KR20000016524A - 복제성 분자의 생체내 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자 요법에 유용한 환상의 복제성 DNA 분자, 및 이를 바이러스 벡터로부터 그 자리에서 생성시키기에 특히 효율적인 방법에 대하여 개시한다.

Description

복제성 분자의 생체내 제조방법
유전자 요법은 유전정보를 병에 걸린 기관이나 세포 중으로 도입함으로써 결핍이나 비정상(돌연변이, 이상발현 등)을 교정함에 있다.
이러한 유전정보는 조직으로부터 추출한 세포 중으로 시험관 내에서 도입되고, 이어서 변형세포는 체내로 재도입되거나, 또는 적당한 조직 중으로 생체내에서 직접 도입시킬 수 있다. 이러한 두 번째의 경우, 다양한 기술이 존재하는데, 이 중에는 상이한 유형의 벡터를 수반하는 상이한 형질감염 기술이 있다. 이들은 한편으로는 천연 또는 합성 화학 및/또는 생화학 벡터이고, 다른 한편으로는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 경우로서, 특히 DNA와 DEAE-덱스트란의 복합체[참조문헌: Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA와 핵 단백질의 복합체[참조문헌: Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], DNA와 지질의 복합체[참조문헌: Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413], 리포좀[참조문헌: Fraley et al.. J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] 등이 언급될 수 있다. 그러나, 이들의 사용에는 특히 다량의 약리학적 순도의 DNA의 생성 가능성을 수반한다.
바이러스 벡터(레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스 등)는 특히 막의 통과에 있어서, 전술한 화학 및/또는 생화학 벡터에 비하여 매우 효율적이다. 이들 바이러스 가운데서, 아데노바이러스는 유전자 요법에 사용하기 위한 가장 유리한 특성을 보인다. 특히, 이들은 상당히 광범위한 숙주 스펙트럼을 지니며, 분열세포 또는 휴지기 세포를 형질도입시킬 수 있으며 아데노바이러스 게놈은 잉여 염색체(extrachromosomal) 형태로 지속된다; 더욱이, 이들은 아직까지는 인간에 있어 주요 병리와 연관되어 있지 않다. 한편, 게놈이 감염세포의 게놈 중으로 무작위로 통합되는 레트로바이러스의 사용은 분열세포에 국한된다. 아데노바이러스는 따라서 해당 유전자를 휴지근 세포(마이오튜브; Ragot et al., Nature 361 (1993) 647)), 간세포(Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), 신경세포(Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224) 및 상피 기관지 세포(Rosenfeld et al., 1992) 등 중으로 전달하는데 사용되어 왔다. 그러나, 급속히 재생가능한 세포의 경우, 세포분열 중 희석효과에 의한 트랜스진(transgene)의 발현의 점진적인 상실이 관찰된다.
아데노바이러스 벡터의 개량 및 벡터의 신세대 개발은 병원성의 잔류하는 잠정적인 위험 및 벡터의 복제와 결부된 면역원성, 자체 게놈의 재조합 및 바이러스 단백질의 발현을 감소시키는 데 주안점을 두고 있다.
이러한 위험성을 가능한 한 피하기 위해서는, 현재 제안되고 있는 바이러스 벡터는 표적세포내에서 자가 복제할 수 없는 벡터가 제조되도록 변형된다. 이러한 현상을 결손되었다고 말한다. 일반적으로, 결손 바이러스의 게놈은 따라서 감염세포내 바이러스의 복제에 필수적인 최소한의 서열이 결핍된다. 즉, 아데노바이러스의 특정 경우에, 선행기술에 기술된 작제물은 이종 DNA 서열이 삽입되는 수준에서 E1 및 임의로 E3 영역이 결실되어 있는 아데노바이러스이다[참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161]. 기타 작제물은 E1 영역의 수준 및 E4 영역의 비-필수부 수준에서의 결실(WO94/12649), 또는 변형된 게놈 구성(FR 94 13355)을 포함한다.
그러나, 복제성 바이러스 입자를 생성하는 재조합 또는 E1형 세포 기능에 의한 생체내 트랜스 상보화의 위험이 이들 결손 바이러스 벡터의 생산 중에 남게 된다. 따라서 오염된 벡터를 유전자 요법에 사용할 경우, 예를 들면, 바이러스 증식의 유도 및 염증반응 및 바이러스 단백질에 대한 면역반응의 위험성과 함께 비통제 전파 초래와 같은 막대한 피해를 주는 결과가 생길 수도 있음이 자명하다.
더욱이, 아데노바이러스 벡터에 의한 형질도입된 세포, 및 특히 분열세포내에서 트랜스진 발현의 안정성 증진이 해결되어야 할 주된 문제점으로 남게 된다. 결과적으로, 본질적으로 전술한 벡터 각각의 장점, 즉 예를 들면, 바이러스 벡터의 것들 및 특히 아데노바이러스의 것들에 기초한 우수한 형질감염 특성 및 특히 생체내에서 복제성 바이러스 입자의 생성 부재를 야기하는 완전한 안전문제를 보여줄 전달벡터가 진정으로 필요하며, 플라스미드 또는 비-바이러스 벡터 사용시 존재하지 않는 위험이 현재까지는 유전자 요법에 남아 있다.
본 발명은 유전자 요법에 사용될 수 있는 환상의 복제성 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상응하는 바이러스 벡터로부터 그 자리에서 이러한 DNA 분자의 생성을 위한 특히 효율적인 방법에 대하여 기술한다.
표 1: 에피솜 작제에 사용되는 서열의 기원.
도 1: 에피솜 작제에 대한 다이아그램.
도 2: 에피솜 구조도.
도 3: 플라스미드 pLoxP-ori-TK-EBNA1 (A) 및 재조합 후 에피솜 (B, C 및 D)내 프로모터(P-RSV)와 발현 카세트 (TK-CITE-EBNA1) 간의 서열 - 서열번호 3.
도 4: 카세트 LoxP-ori-TK-EBNA1 클로닝 단계의 다이아그램.
도 5: 카세트 LoxP-ori-LacZ-EBNA1 클로닝 단계의 다이아그램.
도 6: 레플리콘 및 조절된 Cre 발현 카세트(CRER: 프로모터의 수준에서, 또는 융합에 의해서, 또는 둘다에 의해서 조절된 Cre)를 운반하는 아데노바이러스 벡터의 도. (b)에서, 레플리콘의 배향은 카세트 CRER을 레플리콘에 존재하는 프로모터의 조절하에 놓일 수 있게 한다. 회색 박스는 LoxP 부위에 해당한다.
도 7: 바이러스 캡시드화 영역 Psi(ψ)가 레플리콘에 포함되는 레플리콘과 조절된 Cre 발현 카세트를 운반하는 아데노바이러스 벡터의 도. 회색 박스는 LoxP 부위에 해당한다.
일반 클로닝 및 분자 생물학 기술
세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배에서 플라스미드 DNA의 원심분리, 제한효소로의 분해, 겔 전기영동, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편의 전기용출, 이. 콜라이로의 형질전환, 핵산의 침전 등과 같은 통상적인 분자 생물학 방법이 문헌[참조: Maniatis et al., 1989, Ausubel et al., 1987]에 기재되어 있다. 뉴클레오타이드 서열은 이미 제시된 하기의 절차에 이은 쇄 종결 방법에 의해서 결정된다 [참조문헌: Ausubel et al., 1987].
제한효소는 New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) 또는 Amersham Ltd (Amersham)에 의해서 제공된다.
연결을 위해서, DNA 단편을 0.7% 아가로스 또는 8% 아크릴아미드 겔에서 이의 크기에 따라서 분리하고, 전기영동 후 전기용출에 의해서 정제하고, 페놀로 용출하며, 에탄올로 침전시킨 다음, T4 파지 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP를 함유하는 pH 7.4의 50 mM Tris-HCl에서 배양한다. 올리고뉴클레오타이드를 시아노에틸 그룹에 의해서 b에서 보호된 포스포라미다이트의 화학을 이용하여[참조문헌: Sinha et al., 1984, Giles 1985] 제조자의 권장에 따라 Biosearch 8600 자동 DNA 합성기로 합성한다.
플라스미드 DNA를 알칼리성 용해 기술을 사용하여 정제한다[참조문헌: Maniatis et al., 1989].
본 발명의 목적은 정확하게 말하면, 전술한 요구사항을 충족하는 유전자 전달의 신개념을 제안하는 것이다.
본 발명은 특히 트랜스진의 발현 안정성 및 안전성 입장에서 유리한 치료적 복제성 환상 DNA 분자의 바이러스 벡터를 통한 현장 생성에 있다. 사실상, 이들은 염증형 면역반응 및 몸에 유해 효과를 미칠 수 있고 트랜스진 발현의 지속기간을 제한할 수 있는 바이러스 단백질에 대한 특이적 반응을 유도할 수 있는 바이러스 게놈의 어떠한 서열도 함유하고 있지 않다.
본 발명의 요지는 따라서, 적어도;
(i) 복제에 필수적인 서열을 갖는 하나 이상의 해당 유전자,
(ii) 포유류 세포에서 기능을 띠는 복제기원, 및
(iii) 리콤비나제에 의해 인지된 두 서열 간의 부위-특이성 재조합으로 생기는 서열을 포함하는 복제성 환상 DNA 분자이다.
본 발명은 특히 이러한 치료 DNA 분자의 생산에 특히 효율적인 방법 및 특정 작제물의 개발에 근간을 두고 있다. 특히, 본 발명에 따른 방법은 바이러스 벡터로부터 상기 정의한 치료 DNA 분자의 생산에 있다.
놀랍게도, 본 출원인은 바이러스 벡터로부터 및 부위-특이성 재조합에 의해, 치료 및 복제 특성을 지닌 환상 DNA 분자를 현장에서 생성시킬 수 있음을 입증해 내었다. 더욱이, 유리한 양태로서, 트랜스진 및 복제기원은 바이러스 벡터내에서 불활성이고, 이들의 활성은 부위-특이성 재조합 사건에 의존한다. 한층 더 유리하게는, 재조합 사건은 리콤비나제의 발현에 의해 조건부 유도되고, 이에 따라서 해당 유전자의 발현 전반에 걸쳐서 및 생성된 에피솜 분자의 복제 전반에 걸쳐서 고수준의 통제가 제공된다.
이러한 절차는 다음과 같은 치료관점에서 특히 유리하다:
- 비-바이러스 벡터에 비해 바이러스 벡터에 의해 일반적으로 표명된 우수한 형질감염능의 장점을 취한다는 점,
-소량의 바이러스 벡터가 사용될 때, 바이러스 오염, 국소적인 염증반응 및 항-바이러스 면역반응의 위험을 대폭 감소시킴. 후자는 치료 DNA 분자의 생성에 필요한 비율로만 도입됨,
-일부 바이러스 벡터의 적용분야의 확장 가능: 따라서, 아데노바이러스 벡터는 조혈성 간(stem) 세포와 같은 증식성 세포에 적용이 제한됨. 본 발명은 증식세포에서 안정한 복제성 환상 분자를 생성시키도록 감염력을 이용할 수 있게 해줌.
따라서, 청구된 DNA 분자는 함유하고 있는 치료 유전자(들)의 해당세포 중으로의 전달을 효율적으로 보장하는 능력을 지닌다.
이를 수행하기 위해서는, 특히 포유류 세포와 인간세포에서 기능을 띤다는 사실을 특징으로 하는 복제기원을 함유한다. 유리하게는, 사용된 복제기원은 조건성 복제기원, 즉, 활성이 조절될 수 있는 것이다 더욱 바람직하게는, 복제기원은 바이러스 벡터에서는 불활성이고, 부위-특이성 재조합 후에는 활성이 되도록 배치된다.
유리하게는, 사용된 복제기원은 진핵세포, 바이러스 또는 포유류 기원이다.
본 발명의 프레임워크내에서 사용될 수 있는 복제기원의 바람직한 예는 특히 엡스타인-바(EBV) 바이러스 복제기원이다. EBV 바이러스는 허피스비리대(Herpesviridae) 계열에 속한다. 이의 복제기원은 두 요소: 즉 복제에 관여하고, 활성이 EBNA1 유전자에 의해 암호화된 단백질에 의해 유도되는 oriP 서열(1.7 kb)을 포함한다. 이러한 요소는 그 자체로, 복제와 동시에 에피솜 유지를 허용하고 플라스미드 벡터의 세포당 5 내지 20 카피의 분리까지 허용한다. oriP 서열은 65 bp의 역 반복 단위에 의해 형성되고 30 bp 단위의 4 개의 불완전 카피를 포함하는 복제기원으로부터 960 bp에 의해 분리되어 있는, 30 bp의 20 단위의 반복으로 이루어져 있다. EBNA1 단백질은 복제기원 수준에서 30 bp 단위에 부착되고 S기에 세포 인자의 요구 및 oriP 서열을 시스로 갖는 플라스미드의 세포분열과 동시의 복제를 허용한다. 더욱이, EBNA1은 아마도 반복단위 및 염색체 구조의 수준에서 동일 부착을 통해 내핵 유지 및 세포분열시 에피솜의 분리를 허용한다. EBV 게놈의 복제기원 oriP를 함유하고 EBNA1 바이러스 단백질(641 아미노산)의 발현을 허용하는 플라스미드가 형질감염된 인간세포에서 안정한 에피솜 방식으로 유지되고 이의 복제는 세포분열과 동시성이다(Lupton and Levine, 1985).
복제기원은 또한 파필로마 바이러스로부터 유도될 수도 있다. 파필로마 바이러스는 엡스타인-바 바이러스(EBV)의 것과 유사한 게놈이 에피솜성 유지되는 바이러스 잠복기 시스템을 이용한다. 이러한 시스템은 1형 소 파필로마 바이러스(BPV-1)에 대하여 특히 연구되었다. BPV의 복제기원은 단백질 E1과 E2의 존재하에서 활성을 띤다. EBV의 경우에서와 같이, 에피솜성 유지는 복제와는 독립적이며 MME(미니염색체 유지 요소) 서열의 수준에서 E2의 부착에 의해 보장되지만, 또한 E1의 존재를 요한다. 한편, EBV oriP/EBNA1 시스템과는 대조적으로, 에피솜의 복제는 세포분열과 동시성이 아니다(Piirsoo et al., 1996)
복제기원은 또한 자가 복제할 수 있는 서열 또는 ARS(자가 복제 서열)로 이루어질 수 있다. ARS는 포유류, 특히 인간과 마우스의 염색체로부터 분리되었다. 바람직하게는, 사람의 경우 c-myc 좌의 상류에 위치한 ARS 서열(Ariga et al., 1988) 및 마우스 아데노신 디아미나제 유전자 좌의 4 kb 단편(Virta-Pearlman et al., 1993)의 4 kb 단편을 들 수 있다.
해당 유전자와 관련하여, 이러한 유전자는 치료, 백신, 농학 또는 수의학적 유전자일 수 있다. 이는 또한 표적세포 또는 유기체에서 기능성인 전사 프로모터 영역, 및 전사 및 폴리아데닐화 종결 시그널을 규정하는 3′에 위치하는 영역을 함유한다. 프로모터 영역과 관련하여, 프로모터 영역이 적당한 세포 또는 유기체에서 작용할 수 있을 때 고려되는 유전자의 발현에 관여한다. 이는 또한 (기타 단백질의 발현, 또는 심지어 합성에 관여하는) 상이한 기원의 영역일 수 있다. 특히, 이는 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이는 표적세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 진핵세포 프로모터 가운데서, 유전자의 전사를 특이적으로 또는 비-특이적으로, 유도적으로 또는 비-유도적으로 또는 강력하게 또는 약하게 촉진하거나 억제하는 임의 프로모터 또는 유도된 서열이 사용될 수 있다. 이들은 특히 편재성 프로모터(HPRT, PGK, α-액틴 및 튜불린 및 튜불린 유전자 등의 프로모터), 중간 필라멘트(GFAP, 데스민, 비멘틴, 뉴로필라멘트 및 케라틴 유전자 등)의 프로모터, 치료 유전자의 프로모터(예를 들면, MDR, CFTR, 인자 VIII 및 ApoAI 유전자 등의 프로모터), 조직-특이성 프로모터(피루베이트 키나제, 빌린, 지방산 결합 장 단백질 및 평활근 α-액틴 유전자 등의 프로모터) 또는 자극에 반응하는 프로모터(스테로이드 호르몬에 대한 수용체, 레티노산 수용체 등)일 수 있다. 이와 마찬가지로, 이들은 예를 들면, 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, 초기 CMV 프로모터 또는 RSV LTR의 프로모터 등과 같은 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이들 프로모터 영역은 활성화 서열, 조절 서열 또는 조직-특이성 또는 우점 발현을 허용하는 서열의 첨가로 변형될 수 있다. 더욱이, 해당 유전자는 또한, 표적 세포의 분비경로에서 합성된 산물을 지시하는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 합성산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 여타 기능성 시그널 서열 또는 인공 시그널 서열일 수 있다.
초기 CMV 프로모터 또는 레트로바이러스의 LTR 중에서 선택된 바이러스 기원의 프로모터 또는 포유류 프로모터가 유리하게 사용된다.
복제기원 및 적어도 하나의 해당 유전자 외에, 본 발명의 DNA 분자는 두 서열 간의 특이성 재조합으로 생기는 영역을 포함한다. 이러한 부위-특이성 재조합은 서열 간의 부위-특이성 재조합을 불러오는 다양한 시스템으로부터 수득될 수 있다.
청구된 DNA 분자의 현장 생성을 위한 본 발명의 프레임워크내에서 사용된 특이성 재조합 시스템은 다양한 기원일 수 있다. 특히, 사용된 특이적 서열 및 리콤비나제는 상이한 구조 부류, 특히 박테리오파지 P1 리콤비나제 계통에 속할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 공정에 따라 사용된 부위-특이성 재조합은 일반적으로 리콤비나제로 지칭된 특정 단백질의 존재하에 상호 재조합될 수 있는 두 종의 특정 서열에 의해 수득될 수 있다. 이러한 이유로 해서, 본 발명에 따른 환상 DNA 분자는 추가로 상기 부위-특이성 재조합으로 생기는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 프레임워크내에서 사용된 재조합을 허용하는 서열은 일반적으로, 5 내지 100 염기쌍, 더욱 바람직하게는 50 이하의 염기쌍을 포함한다.
박테리오파지 1 인티그라제 계열에 속하는 리콤비나제로는, 파지 λ[참조문헌: Landy et al., Science 197 (1977) 1147], P22 및 F80[참조문헌: Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468], 헤모필루스 인플루엔제의 HP1[참조문헌: Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859], P1 파지의 인티그라제 Cre, pSAM2 플라스미드의 인티그라제(EP 350 341) 또는 효모 사카로마이세스 세레비지애의 플라스미드 2 m의 FLP 리콤비나제를 들 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 분자가 λ 박테리오파지 인티그라제 계열의 부위-특이성 시스템에 의해 재조합으로 제조될 때, 본 발명에 따른 DNA 분자는 일반적으로, 상응하는 박테리오파지 또는 플라스미드의 부착 att을 위한 두 서열 간의 재조합으로부터 생기는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
트랜스포손 Tn3 계열에 속하는 리콤비나제로는, 특히 트랜스포손 Tn3 또는 트랜스포손 gd, Tn21 및 Tn522의 리솔바제(Stark et al., 1992); 박테리오파지 mu의 인버타제 Gin 또는 RP4의 단편 par의 것과 같은 플라스미드의 리졸바제[참조문헌: Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131]과 같은 플라스미드의 리졸바제를 들 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 분자가 트랜스포손 Tn3 계열의 부위-특이성 시스템에 의해 재조합 제조될 때, 본 발명에 따른 DNA 분자는 일반적으로, 고려된 트랜스포손의 리졸바제의 인지를 위한 두 서열 간의 재조합으로 생기는 서열을 추가로 함유한다.
바람직한 양태에 따라, 본 발명의 유전 작제물에 있어서, 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열은 박테리오파지로부터 유도된다. 더욱 바람직하게는, 이들은 박테리오파지의 부착을 위한 서열(attP 및 attB 서열) 또는 유도된 서열이다. 이들 서열은 인티그라제로 지칭된 리콤비나제의 존재하에서 상호 특이적으로 재조합될 수 있다. 유도된 서열이란 용어에는 적당한 리콤비나제의 존재하에 특이적으로 재조합하기 위한 능력을 보유하는 박테리오파지의 부착을 위한 서열의 변형(들)에 의해 수득된 서열이 포함된다. 따라서, 이들은 이들 서열의 감소된 단편 또는 이와 반대로 기타 서열의 첨가(제한부위 등)에 의해 연장된 단편일 수 있다. 이들은 돌연변이(들), 특히 점 돌연변이(들)에 의해 수득된 변이체일 수 있다. 본 발명에 따라, 박테리오파지 또는 플라스미드의 attP 및 attB 서열은 박테리오파지 또는 플라스미드에 특이적인 재조합 시스템의 서열, 즉 파지 또는 플라스미드내에 존재하는 attP 서열 및 상응하는 염색체 attB 서열을 지칭한다.
바람직한 예로, λ 파지 P22, F80, P1, 헤모필루스 인플루엔제의 HP1 또는 플라스미드 pSAM2, 또는 2 m의 부착을 위한 서열을 특별히 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열은 P1 파지의 재조합 시스템으로부터 유도된다. 이러한 P1 파지는 lox P 부위로 불리는 34 염기쌍 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 인지하는 Cre로 불리는 리콤비나제를 보유하고 있다. 이러한 서열은 8 bp의 보존된 서열에 의해 분리된 13 bp의 두 회문성 서열로 이루어져 있다.
특이적 변이체에 있어서, 따라서 본 발명은 P1 박테리오파지의 두 loxP 영역 간의 부위 특이성 재조합으로부터 유도된 서열(a), 적어도 하나의 해당 서열 및 포유류 및 인간세포에서 기능을 띠고 바람직한 양식에 따라 조건부 기능을 띠는 하나의 복제기원을 보유하는 하나의 복제기원을 포함하는 환상의 복제성 DNA 분자에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 상기 정의된 치료 DNA 분자의 생산에 적당한 특이적 유전자 작제물을 제공한다. 본 발명에 따른 이러한 유전자 작제물, 또는 재조합 DNA는 특히 해당 유전자(들), 복제기원 및 직접배향으로 위치된 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열에 의해 둘러싸인 EBNA1 단백질 유전자를 포함한다. 이들 서열은 카세트 형태로 박테리아 플라스미드 중으로 클로닝시킬 수 있으며, 제 1 경우 플라스미드 DNA를 인간세포 중으로 형질감염시켜 이들 서열의 기능성을 시험할 수 있다. 이들 카세트는 이어서, 이들의 게놈 중으로 통합된 이러한 동일 서열을 보유하는 바이러스 벡터의 작제에 사용된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 다른 일면은 부위-특이성 재조합에 의해 바이러스 벡터로부터 전술한 치료 DNA 분자의 현장 생산을 위한 방법에 있다. 이러한 벡터의 사용은 유리하게는 치료하고자 하는 세포내의 청구된 DNA 분자의 투여를 최적화시킬 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 요지는 또한, 이의 게놈 중으로 삽입된, 부위-특이성 재조합을 허용하고 직접 배향으로 위치한 두 서열에 의해 둘러싸인 적어도 하나의 DNA 영역을 포함하는 바이러스 벡터이고, 상기 DNA 영역은 적어도 하나의 복제기원과 하나의 해당 유전자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 복제기원 및 바이러스 벡터 중으로 통합되는 해당 유전자는 불활성화된 형태로 존재하고, 프로모터는 발현 카세트의 일단에 직접 배향으로 클로닝된다(도 1). 두 LoxP 부위 간의 재조합 후, 프로모터는 해당 유전자의 앞에서 자신의 진로를 모색하고 LoxP 부위에 의해 이로부터 분리되며, 전사물의 첫 번째 ATG는 트랜스진의 개시코돈에 상응한다. oriP 서열은 트랜스진으로서 동일 프로모터의 조절하에서 이시스트론성 메신저 형태로 발현되는 EBNA1 단백질의 존재하에서만 활성을 띤다. EBNA1의 해독은 피코나바이러스 계열의 뇌심근염 바이러스(ECMV)로부터 유도된 IRES 서열의 수준에서 내부 개시 메커니즘에 의해 개시된다. 트랜스진 및 EBNA1 단백질의 발현 및 플라스미드의 복제는 따라서 두 LoxP 부위 간의 재조합 사건에 의해 직접 결정된다.
본 발명의 별법에 따라, 바이러스의 캡시드화 영역은 레플리콘(부위-특이성 재조합을 허용하는 서열에 의해 둘러싸인 DNA 영역)에 포함되어 있다. 이러한 양태는 후술되는 바와 같이 시스템에 추가의 안전성을 제공한다.
사용된 바이러스 벡터는 동물세포, 바람직하게는 인간세포를 형질도입시킬 수 있는 한은 다양한 기원일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV), 허피스 바이러스(HSV) 또는 레트로바이러스로부터 유도된 벡터가 사용될 수 있다. 직접투여 또는 이식하고자 하는 세포의 생체외 변형을 위해 아데노바이러스, 또는 생성세포의 이식을 위해 레트로바이러스를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 바이러스, 즉 이들은 표적세포에서 자가 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 프레임워크내에서 사용되는 결손 바이러스의 게놈은 따라서 감염세포내 바이러스 복제에 필수적인 최소한의 서열이 결핍되어 있다. 이러한 영역은 제거되거나(완전히 또는 부분적으로), 또는 비-기능성이 되게 만들거나, 또는 다른 서열, 특히 해당 이종 핵산 서열에 의해 치환시킬 수 있다. 바람직하게는, 결손 바이러스는 그럼에도 불구하고, 바이러스 입자의 캡시드화에 필수적인 자신의 게놈의 서열을 보유한다.
특히 아데노바이러스의 경우, 유형 2 또는 5 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물기원의 아데노바이러스(특허출원 WO94/26914 참조)가 본 발명의 프레임워크내에서 바람직하게 사용된다. 본 발명의 프레임워크내에서 사용될 수 있는 동물기원의 아데노바이러스로는, 개, 소, 쥐(예를 들면, Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예를 들면, SAV) 기원의 아데노바이러스를 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 바이러스 벡터는 적어도 하나의 복제기원 및 하나의 해당 유전자를 포함하고 직접 배향으로 위치된 두 서열에 의해 둘러싸인 유전자 서열이 게놈에 삽입되어 있는 결손 아데노바이러스이다. 이들은 리콤비나제의 존재에 따라, 부위-특이성 재조합에 의해, 복제기원 및 트랜스진의 조건부 활성을 유도시킬 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 이러한 아데노바이러스의 게놈에서 적어도 E1 영역이 비-기능성이 되게 만든다. 더욱 바람직하게는, E1 유전자 및 E2, E4, L1-L5 유전자 중 적어도 하나는 비-기능성이다. 다른 영역, 특히 E3(WO90/02697), E2(WO94/28938), E4(WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) 및 L5(WO95/02697)도 또한 변형시킬 수 있다.
바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에 결실을 포함하고 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열에 의해 둘러싸인 DNA 영역이 불활성화된 E1 영역의 수준에서 삽입되어 있다. 다른 바람직한 양태에 따라, E1 및 E4 영역에 결실을 포함하고 있으며 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열에 의해 둘러싸인 DNA 영역이 불활성된 E4 영역의 수준에서 삽입되어 있다. 후술되는 바와 같이, 본 발명의 특정 양태에 따라, 아데노바이러스는 또한 리콤비나제 유전자의 발현을 위한 카세트를 포함한다.
청구된 벡터는 상술된 바와 같은 플라스미드와의 재조합에 의해서 수득되고, 즉, 이들이 두 부위-특이성 재조합 영역 사이에 적어도 하나의 복제기원과 조건부 활성을 갖는 하나의 해당 유전자를 포함한다는 사실을 특징으로 한다.
좀더 상세하게 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열 및 청구된 바이러스 벡터로 통합되는 DNA 영역에 존재하는 해당 유전자의 복제기원의 정의에 관해서, 상술된 정의가 참조될 것이다.
본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당해분야 기술자에게 공지된 기술에 의해서 제조될 수 있다 [참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 특히, 이들은 아데노바이러스와 특히 본 발명의 DNA 서열을 운반하는 플라스미드 간의 상동성 재조합에 의해서 또는 이. 콜라이에서의 바이러스 게놈 작제에 의해서 제조될 수 있다. 상동성 재조합은 아데노바이러스와 플라스미드의 적합한 세포주로의 동시 형질감염후 일어난다. 사용된 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소에 의해서 형질전환되고 (ii) 결손 아데노바이러스 게놈부를 보충할 수 있는 서열을 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위해서 통합된 형태로 포함해야 한다. 세포주의 예로서, 특히, 게놈으로 통합되어 Ad5 아데노바이러스(12%) 또는 특히 출원번호 제WO 94/26914호와 WO95/02697호에 기재된 바와 같은 E1 및 E4 분획을 보충할 수 있는 세포주 게놈의 좌측부를 포함하는 인간 배 신장세포주 293[참조문헌: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]이 언급될 수 있다.
이어서 증폭된 아데노바이러스가 실시예에 설명된 통상적인 분자 생물학 기술에 의해서 회수되고 정제된다.
아데노-수반 바이러스(AAV)에 관하여, 이들은 이들이 감염시키는 세포의 게놈으로 안정하고 부위-특이적인 방식으로 통합되는 상대적으로 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태 또는 분화에 어떠한 영향도 유도하지 않으면서 광범위 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 인간의 병리상태에 수반되는 것으로 보이지 않는다. AAV 게놈이 클로닝되고 서열화되고 특징규명되었다. 이것은 약 4700 염기를 포함하고 각 말단에 약 145 염기의 역 반복 영역 (ITR)을 함유하며, 바이러스에 대한 복제 영역으로서 제공된다. 게놈의 나머지 는 캡슐화 기능을 수행하는 두 필수 영역: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 수반되는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측부; 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측부로 나눈다.
유전자의 시험관내 및 생체내 전달을 위한 AAV-유도 벡터가 문헌에 기재되어 있다(참조: WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). 이들 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 해당 유전자에 의해서 치환되는 다양한 AAV-유도 작제, 및 시험관내(배양액내 세포) 또는 생체내(유기체로 직접)로 해당 유전자를 전달시키기 위한 이들의 용도를 기재한다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 2개의 AAV 역 반복 영역 (ITR)에 의해서 경계지워진 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 플라스미드, 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드의 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)에 의해 감염된 세포주로의 동시 형질감염에 의해서 제조될 수 있다. 이어서 생성된 재조합 AAV를 통상의 기술에 의해서 정제한다.
허피스 바이러스 및 레트로바이러스에 관하여, 재조합 벡터의 작제가 문헌[참조: Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689] 등에 광범위하게 기재되어 있다.
특히, 레트로바이러스는 분리된 세포를 선택적으로 감염시키는 통합성 바이러스이다. 그러므로, 이들은 암 적용을 위한 해당 벡터를 구성한다. 레트로바이러스의 게놈은 본질적으로 2 개의 LTR, 캡시드화 서열 및 3 개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 완전히 또는 부분적으로 결실되고 해당 이종 핵산 서열로 치환된다. 이러한 벡터는 레트로바이러스의 다양한 유형, 예를 들면, 특히 MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스", MoMLV로도 불림), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비(harvey) 육종 바이러스"); SNV("비장 괴저 바이러스"); RSV("라우스(Rous) 육종 바이러스") 또는 프렌즈 바이러스로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서, 일반적으로 특히 LTR, 캡시드 서열 및 본 발명의 서열을 포함하는 플라스미드를 작제한 다음 플라스미드에 부족한 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 캡시드화 세포주를 형질감염시키기 위해서 사용한다. 그러므로, 일반적으로 캡시드화 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 캡시드화 세포주, 특히 PA317 세포주(US4,861,719); PsiCRIP 세포주(WO90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주(WO89/07150)가 선행 기술에 기재되어 있다. 또한, 재조합 레트로 바이러스는 전사 활성을 억제하기 위한 LTR의 수준에서의 변형 및 gag 유전자의 일부를 포함하는 연장된 캡시드화 서열을 포함할 수 있다[참조문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 이어서 재조합 레트로바이러스를 통상의 기술에 의해서 정제한다.
본 발명에 따른 바람직한 벡터에 의해서, 좀더 상세하게는 게놈에 본 발명에 따른 DNA 영역을 포함하고 직접 배향으로 배치된 P1 박테리오파지(loxP 영역)의 역 반복 서열에 의해서 경계지워진 아데노바이러스가 제안될 수 있다.
이러한 유형의 벡터의 설명에 의해서, 좀더 상세하게는 β-갈락토시다제(LacZ) 유전자 또는 허피스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자(TK)를 갖는 하기의 작제물이 언급될 수 있다 (도 1). 해당 유전자는 RNA 또는 치료 또는 백신 단백질, 예를 들면, 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 9,203,120), 성장인자, 신경전달물질 또는 이들의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, αFGF, βFGF, NT3, NT5 등; 아폴리로프로테인: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등(FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (FR 9111947)을 암호화하는 유전자(cDNA, gDNA, RNA, 합성 또는 반-합성 핵산), 종양 억제자 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCCm, k-rev 등(FR 93 04745), 혈액응고에 수반된 인자: 인자 VII, VIII, IX 등, 또는 모두 또는 일부의 천연 또는 인공 이뮤노글로불린 (Fab, ScFv 등)을 암호화하는 유전자, 리간드 RNA(WO91/19813) 등일 수 있다.
해당 유전자는 또한 표적 세포에서의 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절함을 가능하게 하는 안티센스 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면, EP 140 308에 기재된 기술에 따라서 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사되고 이로 인해 이의 단백질로의 전사를 억제할 수 있다.
본 발명의 벡터는 특히 독성 인자를 암호화하는 서열의 발현에 적합하다. 이러한 것들은 세포 독(디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리신 A 등), 외부체에 대한 감수성을 유도하는 산물(자살 유전자: 티미딘 키나제, 시토신 디아미나제 등) 또는 세포 사멸을 유도할 수 있는 킬러 유전자(Grb3-3) (PCT/FR94/00542), 안티-ras ScFv (WO 94/29446) 등)일 수 있다. 본 발명의 시스템은 사실상 벡터, 특히 생성 세포에 대한 독성 없이 이러한 서열을 함유하는 바이러스 벡터를 생성하고 부위-특이성 재조합 후 표적 세포에서 이러한 독성 분자의 발현을 선택적으로 유도하는 것을 가능하게 한다. 그러므로, 이러한 유형의 작제물은 예를 들면, 목적이 병에 걸린 세포를 선택적으로 파괴하는 것인 항암 치료 전략에 특히 적합하다. 이러한 시스템은 또한 예를 들면, 비통제성 생성이 매우 현저한 부작용을 보일 수 있는 시토카인, 인터페론, TNF 또는 TGF의 발현에 특히 유리하다.
본 발명은 또한 상술된 바와 같이 본 발명에 따른 적어도 하나의 바이러스 벡터 또는 DNA 분자로 형질감염된 진핵 세포를 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 바이러스 벡터를 함유하는 숙주 세포의 배양물이 유도될 부위-특이성 재조합을 허용하는 리콤비나제와 접촉하게 됨에 따라서 상기에 정의된 바와 같은 DNA 분자의 생성방법에 있다.
좀더 간략하게는, 본 발명은 일반적으로 이것이 순환 및 복제 DNA 분자를 생성하기 위해서 (i) 게놈에 부위-특이성 재조합을 허용하는 2 개의 서열에 의해 둘러싸이고 직접 배향으로 배치된, 적어도 하나의 복제기원 및 하나의 해당 유전자를 포함하는 적어도 하나의 DNA 영역을 포함하는 적어도 하나의 바이러스 벡터를 함유하는 변형된 숙주 세포 및 (ii) 부위-특이성 재조합이 그 자리에서 유도되도록 하는 리콤비나제에 접촉하게 됨을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.
다양한 절차가 바이러스 벡터를 특정 리콤비나제와 접촉시키기 위해 본 발명의 프레임워크내에서 제안될 수 있다. 이것은 특히 숙주 세포의 수준에서 플라스미드와의 동시 형질감염 또는 리콤비나제를 위한 유전자를 함유하는 바이러스 벡터와의 동시감염에 의해서, 또는 숙주 세포 게놈에 직접 존재하는 리콤비나제를 암호화하는 유전자의 발현의 유도에 의해서 수행될 수 있다. 그러므로, 리콤비나제를 암호화하는 유전자는 예를 들면, 플라스미드 또는 이와 달리 아데노바이러스 유형의 수반하는 바이러스 벡터에 게놈으로 통합된 형태로 숙주 세포에 존재할 수 있다. 이러한 경우에, 본 발명에 따른 DNA 분자를 생성하기 위해서 사용되는 바이러스 벡터가 상기에 정의된 바와 같다.
다른 방법에 따라서, 유전자를 발현시키기 위한 카세트가 또한 해당 유전자의 발현을 책임지는 바이러스 벡터 상에서 운반된다.
이러한 특별한 경우에, 본 발명에 따른 방법은 특정 재조합 부위를 암호화하는 두 서열에 의해서 한계가 정해진 DNA 영역 외에도 이의 게놈을 포함하고 적어도 하나의 복제기원 및 하나의 유전자를 포함하는 바이러스 벡터와 리콤비나제 유전자를 발현시키기 위한 카세트를 사용한다.
이러한 벡터는 본 발명의 다른 목적을 구성한다.
이와 관련하여, 특정 별법에 따라서, 본 발명은 레플리콘(2 개의 부위-특이성 재조합 서열에 의해서 둘러싸인 DNA 영역)이 삽입된 E1 영역내 제 1 결실 및 리콤비나제 단백질을 발현시키기 위한 카세트가 삽입된 수준에서 E4 및/또는 E3에 생성된 결실을 포함하는 아데노바이러스에 관한 것이다.
상술된 양태와 대조적으로, 레플리콘은 E3 또는 E4에 상응하는 결실된 부분으로 삽입될 수 있고 반면에 리콤비나제를 발현시키기 위한 카세트는 결실된 E1 영역의 수준에서 삽입된다.
다른 별법에 따라서, 레플리콘 및 리콤비나제를 발현시키기 위한 카세트가 결손 E1 영역의 수준에서 삽입된다.
좀더 상세하게는, 전술한 바와 같이, 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열은 LoxP 서열이고 리콤비나제는 재조합 서열의 작용 양식이 상술된 바와 같은 Cre 단백질이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 숙주 세포내 이러한 리콤비나제의 발현을 조절하고 특히 유도할 수 있는 것이 사실상 바람직하다. 이 때문에, 리콤비나제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절함이 본 발명의 프레임워크 내에서 유리하게 제안된다. 이를 수행하기 위해서, 조절 요소의 조절 하에서 유전자의 발현을 수행함이 제안된다. 이것은 특히 이러한 유전자 발현의 수준 및/또는 기간을 조절함을 가능하게 하는 유도성 프로모터, 예를 들면, 덱사메타손에 의해서 유도된 MMTV LTR 프로모터(Pharmacia) 또는 테트라사이클린에 의해서 조절된 프로모터일 수 있다 (WO94/29442; WO94/04672). 기타 프로모터, 특히 이종 조절 영역(특히 "인핸서" 영역)을 운반하는 MMTV LTR 변이체가 사용될 수 있음이 이해된다.
다른 양태에서, 리콤비나제를 암호화하는 발현은 숙주 세포내 단백질의 구조적 축적을 피하게 위해서 또는 핵 구획을 향한 "누출" 및 세포독성을 최소화하기 위해서 조절되는 프로모터의 조절하에 있다. 전사 트랜스활성화 도메인으로서 기능하는 요소는 따라서 이들과 연계될 수 있다. 이러한 유형의 요소의 대표로서, 특히 스테로이드, 레티노이드산 및 타이로이드 수용체를 포함하는 호르몬 수용체가 언급될 수 있고, 좀더 상세하게는 글루코코티코이드, 미네랄로코티코이드, 타이로이드, 에스트로겐, 알도스테론 및 레티노산에 대한 것들이 언급될 수 있다. 리콤비나제 Cre와 글루코코르티코이드의 DNA-결합 도메인 간의 이러한 유형의 작제물이 예를 들면, 문헌[참조: PNAS 93 (1996) 10887]에 언급되어 있다.
리콤비나제의 발현을 조절하는 가능성은 레플리콘과 리콤비나제 발현 카세트 모두를 운반하는 본 발명의 벡터의 경우에 특히 중요하다. 사실상, 이러한 양태에서, 리콤비나제가 예를 들면, 바이러스 벡터의 생성 도중에 발현되는 경우, 레플리콘은 캡시드화 이전에 바이러스 게놈으로부터 절단될 것이다. 이러한 이유로, 리콤비나제 단백질의 발현이 바이러스 생성 세포에서 억제되는 시스템을 지닐 수 있음이 유용하다. 이것은 상술한 바와 같이 조절 프로모터(테트라사이클린 또는 MMTV 유형), 및/또는 리콤비나제와 연계되어 호르몬의 존재하에 핵외 구획에서 이것을 유지하는 호르몬 수용체 유형 요소를 사용하여 수득된다 (도 6 및 7). 이로 인하여, 호르몬 부재시에 리콤비나제는 작용하지 않고, 호르몬 존재시에 리콤비나제가 활성을 발휘하는 핵 구획으로 수송된다.
리콤비나제 발현을 조절하기 위한 유리한 접근법은 호르몬 수용체(DNA-결합 도메인)와 융합되고 따라서 호르몬 부재시에 불활성인 리콤비나제를 사용함에 있고, 이어서 유전자가 레플리콘 프로모터의 조절하에 있도록 유전자를 바이러스 벡터에 배치함에 있다. 이러한 양태가 예를 들면, 도 6b에 도시되어 있다.
또한, 시스템의 안정성을 증가시키기 위해서, 상술한 바와 같이, 레플리콘에 바이러스 벡터의 캡시드화를 위한 영역을 포함함이 또한 가능하다 (도 7). 이것은 자신의 레플리콘을 상실한 벡터에 의해 오염됨으로부터 생성 바이러스 스톡을 피함을 가능하게 한다. 사실상, 상기에 언급된 조절 시스템에도 불구하고 활성 리콤비나제 발현이 바이러스 생성 도중 발생할 경우, 이것은 바이러스 게놈으로부터 레플리콘의 절단을 일으킬 것이고 이렇게하여 레플리콘을 함유하지 않는 바이러스 게놈이 생성된다. 바이러스의 캡시드화를 위한 영역이 레플리콘에 의해서 운반될 경우, 이렇게하여 생성된 바이러스 게놈은 캡시드화되지 않을 것이다. 따라서, 레플리콘 및 리콤비나제 발현 카세트를 운반하는 바이러스 게놈만이 캡시드화될 수 있다.
본 발명의 요지는 또한 본 발명에 따른 적어도 하나의 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 형질감염 세포를 포함하는 약학 조성물이다. 이러한 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 경로 등에 의한 투여용으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 주사 제형을 위한 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성 멸균 생리식염수 용액(일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 이들 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수 용액의 첨가시, 주사액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결-건조 조성물일 수 있다. 레트로바이러스에 관하여, 이들은 캡시드화 세포에 직접 또는 이들의 생체내 재이식의 목적상 생체외 감염된 세포를 임의로 신-기관의 형태로 사용함이 유리할 수 있다 (WO 94/24298).
주사에 사용되는 벡터의 용량은 다양한 파라미터에 따라서, 특히 사용된 투여 양식, 관련된 병리상태 또는 원하는 치료기간에 따라서 조정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 제형되어 104내지 1014pfu/㎖ 용량의 형태로 투여된다. AAV 및 아데노바이러스에 있어서, 106내지 1010pfu\㎖의 용량이 또한 사용될 수 있다. 용어 pfu("플라크 형성 단위")는 비리온 현탁액의 감염력에 상응하고 적합한 세포 배양물을 감염시키고 일반적으로 48시간 후에 감염된 세포의 플레이트의 수를 측정함으로써 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가 측정술은 문헌에 잘 문서화되어 있다.
본 발명의 DNA 분자 또는 바이러스 벡터의 게놈으로 통합된 영역에 존재하는 해당 유전자에 따라서, 이들은 유전병(근이영양증, 낭포성 섬유증 등), 신경퇴행성 질환(알츠하이머, 파킨슨, ALS 등), 암, 혈액 응고 장애 및 디스리포프로테이네미아와 관련된 병리상태, 바이러스 감염에 관련된 병리상태(간염, AIDS 등)를 포함하는 다수 병리상태의 치료 또는 예방을 위해 또는 농경 및 수의학 분야 등에서 사용될 수 있다.
본 발명은 설명적이고 비-제한적인 것으로서 고려되어야 하는 하기의 실시예의 도움으로 좀더 완전히 기재될 것이다.
실시예 1. 본 발명에 따른 벡터의 기재 (도 1 내지 3)
도 1은 본 발명에 따른 벡터의 일반 구조, 좀더 상세하게는 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열간의 영역을 설명한다. 좀더 상세한 작제가 도 2에 도시되어 있다.
프로모터 (P) 및 트랜스진(TG)와 EBNA1 단백질을 발현시키기 위한 카세트의 배향이 화살표에 의해서 표시되고 따라서 리콤비나제 Cre의 존재하에 재조합 후에만 이러한 두 유전자의 발현을 허용한다. 프로모터 (P)와 재조합후 유전자간 서열의 상세도가 도 3에 제시되어 있다. 이 도면에서, 프로모터는 RSV 바이러스 LTR(P-RSV)이고 유전자는 티미딘 키나제 TK 유전자이다. TK유전자의 메신저 RNA에 상응하는 메신저 RNA의 제 1 ATG에 밑줄이 그어져 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, EBNA-1의 발현은 뇌심근염 바이러스 (ECMV)의 CITE("Cap 독립 해독 입장") 서열로도 불리는 IRES(내부 리보솜 입장 부위)를 사용하여 해독의 내부 개시에 의해서 폴리시스트론 메신저로부터 수득된다. 전사 종결 및 SV40 바이러스 (pA)의 폴리아데닐화를 위한 시그널 서열이 EBNA1의 암호화 서열의 3' 말단에 도입된다. oriP 서열은 발현 카세트 TK-EBNA-1과 RSV 프로모터 사이에 배치된다. 이러한 서열은 EBNA-1의 존재하에서만 복제를 위해 활성적이고; 따라서, 이것은 재조합 및 에피솜의 형성 후에만 기능한다.
실시예 2. 플라스미드 LoxP-oriP-TK-EBNA1 및 LoxP-ori-LacZ- EBNA1의 작제
플라스미드 작제단계가 도 4 및 5에 제시되고 사용된 서열의 기원이 표 1에 요약되어 있다.
2.1. 플라스미드 pLoxP-oriP-TK-EBNA1의 작제(도 4)
1. 플라스미드 pSLori를 제한효소 HpaI과 EcoRI으로 절단하고 oriP 서열에 상응하는, 수득된 1817 bp 단편을 미리 탈포스포릴화된 플라스미드 pIC19H의 SmaI과 EcoRI 부위 사이에 클로닝시켜, 플라스미드 pIC-ori를 생성한다(도 4A).
2. 플라스미드 pIC-ori를 HindIII과 BglII 부위에서 절단하고, 탈포스포릴화시킨 다음 수득된 1900 bp 단편을 벡터 pBS246의 HindIII(174)와 BamHI(208) 부위 사이에 클로닝시켜 벡터 pLox-ori를 생성한다(도 4A).
3. SV40 바이러스의 전사 및 폴리아데닐화 종결 시그널 서열에 상응하는, 벡터 pCEP4의 399 bp BamHI-SalI 단편을 클레나우 DNA 폴리머라제로 수선한 다음 미리 탈포스포릴화된 벡터 pIC20R의 SmaI과 SalI 부위(클레나우 DNA 폴리머라제로 수선됨) 사이에 클로닝시켜, 벡터 pICpA를 생성한다(도 4A).
4. 벡터 pCITE-2의 뉴클레오타이드 16과 518간의 ECMV IRES 서열을 5'-말단에 XbaI과 PvuII(올리고 1) 및 BamHI(올리고 2) 부위를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드 1 5'-GGCCTCTAGACAGCTGGTTATTTTCC-3'(서열번호 1)과 2 5'-GGCCGGATCCCATATTATCATCG-3'(서열번호 2)에 의해 PCR로 증폭한다. 수득된 산물을 제한효소 XbaI과 BamHI으로 절단하고 미리 탈포스포릴화된 벡터 pCMV-EBNA1의 XbaI과 PstI 부위 사이에 클로닝시켜, 벡터 pCITE-EBNA1을 생성한다. 해독 개시코돈에 상응하는 IRES의 ATG 12, 및 EBNA1 단백질의 메티오닌 코돈에 이은 세린 코돈 사이의 서열을 PCR 기술에 의해 부위-지향성 돌연변이로 제거한다(ex-PCR 부위). PCR 후 수득된 IRES와 EBNA1의 전체 서열은 완전히 서열화된다(도 4A).
5. 벡터 pCITE-EBNA1의 XbaI-PstI 단편(2546 bp)을 미리 탈포스포릴화된 플라스미드 pICpA의 XbaI과 PstI 부위 사이에 클로닝시켜, 벡터 pCITE-EBNA1-pA를 생성한다(도 4A).
6. 벡터 pCITE-EBNA1-pA의 ClaI-EcoRI 단편(2945 bp)을 벡터 pLox-ori 중으로 클로닝하고, ori의 말단에 위치된 EcoRI 부위를 부분적으로 절단한 다음, ClaI으로 절단하고 탈포스포릴화시켜 벡터 pLox-ori-CITE-EBNA1-pA를 생성한다(도 4B).
7. BsaW1을 이용한 부분 절단과 클레나우 DNA 폴리머라제를 이용한 BsaW1 부위의 수선에 의해 수득된, 벡터 pCMV-TK의 ClaI-BsaW1 단편(1270 bp)을 벡터 pLox-ori-CITE-EBNA1-pA의 ClaI와 PvuII 사이에 클로닝시켜 벡터 pLox-ori-CITE-TK-EBNA1-pA를 생성한다(도 4B).
8. RSV LTR 프로모터 서열에 상응하는 플라스미드 pRSV-TK의 BamHI-SalI 단편(600 bp)을 미리 탈포스포릴화된 벡터 pLox-ori-CITE-TK-EBNA1-pA의 BamHI과 SalI 부위 사이에 클로닝시켜, 플라스미드 pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNA1-pA를 생성한다(도 4B).
2.2. 플라스미드 pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1의 작제(도 5)
상기 실시예 2.1에서 기술되고 도 4A에서 설명된 클로닝 1-6은 벡터 pLox-ori-pRSV-TK-CTIE-EBNA1-pA과 Lox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNA1-pA의 작제에 있어 공통된다.
7. RSV LTR 프로모터의 클로닝을 실시예 2.1의 단계 7에 따라 수행한다(도 5).
8. 핵 국재 시그널(NLS) 다음의 LacZ 유전자에 상응하는 벡터 pRSV-GalIX의 BamHI-StuI 단편(3205 bp)을 미리 탈포스포릴화된 벡터 pIC20H의 SmaI과 BglII 부위 사이에 클로닝시켜, 플라스미드 pICLacZ를 생성한다(도 5).
9. 벡터 pICLacZ의 XbaI-NruI 단편(3205 bp)을 벡터 pLox-ori-pRSV-CITE-EBNA1-pA의 XbaI과 PvuII 부위 사이에 클로닝시켜 벡터 pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNA1-pA를 생성한다(도 5).
실시예 3. 플라스미드 CMV-Cre(pBS185) 및 LoxP-oriP-TK-EBNA.1 또는 LoxP-oriP-LacZ-EBNA1의 보조하에 인간세포(Hela-EBNA1; 143B-TK-)의 동시 형질감염에 의한 시스템 검증
3.1. 시험관내에서의 검증
EBNA1 유전자를 안정하게 발현시키는 Hela 세포주를 플라스미드 pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1과 사이토메갈로바이러스 프로모터(pBS185)의 통제하에 재조합 효소 Cre에 해당되는 유전자를 발현시키는 플라스미드로 형질감염시킨다. LacZ 유전자를 발현시키는 카세트의 재조합 효율과 기능은 세포내에서 단지 재조합 효소 Cre의 존재하에서만 관찰되는, β-갈락토시다제 활성으로 평가된다. 얻어진 결과는 LoxP 부위간의 재조합 후에 LacZ 유전자 발현의 활성화 및 에피솜의 형성에 의해 재조합 효소 Cre의 작용하에 레플리콘의 생성 효율이 드러남을 입증하고 있다. 또한, 공형질 감염된 세포를 3주간 배양한 후[주당 1회 계대(1:10 희석)], LacZ 유전자를 발현시키는 세포 비율의 유지가 관찰되지만, LacZ의 발현은 복제기원 oriP를 보유하지 않은 대조군 플라스미드로 형질감염된 세포에서는 나타나지 않는데, 이는 작제물에서 oriP의 작용 특성을 입증한다.
또한, TK-세포주(143TK-)를 플라스미드 LoxP-ori-TK-EBNA1과 pBS185로 동시 형질감염시킨다. TK 유전자를 발현시키는 형질 감염된 세포를 HAT 배지에서 선별한다. 세포 분열 동안 TK 유전자 발현의 안정성 및 이에 따른 oriP-EBNA1 시스템의 활성은 허피스 바이러스의 TK 단백질에 특이적인 모노클로날 항체에 의해 면역형광으로 확인된다. 에피솜의 존재 및 세포 분열 동안 이의 복제는 특정 프라이머와 함께, Hirt 기술에 이어, PCR 기술에 의한 에피솜 DNA의 증폭에 의해 알 수 있다.
3.2. 생체내에서의 검증
생체내에서 이러한 작제물의 활성은 Hela 또는 Hela-EBNA1 세포를 누드 마우스에 피하 주사하여 유도된 플라스미드 pLoxP-ori-TK-EBNA1 또는 pLox-ori-LacZ-EBNA1과 pBS185 DNA의 종양내 주사(전기투공)에 의해 시험된다. 이러한 동일 플라스미드로 미리 동시 형질감염된 세포의 주입이 병행하게 수행된다. 이러한 작제물에 의해 형질 도입된 종양내의 트랜스진(TK 또는 LacZ)의 유지는 복제기원을 보유하지 않은 대조군 플라스미드와 비교하면서, 면역 조직 화학으로 분석된다.
실시예 4. 재조합 및 에피솜 유지 시스템의 분석
4.1. 플라스미드 pCre의 작제
플라스미드 p-Cre는 SV40 바이러스 T 항원의 핵 국재 시그널을 지닌 5'에서 융합되고 허피스 바이러스의 티미딘 키나제(TK) 프로모터를 이용하여 발현되는, 재조합 효소 Cre에 대한 유전자를 함유한다. TK 프로모터 대신, 테트라사이클린 또는 MMTV 프로모터에 의해 조절된 프로모터를 운반하는 유사한 작제물을 제조한다. 또한, Cre-ER 융합을 운반하는 카세트도 제조된다.
4.2. 플라스미드 pRep의 작제
EBNA1 단백질없이, β-갈락토시다제 유전자(Zeo-LacZ), oriP 및 사이토메갈로바이러스 초기 주 프로모터(P.CMV)와 플레오마이신 내성 유전자의 융합을 함유한 레플리콘 플라스미드(pRep)를 하기와 같이 작제한다.
LacZ 유전자 및 SV40 바이러스 폴리아데닐화 시그널을 함유한 플라스미드 pRSV-Gal-IX의 StuI-ClaI 단편(1149-4553)을 pLox-ori의 ClaI과 EcoRV 부위(2029-2032) 사이에 클로닝시켜(실시예 2 및 도 4) 플라스미드 pLox-ori-LacZ를 생성한다.
CMV 초기 프로모터를 함유한 pCEP4의 BglII-BglII 단편(473-1226)을 pLox-ori-LacZ의 BamH1 부위에 클로닝시켜 pLX2를 생성한다.
pLX2에서 LacZ 유전자의 5' 말단(Xba1-ClaI 단편)을 플라스미드 pUT651의 NcoI-ClaI 단편으로 치환한다(CAYLA, 표 1). 클로닝을 용이하게 하기 위해, 이 단편을 플라스미드 pIC20RpA의 EcoRV와 ClaI 부위 사이에 미리 아클로닝시킨 다음 XbaI과 ClaI으로 절단하고 pLX2의 XbaI과 ClaI 부위 사이에 클로닝한다.
대조군 플라스미드는 복제기원(OriP)이 결여된 pRep와 동일한 구조를 함유한다.
4.3.-플라스미드 pRep-EBNA1의 작제
ECMV IRES로부터 EBNA1을 발현시키는 카세트는 플라스미드 pCITE-EBNA1-pA로부터 부위-지향성 돌연변이에 의해 작제되고 아데노바이러스 셔틀 벡터 pAdLX2(5-2-2) 중으로 클로닝되어 pAdLX2-EBNA1 또는 pRep-EBNA1을 생성한다. IRES 및 초기 EBNA1은 완전히 서열화된다. IRES를 이용한 EBNA1의 발현은 pRep-EBNA1으로 형질감염된 Hela 세포에서 웨스턴 블롯에 의해 분석된다. pCITE-EBNA1pA의 작제를 위해 제공된 플라스미드 pCMV-EBNA1은 대조군으로 작용한다.
4.4.- 시험관내에서의 검증
4.4.1. Hela-EBNA1 세포에서 재조합 및 에피솜 유지의 분석
제 1 단계에서, 본질적으로 pRep 단독 또는 pCre와 EBNA1 단백질을 발현시키는 Hela 세포(Hela-EBNA1)의 형질감염 실험은 두개의 플라스미드의 동시 형질감염이 β-갈락토시다제 유전자의 레플리콘의 절개 및 이의 발현 유도를 허여함을 보여준다. 레플리콘 플라스미드만으로 형질감염된 대조군 세포는 일정하지만 실질적으로는 무시할 수 있을 정도의 β-갈락토시다제 활성 백그라운드 노이즈를 보여준다. 트랜스진의 발현은 1개월 동안 2 아배양/주(week)의 속도(24회의 세포 분열과 일치)로 세포의 연속적인 계대 동안 모니터링된다. pRep+pCre로 형질감염된 세포에서, β-갈락토시다제의 발현은 전체 실험 기간 동안 유지되지만 이는 복제기원 oriP를 운반하지 않는 대조군 플라스미드로 동시 형질감염된 세포에서는 빠르게 소실된다(수회의 세포 분열 후).
제 2 단계에서, (pRep+pCre)로 동시 형질감염된 세포는 플레오마이신의 존재로 선별된다. 에피솜 DNA는 Hirt 기술로 분리되고, 그렇지 않으면 유일한 XboI 부위의 수준에서 절단되어 선형화된 다음 DNA가 실제로 진핵 세포에서 복제되었는지를 입증하기 위해 MboI으로 임의로 절단된다. 이렇게 수득된 샘플의 서던 블롯 분석은 예측된 크기의 레플리콘의 존재를 확인시킬 수 있다. 세포당 추정된 카피수는 1 내지 10이다. 선별된 세포는 선택압의 존재 또는 부재하에 유지된다. 이러한 두 조건하에, 세포 분열 동안 β-갈락토시다제 발현의 유사한 유지는 느리면서 일정한 감소와 함께 관찰된다. 27회 분열 후, β-갈락토시다제 활성은 시험관내에서의 직접 염색에 의해 세포의 25%에서 여전히 검출될 수 있다. 이러한 결과는 1회 분열할 때마다 에피솜의 97% 분리 안정성과 일치한다. 이는 공개된 결과와 일치하고; 실제로, 1 내지 5%/분열의 상실 속도가 보고되고 있다(Simpson et al., 1996).
4.4.2. Hela 세포에서 EBNA1의 기능 분석
pRep-EBNA1 및 pCre를 이용한 Hela 세포의 동시 형질감염 실험은 EBNA1이 IRES를 이용하여 정확히 발현되고 연속 계대 동안 β-갈락토시다제의 발현 유지의 보장을 체크할 수 있다. 동일한 플라스미드로 형질감염된 Hela-EBNA1 세포는 대조군으로 작용한다.
4.5. 생체내 누드 마우스에서 유도된 종양 모델의 검증
Hela 및 Hela-EBNA1 세포는 누드 마우스에서 발암성이고, 106세포의 피하 주사는 8일만에 검출될 수 있는 매우 빠르게 성장하는 종양의 형성을 유도하고, 1개월간 모니터링될 수 있다. 첫 번째 실험에서, pRep와 pCre로 형질감염된 다음 시험관내에서 플레오마이신의 존재하에 선별된 Hela-EBNA1 세포를 주입한다. X-gal로 염색 후 21일만에 종양(직경 3 ㎝)을 분석하면 이 모델의 생체내 레플리콘의 유지를 입증한다.
두번째 실험에서는, pRep로 형질감염된 다음 AdCre로 감염된 Hela-EBNA1 세포(비교: 실시예 5.2)를 주입한다. 재조합의 부재하에 LacZ를 발현시키고 oriP를 운반하거나 달리 동시에 주입된 pRep로부터 유도된 두 플라스미드로 형질감염된 세포는 대조군으로 작용한다. 21일만의 종양 분석은 제 3 세대 Cre 아데노바이러스가 레플리콘의 절개를 허여하고 이의 존재는 세포 활성 또는 에피솜 설정의 제 1 단계를 변형시키지 않음을 입증한다. oriP를 운반하지 않는 대조군 플라스미드로 형질감염된 세포에서는 어떠한 β-갈락토시다제 활성도 검출될 수 없음을 주목해야 한다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 작제물이 생체 내 종양 세포에서 기능을 띠고; 에피솜도 또한 21일 후에 안정화되는 것을 보여준다.
실시예 5. 1세대와 3세대 재조합 아데노바이러스의 작제
본 실시예는 부위-특이성 재조합에 의해, 생체 내에서 환상의 복제성 분자를 생성할 수 있는 영역을 포함하는 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 작제에 관해 기술하고 있다. 이들 바이러스 벡터는 재조합을 허여하는 재조합 효소를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.
5.1. 1 세대 아데노바이러스의 제조(플라스미드 pBS185, pLox-oriP-TK-EBNA1 및 pLox-oriP-LacZ-EBNA1으로부터)
재조합 효소 Cre를 발현시키는 카세트 및 LoxP 부위를 포함하는 레플리콘의 완전서열은 벡터 pBS185 및 pLox-oriP-TK-EBNA1 또는 pLox-oriP-LacZ-EBNA1으로부터 E1 영역의 전부 또는 일부(Add1327; △E1-△E3)가 제외된 아데노바이러스 벡터의 E1 영역 중으로 클로닝된다. 재조합 아데노바이러스는 세포 293에서 종래의 상동성 재조합 기술에 의해 분리된다. 바이러스 벡터는 또한 아데노 5 △E1△E3의 게놈을 함유한 플라스미드에 의해 이. 콜라이에서 이중 재조합으로 제조될 수 있고, 그 다음 바이러스 게놈은 적절한 세포주에서 아데노바이러스 입자로 캡슐화된다. 클로닝능을 고려하면, LacZ 유전자는 유리하게는 보다 작은 마커 유전자로 대체될 수 있다.
5.2. 3세대 아데노바이러스의 제조
3세대 아데노바이러스의 사용은 안정적인 측면 뿐만 아니라 염증반응의 감소 및 트랜스진 발현의 안정성 증가의 측면에서, 1세대의 것에 비해 특정 이점을 가진다. 이러한 벡터는 또한, 증가된 클로닝능 및 시험관내 및 생체내에서의 직접적인 세포변성 효과의 부재를 지닌다.
3세대 벡터(Adl1007; △E1△E3△E4)는 또한 적절한 패키징 세포에서 기존의 상동성 재조합 기술(WO 96/22378) 또는 이. 콜라이에서 이중 재조합에 이은 패키징에 의해 제조될 수 있다.
두 아데노바이러스는 상술된 방법에 따라 E1 영역을 변형시키도록 의도된, 3세대 아데노바이러스 게놈 pXL2811(pRSV-bGal-△E1,△E3,△E4-dl1007-SspI) 및 pXL2789(p△E1,△E3,△E4-dl1007-SsaI)를 함유한 이. 콜라이 세포, 및 자살 플라스미드(Kana-SacB) pMA37 또는 pXL3048에 의한 이중 재조합으로 작제된다(참조문헌: Crouzet et al., 1997 PNAS, 94:1414; WO96/25506).
5.2.1. Cre 아데노바이러스(Cre-Ad)의 제조
플라스미드 pMC-Cre의 XhoI-BamHI(451-2057)(표 1)를 클레나우로 수선하고 자살 플라스미드 pMA37의 EcoRV 부위에 클로닝시킨다.
플라스미드 pXL2811로 이중 재조합에 의해 수득된 아데노바이러스 게놈을 PacI으로 절단하여 선형화시키고 리포펙타민(GIBCO)을 이용하여 IGRP2 세포(WO96/22378) 중으로 형질감염시킨다. 이렇게 생성된 3.0개의 Cre-Ad를 동일한 세포에서 증폭시킨 다음 통상의 기술(세슘 클로라이드)에 따르거나 크로마토그래피에 의해 정제한다(FR96/08164).
Cre 아데노바이러스 게놈의 구조는 효소 절단으로 알 수 있다.
5.2.2. Rep 아데노바이러스(Rep-Ad)의 제조
플라스미드 pLX2를 BamHI으로 절단한 다음 재환형화시켜 LacZ 유전자의 5'의 SV40 폴리아데닐화 시그널을 제거한다. 이렇게 얻어진 플라스미드의 NotI-NotI 단편(1-6145)을 클레나우로 수선한 다음 BamHI과 SalI로 미리 절단된 자살 벡터 pXL3048의 EcoRV 부위에 클로닝시키고, 이들 두 부위를 파괴하기 위해 클레나우로 수선한 다음 재환형화시켜, 플라스미드 pAdLX2를 생성한다. 돌연변이된 플라스미드 pCITE-EBNA1pA의 XhoI-SalI 단편(441-3457)을 미리 수득된 플라스미드 pAdLX2의 Xho1 부위에 클로닝시켜, 플라스미드 pAdLX2-EBNA1(pRep-EBNA1)을 생성한다.
Cre-Ad에 대한 상술된 기술에 따라, 플라스미드 pAdLA2-EBNA1 및 pXL2789와의 재조합에 의해 Rep-Ad를 수득한다.
5.2.3. Rep/Cre 아데노바이러스의 제조(도 6)
재조합 효소 Cre에 대한 레플리콘과 유전자 모두를 운반하는 Rep-Cre 아데노바이러스를 작제한다. 본 방법은 특히 시험관내에서 레플리콘의 전달 효율을 증가시킬 수 있다. Cre 발현 카세트를 아데노바이러스 게놈 중 E1, E3 또는 E4 영역으로 삽입한다. IGRP2 세포에서 증식 도중, 아데노바이러스 게놈으로부터 레플리콘의 절개를 막기 위해서는 완벽하게 조절된 재조합 효소의 발현이 요구된다.
전사 수준(생체내에서 활성화된 조직-특이성 프로모터 또는 유도성 프로모터) 또는 후-전사 수준(스테로이드 호르몬 수용체 Cre-ER의 부착 도메인과 Cre의 융합)에서 재조합 효소의 발현 조절이 관찰된다.
이러한 아데노바이러스를 작제하기 위해, 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 레플리콘을 플라스미드 pXL2789 중으로 도입한다. 프로모터 tet 또는 MMTV, 또는 Cre-ER 융합을 포함하는 Cre의 발현 카세트를 이.콜라이에서의 이중 상동성 재조합에 의해 상기 플라스미드에 도입시켜 플라스미드 pRep-Cre1(E1에서 Rep 및 Cre)과 pRep-Cre2(E1의 Rep 및 E4의 Cre)를 생성한다. 이들 플라스미드를 PacI로 처리하여 상응하는 바이러스를 생성하기 위해 IGRP2 세포 중으로 도입된 재조합 바이러스 게놈을 추출한다.
5.2.4. Rep/Psi 아데노바이러스의 제조(도 7)
이 작제물은 Cre 활성의 완벽한 조절이 이루어질 수 없는 경우에 레플리콘이 결여된 아데노바이러스로 인한 Rep-Cre-Ad의 오염을 유리하게 피할 수 있다. 본 방법은 레플리콘 중으로 캡슐화 시그널 Psi의 삽입에 기초한다. 벡터 pXL3048은 캡슐화 시그널을 제거하고 LoxP 부위를 도입하기 위해 ITR 영역의 수준에서 부위-지향성 돌연변이로 변형되어, 플라스미드 pXL3048-△Psi-LoxP를 생성한다. "좌측 LoxP"가 제거된 레플리콘 서열은 효소 절단에 의해 플라스미드 pAdLX2 또는 pAdLX2-EBNA1로부터 분리되고 플라스미드 pXL3048-△Psi-LoxP의 EcoRV 부위에 클로닝된다.
실시예 6. 두 재조합 아데노바이러스를 이용한 동시감염에 의한 시스템 검증
본 발명의 바이러스 벡터의 기능은 시험관내 및 생체내에서 조절된다:
6.1. 시험관내에서 다양한 세포주의 감염에 의한 검증
Cre 아데노바이러스의 재조합 효소 활성은 pRep로 형질감염된 시험관내 Hela-EBNA1 세포 및 마우스 배 세포주(LoxP-βgal)에서 입증되는데 여기서 LacZ의 발현은 두 LoxP 부위 사이의 재조합에 의해 활성화될 수 있다.
아데노바이러스 게놈 기원 레플리콘의 절개 효과는 Rep-Ad 및 Cre-Ad로 동시감염된 IGRP2 세포에서 연구된다.
Hirt 기술에 의해 분리되고 XhoI로 절단된 바이러스 DNA의 직접 분석은 Rep-Ad 게놈으로부터 절개되지 않은 레플리콘에 상응하는 단편의 완전한 소실을 보여주는데, 이는 두 LoxP 부위간의 재조합 효율을 입증한다. 동일한 샘플의 서던 분석은 레플리콘에 상응하는 9.2 kb 단편을 보여줄 수 있다.
Rep-Ad와 Cre-Ad로 동시감염된 Hela 세포에서, β-갈락토시다제 활성은 48시간만에 세포의 50%에서 관찰되지만 Rep-아데노만으로 감염된 세포에서는 β-갈락토시다제 활성이 검출되지 않는다. 96시간 후, LacZ를 발현시키는 세포 수는 세포 분열과 동시에 증가한다. 세포의 계대배양 후, LacZ의 발현은 동시감염 후 최소 20일간은 추가로 유지된다. 이러한 결과는 (i) 레플리콘이 이러한 두 아데노바이러스의 동시감염에 의해 세포 중으로 효율적으로 전달될 수 있고, (ii) 재조합은 레플리콘을 방출시켜 트랜스진의 발현을 활성화시키며 (iii) 레플리콘이 세포 분열 동안 트랜스진의 안정한 발현을 보장할 수 있음을 입증한다.
6.2. 생체내에서의 검증
생체내에서의 검증은 누드 마우스에서, 미리 Rep-Ad와 Cre-Ad로 동시감염된 일반 인간세포(케라틴 생성세포, 조혈 간세포(CD34+), 기관지 상피 간세포, 근원세포 등) 또는 발암성 인간세포(MDA, HT29 등)의 전이로 입증된다.
세포 분열 동안 트랜스진의 발현 및 에피솜의 안정성은 상술된 기술로 확인된다.
서열목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 시: 앙토니
(D) 국가: 프랑스
(E) 우편 번호: 920165
(ii) 발명의 명칭: 복제성 분자의 생체내 제조방법
(iii) 서열 수: 3
(iv) 컴퓨터 판독형태:
(A) 매체형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영체제: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30(EPO)
(2) 서열번호 1의 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(xi) 서열배열: 서열번호: 1:
(2) 서열번호: 2의 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 유형:뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(xi) 서열배열: 서열번호:2:
(2) 서열번호: 3의 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길이: 147 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(xi) 서열배열: 서열번호: 3:
에피솜 작제에 사용된 서열의 기원
서열 단편 크기(bp) 기원
LoxP NotI (1-296) 34 pBS246 (GIBCOBRL)
RSV LTR BamHI-SalI(478-1080) 602 pRSV-TK(WO95/14101)
oriP EcoRI-HpaI(5052-3235) 1817 pSLori(WO95/14101)
SV40 폴리A BamHI-SalI(406-7) 399 pCEP-4(In Vitrogen)
EBNA-1 BamHI-PstI(759-2803) 2044 pCMV-EBNA(Clontech)
IRES (16-518) 502 pCITE 2a(Novagen)
TK ClaI-BsawI(1721-556) 1165 pCMV-TK-E1(Gene Therapy 3 (1996) 315)
pIC19H 2700 Marsh et al., Gene 32(1984) 481
pIC20H 2700
pIC20R 2700
pBluescriptII-KS 2850 (Stratagene)
hCMV BglII-BglII(473-1226) 753 pCEP4(IN VITROGEN)
LacZ StuI-BamHI(1149-4354) 3205 pRSVGalIX(L.Stratford- Perricaudet,J.Clin.Invest 1992 p 626)
hCMV-Cre-MTpA HindIII-HindIII(0-3400) 3400 pBS185(GIBCO-BRL)
Zeo-Lac NcoI-ClaI(750-1980) 1230 pUT641(CAYLA)

Claims (31)

  1. 부위-특이성 재조합을 허용하고 직접 배향으로 위치되어 있는 두 서열에 의해 둘러싸여 있고, 적어도 하나의 복제기원 및 하나의 해당 유전자를 포함하고 있는 DNA 영역을 포함하는 바이러스 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 복제기원이 EBV 바이러스의 복제기원, 파필로마바이러스의 복제기원, 및 ARS 서열 중에서 선택됨을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 복제기원이 EBV 바이러스의 복제기원임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 복제기원의 활성이 부위-특이성 재조합에 의존함을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 복제기원이 EBV 바이러스의 oriP 영역 및 발현이 부위-특이성 재조합에 의존하는 EBNA1 단백질을 암호화하는 서열을 포함함을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  6. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 해당 유전자의 발현이 부위-특이성 재조합에 의존함을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  7. 부위-특이성 재조합을 허용하고 직접 배향으로 위치되어 있는 두 서열에 의해 경계지워지며, 포유류 세포에서 기능을 띠는 프로모터, EBV 바이러스의 oriP 서열, 유전자를 포함하는 발현 카세트 및 ECMV 바이러스로부터 유도된 IRES 서열에 의해 분리되어 있는 EBNA1 단백질에 대한 유전자를 연속적으로 포함하고 있는 DNA 영역을 포함하며, 프로모터와 발현 카세트가 두 유전자의 발현이 부위-특이성 재조합 후에만 가능하게 되도록 배향됨을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  8. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열이 리콤비나제의 존재하에서 특이적으로 재조합할 수 있는 서열임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열이 박테리오파지로부터 유도됨을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열이 P1 박테리오파지로부터 유도됨을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서, 재조합이 리콤비나제 Cre에 의해 유도되는 P1 박테리오파지의 역 반복 서열(loxP 영역)을 수반함을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  12. 제 8 항에 있어서, 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열에 의해 경계지워지는 영역 외측에, 상응하는 리콤비나제를 암호화하는 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  13. 제 12 항에 있어서, 리콤비나제를 암호화하는 유전자가 유도성 프로모터의 조절하에 배치됨을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서, 프로모터가 덱사메타존에 의해 유도가능한 MMTV 프로모터 및 테트라사이클린에 의해 유도가능한 프로모터 중에서 선택됨을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  15. 제 13 항에 있어서, 리콤비나제에 대한 유전자가 호르몬 수용체 결합 도메인을 암호화하는 조절 요소를 추가로 포함함을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서, 글루코코티코이드, 미네랄로코티코이드, 타이로이드, 에스트겐, 알도스테론 및 레티노산 수용체 중에서 선택된 수용체임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  17. 제 1 항 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 캡시드화 영역이 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열에 의해 둘러싸인 DNA 영역에 포함되어 있음을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  18. 제 1 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 결손 재조합 아데노바이러스임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  19. 제 18 항에 있어서, E1 영역의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 아데노바이러스임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  20. 제 19 항에 있어서, E4 영역의 전부 또는 일부의 결실을 추가로 포함하는 아데노바이러스임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  21. 제 1 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 결손 재조합 레트로바이러스임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  22. 제 1 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 결손 재조합 AAV임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  23. 제 1 항 내지 22 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터의 삽입에 의해 변형된 세포.
  24. 제 23 항에 있어서, 진핵세포임을 특징으로 하는 세포.
  25. 제 1 항 내지 22 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 바이러스 벡터 또는 제 23 항에 따른 세포를 포함하는 약학 조성물.
  26. 제 8 항에 따른 바이러스 벡터를 함유하는 세포 집단을 부위-특이성 재조합을 현장에서 유도가능케 하는 리콤비나제와 접촉시킴을 특징으로 하는, 환상의 복제성 DNA 분자의 현장 제조방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 리콤비나제와 접촉시키는 단계가 세포를 리콤비나제에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 형질감염시키거나 감염시킴으로써 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  28. (i) -리콤비나제의 존재하에 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열에 의해 둘러싸여 있고 직접 배향으로 위치되어 있으며, 적어도 하나의 복제기원 및 하나의 해당 유전자를 포함하는 DNA 영역, 및
    -유도성 프로모터의 조절하에 리콤비나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 바이러스 벡터에 의한 세포의 형질전환, 및
    (ii) 리콤비나제의 발현 유도를 포함하는, 복제성 환상 DNA 분자의 현장 제조방법.
  29. 복제성 환상 DNA 분자의 현장 생성을 위한 바이러스 벡터의 용도.
  30. (i) -리콤비나제의 존재하에 부위-특이성 재조합을 허용하는 두 서열에 의해 둘러싸여 있고 직접 배향으로 위치되어 있으며, 적어도 하나의 복제기원 및 하나의 해당 유전자를 포함하는 DNA 영역, 및
    -유도성 프로모터의 조절하에 리콤비나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 바이러스 벡터에 의한 세포의 형질전환, 및
    (ii) 리콤비나제의 발현 유도를 포함하는, 핵산의 세포 중으로의 전달방법.
  31. 적어도 (i) 발현에 필수적인 서열을 갖는 하나 이상의 해당 유전자,
    (ii) EBV 바이러스의 복제기원 oriP, 및
    (iii) 두 서열 간의 특이성 재조합으로 생기는 영역을 포함함을 특징으로 하는 재조합성 환상 DNA 분자.
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