본 발명은 감착즙액에 알콜발효균주Saccharomyces kluyveriDJ97(기탁번호 KCTC 8842P)를 접종하여 주모를 준비하는 단계; 알콜발효 조건으로 초기당도, 교반속도 및 발효시간에 따라 중심합성계획을 수립하고 반응표면 분석을 실시하여 최적의 알콜발효 조건을 확립하는 단계; 상기 확립한 최적의 알콜발효 조건에 따라 파쇄한 감과실에 주모를 접종하고 알콜발효를 행한 후 여과 및 감압증류하고 숙성시켜 알콜성분 20 ~ 45%의 본 발명 감과실 증류주를 제조하는 단계; 상기 본 발명 감과실 증류주 제조시 알콜발효 과정중 pH는 pH 메터를 사용하여 측정하고 총산은 NaOH로 중화적정하여 측정하는 단계; 본 발명 감과실 증류주 제조시 알콜발효 과정중 환원당을 DNS 법으로 측정하고 총당은 감과실 증류주에 증류수, HCl을 첨가하고 열탕처리하여 가수분해한 후 NaOH로 중화하고 250mL로 정용한 후 DNS법으로 측정하는 단계; 본 발명 감과실 증류주 제조시 알콜발효 과정중 알콜발효액내 유지성분을 제거한 후 색소 및 단백질 성분도 제거한 다음 유리당을 분석하는 단계; 본 발명 감과실 증류주 제조시 알콜발효 과정 중 알콜발효액에 n-아밀알콜(n-amylalcohol)을 가한 다음 가스 크로마토그라피하여 알콜성분을 분석하는 단계 및; 본 발명 감과실 증류주 제조시 알콜발효가 완료된 발효액을 연속증류 추출한 후 GC 및 GC-MS로 휘발성분을 분석하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 감은 1997년 11월 경북 청도군 일대에서 생산된 떫은감을 탄산가스 농도 80%이상, 30℃에서 탈삽 후 사용하였다.
본 발명에서 알콜발효 균주는 감에서 분리 동정한Saccharomyces kluyveriDJ97(기탁번호 KCTC 8842P)을 YPD(yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%, agar 2%) 사면배지에서 25℃, 24시간 배양하여 4℃ 냉장 보관하면서 각각 사용하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 감과실 증류주 제조
제 1 공정: 주모준비
떫은감을 파쇄하여 착즙한 후 당농도를 10%로 희석하여 15lb로 15분간 살균한 다음Saccharomyces kluyveriDJ97를 접종하고 25℃, 150rpm으로 38시간 배양하여 주모를 제조하였다.
제 2 공정: 반응표면분석에 의한 알콜발효 조건 확립
감을 세척 선별하여 파쇄한 300g의 시료를 이용하여 알콜발효 조건을 중심합성실험계획에 따라 실시하였으며 반응표면분석을 위해서 SAS(statistical analysis system) program을 이용하였다. 알콜발효 조건은 초기당도(X1), 교반속도(X2) 및 발효시간(X3)이었으며, 3개의 알콜발효조건이 5수준(-2, -1, 0, 1, 2)으로 부호화하여 중심합성계획을 수립하였으며 16개의 설정된 조건으로 실험을 행하였고 알콜발효의 품질특성에 관련된 반응변수(Yn)로는 알콜함량(Y1) 및 총산(Y2)으로 하였다. 실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 중심합성계획에 의해 설계된 실험조건에서 알콜발효 과정의 알콜함량에 대한 반응표면은 도 1에 나타내었다. 알콜발효에 있어서 세 가지 요인변수인 원료감의 초기당도(9∼21。Brix), 교반속도(0∼200 rpm) 및 발효시간(48 ~ 144 hr)에 따른 알콜함량에 대한 반응표면회귀식은 하기와 같았다.
회귀식의 R2는 0.9386으로 유의성이 0.0053으로 1% 이내의 유의수준에서 인정되었다. 알콜함량에 대한 발효조건의 영향은 원료감 당도의 영향을 주로 받고 있었으며, 교반속도와 발효시간은 크게 영향을 미치지 않았다. 발효과정에서 알콜함량의 변화는 원료감의 당도가 높아짐에 따라 비례하여 증가하였다.
알콜발효 중 산패의 기준이 되는 총산 변화에 대한 반응표면은 도 2에 나타내었으며, 발효조건에 따른 총산 변화에 대한 반응표면회귀식은 하기와 같았다.
총산에 대한 회귀식의 R2는 0.6473으로 유의성이 인정되지 않았다. 알콜발효 중 총산의 변화는 교반속도와 원료감 당도의 영향을 주로 받고 있었으며 발효시간의 영향은 거의 없었다. 총산은 교반속도가 50 rpm 이하에서는 거의 변화가 없었으나 교반속도 50 rpm 이상에서는 교반속도가 증가하고 원료감의 당도가 높을수록 증가하는 경향이었다. 알콜함량이 가장 높은 조건에서 총산도 가장 높게 나타났다.
감과실을 이용하여 알콜함량 및 총산변화에 준하여 각각의 최적조건을 구하고자 능선분석을 행하여 본 결과는 표 2에 나타낸 바와 같으며 알콜함량에 대한 최대치는 원료감의 당도 20.51。Brix, 교반속도 139.52 rpm 및 발효시간 94.88 hr로 나타났으며, 총산에 대한 최소치는 원료감의 당도 16.19。Brix, 교반속도 2.00 rpm 및 발효시간 95.53 hr로 나타났다.
이상의 결과로 알콜함량이 높고 산패의 위험이 적은 조건 즉, 원료감의 당도 20。Brix 이상, 교반속도 50 rpm 이하 및 발효시간 80 hr 이상이 가장 적당한 알콜발효조건임을 알 수 있었다. 그러나 일반적인 감과실의 당도가 14。Brix 정도임을 감안하여 제한조건으로 원료감의 당도를 14。Brix로 설정한 후 알콜함량 및 총산을 모니터링하여 본 결과는 도 3과 도 4에 나타내었다. 제한조건에서 알콜함량은 발효시간의 영향은 거의 받지 않았고 주로 교반속도에 의해 크게 영향을 받았으며, 낮은 교반속도에서 알콜함량이 높았다. 그러나 원료감의 당도를 14。Brix로 제한한 후 알콜발효에서는 총산의 변화는 교반속도의 영향을 주로 받았으며, 100 rpm까지는 교반속도가 높을수록 증가하였으나 그 이상에서는 교반속도가 높을수록 감소하였다. 따라서 알콜발효 수율이 높고 총산이 낮은 최적 알콜발효조건을 설정하고자 제한조건(원료감의 당도 14。Brix)에서 형성된 알콜함량 및 총산에 대한 등고선도를 겹쳐서 최적조건을 설정하였을 때 빗금친 부분과 같이 교반속도가 50 rpm 이하, 발효시간이 90 hr 이상으로 나타났다(도 5). 이와 같은 예측결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적조건 범위내의 임의의 조건(발효시간 120 hr 및 교반속도 40 rpm)으로 알콜발효를 수행하여 알콜함량과 총산을 측정하여 본 결과 예측된 알콜함량(7.14%) 및 총산(0.62)은 최적조건에서 실제 발효를 행한 결과(알콜함량 7.10%, 총산 0.60)와 유사하였다.
발효시간, 교반속도, 초기당도의 차이에 따른 감과실 알콜발효 후 알콜함량과 총산의 양
실험번호 |
발효조건 |
물리화학적 성질 |
당 농도(。Brix) |
교반속도(rpm) |
발효시간(hr) |
알콜함량(%) |
총산 |
1 |
12(-1) |
50(-1) |
72(-1) |
5.8 |
0.42 |
2 |
12(-1) |
50(-1) |
120(1) |
6.5 |
0.47 |
3 |
12(-1) |
150(1) |
72(-1) |
5.5 |
0.42 |
4 |
12(-1) |
150(1) |
120(1) |
5.5 |
0.55 |
5 |
18(1) |
150(-1) |
72(-1) |
7.4 |
0.50 |
6 |
18(1) |
150(-1) |
120(1) |
7.9 |
0.58 |
7 |
18(1) |
150(1) |
72(-1) |
7.7 |
1.14 |
8 |
18(1) |
150(1) |
120(1) |
8.0 |
1.19 |
9 |
15(0) |
100(0) |
96(0) |
7.0 |
1.15 |
10 |
15(0) |
100(0) |
96(0) |
7.0 |
1.20 |
11 |
21(2) |
100(0) |
96(0) |
9.4 |
1.35 |
12 |
9(-2) |
100(0) |
96(0) |
3.2 |
0.94 |
13 |
15(0) |
200(2) |
96(0) |
6.9 |
0.60 |
14 |
15(0) |
0(-2) |
96(0) |
7.4 |
0.59 |
15 |
15(0) |
100(0) |
144(2) |
6.7 |
1.05 |
16 |
15(0) |
100(0) |
48(-2) |
7.1 |
1.04 |
알콜함량과 총산에 기준하여 최적의 감과실 알콜발효 조건을 능선분석한 결과
발효조건 |
알콜함량 |
총산 |
최대 |
최소 |
최대 |
최소 |
당농도(。Brix) |
20.51 |
9.17 |
20.46 |
16.19 |
교반속도(rpm) |
139.52 |
123.81 |
141.47 |
2.00 |
발효시간(hr) |
94.88 |
96.81 |
97.75 |
95.53 |
예측값 |
8.93 |
3.63 |
1.44 |
0.23 |
형태학적 특성 |
S.P1) |
S.P |
[주] 1) 안장점 |
제 3 공정: 알콜발효에 의한 감과실 증류주 제조
본 공정에서는 상기 제 2 공정에서 반응표면분석으로 수립한 최적의 알콜발효 조건으로 감과실의 알콜발효를 행한후 착즙하여 슬러리(slurry)는 제거하고 여액을 상법의 감압증류로 증류하였다. 즉, 감과실 10kg 파쇄하여 주모 500mL를 가하여 30℃에서 40 rpm으로 알콜발효하면서 품질을 분석하였으며 여과 후 여과한 액을 감압증류기에 넣고 60 ~ 70℃로 알콜성분 20 ~ 45% 까지 증류한 후 증류액을 15℃ 이하에서 3개월 이상 숙성시켜 감과실 증류주를 제조하였다.
실험예 1: 감과실 알콜발효시 pH 및 총산 변화
상기 실시예 1에서 수립한 최적 알콜발효 조건에 따라 실시예 1과 동일한 방법으로 감과실 증류주를 제조하면서 알콜발효 과정중 발효액내 pH는 pH meter를 사용하여 측정하였으며, 총산은 0.1N NaOH 용액으로 중화적정하여 초산으로 환산하였다. 실험결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 pH는 초기에 5.65였으나, 발효기간이 경과함에 따라 점차 감소하여 발효 5일 후에는 4.27로 낮아 졌다. 총산은 초기에 0.15%였으나, 발효기간이 경과함에 따라 조금씩 증가하여 발효 5일후에는 0.29로 나타나서 산패현상은 나타나지 않았다.
실험예 2: 감과실 알콜발효시 환원당 및 총당의 변화
상기 실험예 1 동일한 감과실 증류주를 제조하면서 알콜발효 과정중 발효액내 함유된 환원당을 DNS법으로 측정하여 글루코스(glucose)로 작성한 표준곡선과 비교하여 그 함량을 표시하였다. 총당은 시료 20mL를 취하여 증류수 180mL를 넣고 25% HCl 20mL를 가한 다음 끓는 수욕상에서 3시간 동안 가수분해한 후 이 가수분해액을 10% NaOH 용액으로 중화하고 250mL로 정용한 다음 환원당과 동일한 방법으로 정량하였다. 실험결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 알콜발효중 감과실의 환원당 및 총당은 초기에 각각 125.4와 132.0㎎/mL였으나, 발효기간이 경과됨에 따라 크게 감소하여 발효 5일째에는 각각 4.1 및 4.2㎎/mL로 나타났다. 이 결과는 。Brix의 변화와도 일치하는 경향이었다.
감과실 알콜발효액내 총당 및 환원당의 함량변화
샘플 |
당 |
발효기간(일) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
A.P |
환원당 |
125.4 |
85.6 |
12.0 |
4.4 |
4.2 |
4.1 |
총당 |
132.0 |
87.5 |
14.7 |
4.8 |
4.5 |
4.2 |
[주] A.P: 감과실 알콜발효액단위: mg/mL |
실험예 3: 감과실 알콜발효시 유리당의 함량 변화
실험예 1과 동일한 감과실 증류주를 제조하면서 알콜발효 과정중 발효액내 함유된 유리당분석은 감과실 발효액내 유지성분을 헥산으로 제거하고 0.45㎛ 막 여과기의 여과와 Sep-pak C18로 색소 및 단백질성분을 제거하였다. 유리당 분석조건을 표 4에 정리하였다. 실험결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose) 및 슈크로스(sucrose)가 분석되었으며, 초기에 글루코스, 프럭토스 및 슈크로스의 함량이 각각 5.63, 5.21 및 0.62%로써 글루코스 함량이 가장 많았으며, 슈크로스의 함량은 미량이었으나, 발효 1일 후에는 글루코스 및 프럭토스의 함량이 2.64와 4.30%로 글루코스의 함량이 급격하게 감소하였으며, 슈크로스는 흔적만 남았다. 이후 발효기간이 경과함에 따라 점차 감소하여 발효 5일 후에는 프럭토스만 0.10% 나타났으며, 글루코스와 슈크로스는 흔적만 남았다.
HPLC 조절 조건
항 목 |
조건 |
유리당 |
기계 |
waters HPLC |
컬럼 |
Aminex Carbohydrate |
용매 |
희석수 |
유속 |
0.6mL/min |
속도 |
0.25cm/min |
검출기 |
RI |
주입량 |
5㎕ |
감과실 알콜발효액내 유리당
샘플 |
유리당 |
발효기간(일) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
A.P |
글루코스 |
5.63 |
2.64 |
1.25 |
0.25 |
흔적 |
흔적 |
프럭토스 |
5.21 |
4.30 |
4.30 |
0.90 |
0.15 |
0.10 |
슈크로스 |
0.62 |
흔적 |
흔적 |
흔적 |
흔적 |
흔적 |
[주] A.P: 감과실 알콜발효액단위: % |
실험예 5: 감과실 알콜발효시 알콜 함량의 변화
실험예 1과 동일한 감과실 증류주를 제조하면서 알콜발효 과정중 발효액내 함유된 알콜을 분석하기 위해 알콜발효액 시료 상징액 100mL에 내부 표준물질로n-아밀알콜(n-amylalcohol)을 1mL 가한 다음, 탈이온수 100mL를 가하고 가열증류하여 증류액 20mL을 표 6과 같은 조건으로 가스 크로마토그라피(gas chromatography)로 분석하였다. 실험결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 아세트알데하이드(acetaldehyde)와 6종의 알콜 즉, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 이소-프로필알콜(iso-propylalcohol),n-프로필알콜(n-propylalcohol), 이소-부틸알콜(iso-butylalcohol) 및 이소-아밀알콜(iso-amylalcohol)이 분석되었으며, 이들은 알콜발효 기간이 경과함에 따라 4일째 까지는 모두 증가하는 경향이었으나, 발효기간 5일째에는 에탄올(ethanol)을 제외하고는 거의 미량씩 감소하는 경향이었다.
알콜분석을 위한 가스 크로마토그라피의 조절 조건
항 목 |
조 건 |
GC 기구 |
Hewlett Packard GC 5890 |
컬럼 |
carbowax 20M column |
운반기체 |
He(180℃에서 1.5mL/min) |
컬럼온도 |
40℃(7분간 고정) |
검출기 |
FID |
주입온도 |
200℃ |
검출온도 |
220℃ |
주입량 |
1㎕ |
감과실 알콜발효액내의 알콜 함량
S1) |
피크번호 |
R.T2) |
구성성분 |
발효기간(일) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
A.P4) |
1 |
0.94 |
아세트알데하이드 |
4.6 |
73.8 |
83.6 |
89.2 |
98.3 |
92.1 |
2 |
1.43 |
메탄올 |
48.6 |
621.7 |
486.3 |
236.5 |
139.7 |
136.3 |
3 |
2.20 |
에탄올 |
346.0 |
28433.0 |
41076.0 |
53687.0 |
71420.0 |
75673.0 |
4 |
4.10 |
이소-프로필알콜 |
4.8 |
23.6 |
29.3 |
78.6 |
75.4 |
68.3 |
5 |
6.20 |
n-프로필알콜 |
ND3) |
88.7 |
132.6 |
420.3 |
437.8 |
416.4 |
6 |
7.12 |
이소-부틸알콜 |
0.1 |
0.8 |
5.6 |
16.2 |
14.3 |
13.2 |
7 |
10.02 |
이소-아밀알콜 |
ND |
259.3 |
687.3 |
792.6 |
743.3 |
683.2 |
[주] 1) 샘플, 2) 반응시간, 3) 검출안됨, 4) 감과실 알콜발효액 |
실험예 6: 알콜발효 후 감과실 알콜발효액내 휘발성분 변화
실험예 1과 동일한 방법으로 감과실 증류주를 제조하면서 알콜발효가 완료된 발효액내 함유된 휘발성분을 분석하기 위해 Marse와 Kepner의 방법에 준하여 Likens와 Nikerson이 고안한 연속증류추출(SDE)법으로 추출하여 GC 및 GC-MS로 동정하였다. 즉 100℃로 유지된 시료 플라스크에 시료 50mL, 증류수 250mL 및 내부표준물질로 4-데카놀(4-decanol)(10ppm)을 혼합, 교반하여 넣고, 40℃로 유지된 용매 플라스크에는 에테르를 넣은 후 1시간 동안 휘발성분을 포집한 뒤 농축하여 표 8의 조건으로 분석하였다. 실험결과, 표 9에 나타낸 바와 같이 감의 알콜 발효 후에는 8종류의 휘발성분이 검출되었다.
휘발성분 분석을 위한 GC 및 GC-MS의 조절 조건
항 목 |
조 건 |
GC 기구 |
hewlett packard GC 5890 |
GC-MS 기구 |
Shimadzu GC-MS QP 1000 |
컬럼 |
FFAP 모세관 컬럼 |
검출기 |
FID |
주입온도 |
250℃ |
검출온도 |
250℃ |
컬럼오븐온도 |
70 ~ 230℃(2℃/min.)-20분 고정 |
운반기체 |
He |
plit 비율 |
100:1 |
감과실 알콜발효액내 휘발성분
피크번호 |
구성성분 |
R.T1) |
A.P |
증류주2) |
1 |
아세톤 |
6.528 |
12.80 |
2 |
에틸알콜 |
6.805 |
25305.64 |
3 |
아세트알데하이드 |
8.184 |
44.45 |
4 |
에틸 아세테이트 |
10.330 |
184.43 |
5 |
2-하이드록시-2-부타논 |
12.412 |
ND3) |
6 |
아세트산 |
15.820 |
ND |
7 |
4-데카놀 |
19.475 |
10.00 |
8 |
3-메틸-부탄산 |
21.998 |
ND |
9 |
2-페닐에틸-에스테르 아세트산 |
26.793 |
6.12 |
10 |
벤젠에탄올 |
27.601 |
26.99 |
[주] 1) 용출시간2) 알콜발효가 끝난 알콜발효액3) 검출안됨 |