KR20000065690A - Specific and stable antisense oligonucleotide, antisense DNA and process for preparation thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 목적 유전자에 대한 반응 특이성 및 뉴클레아제 (nuclease)에 대한 안정성을 개선시킨 AS-올리고, 안티센스 DNA 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to an AS-oligo, antisense DNA and a method for producing the same, which improve the reaction specificity for the gene of interest and the stability for nucleases.
보다 상세하게는, 본 발명은 목적 유전자의 염기 서열 중 2차 구조가 형성되지 않아 접근이 용이한 영역의 서열을 각각 또는 조합하여 하나 이상 포함시키고, 시발체를 사용하거나 두 개의 동일한 또는 동일한 구조의 상이한 안티센스 분자를 자체적으로 폐쇄시킨 AS-올리고, 안티센스-DNA 및 이를 포함하는 플라스미드 벡터 및 그들의 제조 방법, 그 용도에 관한 것이다.More specifically, the present invention includes one or more sequences of the regions of the base sequence of the gene of interest, which are not easily formed, so that they can be easily accessed or used in combination with each other. The present invention relates to an AS-oligo, antisense-DNA and a plasmid vector comprising the same, and a method for preparing the same, the use of which is closed by itself.
안티센스 올리고 데옥시뉴클레오타이드 (AS-올리고)는 왓슨-크릭 염기 반응 (Watson- Crick base pairing)에 따라 목적 유전자에 결합되도록 디자인된 짧은 길이의 합성 DNA 로서, 유전자의 특정 염기 서열의 발현을 특이적으로 억제할 수 있어 유전자의 기능을 연구하고 암과 같은 질환을 분자 수준에서 치료할 수 있는 치료제를 개발하는데 이용되어 왔다 (Thompson, C. B. et al., Nature, 314: 363 -366, 1985; Melani, C. et al., Cancer Res., 51: 2897-2901, 1991; Anfossi, G. et al., PNAS, 86: 3379-3383, 1989). 이러한 AS-올리고는 유전자 발현을 억제하는 목표를 다양하게 설정하여 용이하게 제작될 수 있는 장점이 있어, 발암 유전자의 발현과 암세포의 성장을 억제하는 것에 관하여 많은 연구가 이루어져 왔다 (Wagner, R. W. et al., Nature, 372: 333-335, 1996).Antisense oligodeoxynucleotides (AS-oligo) are short-length synthetic DNA designed to bind to a gene of interest according to the Watson-Crick base pairing. It has been used to study gene function and to develop therapeutics that can treat diseases such as cancer at the molecular level (Thompson, CB et al., Nature, 314: 363-366, 1985; Melani, C. et al., Cancer Res., 51: 2897-2901, 1991; Anfossi, G. et al., PNAS, 86: 3379-3383, 1989). Such AS-oligo has the advantage that it can be easily produced by setting a variety of targets to suppress gene expression, many studies have been made on the expression of oncogenic genes and inhibiting the growth of cancer cells (Wagner, RW et al. , Nature, 372: 333-335, 1996).
AS-올리고가 특정 유전자의 발현을 억제하는 과정은 상보적인 mRNA 서열과 결합하여 RNase H 활성을 유도하여 mRNA 를 제거하거나 단백질 번역을 위한 리보좀 복합체 (ribosomal complex)의 형성 및 진행을 방해함으로써 이루어진다. 또한, AS-올리고는 게놈 DNA 와 결합하여 트리플-헬릭스 (triple-helix) 구조를 형성함으로 유전자의 전사를 억제한다고도 한다 (Young, S. L. et al., PNAS, 88: 10023-10026, 1991).The process by which AS-oligo inhibits the expression of certain genes is accomplished by binding to complementary mRNA sequences to induce RNase H activity to remove mRNA or interfere with the formation and progression of ribosomal complexes for protein translation. AS-oligo also inhibits gene transcription by binding to genomic DNA to form triple-helix structures (Young, S. L. et al., PNAS, 88: 10023-10026, 1991).
이와 같이 AS-올리고는 특정 유전자의 발현을 억제하는데 널리 사용될 수 있지만, 실제로 임상에 활용되기 위해서는 몇 가지 문제점을 개선하여야 한다. 구체적으로 뉴클레아제 (nucleases)에 대한 안정성을 향상시키고, 목적 유전자의 염기 서열에 특이적으로 결합하며 목표 조직 및 세포 내로 효율적으로 전달되어야 한다 (Albrecht, T. et al., Ann. Hem., 72: 73-79, 1996).As such, AS-oligo can be widely used to suppress the expression of specific genes, but some problems need to be improved in order to be used in clinical practice. Specifically, it should improve stability against nucleases, specifically bind to the nucleotide sequence of the gene of interest, and be efficiently delivered into target tissues and cells (Albrecht, T. et al., Ann. Hem., 72: 73-79, 1996).
최근 들어 포스포디에스터-올리고 (phosphodiester-oligo, PO-올리고)가 많이 사용되고는 있으나 이는 뉴클레아제에 매우 불안정하여 이를 개선한 포스포로자이오에이트-올리고 (phosphorothioate-oligo, PS-올리고), 메틸포스포네이트-올리고 (methylphosphonate-oligo, MP-올리고), C-5 프로핀 피리미딘 올리고 (propyne pyrimidine oligo)와 N3'→P5' 포스포아미데이트 (N3'→P5' phosphoramidates) 등의 변형된 올리고 유사체들이 다수 개발되었다. 그러나 이들도 목적 유전자 염기 서열에 대한 특이성이 적고 RNase H 활성에 대한 의문과 낮은 안정성 등의 문제점을 가지고 있다 (Akhtar, S. et al., Life Sci., 49: 1793-1801, 1991).Recently, phosphodiester-oligo (PO-oligo) has been used a lot, but it is very unstable to nucleases, thereby improving the phosphorothioate-oligo (PS-oligo), methyl Modified phosphonate-oligo (MP-oligo), C-5 propyne pyrimidine oligo and N3 '→ P5' phosphoramidates (N3 '→ P5' phosphoramidates) Many oligo analogs have been developed. However, they also have problems with low specificity to the target gene sequence and question about RNase H activity and low stability (Akhtar, S. et al., Life Sci., 49: 1793-1801, 1991).
또한 AS-올리고를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위하여, 리포좀 (liposomes), 엽산-폴리라이신 담체 올리고 (folic acid-polylysine carrier oligos) 또는 일렉트로포레이션 (electroporation) 등을 이용한 다양한 방법이 개발되었다 (Ginobbi, P. et al., Anticancer Res., 17: 29-36, 1997). 최근 양이온 리포좀 (cationic liposomes)을 이용한 AS-올리고의 전달 방법이 간편하고 상대적으로 효율성이 큰 것으로 판단되어 빈번히 사용되고 있다. 그러나 양이온 리포좀은 뉴클레아제에 대한 AS-올리고의 안정성을 증가시키고 세포 내 전달을 상당히 개선시킴에도 불구하고 리포좀 자체에 독성이 있어 그 사용량에 한계가 있으며 그 전달 효율성도 아직 많이 개선되어야 한다 (Flanagan, W. M. et al., Mol. Biol. Cell., 7: 1095-1106, 1996).In addition, in order to efficiently deliver AS-oligo into cells, various methods using liposomes, folic acid-polylysine carrier oligos or electroporation have been developed (Ginobbi, P. et al., Anticancer Res., 17: 29-36, 1997). Recently, the AS-oligo delivery method using cationic liposomes has been frequently used because it is judged to be simple and relatively high in efficiency. However, although cationic liposomes increase the stability of AS-oligo to nucleases and significantly improve intracellular delivery, they are toxic to liposomes themselves, limiting their use and still needing to be improved significantly (Flanagan). , WM et al., Mol. Biol. Cell., 7: 1095-1106, 1996).
이외에도 유전자 mRNA 의 2차 및 3차 구조가 AS-올리고의 특이 결합에 중요한 영항을 미친다. 구체적으로 mRNA 2차 구조가 적은 부분이 AS-올리고가 목표로서 접근하는데 매우 유리하므로, AS-올리고를 합성하기 전에 mRNA 2차 구조가 적게 생성되는 영역을 체계적으로 분석하여 AS-올리고의 목표 지점을 선정하는 것이 필요하다.In addition, the secondary and tertiary structures of gene mRNA have an important effect on the specific binding of AS-oligo. Specifically, since the portion of the mRNA secondary structure is very advantageous for the AS-oligo approach, the target region of the AS-oligo is analyzed by systematically analyzing the region where the mRNA secondary structure is generated before synthesizing the AS-oligo. It is necessary to select.
원발암성 유전자 (proto-oncogene)인 c-myb 은 조혈세포 (hematoptietic cell)에서 세포 증식, 분화 및 고정을 조절하는 중요한 유전자로서, 정상적인 조혈세포에서 Myb 단백질은 분화 단계에 따라서 양적으로 변화가 있고 최종 분화 상태에서는 Myb 단백질을 매우 적은 양으로 발현하는 것이 알려져 있다. 그러나 백혈병 세포 (leukemic cell)에서는 빈번히 c-myb 이 비정상적으로 과잉 발현 (over- expression)되는 것이 보고되어 있고, 실제로 HL-60 (promyelocytic cancer cell line)와 K562 (CML, chronic myelogenous leukemia) 암 세포주에서 c-myb mRNA 를 감소시키면 세포 증식이 저해되거나 아폽토시스 (apoptosis)가 진행된다고 한다.The c-myb, a proto-oncogene, is an important gene that regulates cell proliferation, differentiation and fixation in hematopoietic cells. In normal hematopoietic cells, Myb protein changes quantitatively according to differentiation stage and finally It is known to express very low amounts of Myb protein in the differentiated state. However, it has been reported that abnormally over-expression of c-myb in leukemic cells is frequent, and actually in promyelocytic cancer cell line (HL-60) and chronic myelogenous leukemia (KML) cancer cell lines. Reducing c-myb mRNA inhibits cell proliferation or promotes apoptosis.
Myb 단백질은 주로 핵 내에 존재하며 DNA 에 결합하여 활성화되면 세포 주기 G1/S 기에서 조절자로 작용하고, 특히 조혈 세포의 발생 조절에 중요한 역할을 담당하는 것이 알려져 있다. 세포의 분화와 증식에 직, 간접적으로 관여하는 c-myb 유전자는 백혈병 세포에서 빈번히 이상 과발현되는데, 이렇게 과발현된 mRNA 를 AS-올리고를 사용하여 감소 또는 제거하면 세포 성장을 부분적으로 억제시키는 특이적인 분자적 항암제도 개발할 수 있고 c-myb 유전자의 기능도 연구할 수 있다.It is known that Myb protein mainly exists in the nucleus and, when bound to DNA and activated, acts as a regulator in the cell cycle G 1 / S phase, and plays an important role in regulating the development of hematopoietic cells. The c-myb gene, which is directly or indirectly involved in cell differentiation and proliferation, is frequently overexpressed in leukemia cells. Specific molecules that partially inhibit cell growth by reducing or eliminating this overexpressed mRNA using AS-oligo Anticancer agents can also be developed and the function of the c-myb gene can be studied.
이에 본 발명자들은 목적 유전자에 대한 반응 특이성 및 뉴클레아제 (nuclease)에 대한 안정성을 개선시킨 AS-올리고 또는 안티센스 DNA를 얻기 위하여 노력을 계속한 결과, c-myb 유전자 등의 2차 구조를 분석하여 AS-올리고의 접근이 용이한 영역을 선별하고 이 영역 서열을 하나 이상 포함시키고 이들을 시발체를 사용하거나 또는 동일구조의 두 분자를 자체적으로 폐쇄시킨 다양한 구조의 AS-올리고 및 안티센스-DNA 를 제작한 다음 세포내에 양이온 리포좀을 이용하여 전달하고 이 과정에서 원발암성 유전자의 발현 및 세포 성장이 억제됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have continued efforts to obtain AS-oligo or antisense DNA having improved reaction specificity for the target gene and stability against nuclease, and analyzed secondary structures such as c-myb gene. Selecting accessible regions of the AS-oligo, constructing AS-oligo and antisense-DNAs of various structures using one or more of these region sequences and using primers or self-closing two molecules of the same structure The present invention has been completed by confirming that intracellular intracellular delivery is performed using cationic liposomes and in this process, expression of primary carcinogenic genes and cell growth are inhibited.
본 발명은 목적 유전자에 대한 반응 특이성 및 뉴클레아제에 대한 안정성을 개선시킨 AS-올리고, 안티센스-DNA 및 그 제조방법 그리고 이들의 용도를 제공함에 그 목적이 있다.It is an object of the present invention to provide AS-oligo, antisense-DNA, a method for preparing the same, and a use thereof, which have improved response specificity to a target gene and stability to nucleases.
도 1은 폐쇄형 다중 안티센스 올리고(closed multiple antisense oligo, CMAS-올리고)의 구조를 나타낸 것이고,1 shows the structure of a closed multiple antisense oligo (CMAS-oligo),
도 2는 리본형 안티센스 올리고(ribbon-type AS oligo, RiAS-올리고)의 제작과정과 구조를 나타낸 것이고,Figure 2 shows the fabrication process and structure of the ribbon antisense oligo (ribbon-type AS oligo, RiAS- oligo),
도 3은 본 발명의 플라스미드 벡터 pBSIJ34-CDK4의 제작과정을 도시한 것이고,Figure 3 shows the construction of the plasmid vector pBSIJ34-CDK4 of the present invention,
도 4는 리본형 안티센스 DNA(ribbon-type AS DNA, RiAS-DNA) 의 제작과정과 구조를 나타낸 것이고,Figure 4 shows the fabrication process and structure of ribbon antisense DNA (ribbon-type AS DNA, RiAS-DNA),
도 5a는 본 발명의 폐쇄형 AS-올리고를 폴리아크릴아미드 젤상에서 분리한 결과를 나타낸 것이고,Figure 5a shows the result of the separation of the closed AS-oligo of the present invention on a polyacrylamide gel,
도 5b는 본 발명의 폐쇄형 AS-올리고의 안정성을 선상 AS-올리고와 비교하여 실험한 결과를 나타낸 것이다.5b shows the results of experiments comparing the stability of the closed AS-oligo of the present invention with the linear AS-oligo.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은목적 유전자의 염기 서열 중 2차 구조가 형성되지 않아 접근이 용이한 영역의 서열을 각각 또는 조합하여 하나 이상 포함시킴으로 반응 특이성을 개선시킨 AS-올리고 및 이들을 시발체를 사용하거나 또는 동일구조의 두 분자를 자체적으로 폐쇄시켜 뉴클레아제 (nuclease)에 대한 안정성을 향상시킨 폐쇄형 AS-올리고 및 안티센스-DNA를 제공한다. 이 때 목적 유전자로서 c-myb 유전자 혹은 그 유전자의 표현이 질병의 형성 및 진행에 관계되는 여타의 유전자를 사용한다.In order to achieve the above object, the present invention is to improve the specificity of the AS-oligo and primers by including one or more of each or a combination of sequences of easily accessible regions of the base sequence of the target gene is not formed Or closed the two molecules of the same structure by themselves to provide closed AS-oligo and antisense-DNA which have improved stability to nucleases. At this time, c-myb gene or other gene whose expression is related to disease formation and progression is used as a target gene.
구체적으로, 본 발명은 상기 AS-올리고를 시발체를 이용하여 하나 이상 라이게이션시킨 폐쇄형 다중 AS-올리고(closed multiple antisense oligo, 이하 "CMAS-올리고"라 약칭함) 및 스템-루프 (stem-loop) 구조의 AS-올리고 2개를 자체적으로 라이게이션시킨 리본형 AS-올리고 (ribbon-type AS-oligo, 이하 "RiAS-올리고"라 약칭함) 그리고 스템-루프 (stem-loop) 구조의 AS-DNA 2개를 자체적으로 라이게이션시킨 리본형 AS-DNA (이하 "RiAS-DNA"라 약칭함) 등을 제공한다.Specifically, the present invention provides a closed multiple antisense oligo (hereinafter, abbreviated as "CMAS-oligo") and stem-loop in which at least one AS-oligo is ligated using a primer. Ribbon-type AS-oligo (hereinafter abbreviated as "RiAS-oligo") and two stem-loop structures. Ribbon-type AS-DNA (hereinafter abbreviated as "RiAS-DNA") which ligated two DNAs by itself is provided.
또한, 본 발명은 목적 유전자의 염기 서열 중 2차 구조가 형성되지 않아 접근이 용이한 영역의 서열을 각각 또는 조합하여 하나 이상 배열시킨 루프 (loop) 구조와 그 5'-말단과 3'-말단이 상보적 서열을 포함하는 스템-루프 구조를 형성하는 안티센스 DNA 를 포함하는 플라스미드 벡터 (수탁번호 : KCTC 8919 P)를 제공한다.In addition, the present invention provides a loop structure in which one or more sequences of a region of the base sequence of the gene of interest are not formed so that one or more sequences of easily accessible regions can be arranged, respectively, and the 5'-end and 3'-end thereof. A plasmid vector (Accession No .: KCTC 8919 P) comprising an antisense DNA forming a stem-loop structure comprising this complementary sequence is provided.
또한, 본 발명은 (1) 목적 유전자의 염기 서열로부터 2차 구조를 분석하여 2차 구조가 형성되지 않는 영역을 선별하고, (2) 2차 구조가 형성되지 않는 영역의 서열을 하나 이상 포함하는 AS-올리고 또는 안티센스 DNA 를 얻고, (3) 상기 AS-분자 하나를 시발체를 이용하여 또는 둘 이상의 AS 분자를 자체적으로 라이게이션시킴으로 폐쇄형 AS-올리고를 제조하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention (1) analyzes the secondary structure from the nucleotide sequence of the target gene to select a region in which the secondary structure is not formed, and (2) comprising at least one sequence of the region in which the secondary structure is not formed Obtaining an AS-oligo or antisense DNA, and (3) provides a method for producing a closed AS-oligo by using one of the AS-molecules or ligating two or more AS molecules by itself.
상기 AS-올리고 및 안티센스 DNA 는 암, 면역질환, 대사질환 및 감염성 질환을 포함하여 여하한 유전자의 과잉 발현으로 유발되는 질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.The AS-oligos and antisense DNAs can be effectively used for the treatment of diseases caused by overexpression of any gene, including cancer, immune diseases, metabolic diseases and infectious diseases.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 목적 유전자와의 반응 특이성을 개선시키고 뉴클레아제에 대한 안정성을 향상시킨 안티센스 올리고 뉴클레오타이드를 제작하기 위하여, 우선 컴퓨터 프로그램으로 유전자의 2차 구조를 분석한다. 세포 mRNA 는 자체적인 염기 결합에 의하여 2차 또는 3차 구조를 형성하고 RNA 결합성 단백질과 결합하여 구조를 안정화시키므로 AS-올리고가 용이하게 접근할 수 있는 작용 부위를 선별하는 것은 매우 중요하다. 실제로 헤어핀 루프 (hairpin loop) 구조를 가지는 Ha-ras 유전자의 경우 단일가닥 루프 부위에서 상보적인 결합 (hybridization)이 더 일어난다고 보고되어 있다.The present invention first analyzes the secondary structure of a gene with a computer program in order to produce antisense oligonucleotides with improved reaction specificity with the gene of interest and improved stability to nucleases. Since cellular mRNAs form secondary or tertiary structures by their own base bonds and bind to RNA binding proteins to stabilize their structure, it is very important to select sites of action that AS-oligo can easily access. In fact, in the case of the Ha-ras gene having a hairpin loop structure, it is reported that more complementary hybridization occurs at the single-stranded loop site.
본 발명은 DNAsis 프로그램을 이용하여 유전자 2차 구조가 최소화되고 안티센스 효과가 있는 서열 영역을 선별한다. 구체적으로, 동일한 염기 서열을 최소한 3개의 프레임으로 나누어 그 2차 구조를 분석하는데, 이 때 100개의 염기로 구성된 프레임을 3'- 방향으로 30개의 염기를 건너뛰면서 순차적으로 과정을 반복하여 mRNA 의 2차 구조는 합성과 동시에 이루어지는 것도 감안한다. 이 때 2차 구조가 형성되지 않는 루프 부위중에서 G + C 함량이 30% 이상되는 부위를 선별하는 것이 바람직하다.The present invention uses the DNAsis program to select sequence regions having a minimal gene secondary structure and having an antisense effect. Specifically, the secondary structure is analyzed by dividing the same nucleotide sequence into at least three frames. In this case, the frame consisting of 100 bases is repeatedly repeated while skipping 30 bases in the 3'-direction. It is also taken into account that the car structure takes place simultaneously with synthesis. At this time, it is preferable to select a site having a G + C content of 30% or more among the loop sites in which the secondary structure is not formed.
구체적으로, 본 발명은 c-myb 유전자의 2차 구조를 상기 과정으로 분석하여 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4 또는 서열 5 의 특이적 안티센스 염기 서열을 선별하고, 이들을 하나 이상 포함시켜 자체의 2차 구조가 형성되지 않도록 조합하여 반응 특이성을 개선시킨 AS-올리고를 제작한다.Specifically, the present invention analyzes the secondary structure of the c-myb gene by the above process to select the specific antisense nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, including one or more of them AS-oligoes were prepared by improving the reaction specificity by combining so that secondary structures of.
이 때 AS-올리고는 적게는 하나 이상 또는 많게는 4개 이상의 안티센스 서열을 가지고 있어 목적 유전자 부위를 다중 공격 (multiple target site binding)할 수 있고, 이 때 다중 공격은 한 유전자의 여러 곳과 동시에 결합하거나 여러 유전자와 결합하여 동시에 공격하는 것을 말한다.In this case, AS-oligo has at least one or more than four antisense sequences, so that multiple target site bindings can be performed on multiple target sites, where multiple attacks can be combined with several places of a gene at the same time. Combining several genes and attacking at the same time.
이들 AS-올리고는 상보적인 공통의 시발체를 사용하여 라이게이션시킴으로 폐쇄형 (covalently closed)으로 변화되고, 이러한 과정으로 얻은 CMAS-올리고는 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 작용 부위가 없어 뉴클레아제에 대하여 안정하다. 이 때 CMAS-올리고의 서열을 자체적 2차 구조가 적은 형태로 조합하면 목적 유전자에 대한 반응 특이성을 높일 수 있다.These AS-oligoes are covalently closed by ligating using complementary common primers, and the CMAS-oligoes obtained by this process have no site of exonuclease action and therefore are nucleated against nucleases. Stable. At this time, combining the sequence of CMAS-oligo in the form of its own secondary structure can increase the reaction specificity for the target gene.
본 발명은 AS-올리고에 사용되는 염기로서 기존의 데옥시뉴클레오타이드 이외에도 염기 결합을 향상시키는 변형된 뉴클레오타이드를 사용한다.The present invention uses modified nucleotides that enhance base binding in addition to the existing deoxynucleotides as bases used in AS-oligo.
구체적으로 본 발명에서는 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 안티센스 서열을 포함하고, 서열 6의 시발체를 이용하여 라이게이션시킨 서열 7의 CMAS-올리고를 제공한다(도 1 참조).Specifically, the present invention provides the CMAS-oligo of SEQ ID NO: 7 comprising the antisense sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 using the primers of SEQ ID NO: 6 (see FIG. 1).
또한, 본 발명은 스템-루프 (stem-loop) 구조를 가지는 동일한 서열의 AS-올리고 또는 동일한 구조의 상이한 서열을 가진 AS-올리고를 2개 결합하여 도 2에 보는 바와 같이 리본 형태를 가지는 AS-올리고 (ribbon-type AS-oligo, RiAS-올리고)를 제공한다. 이는 하나의 스템을 중심으로 양쪽에 2개의 루프로 구성되고, 각 루프에는 하나 이상의 안티센스 서열이 포함되며 스템은 RiAS-올리고의 구조적인 안정성을 부여한다. RiAS-올리고도 목적 유전자 부위를 다중 공격할 수 있고, 엑소뉴클레아제 작용 부위가 없어 뉴클레아제에 대하여 안정하다. 또한, RiAS-올리고의 안티센스 서열을 자체적인 2차 구조가 적은 형태로 조합하면 목적 유전자에 대한 반응 특이성을 높일 수 있고, 염기로도 기존의 데옥시뉴클레오타이드 이외에도 염기 결합을 향상시키는 변형된 뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.In addition, the present invention combines two AS- oligos of the same sequence having a stem-loop structure or two AS-oligoes having different sequences of the same structure, and thus has an AS- having a ribbon form as shown in FIG. 2. Oligo (ribbon-type AS-oligo, RiAS-oligo). It consists of two loops on both sides about one stem, each loop containing one or more antisense sequences and the stems confer structural stability of the RiAS-oligo. RiAS-oligo can also attack multiple target gene sites and is stable against nucleases due to the lack of exonuclease action sites. In addition, by combining the antisense sequence of RiAS-oligo with its own secondary structure, it is possible to increase the reaction specificity for the gene of interest, and to use a modified nucleotide that enhances the base bond in addition to the existing deoxynucleotide as a base. Can be.
구체적으로 본 발명에서는 서열 3, 서열 4 및 서열 5의 안티센스 서열을 포함하는 서열 8의 AS-올리고 분자 두 개를 자체적으로 라이게이션시켜 제조한 RiAS-올리고를 제공한다(도 2 참조).Specifically, the present invention provides RiAS-oligo prepared by ligating two AS-oligo molecules of SEQ ID NO: 8 including SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and antisense sequences of SEQ ID NO: 5 (see FIG. 2).
또한 스템-루프 구조를 형성하는 동일 또는 상이한 서열의 AS-DNA를 2개 결합하여 도 4에 보는 바와 같이 리본 형태를 가지는 AS-DNA (ribbon-type AS-oligo, RiAS-DNA)를 제공한다. 이 때 AS-DNA에는 하나 이상의 목적 유전자에 각각 상보적인 안티센스 DNA가 조합될 수 있으므로 생물학적 우회적 반응(by passing)의 차단을 통한 좀더 완벽한 안티센스 효과를 유도한다.In addition, two AS-DNAs of the same or different sequence forming the stem-loop structure are combined to provide an ribbon-type AS-DNA (ribbon-type AS-oligo, RiAS-DNA) as shown in FIG. 4. In this case, the AS-DNA may be combined with antisense DNA complementary to one or more target genes, thereby inducing a more complete antisense effect through blocking of biological bypass.
본 발명에서는 서열 10의 CDK4에 대한 AS-DNA 두 개를 자체적으로 라이게이션시켜 제조한 RiAS-DNA를 제공한다.The present invention provides RiAS-DNA prepared by ligating two AS-DNAs to CDK4 of SEQ ID NO: 10 by itself.
또한, 본 발명은 목적 유전자의 염기 서열 중 2차 구조가 형성되지 않아 접근이 용이한 영역의 서열을 각각 또는 조합하여 하나 이상 포함하는 루프 (loop) 구조와 그 5'-말단과 3'-말단에 상보적 서열을 포함하는 스템-루프 구조를 형성하는 안티센스 DNA 를 포함하는 플라스미드 벡터를 제작한다.In addition, the present invention is a loop structure including one or more of each or a combination of sequences of an easily accessible region because the secondary structure is not formed in the base sequence of the target gene and its 5'-end and 3'-end A plasmid vector comprising an antisense DNA forming a stem-loop structure comprising a complementary sequence is constructed.
상기 플라스미드 벡터는 카세트를 포함하고 삽입되는 안티센스 DNA 길이에 제한이 없다. 상기 스템 구조의 상보적 서열에는 제한효소 인지부위가 하나 이상 포함되어 동일형 분자가 마주보는 다이머 형태로 제작될 수 있고, 이 때 모든 종류의 제한효소 인지부위가 이용될 수 있다.The plasmid vector contains a cassette and is not limited in length of antisense DNA to be inserted. Complementary sequence of the stem structure includes one or more restriction enzyme recognition site can be produced in the form of a dimer facing the same type molecule, when all kinds of restriction enzyme recognition site can be used.
구체적으로 본 발명에서는 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+)내의 698-731 에 상보적인 34 mer 염기서열과 이에 일부가 상보적인 짧은 14mer의 올리고를 결합시킨 후 클레노 효소를 처리하여 이중가닥으로 만들고 이를 EcoRⅤ로 절단한 pBluescript SK(+)에 삽입하여 플라스미드 벡터 pBSIJ-34를 얻는다. 다음 상기 pBSIJ-34를 EcoRⅤ로 절단하고 CDK4 RNA로부터 RT-PCR을 수행하여 얻은 CDK4 cDNA를 삽입하여 본 발명의 플라스미드 벡터 pBSIJ34-CDK4를 제작한 다음(도 3 참조), 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 12월 28일자로 기탁하였다. (수탁번호 : KCTC 8919 P).Specifically, the present invention binds a 34 mer nucleotide sequence complementary to 698-731 in the plasmid vector pBluescript SK (+) and a short 14mer oligo which is complementary thereto, and then cleaves into a double strand by processing the clenoenzyme. The plasmid vector pBSIJ-34 was obtained by inserting into the cleaved pBluescript SK (+). Next, the plasmid vector pBSIJ34-CDK4 of the present invention was prepared by cutting the pBSIJ-34 with EcoRV and inserting CDK4 cDNA obtained by performing RT-PCR from CDK4 RNA (see FIG. 3). It was deposited with the Institute of Engineering Gene Bank on December 28, 1998. (Accession No .: KCTC 8919 P).
본 발명에서 상기 RiAS-DNA는 본 발명의 플라스미드 벡터 pBSIJ34-CDK4로부터 제조할 수 있는데 구체적으로 상기 벡터를 XbaⅠ으로 절단하고 25 mer인 서열 9의 5'-시발체 (5'-GGTCGACGGTATCGATAAGCTTGAT-3')만으로 한 방향(one-direction) PCR을 수행하여 루프-스템 구조의 서열 10의 AS-DNA를 분리한 다음 BamHI으로 절단하고 T4DNA 라이게이즈를 이용하여 두 분자를 연결시킴으로 2개의 루프와 1개의 스템을 갖는 RiAS-DNA를 제조한다(도 4 참조).In the present invention, the RiAS-DNA can be prepared from the plasmid vector pBSIJ34-CDK4 of the present invention. Specifically, the vector is cleaved with XbaI and the 5'-promoter of sequence 9 (5'-GGTCGACGGTATCGATAAGCTTGAT-3 '), which is 25 mer, is used. One-direction PCR was performed to isolate the AS-DNA of SEQ ID NO: 10 of the loop-stem structure, cleaved with BamHI, and linking the two molecules using a T 4 DNA ligase. RiAS-DNA with stem is prepared (see FIG. 4).
본 발명의 CMAS-올리고, RiAS-올리고 및 RiAS-DNA를 선상 AS-올리고와 함께 엑소뉴클레아제 (Exonuclease Ⅲ)를 처리하여 그 안정성을 시험한 결과, 선상 AS-올리고는 쉽게 분해되는 반면 본 발명의 폐쇄형 AS-올리고는 전혀 분해되지 않았다.The CMAS-oligo, RiAS-oligo and RiAS-DNA of the present invention were treated with Exonuclease III together with the linear AS-oligo to test its stability. The closed AS-oligo of did not disintegrate at all.
또한, 본 발명은 AS-올리고를 양이온 리포좀 (cationic liposome)과 반응시켜 얻은 복합체를 이용하여 목적 조직 또는 세포에 안티센스 DNA 를 전달하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for delivering antisense DNA to a target tissue or cell using a complex obtained by reacting AS-oligo with a cationic liposome.
본 발명은 양이온 리포좀을 운반체로 하여 상기 AS-올리고를 암세포에 전달하여 암세포 성장 억제 효과를 세포 증식 저해 시험 (inhibition test of cell growth) 및 소프트 아가로스 콜로니 분석 (soft agarose colony assay) 등을 이용하여 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 폐쇄형 AS-올리고 및 안티센스 DNA는 소량으로도 암 유전자의 발현을 효과적으로 감소시키는 뛰어난 안티센스 효과를 나타내었다.The present invention uses the cationic liposome as a carrier to deliver the AS-oligo to cancer cells to inhibit the effect of cancer cell growth by using an inhibition test of cell growth and a soft agarose colony assay. Investigate. As a result, the closed AS-oligo and antisense DNA of the present invention exhibited an excellent antisense effect that effectively reduces the expression of cancer genes even in small amounts.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.
실시예 1. CMAS-올리고의 제작Example 1. Preparation of CMAS-oligo
본 발명은 기존 AS-올리고의 안정성을 개선하기 위하여, 스템-루프 (stem- loop) 구조에 4개의 상이한 유전자 결합 부위를 가지는 AS-올리고를 시발체를 이용하여 공유결합시킴으로 뉴클레아제에 안정한 CMAS-올리고를 제작하였다.In order to improve the stability of the existing AS-oligo, the present invention provides a CMAS-stable to nucleases by covalently binding an AS-oligo having four different gene binding sites to a stem-loop structure using a primer. Oligos were made.
우선 AS-올리고를 제작하기 위하여, c-myb 의 cDNA 2차 구조를 DNAsis 프로그램 (Ver.2.1, Hitach software, Japan)을 이용하여 분석하고 안티센스 서열 중에서 안티센스 효과가 있는 것으로 판명된 몇 개의 AS-올리고를 자체적 2차 구조 형성이 적은 형태로 조합하여 합성하였다. 또한 CMAS-올리고를 제작하기 위하여, 하기 표 1에서 보는 바와 같이 서열 1 의 MIJ-1, 서열 2 의 MIJ-3, 서열 3 의 MIJ-2, 서열 4 의 MIJ-4 를 조합하여 서열 7의 60-mer의 선상 AS-올리고를 얻고 그 5'-말단을 인산화하여 리가제 (ligase, Boeringer Mannheim, Germany)로 양 끝을 공유결합시켰다. 이 때 5'-말단과 3'-말단에 반쪽씩 상보적인 서열 6의 14-mer의 시발체를 이용하였다 (intramolecular ligation).First, in order to produce AS-oligo, the cDNA secondary structure of c-myb was analyzed using the DNAsis program (Ver.2.1, Hitach software, Japan) and several AS-oligoids were found to have an antisense effect among antisense sequences. Was synthesized by combining them in a form with little formation of their own secondary structure. In addition, in order to prepare the CMAS-oligo, as shown in Table 1, MIJ-1 of SEQ ID NO: 1, MIJ-3 of SEQ ID NO: 2, MIJ-2 of SEQ ID NO: 3, MIJ-4 of SEQ ID NO: 4 The on-line AS-oligo of -mer was obtained and its 5'-end was phosphorylated to covalently bind both ends with ligase (ligase, Boeringer Mannheim, Germany). At this time, the 14-mer primer of SEQ ID NO: 6 complementary to the 5'-end and the 3'-end was used (intramolecular ligation).
구체적으로 상기 AS-올리고와 시발체는 85℃에서 2분간 열처리하고 상온에서 서서히 냉각시켜 결합시킨 다음 리가제 1 U/㎍ 로 AS-올리고를 처리하고 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 라이게이션한 다음 이로부터 얻은 폐쇄형 AS-올리고를 5% 메타포 아가로스 (Metaphor agarose, FMC, USA) 또는 15% 변성 폴리아크릴아미드 젤을 이용하여 분석하였다.Specifically, the AS-oligo and the primer are heat-treated at 85 ° C. for 2 minutes, slowly cooled at room temperature, combined, treated with AS-oligo with ligase 1 U / μg, reacted at 16 ° C. for 16 hours, and then to this. Closed AS-oligoes obtained from were analyzed using 5% metaphor agarose (Metaphor agarose, FMC, USA) or 15% modified polyacrylamide gels.
그 결과, 상기 CMAS-올리고는 선상 AS-올리고와 전기영동 상에서 지연 현상이 유발시키고 엑소뉴클레아제 (Exonuclease Ⅲ)를 처리한 경우에도 지연된 AS-올리고의 띠 (band)는 전혀 분해되지 않고 CMAS-올리고 분자가 모노머 (60-mer), 다이머 (120-mer) 그리고 트라이머 (180-mer) 형태로 각각 폴리아크릴아미드 젤상에 명확하게 나타나므로 그 폐쇄성을 확인할 수 있었다. 그러나 선상 AS-올리고는 2시간만에 엑소뉴클레아제에 의하여 완전히 분해되었다.As a result, the CMAS-oligo was induced by delay on the linear AS-oligo and electrophoresis, and even when treated with exonuclease III, the band of the delayed AS-oligo was not decomposed at all and the CMAS-oligo was not decomposed. The oligo molecule was clearly shown on the polyacrylamide gel in the form of monomer (60-mer), dimer (120-mer) and trimer (180-mer), respectively, thereby confirming its closure. However, onboard AS-oligo was completely degraded by exonuclease in 2 hours.
실시예 2. 리본형 AS-올리고 (RiAS-올리고)의 제작Example 2. Fabrication of Ribbon-type AS-oligo (RiAS-oligo)
c-myb mRNA 에 대하여 안티센스 효과가 이미 확인된 안티센스 염기 서열 중 서열 3, 서열 4 및 서열 5(MIJ-17에서 3-mer 제거한 15-mer)의 3개의 염기 서열 (각각 15-mer)을 선택하고 실시예 1 의 과정으로 자체적으로 2차 구조가 적은 형태로 조합하여 서열 8의 스템-루프 형태의 AS-올리고를 제작한 다음 스템-루프 형태의 AS-올리고 2개를 서로 결합시킴으로 폐쇄된 리본 (covalently-closed ribbon) 형태로 리본형 AS-올리고 (RiAS-올리고)를 제작하였다 (도 2 참조).Three base sequences (15-mer each) of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 (15-mer removed 3-mer in MIJ-17) are selected from antisense base sequences for which antisense effects have already been confirmed for c-myb mRNA. In the procedure of Example 1, the secondary structure itself was combined to form a stem-loop form of the AS- oligo of SEQ ID NO: 8, and then the stem-loop form of the AS-oligo and closed by combining the two together A ribbon type AS-oligo was produced in the form of (covalently-closed ribbon) (see FIG. 2).
상기 RiAS-올리고는 한 개의 스템을 중심으로 두 개의 루프가 양쪽에 존재하고, 하나의 루프 부위에는 1개의 이상의 안티센스 염기 서열 (일례로서 총 45-mer; 3개의 15-mer로 구성;길이의 제약없음)이 포함되며 스템 부위는 안티센스가 아닌 염기 서열 (13-mer;길이의 제약없음)로 구성되어 폐쇄형 리본 구조를 유지한다. 특히 스템의 최말단 부위에는 단일가락 형태 (4-mer, 5'-overhang)의 제한효소 인지부위가 있어 2개의 AS-올리고가 별개의 시발체없이 라이게이션되어 폐쇄형 (covalent ligation)으로 변화된다. 또한 5'-말단도 인산화되어 있어 라이게이션이 더욱 용이하며, 이러한 5'-말단 인산화는 AS-올리고가 합성되는 과정 또는 합성후에 수행될 수 있다.The RiAS-oligo has two loops on both sides of one stem, and at least one antisense sequence (45-mer total, for example, consisting of three 15-mers) at one loop site; None) and the stem region consists of a base sequence (13-mer; no length constraint) that is not antisense to maintain a closed ribbon structure. In particular, at the end of the stem, there is a restriction enzyme recognition site in the form of 4-mer, 5'-overhang, so that two AS-oligoes are ligated without a separate primer and changed to covalent ligation. In addition, the 5'-end is also phosphorylated to facilitate ligation, and this 5'-end phosphorylation may be performed during or after the synthesis of the AS-oligo.
상기 과정으로 제조한 RiAS-올리고는 단순 스템-루프 형태의 선상 AS-올리고보다 분자량이 두 배이기 때문에 폴리아크릴아미드 젤 상에서 쉽게 구분되고 확인 및 분리·정제가 용이하다(도 5a 참조).RiAS-oligo prepared by the above process has a molecular weight twice that of the linear AS-oligo in the form of a simple stem-loop, so it is easily distinguished on a polyacrylamide gel and is easily identified, separated and purified (see FIG. 5A).
실시예 3. 안티센스 DNA 를 포함하는 플라스미드 벡터의 제작Example 3 Construction of Plasmid Vectors Containing Antisense DNA
플라스미드 벡터 pBluescript SK(+)내의 698-731 에 상보적인 34 mer 염기서열과 이에 일부가 상보적인 짧은 14mer의 올리고를 결합시킨 후 클레노 효소를 처리하여 이중가닥으로 만들고 이를 EcoRⅤ로 절단한 pBluescript SK(+)에 삽입하여 플라스미드 벡터 pBSIJ-34를 얻는다.PBluescript SK (combined with 34 mer nucleotides complementary to 698-731 in the plasmid vector pBluescript SK (+) and a short 14mer oligo which is partially complementary to it) was subjected to clenoenzyme and double-stranded and digested with EcoRV. Insert) into plasmid vector pBSIJ-34.
다음 상기 pBSIJ-34를 EcoRⅤ로 절단하고 CDK4 RNA로부터 시발체를 이용한 RT-PCR을 수행하여 얻은 CDK4 cDNA를 삽입하여 본 발명의 플라스미드 벡터 pBSIJ34-CDK4를 제작하였다(도 3 참조).Next, the plasmid vector pBSIJ34-CDK4 of the present invention was prepared by inserting CDK4 cDNA obtained by cleaving pBSIJ-34 with EcoRV and performing RT-PCR using a primer from CDK4 RNA (see FIG. 3).
이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 12월 28일자로 기탁하였다. (수탁번호 : KCTC 8919 P).It was deposited on Dec. 28, 1998 to Gene Bank of Korea Institute of Science and Technology. (Accession No .: KCTC 8919 P).
실시예 4. 리본형 AS-DNA (RiAS-DNA)의 제작Example 4 Fabrication of Ribbon Type AS-DNA (RiAS-DNA)
RiAS-DNA는 본 발명의 플라스미드 벡터 pBSIJ34-CDK4로부터 제조할 수 있는데 구체적으로 상기 벡터를 XbaⅠ으로 절단하고 25 mer 인 서열 9의 5' 시발체 (5'-GGTCGACGGTATCGATAAGCTTGAT) 만으로 한 방향 PCR을 수행하여 서열 10의 루프-스템 구조의 AS-DNA를 분리한 다음 BamHI으로 절단한 후 T4DNA 라이게이즈를 이용하여 두 분자를 연결시킴으로 2개의 루프와 1개의 스템을 갖는 RiAS-DNA를 제조하였다(도 4 참조).RiAS-DNA can be prepared from the plasmid vector pBSIJ34-CDK4 of the present invention. Specifically, the vector was cleaved with XbaI and subjected to one-way PCR using only the 5 'primer (5'-GGTCGACGGTATCGATAAGCTTGAT) of SEQ ID NO. Ris-DNA having two loops and one stem was prepared by separating AS-DNA having a loop-stem structure of and then cleaving with BamHI and connecting two molecules using T 4 DNA ligase (FIG. 4). Reference).
본 발명의 RiAS-DNA는 G1/S기의 세포주기 조절자인 cdk4 등 혹은 안티센스 효과가 있는 여하한 서열을 포함할 수 있으므로 유전자의 과잉발현으로 인한 암, 면역질환, 대사질환 및 감염성 질환의 유발 및 진행에 관여할 것으로 예상되는 여하한 유전자에 대하여도 안티센스 효과를 기대할 수 있다. 안티센스 효과를 기대하는 목적 유전자는 cdk4 유전자에 한정되는 것이 아니라 유전자의 과잉발현으로 인한 암, 면역질환, 대사질환 및 감염성 질환의 유발 및 진행에 관여하고 과 표현되는 어떠한 유전자도 목표로 할 수 있다.RiAS-DNA of the present invention may include any sequence having an antisense effect, such as cdk4, a cell cycle regulator of the G1 / S phase, or the like, causing cancer, immune diseases, metabolic diseases and infectious diseases due to overexpression of genes, and Antisense effects can be expected for any gene that is expected to be involved in progression. The target gene for which antisense effect is expected is not limited to the cdk4 gene, but may be any gene that is involved in overexpression and is involved in the induction and progression of cancer, immune disease, metabolic disease and infectious disease due to overexpression of the gene.
실시예 5. AS-올리고의 안정성 조사Example 5. Investigation of stability of AS-oligo
AS-올리고가 목적 유전자 서열에 특이적으로 결합하고 뉴클레아제에 대해 안정한 것이 안티센스 효과에 중요하므로, CMAS-올리고 및 RiAS-올리고의 뉴클레아제에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 혈청 및 엑소뉴클레아제 Ⅲ 를 처리하였다. 우선 세포 배양에 사용되는 소혈청으로 가열 처리 (heat-inactivation)하지 않은 FBS (fetal bovine serum)를 사용하여 20% 혈청 농도로 AS-올리고와 37℃에서 4시간과 16시간 동안 각각 반응시킨 다음 페놀 / 클로로포름으로 추출하여 15% 변성 (denaturing) 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (PAGE)으로 분석하였다. 또한, 선상 및 폐쇄형 AS-올리고에 직접 엑소뉴클레아제 Ⅲ (Dakara, Japan) 160 U/1 ㎍ 를 처리하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음 상기와 같은 과정으로 추출하여 분석하였다.Since AS-oligo specifically binds to the desired gene sequence and is stable against nucleases, it is important for antisense effects, so to investigate the stability of CMAS-oligo and RiAS-oligo to nucleases, serum and exonuclease The third III was processed. First, reacted with AS-ol at 20% serum concentration using FBS (fetal bovine serum) without heat-inactivation with bovine serum used for cell culture, and reacted for 4 hours and 16 hours at 37 ° C, respectively. Extracted with chloroform and analyzed by 15% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Also, 160 U / 1 μg of exonuclease III (Dakara, Japan) was directly reacted with linear and closed AS-oligoes at 37 ° C. for 2 hours, and then extracted and analyzed in the same manner.
그 결과, 선상 AS-올리고는 FBS 로 4시간 처리한 경우 70% 이상이 분해되고 16시간 후에는 완전히 분해되었으나, CMAS-올리고는 FBS 로 4시간과 16시간 처리한 경우에도 분해 정도가 경미하였다. 또한, CMAS-올리고는 엑소뉴클레아제 (Exonuclease Ⅲ)를 처리한 경우에도 전혀 분해되지 않고 선상 AS-올리고는 2시간만에 엑소뉴클레아제 Ⅲ 에 의하여 완전히 분해되었다. 또한 RiAS-올리고의 경우도 단순 스템-루프 형태의 AS-올리고는 2시간 내에 완전히 분해되었으나 폐쇄형 RiAS-올리고는 전혀 분해되지 않았다. 따라서 본 발명의 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고는 엑소뉴클레아제에 대해 탁월하게 안정함을 확인하였다(도 5b 참조).As a result, the linear AS-oligo was decomposed more than 70% when treated with FBS for 4 hours and completely decomposed after 16 hours, but the degree of degradation was slight even when CMAS-oligo was treated with FBS for 4 hours and 16 hours. In addition, CMAS-oligo was not degraded at all even when treated with Exonuclease III, and on-board AS-oligo was completely degraded by Exonuclease III in 2 hours. In the case of RiAS-oligo, the AS-oligo in simple stem-loop form was completely decomposed within 2 hours, but the closed RiAS-oligo was not decomposed at all. Therefore, it was confirmed that the CMAS-oligo and RiAS-oligo of the present invention are excellently stable against exonuclease (see FIG. 5B).
실시예 6. AS-올리고를 이용하여 세포 형질감염Example 6. Cell Transfection Using AS-oligo
(6-1) 세포 배양(6-1) Cell Culture
백혈병 세포주인 HL-60 (promyelocytic leukemia cell line)와 K562 (chronic myelogenous leukemia cell line)를 대전, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 분양받아 RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) 배지에 10% FBS (Gibco BRL, USA)와 1% 페니실린 / 스트렙토마이신 (Gibco BRL, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2항온기에서 배양하고, 배양 과정에서 세포 농도를 적정하게 유지시켰다. 형질감염 (transfection) 실험에 사용되는 세포는 모두 실험 전날 (16시간 전) 신선한 배양액으로 교체하여 0.4% 트립판 블루로 생존율 (viability)을 확인하였다.The leukemia cell lines HL-60 (promyelocytic leukemia cell line) and K562 (chronic myelogenous leukemia cell line) were purchased from Daejeon, Korea Institute of Science and Technology, a biotechnology research center gene bank and 10% FBS in RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) medium. (Gibco BRL, USA) and 1% penicillin / streptomycin (Gibco BRL, USA) were added and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, and the cell concentration was maintained appropriately during the culture. Cells used for the transfection experiments were replaced with fresh culture on the day before the experiment (16 hours ago) to confirm viability with 0.4% trypan blue.
(6-2) AS-올리고와 양이온 리포좀의 복합체를 이용한 세포 형질감염(6-2) Cell Transfection Using a Complex of AS-oligos and Cationic Liposomes
AS-올리고를 양이온 리포좀 복합체를 이용하여 세포 내로 형질감염시키기 위하여, 리포펙틴 (LipofectinTM, Gibco BRL, USA), 리포펙타민 (LipofectamineTM, Gibco BRL, USA) 또는 DOSPERTM(Boerhinger Mannheim, 독일)의 양이온 리포좀과 AS-올리고는 혈청과 항생제를 첨가하지 않은 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA) 배지로 희석하여 혼합하고 상온에서 40분간 반응시킴으로 AS-올리고-양이온 리포좀의 복합체를 준비하였다. 다음 실험 전날 신선한 RPMI-1640 배양액으로 교환해 준 세포를 OPTI-MEM 배지로 두 번 세척하고 4 × 105cells/㎖로서 세포 농도를 조정하여 96-웰 플레이트에 50 ㎕씩 분주하였다. 상기 AS-올리고-리포좀 복합체는 2일 (day 0, day 1) 동안 2회 처리하고, 각 웰에 올리고-리포좀 복합체를 20 ㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO2항온기로 6시간 동안 배양한 다음, 10% FBS (Gibco BRL, USA)가 첨가된 OPTI-MEM 배지 50 ㎕ 가하여 다시16시간 더 배양하였다. 다음 각 웰로부터 50㎕씩 상층액을 조심스럽게 제거하고 상기와 같은 과정으로 각각의 웰에 올리고-리포좀 복합체를 재처리하여 6시간 뒤 혈청과 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 OPTI-MEM 배지를 100 ㎕ 가하고 24시간 배양하여 안티센스 효과를 분석하였다.Lipofectin (Lipofectin ™ , Gibco BRL, USA), Lipofectamine ™ (Gibco BRL, USA) or DOSPER ™ (Boerhinger Mannheim, Germany) to transfect AS-oligo into cells using cationic liposome complexes The cationic liposomes and AS-oligo were prepared by diluting with OPTI-MEM (Gibco BRL, USA) medium without serum and antibiotics, mixing and reacting at room temperature for 40 minutes to prepare a complex of AS-oligo-cationic liposomes. On the day before the next experiment, cells exchanged with fresh RPMI-1640 medium were washed twice with OPTI-MEM medium and cell concentration was adjusted to 4 × 10 5 cells / mL and 50 μl was dispensed into 96-well plates. The AS-oligo-liposomal complex was treated twice for 2 days (day 0, day 1), and 20 μl of the oligo-liposomal complex was added to each well and incubated with 37 ° C. and 5% CO 2 incubator for 6 hours. Next, 50 μl of OPTI-MEM medium to which 10% FBS (Gibco BRL, USA) was added was incubated for another 16 hours. Then, 50 μl of each supernatant was carefully removed from each well, and the oligo-liposomal complex was reprocessed in each well in the same manner as above. After 6 hours, 100 μl of OPTI-MEM medium containing serum and penicillin / streptomycin was added. Addition and incubation for 24 hours to analyze antisense effect.
(6-3) CMAS-올리고에 의한 c-myb mRNA 의 특이적 감소 분석(6-3) Specific Reduction Analysis of c-myb mRNA by CMAS-oligo
양이온 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달한 CMAS-올리고의 염기 서열에 특이적인 안티센스 효과를 조사하기 위하여, RNA 를 분리하여 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)과 서던 하이브리디제이션을 수행하였다. 구체적으로 CMAS-올리고 0.3㎍ 을 리포펙틴 2㎍ 과 함께 HL-60 세포에 형질감염시킨 경우 스크램블드 올리고 (scrambled oligo, SC-올리고)와 비교하여 c-myb mRNA 발현이 95% 이상 감소하였고, 60mer인 선상 AS-올리고 1㎍ 을 사용한 경우는 발현이 37% 감소하였다. 이러한 결과는 15-mer와 60-mer 선상 AS-올리고 보다 CMAS-올리고가 적은 양으로도 우수한 안티센스 효과를 나타내는 것을 보여주고 있다.In order to investigate the antisense effect specific to the nucleotide sequence of CMAS-oligo delivered into cells using cationic liposomes, RNA was isolated and reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Southern hybridization were performed. Specifically, when 0.3 μg of CMAS-oligo was transfected into HL-60 cells with 2 μg of lipofectin, c-myb mRNA expression was reduced by 95% or more compared to scrambled oligo (SC-oligo), and 60mer. In the case of using 1 μg of AS-oligo in phosphorus, expression decreased by 37%. These results show that the CMAS-oligo has better antisense effect than the 15-mer and 60-mer linear AS-oligo.
실시예 7. CMAS-올리고에 의한 암 세포 성장 억제 조사Example 7. Investigation of inhibition of cancer cell growth by CMAS-oligo
(7-1) 세포 증식 저해 시험(7-1) Cell Proliferation Inhibition Test
AS-올리고에 의한 세포 증식 저해 정도를 조사하기 위하여, MTT (3-[4,5 -dimethylthiazol -2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) (Sigma, USA) 시약을 사용하였다. HL-60 세포는 혈청이 없는 OPTI-MEM 배지로 두 번 세척하여 96-웰 플레이트에 6×104세포/ml 농도로 조정하여 50 ㎕씩 분주하고, 리포펙틴 (LipofectinTM)은 0.2 ㎍/15 ㎕ 농도로 조제하여 40분간 상온에서 반응시켰다. AS-올리고는 1 ㎍/30 ㎕로 농도를 조정하여 15 ㎕ OPTI-MEM 배지에 2 배수로 희석하고, 미리 조제된 리포펙틴TM용액을 동량 (15 ㎕) 혼합하여 15분간 더 반응시키고 이 과정을 2회에 반복 수행하였다. 1차 처리 5시간 후 2차 처리하고, 2시간 뒤 10% FBS (HyClone, USA)와 항생제가 포함된 OPTI-MEM 배지를 가하여 37℃로 5% CO2항온기에서 5일간 배양하였다. MTT 시약은 인산 완충용액 (PBS)으로 5 mg/ml 농도로 조제하고, 배양액 100 ㎕/웰당 100 ㎍의 MTT 시약을 처리하여 5% CO2항온기에서 37℃로 4시간 배양하였다. 그 후 이소프로판올 (0.1 N HCl)을 배양액과 동량으로 처리하여 한시간 동안 상온에서 반응시키고 잘 섞은 다음 ELISA 리더로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다.In order to investigate the degree of inhibition of cell proliferation by AS-oligo, the reagent MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) (Sigma, USA) was used. HL-60 cells were washed twice with serum-free OPTI-MEM medium, adjusted to a concentration of 6 × 10 4 cells / ml in 96-well plates, and 50 μl were dispensed, and Lipofectin ™ was 0.2 μg / 15. Prepared to the μl concentration and reacted at room temperature for 40 minutes. AS-oligo was adjusted to 1 μg / 30 μl, diluted in multiples of 15 μl OPTI-MEM medium in multiples, and then reacted for 15 minutes by mixing the same amount of the prepared Lipofectin TM solution (15 μl). Repeated times. After 5 hours of primary treatment, the secondary treatment was performed, and after 2 hours, OPTI-MEM medium containing 10% FBS (HyClone, USA) and antibiotics was added thereto, and the cells were incubated at 37 ° C. for 5 days in a 5% CO 2 incubator. MTT reagent was prepared at a concentration of 5 mg / ml in phosphate buffer (PBS), and treated with 100 μg of MTT reagent per 100 μl / well of the culture and incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 4 hours. Thereafter, isopropanol (0.1 N HCl) was treated in the same amount with the culture solution, reacted at room temperature for 1 hour, mixed well, and the absorbance was measured at 570 nm with an ELISA reader.
(7-2) 소프트 아가로스 콜로니 분석 (soft agarose colony assay)(7-2) soft agarose colony assay
세포 형질감염 후 AS-올리고가 세포 성장을 억제하는 정도를 조사하기 위한또 다른 방법으로 소프트 아가로스 상에서 세포의 콜로니 형성 능력을 0.4% LMP 아가로스 (low melting point agarose, Gibco BRL, USA)를 사용하여 다음과 같이 측정하였다. K562 세포에 각종 AS-올리고를 상기와 같이 형질감염시키고 24시간 배양하여 20% FBS (HyClone, USA)와 항생제가 포함된 2× RPMI 1640 배양액에 200개의 세포가 포함되도록 하고 0.8% LMP 아가로스를 1 : 1 로 혼합하여 96-웰 플레이트에 분주 도포하였다. 0.4% LMP 아가로스와 세포가 혼합 분주된 96-웰 플레이트는 4℃에서 5분간 나두어 고형화하고, 37℃ CO2항온기에서 15일간 배양한 다음 20개 이상의 세포로 구성된 콜로니의 수를 계산하였다.Another method for investigating the extent of AS-oligo inhibition of cell growth after cell transfection was to use 0.4% LMP agarose (low melting point agarose, Gibco BRL, USA) to determine the colony forming ability of cells on soft agarose. It was measured as follows. Various AS-oligois were transfected into K562 cells as described above, and cultured for 24 hours to include 200 cells in a 2 × RPMI 1640 culture solution containing 20% FBS (HyClone, USA) and antibiotics, and 0.8% LMP agarose. 1: 1 was mixed and dispensed in 96-well plates. A 96-well plate mixed with 0.4% LMP agarose and cells was allowed to solidify for 5 minutes at 4 ° C, incubated for 15 days in a 37 ° C CO 2 incubator, and the number of colonies consisting of 20 or more cells was calculated.
(7-3) 결과(7-3) Results
c-myb 유전자는 세포 성장과 관련이 있어 c-myb 에 대한 AS-올리고를 HL-60 세포에 처리하여 세포 성장을 억제하는 정도를 조사하였다. 세포 성장 억제는 트립판 블루 염색으로 세포 수를 직접 측정하거나 MTT 발색 시약을 이용하여 흡광도를 측정하거나 소프트 아가로스에서 콜로니 형성을 조사함으로 확인되었다. CMAS-올리고를 포함한 각종 올리고는 0.03 ㎍ ∼ 1 ㎍ 농도로 HL-60 세포에 형질감염시키고, 5일째에 MTT 시약을 가하였다. CMAS-올리고를 HL-60 에 1번 또는 2번 처리하는 경우 농도의 증가에 따라 점진적으로 세포 수가 감소하고, 2번 처리하는 경우는 1번 처리한 것보다 세포 성장이 2배 정도 더 감소되었다. 또한 CMAS-올리고는 매우 낮은 농도 (0.12 ㎍)에서도 강력한 안티센스 효과를 나타내고, 선상 60-mer AS-올리고와 선상 센스 올리고는 리포펙틴 또는 아무것도 처리되지 않은 대조군과 비교하여 거의 변화가 없었다. 그 결과 표 2에서 보는 바와 같이, CMAS-올리고가 암 세포의 성장을 효과적으로 그리고 농도 의존적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.The c-myb gene is related to cell growth, and the degree of inhibition of cell growth was investigated by treating AS-oligo against c-myb to HL-60 cells. Cell growth inhibition was confirmed by measuring cell number directly with trypan blue staining, absorbance using MTT chromogenic reagents or by examining colony formation in soft agarose. Various oligos, including CMAS-oligo, were transfected into HL-60 cells at a concentration of 0.03 μg to 1 μg, and MTT reagent was added on day 5. When CMAS-oligo was treated with HL-60 once or twice, the cell number gradually decreased with increasing concentration, and when treated twice, cell growth was reduced by twice as much as that of once treatment. CMAS-oligo also showed a strong antisense effect at very low concentrations (0.12 μg), and the linear 60-mer AS-oligo and linear sense oligos showed little change compared to the control group treated with lipofectin or none. As a result, as shown in Table 2, it can be seen that CMAS-oligo effectively and cancer-dependently inhibit the growth of cancer cells.
또한, 소프트 아가로스에서 콜로니 형성이 왕성한 세포주인 K562 세포에 CMAS-올리고를 처리한 경우 K562 세포는 93% 이상 콜로니 형성이 감소되었고, 선상 60-mer인 AS-올리고를 처리한 경우는 77% 정도 콜로니 숫자가 감소되었으나, 대조군인 센스 올리고 및 SC-올리고는 각각 11% 와 32% 로 콜로니 수를 감소시켰다.In addition, when CMAS-oligo was treated to K562 cells, a cell line with strong colony formation in soft agarose, K562 cells had reduced colony formation by more than 93% and 77% when treated with 60-mer AS-oligo. The colony numbers were reduced, but the control sense oligos and SC-oligoes reduced the colony counts by 11% and 32%, respectively.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 CMAS-올리고는 뉴클레아제에 매우 안정하고 소량으로도 안티센스 효과가 탁월하여 유전자의 과잉 발현으로 유발되는 질환에 대한 분자 약제로서 유용하게 이용될 수 있다. 또한, RiAS-올리고는 라이게이션시 시발체가 필요하지 않고 다이머로만 구성되어 다중체 (multimer)가 혼재하지 않아 뉴클레아제에 안정한 AS-올리고로서 유용하다. 실제로 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고는 기존의 것보다 20배 이상의 적은 양에서도 안티센스 효과를 탁월하게 나타낸다. 따라서, 본 발명의 AS-올리고 및 안티센스 DNA 는 암을 포함하여 유전자의 이상 발현으로 유발되는 면역질환, 감염 질환, 대사 질환 및 유전성 질환 등의 치료에 널리 사용될 수 있다.As described above, the CMAS-oligo of the present invention is very stable to nucleases and excellent antisense effect in a small amount can be usefully used as a molecular drug for diseases caused by overexpression of genes. In addition, RiAS-oligo is useful as an AS-oligoid that is stable to nucleases because it does not require a primer at the time of ligation and is composed of only dimers, so that multimers are not mixed. Indeed, CMAS-oligo and RiAS-oligo exhibit excellent antisense effects even in amounts 20 times smaller than conventional ones. Therefore, the AS-oligos and antisense DNAs of the present invention can be widely used for the treatment of immune diseases, infectious diseases, metabolic diseases and hereditary diseases caused by abnormal expression of genes including cancer.
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