KR20000021490A - 독감 바이러스에 대한 디엔에이 백신 - Google Patents

독감 바이러스에 대한 디엔에이 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 독감 바이러스에 대해 면역 효과 및 교차방어 효과가 우수한 DNA 백신에 관한 것으로, 독감 바이러스의 적혈구응집소(hemagglutinin, HA) 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 독감 바이러스의 핵단백질(nucleoprotein, NP) 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 및 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6) 유전자의 발현 플라스미드 DNA를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

독감 바이러스에 대한 디엔에이 백신
본 발명은 독감 바이러스에 대해 면역 효과 및 교차방어 효과가 우수한 DNA 백신에 관한 것이다.
독감 바이러스는 매년 전세계적으로 발생하여 호흡기 질환을 일으키는데, 이 질환은 면역 능력이 약한 어린이와 노인들에 대해 치사율이 높고, 합병증으로 폐렴(pneumonia), 심폐질환(cardiopulmonary disease) 등의 기관지 질환들을 수반하는 경우 치사율이 더욱 높아져 국민 보건에 미치는 영향이 크다고 할 수 있다.
특히 1918년에 약 2,000 만명의 사망자를 낸 스페인 독감 바이러스와 같이, 10 내지 20년 주기로 전세계적으로 출현하는(pandemic) 독감 바이러스는 매우 치명적인데, 60년대의 홍콩 독감 바이러스 이후 이러한 독감 바이러스가 발생하지 않았다는 점을 고려하면, 가까운 미래에 치명적인 독감 바이러스의 출현이 예상되고 있다.
이러한 독감 바이러스의 예방을 위해, 세계 보건 기구(WHO)는 통계를 토대로 1 년후에 발생가능한 독감 바이러스를 세 유형별로 미리 선정하여 고시함으로써 3가 백신이 보급되도록 하고 있다.
현재까지 개발되어온 독감 바이러스 백신은 크게 사백신(killed vaccine), 약독화된 생백신(attenuated vaccine) 및 DNA 백신으로 구분된다.
사백신으로는 1941년에 불활성화된 독감 바이러스 입자 전체가 사용된 이래, 최근에는 표면 항원만이 사용되기도 한다. 그러나 사백신은 불활성화 과정중에 표면항원이 변성됨으로 인해 면역성이 저하되는 단점이 있다. 또한, 사백신은 항원이 외인성 항원 표현경로(exogenous Ag presentation pathway)만을 통해 표현될 뿐 세포질 경로(cytosolic pathway)로 표현되지 않으므로, 감염 초기에 바이러스 중화(viral neutralization)를 담당하는 항체 반응(antibody response)을 유도하지만, 급성기(acute phase)에 감염 세포의 제거(infected cell clearance)를 담당하는 세포성 면역 반응(cell-mediated immune response)을 유도하지 못하여 급성기에 감염 세포의 제거를 효과적으로 수행하지 못한다는 단점이 있다. 따라서 사백신은 독감 바이러스에 대한 백신으로는 불충분하다.
약독화된 생백신은 방어면역을 유발하지만 독성이 약화된 바이러스로, 독감 바이러스를 부적당한 조건하에 배양하여 얻어지며, 사백신의 단점을 극복하고 있어 차세대 백신으로 주목받고 있다.
이러한 장점에도 불구하고, 독감 바이러스의 다양성과 급격한 변이, 40 내지 50%에 불과한 세계 보건 기구의 낮은 예고 적중률로 인해, 약독화된 생백신의 사용에는 제한이 있다. 따라서 약독화된 생백신은 독감 바이러스 균주간의 다양성을 극복할 수 있도록 교차 방어(cross-protection) 효과가 보완되어야 한다.
교차 방어력을 갖는 생백신으로, 생백신 균주의 기본골격(backbone) 유전자를 예고된 균주의 표면항원 유전자와 재조합(reassortment)한 바이러스가 개발되었다. 이 바이러스에서는 생백신 균주 자신의 표면항원이 예고된 균주의 표면항원으로 치환되어 있어 목적하는 항체를 형성할 수 있다. 그러나 이 치환과정은 고도의 기술과 많은 시간을 요할 뿐 아니라, 경우에 따라 생백신 균주 표면항원의 호환성 때문에 최적의 재조합 바이러스를 얻지 못할 가능성도 있는데, 예를 들면 재조합하고자 하는 표면 항원 유전자가 독감 바이러스의 복제과정에 특정역할을 담당하면서 생백신 균주의 다른 유전자와의 상호 연락이 맞지 않는 경우에는 바이러스 복제의 어려움으로 인해 재조합 바이러스를 얻지 못한다.
한편, DNA 백신은 항원 유전자의 발현 플라스미드 DNA로, 인체에 투여될 경우 발현된 단백질이 항원으로 작용하게 된다. 즉, DNA 백신이 인체에 투여되면, 숙주 세포에 유입된 DNA로부터 항원이 생산되며, 이 항원은 세포질 경로 뿐 아니라 외인성 항원 표현 경로를 통해 표현되므로 생백신과 유사한 면역 유도 능력을 갖게 된다. 또한 DNA 백신은 생백신에서와 같은 별도의 재조합 과정이 필요하지 않으므로 세계 보건 기구의 예고 후 단시간 내에 제조할 수 있다는 장점이 있다.
DNA 백신이 독감 바이러스에 대해 면역 반응을 유도하며 이 바이러스 내부항원 NP 유전자는 다른 균주의 감염을 교차방어한다는 보고(Ulmer, J.B., Science, 259, 1745(1993))와 독감 바이러스 표면항원 HA 유전자가 방어 면역을 형성한다는 보고(Fynan, E.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 11478(1993))가 있다.
본 발명의 목적은 독감 바이러스에 대해 면역 효과 및 교차방어 효과가 우수한 DNA 백신을 제공하는 데 있다.
도 1은 벡터 pCI-neo의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 DNA 백신을 생쥐에 근육 주사투여한 후 시간 경과에 따른 총 IgG 양을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 DNA 백신을 생쥐에 근육 주사투여한 후 시간 경과에 따른 IgG1 및 IgG2a 양을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 DNA 백신으로 면역화된 생쥐의 지라 세포를 이용하여 CTL(cytotoxic T lymphocyte, 세포독성T림프구) 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 DNA 백신으로 면역화된 생쥐에 맹독성 독감 바이러스를 감염시킨 후 생존률을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 독감 바이러스의 적혈구응집소(hemagglutinin, HA) 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 독감 바이러스의 핵단백질(nucleoprotein, NP) 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 및 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6) 유전자의 발현 플라스미드 DNA를 포함하는, 독감 바이러스에 대한 DNA 백신을 제공한다.
상기 HA 유전자, NP 유전자 및 IL-6 유전자는 공지된 유전자로 통상적인 방법으로 얻을 수 있는데, 예를 들면 HA 유전자와 NP 유전자는 독감 바이러스의 RNA로부터 적절한 프라이머를 사용하여 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행함으로써 쉽게 얻을 수 있다.
이 유전자들을, 포유동물에서 과발현되는 적절한 발현벡터인 pCI-neo(Promega)에 삽입하여 각 유전자의 발현 플라스미드를 얻을 수 있다.
본 발명의 백신에서 HA 유전자의 발현 플라스미드 DNA, NP 유전자의 발현 플라스미드 DNA 및 IL-6 유전자의 발현 플라스미드 DNA가 중량비 4:4:1 내지 1:1:1, 바람직하게는 2:2:1로 포함될 수 있다.
본 발명의 백신은 근육 주사투여될 수 있으며, 이때 HA 유전자의 발현 플라스미드, NP 유전자의 발현 플라스미드 및 IL-6 유전자의 발현 플라스미드 DNA는 총 600㎍ 내지 2㎎의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신으로부터 발현되는 HA는 목적하는 독감 바이러스에 대한 방어 면역을 유도하고, NP는 다양한 독감 바이러스에 대해 작용하는 교차방어를 유도한다. 또한 IL-6은 면역 조절 단백질로서 독감 바이러스에 대한 DNA 백신의 효능(면역체계 형성)을 증가시키는 작용을 하며, 이러한 작용은 다른 면역 조절 단백질인 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF), IL-12 또는 IL-4에서는 매우 미미하다. 특히 본 발명의 HA, NP 및 IL-6은 동시에 작용함으로써 각각을 단독으로 사용하는 경우보다 면역 및 교차방어에 대해 상승 작용을 가진다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
참조예: HA, NP 유전자 및 면역 조절 단백질의 클로닝 및 발현의 확인
(1) HA 유전자의 클로닝
개의 신장으로부터 유래된 세포 MDCK(ATCC Cat.# CCL-34)의 단일 세포층에 독감 바이러스 A/WSN/33(위스콘신 대학의 Yoshi Kawaoka 박사로부터 얻음)을 5 m.o.i.(multiplicity of infection, 감염다중도)로 감염시킨 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 배양액을 1,000xg에서 10분동안 원심분리하여 세포 분획을 얻고, 퀴아진(Qiagene)사의 RNeasy 키트를 사용하여 총 RNA를 분리한 후, 260㎚에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.
RNA 2㎍에 대해 하기 서열 1과 2의 프라이머를 사용하여 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하였다.
5'-CCCTCTAGAATGAAGGCAAAACTACTG-3'
5'-CCCCCCGGGTCAGATGCATATTCTGCA-3'
증폭된 HA 유전자 절편을 벡터 pCI-neo(Premega, 도 1)의 XbaI/SmaI 위치에 삽입하였으며, 이 벡터를 pCIN HA로 명명하였다.
(2) NP 유전자의 클로닝
독감 바이러스 A/WSN/33 대신에 A/PR/8/34(영국 옥스포드 대학의 George G. Brownlee 박사로부터 얻음)를, 서열 1과 2의 프라이머 대신에 서열 3과 4의 프라이머를 사용한다는 점을 제외하고는 (1)에서와 동일한 방법으로 RT-PCR을 실시하고, 얻어진 NP 유전자를 벡터 pCI-neo의 XhoI/XbaI 위치에 클로닝하였으며, 이 벡터를 pCIN NP로 명명하였다.
5'-CCCCTCGAGAAAATCATGGCGTCTCAA-3'
5'-CCCTCTAGATTAATTATCGTATTCCTC-3'
(3) GMCSF의 클로닝
GMCSF cDNA(한국원자력병원 정희용 박사로부터 얻음)를 벡터 pCI-neo의 XbaI/SmaI 위치에 클로닝하였으며, 이 벡터를 pCIN GM으로 명명하였다.
(4) 생쥐 IL-12의 클로닝
생쥐 IL-12 cDNA(서울대학교 김 선영 교수로부터 얻음)를 벡터 pCI-neo의 XhoI/NotI 위치에 클로닝하였으며, 이 벡터를 pCIN IL12로 명명하였다.
(5) IL-4의 클로닝
IL-4 cDNA(한국원자력병원 정희용 박사로부터 얻음)를 벡터 pCI-neo의 EcoRI/SalI 위치에 클로닝하였으며, 이 벡터를 pCIN IL4로 명명하였다.
(6) IL-6의 클로닝
IL-6 cDNA(일본 오사카 대학의 Kishimoto 박사로부터 얻음)를 벡터 pCI-neo의 XbaI/SmaI 위치에 클로닝하였으며, 이 벡터를 pCIN IL6으로 명명하였다.
벡터 pCIN HA, pCIN NP, pCIN GMCSF, pCIN IL12, pCIN IL4 및 pCIN IL6를 칼슘 포스페이트 방법(Sambrook, J. et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.)에 따라 각각 CHO 세포 또는 COS-7 세포에 형질감염시켜 발현시킨 후 웨스턴 블랏 및 ELISA를 실시한 결과, HA, NP 및 면역조절 유전자 GMCSF, IL-12, IL-4, IL-6의 발현을 확인하였다.
실시예 및 비교예 1 내지 5: DNA 백신의 제조
참조예에서 제조한 플라스미드를 하기 표 1의 조성에 따라 실시예 및 비교예 1 내지 5의 DNA 백신을 제조하였으며, 생리식염수에 녹여 면역화에 사용하였다.
DNA실험구 pCIN HA (㎍) pCIN NP (㎍) pCIN GM (㎍) pCIN IL12 (㎍) pCIN IL4 (㎍) pCIN IL6 (㎍) pCIN-neo (㎍)
비교예 1 - - 40 40 40 40 40
비교예 2 80 80 - - - - 40
비교예 3 80 80 40 - - - -
비교예 4 80 80 - 40 - - -
비교예 5 80 80 - - 40 - -
실시예 80 80 - - - 40 -
시험예 1: 면역화 및 항체 생성 정도
실시예 및 비교예 1 내지 5에서 제조된 DNA 백신에 의한 면역화 실험을 생후 6주된 Balb/c 암컷 생쥐(B & K, 미국) 10 마리씩을 사용하여 다음과 같이 실시하였다.
즉, DNA 백신이 근육세포에 유입되는 효율을 높이기 위해 생쥐의 뒷다리 대퇴부 근육에 0.25% 부피바칸(bupivacane) 용액 100 ㎕를 주사투여하고, 3일 후에 동일한 근육에 DNA 백신 200㎍을 주사투여하였다. 백신 투여후 4, 7, 12, 16 또는 20주가 경과한 때에 채혈한 후, ELISA 법에 따라 혈액중의 총 IgG 양을 측정하고 종말점 역가측정법(end-point titration)에 따라 역가를 결정하였다.
그 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 보듯이, 비교예 1의 백신 투여군은 총 IgG 양이 거의 증가하지 않은데 반하여 비교예 2 내지 5 및 실시예의 백신 투여군에서는 IgG 생성량이 증가하였으며, 비교예 5와 실시예의 DNA 백신 투여군은 동일한 수준의 IgG 생성량을 나타내었다. 특히, 백신 투여후 4 내지 7주 동안에는 비교예 2 내지 5 및 실시예의 백신 투여군간에 IgG 생성량이 차이가 있으나, 12주 이후에는 IgG 생성량이 모두 동일하였다. 예외로 비교예 3의 백신 투여군에서는 20주까지도 IgG 생성량이 증가하였다.
시험예 2: IgG의 아이소타입(Isotype)별 분포 조사
실시예 및 비교예 1 내지 5에서 제조된 DNA 백신이 유도하는 면역반응의 특성을 확인하기 위하여, 총 IgG의 아이소타입별 분포를 다음과 같이 조사하였다.
시험예 1에서와 동일한 방법으로 Balb/c 암컷 생쥐에 실시예 및 비교예 1 내지 5에서 제조된 DNA 백신을 각각 주사투여하여 면역화한 후, 4, 12 또는 20주가 경과한 때에 채혈하고 ELISA 법에 따라 혈액중의 IgG1과 IgG2a 양을 결정하였다.
그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 보듯이, 실시예 및 비교예 1 내지 5의 백신 투여군에서 IgG2a 아이소타입 양이 증가되었으며, 이러한 현상은 일반적인 DNA 백신에서도 나타나는 것이다. 특히 비교예 3의 백신 투여군에서는 백신 투여후 12 및 20주가 경과한 때에 IgG1 및 IgG2a 양이 다른 백신에 비해 증가하였으며 이 점은 시험예 1의 결과와도 일치한다.
이러한 결과는, IgG1이 항체 반응을, IgG2a가 세포성 면역 반응을 수행한다는 보고에 비추어 볼 때, 본 발명의 DNA 백신은 바이러스 중화뿐 아니라 세포성 면역 반응도 유도한다는 것을 알 수 있다.
시험예 3: CTL(cytotoxic T lymphocyte, 세포독성T림프구) 반응 시험
세포성 면역 반응을 다음과 같이 CTL 활성으로 검증하였다.
시험예 1에서와 동일한 방법으로 Balb/c 암컷 생쥐에 실시예 및 비교예 1 내지 5에서 제조된 DNA 백신을 각각 주사투여하여 면역화한 후(각 군당 생쥐 2마리씩), 20주가 경과한 때에 생쥐의 지라를 적출하였다. 지라를 셀렉터(cellector, Bellco사)를 이용하여 파쇄하고 세포를 분리한 후 10% 우태아혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 50μM β-머캅토에탄올을 함유한 RPMI 1640 배지에 접종하였다. 이렇게 얻어진 전구(precursor) CTL 세포를 10μM 펩티드 TYQRTRALV(NP의 147 내지 155번째 아미노산 서열에 해당함; NP147-155펩티드) 및 10U/㎖ mIL-2와 함께 37 ℃에서 7일 동안 배양하여 작동 CTL 세포(effector cytotoxic T cell)로 활성화시켰다.
10μM NP147-155펩티드로 펄스(pulse)되고51CrNa2CrO4로 방사능 표지된 P815(H-2d) 표적 세포 104개를 3배 또는 10배의 활성화된 작동 TCL 세포와 함께 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 접종하여 37℃에서 5시간 동안 배양한 후, 배지로 흘러나온 방사능의 양을 측정함으로써 CTL 활성을 조사하였다. 이때 대조군으로는 2% Triton X-100로만 처리한 경우를 사용하였다.
CTL 활성은 측정된 방사능 수치를 대조군의 경우에 대한 백분율로 환산한 비용균률(specific lysis, %)로 나타내었다
그 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 보듯이, 비교예 2에서 제조된 백신의 경우를 기준으로 볼 때 비교예 3 내지 5 및 실시예에서 제조된 백신들은 의미있는 CTL 반응을 나타내며, 특히 비교예 5 및 실시예에서 제조된 백신의 경우에는 더욱 증가된 반응을 나타낸다. 이 결과로부터 본 발명의 DNA 백신은 세포성 면역 반응을 유도한다는 것을 알 수 있다.
시험예 4: 맹독성 독감 바이러스 감염을 통한 DNA 백신의 효력 조사
생쥐에서 오랫동안 계대배양된 독감 바이러스 A/PR/8/34는 생쥐에 대해 맹독성을 가지며, 이 균주의 LD50은 1,600 pfu이다.
이 바이러스에 면역화된 생쥐에서 면역 조절물질에 의한 방어의 차이를 조사하기 위해, Balb/c 암컷 생쥐에 비교예 1 내지 5 및 실시예에서 제조된 백신 200㎍을 각각 투여하여 면역화시킨 후, 20주가 경과된 때에 생쥐에 2.5% 아버틴 250㎕를 복강주사하여 마취시키고 100 LD50(160,000 pfu)의 맹독성 독감 바이러스 A/PR/8/34를 비강감염시킨 다음, 90일동안 생존률을 조사하였다.
그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 보듯이, 실시예의 백신 투여군은 100%의 생존률을 보였으며, 비교예 2 내지 5의 백신 투여군은 각각 50%, 63% 및 38%의 생존률을 보였다.
이러한 결과로부터, IL-6는 독감 바이러스 DNA 백신의 면역능력을 가장 많이 증가시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 DNA 백신은 항체 반응뿐 아니라 세포성 면역 반응을 유도하므로 사백신보다 면역 효과가 우수할 뿐 아니라 광범위한 독감 바이러스에 대해 우수한 교차방어 효과를 가지며, 더욱 향상된 DNA 백신의 면역화를 유도한다. 특히, 본 발명의 DNA 백신은 HA, NP, IL-6를 혼합하여 사용함으로써 각각을 단독으로 사용한 경우보다 현저하게 높은 면역 효과 및 방어 효과를 가진다.

Claims (2)

  1. 독감 바이러스의 적혈구응집소(HA) 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 독감 바이러스의 핵단백질(NP) 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 및 인터루킨-6(IL-6) 유전자의 발현 플라스미드DNA를 포함하는, 독감 바이러스에 대한 DNA 백신.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 적혈구응집소 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 핵단백질 유전자의 발현 플라스미드 DNA, 및 면역조절 유전자의 발현 플라스미드 DNA가 중량비 4:4:1 내지 1:1:1로 포함된 DNA 백신.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100600988B1 (ko) * 2002-03-13 2006-07-13 주식회사 엘지생명과학 Ｄｎａ 면역화에서 인플루엔자 ｎｐ 유전자 ｄｎａ를 함께투여하여 면역반응을 증가시키는 방법

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KR100600988B1 (ko) * 2002-03-13 2006-07-13 주식회사 엘지생명과학 Ｄｎａ 면역화에서 인플루엔자 ｎｐ 유전자 ｄｎａ를 함께투여하여 면역반응을 증가시키는 방법

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