KR20000016743A - 케모카인 베타-15 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 케모카인 CC 단백질 군의 일원에 관한 것이다. 구체적으로, 분리된 핵산 분자는 케모카인 β-15 단백질을 암호화하는 분자로서 제공된다. 케모카인 β-15 폴리펩티드도 또한 제공된다. 본 발명은 또한 흉선 질환을 검출하기 위한 진단 방법과 골수 세포 증식 및 분화를 조절하는 치료 방법을 제공한다.

Description

케모카인 베타-15

1987년의 IL-8의 발견은 이들이 백혈구를 활성화하는 능력 및 염증 조절제로서의 그 유력한 역할로 인해 케모카인으로 현재 지칭되는 신규한 종류의 작은 사이토카인의 존재를 드러내었다. 클로닝 또는 생화학적 정제 및 아미노산 서열분석에 의해 다수의 상이한 인간 케모카인이 IL-8 이후에 동정되었다. 이들은 모두 특징적인 이황화물 결합을 형성하는 4개의 보존된 시스테인, 짧은 아미노 말단 및 보다 긴 카르복시 말단 서열을 가진다. 두 개의 세부종이 처음 두 개의 시스테인의 배열에 의해 구별되는데, 이들 시스테인은 하나의 아미노산에 의해 분리되거나(CXC 케모카인) 또는 인접하여(CC 케모카인) 있다. 케모카인 cDNA는 통상 20개 내지 25개의 아미노산의 리더 서열의 절단후에 분비되는 길이 92개 내지 99개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화한다. IL-8의 NMR-유래 구조에 기초한 모델은 CXC 및 CC 케모카인이 유사한 방법으로 폴딩된다는 것을 시사한다.

최초의 인간 CC 케모카인은 차등 하이브리드화 클로닝에 의해 동정되어 LD78로 명명되었다(Obaru, K. Fukuda, M., Maeda, S. and Shimada, K. (1986) J. Biochem. (토쿄) 99, 885-894). 밀접 관련된 인간 케모카인 Act-2의 몇가지 cDNA 아이소형태가 나중에 개시되었고(Miller, M.D. and Krangel, M.S. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12, 17-46), 두 개의 유사한 단백질, 즉 대식세포 염증 단백질 1α(MIP-1α) 및 MIP-1β가 지다당류(LPS)-자극된 마우스 대식세포의 세포 배지로부터 정제되었다(Wolpe, S.D., Davatelis, G. Sherry, B. 등(1988) J. Exp. Med. 167, 570-581). 70% 이상의 아미노산 동일성에 근거하여, 쥐 및 인간의 단백질은 상동체로 간주되고, 인간 MIP-1α 및 MIP-1β라는 용어는 통상 LD78 및 Act-2 대신에 사용된다. 특성이 가장 잘 규명된 CC 케모카인은 단구 주화성 단백질 1(MCP-1)인데, 이것은 상이한 공급원으로부터 정제 및 클로닝되었다(Miller, M.D. and Krangel, M.S. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12, 17-46; Yoshimure, T. Robinson, E.A. Takana, S. Appella, E. and Leonardo, E.J. (1989) J. Immunol. 142, 1956-1962; Matsushima, K., Larsen, C.G., DuBois, G.C. and Oppenheim, J.J. (1989) J. Exp. Med. 169, 1485-1490). 기타 CC 케모카인인 I-309(Miller, M.D., Hata, S., De Waal Malafyt, R. and Krangel, M.S. (1989) J. Immunol. 143, 2907-2916), 란테스(Schall, T.J. Jongstra, J., Dyer, B.J. 등 (1988) J. Immunol. 141, 1018-1025) 및 HC14(Chang, H.C., Hsu, F., Freeman, G.J., Griffin, J.D. and Reinherz, E. L. (1989) Int. Immunol. 1, 388-397)가 활성화된 T 세포의 생성물로서 정제 또는 클로닝되었다. MCP-2로 명명된 HC14 역시 골육종 세포 배양으로부터(Van Damme, J. Proost, P., Lenaerts, J-P. and Opdenakker, G. (1992) J. Exp. Med. 176, 59-65), 신규한 CC 케모카인인 MCP-3과 함께 분리되었는데, MCP-3은 이어서 클로닝되고 발현되었다(Minty, A. Chalon, P. Guillemot, J.C. 등 (1993) Eur. Cytokine Netw. 4, 99-100; Opdenakker, G. Froyen, G. Fiten, P., Proost, P. and Van Damme, J. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 535-542). 이들 CC 케모카인은 MCP-1과 29% 내지 71%의 서열 상동성을 가진다(MCP-2 및 MCP-3는 MCP-1과 62% 내지 71%의 동일성을 가짐).

CC 케모카인 세부종의 원형인 MCP-1은 단구에 대해서는 주화성이 있으나, 호중구에 대해서는 주화성이 없고(Yoshimure, T. Robinson, E.A. Takana, S. Appella, E. and Leonardo, E.J. (1989) J. Immunol. 142, 1956-1962; Matsushima, K., Larsen, C.G., DuBois, G.C. and Oppenheim, J.J. (1989) J. Exp. Med. 169, 1485-1490), 초기에는 IL-8의 유사물로 간주되었다. 실제로, 단구는 자극-의존성 [Ca²⁺]i 변화로부터 판단할 때 모든 CC 케모카인에 반응한다(Miller, M.D. and Krangel, M.S. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12, 17-46; Bioschoff, S.C., Krieger, M. Brunner, T. 등(1993) Eur. J. Immunol. 23, 761-767; McCOL, S.R., Hachicha, M., Levasseur, S., Noete, K. and Schall, T.J. (1993) J. Immunol. 150, 4550-4560). MCP-1, MCP-2 및 MCP-3은 래트 및 토끼내로 피내 주사시에 단구 침투를 유도하고(Van Damme, J. Proost, P., Lenaerts, J-P. and Opdenakker, G. (1992) J. Exp. Med. 176, 59-65; Zacha, C.O.C., Anderson, A.O., Thompson, H.L. 등 (1990) J. Exp. Med. 171, 2177-2182), MCP-1은 또한 단구에서 호흡기 파열(Miller, M.D. and Krangel, M.S. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12, 17-46) 및 β2 인테그린의 발현(Jiang, Y., Beller, D.I., Frendl, G. and Graves, D.T. (1992) J. Immunol. 148, 2423-2428)을 유도한다.

CXC 케모카인이 호중구에 작용하고, CC 케모카인이 단구에 작용한다는 관찰은 명백히 유효하게 유지되는 반면에, 최근의 연구에서는, CC 케모카인은 이들이 일부 임파구 및 구체적으로 호염기구 및 호산구 백혈구를 활성화할 수도 있기 때문에 훨씬 더 광범위한 생물학적 활성을 가지는 것으로 나타났다. 따라서, 신규한 CC 케모카인을 분리하는 기술에 대한 지속적인 필요성이 존재한다.

본 발명은 인간의 CC 케모카인 단백질(즉, "CC"로 나타낸 인접한 4개의 시스테인 잔기중 처음 2개를 가진 사이토카인) 및 이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

도 1은 ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 DNA 클론의 서열 분석에 의해 결정된 완전 케모카인 β-15 단백질의 뉴클레오티드(서열번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)을 도시한 것이다. 이 단백질은 약 20개 아미노산 잔기(밑줄침)의 리더 서열 및 약 16kDa의 추론 분자량을 가진다. 예측된 성숙 CKβ-15 단백질의 아미노산 서열은 도 1(마지막 129개 아미노산) 및 서열번호 2(아미노산 잔기 1 내지 잔기 129)에 도시되어 있다.

도 2는 CKβ-15 단백질과 마우스 대식세포 염증 단백질 관련 단백질 2(MMRP-2)(서열번호 3)의 아미노산 서열들 사이의 유사성 영역을 도시한 것이다.

도 3은 다양한 인간 조직의 CKβ-15 유전자로부터 mRNA의 발현에 대한 노던 블롯 분석을 도시한 것이다. "HTSEX82"로 표시된 패널은 CKβ-15 cDNA 프로브에 하이브리드화를 나타내고, "액틴"으로 표시된 패널은 각 샘플내 천연 RNA의 존재를 나타내는 양성 대조군으로 작용하는 액틴을 암호화하는 cDNA의 하이브리드화를 나타낸다.

본 발명은 도 1의 아미노산 서열(서열번호 2) 또는 ATCC 기탁 번호 제97519호(1996년 4월 25일)로 세균 숙주로 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 인간 케모카인 β-15(CKβ-15) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 도 1(서열번호 1)에 도시한 기탁된 CKβ-15 cDNA 클론의 서열분석에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 위치 1 내지 3의 개시 코돈, 아미노산 잔기 약 20개의 리더 서열을 포함하고 약 16kDa의 추론된 분자량을 가지는 아미노산 잔기 149개의 폴리펩티드를 암호화하는 개방형 판독틀을 포함한다. 예측된 성숙 CKβ-15 단백질의 129개 아미노산 서열은 도 1(마지막 129개 잔기) 및 서열번호 2(아미노산 잔기 1 내지 잔기 129)에 도시되어 있다.

따라서, 본 발명의 1 양태는 하기 (a) 내지 (e)로 구성되는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다: (a) 서열번호 2에 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (b) 서열번호 2에서 위치 1 내지 129의 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (c) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (d) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 (e) 상기 (a) 내지 (d)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열. 핵산 분자는서열번호 2의 또는 상기 기탁된 cDNA가 암호화하는 성숙 폴리펩티드가 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태로는 상기 (a) 내지 (e)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일, 보다 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 (a) 내지 (e)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에 엄중 하이브리드화 조건하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자가 있다. 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 잔기 A로만 또는 잔기 T로만 구성되는 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에는 엄중 하이브리드화 조건하에 하이브리드화되지 않는다. 본 발명의 추가의 핵산 양태는 상기 (a) 내지 (d)의 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드의 에피토프 보유부의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 벡터를 포함하는 숙주 세포, 뿐만 아니라, 그러한 벡터 및 숙주 세포의 제조 방법 및 이들을 재조합 기술에 의해 CKβ-15 폴리펩티드의 생산에 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하기 (a) 내지 (d)로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 분리된 케모카인 β-15 폴리펩티드를 제공한다: (a) 도 1(서열번호 2)에 도시한 리더 서열을 포함하는 완전한 149개의 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드의 아미노산 서열, (b) 서열번호 2에서 위치 1 내지 129의 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드(리더 없음)의 아미노산 서열, (c) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 리더를 포함하는 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 (d) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드의 아미노산 서열. 본 발명의 폴리펩티드로는 또한 상기 (a) 내지 (d)에 기술한 것과 유사성이 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드, 뿐만 아니라, 상기한 것과의 동일성이 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드가 있다.

본 발명의 추가의 양태는 상기 (a) 내지 (d)에 기술한 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드의 에피토프 보유부의 아미노산 서열을 가진 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 케모카인 β-15 폴리펩티드의 에피토프 보유부의 아미노산 서열을 가진 펩티드 또는 폴리펩티드는 6개 또는 7개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 보다 바람직하게는 약 30 이상 내지 약 50개의 아미노산을 가진 그러한 폴리펩티드부를 포함하지만, 상기 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열의 길이 이하의 임의의 길이 및 그 서열을 포함하는 임의의 길이의 에피토프 보유 폴리펩티드 역시 본 발명에 포함된다. 또 다른 양태로 본 발명은 상기 (a) 내지 (d)에 기술한 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다.

본원 발명자들은 CKβ-15가 흉선 조직에서만 발현된다는 것을 발견하였다(도 3 참조). 다수의 흉선 질환의 경우, CKβ-15 유전자 발현의 현저히 높거나 낮은 레벨은 "표준" CKβ-15 유전자 레벨, 즉 흉선 질환을 갖지 않은 사람에게서 취한 흉선 조직 또는 체액에서의 CKβ-15 발현 레벨과 비교하여, 그러한 질환을 가진 사람으로부터 취한 흉선 조직 또는 체액(예; 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 척수액)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 흉선 질환의 진단시에 유용한 진단 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 개인의 세포 또는 체액내 케모카인 β-15 유전자 발현 레벨을 분석하는 단계, (b) 케모카인 β-15 유전자 발현 레벨을 표준 케모카인 β-15 유전자 발현 레벨과 비교하는 단계를 포함하는데, 표준 발현 레벨과 비교하여 분석된 케모카인 β-15 유전자 발현 레벨의 증가 또는 감소가 흉선 질환의 지표이다. 본 발명의 추가의 양태는 체내 케모카인 β-15 활성의 증가된 레벨을 필요로 하는 사람의 치료 방법에 관한 것인데, 이 방법은 그러한 사람에게 본 발명의 분리된 케모카인 β-15 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 클로닝된 cDNA를 서열분석하여 결정된 도 1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15(CKβ-15)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. CKβ-15는 그 유전자 인간 염색체 17 및 마우스 염색체 11상에 존재하는 β-케모카인 세부종(CC)의 신규한 일원이다(Wilson, S.D. 등, J. Exp. Med. 171:1301(1990) and Modi, W.S. 등, Hum. Genet. 84:185 (1990)). 본 발명의 CKβ-15 단백질은 마우스 대식세포 염증 단백질 관련 단백질 2(MMRP-2)(도 2)(서열번호3)와 서열 상동성을 공유한다. 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열은 CKβ-15 폴리펩티드를 암호화하는 HTSEX82 cDNA 클론을 서열 분석하여 얻었는데, 이 클론은 1996년 4월 25일에 매릴랜드주 20852 록빌 파크 론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 기탁되어 수탁 번호 제97519호를 부여받았다. 기탁된 클론은 pBluescript SK(-) 플라스미드(캘리포니아주 라졸라 소재의 스트래터진)에 함유된다.

핵산 분자

달리 언급하지 않으면, 본원에서 DNA 분자의 서열분석에 의해 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 자동 DNA 서열분석기(예; 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드에서 시판되는 모델 373)를 사용하여 결정하였고, 본원에서 결정된 DNA 분자가 암호화하는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정된 DNA 서열의 해독에 의해 예측된 것이다. 그러므로, 이러한 자동화 방법에 의해 결정된 임의의 DNA 서열에 대해서는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 약간의 착오를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 통상 서열분석된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 약 90% 이상, 보다 통상적으로는 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 당해 분야에 널리 공지된 수작업에 의한 DNA 서열분석 방법을 포함하여 기타 방법에 의해 보다 정확히 결정할 수 있다. 당해 분야에 역시 공지되어 있는 바와 같이, 실제 서열과 비교하여 결정된 뉴클레오티드 서열에서의 단일의 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 해독시에 틀변경을 야기하여, 결정된 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 예측된 아미노산 서열이 그러한 삽입 또는 결실점에서 시작하여 서열분석된 DNA 분자가 실제로 암호화하는 아미노산 서열과 완전히 상이하게 한다.

다른 언급이 없으면, 본원에 제시된 각각의 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드(약어 A, G, C 및 T)의 서열로서 제시된다. 그러나, DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 데옥시리보뉴클레오티드의 서열이, RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 리보뉴클레오티드(A, G, C 및 U)의 상응하는 서열이 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"을 의미하는데, 여기서 지정된 데옥시뉴클레오티드 서열의 각각의 티미딘 데옥시뉴클레오티드(T)는 리보뉴클레오티드 유리딘(U)에 의해 대체된다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드 약어를 사용하여 제시된 서열번호 1의 서열을 가진 RNA 분자에 대한 언급은 서열번호 1의 각각의 데옥시뉴클레오티드 A, G 또는 C가 상응하는 리보뉴클레오티드 A, G 또는 C로 대체되고, 각각의 데옥시뉴클레오티드 T는 리보뉴클레오티드 U로 대체된 서열을 가진 RNA 분자를 나타내기 위한 것이다.

도 1의 뉴클레오티드 서열과 같은 본원에 제시된 정보를 사용하여, CKβ-15 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 출발 물질로서 mRNA를 사용하여 cDNA를 클로닝하기 위한 절차와 같은 표준 클로닝 및 스크리닝 절차를 사용하여 수득할 수 있다. 본 발명의 예시적인 양태로서, 도 1(서열번호 1)에 기술된 핵산 분자는 인간 흉선 조직에서 유래한 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. 도 1의 CKβ-15 cDNA의 결정된 뉴클레오티드 서열은 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열의 위치 1 내지 3의 개시 코돈과 함께 149개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방형 판독틀과 약 20개의 아미노산 잔기의 예측된 리더 서열을 포함하고, 약 16kDa의 추론된 분자량을 가진다. 예측된 성숙 CKβ-15 단백질의 아미노산 서열은 도 1(서열번호 1)에 아미노산 잔기 21 내지 잔기 149로 도시되어 있다. 도 1(서열번호 2)에 도시한 CKβ-15 단백질은 MMRP2(도 2)와 약 34%가 동일하고 약 53%가 유사하다. 전술한 서열분석 착오의 가능성, 뿐만 아니라 상이한 공지된 단백질내 리더에 대한 절단 부위의 가변성으로 인해 당업자라면 이해할 수 있듯이, 축적된 cDNA가 암호화하는 실제의 CKβ-15 폴리펩티드는 약 149개의 아미노산을 포함하지만, 아미노산 142개 내지 154개의 범위로 도처에 존재할 수 있고; 이 단백질의 실제 리더 서열은 약 20개 아미노산이지만, 아미노산 약 15개 내지 약 25개 아미노산의 범위로 도처에 존재할 수 있다.

나타낸 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA 형태로 또는 클로닝에 의해 얻거나 합성에 의해 생성된 cDNA 및 게놈 DNA와 같은 DNA 형태로 존재할 수 있다. DNA는 2본쇄 또는 1본쇄일 수 있다. 1본쇄 DNA 또는 RNA는 센스 가닥으로도 알려진 암호 가닥이거나 또는 안티센스 가닥으로도 지칭되는 비암호 가닥일 수 있다.

"분리된" 핵산 분자(들)는 그 천연의 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, 벡터에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 추가의 예로는 용액중에 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자 또는 이종 숙주 세포에서 유지된 재조합 DNA 분자를 들 수 있다. 분리된 RNA 분자로는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 생체외 RNA 전사체를 들 수 있다. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 합성에 의해 생산된 그러한 분자를 들 수 있다.

본 발명의 분리된 핵산 분자로는 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열의 위치 1 내지 3의 개시 코돈을 가진 개방형 판독틀(ORF)을 포함하는 DNA 분자; 도 1(마지막 129개 아미노산) 및 서열번호 2(잔기 1 내지 129)에 도시한 성숙 CKβ-15 단백질에 대한 암호 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 전술한 것과 실질적으로 상이한 서열을 포함하지만, 유전암호의 축퇴성으로 인해 여전히 CKβ-15 단백질을 암호하는 DNA 분자가 있다. 따라서, 당업자에게는 전술한 축퇴 변형체를 생성시키는 것은 통상적인 일이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 제97519호(1996년 4월 25일)로 기탁된 플라스미드에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 CKβ-15 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이 핵산 분자는 전술한 기탁 cDNA 클론이 암호화하는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 전술한 기탁 클론에 포함된 CKβ-15 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자, 또는 상기 서열중 하나와 상보적인 서열을 가진 핵산 분자를 제공한다. 그러한 분리된 분자, 특히 DNA 분자는 인간 조직에서 CKβ-15 유전자의 발현을, 예컨대 노던 블롯 분석에 의해 검출하기 위한 용도 및 염색체와의 동일계 하이브리드화에 의해 유전자 지도작성을 위한 용도의 프로브로서 유용하다. 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 특정 조직 또는 체액내에서 변형된 CKβ-15 유전자 발현의 검출은 흉선 질환의 지표이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 전술한 본 발명의 핵산 분자내 폴리뉴클레오티드부에, 예를 들면, ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론에 엄중 조건하에서 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄중 하이브리드화 조건(stringent hybridization conditions)"이란 50%의 포름아미드, 5xSSC(150mM NaCl, 15mM 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH7.6), 5x덴하르트 용액, 10% 황산덱스트란 및 20㎍/㎖의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 42℃로 하루밤 동안 항온 처리하고, 이어서 필터를 약 65℃에서 0.1xSSC에서 세척하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드"부"에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 약 15개 이상, 보다 바람직하게는 약 20개 이상, 더욱 바람직하게는 약 30개 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30개 내지 70개의 기준 뉴클레오티드에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이들은 전술한 바와 같이 그리고 이하에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 진단용 프로브 및 프라이머로서 유용하다.

물론, 기준 폴리뉴클레오티드(예; 기탁된 cDNA 클론)의 다량 부분, 예를 들면 뉴클레오티드 50개 내지 750개 길이의 부분 또는 심지어 기준 폴리뉴클레오티드의 전체 길이에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드도 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 대부분(모두가 아니면)에 상응하는 폴리뉴클레오티드와 마찬가지로 본 발명에 따른 프로브로서 유용하다. "20개 이상의 뉴클레오티드의 길이"의 폴리뉴클레오티드 부분은 예를 들면, 기준 폴리뉴클레오티드(예; 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA)의 뉴클레오티드 서열로부터 20개 이상의 인접 뉴클레오티드를 의미한다. 나타낸 바와 같이, 그러한 부분은 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제2판, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 그 전체 개시 내용은 본원에 참고로 인용함)]에 기술된 바와 같이, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 표적 서열의 증폭용 프라이머로서 또는 통상의 DNA 하이브리드화 기술에 따른 프로브로서 진단용으로 유용하다.

CKβ-15 cDNA 클론은 기탁되었고, 그 결정된 뉴클레오티드 서열이 도 1(서열번호 1)에 제시되어 있기 때문에, CKβ-15 cDNA 분자의 부분에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 것은 당업자에게는 통상적인 일이다. 예를 들면, CKβ-15 cDNA 클론의 초음파 처리에 의한 제한 엔도뉴클레아제 절단 또는 전단은 CKβ-15 cDNA 분자의 부분에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드인 다양한 크기의 DNA 부분을 생성시키는 데에 용이하게 사용할 수 있다. 한편, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화는 공지된 기술에 따라 합성에 의해 생성시킬 수 있다. 물론, 폴리 A 서열(예; 도 1(서열번호 1)에 도시한 CKβ-15 cDNA의 3' 말단 폴리(A) 영역)에 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적인 연장체에만 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부분에 하이브리드화하는 데에 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는데, 왜냐하면, 그러한 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 연장체 또는 그 상보체(예; 실제로 임의의 2본쇄 cDNA 클론)를 함유하는 임의의 핵산 분자에 하이브리드화될 것이기 때문이다.

나타낸 대로, CKβ-15 단백질 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자로는 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 자체적으로 암호화하는 핵산 분자; 성숙 폴리펩티드에 대한 암호 서열 및 추가의 서열, 예를 들어 약 20개의 아미노산 리더 또는 분비 서열(예; 프리단백질, 프로단백질 또는 프리프로단백질 서열); 성숙 폴리펩티드의 암호 서열이 있으나, 이에 국한되지 않으며, 전술한 추가의 암호 서열의 존재 여부와 무관하게 추가의 비암호 서열의 예로는 인트론 및 비암호 5' 및 3' 서열, 예를 들면, 전사, mRNA 가공처리(스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 포함), 리보좀 결합 및 mRNA의 안정성에 역할을 하는 전사되고 비해독되는 서열; 추가의 기능을 제공하는 것과 같은 추가의 아미노산을 암호화하는 추가의 암호 서열이 있다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 융합된 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 마커 서열에 융합시킬 수 있다. 본 발명의 상기 양태의 특정의 바람직한 예에서는, 마커 아미노산 서열이 pQE 벡터(퀴아젠 인코포레이티드)에 제공된 표지와 같은 헥사-히스티딘 펩티드이고, 그 중 다수는 시판되는 것들이다. 문헌[Gentz 등(1989) Proc. Natl. Acad. Sci., 미국 86:821-824]에 기술된 바와 같이, 예를 들면, 헥사-히스티딘이 융합 단백질의 정제의 편의성을 제공한다. "HA" 표지는 문헌[Wilson 등, Cell 37: 767(1984)]에 기술된 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응하는 정제에 유용한 또 다른 펩티드이다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자의 변형체에 관한 것인데, 이 변형체는 CKβ-15 단백질의 부분, 유사물 또는 유도체를 암호화한다. 변형체는 천연 대립형질 변형체와 같이 천연적으로 존재할 수 있다. "대립형질 변형체"란 유기체의 염색체상의 주어진 좌를 차지하는 유전자의 몇가지 또 다른 형태중의 하나를 의미한다(Genes II, Lewin 편집). 비자연발생적인 변형체는 당해 분야에 공지된 돌연변이 유발 기술을 사용하여 생산할 수 있다.

적합한 변형체로는 뉴클레오티드 치한, 결실 또는 첨가에 의해 생산된 것들이 있다. 치환, 결실 또는 치환은 하나 이상의 뉴클레오티드와 관련이 있을 수 있다. 변형체는 암호 영역 또는 비암호 영역 또는 그 둘다에서 변형될 수 있다. 암호 영역에서의 변형은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 산출할 수 있다. 이들중 특히 바람직한 것은 침묵 치환, 첨가 및 결실인데, 이들은 CKβ-15 단백질 또는 그 부분의 성질 및 활성을 변화시키지 않는다. 역시 이 관계에서 특히 바람직한 것은 보존적 치환이다. 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 성숙 CKβ-15 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자가 가장 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태로는 하기 (a) 내지 (e)의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자가 있다: (a) 예측된 리더 서열을 포함하여 서열번호 2의 완전 아미노산 서열을 가진 전체 길이의 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (b) 서열번호 2에서 위치 1 내지 129의 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드(리더 서열이 제거된 전체 길이의 폴리펩티드)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (c) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 리더를 포함한 완전 아미노산 서열을 가진 전체 길이의 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (d) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 (e) 상기 (a) 내지 (d)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열.

케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열과 예컨대 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드란 폴리뉴클레오티드 서열이 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드의 100개 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 기준 서열의 뉴클레오티드의 5% 이하를 결실시키거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환하거나, 또는 기준 서열의 전체 뉴클레오티드중 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열내로 삽입시킬 수 있다. 기준 서열의 상기 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 도처에서 일어나거나, 또는 기준 서열의 뉴클레오티드중에서 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 군에 산재될 수 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 구체적인 핵산 분자가 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한가의 여부는 베스트핏 프로그램(위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 베스트핏은 두 서열 사이의 상동성의 최상의 분절을 확인하기 위해 스미스 및 워터맨(Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981)의 국부적 상동성 알고리듬을 사용한다. 베스트핏 또는 임의의 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예를 들면 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지 여부를 결정할 경우, 물론 동일성의 비율이 기준 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 기준 서열의 뉴클레오티드의 총수의 5% 이하의 상동성의 차이가 허용되도록 매개변수를 설정한다.

본 출원은 핵산 서열이 CKβ-15 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는지 여부와는 무관하게, 도 1(서열번호 1)에 도시한 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 대한 것이다. 이것은 특정 핵산 분자가 CKβ-15 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하지 않는 경우에조차 당업자는 예를 들면 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 핵산 분자를 사용하는 방법을 여전히 알 수 있기 때문이다. CKβ-15 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도로는 특히 (1) cDNA 라이브러리에서 CKβ-15 유전자 또는 그 대립형질 변형체의 분리, (2) 문헌[Verma 등, Human Chromosomes: a Manual of Basis Techniques, 퍼거몬 프레스, 뉴욕(1988)]에 기재된 바와 같이 CKβ-15 유전자의 정확한 염색체상 위치를 제공하기 위한 중기 염색체 확장체에의 동일계 하이브리드화(예; "FISH") 및 특이 조직(예; 흉선 조직)에서의 CKβ-15 mRNA 발현을 검출하기 위한 노던 블롯 분석이 있다.

그러나, 도 1(서열번호 1)에 도시한 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하고 실제로 CKβ-15 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 바람직하다. "CKβ-15 활성을 가진 폴리펩티드"란 구체적인 생물학적 분석에서 측정되는 바와 같이 본 발명의 CKβ-15 단백질(전체 길이의 단백질 또는 바람직하게는 성숙 단백질)의 활성과 유사하나 반드시 동일하지는 않은 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 다른 CC 사이토카인과 마찬가지로, CKβ-15는 단구, 임파구 및 호중구에 대한 활성을 나타낸다. 그러나, 기타 공지된 CC 사이토카인과는 달리, CKβ-15는 흉선에서만 발현되는 것으로 나타났다. 그러므로, CKβ-15는 흉선의 세포, 특히 초기 흉선세포의 활성의 조절에 특히 활성이 있다. 예를 들면, CKβ-15에 의한 초기 흉선세포 증식의 자극은 표준 증식 분석(참조문헌 예; Spits등 (1987) J. Immunol. 139:1142; Dalloul 등(1989) Eur. J. Immunol. 19:1985; Murphy 등, (1992) Ped. Res. 32:269; Ruggiero등, (1996) J. Immunol. 156:3737)에서 분석한다. 간단히 언급하면, 분석은 인간 흉선으로부터 흉선세포를 정제하고, 그들을 CKβ-15가 있거나 없는 배지에 도말하고, 대조군 배양과 비교하여 세포의 수 또는 증식 속도에 있어서 경과된 시간에 따른 변화를 통상의 수단으로 측정하는 것을 포함한다. 대표적인 세포주를 그러한 분석에 이용할 수도 있다.

CKβ-15는 또한 흉선내 T 세포 전구체의 성숙 T-임파구(α/β+ 또는 γ/δ+ T 세포 수용체 임파구임)로의 분화를 매개한다(문헌[Barcena 등 (1990) J. Exp. Med. 172:439). 이러한 효과는 흉선내 흉선세포의 특이적 부분집합의 고사를 조정(유도 또는 억제)함으로써 또는 특이적 부분집합의 분화를 직접 유도함으로써 매개된다. 또한 CKβ-15는 미성숙 임파구 전구체가 흉선으로 복귀하여 적절히 성숙되도록 유도한다. 이러한 활성은 1차 선조 또는 대표적인 세포주를 사용하여 생체외 주화성 분석에 의해 입증된다. CKβ-15는 또한 흉선 상피 세포를 통해 인간 흉선세포 증식 또는 분화에 대한 다양한 시험관내 분석(Ruggiero 등 (1996) J. Immunol. 156:3737; Barcena 등(1990) J. Exp. Med. 172:439; Singer 등, (1990) J. Immunol. 144:2931)에 의해 나타나는 바와 같이, 예를 들면, 증식 또는 분화에 대한 공통 자극 신호를 제공함으로써 적절한 T-임파구 성숙을 매개한다.

본 발명의 CKβ-15 단백질은 또한 대식세포 염증 단백질 관련 단백질-2(MMRP-2)와 마찬가지로 골수 선조 세포의 콜로니 형성을 매개한다. 골수 선조 세포의 억제도를 측정하기 위한 시험관내 콜로니 형성 분석은 문헌[Youn 등, The Journal of Immunology 155:2661-2667 (1995)]에 기재되어 있다. 간단히 언급하면, 분석은 인간 또는 마우스 골수 세포를 수집하고 이것을 아가상에 도말하고, 하나 이상의 성장 인자 및 (1) CKβ-15 단백질을 함유하는 형질감염된 숙주세포 상청액(즉 폴리펩티드 후보) 또는 (2) 형질감염되지 않은 숙주 세포 상청액 대조군을 첨가하고, 쥐 및 인간의 CFU-과립구-대식세포(CFU-GM)에 의해, 인간의 파열 형성 단위 적혈구계에 의해 또는 인간의 CFU 과립구-적혈구-대식세포-거핵구(CFU-GEMM)에 의해 콜로니 형성에 대한 영향을 측정하는 것을 포함한다.

CKβ-15 단백질은 초기의 흉선세포 증식 및 분화를 전술한 분석에서 용량 의존적 방법으로 조절한다. 따라서, "CKβ-15 단백질 활성을 가진 폴리펩티드"는 전술한 분석에서 용량 의존적 방법으로 동일한 흉선세포 조정 활성중 임의의 것을 나타내기도 하는 폴리펩티드를 포함한다. 용량 의존적 활성도가 CKβ-15 단백질의 그것과 동일할 필요는 없지만, 바람직하게는 "CKβ-15 단백질 활성을 가진 폴리펩티드"는 CKβ-15 단백질과 비교하여 주어진 활성에서 거의 유사한 용량 의존성을 나타낼 것이다(즉, 후보 폴리펩티드는 기준 CKβ-15 단백질과 비교하여 보다 큰 활성 또는 약 10배 이하, 바람직하게는 약 2배 이하의 활성을 나타낼 것이다).

물론, 유전암호의 축퇴성으로 인해, 당업자라면 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 도 1(서열번호 1)에 도시한 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 가진 다수의 핵산 분자가 "CKβ-15 단백질 활성"을 가진" 폴리펩티드를 암호화한다는 것을 즉시 인지할 것이다. 실제로, 상기 뉴클레오티드 서열의 축퇴 변형체는 모두 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 이것은 전술한 비교 분석을 실시하지 않고도 당업자에게는 명백한 사항일 것이다. 축퇴 변형체가 아닌 그러한 핵산 분자의 경우, 합리적인 숫자는 또한 CKβ-15 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화한다는 것도 인지될 것이다. 이것은 당업자가 단백질 기능에 덜 현저하게 영향을 끼치거나 영향을 끼치지 않는 아미노산 치환(예; 하나의 지방족 아미노산을 제2의 지방족 아미노산으로 대체)을 충분히 알 수 있기 때문이다.

예를 들면, 표현형상 침묵 아미노산 치환을 일으키는 방법에 관한 지침은 문헌[Bowie, J. U. 등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)]에 제시되어 있는데, 여기서는 하나의 아미노산 변화에 대한 내성을 연구하는 두가지의 주요 연구가 기재되어 있다. 그 첫 번째 방법은 돌연변이가 자연선택에 의해 수용되거나 또는 거부되는 진화 과정에 의존한다. 두 번째 방법은 유전공학을 이용하여 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하고 기능을 유지하는 서열을 동정하기 위해 선별 또는 스크린한다. 상기 문헌에 언급되어 있듯이, 이들 연구는 단백질이 놀랍게도 아미노산 치환에 대해 내성이 있음을 나타내고 있다. 상기 문헌은 또한 아미노산 치환이 단백질의 특정 위치에서 허용되는 경향을 나타내고 있다. 예를 들면, 대부분의 매립된 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 필요로 하는 반면에, 표면 측쇄의 특성을 일반적으로 거의 보존되지 않는다. 그러한 기타 표현형상 침묵 치환은 문헌[Bowie, J.U. 등, 상기 참조] 및 그에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 재조합 백터를 사용하여 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 CKβ-15 폴리펩티드 또는 그 부분의 제조 방법에 관한 것이다.

재조합 구성체는 감염, 형질도입, 형질감염, 트랜스벡션, 전기사출법 및 형질전환과 같은 널리 공지된 기술을 사용하여 숙주 세포내로 도입시킬 수 잇다. 벡터의 예로는 파지, 플라스미드 또는 비루스 또는 레트로비루스 벡터가 있다. 레트로비루스 벡터는 복제능이 있거나 또는 복제 결함성일 수 있다. 복제 결합성인 경우에, 비루스의 전파는 일반적으로 숙주 세포의 보충시에만 일어난다.

폴리뉴클레오티드는 숙주내 전파용 선별 마커를 포함하는 벡터에 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물과 같은 침전물에 또는 전하를 띤 지질과의 복합체에 도입된다. 벡터가 비루스인 경우, 그것은 적절한 포장 세포주를 사용하여 시험관내에서 포장할 수 있고 숙주 세포내로 형질도입할 수 있다.

당해 폴리뉴클레오티드에 대해 시스 작용성의 제어 영역을 포함하는 벡터가 바람직하다. 적합한 트란스 작용성 인자는 숙주에 의해 제공되거나, 보충 벡터에 의해 제공되거나 또는 숙주내로의 도입시 벡터 자체에 의해 제공될 수 있다.

이와 관련하여 특히 바람직한 양태에서, 벡터는 유도성 및/또는 세포형 특이적인 것으로서 특이적 발현을 제공한다. 그러한 벡터중에서 온도 및 영양 첨가제와 같이 조작하기가 용이한 환경 인자에 의해 유도될 수 있는 벡터가 특히 바람직하다.

본 발명에 유용한 발현 벡터로는 염색체 유래, 에피좀 유래 및 비루스 유래 벡터, 예를 들면, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피좀, 효모 염색체 요소, 비루스(예; 바쿨로비루스, 파포바 비루스, 백시니아 비루스, 아데노비루스, 가금 천연두 비루스, 가광견병 비루스 및 레트로비루스) 및 이들의 조합으로부터 유래한 벡터(예; 코스미드 및 파지미드)가 있다.

DNA 삽입체는 파지 람다 PL 프로모터, 이. 콜리lac,trp및tac프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로비루스 LTR의 프로모터와 같은 적합한 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 기타 적합한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 발현 구성체는 추가로 전사 개시부, 종결부를 포함하고, 전사된 영역에서 해독을 위한 리보좀 결합부를 포함한다. 그 구성체가 발현시키는 성숙 전사체의 암호부는 해독 개시 코돈 AUG와 해독될 폴리펩티드의 말단에 적절히 위치한 종결 코돈을 포함한다.

나타낸 바와 같이, 발현 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 마커로는 진핵 세포 배양의 경우 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성을 포함하고, 이.콜리 및 기타 박테리아 배양의 경우에는 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예로는 이.콜리, 스트렙토코커스 및 살모넬라 티피뮤리엄 세포와 같은 박테리아 세포; 효모 세포와 같은 진균 세포; 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS 및 보웨스(Bowes) 흑색종 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포가 있다. 전술한 숙주 세포에 적합한 배양 배지 및 조건은 당해 분야에 공지되어 있다.

박테리아에 사용하기에 바람직한 벡터로는 퀴아젠에서 시판되는 pA2, pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트래터진에서 시판되는 pBS 벡터, 파지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파마시아에서 시판되는 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5가 있다. 바람직한 진핵 세포 벡터로는 스트래터진에서 시판되는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 및 파마시아에서 시판되는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이 있다. 기타 적합한 벡터는 당업자에게는 용이하게 인지된다.

본 발명에 사용하기에 적합한 공지의 박테리아 프로모터로는 이.콜리lacI 및lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터,gpt프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및trp프로모터가 있다. 적합한 진핵세포 프로모터로는 CMV 즉시 초기(immediate early) 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 로우스(Rous) 육종 비루스(RSV)의 것과 같은 레트로비루스 LTR의 프로모터 및 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터가 있다.

구성체의 숙주 세포로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온 지질 매개 형질감염, 전기사출법, 형질도입, 감염 또는 기타 방법에 의해 수행할 수 있다. 그러한 방법들은 문헌[Davis 등, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986)]과 같은 다수의 표준 실험실 매뉴얼에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 고등 진핵세포에 의한 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스 작용성 요소로서 통상 주어진 숙주 세포형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키는 작용을 하며, 약 10 bp 내지 300 bp이다. 인핸서의 예로는 복제 기점의 마지막쪽에 100 bp 내지 270 bp로 위치하는 SV40 인핸서, 시토메갈로비루스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 마지막쪽상의 폴리오마 인핸서 및 아데노비루스 인핸서가 있다.

내형질 세망의 루멘내로, 세포질 공간으로 또는 세포외 환경으로 해독된 단백질을 분비하기 위해, 적절한 분비 신호가 발현 폴리펩티드내로 혼입될 수 있다. 그 신호는 폴리펩티드에 대해서는 내생적이거나 이종성 신호일 수 있다

폴리펩티드는 융합 단백질과 같이 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 신호 뿐만 아니라 추가의 이종 기능 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 추가의 아미노산, 특히 전하를 띤 아미노산 영역을 폴리펩티드의 N-말단에 첨가하여 정제중 또는 후속의 취급 및 보관중에 숙주 세포에서 안정성 및 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 펩티드부를 첨가하여 정제를 촉진할 수도 있다.

CKβ-15 단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록시애퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 고실행도 액체 크로마토그래피("HPLC")를 정제에 이용하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드로는 천연 정제 생성물, 화학 합성 절차의 생성물 및 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물이 있다. 재조합 정제 절차에 이용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당부가되거나 또는 당부가되지 않을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 숙주 매개의 과정의 결과로서 일부 경우에는 변형된 개시 메티오닌 잔기를 포함할 수도 있다.

CKβ-15 폴리펩티드 및 펩티드

본 발명은 또한 기탁된 cDNA가 암호화하는 아미노산 서열 또는 도 1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 가진 분리된 CKβ-15 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. "펩티드" 및 "올리고펩티드"란 용어는 동의어로 간주되고(통상 인지되는 바와 같이), 각 용어는 내용이 펩티드 연결체에 의해 연결된 아미노산에 대한 최소한의 쇄를 나타내는 데에 필요한 대로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. "폴리펩티드"란 용어는 본원에서 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 쇄에 사용된다. 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 형태 또는 서열은 좌에서 우로 그리고 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 작성된다.

CKβ-15 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 이렇다할 효과를 끼치지 않고 변화될 수 있음은 당해 분야에서는 인지될 수 있다. 서열상의 그러한 차이를 고려하면, 단백질상에는 활성을 결정하는 중요한 영역이 있음을 상기하여야 한다. 일반적으로, 유사한 기능을 수행하는 잔기를 사용한다면, 3차 구조를 형성하는 잔기를 대체하는 것이 가능하다. 다른 예에서는, 변형이 단백질의 비중요 영역에서 일어난다면, 잔기의 유형이 전혀 중요하지 않을 수도 있다.

따라서, 본 발명은 또한 상당한 CKβ-15 폴리펩티드 활성을 나타내거나 또는 후술하는 단백질 부분과 같은 CKβ-15 단백질 영역을 포함하는 CKβ-15 폴리펩티드의 변형체를 포함한다. 그러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 종류 치환(예; 다른 하나의 잔기 대신에 하나의 친수성 잔기로 치환하지만, 대개 강한 소수성 잔기를 강한 친수성은 아닌 잔기로 치환함)을 포함한다. 작은 변화 또는 그러한 "중성" 아미노산 치환은 일반적으로 활성에는 거의 영향을 끼치지 않는다.

대체는 통상 보존적 치환으로 나타나는데, 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 하나를 다른 하나로 대체, 히드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe, Tyr 사이의 대체가 있다.

상기에 상세히 나타낸 바와 같이, 어느 아미노산 변화가 표현형상 침묵성인 경향(즉, 기능에 현저한 유해 효과를 나타내지 않는 경향)이 있는 지에 대한 추가의 지침은 문헌[Bowie, J.U.등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)]에서 발견할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태로 제공되는 것이 바람직하고, 실질적으로 정제되는 것이 바람직하다. CKβ-15 폴리펩티드의 재조합에 의해 제조된 형태는 문헌[Smith and Johnson, Gene 67:31-40(1988)]에 기재된 1 단계 방법에 의해 실질적으로 정제할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드로는 리더를 포함하는 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 폴리펩티드, 리더가 제외된 기탁된 cDNA가 암호화하는 성숙 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질), 리더를 포함하는 서열번호 2의 폴리펩티드, 리더가 제외된 서열번호 2의 폴리펩티드, 또한 전술한 폴리펩티드와 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 유사도를 가진 폴리펩티드가 있다. 본 발명의 추가 폴리펩티드로는 기탁된 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드, 서열번호 2의 폴리펩티드와 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩티드가 있으며, 또한 30개 이상의 아미노산 및 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 가진 상기 폴리펩티드의 부분을 포함한다.

2개의 폴리펩티드에 대한 "유사도(%)"란 베스트핏 프로그램(위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8) 및 유사도 측정용의 디폴트 장치를 사용하여 두 개 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교하여 산출된 유사도 값을 의미한다. 베스트핏은 베스트핏은 두 서열 사이의 상동성의 최상의 분절을 확인하기 위해 스미스 및 워터맨(Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981)의 국부적 상동성 알고리듬을 사용한다.

케모카인 β-15 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드란 폴리펩디드 서열이 케모카인 β-15 폴리펩티드의 기준 아미노산의 100개 아미노산당 5개 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 기준 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 기준 서열의 아미노산 잔기의 5% 이하를 결실시키거나 또 다른 아미노산으로 치환하거나, 또는 기준 서열의 전체 아미노산 잔기중 5% 이하의 다수의 아미노산을 기준 서열내로 삽입시킬 수 있다. 기준 서열의 상기 변형은 기준 뉴클레오티드 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 도처에서 일어나거나, 또는 기준 서열의 잔기중에서 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 군에 산재될 수 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 구체적인 폴리펩티드가 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한가의 여부는 베스트핏 프로그램(위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 베스트핏 또는 임의의 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예를 들면 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지 여부를 결정할 경우, 물론 동일성의 비율이 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 기준 서열의 아미노산의 총수의 5% 이하의 상동성의 차이가 허용되도록 매개변수를 설정한다.

아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 다클론 및 단일클론 항체를 생성시킬 수 있는데, 이들 항체는 후술하는 바와 같이 CKβ-15 단백질 발현을 검출하는 진단 분석에 또는 CKβ-15 단백질 기능을 증강 또는 억제할 수 있는 작동물질 및 길항물질로서 유용하다. 또한, 그러한 폴리펩티드는 효모의 2-하이브리드 시스템에 사용하여 본 발명에 따른 후보 작동물질 및 길항물질이기도 한 CKβ-15 단백질을 "포착"할 수 있다. 효모의 2 하이브리드 시스템은 문헌[Fields and Song, Nature 340:245-246 (1989).

또 다른 양태로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프 보유 영역을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 일부로서 정의된다. 이들 면역원성 에피토프는 분자상의 몇 개의 좌에 국한되는 것으로 생각된다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"로 정의된다. 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 적다(참조문헌의 예; Geysen, H.M., Meloen, R.H. and Barteling, S.J.(1984) Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002).

항원성 에피토프(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 포함하는 것)를 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 선별에 대해서는, 단백질 서열의 일부와 유사한 비교적 짧은 합성 펩티드가 부분적으로 유사한 단백질과 반응하는 항혈청을 통상적으로 유도할 수 있다는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(참조문헌의 예; Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N. and Learner, R.A. (1983) Antibodies that react with predetermined sites on proteins. Science 219:660-666). 단백질 반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 단백질의 1차 서열에서 자주 나타나고, 한 세트의 간단한 화학 규칙을 특성으로 하며, 천연 단백질의 면역 우세 영역(즉, 면역원성 에피토프)에 한정되지도 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 한정되지도 않는다. 극히 소수성인 펩티드 및 6개 이하의 잔기를 가진 펩티드는 일반적으로 유사한 단백질에 결합하는 항체를 유도하는 데에 비효율적이고; 보다 길고 용해성인 펩티드, 특히 프롤린 잔기를 함유하는 펩티드가 통상 효과적이다(Sutcliffe 등, 상기 참조, 661). 예를 들면, 상기 지침에 따라 안출된 20개 펩티드중 18개는 인플루엔자 비루스 혈구응집소 HA1 폴리펩티드쇄의 서열의 75%를 차지하는 8개 내지 39개 잔기를 포함하는 것으로서, HA1 단백질 또는 천연 비루스와 반응한 항체; 및 각각의 단백질을 침전시킨 광견병 당단백질 유도 항체로부터 18/18 및 MuLV로부터 12/12 펩티드를 유도하였다.

그러므로, 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체와 같은 항체를 형성하는 데에 유용하다. 따라서, 항원성 에피토프 보유 펩티드로 면역화된 공여자로부터 유래한 비장 세포의 융합에 의해 수득된 고비율의 하이브리도마는 일반적으로 천연 단백질과 반응성이 있는 항체를 분비한다(Sutcliffe 등, 상기 참조 663). 항원성 에피토프 보유 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 형성된 항체는 유사한 단백질을 검출하는 데에 유용하고, 상이한 펩티드에 대한 항체는 해독후 변형을 수행하는 단백질 전구체의 당야한 영역의 운명을 추적하는데에 사용될 수 있다. 펩티드 및 항펩티드 항체는 짧은 펩티드(예; 약 9개의 아미노산)조차 면역침전 분석에서 보다 큰 펩티드에 결합하고 그것을 대체할 수 있는 것으로 나타났기 때문에 예를 들면 경쟁 분석에서 유사한 단백질에 대한 다양한 질적 또는 양적 분석에 사용될 수 있다(참조문헌의 예; Wilson, I.A., Niman, H.L., Houghten, R.A., Cherenson, A.R., Connolly, M.L. and Lerner, R.A.(1984) The structure of an antigenic determinant in a protein. Cell 37:767-778 at 777). 본 발명의 항펩티드 항체는 또한 예를 들면 당해 분야에 널리 공지된 흡착 크로마토그래피에 의한 유사한 단백질의 정제에 유용하다.

상기 지침에 따라 안출된 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 포함된 아미노산중 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 아미노산의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 다수 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 약 30개 내지 약 50개의 아미노산을 포함하거나 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열에 이르는 임의의 길이의 아미노산을 포함하는 것으로서, 역시 본 발명의 에피토프 보유 펩티드 또는 폴리펩티드로 간주되고, 또한 유사한 단백질과 반응하는 항체의 유도에 유용하기도 하다. 에피토프 보유 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매중에서 상당한 용해도를 제공하도록 선택되고(즉, 서열은 비교적 친수성 잔기를 포함하고 고도의 소수성 서열은 피하는 것이 바람직함), 프롤린 잔기를 포함하는 서열이 특히 바람직하다.

본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 분자를 사용하는 재조합 수단을 포함하여 펩티드 또는 폴리펩티드의 제조를 위한 통상적인 수단에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 짧은 에피토프 보유 아미노산 서열은 재조합에 의한 생산 및 정제중에, 또한 항펩티드 항체의 생산을 위한 면역화중에 캐리어로서 작용하는 보다 큰 폴리펩티드에 융합시킬 수 있다. 에피토프 보유 펩티드는 또한 화학 합성의 공지된 방법을 사용하여 합성할 수도 있다. 예를 들면, 하우튼은 4주내에 제조되고 특성분석(ELISA형 결합 연구에 의해)되는 HA1 폴리펩티드의 분절의 단일 아미노산 변형체를 나타내는 10㎎ 내지 20㎎의 248개의 상이한 13개 잔기의 펩티드와 같이 다수의 펩티드의 간단한 합성 방법을 개시하였다(Houghten, R.A. (1985) General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody at the level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135). 이러한 "동시 다발적 펩티드 합성(SMPS)" 방법은 미국 특허 제4,631,211호(Houghten 등 (1986))에도 기재되어 있다. 이러한 방법에서 다양한 펩티드의 고체상 합성용의 각각의 수지는 별도의 용매 투과성 패킷에 포함되어 있는 것으로서 고체상 방법에 관련된 다수의 동일한 반복 단계를 최적 사용을 가능하게 한다. 완전히 수작업으로 하는 방법은 500 내지 1000 또는 그 이상의 합성이 동시에 수행될 수 있도록 한다(Houghten 등, 상기 참조. 5134)

본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 항체를 유도하는 데에 사용한다(참조문헌의 예; Sutcliffe 등, 상기 참조; Wilson 등, 상기 참조; Chow, M., Yabrov, R., Bittle, J., Hogel, J. and Baltimore, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; and Bittle, F.J., Fry, C.M., Rowlands, D.J., Brown, F., Bittle, J.L., Houghten, R.A. and Lerner, R.A. (1985) J. gen. Virol. 66:2347-2354). 일반적으로, 동물은 유리 펩티드로 면역화할 수 있지만, 항펩티드 항체 역가는 키홀 림펫 헤마시아닌(KLH) 또는 테타누스 톡소이드와 같은 거대분자 캐리어에 펩티드를 연결시켜 증가될 수 있다. 예를 들면, 시스테인을 함유하는 펩티드는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용하여 캐리어에 연결시킬 수 있는 반면에, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 연결제를 사용하여 캐리어에 연결시킬 수 있다. 토끼, 래트 및 마우스와 같은 동물은 예를 들면, 약 100㎍ 펩티드 또는 캐리어 단백질 및 프로인트 보조제를 함유하는 유탁액의 복강내 및/또는 피내 주사에 의해 유리 펩티드 또는 캐리어 연결된 펩티드로 면역화한다. 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하여 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항펩티드 항체의 유용한 역사를 제공하기 위해 예를 들면, 약 2주의 간격으로 여러 가지 추가 항원 자극 주사가 필요할 수 있다. 면역화된 동물로부터 유래한 혈청내 항펩티드 항체의 역가는 항펩티드 항체의 선별에 의해, 예를 들면 고체 지지체상에서 펩티드에의 흡착 및 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 선택된 항체의 용출에 의해 증가될 수 있다.

본 발명의 면역원성 보유 펩티드, 즉 전체 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 부분이 당해 분야에 공지된 방법에 따라 동정된다. 예를 들면, 문헌[Geysen 등, 1984, 상기 참조]은 효소 결합된 면역흡착 분석에서 반응하기에 충분한 순도의 수백개의 펩티드의 고체 지지체상에서의 신속한 동시 합성 방법을 개시하고 있다. 합성된 펩티드와 항체의 상호작용은 지지체로부터 이들을 제거하지 않고 용이하게 검출된다. 이러한 방식으로, 목적 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티는 당업자에 의해 통상적으로 동정될 수 있다. 예를 들면, 발과 입의 질병 비루스의 코트 단백질의 면역학적으로 중요한 에피토프는 게이센 등에 의해 단백질의 전체 213개 아미노산 서열을 차지하는 모든 208개의 가능한 헥사펩티드의 중첩 세트의 합성에 의해 7개의 아미노산을 분리함으로써 위치가 지정되었다. 그 다음, 20개의 아미노산이 모두 에피토프내 모든 위치에서 교대로 치환된 펩티드의 완전한 대체 세트가 합성되었고, 항체와의 반응에 대한 특이성을 부여하는 구체적인 아미노산을 측정하였다. 따라서, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드의 펩티드 유사물은 상기 방법에 의해 통상적으로 제조될 수 있다. 미국 특허 제4,708,781호(게이센, 1987)는 추가로 목적 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드를 동정하는 상기 방법을 기재하고 있다.

또한, 미국 특허 제5,194,392호(게이센, 1990)는 에피토프의 국소해부학적 등가물("미모토프")인 단량체(아미노산 또는 기타 화합물)의 서열을 검출하거나 또는 결정하는 일반 방법을 개시하고 있는데, 이 때 상기 에피토프는 당해 항체의 구체적인 파라토프(항원 결합 부위)에 상보적인 것이다. 보다 일반적으로, 미국 특허 제4,433,092호(게이센, 1989)는 당해 구체적인 수용체의 리간드 결합 부위와 상보적인 리간드의 국소해부학적 등가물인 단량체의 서열을 검출 또는 결정하는 방법을 개시하고 있다. 유사하게, 과알킬화된 올리고펩티드 혼합물에 관한 미국 특허 제5,480,971호(하우튼 R.A., 1996)는 선형의 C₁-C₇-알킬 과알킬화된 올리고펩티드 및 이 펩티드의 세트 및 라이브러리와, 그러한 올리고펩티드 세트 및 라이브러리를 당해 수용체 분자에 우선적으로 결합하는 과알킬화된 올리고펩티드의 서열을 결정하기 위해 사용하는 방법을 개시하고 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드의 비펩티드 유사물은 이들 방법에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.

"폴리펩티드 및 펩티드"에 관한 본 섹션에서 인용된 각 서류의 전체 개시사항은 본원에 참고로 인용하였다.

흉선 관련 질환 진단

본원 발명자들은 CKβ-15가 흉선 조직에서만 발현된다는 것을 발견하였다. 다수의 흉선 관련 질환의 경우, CKβ-15 유전자 발현의 실질적으로 변경된(증가 또는 감소) 레벨은 "표준" CKβ-15 유전자 발현 레벨, 즉 흉선 질환을 가지지 않은 사람의 흉선 조직 또는 체액의 CKβ-15 발현 레벨과 비교하여 그러한 질환을 가진 사람에게서 취한 흉선 조직 또는 기타 세포 또는 체액(예; 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 척수액)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 흉선 질환의 진단중에 유용한 진단 방법을 제공하는데, 이 방법은 개인의 흉선 조직 또는 기타 세포 또는 체액내 CKβ-15 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 레벨을 측정하는 단계, 측정된 유전자 발현 레벨을 표준 CKβ-15 유전자 발현 레벨과 비교하는 단계를 포함하며, 표준 발현 레벨과 비교한 유전자 발현 레벨의 증가 또는 감소가 흉선 질환의 지표이다.

개인이란 포유류의 개체, 바람직하게는 인간을 의미한다. "CKβ-15 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 레벨을 측정한다"란 제1의 생물학적 샘플에서 CKβ-15 단백질을 암호화하는 mRNA의 레벨 또는 CKβ-15 단백질의 레벨을, 직접적으로(예; 절대 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨의 측정하거나 또는 평가함으로써) 또는 상대적으로(예; 제2의 생물학적 샘플내 CKβ-15 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨을 비교함으로써), 정성적으로 또는 정량적으로 측정 또는 평가하는 것을 의미한다. 제1의 생물학적 샘플내 CKβ-15 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨을 측정 또는 평가하여 표준 CKβ-15 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨과 비교하는데, 상기 표준은 흉선 질환을 갖지 않은 개인에게서 얻은 제2의 생물학적 샘플로부터 취하거나, 흉선 질환을 갖지 않은 개인 집단의 레벨을 평균함으로써 측정된다. 당해 분야에서 이해되어 있듯이, 일단 표준 CKβ-15 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨이 알려지면, 그 레벨은 비교를 위해 표준으로서 반복적으로 사용할 수 있다.

"생물학적 샘플"이란 개인에게서 얻은 임의의 생물학적 샘플, 체액, 세포주, 조직 배양 또는 CKβ-15 단백질 또는 mRNA를 함유하는 기타 공급원을 의미한다. 나타낸 바와 같이, 생물학적 샘플에는 분비된 성숙 CKβ-15 단백질을 함유하는 체액(예; 혈청, 혈장, 뇨, 활액 및 척수액), 흉선 조직, 및 CKβ-15 또는 CKβ-15 수용체를 발현시키는 것으로 확인된 기타 조직 공급원이 있다. 포유 동물로부터 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 생물학적 샘플에 mRNA를 포함시키고자 하는 경우에는, 조직 생검이 바람직한 공급원이다.

본 발명은 포유 동물, 바람직하게는 인간의 다양한 흉선 관련 질환의 진단 또는 치료에 유용하다. 그러한 질환으로는 하기하는 종양 및 암, 활동저하, 활동항진, 위축, 흉선의 확장 등이 있다. 기타 질환으로는 T-임파구 선별 또는 활성의 조절이상이 있으며, 그 예로는 자가면역, 관절염, 백혈병, 임파종, 면역억제, 패혈증, 상처 치료, 급성 및 만성 염증, 세포 매개 면역, 체액성 면역, TH1/TH2 불균형 등이 있으나, 이에 국한되지 않는다.

전체 세포 RNA는 문헌[Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)]에 기재된 1단계의 구아니듐-티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법과 같은 임의의 적합한 기술을 사용하여 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. CKβ-15 단백질을 암호화하는 mRNA의 레벨을 적합한 임의의 방법을 사용하여 분석한다. 그 예로는 노던 블롯 분석, S1 뉴클레아제 지도작성, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 폴리머라제 연쇄 반응과 연계된 역전사(RT-PCR) 및 리가제 연쇄 반응과 연계된 역전사(RT-LCR) 방법이 있다.

노던 블롯 분석은 문헌[Harada 등, Cell 63:303-312(1990)]에 기재된 대로 실시할 수 있다. 간단히 언급하면, 전술한 바와 같이 전체 RNA를 생물학적 샘플로부터 준비한다. 노던 블롯을 위해, RNA를 적합한 완충액(예; 글리옥살/디메틸 설폭사이드/인산 나트륨 완충액)에서 변성시키고, 아가로스 겔 전기영동시키고, 니트로셀룰로스 필터상으로 옮긴다. RNA를 UV 링커에 의해 필터에 연결시킨 후, 필터를 포름아미드, SSC, 덴하르트 용액, 변성된 연어 정자, SDS 및 인산나트륨 완충액을 함유하는 용액에 사전하이브리드화한다. 임의의 적합한 방법(예;³²P-다중 프라이밍된 DNA 표지 시스템(아머샴))에 따라 표지된 CKβ-15 단백질 cDNA를 프로브로 사용한다. 하루밤 동안 하이브리드화한 후, 필터를 세척하고 x-선 필름에 노출시킨다. 본 발명에 따른 프로브로서 사용하기 위한 cDNA는 상기 섹션에서 설명하였고, 길이가 15bp이상인 것이 바람직하다.

문헌[Fujita 등, Cell 49:357-367(1987)]에 기재된 대로 수행할 수 있다. S1 지도작성에 사용하기 위한 프로브 DNA를 제조하기 위해, 전술한 cDNA의 센스 가닥을 주형으로 사용하여 표지된 안티센스 DNA를 합성한다. 안티센스 DNA는 적합한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 분해시켜 목적하는 길이의 추가 DNA 프로브를 생성시킬 수 있다. 그러한 안티센스 프로브는 표적 mRNA(즉, CKβ-15 단백질을 암호화하는 mRNA)에 상응하는 보호된 밴드를 가시화하는 데에 유용하다. 노던 블롯 분석은 상기한 바와 같이 실시할 수 있다.

CKβ-15 단백질을 암호화하는 mRNA의 레벨은 문헌[Makino 등, Technique 2:295-301(1990)]에 기재된 RT-PCR 방법을 사용하여 분석하는 것이 바람직하다. 이 방법에 의해, 폴리아크릴아미드 겔 밴드내 "앰플리콘"의 방사능은 표적 mRNA의 초기 농도와 선형으로 관련된다. 간단히 언급하면, 상기 방법은 RT 프라이머 및 적합한 완충액을 함유하는 반응 혼합물에서 생물학적 샘플로부터 분리된 전체 RNA를 첨가하는 것을 포함한다. 프라이머 어닐링을 위해 항온처리한 후, 혼합물은 RT 완충액, dNTP, DTT, RNase 억제제 및 역전사효소로 보충할 수 있다. RNA의 역전사를 수행하기 위해 항온처리한 후, 표지된 프라이머를 사용하여 RT 생성물을 PCR에 적용시킨다. 한편, 프라이머를 표지하기 보다는 표지된 dNTP를 PCR 반응 혼합물에 포함시킬 수 있다. 통상의 기술에 따라 DNA 열 사이클러에서 PCR 증폭을 실시할 수 있다. 증폭을 수행하기 위한 적합한 주기후에, PCR 반응 혼합물을 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동한다. 겔을 건조시킨 후, 적합한 밴드(CKβ-15 단백질을 암호화하는 mRNA에 상응함)의 방사능을 이미지 형성 분석기를 사용하여 정량분석하였다. RT 및 PCR 반응 성분 및 조건, 시약 및 겔 농도, 및 표지 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. RT-PCR 방법에 대한 변형은 당업자에게는 자명한 사항이다.

역전사된 표적 mRNA를 증폭시키는 임의의 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있고, 상기 부분에서 설명한 바와 같이 디자인할 수 있다.

생물학적 샘플내 CKβ-15 단백질 레벨의 분석은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 생물학적 샘플내 CKβ-15 단백질 레벨의 분석에는 항체계 기술이 바람직하다. 예를 들면, 조직내 CKβ-15 단백질 발현은 고전적인 면역조직학적 방법으로 연구할 수 있다. 이 경우에, 1차 항체(다클론 또는 단일클론)에 의해 특이적 인지가 제공되나, 2차 검출 시스템은 형광, 효소 또는 기타 접합된 2차 항체를 이용할 수 있다. 결과적으로, 병리학적 검사를 위한 조직 단편의 면역조직학적 염색이 얻어진다. 조직은 웨스턴-블롯 또는 점/슬롯 분석을 위해 CKβ-15 단백질의 방출하도록 요소 또는 중성 세제를 사용하여 추출할 수도 있다(Jalkanen, M. 등, J. Cell. Biol. 101:976-985(1985); Jalkanen, M. 등, J. Cell. Biol. 105:3087-3096(1987)). 양이온성 고체상의 사용에 근거한 이 기술에서는, CKβ-15 단백질의 정량 분석은 표준으로서 분리된 CKβ-15 단백질을 사용하여 수행할 수 있다. 이 기술은 또한 체액에도 적용할 수 있다. 이들 샘플을 사용하여, CKβ-15 단백질의 몰 농도는 혈청, 혈장, 뇨, 활액, 척수액 등과 같은 상이한 체액에 대한 CKβ-15 단백질 함량의 표준값을 설정하는 것을 보조한다. CKβ-15 단백질 양의 정상적인 외관은 건강한 개인의 값을 사용하여 설정할 수 있고, 이 값은 시험 대상에게서 얻은 것과 비교할 수 있다.

CKβ-15 단백질의 검출에 유용한 기타 항체계 방법으로는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사성면역분석(RIA)과 같은 면역분석법이 있다. 예를 들면, CKβ-15 단백질 특이적인 단일클론 항체는 면역흡착제로서 및 CKβ-15 단백질을 검출하고 정량분석하는 효소 표지된 프로브로서 사용할 수 있다. 샘플에 존재하는 CKβ-15 단백질의 양은 선형 회귀 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 표준 제제에 존재하는 양을 기준으로 계산할 수 있다. 종양 항원을 검출하는 그러한 ELISA는 문헌[Iacobelli 등, Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30(1988)]에 기재되어 있다. 또 다른 ELISA 분석에서는, 두 개의 별개의 특이 단일클론 항체를 사용하여 체액내 CKβ-15 단백질을 검출할 수 있다. 이 분석에서는, 항체중 하나는 면역흡착제로서, 다른 하나는 효소 표지된 프로브로서 사용한다.

상기 기술은 본질적으로 "1 단계" 분석법 또는 "2 단계" 분석법으로 수행할 수 있다. "1 단계" 분석법은 CKβ-15 단백질을 고정화된 항체와 접촉시키고, 세척 단계 없이 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키는 것으로 이루어진다. "2 단계" 분석법은 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키기 전에 세척 단계를 포함한다. 기타 통상의 방법을 적절하게 이용할 수도 있다. 분석 시스템의 하나의 성분을 지지체에 고정화하여 시스템의 다른 성분이 그 성분과 접촉되게 하고 샘플로부터 용이하게 제거되도록 하는 것이 보통 바람직하다.

적합한 효소 표지의 예로는 기질과 반응하여 과산화수소를 생산하는 반응을 촉매하는 옥시다제 군의 것이 있다. 글루코스 옥시다제가 특히 바람직한데, 왜냐하면, 그것이 양호한 안정성을 가지며 그 기질(글루코스)을 용이하게 이용할 수 있기 때문이다. 옥시다제 표지의 활성은 효소 표지된 항체/기질 반응에 의해 형성된 과산화수소의 농도를 측정함으로써 분석할 수 있다. 효소 외에도, 기타 적합한 표지로는 요오드(¹²⁵I,¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 트리튬(³H), 인듐(¹¹²In) 및 테크네튬(^99mTc)과 같은 방사성 동위원소, 및 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광성 표지, 및 비오틴이 있다.

개인으로부터 얻은 생물학적 샘플내 CKβ-15 단백질 레벨을 분석하는 것 외에도, CKβ-15 단백질은 이미지 형성 방법에 의해 생체내에서 검출할 수도 있다. CKβ-15 단백질의 생체내 이미지 형성용의 항체 표지 또는 마커로는 X-선 촬영법, NMR 또는 ESR에 검출가능한 것들이 있다. X-선 촬영법의 경우, 적합한 표지로는 검출가능한 방사선을 방출하지만 피검체에는 명백하게 무해한 바륨 또는 세슘과 같은 방사성 동위원소가 있다. NMR 및 ESR용으로 적합한 마커로는 관련 하이브리도마에 대한 영양물의 표지에 의해 항체내로 혼입될 수 있고, 중수소와 같은 검출가능한 특징적인 스핀이 있는 것들이 있다.

적합한 검출가능한 이미지 형성부, 예를 들면 방사성 동위원소(예;¹³¹I,¹¹²In,^99mTc), 방사선-불투과 물질 또는 핵 자기 공명에 의해 검출가능한 재료로 표지된 CKβ-15 단백질 특이 항체 또는 항체 부분을 포유동물내로 도입하여(예; 비경구, 피하 또는 복강내로) 흉선 질환을 검사한다. 사용된 피검체의 크기 및 이미지 형성 시스템이 진단적 이미지를 생성시키는 데 필요한 이미지 형성부의 양을 결정한다는 것은 당해 분야에서는 이해되는 사항이다. 방사성 동위원소부의 경우에, 인간의 경우에는 주사된 방사능의 양은 정상적으로는^99mTc 약 5 밀리큐리 내지 20 밀리큐리의 범위이다. 표지된 항체 또는 항체부는 CKβ-15 단백질을 함유하는 세포의 위치에서 우선적으로 축적될 것이다. 생체내 종양 이미지 형성 방법은 문헌[S.W. Burchiel 등, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Portions"(Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes 편집, 매슨 퍼블리싱 인코포레이티드(1982)]에 기재되어 있다.

본 발명에 사용하기 위한 CKβ-15 단백질 특이 항체는 천연 CKβ-15 단백질 또는 그 항원성 폴리펩티드 부분에 대해 형성될 수 있는데, 이것은 알부민과 같은 캐리어 단백질과 함께 동물 시스템(예; 토끼 또는 마우스)에 제공될 수 있고, 또는 그것이 충분히 길다면(약 25개 이상의 아미노산) 캐리어 없이 제공될 수 있다.

본원에 사용된 "항체"(Ab) 또는 "단일클론 항체"(Mab)란 용어는 CKβ-15 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 부분(예; Fab 및 F(ab')₂부분) 뿐만 아니라 천연 분자를 포함하는 용어이다. Fab 및 F(ab')₂부분은 순환계로부터 보다 신속히 제거되는 천연 항체의 Fc 부분이 결핍되어 있고, 천연 항체의 덜 비특이적인 조직 결합을 가질 수 있다(Wahl 등, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). 따라서, 이들 부분이 바람직하다.

본 발명의 항체는 다양한 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, CKβ-15 단백질 또는 그 항원성 부분을 발현시키는 세포를 동물에 투여하여 다클론 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 바람직한 방법에서는, CKβ-15 단백질 제제가 제조되고 상기한 바와 같이 정제되어 천연 오염물질이 거의 없도록 만든다. 그러한 제제는 동물내로 투여하여 보다 높은 특이 활성을 가진 다클론 항혈청을 생산한다.

가장 바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체(또는 그 CKβ-15 결합 부분)이다. 그러한 단일클론 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조할 수 있다(Kohler 등, Nature 256:495(1975); Kohler 등, Eur. J. Immunol. 6:511(1976); Kohler 등, Eur. J. Immunol. 6:292(1976); Hammerling 등, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 엘세비어, 뉴욕, 563-681면 (1981)). 일반적으로, 그러한 절차는 동물(바람직하게는 마우스)을 CKβ-15 단백질 항원 또는 보다 바람직하게는 CKβ-15 단백질 발현 세포로 면역화시키는 것을 포함한다. 적합한 세포는 그들이 항-CKβ-15 단백질 항체에 결합하는 능력에 의해 인지할 수 있다. 그러한 세포는 임의의 적합한 조직 배양 배지에서 배양할 수 있지만, 10% 소 태내 혈청(약 56℃에서 불활성화됨)으로 보충되고, 약 10㎍/l의 비필수 아미노산, 약 1,000U/㎖의 페니실린 및 약 100㎍/㎖의 스트렙토마이신으로 보충된 얼(Earle)의 변형된 이글(Eagle) 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 그러한 마우스의 비장세포를 추출하고 적합한 골수종 세포주와 융합한다. 임의의 적합한 골수종 세포주를 본 발명에 따라 이용할 수 있으나, 매릴랜드주 록빌 소재의 미국 모식균 배양 수집소에서 입수가능한 모골수종 세포주(SP₂O)를 이용하는 것이 바람직하다. 융합후, 생성된 하이브리도마 세포는 HAT 배지에서 선택적으로 배양한 다음 문헌[Wands 등, Gastroenterology 80:225-232(1981)]에 기술된 제한 희석법으로 클로닝하였다. 그러한 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포를 분석하여 CKβ-15 항원에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.

한편, CKβ-15 단백질 항원에 결합할 수 있는 추가의 항체는 항-이디오타입 항체를 사용하여 2 단계 방법을 제조할 수 있다. 그러한 방법은 항체들이 그 스스로 항원이며, 따라서 제2 항체에 결합하는 항체를 얻을 수 있다는 사실을 이용한다. 이 방법에 따르면, CKβ-15 단백질 특이적인 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화한다. 그러한 동물의 비장 세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 생산하고, 하이브리도마 세포를 스크리닝하여, 그것이 CKβ-15 단백질 특이 항체에 결합하는 능력이 CKβ-15 단백질 항원에 의해 차단될 수 있는 항체를 생산하는 클론을 동정한다. 그러한 항체는 CKβ-15 단백질 특이 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 포함하는 것으로서, 그것을 사용하여 동물을 면역화하여 추가의 CKβ-15 단백질 특이 항체의 형성을 유도할 수 있다.

본 발명의 항체의 Fab 및 F(ab')₂및 기타 부분을 본원에 개시된 방법에 따라 사용할 수 있음은 이해될 것이다. 그러한 부분은 통상 파파인(Fab 부를 생성시킴) 또는 펩신(F(ab')₂부분을 생성시킴)과 같은 효소를 사용하여 단백질 분해성 절단에 의해 생성된다. 한편, CKβ-15 단백질 결합 부분은 재조합 DNA 기술의 응용 또는 합성 화학을 통해 생성될 수 있다.

생체내 이미지 형성법을 사용하여 인간에서의 진단용으로 CKβ-15 단백질의 증가된 레벨을 검출하고자 하는 경우에, "인간화된" 키메라 단일클론 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 항체는 전술한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포에서 유래한 유전자 구성체를 사용하여 제조될 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(참조문헌의 예; Morrison, Science 229:1202(1985); Oi 등, BioTechniques 4:214(1986); Cabilly 등, 미국 특허 제4,816,567호; Taniguchi 등, EP 171496호; Morrison 등, EP 173494호; Neuberger 등, WO 8601533호; Robinson 등, WO 8702671호; Boulianne 등, Nature 312:643(1984); Neuberger 등, Nature 314:268(1985)).

본 발명의 CKβ-15 단백질 특이 항체에 적합한 추가의 표지로는 하기하는 것들이 있다. 적합한 효소 표지의 예로는 말레이트 디히드로게나제, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알코올 디히드로게나제, 알파-글리세롤 포스페이트 디히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스터라제가 있다.

적합한 방사성 동위원소 표지의 예로는³H,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I,³²P,³⁵S,¹⁴C,⁵¹Cr,⁵⁷To,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁷⁵Se,¹⁵²Eu,⁹⁰Y,⁶⁷Cu,²¹⁷Ci,²¹¹At,²¹²Pb,⁴⁷Sc,¹⁰⁹Pd 등이 있다.¹¹¹In은 간에 의한¹²⁵I 또는¹³¹I- 표지된 단일클론 항체의 탈할로겐화 문제를 피하기 때문에 생체내 이미지 형성을 사용하는 경우에 바람직한 아이소타입이다. 또한, 이러한 방사성 뉴클레오티드는 이미지 형성을 위한 보다 양호한 감마 방출 에너지를 가진다(Perkins 등, Eur. J. Nucl. Med. 10:296-301 (1985); Carasquillo 등, J. Nucl. Med. 28:281-287 (1987)). 예를 들면, 1-(P-이소티오시아나토벤질)-DPTA로 단일클론 항체에 연결된¹¹¹In은 비종양성 조직, 특히 간에서 거의 흡수되지 않으며, 따라서 종양 국부화의 특이성을 증가시킨다(Esteban 등, J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).

적합한 비-방사성 동위원소 표지의 예로는¹⁵⁷Gd,⁵⁵Mn,¹⁶²Dy,⁵²Tr 및⁵⁶Fe를 들 수 있다.

적합한 형광 표지의 예로는¹⁵²Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, o-프탈데히드 표지 및 플루오레스카민 표지를 들 수 있다.

적합한 독소 표지의 예로는 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소를 들 수 있다.

화학 발광성 표지의 예로는 루민 표지, 이소루민 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라제 표지 및 아쿠오린 표지를 들 수 있다.

핵 자기 공명 대조제의 예로는 Gd, Mn 및 Fe와 같은 중금속 핵을 들 수 있다.

상기한 표지들을 항체에 결합시키기 위한 전형적인 기법들은 문헌[참조: Kennedy 등, Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1976); Schurs 등, Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1977)]에 기재되어 있다. 상기 Schurs 등의 문헌에 기재된 커플링 기법들은 글루타르알데히드법, 페리오데이트법, 디말레이미드법, m-말레이미도벤질-N-히드록시-석신이미드 에스테르법이며, 이들은 모두 본 명세서에 참고 인용한 것이다.

염색체 분석

또한, 본 발명의 핵산 분자는 염색체 동정에도 유용하다. 상기 서열은 개별적인 인간 염색체상의 특정 위치에 특이적으로 표적화하고, 하이브리드화한다. 게다가, 염색체 상의 특정 위치를 동정하기 위해 필요성이 계속적으로 있어왔다. 현재, 염색체 위치를 표시하기 위해 이용할 수 있는 실질적인 서열 자료(반복 다형성)에 기초한 염색체 표시 시약은 거의 없다. 본 발명에 따른 염색체에 대한 DNA의 지도화는 질병에 관련된 유전자와 이들 서열간의 상호관계에서 중요한 첫 단계이다.

이러한 관점의 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에서 개시한 cDNA는 CKβ-15 단백질 유전자의 게놈 DNA를 클로닝하는데 사용된다. 이는 널리 공지된 기법과 일반적으로 시판되는 라이브러리를 이용하여 수행할 수 있다. 이어서, 게놈 DNA는 이 목적으로 널리 공지된 기법을 이용하여 동위치 염색체 지도화를 위해 사용된다. 전형적으로, 염색체 지도화의 일반적인 기법에 따라 양호한 동위치 하이브리드화 신호를 부여하는 게놈성 프로브를 동정하기 위해 몇몇 시행착오가 필요할 수 있다.

또한, 몇몇 경우에, 서열은 cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15-25 bp)를 제조하므로써 염색체에 대해 지도화할 수 있다. 유전자의 3' 비해독 영역의 컴퓨터 분석을 이용하여 게놈 DNA의 하나 이상의 엑손에 걸치지 않는 프라이머를 신속하게 선택되는데, 이로써 증폭 과정은 복잡해진다. 이어서, 이들 프라이머는 개별적인 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용된다. 단지 상기 프라이머에 상응하는 인간 유전자를 함유하는 이들 하이브리드만 증폭된 부분을 산출할 것이다.

체세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정 염색체에 특정 DNA를 할당하는 신속한 작업이다. 동일한 올리고뉴클레오티드와 함께 본 발명을 이용하므로써, 하부정위는 특정 염색체의 부분의 패널 또는 유사한 방식으로 큰 게놈 클론의 푸울로 성취할 수 있다. 그 염색체에 대한 지도화를 위해 유사하게 사용할 수 있는 기타 지도화 기법으로는 동위치 하이브리드화, 표지된 흐름-분류된 염색체를 이용하는 예비스크리닝 및 염색체 특이성 cDNA 라이브러리를 구성하는 하이브리드화에 의한 예비선택이 있다.

중기 염색체 스프레드에 대한 cDNA 클론의 형광 동위치 하이브리드화("FISH")를 이용하여 한 단계로 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 이 기법은 cDNA로부터 취한 50 또는 60 bp 만큼 짧은 프로브로 이용할 수 있다. 이 기법에 대한 설명은 문헌[참조: Verma 등, HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, 페르가몬 인쇄, 뉴욕 (1988)]에 기재되어 있다.

일단 정확한 염색체 위치에 대해 서열이 지도화되면, 상기 염색체 상에서 이 서열의 물리적 부분은 유전 지도 데이터와 상호 관련된다. 예를 들어, 이러한 데이터는 존스 홉킨스 유니버시티, 웰치 메디칼 라이브러리를 통해 온라인으로 이용할 수 있는 V. McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN 에서 확인된다. 이어서, 동일한 염색체 영역에 대해 지도화되어온 유전자와 질병간의 관계는 연결 분석(물리적으로 인접한 유전자의 동시 유전)을 통해 확인된다.

이어서, cDNA 또는 게놈 서열에서 영향받은 개체와 영향받지 않은 개체간의 차이를 결정한다. 임의의 정상적인 개체가 아닌 영향받은 개체 일부 또는 모두에서 돌연변이가 관찰되는 경우, 그 돌연변이는 질병의 원인일 것이다.

물리적인 지도화 및 유전적 지도화의 현재 해상도 때문에, 질병과 관련된 염색체 영역에 정확히 위치한 cDNA는 50 내지 500개의 가능한 원인제중 하나일 수 있다(이는 1 메가베이스 지도화 해상도와 20 kb 당 한 유전자를 추정한다).

흉선-관련된 질환의 치료

상기한 바와 같이, 기타 공지된 CC 시토킨과는 달리 CKβ-15는 단지 흉선 내에서만 발현되는 것으로 생각되어 왔다. 따라서, CKβ-15는 흉선 내의 단핵구, 특히 초기 흉선 세포의 활성, 예를 들어 "CKβ-15 활성을 가진 폴리펩티드"의 기재와 관련된 상기한 바와 같은 활성을 조절하는데 특히 활성이 있다. 흉선 세포 활성이 CKβ-15에 의해 조절되기 때문에, 표준 또는 "정상적인" 수준과 비교된 개체 내에서 CKβ-15의 실질적으로 변경된(증가 또는 감소된) 발현 수준은 흉선-관련된 질환과 관련하여 상기한 바와 같은 병리학적 증상을 제공하는 것은 용이하게 파악된다. 또한, CKβ-15 단백질(특히 성숙된 형태)이 외인성 소스로부터 세포로 첨가되는 경우, CKβ-15를 발현하는 세포로부터 성숙된 단백질의 분비에 적합한 리더 서열과 함께 발현되기 때문에, 이 단백질은 상기 개체에서 그의 임의의 표적 세포에 대한 그의 조절 활성을 발휘할 것이라는 것을 당업자에게는 명백할 것이다. 따라서, 개체 내에서 CKβ-15 활성이 표준 또는 정상적인 수준보다 감소되므로써 발병되는 증상, 특히 흉선의 장애는 CKβ-15 단백질을 투여하므로써 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CKβ-15 활성의 증가된 수준을 필요로하는 개체의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 개체에 본 발명의 분리된 CKβ-15 폴리펩티드, 특히 본 발명의 CKβ-15 단백질의 성숙된 형태를 상기 개체에서 CKβ-15 활성 수준을 증가시키기에 유효한 양으로 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

또한, CKβ-15 단백질은, 개체에 투여시, 골수 세포 증식을 억제하기 때문에, 본 발명은 개체에서 골수 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 골수억제량의 CKβ-15를 단독으로 또는 대식세포 염증성 단백질-1α(MIP-1α), 대식세포 염증성 단백질-2α(MIP-2α), 혈소판 인자 4(PF 4), 인터류킨-8(IL-8), 대식세포 주화성 및 활성 인자(MCAF) 및 대식세포 염증성 단백질-관련 단백질-2(MRP-2)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 케모카인과 함께 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 골수 억제성 조성물은 골수보호 효과를 제공하며, 골수 세포에 유해한 영향을 끼치는 치료법과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 골수억제성 조성물은 느린-순환 상태에서 골수 세포에 위치하기 때문에, 예를 들어 방사선 요법 또는 세포-주기 활성 약물, 예를 들어 시토신 아라비노시드 및 히드록시우레아를 이용하는 화학요법에 의한 세포 손상에 대한 보호를 제공한다.

또한, 본 발명의 골수억제성 약학 조성물은 과증식성 골수 세포 상태를 유발시키는 백혈병의 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 백혈병을 치료하는 방법을 더 제공하는데, 이 방법은 백혈병 환자에게 골수억제량의 CKβ-15를 단독으로 투여하거나 또는 MIP-1α, MIP-2α, PF4, IL-8, MCAF 및 MRP-2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 케모카인과 함께 투여하는 단계를 포함한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "골수 세포 증식을 억제하는"은 느린-순환 주기에서 골수 세포의 세포 증식을 감소시키고/거나 골수 세포의 백분율을 증가시킨다는 의미이다. 상기한 바와 같이, "개체"는 포유류, 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 발명의 골수억제성 조성물과 아세토니트릴(ACN)의 예비배양은 골수 후대 세포의 억제를 위해 이들 케모카인의 특이 활성을 현저히 증강시킨다. 따라서, 투여 전에 본 발명의 골수억제성 조성물은 문헌[참조: Broxmeyer H. E. 등, Ann-Hematol. 71(5): 235-46 (1995) 및 PCT 공보 WO 94/13321; 모두 본 명세서에 참고 인용함]에 기재된 바와 같이 ACN으로 예비처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 골수억제성 조성물은 여러 가지 화학 치료제, 예를 들어 질소 머스타드, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 알킬 설포네이트, 니트로수크로즈 및 트리아젠과 같은 알킬화제; 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 특히 플루오로우라실 및 시토신 아라비노사이드 및 퓨린 유사체와 같은 항대사물질; 빈카 알칼로이드, 에피도필로톡신, 항생제, 효소 및 생물학적 반응 조절자와 같은 천연 생성물; 및 백금 배위 착물, 안트라세네디온, 히드록시우레아와 같은 치환된 우레아, 메틸 히드라진 유도체 및 아드레노코르티코이드 억제제와 같은 기타 생성물을 포함하는 여러 가지 화학치료제와 함께 사용할 수 있다.

화학치료제는 공지된 기법에 따른 공지된 농도로 투여할 수 있다. 본 발명의 골수억제성 조성물은 화학치료제와 동시 투여하거나, 별도로 투여할 수 있으며, 화학치료제를 투여하기 전 또는 투여한 후에 투여할 수 있다.

특정 케모카인, 예를 들어 MIP-1β, MIP-2β 및 GRO-α는 본 발명의 골수억제성 조성물의 골수 억제성 효과를 억제(적어도 부분적으로 차단)한다. 따라서, 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 골수억제를 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 포유류를 골수억제제 CKβ-15 단독 또는 CKβ-15와 함께 MIP-1α, MIP-2α, PF4, IL-8, MCAF 및 MRP-2중 하나 이상에 노출시키기 이전에 MIP-1β, MIP-2β 및 GRO-α로 구성되는 군으로부터 선택된 골수억제성 억제제의 유효량을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.

당업자는 CKβ-15 활성의 증가된 수준을 필요로 하는 개체를 치료하기 위한 CKβ-15 폴리펩티드의 유효량(골수억제제 또는 골수억제성 억제제를 이용하거나 이용하지 않는 골수억제에 유효한 CKβ-15 폴리펩티드의 양을 포함함)은, CKβ-15의 투여가 표시되는 경우, 각각의 증상에 대해 실험적으로 결정할 수 있을 것이다. CKβ-15 활성을 갖는 폴리펩티드는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 약학 조성물로 투여할 수 있다. 인간 환자에게 투여하는 경우, 본 발명의 약학 조성물의 일일 총 투여량은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 치료의사에 의해 결정될 것이다. 임의의 특정 환자에 대해 치료학적 특정 유효량은 여러 가지 요인에 의해 결정되는데, 그 요인의 예로는 획득하려는 반응의 종류와 정도; 필요한 경우 기타 제제가 사용되는 특정 조성물; 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비 속도; 치료의 지속시간; 특정 조성물과 연합하거나 함께 사용되는 약물(예를 들어, 화학치료제); 및 의학계에 널리 공지된 기타 요인을 들 수 있다.

예를 들어, 1회 투여시 또는 일일 2 내지 4회 분할 투여시 약 0.05 내지 10 mg/kg/일, 바람직하게는 0.1 내지 7.5 mg/kg/일, 더 바람직하게는 0.1 내지 2 mg/kg/일의 투여량으로 CKβ-15 활성을 보유하는 폴리펩티드를 경구 투여하므로써 만족스러운 결과를 얻을 수 있다. 비경구 투여시, 예를 들어 점적 또는 주입 투여시, 약 0.01 내지 5 mg/kg/일, 바람직하게는 0.05 내지 1.0 mg/kg/일, 더 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/kg/일의 투여량이 사용될 수 있다. 따라서, 환자를 위해 적합한 일일 투여량은 약 2.5 내지 500 mg(경구), 바람직하게는 5 내지 250 mg(경구), 더 바람직하게는 5 내지 100 mg(경구) 또는 약 0.5 내지 250 mg(정맥내), 바람직하게는 2.5 내지 125 mg(정맥내), 더 바람직하게는 2.5 내지 50 mg(정맥내)이다.

또한 투여량은 예를 들어, RIA 기법에 의해 결정된 바와 같이, 혈액 내에서 CKβ-15 활성의 기설정된 농도를 제공하기 위해 환자 특이성 방식으로 조정할 수 있다. 따라서, 환자에 대한 투여량은 RIA에 의해 측정된 바와 같이 규칙적인 진행중인 구(trough) 혈액 수준을 획득하기 위해 약 50 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 150 내지 500 ng/ml으로 조정할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장내, 비경구, 조내, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 점적 또는 경피용 패치), 비강내 투여하거나 경구 또는 코 스프레이를 이용하여 투여할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 임의 형태의 제제화용 보조제를 의미한다. 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복막내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 모드를 의미한다.

경구 투여를 위한 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유탁액 뿐만 아니라 사용 직전에 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 분말을 포함한다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜등), 카르복시메틸셀룰로즈 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 기름(예를 들어, 올리브유) 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레이트를 들 수 있다. 적합한 유동성은 레시틴과 같은 코팅재의 이용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제를 이용하는 방법으로 유지할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 보조제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 미생물 작용의 억제는 여러 가지 항균제 또는 항진균제를 포함시키므로써 보장되는데, 이러한 항균제 또는 항진균제의 예로는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브 등을 들 수 있다. 또한, 등장제, 예를 들어 설탕, 염화 나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시키므로써 달성할 수 있다.

몇몇 경우, 약학 조성물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로 약물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 수용해도가 불량한 결정성 또는 비정질 재료를 이용하여 수행할 수 있다. 약물의 흡수 속도는 결정 크기 및 결정 형태에 의존할 수 있는 그의 용해 속도에 의존한다. 별법으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 오일 비히클 내에 상기 약물을 용해시키거나 현탁시키므로써 수행할 수 있다.

주사 가능한 디포트(depot) 형태는 폴리악티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체내에 상기 약물의 미세캡슐화된 매트릭스를 형성하므로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비 및 사용된 특정 중합체의 특성에 따라, 약물 방출 속도를 조절할 수 있다. 기타 생분해 가능한 중합체의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(안하이드라이드)를 들 수 있다. 또한, 디포트 주사용 제제는 상기 약물을 체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼내에 포획시키므로써 제조할 수 있다.

주사 가능한 제제는 예를 들어, 박테리아-유지 필터를 통한 여과, 또는 사용 직전에 멸균수 또는 기타 멸균 주사 가능한 매체 내에 용해 또는 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입시키므로써 멸균할 수 있다.

경구 투여를 위한 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여 형태에 있어서, 활성 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체, 예를 들어 시트르산 나트륨 또는 인산 디칼슘 및/또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토즈, 수크로즈, 글루코즈, 만니톨 및 실릭산, (b) 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로즈, 알기네이트, 겔라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로즈 및 아카시아, (c) 글리세롤과 같은 습윤제(humectant), (d) 붕해제, 예를 들어 한천-한천, 칼슘 카르보네이트, 감자 전분 또는 타피오카 전분, 알긴산, 임의의 실리케이트 및 나트륨 카르보네이트, (e) 파라핀과 같은 용해 지연제, (f) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 가속제, (g) 습윤제(wetting agent), 예를 들어 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, (h) 카올린과 벤토나이트 점토와 같은 흡수제 및 (i) 윤활제, 예를 들어 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 투여 형태는 완충체를 포함할 수도 있다.

또한, 유사한 형태의 고체 조성물은 락토즈 또는 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜등과 같은 부형제를 이용하는 연질 및 경질 충전된 겔라틴 캡슐 내에서 충전재로서 사용할 수 있다.

고체 투여 형태인 정제, 드라기스, 캡슐, 알약 및 과립은 장용피 및 기타 제약 업계에 공지된 코팅물과 같은 코팅물 및 쉘을 이용하여 제조할 수 있다. 이들은 임의로 불투명제를 함유할 수 있으며, 장관의 특정 부분에서 임의의 지연된 방식으로 활성 성분(들)만을 또는 활성 성분(들)을 우선적으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용할 수 있는 매립형 조성물의 예로는 중합체 물질 및 왁스를 들 수 있다.

또한, 활성 화합물은 미세캡슐화된 형태일 수 있으며, 필요에 따라 상기한 부형제를 하나 이상을 포함한다.

경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물 이외에, 상기 액체 투여 형태는 당업계에서 통상 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 기타 용매, 용해체 및 유화제, 예를 들어 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일(특히. 목화씨, 괴경, 옥수수, 배아, 올리브, 캐스터 및 참깨 기름), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이의 혼합물과 같은 유화제를 포함할 수 있다.

불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 향미제 및 방향제를 포함할 수 있다.

현탁액은 활성 화합물 이외에 현탁제, 예를 들어 에톡실화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에티렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로즈, 알루미늄 메타히드록사이드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트리가칸스 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

또한, 활성 화합물은 리포좀의 형태로 투여할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 기타 지질 물질로부터 유도된다. 리포좀은 수성 매질 내에서 분산되는 일층 또는 다층 수화된 액체 결정으로 형성된다. 임의의 비독성이고, 생리학적으로 허용가능하고, 대사가능하며 리포좀을 형성할 수 있는 임의의 지질을 사용할 수 있다. 리포좀 형태내 본 발명의 조성물은 약제 또는 억제제 외에도, 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜레이트(레시틴)이며, 이는 천연이어도 합성이어도 무방하다. 리포좀을 형성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다[참조: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volumn XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976) p 33].

지금까지 본 발명은 일반적으로 기술하였으며, 하기 실시예에 의해서 더 용이하게 이해될 것이다. 하기 실시예은 단시 예를 목적으로 기술하는 것이며, 본 발명의 범위를 이 실시예만으로 제한하려는 의도는 없다.

실시예 1: 이. 콜리 내에서 CKβ-15의 발현 및 정제

기탁된 cDNA 클론에서 성숙 CKβ-15를 암호화하는 DNA 서열은 CKβ-15 단백질의 아미노 말단 서열과 상기 유전자에 대한 벡터 서열 3'에 특이적인 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 클로닝을 용이하게 하기 위해 제한 부위를 함유하는 추가 서열은 5' 및 3' 서열에 각각 첨가하였다.

5' 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 5' GCC GTC GAC GTC CAC ACC CAA GGT GTC 3'[서열 번호 4]을 보유하며, 이때 상기 밑줄친 서열은 SalI 제한 부위이며, 상기 서열은 신호 펩티드 직후에서 시작하는 도 1[서열 번호 1]의 CKβ-15 단백질 코딩 서열의 18 뉴클레오티드를 암호화한다.

3' 프라이머는 서열 5' GCC TCT AGA GGA GCC CAG AAA TGA GCC GGC 3'[서열 번호 5]를 보유하는데, 이때 상기 밑줄친 서열은 XbaI 제한 부위를 나타내며, 그 뒤로 21개의 서열은 도 1의 CKβ-15 단백질 코딩 서열 직후의 최종 21개 뉴클레오티드에 상보적이다.

제한 부위는 이들 실시예에서 박테리아 발현을 위해 사용되는 박테리아 발현 벡터 pD10(pQE9) 내의 제한 효소 부위에 가깝다(미국 캘리포니아 91311, 캐츠워스, 이톤 애비뉴 9259에 소재하는 퀴아젠 인코포레이티드). [pD10]pQE9는 앰피실린 항생제 내성("Amp^r")을 암호화하며, 박테리아 복제 원점("ori"), IPTG 유도성 프로모터, 리보좀 결합 위치("RBS"), 6-His 표지 및 제한 효소 부위를 함유한다.

증폭된 CKβ-15 단백질 DNA 및 벡터 pQE9는 둘다 SalI 및 분해된 DNA는 서로 연결시켰다. 제한된 pQE9 내로의 CKβ-15 단백질 DNA의 삽입은 상기 벡터의 IPTG 유도성 프로모터의 하류 CKβ-15 단백질 코딩 영역에 위치하며, 상기 벡터의 IPTG 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되며, CKβ-15 단백질의 해독을 위해 적절히 위치된 개시 AUG와 함께 프레임 내에 위치하였다.

연결 혼합물은 표준 방법을 이용하여 번식가능한 이. 콜리 내로 형질전환시켰다[참조: Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2판: 콜드 스프링 하버 레보레토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕 (1989)]. lac 리프레서를 발현시키고, 카나마이신 내성("Kan")을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다수의 카피를 함유하는 이. 콜리 균주 M15/rep는 본 명세서에 기재한 예시예를 수행하는데 사용하였다. CKβ-15 단백질을 발현하기에 적합한 다수의 균주중 하나에 불과한 이 균주는 퀴아젠에서 시판되고 있다.

형질전환체는 앰피실린과 카나마이신의 존재 하에서 LB 평판 상에서 성장할 수 있는 이들의 능력을 확인하였다. 플라스미드 DNA는 내성 콜로니로부터 분리하였으며, 클로닝된 DNA의 실체는 제한 분석으로 확인하였다.

소정의 구성체를 함유하는 클론 앰피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 보충된 LB 배지에서 하룻밤(O/N) 배양하였다.

하룻밤 배양물은 약 1:100 내지 1:250의 희석율로 큰 배양물을 접종시키는데 사용하였다. 이 세포들은 600 nm에서의 광학 밀도가 0.4 내지 0.6 내에서 성장시켰다. 그후, 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드("IPTG")를 첨가하였는데,lacI 리프레서를 불황성화시키므써lac리프레서 민감성 프로모터로부터 전사를 유도하기 위해 최종 농도를 1 mM로 하여 첨가하였다. 이어서 세포는 3 내지 4 시간 동안 추가 항온처리하였다. 이어서, 세포는 표준 방법을 이용하여 원심분리하고, 파괴하였다. 봉입체는 일반적인 방법을 이용하여 파괴된 세포로부터 정제하였으며, 단백질은 상기 봉입체로부터 8 M 우레아내로 용해시켰다. 용해된 단백질을 함유하는 8 M 우레아 용액을 2X 인산염 완충처리된 염수("PBS") 내의 PD-10 칼럼에 통과시키므로써 우레아를 제거하고, 완충액을 교환하고, 단백질을 재폴딩시켰다. 상기 단백질은 내독소를 제거하기 위해 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 이어서, 멸균 여과하였다. 멸균 여과된 단백질 제제는 95 μ/ml의 농도로 2X PBS 내에서 저장하였다.

표준 방법인 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 상기 제제의 분석 결과, 상기 제제는 예상 분자량이 약 16.7 kDa인 약 95%의 단량체 CKβ-15 단백질을 포함하는 것으로 확인되었다.

실시예 2: 바쿨로비루스 발현 시스템 내에서 CKβ-15 단백질의 클로닝 및 발현

기탁된 클론에서 전장 CKβ-15 단백질을 암호화하는 cDNA 서열은 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭하였다:

5' 서열은 5' GCC TCT AGA GCC ATC ATG AAC CTG TGG CTC CTG GCC 3'[서열 번호 6]을 보유하는데, 이때 밑줄친 부분은 XbaI 제한 효소 부위이며, 그 뒤로 21개의 염기는 도 1에서 CKβ-15 단백질의 서열이다. 후술하는 바와 같이 발현 벡터 내로 삽입하는 경우, CKβ-15를 암호화하는 증폭된 단편의 5' 단부는 효율적인 신호 펩티드를 제공하였다. 문헌[참조: Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987)]에 언급되어 있는 바와 같이 진핵 세포 내에서 해독 개시를 위한 효율적인 신호는 구성물의 벡터 부분에 적절히 위치된다.

3' 프라이머는 5' GCC TCT AGA GGA GCC CAG AAA TGA CCC GGC 3'[서열 번호 7]을 보유하는데, 이때 밑줄 친 부분은 XbaI 제한 효소 부위이며, 그 뒤로 도 1에 기술한 CKβ-15 코딩 서열의 최종 21개 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드가 따른다.

증폭된 단편은 시판되는 키트(미국, 캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 바이오 101 인코포레이티드에서 시판되는 "진클린")를 이용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리하였다. 이어서, 단편은 XbaI로 분해하고, 다시 1% 아가로즈 겔 상에서 정제하였다. 이하 이 단편은 F2라 칭한다.

벡터 pA2-GP를 이용하여 문헌[참조: Summers 등, A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, 텍사스 농업 실험국 회보 제1555호 (1987)]에 기술된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 바쿨로비루스 발현 시스템 내에서 CKβ-15 단백질을 발현시켰다. 이 발현 벡터는 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 비루스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터와 그 뒤로 유용한 제한 부위들을 포함한다. N-말단 메티오닌을 포함하는 AcMNPV gp67의 신호 펩티드는 BamHI 부위의 바로 상류에 위치한다. 시미안 비루스 40("SV40")의 폴리아데닐화 위치는 효율적인 아데닐화를 위해 사용하였다. 재조합 비루스의 용이한 선택을 위해, 이. 콜리로부터 베타-갈락토시다제 유전자를 폴리헤드린 프로모터와 동일한 방향으로 삽입하였으며, 그 뒤로 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호가 뒤 따른다. 폴리헤드린 서열은 양 측면에 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 생존 비루스를 생성하기 위한 야생형 비루스 DNA와 함께 세포-매개된 상동성 재조합을 위한 비루스 서열과 인접되어 있다.

다수의 기타 바쿨로비루스 벡터, 예를 들어 pAc373, pVL941 및 pAcIM1이 pA2-GP를 대신하여 사용될 수 있으며, 이들이 필요에 따라 프레임내 AUG와 신호 펩티드와 같이 전사, 해독, 트래픽킹과 같은 적절히 위치된 신호를 제공한다는 것을 당업자에게는 공지된 사실이다. 이러한 벡터는 문헌[참조: Luckow 등, Virology 170: 31-39]에 기재되어 있다.

이 플라스미드는 제한 효소 XbaI으로 분해하고, 이어서 송아지 장 포스파타제와 당업계에 공지된 방법을 이용하여 탈포스포릴화하였다. 이어서, DNA는 시판되는 키트(미국, 캘리포니아 라졸라에 소재하는 바이오 101 인코포레이티드에서 시판되는 "진클린")를 이용하여1% 아가로즈 겔로부터 분리하였다. 이하 이 벡터 DNA는 "V2"라 칭한다.

단편 F2와 탈포스포릴화된 플라스미드 V2는 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결하였다. 이 연결 혼합물을 이용하여 이. 콜리 HB101 세포를 형질전환하고, 배양 평판 상에 도말하였다. XbaI를 이용하여 개별적인 콜로니로부터 DNA를 분해하고, 이어서 겔 전기영동에 의해 분해 생성물을 분석하므로써 박테리아가 인간 CKβ-15 유전자를 보유하는 플라스미드를 함유하는 것을 확인하였다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열 결정법으로 확인하였다. 이하 이 플라스미드는 pBacCKβ-15라 칭한다.

5 ㎍의 상기 플라스미드 pBacCKβ-15는 시판되는 선형화된 바쿨로비루스 DNA(미국, 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 파르밍겐으로부터 시판되는 "바쿨로골드(등록상표)바쿨로비루스 DNA") 1.0 ㎍과 문헌[참조: Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987)]에 기술된 리포펙션법을 이용하여 동시형질감염하였다. 바쿨로골드(등록상표) 비루스 DNA 1 ㎍과 5 ㎍의 플라스미드 pBacCKβ-15를 무혈청 그레이스 배지(미국, 매릴랜드, 게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드) 50 ㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균 웰 내에서 혼합하였다. 그후, 리포펙틴 10 ㎕ + 그레이스 배지 90 ㎕를 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 이어서, 형질감염 혼합물은 무혈청 그레이스 배지 1 ml와 함께 35 mm 조직 배양 평판에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하였다. 평판을 전후로 흔들어서 새로이 첨가된 용액을 혼합하였다. 이어서 이 평판은 27℃에서 5 시간 동안 항온처리하였다. 5 시간후, 상기 형질감염 용액을 평판으로부터 제거하고, 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1 ml을 첨가하였다. 이 평판을 다시 항온처리기에 넣고 27℃에서 4일 동안 배양하였다.

4일후, 상청액을 수집하고, 상기한 Summers와 Smith의 문헌에 기술된 바와 같이 플라크 분석을 수행하였다. "블루 갈"(게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드)을 갖는 아가로즈 겔을 이용하여 푸른색으로 염색된 플라크를 생성하는 갈-발현 클론을 용이하게 동정 및 분리하였다. (또한, 이러한 형태의 "플라크 분석법"에 대한 자세한 설명은 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드에서 배포하는 곤충 세포 배양 및 바쿨로비루스학의 사용자 지침서 9-10면에 기재되어 있다.)

일련의 희석을 수행하고 4일이 경과된 후, 상기 비루스를 상기 세포에 첨가하였다. 적절한 항온처리후, 푸르게 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫의 팁으로 채취하였다. 이어서, 재조합 비루스를 함유하는 한천은 그레이스 배지 200 ㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시켰다. 단순 원심분리를 수행하여 한천을 제거하고, 재조합 바쿨로비루스를 함유하는 상청액을 이용하여 35 mm 접시에 접종된 Sf9 곤충 세포를 감염시켰다. 4일후, 이들 배양 접시의 상청액을 수거한 후, 4℃에서 저장하였다. 적절하게 삽입된 hESSB I, II 및 III을 함유하는 클론은 제한 지도화와 서열결정을 포함하는 DNA 분석으로 동정하였다. 이하 이 클론은 V-CKβ-15라 칭한다.

Sf9 세포는 10% 열-불활성화된 FBS로 보충된 그레이스 배지 내에서 성장시켰다. 상기 세포들은 약 2(약 1 내지 약 3)의 감염다중도("MOI")로 재조합 바쿨로비루스 V-CKβ-15로 감염시켰다. 6시간 후, 상기 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인을 제거한 SF900II 배지(게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드에서 시판됨)로 대체하였다. 42시간후,³⁵S-메티오닌 5 μCi 및³⁵S-시스테인(아메르샴에서 시판됨) 5 μCi를 첨가하였다. 상기 세포들은 16시간 동안 더 항온처리한 후, 원심분리로 수거하고, 용균시키고, 표지된 단백질은 SDS-PAGE 및 자동방사능사진법을 이용하여 시각화하였다.

실시예 3: 포유류 세포(COS)에서의 발현

발현 플라스미드 pCKβ-15 HA는 발현 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐 인코포레이티드에서 입수가능함) 내로 CKβ-15를 암호화하는 cDNA를 클로닝하므로써 제조하였다.

발현 벡터 pcDNAI/amp는 (1) 이. 콜리와 기타 원핵 세포 내에서 증식하기에 효과적인 이. 콜리 복제 원점; (2) 플라스미드-함유 원핵 세포 선택을 위한 앰피실린 내성 유전자; (3) 진핵 세포에서의 증식을 위한 SV40 복제 원점; (4) CMV 프로모터, 폴리링커, SV40 인트론 및 cDNA가 CMV 프로모터의 발현 조절하에 용이하게 위치되고, SV40 인트론에 작동가능하게 연결될 수 있도록 제한 부위에 의해 상기 폴리링커 내에 배열된 폴리아데닐화 신호를 포함한다.

완전한 CKβ-15 전구물질을 암호화하는 DNA 단편 및 프레임 내에서 그의 3' 단부에 융합된 HA 태크는 상기 벡터의 폴리링커 영역 내로 클로닝하므로써 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터에 의해 유도된다. 상기 HA 표지는 문헌[참조: Wilson 등, Cell 37: 767 (1984)]에 기재된 인플루엔자 해마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다. 표적 단백질에 대한 HA 표지의 융합은 HA 에피토프를 인지하는 항체를 이용하는 재조합 단백질의 용이한 검출을 가능하게 한다.

상기 플라스미드 구성 방법은 다음과 같다.

기탁된 클론의 CKβ-15 cDNA는 이. 콜리 내에서 CKβ-15의 발현을 위해 발현 벡터의 구성에 관해 상기한 바와 같은 유용한 제한 부위를 함유하는 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 발현된 CKβ-15의 검출, 정제 및 특정화를 용이하게 하기 위해, 프라이머중 하나는 상기한 바와 같은 헤마글루티닌 표지("HA 표지")를 포함하였다.

적합한 프라이머는 본 실시예에서 사용한 후술하는 프라이머이다. 밑줄친 HindIII 부위, AUG 개시 코돈 및 5' 코딩 영역의 6개의 코돈을 함유하는 5' 프라이머는 하기 서열을 보유한다:

5' GCG AAG CTT ATG AAC CTG TGG CTC CTG GCC 3'[서열 번호 8]

밑줄친 XhoI 부위, 정지 코돈, 이후의 혈구응집소 HA 표지를 형성하는 9개의 코돈 및 3' 암호 서열의 22 bp(3' 단부에서)를 함유하는 3' 프라이머는 하기 서열을 보유한다:

5' GCG CTC GAG TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CAG TCC TGA ATT AGC TGA TAT C 3'[서열 번호 9]

PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터 pcDNAI/Amp는 HindIII와 XhoI로 분해한 후, 연결하였다. 연결 혼합물은 이. 콜리 균주 SURE(미국 캘리포니아 92037, 라졸라, 노스 토레이 파인즈 로드 11099에 소재하는 스트라타진 클로닝 시스템즈에서 시판됨) 내로 형질전환하였으며, 형질전환된 배양물은 차후 앰피실린 내성 콜로니의 성장을 가능하게 하기 위해 항온처리할 앰피실린 배지 평판상에 도말하였다. 플라스미드 DNA는 내성 콜로니로부터 분리하였으며, CBβ-15-암호화 단편의 존재하에서 제한 분석 및 겔 크기 측정으로 분석하였다.

재조합 CKβ-15의 발현을 위해, COS 세포를 상기한 바와 같은 발현 벡터로 형질감염하였으며, 이때 문헌[참조: Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 뉴욕 콜드 스프링 하버의 콜드 스프링 레보레토리 출판 (1989)]에 기재된 바와 같은 DEAE-덱스트란을 이용하였다. 세포들은 상기 벡터에 의한 CKβ-15의 발현을 위한 조건 하에서 항온처리하였다.

CKβ-15 HA 융합 단백질의 발현은 문헌[참조: Harlow 등, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, 2판; 뉴욕 콜드 스프링 하버 콜드 스프링 하버 출판 (1988)]에 기재된 방법을 이용하는 방사성 표지화 및 면역 침전으로 검출하였다. 이를 위해, 형질감염하고 2일이 경과한후, 상기 세포들을³⁵S-시스테인을 함유하는 배지 내에서 8시간 동안 항온처리하므로써 표지하였다. 상기 세포와 배지를 수집하고, 세포들은 세척하고, 세정제-함유 RIPA 완충액으로 용균하였다. 상기 완충액의 구성은 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM 트리스(pH 7.5)이며, 이는 상기 언급한 Wilson 등의 문헌에 기록되어 있다. 단백질은 HA-특이성 모노클로날 항체를 이용하여 세포 용균물과 배양 배지로부터 침전시켰다. 이어서, 침전된 단백질은 SDS-PAGE 겔 및 자동방사능사진법으로 분석하였다. 예상된 크기의 발현 생성물이 세포 용균물로부터 확인되었으며, 음성 대조군에서는 확인되지 않았다.

실시예 4: CKβ-15 단백질 발현의 조직 분포

여러 가지 방법 중에서 상기 언급한 sambrook 등의 문헌에 기재된 방법을 이용하여 노던 블로트 분석을 수행하여 인간 조직에서 CKβ-15 단백질의 발현 수준을 조사하였다. 폴리 A⁺는 클론테크(미국 캘리포니아 94303 팔로알토 이스트 미도우 서클 1020)로부터 구입하였다.

폴리 A⁺RNA 약 1 ㎍은 강한 변성 조건하에서 1% 아가로즈 겔을 통한 전기영동에 의해 크기 용해하였다. RNA는 겔로부터 나일론 필터에 블로팅시키고, 이어서 상기 필터는 검출가능하게 표지된 폴리뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화하기 위해 제조하였다.

CKβ-15 단백질을 암호화하는 mRNA를 검출하기 위한 프로브로서, 기탁된 클론의 cDNA 삽입물의 코딩 영역의 안티센스 스트랜드는 높은 특이 활성으로 표지하였다. cDNA는 스트라타진에서 시판되는 프라임-잇 키트를 이용하는 프라이머 연장에 의해 표지하였다. 반응은 cDNA 50 ng을 이용하여 수행하였는데, 공급자가 제시하는 표준 반응 프로토콜을 이용하였다. 표지된 폴리뉴클레오티드는 미국 콜로라도 80303 보울더 아라파호 로드 5603에 소재하는 5-프라임-3-프라임에서 입수한 셀렉트-G-50 칼럼을 이용하는 칼럼 크로마토크래피로 기타 표지된 반응 성분으로부터 정제하였다.

표지된 프로브는 문헌[참조: Kreider 등, Molecular and Cellular Biology, pp 4846-4853 (1990. 9)]에 기재된 바와 같이, 1,000,000 cpm/ml의 농도로 필터에 하이브리드화하였다. 그후, 프로브 용액은 버리고, 필터는 0.1 x SSC, 0.1% SDS를 이용하여 실온에서 2회, 65℃에서 2회 세척하였다. 이어서, 필터는 건조시키고, 증강 스크린을 이용하여 -70℃에서 하룻밤 필름에 노출시켰다. CKβ-15 cDNA 프로브를 이용하는 전형적인 노던 블로트 분석의 결과는 도 3에 나타냈다.

실시예 5: 인간 CKβ-15 단백질의 유전자 치료적 발현

피부 생체 검사를 수행하여 환자로부터 섬유아세포를 얻었다. 얻은 조직은 조직 배양 배지 내에 위치시키고, 소 단편으로 분리하였다. 작은 조직 덩어리는 조직 배양 플라스크의 젖은 표면에 위치시켰는데, 각각의 플라스크에 약 10개의 단편을 위치시켰다. 이 플라스크는 뒤집고, 완전히 밀봉하고, 실온에서 하룻밤 방치시켰다. 실온에서 24시간후, 상기 플라스크를 다시 뒤집고-조직 덩어리는 플라스크의 바닥에 남아 있는다-새로운 배지(예를 들어, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 햄의 F12배지)를 첨가하였다. 상기 조직은 37℃에서 약 1주일 동안 항온처리하였다. 이때, 새로운 배지를 첨가하고, 계속 며칠 간격으로 배지를 교환하였다. 추가로 2주간 더 배양한 후, 섬유아세포의 단층이 나타났다. 이 단층은 트립신 처리하고, 더 큰 플라스크로 확대시켰다.

유전자 치료법을 위한 벡터는 발현하려는 부분을 클로닝하기 위한 제한 효소로 분해하였다. 분해된 벡터는 송아지 장 포스파타제로 처리하여 자가 연결을 방지하였다. 탈포스포릴화된 선형 벡터는 아가로즈 겔 내에서 분획화하고, 정제하였다.

활성 CKβ-15 단백질을 발현할 수 있는 CKβ-15 단백질 cDNA를 분리하였다. 상기 부분의 단부는 필요에 따라 벡터 내로 클로닝하기 위해 개질하였다. 예를 들어, 5' 돌출부는 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활 단부를 생성할 수 있다. 3' 돌출부는 S1 뉴클레아제를 이용하여 제거할 수 있다. 링커는 T4 DNA 리가제를 이용하여 평활 단부에 연결할 수 있다.

동일한 양의 몰로니 쥐 백혈병 비루스 선형 골격과 CKβ-15 단백질 부분을 혼합하고, T4 DNA 리가제를 이용하여 연결하였다. 이 연결 혼합물을 이용하여 이. 콜리를 형질전환시키고, 이어서 박테리아는 카나마이신을 함유하는 한천상에 도말하였다. 카나마이신 표현형 및 제한 분석 결과 이 벡터는 적절히 삽입된 유전자를 보유하는 것으로 확인되었다.

포장 세포는 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 내에서 융합성 밀도로 조직 배양으로 성장시켰다. CKβ-15 단백질 유전자를 함유하는 벡터는 표준 기법으로 포장 세포 내로 도입하였다. CKβ-15 단백질 유전자를 함유하는 감염성 비루스 입자를 상기 포장 세포로부터 수집하였으며, 이하 이 세포는 생산자 세포라 칭한다.

새로운 배지를 생산제 세포에 첨가하고, 적절한 기간 동안 항온처리한 후, 융합성 생산자 세포의 평판으로부터 배지를 수집하였다. 감염성 비루스 입자를 함유하는 배지는 밀리포어 필터를 통해 여과하여 떨어진 생산자 세포를 제거하였다. 이어서, 여과된 배지를 이용하여 섬유아세포를 감염시켰다. 섬유아세포의 아융합성 평판으로부터 배지를 제거하고, 신속하게 여과된 배지로 대체하였다. 상기 배지 내에 폴리브렌(알드리치)을 포함시켜 혈질도입을 용이하게 할 수 있다. 적합한 기간동안 항온처리한 후, 배지를 제거하고, 새로운 배지로 대체하였다. 비루스 역가가 높은 경우, 실질적으로 모든 섬유아세포가 감염될 것이며, 선택할 필요는 없을 것이다. 역가가 낮은 경우, 확장을 위해 형질도입된 세포를 선택하는 neo 또는 his와 같은 선택 가능한 마커를 보유한 레트로비루스 벡터를 이용할 필요가 있다.

이어서, 형질감염된 섬유아세포를 쥐에게 단독으로 주사하거나 사이토덱스 3 비드와 같은 마이크로캐리어 담체 상에서 융합군으로 성장시킨 후 투여하였다. 주입된 섬유아세포는 CKβ-15 단백질 생성물을 생성하였으며, 이 단백질의 생물학적 작용은 숙주에 전달되었다.

본 발명은 전술한 발명의 상세한 설명 및 실시예에 기재된 것과는 다르게 수행될 수 있음을 명백하다.

상기한 본 발명의 기재로부터 본 발명의 다양한 변형 실시가 가능하며, 따라서 이러한 변형 실시는 첨부하는 특허청구의 범위 내에 있다.

본 명세서에 인용한 특허 문헌를 포함한 모든 간행물은 본 명세서에 참고로 인용한 것이다.

서열 목록

(1) 일반 정보:

(i) 출원인:

(A) 명칭: 휴먼 제놈 사이언시즈 인코포레이티드

(B) 거리명: 키 웨스트 애비뉴 9410

(C) 도시명: 록빌

(D) 주명: 매릴랜드

(E) 국가명: 미국

(F) 우편번호: 20850-3338

(G) 전화: 301-309-8504

(H) 팩스: 301-309-8512

(i) 출원인:

(A) 성명: 웨이 잉-페이

(B) 거리명: 스트로 베일 레인

(C) 도시명: 단스타운

(D) 주명: 매릴랜드

(E) 국가명: 미국

(F) 우편번호: 20878

(i) 출원인:

(A) 성명: 크라이더 브렌트

(B) 거리명: 프레인 놀 코트 13014

(C) 도시명: 저먼타운

(D) 주명: 매릴랜드

(E) 국가명: 미국

(F) 우편번호: 20874

(i) 출원인:

(A) 성명: 로젠 크레이그

(B) 거리명: 롤링 힐 로드 22400

(C) 도시명: 레이톤스빌

(D) 주명: 매릴랜드

(E) 국가명: 미국

(F) 우편번호: 20882

(ii) 발명의 명칭:

케모카인 베타 15

(iii) 서열수: 9

(iv) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 종류: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC-호환 가능

(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30(EPO)

(v) 현재 출원 데이터:

(A) 출원번호: (미지정)

(B) 출원일: 1996. 6. 17

(vii) 통신용 주소:

(A) 수신인: 스턴, 케슬러, 골드스타인 앤드 팍스 피.엘.엘.씨.

(B) 거리명: 스윗700 뉴욕 애비뉴 1100

(C) 도시명: 워싱턴

(D) 주명: DC

(E) 국가명: 미국

(F) 우편번호: 20005-3934

(viii) 대리인/대리회사 정보:

(A) 성명: 골드스타인 조지 에이

(B) 등록번호: 29,021

(C) 참조/문서 번호: 1488.042PC00

(2) 서열번호 1에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 989개 염기쌍

(B) 서열형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 종류: DNA(게놈)

(ix) 특징

(A) 명칭/키: CDS

(B) 위치: 88..534

(ix) 특징

(A) 명칭/키: sig_펩티드

(B) 위치: 88..147

(ix) 특징

(A) 명칭/키: mat_펩티드

(B) 위치: 148..534

(xi) 서열: 서열번호 1:

(2) 서열번호 2에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 149개 아미노산

(B) 서열형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 종류: 단백질

(xi) 서열: 서열번호 2:

(2) 서열번호 3에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 95개 아미노산

(B)서열형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 종류: 단백질

(xi) 서열: 서열번호 3:

(2) 서열번호 4에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 27개 염기쌍

(B) 서열형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 종류: DNA(게놈)

(xi) 서열: 서열번호 4:

(2) 서열번호 5에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 30개 염기쌍

(B) 서열형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 종류: DNA(게놈)

(xi) 서열: 서열번호 5:

(2) 서열번호 6에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 36개 염기쌍

(B) 서열형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 종류: DNA(게놈)

(xi) 서열: 서열번호 6:

(2) 서열번호 7에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 30개 염기쌍

(B) 서열형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 종류: DNA(게놈)

(xi) 서열: 서열번호 7:

(2) 서열번호 8에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 30개 염기쌍

(B) 서열형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: DNA(게놈)

(xi) 서열: 서열번호 8:

(2) 서열번호 9에 관한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 61개 염기쌍

(B) 서열형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: DNA(게놈)

(xi) 서열: 서열번호 9:

Claims (20)

1. 하기 (a) 내지 (e)로 구성되는 군에서 선택되는 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자:

   (a) 서열번호 2의 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (b) 서열번호 2에서 위치 1 내지 129의 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (c) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (d) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 (e) 상기 (a) 내지 (d)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 1의 완전 뉴클레오티드 서열을 가진 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 2의 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가진 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가진 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론의 완전 뉴클레오티드 서열을 가진 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
6. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
7. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
8. 제1항의 (a) 내지 (e)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에 엄중 하이브리드화 조건하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자로서, 이 때, 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 잔기 A로만 또는 잔기 T로만 구성되는 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에는 엄중 하이브리드화 조건하에 하이브리드화되지 않는 것인 분리된 핵산 분자.
9. 제1항의 (a) 내지 (e)중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드의 에피토프 보유 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
10. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
11. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 RNA인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
12. 제1항의 분리된 핵산 분자를 벡터내로 삽입시키는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조 방법.
13. 제12항의 방법에 의해 제조된 재조합 벡터.
14. 제15항의 재조합 벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 단계를 포함하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법.
15. 제14항의 방법에 의해 제조된 재조합 숙주 세포.
16. 케모카인 β-15 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건하에 제15항의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 케모카인 β-15 폴리펩티드를 생산하기 위한 재조합 방법.
17. 하기 (a) 내지 (d)로 구성되는 군에서 선택되는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 분리된 케모카인 β-15 폴리펩티드:

    (a) 서열번호 2의 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드의 아미노산 서열, (b) 서열번호 2에서 위치 1 내지 129의 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드의 아미노산 서열, (c) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 완전 아미노산 서열을 가진 케모카인 β-15 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 (d) ATCC 기탁 번호 제97519호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 성숙 케모카인 β-15 폴리펩티드의 아미노산 서열.
18. 제17항의 케모카인 β-15 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
19. 케모카인 β-15 활성의 증가된 레벨을 필요로 하는 개인에게 제17항의 분리된 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 케모카인 β-15 활성의 증가된 레벨을 필요로 하는 개인의 치료 방법.
20. 개인의 흉선 질환의 진단시에 유용한 방법으로서, (a) 상기 개인의 세포 또는 체액내 케모카인 β-15 유전자 발현 레벨을 측정하는 단계 및 (b) 상기 개인의 케모카인 β-15 유전자 발현 레벨을 표준 케모카인 β-15 유전자 레벨과 비교하는 단계를 포함하며, 이 때, 상기 표준 발현 레벨과 비교한 상기 개인의 케모카인 β-15 유전자 발현 레벨의 증가 또는 감소가 흉선 질환의 지표인, 개인의 흉선 질환의 진단시에 유용한 방법.