 때까지 저장하였다. RNA는 RNA TrackTM(텍사스 프렌즈우드에 소재한 바이오텍스(Biotecx)사 제품)를 사용하여 제조하였다. RNA는 60ul의 전체 부피내에 1000U 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 가역 전사효소(메릴랜드 가이써스버그에 소재하는 BRL사 제품), 50mM 불규칙한 6량체 프라이머, 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 10mM 디티오트레이톨, 3mM MgCl2, 각각 0.5mM인 dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP를 함유하는 반응 혼합물에서의 cDNA의 제 1 가닥 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. cDNA 반응을 37℃에서 90분 동안 수행한 다음, 물에서 1:3 또는 1:7로 희석시키고, DEPC로 사전처리하였다. 올리고누클레이티드 프라이머를 물중의 40μM으로 희석시켰다.

RT-PCR에 있어서, 변형된 고온 스타트 방법을 사용하였다. cDNA 3 내지 5㎕를 17mM 트리스-HCl(pH 8.3) 및 80mM KCl 및 각각의 프라이머 0.8μmol을 함유하는 마스터 혼합물 30㎕에 첨가하였다. 물을 cDNA 반응물에 첨가하여 최종 부피 40㎕가 되게 하였다. 모든 반응물을 가벼운 광유로 피복시킨 후 99℃까지 가열시켰다. 10분 후에 반응물을 94℃로 냉각시키고, 7mM MgCl₂, 각각 1mM인 dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP 및 1.2U Taq 폴리머라아제(뉴저지 브랜치버그에 소재하는 페르킨-엘머 세츄스(Perkin-Elmer Cetus)사 제품)를 함유하는 10㎕ 부피를 오일 피복물을 통해 직접 첨가하였다. 사이클 변수는 60초 동안에 95℃, 30초 동안에 55 내지 57℃, 30초 동안에 72℃였으며, 75℃에서의 최종 범위는 15분이었다. 반응은 자동 가동되는 써모사이클러(코네티컷 노르워크에 소재하는 페르킨-엘머 세츄스사 제품)를 사용하여 32 내지 34회 순환시켰다. RT-PCR 생성물을 2% 낮은 EEO 아가로오스(펜실바니아 피츠버그에 소재하는 피셔 사이언티픽사 제품)상에 분리시켰다. 에티듐 브로마이드(EtBr) 겔을 45분 동안 200V에서 가동시켜, 자외선에 의해 시각화시키고 사진으로 찍었다.

RT-PCR에 대한 올리고누클레오티드는 CD44 동형체 모두의 유효한 증폭을 가능케하는 방식으로 CD44 유전자 내부의 엑손으로 배열시켰다. 올리고누클레오티드는 하기와 같이 엑손수에 의해서 및 전방향(F) 또는 역방향(R)로서 나타내었다:

F5 5'-GATGATGACGTGAGCGGCTC-3; F12 5'-CAGTCATAGTACAACGCTTCA-3; R7 5'-GATAAAATCTTCATGATCATC-3'; R 15 5'ATTCAGATCCATGAGTGGTAT-3'; β-액틴 전방향 5'-GCTCTCTTCCAGCCTTCC-3'; β-액틴 역방향 5-AGAGCCACCAACCCACACAGAG-3'.

상기 CD44 동형체는 HA를 결합시킬 수 있고, 최소한 부분적으로 분비된 HA의 수용체 중재 세포내이입을 조절할 수 있다. 이러한 경로로, HA는 CD44 수용체를 통해 내부화되고 히알루론산 분해효소에 의한 분해를 위해 리조솜으로 유도된다. 또한, CD44 및 CD44E는 세포내이입이 없는 세포 표면에의 HA 및 다른 GAG의 결합을 나타난다.

실시예 5 - T₃는 CD44 동형체의 발현을 감소시킨다

T₃가 CD44 수용체 유전자의 선택적인 스플라이싱을 통한 HTM에 의한 분비된 HA 변화에 영향을 미치는 지를 결정하기 위해, CD44 발현을 본원에 설명되는 바와 같이, RT-PCR을 사용하여 측정할 수 있다. HTM 세포가 18시간 동안에 보충 T₃에 노출되는 경우, CD44E 및 CD44-v3 동형체의 발현이 현저하게 감소한다. 이와 같이, T₃에 의해 유도된 CD44 발현의 감소는 주세포에의 HA 및 다른 GAG의 결합의 감소와 일관된다.

실시예 6 - 사람 눈은 수성 T₄를 함유한다

사람의 안구방수가 T₄를 함유하는지를 조사하기 위해, 티로이드 질환에 걸리지 않는 환자를 백내장 수술하는 동안에 수득된 안구방수로부터 직접적인 투석 기술(캘리포니아 샌주안 카피스타노에 소재한 코닝 니콜스 인스티튜트(Corning Nichols Institute)사 제품)을 사용하여 T₄를 측정한다. 안구방수 표본의 푸울링된 샘플의 유리 T₄수준은 0.4ng/dL인 것으로 나타났다. T₃는 같은 표본에서 전혀 측정되지 않았다.

실시예 7 - 사람 눈의 TM 세포는 티로이드 호르몬 수용체를 갖는다

사람 눈이 티로이드 호르몬 수용체를 함유하는지를 조사하기 위해, 특히 HTM 세포의 티로이드 호르몬 수용체는 HTM 세포를 사용하는 티로이드 수용체 핵산에 대한 RT-PCR 분석 또는 면역조직화학을 이용하여, 티로이드 호르몬 수용체에 대한 항체를 사용하여 측정한다. 티로이드 호르몬 수용체 α1, 2 및 β1을 2가지 검정 모두를 사용하여 발견하였고, 비특이적 결합은 비교적 낮았다.

실시예 8 - 생체내 방법으로 눈에 T₃를 국소 투여하면, T₃는 각막 및 전방내로 확산된다

눈의 조직을 투과하는 합성 티로이드 호르몬의 능력을 조사하기 위해, I¹²⁵-T₃를 생체내 방법으로 토끼 눈에 투여하였고 방사성을 안구방수에서 측정하였다. 간단하게, 눈내로의 티로이드 호르몬의 투과를 측정하는데 다음 과정을 사용할 수 있다: 1) 토끼를 2:1 케타민:크실라진으로 마취시키는 단계; 2) 눈에 국소 마취제 1방울을 투여하는 단계, 3) 눈을 밸런스 식염수 용액(알콘사 제품)으로 세정하고 가볍게 건조시키는 단계, 4) 100% EtOH 용액중의 I¹²⁵-T₃30ul 또는 PBS(인산염 완충 식염수)중의 30% DMSO중의 I¹²⁵-T₃30ul를 투여하는 단계, 5) 알코올 용액에 대해서는 T₃용액을 30분 내지 1시간 동안 및 DMSO 용액에 대해서는 45분 동안 흡수시키는 단계, 6) 대조군에서는 약 30초 동안 T₃용액을 흡수시키는 단계, 7) 멸균시킨 물 60ml로 눈을 세정한 후 일회용 주사기로 안구방수 50ul를 빼내는 단계, 및 8) 안구방수 샘플로부터의 방사성을 감마 카운터로 측정하는 단계. 국소 I¹²⁵-T₃의 투여 후에 2시간 적출시킨 토끼 눈에서 방사능 사진을 찍었다. 국소적으로 투여된 T₃가 소주 망구조에 결합될 수 있는 것을 나타내는 눈의 안구방수 유출 채널에 표지를 집충시켰다. 상기 방법을 사용하여 약 0.125%의 투여된 T₃는 45 내지 60분 후에 안구방수내로 확산되고 이 확산은 알코올 또는 DMSO가 T₃에 대한 용매로서 사용되지 것에 무관하다. 이와 같이, T₃는 각막의 확산 장벽을 가로질러 확산될 수 있어서 안구방수 및 소주 망구조에 영향을 받기 쉽다.

실시예 9 - 생체내 방법으로 눈에 T₃를 국소 투여하면, 안압이 낮아진다

T₃와 같은, 합성 티로이드 호르몬의 안압에 대한 영향을 조사하기 위해, 생체내 방법으로 토끼 눈에 T₃를 국소 투여하였다. 정상적으로 착색된 네덜란드산 토끼를 IOP 실험에 사용하였으며 T₃를 30% DMSO 비이클을 사용한 1mM T₃멸균 용액 30㎕로서 하루에 4번 토끼의 오른쪽 눈에 국소 투여하였다. 30% DMSO 비이클을 대조군의 왼쪽 눈에 하루에 4번 투여하였다. 지정한 시간에 IOP를 기체 조영 단층 촬영 기술을 사용하여 측정하였다. 임상학적 상황에서 소량의 T₃가 정상적으로 투여되어 빈맥 효과와 같이, 잠재적인 전신 독성 또는 장애를 감소시킨다.

5마리의 토끼에게서 투여 후 3주내에 일부 이상이 검출가능한 IOP의 감소가 나타났으며 한마리의 토끼에서는 T₃투여한 후 3주 후에 IOP가 25% 감소한 것으로 나타났다. 양쪽 눈에서 관찰된 IOP 감소는 국소적으로 투여된 T₃의 전신 흡수와 관련될 수 있다. T₃의 측정되는 혈청 수준은 국소 처리(정상적인 범위가 88 내지 160ng.dL인 176 내지 427 ng/dL의 범위로 처리)한 후 2주후에 상기 토끼들에서 증가하였다. 한마리의 토끼는 죽었으며, 이것은 국소 투여로부터 결과된 혈청의 높은 T₃농도로부터 유도된 T₃의 독성으로 인한 것으로 본다. T₃독성은 본원에 설명되는 바와 같이 STH의 전구 약물 에스테르 유도체의 저농도를 사용하거나 활성이 적은 STH를 사용하여, 투여되는 합성 티로이드 호르몬의 양을 감소시킴으로써 제거될 수 있다.

실시예 10 - 배양된 사람의 소주 망구조 세포의 수력학적 전도성: 안구방수 유출의 생체외 모델

생체내 HTM 기능에 영향을 주는 티로이드 호르몬의 능력을 측정하기 위해, T₃가 생체외에서 HTM 세포의 단층을 가로지르는 유체 흐름을 증가시키도록 직접 작용할 수 있는지 평가하였다. 수력학적 전도성을 측정하기 위해 생체외 모델을 사용하였다. 이 모델은 HTM 세포의 융합 단층의 수력학적 전도성을 측정한다.

HTM 세포의 단층은 폴리스티렌 홀더내의 밀리포어 여과지에서 성장하였다. 상기 홀더를 공지된 저항에 대한 유체 흐름으로 생기는 압력차를 측정하는 장치내에 장착하였다. 2개의 압력 게이지, 공지된 레지스터의 상류인 하나의 게이지 및 HTM 세포를 갖는 여과지 홀더의 상류이지만 공지된 레지스터의 하류인 하나의 게이지로 압력차를 측정하였다. 여과지의 외면이 대기압하에 있기 때문에, 제 2 게이지에서의 압력은 세포의 관류압이다. 수력학적 전도성은 Q/PA와 같으며, Q는 흐룸이고, P는 관류압이고, A는 단층의 표면적이다.

융합 HTM 세포를 2mM 글루타민, 1nM 페니실린, 및 1nM 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM-H16중의 1cm 밀리포어 여과지(메사츄세츠 베드포드에 소재한 밀리포어 코포레이션 제품)상에서 4일 또는 8일간 성장시켰다. 또한 배지를 활성화된 숯을 이용한 인큐베이션에 의해 호르몬이 제거된 10% 우태아 혈청 및 혼합 양이온/음이온 교환 수지(캘리포니아 헤르큘레스에 소재한 바이오 래드(Bio-Rad)사의 AG 501-X8 수지)으로 구성하였다. 융합 HTM 세포를 10^-3M T₃를 사용하거나 사용하지 않고서 4일 또는 8일간 성장시켰다. 대조군 세포를 적당한 양의 에탄올 비이클로 처리하였다. 세포가 ㎕/min/mm Hg/cm²에서 성장하고 발현되는 같은 배지에 세포를 살포하는 동안 각각의 여과지의 수력학적 전도성을 30분에 걸쳐 측정한다. 모든 실험을 4번 거듭하여 수행하였다.

처리한지 4일 후에, T₃로 인큐베이트시킨 HTM 세포의 수력학적 전도성은 T₃의 부재하에 성장시키는 HTM 세포 보다 1.5배 내지 2배 더 컷다(도 3 참조). 그러나, 이러한 차이는 통계학적으로 중요하지 않다(윌콕손 시험). 처리한지 8일 후에, T₃로 인큐베이트시킨 HTM 세포의 수력학적 전도성은 T₃의 부재하에 성장시키는 HTM 세포 보다 2배 내지 3배 더 컷으며, 이것은 통계학적으로 중요하다(p=0.0286, 윌콕손 시험)(도 4 참조). 이와 같이, T₃는 HTM 세포의 융합층상에 직접적으로 작용하여 유체 흐름에 대한 이들의 저항성을 감소시키고 수력학적 전도성은 증사시킨다. 또한, 이러한 효과의 정도는 안구방수 유출을 증가시키고 안압을 감소시키는 녹내장 방지제, 에피네프린을 이용하는, 이전에 보고된 연구와 유사하다. 그 결과는 중요한데, 그 이유는 수력학적 전도성의 생체외 측정이 생체내 안구방수 유출에 대한 에피네프린 및 코르티코스테로이드와 같은 안구 약물의 관찰된 효과와 매우 관련이 있기 때문이다. 그러므로, T₃가 생체외 수력학적 전도성을 증가시키기 때문에, 이것은 녹내장에 걸린 환자의 안구방수 유출을 증가시키고 안압을 감소시킬 수 있다.

실시예 11 - T₃는 배양된 사람 소주 망구조 세포에의 세포외 매트릭스의 결합을 조절한다.

발명자들은 T₃의 존재하에 성장된 HTM 세포가 T₃의 부재하에 성장된 HTM 세포 보다 히알루론산을 덜 생성시키는 것을 증명하였다. 히알루론산(HA)은 일반적으로 세포 표면 수용체, CD44에의 결합에 의해 세포와 상호작용하여 세포외 매트릭스를 형성시킨다. T₃투여가 HA에 결합하고 세포외 메트릭스를 조합하는 HTM 세포의 능력에 영향을 주는지 평가하기 위해, 발명자들은 배양물에 배양된 HTM 세포가 HA에 결합하고 시각적인 세포외 매트릭스를 조합하는 능력을 검정하였다. 검정 시스템은 세포 주위의 영역으로부터 포르말린으로 처리된 적혈구를 배제시키는 능력을 이용함으로써 세포의 세포외 매트릭스를 눈에 보이게 한다. 세포 주위의 매트릭스 조합이 현미경법에 의해 관찰되므로, 프로테오글리칸 단량체 및 HA를 세포에 과량으로 첨가한다. 소주 망구조 세포 주위의 매트릭스 조합은 안구방수 유출에 대한 저항에 있어 중요한 요소가 되기 때문에, 이러한 매트릭스의 조절은 안압 결정 인자 중 하나일 수 있다.

HTM 세포는 플레이트당 1×10⁴세포의 밀도로 35mm 접시상에 플레이팅된다. 세포는 2mM 글루타민, 1nM 페니실린, 및 1nM 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM-H16에서 10^-7M T₃를 사용하거나 사용하지 않고서 2일 또는 6일간 성장시켰다. 또한 배지를 활성화된 숯을 이용한 인큐베이션에 의해 호르몬이 제거된 10% 우태아 혈청 및 혼합 양이온/음이온 교환 수지(캘리포니아 헤르큘레스에 소재한 바이오 래드(Bio-Rad)사의 AG 501-X8 수지)으로 구성하였다. 외인성 매트릭스 조합에 있어서, 37℃에서 3시간 동안 수집한 프로테오글리칸 단량체(쥐의 연골육종 종양(기준 1)으로부터 정제됨) 3.0mg/ml 및 히알루로난(등급 1, 미주리 세인트 루이스에 소재한 시그마 케미칼 코포레이션 제품) 15㎍/ml으로 인큐베이트시켰다. 배지를 제거하고 0.1% 우 혈청 알부민을 갖는 인산염 완충 염수중의 포름알데히드로 고정시킨 적혈구(1×10⁸세포/ml) 현탁액 0.75ml를 세포의 각각의 벽에 첨가하였다. 10분 후에, 세포 및 세포외 매트릭스(ECM)를 상 대조 현미경법으로 시각적으로 관찰하였다(기준 2, 3). 세포 매트릭스를 3개의 군 중 하나로 분류하였다. 전혀 피복되지 않은 세포에서는 ECM이 관찰되지 않았다. 조금 피복된 세포에는 세포의 플라즈마 막으로부터 배제된 세포의 핵의 폭보다 적게 확장된 ECM이 관찰되었다. 많이 피복된 세포에는 세포의 플라즈마 막으로부터 배제된 세포의 핵의 폭보다 넓게 확장된 ECM이 관찰되었다.

10^-7M T₃의 존재하에 2일 동안 성장된 세포는 T₃의 부재하에 성장된 세포의 경우 보다 피복되지 않은 세포의 수가 약 2배 많았다. 10^-7M T₃로 처리한 지 4일 후에 이러한 차이는 4배 이상으로 증가하였다. 이와 같이, 10^-7M T₃로 처리된 HTM 세포는 T₃유리 배지에서 성장한 세포의 경우 보다 HA와 덜 결합하고 더 적은 ECM을 모은다. 이와 같이 T₃는 주세포로부터 ECM을 대체시키거나, 대안적으로 ECM 어셈블리 합성을 억제하도록 작용할 수 있다. 이러한 경우에, 세포 결합된 ECM의 감소는 안구방수 유출 저항을 감소시키고 안압을 감소시킬 수 있다.

실시예 12 - STH의 합성

T4(티록신), T3, T2 및 TS-9를 포함하여, 많은 TR(티로이드 수용체) 리간드가 당해 분야에 공지되어 있다. 본원에 참고 문헌으로서 인용되는 하기 문헌을 참조한다 [참고 문헌: Jorgensen, Thyroid Hormones and Analogs, in 6 Hormonal Proteins and Peptides, Thyroid Hormones 107-204 (Choh Hao Li ed., 19780].

여러 가지 TR 리간드의 합성을 하기에서 설명한다.

TS1, TS2, TS3, TS4, TS5의 합성

TS1, TS2, TS3, TS4, TS5 및 이들의 유사체는 모두 T3 (3,4,3'-트리요도-L-티로닌), T4(티록신) 및 3,5-디요도티로닌을 포함하는 티로닌 유사체의 질소 원자의 간단한 아실화에 의해 제조할 수 있다. TS1 및 TS2는 T3를 각각 Ph₂CHCO₂NHS(N-히드록시 숙신이미드-2,2-디페닐아세테이트) 및 C₁₆H₃₃CO₂NHS와 반응시킴으로써 합성시킨다. TS3는 T3를 FMOC-C1(플루오레닐메틸옥시카르보닐클로라이드)와 반응시킴으로써 합성시킨다. TS4는 T3를 tBOC₂O(tBOC 무수물 또는 디-t-부틸디카르보네이트)와 반응시킴으로써 합성된다. R¹ ₃위치에서 -I 대신에 -H를 가져서 TS1-4와 상이한 TS5는 3,5-디요도티로닌을 tBOC₂O와 반응시킴으로써 합성시킨다. TS1, TS2, TS3, TS4 및 TS5에 대한 일반적인 반응 도식이 도 3에 도시되어 있다. 반응 도식에서, TS5 및 이것의 전구체는 모두 R¹ ₃위치에서 요오드 보다는 수소를 갖는 것을 주목해야 한다.

TS6 및 TS7의 합성

TS6은 TS7을 파라니트로페닐이소시아네이트와 반응시킴으로써 합성시킨다. TS7은 TS6을 TFA(트리플루오로아세트산)(tBOC기를 분리시킴)과 반응시킴으로써 합성한다. 이러한 반응은 당업자는 누구든지 수행할 수 있는 간단한 유기 합성 반응이다. TS6 및 TS7의 합성 도식은 도 4에 도시되어 있다.

TS8의 합성

TS8은 TBTU(히드록시벤즈트리아졸유로늄 테트라플루오로보레이트) 또는 HBTU(히드록시벤즈트리아졸유로늄 헥사플루오로포스페이트)와 같은, 아미드 형성 축합제 및 트리에틸아민의 존재하에 TS5를 Ph₂CHNH₂(디페닐메틸아민)과 반응시킴으로써 합성시킨다. TS8의 합성 도식은 도 5에 도시되어 있다.

3,5-디요도-3'-이소프로필티로닌 유도체의 합성

길항제의 부류를 지정하기 위해서, 5' 위치에서의 확장 뿐만아니라 3' 위치에서 소수성기를 갖는 것이 중요하다. 3' 위치에서의 바람직한 소수성 기로는 메틸, 벤질, 페닐, 요도 및 헤테로고리 구조가 포함된다. 3,5-디요도-3'-이소프로필-5'-치환 티로닌의 합성을 하기에 설명한다. 주어진 실시예는 TS10 화합물을 합성하는 특정 단계를 설명하지만, 이러한 일반적인 반응 도식을 이용하여 당업자는 3,5-디요도-3'-이소프로필-5' 치환 티로닌 유도체를 합성할 수 있으며, 이 유도체는 5' 위치에서 확장부를 갖는 것을 특징으로 한다. 이러한 부류의 추가 화합들은 공지된 유기 합성 기술을 이용하여 합성할 수 있다.

TS10의 합성은 하기에서 설명하며 도 6에 도시되어 있다. 각각의 단계에 대한 반응 생성물을 나타내는, TS10에 대한 반응 도식에 사용된 부호는 괄호에 넣어 표시한다.

2-포르밀-6-이소프로필아니졸(1): 본원에 참고문헌으로서 인용되는 하기 문헌에 설명된 바와 같이, 2-포르밀-6-이소프로필아니졸(10.0g, 61mmol)을 둥근 바닥 플라스크내의 DMF 50ml 및 THF 50ml 중의 수산화나트륨(3.7g, 153mmol) 현탁액에 한방울씩 첨가한다. 이러한 첨가는 발열 반응을 일으키며 회색 고체를 형성시킨다. 그 다음 메틸 요다이드(26.0g, 183mmol)을 한방울씩 첨가하고 반응 혼합물을 5시간 동안 실온에서 교반시킨다. 반응 혼합물에 물 20ml을 가한 다음, 물 500ml에 붓고, 에테르(2×300ml)로 추출시킨다. 에테르층을 조합하고, 물 (5×1000ml)로 세척하고, 황산 마그네슘으로 건조시키고 진공하에서 농축시켜 표제 화합물 10.2g(94%)를 수득하였으며, 이 화합물의¹H NMR(CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 10.30(s, 1H), 7.63(d, 1H, J=3Hz), 7.50(d, 1H, J=3 Hz), 7.13(t, 1H, J=3 Hz), 3.81(s, 3H), 3.31(heptet, 1H, J=7.5 Hz), 1.19(d, 6H, J=7.5 Hz).

2-(2-히드록시노닐)-6-이소프로필아니졸(도식에 도시되지 않음): -78℃에서 염화 옥틸마그네슘(8.4ml, 16.9mmol, 2.0M)을 10ml THF중의 1(1.5g, 8.4mmol) 용액에 한방울씩 첨가한다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키면서 2시간 동안 교반시킨다. 반응 혼합물을 에테르 50ml로 희석시키고 물 50ml에 붓는다. 에테르층을 소금물(1×50ml)로 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시키고, 진공하에서 농축시킨다. 플래쉬 크로마토그래피(실리카 겔, 10% 에테르/헥산 → 15% 에테르/헥산)로 정제하여 표제 화합물 734mg(34%)를 수득하였으며, 이 화합물의¹H NMR(CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 7.33-7.10(m, 3H), 5.00(br. s, 1H), 3.81(s, 3H), 3.31 (heptet, 1H, J=7 Hz), 1.90-1.19(m, 14H), 0.86(t, 3H, J=6.5 Hz); HRMS(EI), 질량 실측치: 292.2404; 계산치: 292.2402.

2-노닐-6-이소프로필아니졸(2): 화합물 2(663mg, 2.3mmol)을 에탄올 5ml 및 아세트산 5ml의 용액에 용해시키고, 탄소 촉매상의 팔라듐을 조금 첨가한다. 그 다음 반응 혼합물을 수소 기체로 하전시키고(단순한 기구 및 바늘 사용), 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨다. 다음날, 반응 혼합물을 에테르(100ml)에 붓고 에테르층을 포화 중탄산나트륨(3×100ml)으로 추출시킨다. 에테르층을 황산 나트륨을 건조시키고 진공하에서 농축시켜 표제 화합물 581mg(91%)를 수득하였으며, 이 화합물의¹H NMR(CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 7.14-7.00(m, 3H), 3.75(s, 3H), 3.36 (heptet, 1H, J=6.8 Hz), 2.63(t, 2H, J=7.5 Hz), 1.68-1.15(m, 14H), 0.86(t, 3H, J=5.5 Hz); HRMS(EI), 질량 실측치: 276.2459; 계산치: 276.2453.

티로닌 부가물(4): 발연 질산(0.071ml)를 -5℃까지 냉각시킨 아세트산 무수물 0.184ml에 첨가한다. 반응 혼합물을 요오드 전부가 용해되는 실온으로 가온시키면서 1시간 동안 교반시킨다. 그 다음 반응 혼합물을 진공하에 농축시켜 오일성 반고체 물질을 수득한다. 잔여물을 아세트산 무수물 0.7ml에 용해시키고 -20℃로 냉각시킨다. TFA 0.58ml 및 아세트산 무수물 1.2ml중의 아니솔(2)(581mg, 2.1mmol) 용액을 한방울씩 첨가한다. 반응 혼합물을 -20℃에서 1시간 동안 교반시킨 다음 실온으로 가온시키면서 밤새 교반시킨다. 반응 혼합물을 물과 염화 메틸렌 사이에서 분배시킨다. 염화 메틸렌층을 황산 나트륨으로 건조시키고 진공하에 농축시켜 오일로서 요오드늄염(3)을 수득한다. 이 물질은 정제되지 않거나 특징지어지지 않고서, 커플링 반응으로 직접 유도된다.

본원에 참고 문헌으로서 인용되는 하기 문헌의 방법에 따라 제조된 N-트리플루오로아세틸-3,5-디요도티로신 메틸 에스테르(552ml, 1.0mmol) 및 상기에서 수득한 미정제 요오드늄염(3) 모두를 무수 메탄올 5ml에 용해시킨다. 디아자비시클로[5.4.0]운데칸(DBU)(183mg, 1.2mmol) 및 조금의 구리 청동을 첨가하고 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨다. 다음날,, 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공하에 농축시킨다. 미정제 잔여물을 플래시 크로마토그래피로 정제시켜(실리카 겔, 10% 에틸 아세테이트/헥산) 보호되는 티로닌 부가물(4) 30mg(4%)를 수득한다.

탈보호되는 티로닌(TS10): 보호되는 티로닌 4(30mg, 0.04mmol)을 아세트산 2.25ml 및 49% 브롬화수소산 2.25ml의 혼합물에 용해시킨다. 반응 혼합물을 5시간 동안 환류 온도까지 가열시킨다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 진공하에 제거한다. 물을 첨가하여 오일성 잔여물을 회색 고체로 처리한다. 이러한 고체 물질을 여과하고, 물로 세척하고, 진공하에 P₂O₅로 건조시켜 표제 화합물 TS10 24mg(81%)를 수득하였으며, 이 화합물의¹H NMR(CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 7.57(s, 1H), 6.86(s, 1H), 6.45(s, 1H), 6.34(s, 1H), 4.81(m, 1H), 3.86(s, 3H), 3.71(s, 3H), 3.33-3.05(m, 3H), 2.58-2.47(m, 2H), 1.62-0.76(m, 23H); MS (LSIMS): M⁺= 817.0.

상기에 언급된 바와 같이, 반응 도식은 당업자에 의해 변형되어 3,5-디요도-3'-이소프로필티로닌 유도체에 의해 특징지어지는 부류의 화합물을 합성할 수 있으며, 이때 (1) 3' 이소프로필기는 메틸, 벤질, 페닐, 요도 및 헤테로고리 구조를 포함하는 소수성기로 치환될 수 있고, (2) 알킬기, 평면 아릴, 헤테로고리기, 또는 극성 및/또는 하전된기를 포함하는 다양한 화학적 구조가 5' 위치에 혼입될 수 있다.

상기 반응 도식에서 알데히드(1)는 최종 티로닌 유도체의 5' 위치에 다양한 화학 부분을 결합시키는 다용도의 합성 중간체이다. 또한, 다양한 화학 반응이 화학 부분을 결합시키는데 사용될 수 있다. 이러한 반응은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 알데히드에의 유기 금속(그리나드 시약, 유기 리튬 등을 포함) 첨가 반응, 알데히드와 일차 또는 이차 아민의 환원 아민 반응, 및 인 일리드 또는 안정화된 인산염 음이온을 이용한 비티히(Wittig) 올레핀 반응을 포함한다. 다른 가능한 반응으로는 5' 위치에서 에테르화 반응을 고려하는, 알데히드에서 벤질 알코올로의 환원 반응을 포함한다. 상기에 언급된 바와 같이, 상기 반응들은 알킬기, 평면 아릴, 헤테로고리기, 또는 극성 및/또는 하전된기를 포함하여, 최종 티로닌 유도체의 5' 위치에서 혼입되는 다양한 화학 부분을 이용한다.

표 1 및 도 6은 여러가지 TR 리간드의 구조를 나타낸다.

화학식 (I)

상기식에서,

R₆, R₂및 'R₃는 H이고,

X는 O이다.

상기 표에서,

*는 종래의 화합물이고,

-는 페닐이며,

-pNO₂는 파라 니트로 페닐이다.

각각의 개개 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 기재되어 참고 문헌으로서 인용되는 것과 마찬가지로, 본원의 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 본원에 참고 문헌으로서 인용된다.

본 발명은 이제 완전하게 설명되었으며, 많은 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 사상 및 범위내에서 이루어질 수 있음이 당업자에게 자명해질 것이다.

Claims (53)

1. 치료제로서 유용한 화합물을 확인하는 방법으로서,

   농도가 10μM 이하인 화합물을 소주 망구조 세포에 접촉시키는 단계, 및

   소주 망구조 세포에의 화합물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 검출 단계가 사람 소주 망구조 세포로부터의 히알루론산 분비가 감소되는 정도를 측정하는 것을 포함하고, 글리코스아미노글리칸(GAG) 생성을 조절하는데 유용한 화합물을 선택하는 것을 더 포함하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 검출 단계가 사람 소주 망구조 세포 내부의 세포내 수용체에의 화합물의 결합을 측정하는 것을 포함하는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 화합물이 합성 티로이드 호르몬인 방법.
5. 제 4항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 합성 티로이드 호르몬의 에스테르화된 유도체가 아닌 방법.
6. 제 4항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 TS1, TS2, TS3, TS4, TS5, TS6, TS7, TS8, TS9, TS10, 및 이들의 에스테르화된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 에스테르 유도체가 아닌 방법.
8. 제 4항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬을 합성시키는 단계를 더 포함하며, 농도가 1.0μM 이하인 합성 티로이드 호르몬이, 합성 티로이드 호르몬의 부재하에 배양된 소주 망구조 세포로부터의 히알루론산 분비와 비교하여, 히알루론산 분비를 30% 이상 감소시키는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 포유류의 눈에 합성 티로이드 호르몬을 국소적으로 투여하는 단계를 더 포함하며, 소주 망구조 세포가 토끼, 쥐, 마우스, 피그, 고양이 및 원숭이의 눈으로부터 단리되는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 검출 단계가 소주 망구조 세포에서의 화합물의 결합을 측정하는 기능 검정으로 화합물의 존재 및 부재하에 화합물의 결합을 간접적으로 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
11. 히알루론산을 분비하는 세포로부터의 히알루로산 분비를 억제하는 합성 티로이드 호르몬 일정량을 비전신 투여하는 단계를 포함하여, 히알루론산 분비를 억제시키는 방법으로서,

    농도가 10μM 이하인 합성 티로이드 호르몬이, 37℃에서의 3일간 배양 후 합성 티로이드 호르몬의 부재하에 배양된 사람 소주 망구조 세포와 비교하여, 37℃에서의 3일간 배양 후 배양된 사람 소주 망구조 세포로부터의 전체 히알루론산 분비를 10% 이상 억제하며,

    비전신 투여 단계가 천연 조직으로부터 단리되는 T₃의 결막하 주사(1), 또는 T₃또는 T₄의 국소 투여(2)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 농도가 1μM인 합성 티로이드 호르몬이 배양된 사람 소주 망구조 세포에서의 전체 히알루론산 분비를 10% 이상 억제하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 농도가 0.1μM인 합성 티로이드 호르몬이 배양된 사람 소주 망구조 세포에서의 전체 히알루론산 분비를 10% 이상 억제하는 방법.
14. 제 12항에 있어서, 세포가 사람 소주 망구조 세포인 방법.
15. 제 14항에 있어서, 사람 소주 망구조 세포가 육종 망구조 내에 있는 방법.
16. 제 14항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 눈에 적합한 약제학적 담체를 이용하여 투여되는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 약제학적 담체가 눈에 적합한 식염수인 방법.
18. 제 16항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 에스테르 유도체인 방법.
19. 제 16항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 리포좀 혼합물인 방법.
20. 제 16항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 확산에 의해 방출될 수 있는 합성 중합체내에 포함되는 방법.
21. 합성 티로이드 호르몬을 필요로 하는 눈에 합성 티로이드 호르몬을 안과적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하여 녹내장을 치료하는 방법으로서,

    투여 단계가 천연 조직으로부터 단리되는 T₃의 결막하 주사(1), T₃또는 T₄의 국소 투여(2), 또는 백내장에 걸린 눈에의 T₃또는 T₄의 투여(3)를 포함하지 않는 방법.
22. 제 21항에 있어서, 투여 단계가 눈에 적합한 약제학적 담체중의 합성 티로이드 호르몬을 눈에 국소 투여하는 것을 포함하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 국소 투여 단계가 안구 삽입물 또는 안구 이식물로부터의 합성 티로이드 호르몬의 확산을 포함하는 방법.
24. 제 23항에 있어서, 안구 이식물이 합성 티로이드 호르몬으로 포화된 안구 접촉물이며, 합성 티로이드 호르몬이 안구 접촉물로부터 확산되는 방법.
25. 제 22항에 있어서, 국소 투여 단계가 눈에 적합한 약제학적 담체를 이용하여 합성 티로이드 호르몬을 투여하는 것을 포함하는 방법.
26. 제 25항에 있어서, 눈에 적합한 약제학적 담체가 합성 티로이드 호르몬을 지속 방출시킬 수 있는 생분해가능한 합성 중합체를 포함하는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 각각의 눈에 대한 유효량이 하루에 0.1 내지 20ng인 방법.
28. 제 26항에 있어서, 농도가 1μM 이하인 합성 티로이드 호르몬이, 합성 티로이드 호르몬의 부재하에 배양된 소주 망구조 세포로부터의 히알루론산 분비와 비교하여, 소주 망구조 세포로부터의 히알루론산 분비를 30% 이상 감소시키고, 포유류의 눈에 합성 티로이드 호르몬을 국소 투여하는 단계, 및 국소 투여 단계 전과 후에 안압을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
29. 제 21항에 있어서, 투여 단계가 합성 티로이드 호르몬을 지속적으로 방출시킬 수 있는 중합체를 포함하는 안내 지속 방출 수단을 외과적으로 이식하거나 주입하는 것을 포함하는 방법.
30. 제 29항에 있어서, 중합체가 생분해가능한 방법.
31. 소주 망구조 세포 내부의 합성 티로이드 호르몬을 포함하는 조성물로서, 합성 티로이드 호르몬이 혈안 장벽을 통과하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
32. 제 31항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 합성 티로이드 호르몬의 에스테르화된 유도체인 조성물.
33. 제 31항에 있어서, 소주 망구조 세포가 눈 외식편으로부터의 사람 소주 망구조 세포인 조성물.
34. 제 31항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 사람 티로이드 수용체에 결합되는 조성물.
35. 제 34항에 있어서, 소주 망구조 세포 내부의 합성 티로이드 호르몬의 농도가 0.04ng/dl^-1이고, 소주 망구조 세포가 사람 소주 망구조 세포인 방법.
36. 합성 티로이드 호르몬 및 눈에 적합한 약제학적 담체를 포함하는 조성물.
37. 제 36항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 합성 티로이드 호르몬의 에스테르화된 유도체인 조성물.
38. 제 36항에 있어서, 눈에 적합한 약제학적 담체가 완충 식염수 용액을 포함하는 조성물.
39. 제 38항에 있어서, 눈에 적합한 약제학적 담체가 리포솜을 포함하는 조성물.
40. 제 36항에 있어서, 눈에 적합한 약제학적 담체가 생분해가능한 합성 중합체를 포함하는 조성물.
41. 합성 티로이드 호르몬으로 포화된 안구 접촉물을 포함하는 조성물.
42. 제 41항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 합성 티로이드 호르몬의 에스테르화된 유도체인 조성물.
43. 합성 티로이드 호르몬을 필요로 하는 환자에게 유효량의 합성 티로이드 호르몬을 전신 투여하는 단계를 포함하여 녹내장을 치료하는 방법.
44. IOP 감소 및 안구방수 유출에 영향을 미치는 합성 티로이드 호르몬을 스크리닝시키는 방법으로서,

    a) 농도가 10μM 이하인 합성 티로이드 호르몬을 소주 망구조 세포에 접촉시키는 단계; 및

    b) 합성 티로이드 호르몬과의 접촉 후에 소주 망구조 세포의 수력학적 전도성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
45. 제 44항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 화학식(I)에 의해 정의되는 방법.
46. 제 44항에 있어서, 합성 티로이드 호르몬이 화학식(II)에 의해 정의되는 방법.
47. 세포외 매트릭스 조합에 영향을 미치는 합성 티로이드 호르몬을 검정하는 방법으로서,

    a) 히알루론산 및 프로테오글리칸 단량체의 존재하에 농도가 10μM 이하인 합성 티로이드 호르몬을 소주 망구조 세포에 접촉시키는 단계; 및

    b) 소주 망구조 세포에 결합된 세포외 매트릭스의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
48. 제 47항에 있어서, 화합물이 화학식(I)에 의해 정의되는 방법.
49. 제 47항에 있어서, 화합물이 화학식(II)에 의해 정의되는 방법.
50. 안압을 감소시키기 위한 조성물에 공지된 티로이드 호르몬을 치료학적 유효량으로 사용하는 방법.
51. 제 50항에 있어서, 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 방법.
52. 제 51항에 있어서, 조성물이 국소 투여되는 방법.
53. 제 51항에 있어서, 조성물이 안내 투여되는 방법.