KR20000016161A - 형광에 의한 dna 증폭 모니터링 방법 및 시스템 - Google Patents

형광에 의한 dna 증폭 모니터링 방법 및 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20000016161A
KR20000016161A KR1019980709729A KR19980709729A KR20000016161A KR 20000016161 A KR20000016161 A KR 20000016161A KR 1019980709729 A KR1019980709729 A KR 1019980709729A KR 19980709729 A KR19980709729 A KR 19980709729A KR 20000016161 A KR20000016161 A KR 20000016161A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fluorescence
sample
temperature
chamber
biological sample
Prior art date
Application number
KR1019980709729A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100479767B1 (ko
Inventor
칼 티. 위터
커크 엠. 리리
랜디 피. 라스센
데이비드 알. 힐야드
Original Assignee
프레드한 아룬디프 에스
유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프레드한 아룬디프 에스, 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 filed Critical 프레드한 아룬디프 에스
Priority to KR10-1998-0709729A priority Critical patent/KR100479767B1/ko
Publication of KR20000016161A publication Critical patent/KR20000016161A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100479767B1 publication Critical patent/KR100479767B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5082—Test tubes per se
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B01L2300/0838—Capillaries
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1838—Means for temperature control using fluid heat transfer medium
    • B01L2300/1844—Means for temperature control using fluid heat transfer medium using fans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/0303—Optical path conditioning in cuvettes, e.g. windows; adapted optical elements or systems; path modifying or adjustment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/07—Centrifugal type cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/025—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having a carousel or turntable for reaction cells or cuvettes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

열 싸이클링 방법 및 장치가 발표된다. 이 장치는 DNA 폴리메라제 연쇄반응과 같은 여러 생물학적 절차를 수행하는데 필요한 온도범위에 대해서 신속하고 정확하게 온도가 조절될 수 있는 샘플챔버를 포함한다. 생물학적 샘플은 유리 마이크로 모세관 튜브에 충진되고 이후에 샘플 챔버 내부에 위치된다. 프로그램가능한 제어기는 샘플 챔버 내부의 샘플 온도를 조절한다. DNA 증폭의 모니터링은 싸이클당 한 번 또는 싸이클당 여러번 형광에 의해 모니터링 된다. 본 발명은 DNA 정량화에 강력한 도구인 PCR 형광 모니터링 방법을 제공한다.

Description

형광에 의한 ＤＮＡ 증폭 모니터링 방법 및 시스템
다양한 산업, 기술 및 연구 분야에서 비교적 적은 샘플을 신뢰성 있고 재현성 있게 열 싸이클링을 받게할 필요가 있다. 샘플을 반복된 열 싸이클을 받게할 필요성은 특히 생물공학 분야에서 절실하다. 생물공학 분야에서 짧은 기간에 걸쳐서 작은 샘플을 반복적으로 가열 및 냉각할 필요가 자주 발생한다. 정기적으로 수행되는 이러한 생물학적 과정은 주기적 DNA 증폭이다.
열안정성 DNA 폴리메라제를 사용하는 주기적 DNA 증폭은 "폴리메라제 체인 반응"이라고 널리 알려진 프라이머 특이성 DNA의 자동 증폭을 허용한다. 이러한 과정의 자동화는 통상 복수의 용기에 담긴 반응 혼합물의 조절되고 정확한 열 싸이클링을 필요로 한다. 과거에 선호되는 용기는 플라스틱 마이크로 튜브였다.
시간에 대한 필요한 온도구배를 통해서 마이크로 튜브에서 샘플의 열 싸이클링을 하기 위해서 과거에는 프로그램가능한 금속 열 블럭이 사용되었다. 그러나, 짧은 기간에 걸쳐서 넓은 온도 범위에서 열블럭의 온도를 신속하고 정확하게 조절할 수 없으므로 폴리머아제 체인 반응을 수행할 때 열 제어 시스템으로서 열블럭 형태의 장치가 바람직하지 않게 되었다.
게다가, 일반적으로 사용된 마이크로 튜브는 단점이 있다. 마이크로 튜브 재료, 이의 벽두께, 및 마이크로 튜브의 모양은 그속에 담긴 샘플의 신속한 가열 및 냉각에 장애가 된다. 마이크로 튜브의 벽두께 및 플라스틱 재료는 담긴 샘플과 주변 매체간에 절연체로서 작용하여 열에너지 전달을 방해한다. 또한 마이크로튜브의 모양은 열에너지 전달에 어떠한 매체가 사용되는지에 관계없이 작은 표면적을 제시한다. 당해 분야에서 최적이 아닌 모양을 가진 마이크로 튜브의 계속된 사용은 개선된 열전달(일정한 부피의 샘플에 대해서 샘플용기의 표면적을 증가시킴으로써 가능한)의 장점이 여태까지 인식되지 않았음을 표시한다.
게다가, 유체식 전환(또는 기계적 전달)을 하는 수조를 사용하는 장치가 폴리메라제 연쇄반응을 위한 열적 순환기로 사용된다. 수조는 반응에 필요한 시간대 온도 구배를 통해 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물을 싸이클링시키는데 사용되었지만 물의 높은 열질량과 플라스틱 마이크로 튜브의 낮은 열 전도성은 장치의 성능 및 반응의 수율을 크게 제한시켰다.
수조를 사용한 장치는 성능에 있어서 제한적이다. 그 이유는 물의 열질량이 달성될 수 있는 시간에 대한 최대 온도 그래디언트를 크게 한정시키기 때문이다. 또한, 수조 장치는 크기, 물전달 호스의 수, 및 외부 온도 조절 장치로 인하여 매우 복잡하다. 게다가, 수조 장치의 누수를 탐지할 목적으로 피팅의 주기적인 보수 및 조사는 귀찮고 시간 소모적이다. 마지막으로, 샘플 튜브내 온도를 필요한 정확도로 제어하는 것이 수조장치로는 곤란하다.
미국특허 3,616,264(Ray)는 생물학적 샘플을 일정한 온도로 가열 또는 냉각시키기 위해서 공기를 순환시키는 장치를 보여준다. Ray의 장치가 에어 챔버내의 온도를 일정하게 유지시키는데 다소 효과적이지만 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적 과정에 필요로 하는 시간대 온도 프로파일에 따라 주기적 방식으로 온도를 신속히 조절할 필요성에 대해서 강조하지 않는다.
미국특허 4,420,679(Howe) 및 4,286,456(Sisti)는 가스 크로마토그래피 오븐을 발표한다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 가스 크로마토그래피 과정을 수행하는데 적합하지만 이전에 언급된 장치에 의해 제공되는 것보다 빠른 열적 싸이클링을 제공하지 못한다. 신속한 열적 순환은 많은 과정을 수행하는데 유용하다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 이러한 반응을 빠르고 효과적으로 수행하는데는 부적합하다.
특히, 폴리메라제 연쇄반응(PCR)은 분자생물학의 기본이며 임상 실험실에서 중요한 분자공학 기술이다. 이의 유용성 및 대중성에도 불구하고 PCR에 대한 현재의 지식은 그다지 진보하지 못했다. 증폭은 시행착오에 의해 최적화되어야 하며 프로토콜은 맹목적이었다. 당해분야에서 PCR에 대한 제한된 이해는 당해분야의 숙련된 자가 이해없이 강력한 기술을 활용하는데 얼마나 만족하는가에 대한 좋은 예이다.
PCR을 샘플의 온도 순환을 필요로 한다. 공지기술이 온도 순환을 느리게 시킬 뿐만 아니라 PCR의 기본 원리를 무시하며 PCR을 더욱 유용하게 하는데 사용될 수 있는 기본원리를 무시한다. 따라서, PCR을 빠르게 수행하며 일어나는 반응을 분석하는 장치 및 방법을 제공한다면, 특히 이러한 반응이 실시간으로 분석된다면 당해분야에서 큰 진보일 것이다.
본 발명은 반응의 진행을 모니터링하면서 PCR 샘플을 신속히 제어하는 장치에 관계한다. 특히 본 발명은 반응을 모니터링하면서 신속한 PCR이 수행될 수 있게 하는 열 싸이클링 장치에 관계한다.
도 1 은 본 발명의 개념에 따라 순환적 DNA 증폭에 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 열적 싸이클링 장치의 사시도이다.
도 2 는 도 1 장치의 유체 챔버부위의 측면도이다.
도 3 은 도 1 에 도시된 장치의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.
도 4 는 본 발명의 또다른 구체예의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.
도 5 는 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용하여 폴리메라제 연쇄반응에 대한 최적화된 시간대 온도 프로파일을 보여준다.
도 6 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 어닐링 시간이 PCR 특이성 및 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 변성 시간이 PCR 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8a 및 8b 는 본 발명의 또다른 구체예의 사시도와 단면도를 보여준다.
도 8c 는 도 8a 및 8b 에 도시된 구체예에서 생물학적 샘플을 담는 모세관 튜브와 열발생요소의 관계를 나타내는 다이아그램이다.
도 9a 는 4개의 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물(A-D)을 보여준다.
도 9b 는 본 발명에 의해 사용된 또다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.
도 9c-g 는 본 발명에서 사용되는 다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.
도 10 은 본 발명에 따른 온도 기울기 제어회로의 블록선도이다.
도 11 은 본 발명에 따라서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러의 개략도이다.
도 11a 는 도 11 의 장치의 작동을 보여주는 시간대 온도 차트이다.
도 12 는 3차원 플롯으로도 도시된 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광을 2차원 플롯으로 보여주는 차트이다.
도 13 은 인간 β-글로블린 유전자의 536 베이스 쌍 조각에 대한 온도대 형광 투영도이다.
도 14 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광대 싸이클 횟수 플롯이다.
도 15 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광비대 싸이클 횟수 플롯이다.
도 16 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.
도 16a 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 싸이클횟수대 형광비 플롯이다.
도 17 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.
도 18 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 수많은 초기 템플레이트 복제물에 대한 싸이클 횟수대 형광 플롯이다.
도 19a-d 는 본 발명에 따라서 PCR 생성물의 서열 특이성 탐지를 제공하기 위한 2개의 선호되는 배열을 보여준다.
도 20 은 본 발명에 따라서 획득된 이중-라벨링된 가수분해 프로브를 써서 모니터링된 DNA 증폭에 대한 싸이클 횟수대 형광비(형광제/로오다민) 플롯이다.
도 21a-d 는 dsDNA 염료 SYBR Green I(A), 이중라벨링된 형광제/로오다민 가수분해 프로브(B), 및 Cy5-라벨링된 프라이머를 갖는 형광제-라벨링된 교합 프로브(c)를 포함하여 PCR에 대한 3개의 형광 모니터링 방법을 비교하는 것으로서, 도 21d 는 도 21a-c 에 도시된 3개의 모니터링 기술의 분산 계수를 보여준다.
도 22 는 PCR 형광곡선의 정량화를 위한 내삽방법의 적용을 보여주는 플롯이다.
도 23a 는 더 많은 프로브가 가수분해될 때 온도에 따른 형광비의 선형 변화와 형광의 증가를 보여주는 플롯이다.
도 23b 는 교합 프로브로 부터 형광비가 온도에 따라 급변함을 보여주는 플롯이다.
도 24 는 본 발명에 따라서 PCR동안 생성물쇄 상태의 온도 종속성을 보여주는 플롯이다.
도 24a 는 SYBR Green I 사용시 PCR의 형광대 온도 플롯이다.
도 25 는 본 발명에 따라서 생성물 용융 곡선의 최초성분과 경쟁 성분을 보여주는 플롯이다.
도 26 은 본 발명에 따라서 PCR생성물의 다양한 농도에서 생성물 재어닐링 속도에 대한 플롯이다.
도 27 은 속도상수의 초기 결정을 보여주는 플롯이다.
도 28 은 평형 PCR 패러다임과 동적 PCR 패러다임을 보여주는 그래프이다.
도 29 는 루틴 증폭의 선형 부위의 로그에서 10배의 동적 범위에 대한 모니터링이 수행됨을 보여준다.
도 30 은 단일 샘플의 연속 모니터링을 위해 구성된 본 발명의 구체예를 보여준다.
도 31 은 PCR샘플의 연속 모니터링을 위해서 본 발명에 따른 또다른 구체예의 광학적 배치를 보여준다.
도 32 는 모세관 샘플튜브의 측부보다 팁을 보여줌으로써 광 파이핑의 효과를 보여주는 차트이다.
도 33 은 모세관 샘플튜브를 사용할 때 관찰되는 편광이 활성화 비임에 대한 튜브의 위치선정에 달려있음을 보여주는 차트이다.
도 34 는 본 발명에 따라서 하나의 편광 프로브 사용시 수득되는 결과를 보여준다.
도 35 는 형광제와 로오다민 라벨 사이에 5개의 베이스를 갖는 프로브로 부터 나오는 형광 PCR 결과이다.
도 36 은 프로브 농도가 민감성에 미치는 효과를 보여준다.
도 37 은 본 발명에 따라서 가수분해 프로브의 공명에너지 전달에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 싸이클 횟수 플롯이다.
도 38 은 본 발명에 따라서 이중 라벨링된 형광제/Cy5 프로브의 공명에너지 전달에 의해 모니터링된 형광대 방출 파장 플롯이다.
도 39 는 교합 프로브의 공명에너지 전달에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 싸이클 횟수를 보여주는 플롯이다.
도 40 은 인접한 교합 프로브에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 온도 플롯이다.
도 41 은 가수분해 프로브에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 온도 플롯이다.
도 42a 는 온도와 형광간의 반비례 관계를 보여주는 형광대 시간 플롯이다.
도 42b 는 온도와 형광간의 반비례 관계를 보여주는 온도대 시간 플롯이다.
도 43 은 PCR 생성물의 겉보기 Tm이 가열속도에 종속됨을 보여주는 형광대 온도 플롯이다.
도 44 는 PCR 생성물의 Tm이 dsDNA 염료농도에 종속됨을 보여주는 온도대 상대 형광 플롯이다.
도 45 는 Tm이 2℃ 차이가 나는 두 개의 정제된 PCR 생성물이 혼합될 때 수득되는 용융곡선을 보여주는 온도대 형광 플롯이다.
도 46 은 각 PCR의 상대적 양이 정량될 수 있는 방법을 보여주는 플롯이다.
도 47 은 모세관 샘플튜브의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러의 개략도이다.
도 47a-d 는 샘플이 충진되는 복합 플라스틱/유리 용기를 보여준다.
도 48 은 형광 교합 모니터링에 유용한 시간대 온도 세그멘트를 보여준다.
도 49 는 용융 피크로서 표시된 용융 곡선 정보를 보여준다.
도 50 은 각 반응 싸이클동안 쇄의 상태를 모니터링할 수 있도록 PCR동안 온도의 함수로서 dsDNA 특이성 염료에서 나오는 형광의 플롯이다.
도 51 은 용융곡선 획득싸이클 플롯이다.
도 52a 는 PCR 생성물 용융곡선의 절대위치를 보여준다.
도 52b 는 변성온도를 통한 신속한 온도전이가 용융곡선을 더 높은 겉보기 Tm으로 이동시킴을 보여주는 플롯이다.
도 53 은 3개의 정제된 PCR 생성물의 용융곡선이다.
도 54 는 정제된 PCR 생성물이 혼합될 때 나오는 겹치는 용융곡선을 보여준다.
도 55 는 2℃미만으로 Tm이 차이가 나는 반응 생성물 혼합물을 별도의 피크로 분해할 수 있음을 보여주는 용융 피크로 전환후 결과를 보여준다.
도 56 은 프라이머 다이머와 같은 비특이성 생성물로 부터 목적 생성물을 구별시키는데 사용되는 용융곡선 분석 플롯이다.
도 57 은 초기 템플레이트 농도에서 변하는 일련의 반응동안 생성물의 폴리메라제 확장후 각 싸이클마다 획득된 상대 형광을 보여주는 플롯이다.
도 58 은 여러 샘플에 대해 획득된 용융 피크 플롯이다.
도 59 는 보정된 플롯을 제공하기 위해서 적당한 비율이 곱해진 도 57 데이타에 대한 플롯이다.
도 60 은 도 58 의 결과가 전기영동 결과와 상관함을 보여준다.
도 61 은 존재하는 다양한 생성물의 상대적 양을 추정하기 위해 도 56 에 도시된 용융 곡선이 생성물 피크로 분해될 수 있음을 보여준다.
* 부호 설명
10 ... 열적 싸이클링 장치 11 ... 챔버
12 ... 제어기 13 ... 하우징
14 ... 통기 도어 15 ... 하우징
16 ... 송풍기 장착 보오드 17 ... 솔레노이드 플랫포옴
18 ... 솔레노이드 19 ... 솔레노이드 전기자
20 ... 로드 21 ... 상부단부
22 ... 스프링 23 ... 지지 포스트
24 ... 전송 케이블 25 ... 입력키
26 ... 디스플레이 27 ... 샘플구획
28 ... 송풍기 29 ... 가열구획
30 ... 반응구획 31 ... 가열코일
32 ... 배플 33 ... 배플
34 ... 유체 복귀 구획 35 ... 열전쌍 센서
36 ... 입구 37 ... 출구
39 ... 가열구획 100 ... 장치
102 ... 하우징 104 ... 피트
106 ... 브라켓 108 ... 모세관 튜브
110 ... 발포물 112 ... 램프
112A ... 램프 소켓 112B ... 지지부
114 ... 하우징 입구 116 ... 팬
118 ... 모터 122 ... 모터 샤프트
124 ... 패들 126 ... 챔버입구
128 ... 통기도어 129 ... 힌리
130 ... 하우징 입구 132 ... 솔레노이드
136 ... 경로 200 ... 열전쌍
206 ... 집적회로 212 ... 회로
214 ...전위차계 218 ... 연산 증폭기
222 ... 회로 224, 226 ... 디지탈 아날로그 전환기
230 ... 전위차계 236, 238, 244 ... 저상
240 ... 합산회로 242, 246 ... 연산증폭기
248 ... 트랜지스터 250 ... 공급원
252, 256 ... 저장 254 ... 회로
260 ... AC 전류원 262 ... 램프
300 ... 온도싸이클너 302 ... 고온 공기원
304 ... 저온공기원 306, 308 ... 나일론 튜브
310 ... 샘플챔버 312 ... 통기구
314 ... 배출팬 316 ... 열전쌍
318 ... 샘플챔버팬 320 ... 모세관 튜브
322... 카루셀 324 ... 스테핑 모터
326 ... 구동 모듈 328 ... 형광 활성화 소스
332 ... 유리 334 ... 혼채
336, 340 ... 평철 렌즈 338 ... 간섭 필터
342, 344 ... 실리카 윈도우 348 ... 필터
350 ... 셔터 352 ... 셔터제어부
354 ... 비구면렌즈 356, 358 ... 필터
360A, 360B 평철렌즈 362A, 362 B ...광 배증관
364 ... 제어모듈 366A, 366B ... PMT 셔터
본 발명의 목적은 생물학적 샘플의 온도를 정확히 조절하는 장치를 제공하는 것이다.
예정된 시간 대 온도 프로파일에 따라서 생물학적 샘플의 온도를 빠르고 정확하게 변화시키는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.
다양한 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 적합한 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.
매우 짧은 기간에 걸쳐 샘플이 큰 온도 그래디언트를 받게 할 수 있는 낮은 열량의 열전달 매체를 가지는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.
열전달 매체로서 공기를 사용하여 생물학적 샘플이 신속한 열 순환을 받게 하는 장치 제공도 본 발명의 목적이다.
내부 히터를 사용하여 유체 챔버에 위치된 샘플을 가열하고 열순환에서 적절한 시기에 샘플을 냉각시키기 위해서 주변 유체를 챔버에 이동시켜 샘플을 냉각하는 열순환 장치 제공도 본 발명의 목적이다.
PCR을 빠르게 수행하며 반응을 동시에 모니터링하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.
PCR을 빠르게 수행하며 반응을 연속으로 모니터링하고 반응이 진행되는 동안 반응 매개변수를 조절하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.
본 발명은 수많은 절차 또는 공정을 수행하기 위해서 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 특히 적합한 장치이다. 선호되는 예에서 장치는 생물학적 샘플 유지수단을 포함한다. 생물학적 샘플 유지수단 또는 샘플 챔버에는 열에너지 유지를 위한 절연수단과 샘플챔버 내부를 가열하는 수단이 제공된다. 특히 고출력 백열등이 샘플 챔버 내부를 가열하는 수단으로 기능을 한다. 열 절연체는 샘플 챔버 내부에 라이닝 되어서 샘플 챔버내에서 램프에 의해 발생되는 열을 유지하고 절연 수단으로서 작용한다.
샘플 챔버를 신속히 냉각하기 위해서, 장치는 공기를 샘플챔버에 강제 주입하는 수단과 샘플챔버에 주입된 공기를 분산시키는 수단을 포함한다. 고속팬이 공기를 샘플챔버에 주입하며 회전 패들이 공기를 챔버에 분산시키는 작용을 한다. 통기 수단은 샘플 챔버로 부터 공기를 빼내서 불필요한 열을 제거하는 수단이다. 본 발명은 샘플의 가열 및 냉각이 신속하고 균일하게 이루어질 수 있도록 한다.
본 발명의 장치는 필요한 온도대 시간 프로파일을 통해서 장치를 작동시키는 제어수단을 포함한다. 본 발명은 자동화된 폴리메라제 연쇄반응을 수행하는데 특히 적합하다.
본 발명의 또다른 구체예는 폐쇄 루우프 고온유체 구획과 반응 구획을 포함한다. 반응 구획은 고온 유체 구획내에 위치되며 폴리메라제 연쇄반응 혼합물을 포함할 수 있는 모세관 튜브에 샘플의 삽입을 허용하기 위해 통기 도어를 통해 접근될 수 있다. 가열 코일 역시 이 구획에 위치되며 반응 구획에 인접한 위치에서 이 구획에 위치된 열전쌍 센서를 통해서 프로그램가능한 공정 제어기에 의해 조절된다.
가열코일은 반응구획 상류에 위치되며 송풍기 유닛에 의해 가열 코일을 가로질러 송풍된 유체가 반응 구획을 통해 폐쇄된 루우프 방식으로 송풍기 유체의 유입부에 통과하도록 팬이 가열 코일 상류에 위치된다. 가열된 유체가 반응 구획을 통과하기 이전에 가열된 유체의 균질 혼합을 위해서 가열코일과 반응구획사이에 배플이 위치될 수 있다.
혹은, 팬은 가열 코일 하류, 반응 구획 앞에 위치될 수 있다. 이 경우에 팬의 날개는 가열된 유체를 혼합하는 배플로 작용한다. 예정된 열순환에서 올바른 시간에 제어기는 유체를 구획으로 부터 통기시키는 통기 도어를 개방시키는 솔레노이드를 활성화 시켜서 차가운 유체가 유입되어 샘플을 냉각시킨다.
본 발명의 제어기는 챔버와 샘플구획내에 위치된 샘플이 폴리메라제 연쇄반응에서 변성, 어닐링 및 신장단계에 해당하는 예정된 온도 싸이클을 받게 한다. 사용시, 본 발명의 장치는 시간 및 온도 측면에서 변성, 어닐링 및 신장단계의 신속한 최적화와 각 단계에서 온도간의 짧아진 기간(램프타임)을 허용한다.
본 발명은 특이성 및 수율을 크게 증가시키면서 공지 기술의 열 순환 장치에 비해서 폴리메라제 연쇄반응의 완결에 필요한 총시간을 단축시킨다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링 장치 및 방법을 제공한다. 선호되는 구체예에서 다양한 형광 기술에 의해서 DNA 증폭을 연속 모니터링 하기 위해서 신속한 온도 순환을 제공하는 구조와 광학적 성분이 조합된다. 유리 모세관 샘플 튜브와 복합 플라스틱/유리샘플 튜브가 공기로 부터 신속한 열전달(15분 미만에서 30싸이클)과 반응의 동시적 광학모니터링을 허용한다. 회전체상의 단일 샘플 또는 다중샘플로 부터 형광이 연속으로 수득되며 모든 샘플은 동시에 신속한 열순환을 받는다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면 DNA 증폭동안 형광이 다음에 의해서 모니터링된다: 1) 이중쇄-특이성 염료 SYBR Green I, 2) 이중-라벨링된 하이브리다이제이션 프로브의 엑소누클레아제 절단후 로오다민에 의한 형광제 퀀칭의 감소, 3) 인접한 하이브리다이제이션 프로브에 의해 Cy5로의 형광제의 공명에너지 전달. 싸이클마다 수득된 형광 데이타는 형광 특이성 및 증폭 효율이 알려진다면 초기 템플레이트 복사 횟수의 정량화를 가능하게 한다.
게다가, 싸이클마다 형광을 측정하는 것에 비해서 본 발명의 구체예에서 각 싸이클마다 온도, 시간 및 형광을 연속으로 모니터링 하여서 3차원 나선을 생성한다. 3차원 나선은 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광 플롯이 될 수 있다. 하이브리다이제이션 프로브의 온도대 형광 플롯은 엑소누클레아제 절단의 축적되는 비가역 신호와 인접한 프로브의 온도 종속 가역 하이브리다이제이션을 구별한다. 2중쇄 염료를 사용하여 생성물 변성, 재어닐링 및 확장이 각 싸이클내에서 뒤따를 수 있다.
본 발명은 PCR의 형광 모니터링이 DNA 정량화에 강력한 도구임을 제공한다. dsDNA를 사용한 순환적 모니터링은 고유한 프로브를 필요치 않아서 큰 동적 범위에서 정량화가 가능하다. 서열 특이성 형광 프로브는 향상된 특이성을 제공하므로 매우 적은 수의 템플레이트 복사를 정량하는데 사용될 수 있다. PCR에서 유용한 적어도 두가지 부류의 서열 특이성 형광 올리고누클레오타이드 프로브가 있다. 신호 발생 메카니즘은 이들을 가수분해 프로브 또는 교합 프로브로 분리한다. 각 싸이클에서 형광을 모니터링 함으로써 어느 프로브 시스템이나 정량에 사용될 수 있다. 형광의 연속 모니터링은 온도 싸이클링 동안 용융 곡선과 생성물 어닐링 곡선을 얻을 수 있게 한다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면 형광 모니터링 광학 성분이 신속한 열 순환기와 조합되어서 2중쇄 특이성 염료의 형광 모니터링에 의해 PCR동안 DNA 용융 곡선 습득에 사용된다. 생성물의 해리온도를 통해 열순환기가 가열될 때 온도의 함수로서 형광을 플로팅하면 DNA 용융 곡선이 획득된다. DNA 용융곡선의 모양과 위치는 GC/AT 비율, 길이 및 서열의 함수이며 용융온도에서 2℃ 미만으로 분리된 증폭 생성물을 구별하는데 사용될 수 있다. 필요한 생성물은 프라이머 다이머를 포함한 원치않은 생성물과 구별될 수 있다. 용융곡선의 분석은 정량적인 PCR의 동적범위를 연장시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 15분 미만, 특히 10분 미만에서 증폭 및 정량 분석으로 신속한 싸이클 PCR 방법 및 장치를 제공한다.
본 발명은 목표 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭의 실시간 모니터링 방법, DNA 서열 다형성, 이형 접합성 또는 돌연변이를 위해 생물학적 샘플의 목표 DNA 서열을 분석하는 방법을 제공한다. 이 방법은 목표 서열의 인접 지역까지 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 존재하에서 폴리메라제 연쇄반응에 의해 목표 서열을 증폭하고, 도너 형광단에 의해 흡수되는 파장의 빛으로 샘플을 활성화시키고, 샘플에서 나오는 형광방출을 탐지하는 단계를 포함한다. 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 프로브는 두 개의 프로브를 목표 서열의 교합시 도너와 받게 형광이 0 내지 25개의 누클레오타이드내에 있도록 형광 에너지 전달쌍이 도너 형광단으로 라벨링된다. 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 샘플에 목표 핵산 서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 첨가하고 변성온도와 신장온도사이에서 생물학적 샘플을 열순환시키는 단계를 포함한다. 또다른 구체예에서 샘플에서 나오는 형광이 샘플온도의 함수로서 모니터링된다. 또다른 구체예에서, 도너 형광단은 형광제이다. 형광제와 함께 사용하기에 적합한 받게 형광단은 Cy5이다.
본 발명의 또다른 구체예로서 생물학적 샘플의 목표 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭의 실시간 모니터링 방법이 제공된다. 이 방법은 DNA 서열 다형성, 이형 접합성 및 돌연변이를 위해 생물학적 샘플의 목표 DNA 서열을 분석하는데 유용하다. 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 생물학적 샘플에 유효량의 2 핵산 프라이머와 핵산 프로브를 첨가하고, 상기 프라이머와 핵산중 하나는 받게 형광단과 도너 형광단을 포함하는 형광에너지 전달쌍으로 라벨링되고, 라벨링된 프로브는 라벨링된 프라이머 0 내지 25 누클레오타이드내에서 목표 핵산 서열의 증폭된 복제까지 교합되고;
(b) 폴리메라제 연쇄반응에 의해 목표 핵산서열을 증폭하고, 상기 폴리메라제 연쇄반응은 목표 핵산 서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 첨가하고 변성온도와 신장 온도 사이에서 생물학적 샘플을 열순환시키는 단계를 포함하고;
(c) 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 생물학적 샘플에 조사하고 샘플의 형광 방출을 탐지하는 단계.
이 방법은 샘플의 온도 종속 형광 모니터링 단계를 더욱 포함할 수 있다.
생물학적 샘플의 온도 종속 형광에 관련된 데이타는 열순환 조건 조절의 기초로 사용되어서 반응의 특이성 또는 수율을 최적화 할 수 있다. 따라서 생물학적 샘플의 목표 핵산 서열 증폭을 위한 개선된 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 생물학적 샘플에 목표 서열의 인접지역까지 교합하는 2개의 핵산 프로브의 유효량을 첨가하고, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 두 개의 프로브와 목표 서열의 교합시 도너 및 받게 형광단이 0 내지 25 누클레오타이드내에 있도록 형광 공명에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되고;
(b) 예정된 시간 및 온도를 사용하여 생물학적 샘플이 열 싸이클링을 받게 하는 단계를 포함하는 폴리메라제 연쇄반응을 사용하여 목표 핵산 서열을 증폭하고;
(c) 폴리메라제 연쇄반응동안 상기 받게 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 생물학적 샘플에 조사하고;
(d) 상기 샘플에서 나오는 형광 방출을 모니터링하고;
(e) 단계(d)에서 발생된 데이타에 따라서 온도 및 시간을 조절하여 수율 또는 특이성을 최적화하는 단계.
폴리메라제 연쇄반응의 상태를 표시하는 형광신호의 소스로서 형광 공명 에너지 전달쌍을 사용하는 본 발명의 방법에서 공명 에너지 전달쌍이 도너로서 형광제와 받게로서 Cy5를 포함하는 경우에 양호한 결과가 수득된다. 이 방법은 최대 온도에서 최소의 유지시간으로 고온 램프 속도에서 광학적으로 투명한 모세관 튜브에서 생물학적 샘플이 열 싸이클링을 받게 하도록 설계된 장치에서 이득이 되게 수행되며 샘플 형광이 모세관 튜브의 단부를 통해 탐지됨을 특징으로 한다.
본 발명은 샘플의 형광을 모니터링하는 장치를 제공한다. 이 장치는 다음을 포함한다.
챔버;
높은 부피대 표면적을 가지며 광학적으로 투명한 재료를 포함하는 모세관 튜브;
모세관 튜브 유지기;
상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브 단부를 통해 모세관 튜브를 조사하는 광원;
상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 모세관 튜브로 부터 나오는 형광을 측정하는 광 탐지기.
장치의 구체예에서 모세관 튜브 유지기는 복수의 모세관 튜브를 유지하는 목마 형태이다. 목마는 상기 챔버에 회전가능하게 장착되며 본 장치는 목마를 회전시키는 스테핑 모터; 상기 목마를 상기 모터에 결합시키는 수단을 더욱 포함한다. 또다른 구체예에서 장치에 히터와 팬이 제공되며 팬은 챔버와 공기를 교환할 수 있다. 히터와 팬은 프로그램가능한 제어기에 의해 조절되어서 챔버의 온도를 신속히 순환시킨다.
또한, 본 발명은 다음을 포함하는 PCR 반응 수행 장치에도 관계한다:
챔버;
상기 장치에 장착되며 챔버와 공기를 교환하는 히터와 팬;
복수의 모세관 튜브를 유지하며 상기 챔버에 회전가능하게 장착되는 목마, 상기 모세관 튜브는 광학적으로 투명한 재료를 포함한다;
상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 적어도 하나의 모세관 튜브를 조사하는 광원;
상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 적어도 하나의 모세관 튜브에서 나오는 형광을 측정하는 광 탐지기.
또한, 형광단을 포함하는 샘플에서 형광의 습득효율과 탐지효율을 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 형광 방출의 습득 및 모니터링을 최적화시키기 위해서 완전 내부 반사를 사용한다. 이 방법은 광학적으로 투명한 재료로된 모세관 튜브에 샘플을 넣고 모세관 단부를 통해 샘플에서 나오는 형광을 탐지하는 단계를 포함한다. 모세관 튜브의 부피에 대한 표면적의 비는 4㎜-1이상이다. 형광이 샘플의 형광단 ― 조사에 의해 유도되는 경우에 이 방법은 특히 탐지된 형광의 광학경로를 따라 모세관의 단부를 통해 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함한다.
선호되는 구체예에서, 생물학적 샘플의 형광은 온도 종속적이며 이 방법은 샘플의 온도종속 형광을 모니터링하기 위해서 형광탐지동안 생물학적 샘플을 가열 또는 냉각하는 단계를 더욱 포함한다. 샘플은 형광 에너지 전달쌍을 포함할 수 있고 형광 에너지 전달쌍중 적어도 하나의 형광단의 형광이 탐지된다. 한 구체예에서, 샘플은 핵산 프로브를 포함하는 핵산이다. 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 프로브는 형광 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링된다. 탐지된 형광은 도너 형광단 또는 받게 형광단에서 나오는 형광이다.
본 발명의 또다른 측면은 샘플 취급 시스템이다. 이 시스템은 샘플 운반 포트를 가지는 모세관 튜브와 상기 모세관 튜브를 충진하는 퍼넬 캡을 포함한다. 모세관 튜브는 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 부피에 대한 표면적의 비는 4㎜-1이상이다. 퍼넬 캡은 샘플 수신 구멍, 샘플 전달 구멍, 퍼넬캡의 샘플 전달구멍과 모세관 튜브의 샘플전달구멍이 일직선이 되도록 모세관 튜브의 샘플 전달 구멍과 착탈식으로 맞물리는 수단을 포함한다. 또한 샘플 취급 시스템은 퍼넬캡의 샘플 수신 포트와 마찰식으로 맞물리는 플러그를 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예는 다음을 포함하며 실시간으로 PCR을 모니터링하는 시스템이다:
챔버;
챔버와 공기가 교환되게 상기 장치에 장착되는 히터 및 팬과 예정된 초기 온도 및 시간에 따라서 챔버내 온도를 순환시키는 제어기;
복수의 모세관 샘플 튜브를 유지하며 상기 챔버에 회전가능하게 장착되는 목마, 상기 모세관 튜브는 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 신속한 열전달을 위해 높은 부피대 표면적비를 가지며;
상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 적어도 하나의 모세관 튜브를 조사하는 광원;
상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 모세관 튜브로 부터 나오는 형광을 측정하는 광 탐지기;
탐지된 형광에 기초하여 반응의 상태를 표시하는 수단.
선호되는 구체예에서 시스템은 하나 이상의 반응 매개변수가 실시간으로 조절되도록 제어기를 조절하는 수단을 더욱 포함한다. 모세관 샘플 튜브는 0.02 내지 1.0㎜의 내경을 가질 수 있다. 또다른 구체예에서 장치는 모세관 샘플 튜브의 단부를 통해 조명 및 형광 탐지를 위해 상기 목마에 의해 고정된 모세관 튜브를 위치시키도록 목마를 회전시키는 스테핑 모터를 더욱 포함한다.
도 1 에서 열적 싸이클링 장치(10)는 통기도어(14)를 통해 순환되며 샘플을 수용하는 폐쇄루우프 유체(특히 공기)챔버(11)를 포함한다. 폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 복수의 구획을 포함한다. 장치(10)는 입력키(25) 및 디스플레이(26)를 수단으로 프로그램될 수 있는 제어기(12)를 포함하여서 예정된 기간에 걸쳐서 일련의 온도를 통해 챔버(11)가 싸이클링 받을 수 있다. 챔버(11)의 열적 싸이클링은 여러 절차를 수행하는데 사용되며 특히 샘플 함유 반응 혼합물로 부터 프라이머 특이성 DNA의 증폭에 적합하다.
폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 박스형태로 하우징(13)에 의해 에워싸인다. 필요하다면 송풍기 장착 보오드(16)가 챔버(11)의 직사각형 섹션을 구획하고 거기에 실린더형 하부 하우징(15)을 지탱 및 고정하도록 위치될 수 있다. 혹은, 송풍기(28)의 팬이 챔버 하우징(13)내에 일체로 수용될 수 있다.
송풍기 하우징(15)의 내부는 날개와 샤프트를 포함한다. 송풍기 모터(도시안된)는 송풍기 하우징(15) 외부, 챔버(11) 외부에 위치된다. 이러한 구성에서 날개와 샤프트는 챔버(11)내에서 순환하는 고온 유체에 노출되는 송풍기의 부분이다. 모터에 온도변화를 주며 가열 및 냉각을 겪는 챔버에 모터의 열량을 첨가시키는 챔버내 모터 장착은 단점이 된다. 챔버(11)에서 유체에 노출된 열량의 감소는 예정된 시간대 온도 프로파일을 샘플이 받게하는 기능에 있어서 장치(10)의 전체 성능에 중요하다.
송풍기(28)는 낮은 열량의 프로펠러형 팬 또는 다람쥐장 형태의 팬을 사용하는 "인 라인"형 송풍기이며 팬은 분당 75세제곱피트의 최소 용량을 가진다.
솔레노이드 플랫포옴(17)은 솔레노이드(18)를 고정시킨다. 솔레노이드 전기자(19)는 통기 도어(14)에 부착되며 통기 도어(14) 상하 지점에서 하우징(13)에 회전가능하게 부착되는 로드(20)의 상부단부에 부착된다. 그러므로 로드(20)는 통기 도어(14)를 로드의 종축 주위로 하우징(13)에 대해서 자유 회전시킬 수 있다.
스프링(22)은 지지 포스트(23)에 의해서 한 단부에서 하우징(13)에 부착된다. 스프링(22)의 반대단부는 솔레노이드 전기자(19) 부착부에 인접한 로드(20)의 상부단부(21)에 부착된다. 스프링(22)은 두 부착점 사이에서 인장된다. 그러므로 스프링(22)은 지지포스트(23)쪽으로 상부 단부(21)를 당겨서 통기 도어(14)를 폐쇄 위치로 회전시킨다. 솔레노이드(18)가 활성화될 때 전기자(19)는 로드(20)의 상부단부(21)를 스프링(22) 당김 방향과 반대인 솔레노이드(18) 방향으로 당겨서 통기 도어(14)를 개방시킨다.
제어기(12)는 전송 케이블(24)에 의해 챔버(11)에 전기적으로 부착된다. 케이블(24)은 송풍기 모터(도시안된)와 가열코일(31)에 전력을 공급하기도 한다. 게다가, 제어기(12)는 온도 데이타에 해당하는 신호를 수신하는 열전쌍 센서(35)와 솔레노이드 전기자를 활성화시키는 솔레노이드(18)에 연결된다.
제어기(12)는 챔버(11)내에서 시간의 함수로서 예정된 온도를 달성하도록 가열코일(31), 통기도어(14), 및 송풍기를 조절하도록 프로그램되며 예정된 기간과 챔버온도에서 솔레노이드를 구동하는 릴레이 출력을 활성화시키도록 프로그램될 수 있는 공지형태의 온도 제어기일 수 있다. 도 1-3 의 구체예에서 사용하는 온도 제어기(12)는 Omega Engineering Inc.(Stanford, Connecticut)로 부터 모델번호 CN8600 프로세스 컨트롤러로 구매가능한 Partlow MIC-6000 비율 온도 제어기이다.
도 2 및 도 3 에서, 챔버(11)의 내부는 4개의 주요 구획으로 나뉘어진다. 송풍기 구획(28)은 송풍기 하우징(15) 및 송풍기 장착판(16)으로 구성된다. 송풍기 구획(28) 전체는 팬과 샤프트로 채워진다. 송풍기는 공지된 디자인을 가진다. 송풍기 구획(26)에 위치된 팬은 유체를 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)안으로 들여보내고 출구(37)를 통해 유체를 내보낸다.
유체는 송풍기에 의해 분당 75세제곱 피트 이상의 속도로 흐를 수 있다. 그러나, 본 발명에서 중요한 점은 챔버(11)에 위치된 유체가 송풍기의 팬과 구동 샤프트 부분만을 접촉하며 송풍기 모터 자체는 송풍기 하우징(15)밖에 위치되어서 챔버(11)의 유체와의 접촉이 방지된다는 것이다. 싸이클링 과정동안 가열 또는 냉각되어야 하는 재료의 열량을 최소화하기 위해서 챔버(11) 내부에서 유체와 접촉하는 재료를 최소화 하는 것이 본 발명의 작동속도에 중요하다. 유체에 의해서 가열 또는 냉각되어야 하는 열량을 최소화 함으로써 챔버(11) 내용물을 균일한 온도가 되게 하는데 필요한 응답시간이 크게 단축된다.
출구(37)를 통해 송풍기 구획(28)을 빠져나가는 유체는 가열구획(29)에 들어온다. 가열구획(29)으로 들어온 유체는 가열 코일(31)을 통과한다. 가열 코일(31)이 가열구획(29)에 들어오는 유체보다 뜨거워진다면 유체는 이 구획을 통과할 때 가열된다. 가열코일은 마이크로서포트 주위에 감긴 1000와트(125VAC) 니크롬선 코일이다. 그러나 챔버에 존재하는 유체의 가열에 적합한 모든 가열 유닛이 사용될 수 있다. 도 1-3 의 가열코일은 Johnstone Supply (Portland, Oregon)에 의해 제조된다.
가열코일은 제어기(12)에 포함된 출력 릴레이에 의해 활성화된다. 선호되는 릴레이는 Omega Engineering Inc. (Stanford, Connecticut)에 의해 모델번호 Omega SSR 240 D25로 제조되는 25A, 125VAC 고체상태 릴레이이다.
가열구획(29)을 통과하는 유체는 반응구획(30)에 통과하기 전에 배플(32, 33)에 충돌한다. 배플(32, 33)은 층흐름 유체를 파괴하여 교란을 일으켜서 균질온도에서 반응구획(30)에 도달하도록 유체를 효과적으로 혼합한다.
열전쌍 센서(35)는 반응구획(30)에서 유체온도에 대응하는 전기적 입력신호를 제어기(12)에 제공한다. 열 싸이클링 장치(10)의 작동동안 온도 모니터링은 30-게이지 철-콘스탄탄 "J-형" 열전쌍으로 이루어진다. 제어기는 이 정보를 사용하여 프로그램된 시간대 온도 프로파일에 따라 가열 코일(31)을 제어하고 솔레노이드(18)를 활성화시킨다.
반응구획(30)으로 부터 복귀 공기 구획(34)으로 통과하는 유체는 샘플 구획(27)(점선으로 도시된)을 통과한다.
유체 복귀 구획(34)은 샘플구획(27)에 위치된 샘플로의 열전달 때문에 약간 냉각된다. 유체 복귀 구획(34)의 유체는 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)으로 흐르고 팬의 작용에 의해 출구(37)를 통해 가열구획(39)으로 흐른다. 따라서, 통기 도어(14)가 폐쇄될 때 유체챔버(11)는 각 구획을 통해 폐쇄된 루우프 경로를 따라 유체를 연속으로 재순환시켜서 내용물이 균일한 온도가 되게 하는 폐쇄된 루우프 유체 챔버이다. 공기 챔버(11)에서 공기의 연속 순환은 샘플구획(27)내 샘플이 가능한 빨리 예정된 온도가 되게 하며 이 온도로 유지될 수 있게 한다.
장치(10)가 반응구획(27)에 위치된 재료를 주변유체(공기)온도 이상의 온도로 가능한 빨리 가열해서 냉각시키는데 사용될 때 제어기(12)는 통기 도어(14)를 개방시켜 많은 양의 주변유체를 가열된 유체가 탈출하는 동안 구획(11)에서 범람시키도록 솔레노이드(18)를 작동시키도록 프로그램될 수 있다.
통기도어(14)를 개방시켜 송풍기를 연속으로 활성화시키는 동안 가열 코일(31)을 활성제거하면 주변유체가 복귀 구획(34) 및 송풍기 구획(28)으로 흐른다. 송풍기는 주변유체를 가열구획(29)으로 흐르게 하고 코일(31)에 의해 가열됨이 없이 반응구획(30)으로 직접 통과시킨다. 주변유체는 이후에 샘플구획(27)을 통과하고 통기 도어(14)를 통해 챔버(11) 밖으로 탈출한다. 챔버(11)에 위치된 재료의 최소의 열량과 송풍기 팬의 작용으로 인하여 많은 양의 주변유체가 샘플구획(27)을 통과하고 챔버(11) 밖으로 나온다. 따라서, 반응 구획(27)에 위치된 샘플 또는 재료의 신속한 냉각이 이루어진다.
샘플구획(27)은 샘플을 담은 길쭉한 중공 유리 튜브와 같은 복수의 샘플이 이격된 방향에 쉽게 위치되도록 하는 크기를 가져서 유체가 각 샘플 주위에 균일하게 통과할 수 있다. 필요하다면 샘플구획(27)은 균일한 간격으로 복수의 샘플을 수용하여서 샘플챔버(27)에 샘플충진을 단순화시키도록 구성된 랙 또는 바스켓의 삽입을 허용하는 크기와 모양을 가질 수 있다.
샘플구획(27)으로의 접근은 통기도어(14)를 개방위치까지 회전시켜 이루어진다. 통기도어(14)가 폐쇄위치로 부터 90도만큼 회전된다면 샘플구획(27)에 쉽게 접근할 수 있다. 또한, 폐쇄위치로 부터 통기도어(14)의 90도 회전은 복귀유체 구획(34)을 반응 구획(30)으로 부터 폐쇄시킨다. 따라서 본 발명의 장치(10)가 "냉각"모드에 있을 때 주변유체가 복귀유체구획(34)으로 직접 들어오고 폐쇄 루우프 유체 흐름 경로와 동일한 경로를 따라 송풍기 구획(28), 가열구획(29), 반응구획(30) 및 샘플구획(28)으로 흐른다. 이후에 유체는 공기챔버(11) 밖으로 나와 샘플구획(27)과 복귀 유체 구획(34) 사이에 통기도어(14)의 위치 선정에 의해 공기 복귀 구획(34)으로 복귀하는 것을 방지한다.
따라서, 통기도어(14)는 주변유체를 챔버(11)에 들어오게 할뿐만 아니라 챔버(11)를 통해 유체가 루우프 형태로 재순환 하는 것을 방지할 수 있다. 대신에, 유체는 샘플구획(27)을 통과하고 이후에 챔버(11) 밖으로 나와서 샘플 내용물과 챔버(11)의 신속한 냉각을 돕는다.
본 발명의 장치(10)가 순환적 DNA 증폭에 사용될 때 시간대 온도 프로파일을 통한 반복적 순환이 필요하다. PCR동안 반응 혼합물 함유 샘플은 증폭과정의 변성, 어닐링 및 신장 단계에 대응하는 시간대 온도 프로파일을 통해 약 30회 순환되어야 한다.
본 발명의 장치(10)는 낮은 열량으로 인하여 공지기술에 비해서 단축된 시간대 온도 프로파일을 통해서 샘플을 싸이클링 받게할 수 있다. 도 1-3 구체예의 DNA 증폭응용은 30-60초후에 시간대 온도 프로파일 싸이클을 통과한다(도 5). 공지기술 사용시 동일한 싸이클은 5-10배 더 오래 걸린다. 이러한 낮은 싸이클 시간은 공지기술의 싸이클링에 비해서 PCR의 수율 및 특이성을 증가시켰다.
실시예 1
폴리메라제 연쇄반응이 50ng DNA 템플레이트, 0.5㎃ 데옥시누클레오타이드, 500nM 올리고누클레오타이드 프라이머가 50mM Tris-HCl(25℃에서 pH 8.5), 3.0mM 염화마그네슘, 20mM HCl 및 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민으로 구성된 반응 버퍼에 들어있는 10㎕ 부피에서 수행된다. 내열성 폴리메라제 (Tag 폴리메라제 0/4 유닛 － Stratagene)가 첨가되고 샘플이 8㎝ 길이의 얇은 벽 모세관 튜브(Kimble, Kimax 46485-1)에 담기고 튜브의 양 단부에 공기방울이 존재하도록 단부가 실험실 가스버너로 융합된다.
이후에 모세관 튜브는 1㎜ 두께의 "사전 펀칭된 보오드"로 구성된 홀더(Radio Shack에 의해 제조)에 수직으로 놓인다. 혼합물은 도 5 의 시간대 온도 프로파일에 표시된 시간동안 30회 변성(90-92℃), 어닐링(50-55℃), 및 신장(72-75℃)된다. 10㎕ 탈이온수에 놓이고 열전쌍 모니터(BAT-12, Sensortek)에 연결된 소형 열전쌍(IT-23, Sensortek, Clifton, NJ)을 써서 모세관 튜브의 온도 모니터링이 수행된다. 증폭 생성물은 1.5% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분별된다. 양호한 결과가 수득되었다.
본 발명의 장치(10)가 열전달 매체로서 물대신에 공기를 순환시키기 때문에 빠르게 데워질 수 있는 저열량 매체(공기)를 통해 열전달이 이루어지는 장점이 있다.
샘플냉각 응답시간을 공지 공정에서 사용된 플라스틱 마이크로 튜브대신에 샘플유지에 얇은벽 유리 모세관 튜브를 사용하고 챔버(11) 내부의 재료의 열량을 최소화함으로써 매우 빠르다(도 5). 이러한 응답시간은 시간 및 온도 측면에서 폴리메라제 연쇄반응의 변성, 어닐링 및 신장 단계의 최적화를 허용한다.
게다가, 단축된 "램프"시간이 획득된다. 즉, 샘플의 온도는 한 온도 수준에서 다음 온도 수준이 되게 하는데 필요한 시간이 단축된다. 이것은 완전한 증폭에 필요한 시간을 감소시키고 폴리메라제 연쇄반응 프로토콜내에서 어닐링, 변성 및 효소반응의 특이성 연구를 허용한다.
필요시 샘플구획(27)내에서 적당한 온도 균일성을 달성하는데 배플(32, 33)이 사용될 수 있다. 배플(32, 33)은 반응 구획(30)의 온도 변화를 10℃에서 2℃로 감소시킨다. 필요시 반응구획(30)의 온도변화를 더욱 감소시키기 위해서 추가 배플이 사용될 수 있다. 혹은, 도 4 에 도시된 바와 같이 팬이 가열 코일(31)의 하류, 샘플구획(27)앞에 위치되어서 더욱 균일한 혼합을 할 수 있다.
장치(10)의 사용을 통해 수득된 증폭 생성물은 수동 수조 싸이클링 방법을 통해서 수득된 것과 정량적 및 정성적으로 유사하다. 그러나, 특이성 및 수율에서 향상과 반응 혼합물의 신속한 열제어가 가능하다. 도 6 은 본 발명의 열순환 장치(10)를 사용할 때 도 5 의 시간대 온도 프로파일의 변성 시간 변화가 DNA 증폭 수율에 미치는 효과를 보여준다. 밝은 수직 라인은 변성 온도에서 특정 시간에 대응한다. 수율은 변성시간이 짧을수록 크다. 이러한 신속한 응답은 공지 시스템으로는 불가능하다.
도 7 은 열순환 장치(10) 사용시 도 5 의 시간대 온도 프로파일이 특이성에 미치는 효과를 보여준다(즉, 복수의 유사한 또는 "새도우" 생성물에 대응하는 특이성 생성물 수율). 램프 및 어닐링 시간이 짧을수록 생성물 특이성은 크다. 장치(10)의 신속한 온도 응답은 공지 시스템으로는 불가능한 특이성 및 수율향상을 가져왔다.
장치(10)의 열용량을 감소시킴으로써 본 발명은 폴리메라제 연쇄반응에 필요한 총시간을 크게 감소시킬 수 있다. 추가로, 적은 샘플의 사용은 최대 90%까지 사용되어야 하는 값비싼 시약의 양을 감소시켜서 본 발명을 사용하여 절차를 수행하는 비용을 절감시킨다. 예컨대, 0.25 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수 있다. 어떤 경우에 0.02 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수도 있다.
본 발명의 장치(10)는 임의의 소스로 부터 DNA를 증폭하는데 유용하다.
본 발명의 또다른 구체예가 도 8a-c 에 나타난다. 도 8a 는 사시도이고 도 8b 는 단면도이다. 도 8a-c 에서 열발생 요소는 생물학적 샘플 용기에 인접하여서 생물학적 샘플의 가열 및 냉각 시간을 더 빠르게 한다.
도 8a-c 의 장치는 열순환이 수행되는 속도에 있어서 공지 기술에 비해 귀다한 진보를 제공한다. 즉, 30, 15, 10 내지 5분 이내에 DNA 증폭을 15 또는 30 싸이클 할 수 있다. 게다가, 장치(100)는 더 양호한 열 균일화가 가능하게 한다.
도 8a 에 하우징(102)의 일반 구성이 도시된다. 하우징(102)은 피트(104)상에 놓이며 (도 8b) 구조물을 제자리에 유지시키며 뜨거운 구조물을 주변환경으로 부터 분리시키는 작용을 한다. 도 8a 의 장치(100)에 입력키(25) 및 디스플레이(26)가 포함된다.
도 8b 의 단면도에서 샘플챔버는 브라켓(106)으로 표시된다. 힌지(131)에 의해 하우징(102)에 연결된 뚜껑(138)이 개방되어서 샘플 챔버(106)에 접근할 수 있다. 샘플 챔버(106)는 원통형일 수 있다.
샘플챔버(106)는 흑색 발포물(110)로 라이닝되어서 이의 표면은 광흡수성을 가지며 발포물의 대부분 두께는 절연성을 가진다. 흑색 발포물은 쉽게 구매할 수 있다. 발포물(110)은 통과하는 공기에 의해 쉽게 냉각되는 물질이다. 즉, 이 물질은 낮은 열전도성과 다공성 표면을 가진다.
흑색 다공성 표면은 표면에 입사하는 짧은 파장의 복사에너지를 장파 에너지로, 즉 샘플 챔버에 복사되는 열로 전환한다.
발포물(110)은 샘플챔버를 하우징의 주변공기공간으로 부터 분리시키고 램프(112)에 의해 방출된 빛을 열에너지로 전환시킨다. 발포물(110)은 다른 구조물로 대체될 수 있다. 예컨대, 한면이 흑색 도장된 폴리카보네이트 박판과 같은 흑색 비반사 표면을 가지는 재료가 유리섬유 또는 발포물과 같은 절연재료에 의해 보강될 수 있다. 다양한 기질에 도장될 수 있는 흑색 표면은 입사한 단파장의 복사에너지를 열복사에너지로 전환시키며 절연재료는 샘플챔버를 주변환경으로 부터 절연시킨다.
램프(112)는 500와트 할로겐 램프일 수 있다. 적절한 제어장치가 사용된다면 더 높은 출력의 램프나 복수의 램프가 사용될 수 있다. 램프소켓(112A)은 지지부(112B)에 의해 하우징(102)에 부착된다. 램프(112)는 샘플챔버(106)를 필요한 온도까지 신속하고 균일하게 가열할 수 있다. 니크롬선과 같은 적외선 복사원이 본 발명의 범위내에 사용될 수도 있다.
도 8b 에 2개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시된다. 두 개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시될지라도 샘플챔버(106)는 여러개의 이러한 튜브를 유지할 수 있다. 얇은벽 모세관 튜브(108)는 공지 장치에 비해서 몇가지 장점을 가지며 생물학적 샘플 유지 수단으로 사용된다.
얇은벽 모세관 튜브(108)는 접근의 용이성을 위해 구멍(140)을 통해 샘플챔버 밖으로 부분 연장될수도 있지만 특정한 용도에 적합한 다른 수많은 유체 유지 구조물과 같이 샘플챔버(106)내에 완전히 내장될 수 있다. 선호되는 얇은벽 모세관 튜브(108)는 약 10㎕의 용량을 가진다. 샘플의 부피는 적게 유지되어야 하며 샘플 유지 구조물의 표면적은 비교적 커야 하며 비교적 적은 열용량을 가져야 한다. 샘플 유지 구조물은 0.1 내지 10,000㎕의 부피를 가질 수 있다.
램프(112)와 절연성 발포물(110)은 함께 얇은벽 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플과 샘플챔버(106)내의 공기를 빠르고 균일하게 가열한다. 열전쌍(134)이 샘플 챔버(106)내에 포함되어서 챔버내 온도를 감지하고 샘플챔버내에서 필요한 온도를 유지시키는데 사용된다.
열전쌍(134)은 이의 열응답이 생물학적 샘플과 이를 유지하는 용기의 열응답과 일치하며 구매가능한 것이다. 이러한 열전쌍은 Idaho Labs로 부터 금속 외장 J-형 열전쌍 형태로 구매할 수 있다. 생물학적 샘플과 용기의 열응답과 열전쌍의 열응답의 일치는 PhysiTem로 부터 구매가능한 모델 IT-23 열전쌍과 같은 마이크로 열전쌍을 선택된 용기에 담긴 생물학적 샘플속에 삽입하고 샘플과 열전쌍은 동일한 온도변화를 받게 함으로써 달성된다. 테스트중인 열전쌍은 열전쌍의 열응답이 샘플 및 용기의 열응답에 일치할때까지 변화될 수 있다.
도 8b 의 배열은 기존의 장치보다 더 균일한 샘플의 가열 및 냉각을 제공한다. 기존의 장치에서 샘플을 통한 열전달은 샘플을 통한 대류에 의해 이루어진다. 샘플유지에 어떠한 구조물이 사용되든 샘플의 대류 유도 운동이 적은 생물학적 샘플(10-100㎕)의 온도차에 의해 야기된다.
샘플내의 온도차의 효과는 샘플에 대한 싸이클시간이 감소될 때 더욱 제어하기 곤란하다. 샘플내 불균일 온도의 존재와 샘플내에서 "대류에 의한 혼합"에 대한 의존성은 샘플에 대한 싸이클시간을 증가시키고 생물학적 샘플에 악영향을 준다. 장치(100)는 10㎕ 샘플내의 열차이가 30초 싸이클동안 ±1℃ 미만이 되도록 가열 및 냉각을 할 수 있다.
더욱 균일한 냉각 및 가열을 촉진하기 위해서 얇은벽 모세관 튜브(108)가 램프(112)와 같은 열원으로 부터 다소 떨어지는 것이 좋다. 도 8c 는 도 8a-b 에서 도시된 장치(100)에 배열된 램프(112)와 복수의 얇은벽 모세관 튜브(108)의 평면도이다.
도 8c 에서 램프(112)로 부터 가장 멀리있는 (F로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)는 램프에 가장 가까운 (N으로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)와 램프(112)간의 거리보다 램프(112)로 부터 40%, 특히 25% 정도 더 멀리 있다. 예컨대 N으로 표시된 거리는 7.3㎝이고 F로 표시된 거리는 8.5㎝이다. 얇은벽 모세관 튜브(108)의 배열은 원형 또는 반원형일 수 있다.
게다가 열발생 요소와 샘플용기간의 거리를 측정하는 점은 열발생 요소의 크기 및 종류에 따라 변한다. 예컨대, 열발생요소는 크기 및 모양이 다양한 복수 램프 또는 전기저항요소일 수 있다. 샘플 챔버벽으로 부터 샘플 용기가 위치되는 거리를 고려하는 것도 중요하다. 구멍(140)(도 8a)은 샘플용기 유지수단으로 작용하지만 다른 구조물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
장치(100)는 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플을 빠르고 균일하게 냉각하기도 한다. 샘플챔버(106)를 냉각하기 위해서, 하우징(102) 외부로 부터 공기가 모터(118)에 의해 구동되는 모터 샤프트(122)에 연결된 팬(116)에 의해 하부 하우징 입구(114)를 통해 하우징 내부로 들어온다. 샘플챔버의 신속한 냉각이 필요하므로 모터(118)와 팬(116)의 조합은 충분한 부피의 공기를 샘플챔버(106)에 이동시키고 이후에 공기를 샘플챔버(106) 내부에 분산시킬 수 있어야 한다. 도 8b 에 도시된 모터(118) 및 팬(116) 이외의 장치가 사용될 수 있다.
액체와 다른 가스에 비해서 열전달 매체로서 공기를 사용하는 것은 저렴하며 쉽게 구할 수 있으며 쉽게 혼합되는 장점이 있다. 샘플을 담는 모세관 튜브의 높은 부피대 표면적 비는 열전달 매체로서 공기를 사용하여 신속하게 열을 전달시킨다.
열싸이클중 냉각단계에서 팬(116)의 작용은 주변공기를 하우징(102)으로 들여보내는 것이다. 힌지(129)로 움직이는 통기도어(128)가 제공된다. 통기도어(128)는 솔레노이드(132)에 의해 자동으로 개방되어서 하우징(102)의 내부가 상부 하우징 입구(130)로 부터 밀폐된다. 솔레노이드(132)는 당해분야에 공지된 스테핑 모터로 대체될 수 있다. 스테핑 모터의 사용은 통기 도어(128)를 정확하고 증분적으로 샘플의 가열 및 냉각 필요성에 따라 개폐시킬 수 있게 한다. 당해분야 숙련자는 SC-149 스테핑 모터 제어기(Alpha products)를 사용하여 적절한 제어를 할 수 있다.
상부 샘플챔버 입구(126)의 위치 및 더 큰 단면적과 하부 샘플챔버 입구(120)의 배치로 인하여 실온의 공기가 샘플챔버(106)로 이동되고 분산되고 모터 샤프트(122)에 연결된 패들(124)에 의해 샘플 챔버(106)내에서 혼합된다. 패들(124)은 샘플챔버(106)내에서 분당 250미터, 특히 500미터, 더더욱 1000미터 정도의 공기 속도를 일으키기에 충분한 속도로 회전해야 한다. 고속회전하는 단일 또는 다중패들일 수 있는 패들(124)을 사용하여 공기가 샘플 챔버(106)내로 유입되거나 점선(136)으로 표시된 경로를 따라 챔버(106)로 부터 유출된다. 패들(124)의 회전은 샘플챔버(106)에 들어오는 공기의 혼합을 촉진하고 얇은벽 모세관 튜브(108)의 표면으로 부터 샘플 챔버(106)를 통과하는 공기로 가장 효과적인 열에너지 전달을 보장한다.
솔레노이드(132)가 통기도어(128)를 개방시키도록 활성화될 때 샘플챔버(106)에 유입된 실온의 공기는 샘플챔버 상부입구(126)와 상부 하우징 입구(130)를 통해 배출되어 샘플챔버(106)로 부터 열을 주변대기에 전달한다. 샘플 챔버(106)를 통과하고 분배된 공기의 빠른 혼합은 샘플의 균일하고 신속한 냉각을 가져온다.
실시예 2
도 9a 는 4개의 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물을 보여준다. 프로파일 A와 B는 공지기술의 마이크로 튜브를 사용하는 공지 가열블럭 장치를 사용하여 수득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 온도간의 전이는 느리며 프로파일 A 및 B에 수많은 비특이성 밴드가 존재한다. 프로파일 B는 각 샘플이 각 온도에서 유지되는 시간을 제한함으로써 비특이성 밴드의 일부가 제거됨을 (프로파일 A에 비해서) 보여주는데, 이것은 시간이 짧을수록 바람직한 결과가 얻어짐을 보여준다.
프로파일 c 및 b는 도 8a-b 의 장치를 사용하여 획득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 증폭이 특이적이며 수율이 c에서 최대일지라도 (60초 신장) D에서도 적절하다(10초 신장).
인간 유전자 DNA로 부터 β-글로블린의 536bp의 증폭에 최적의 시간 및 온도 역시 결정된다. 변성(93℃) 및 어닐링(55℃)이 1초 미만일 때 증폭 수율 및 생성물 특이성이 최적이다. 더 긴 변성 또는 어닐링 시간으로 잇점이 없다. 77℃에서 더 오랜 신장시간으로 수율이 증가하지만 10-20초보다 긴 신장시간으로는변화가 거의 없다. 이러한 예기치 못한 결과는 DNA 증폭에 사용된 기존의 장치가 반응의 물리적 및 효소적 조건을 최적화하는데 필요한 조건을 최대화하지 못함을 나타낸다.
추가 정보가 다음으로 부터 획득될 수 있다:
Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B., and Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis △F50BLocus," 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., and Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification," THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994).
도 9a 에 제공된 정보로 부터 샘플은 신속한 열순환이 되며 샘플의 온도는 0.5℃/초 이상의 속도로 증감된다. 폴리메라제 연쇄반응은 수행하는 본 발명의 경우에 온도변화는 30 내지 50℃에 대해서 수행된다. 열 싸이클은 40분후에 30이상의 열싸이클, 특히 20분후에 30회의 열싸이클, 더더욱 10분후에 30회의 열싸이클을 완료시키도록 충분히 빠르게 수행되는 것이 좋다.
장치(100)는 1.0℃/초 이상, 특히 4.0℃/초 이상, 더더욱 10.0℃/초 이상의 속도로 샘플의 온도를 증감시킨다. 주변매체나 샘플용기가 아니라 생물학적 샘플이 지정된 열적 변화를 겪어야 한다. 기존의 장치의 본 발명의 장치만큼 빠르게 열적변화를 수행할 수 없으며 주변매체 및 용기의 온도가 아니라 샘플의 온도를 빠르고 균일하게 변화시키는 문제에 대한 인식이 없었다.
도 9b 에서, 본 발명의 방법은 20℃ 이상, 특히 30℃ 이상, 더더욱 40℃ 이상의 온도범위에 걸쳐서 10℃/초이상, 특히 20℃/초이상의 속도로 열적 싸이클링을 이룰 수 있다. 도 9b 는 생물학적 샘플이 열싸이클을 받을 때 생물학적 샘플의 온도(℃)가 주변공기 또는 용기의 온도가 아님을 보여준다. 도 9b 는 74℃에서 시작되며 D로 표시된 변성온도 92℃에서 2초간 가열되는 PCR 샘플을 보여준다. 샘플은 이후에 A로 표시된 어닐링 온도 55℃까지 2초간 냉각된다. 변성온도와 어닐링온도간의 전이는 4초간 37℃로서 10℃/초 이상의 속도를 제공한다. 이후에 샘플은 도 9b 에서 E로 표시된 신장온도 74℃에서 5초간 데워진다. 변성온도, 어닐링온도 및 신장온도를 통한 샘플의 싸이클링은 30회 반복된다.
도 9c-g 는 본 발명에 의해 달성되는 다른 선호되는 온도/시간 프로파일의 예시적인 싸이클을 보여준다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라서 지정된 공정을 수행하기 위해서 표시된 온도/시간 프로파일을 변경할 수 있을 것이다. 당해분야 숙련자는 고체 또는 액체르 통해 샘플에 열을 전도하는 공지 장치 및 방법이 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 인식할 것이다. 게다가 크로마토그래피 오븐과 같은 공기 및 전달매체를 활용하는 공지장치 및 방법은 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 알 수 있을 것이다.
가장 빠른 열 싸이클링 시간을 제공하기 위해서 램프(112, 도 8a, 8b)의 정격전력은 2000와트이거나 유사한 출력의 복수의 램프가 포함될 수 있다. 또한 Alpha products(모델번호 SP-127)(Darian, Connecticut)로 부터 구매가능한 하이레벨 프로그램 인터프리터와 클록과 함께 8052 마이크로컨트롤러를 사용하는 A-버스 컨트롤러/획득 시스템과 관련하여 도 10 에 나타난 온도 기울기 제어회로를 포함시키는 것이 선호된다. 마이크로컨트롤러에 사용되는 프로그램 코드는 프로그램 코드 부록에 포함된다. 부록에 제공된 프로그램 코드는 마이크로컨트롤러에 다운로드를 위한 BASIC52 파일이며 열싸이클링동안 예시적인 온도 기울기 제어를 한다. 2000와트 열 발생장치와 제어기는 20℃/초의 속도가 달성될 수 있게 한다.
도 10 에 도시된 온도 기울기 제어회로는 샘플온도응답에 일치되는 열전쌍(200)을 포함한다. 열전쌍(200)은 당해분야에서 AD595로 알려진 집적회로(206)에 연결되며, 이의 출력은 100㎐의 컷오프 주파수로 4차 저역 필터(208)와 출력이 온도의 디지탈 표시에 사용되는 12비트 아날로그-디지탈 전환기(210)에 전달된다.
회로(206)의 출력은 측정된 기울기 회로(212)에도 전달된다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(218), 100㏀ 전위차계(214), 1㏁ 전위차계(230), 22㎌ 축전기를 포함한다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(246)의 역전 입력에 신호를 출력한다.
기울기 설정 회로(222)는 양의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(226)와 음의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(224)를 포함한다. 디지탈-아날로그 전환기(224, 226)는 당해분야에서 DA147로 알려진 8비트 디지탈-아날로그 전환기이다. 기울기 설정 회로는 퍼스널 컴퓨터와 같은 또다른 디지탈 장치(도 10 에 도시안된)로 부터의 지령을 수신할 수 있다. 기울기 설정회로(228)의 출력은 합산 회로(240)에 전송된다.
합산회로(240)는 100㏀ 저항기(236, 238, 244)와 353 연산증폭기(242)를 포함한다. 합산회로(240)의 출력은 연산증폭기(246)의 비-역전 입력에 전달되고 필요한 온도변화 기울기를 나타낸다. 연산증폭기(246)의 출력은 전력전환회로(262)내에 포함된 트랜지스터(248)에 제공된다.
전력전환회로(262)는 트랜지스터(248)에 전류를 제공하는 5VDC 공급원(250)을 포함한다. 트랜지스터(248)는 330Ω 저항과 같은 저항(252)을 수단으로 3010회로(254)에 연결된 이미터를 가진다. 3010 회로(254)는 180Ω 저항과 같은 저항(256)과 직렬 연결된 출력을 포함한다. 트라이액(258)이 AC 전류원(260)으로 부터 램프(262) 또는 다른 열발생장치에 전달되는 전류 제어에 사용된다.
다른 시스템 성분과 함께 도 10 에 도시된 온도기울기 제어회로는 생물학적 샘플을 30℃의 온도 범위에서 20℃/초, 특히 40℃의 온도 범위에서 20℃/초로 열 싸이클링을 받게 하며 전체 생물학적 샘플의 균일성이 유지되게 한다.
여기서 발표된 장치는 다음과 같은 응용분야에 사용될 수 있다: 폴리메라제 연쇄 반응; 싸이클 시이퀀싱; 리가아제 연쇄반응과 같은 다른 증폭 프로토콜. 본 발명은 샘플 챔버내에 위치된 샘플의 온도를 정확히 제어하는 장치를 제공하여서 예정된 시간대 온도 프로파일에 따라서 챔버에 위치된 샘플온도를 빠르고 정확하게 변화시킨다.
DNA 증폭의 연속 형광 모니터링
앞서 기술된 바와 같이 폴리메라제 연쇄 반응은 신속히 수행될 수 있다. 기술된 장치 및 방법을 사용하여 필요한 횟수의 온도 싸이클이 공지 기술에서 보다 빠르게, 예컨대 15분 미만에 완결될 수 있다. 변성시간과 어닐링 시간을 최소화함으로써 신속히 싸이클링된 증폭의 특이성 및 수율이 이전보다 개선된다. 게다가, 신속한 열전달 촉진 뿐만 아니라 광학적으로 투명한 모세관 튜브의 사용은 본 발명에 따라서 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링을 가능하게 한다.
형광 프로브는 DNA 증폭을 탐지 및 모니터링 하는데 사용될 수 있다. 유용한 프로브는 이중쇄 DNA 특이성 염료와 서열특이성 프로브를 포함한다. 삽입물질 에티듐 브로마이드를 사용하여 모세관튜브 또는 마이크로 튜브에서 증폭후 UV활성화된 적색 형광이 증가한다. 서열 특이성 형광 탐지는 올리고누클레오타이드 교합 프로브를 사용하여 가능하다. 예컨대, 이중-라벨링된 형광제/로오다민 프로브는 폴리메라제 신장동안 5'-엑소누클레아제 활성에 의해 절단되고 형광단을 분리하여 형광제/로오다민 형광비를 증가시킬 수 있다.
온도 싸이클링 완료후 생성물 축적을 모니터링하여 싸이클마다 한 번 또는 각 싸이클내에서 연속으로 형광이 측정될 수 있다. 본 발명과 대비하여 구매가능한 서열 특이성 방법은 종말점 분석으로 제한된다.
본 발명은 초기 템플레이트 복제물 갯수의 정량화를 위해 싸이클마다 모니터링을 할 수 있다. 이러한 모니터링을 수행하기 위해서 각 싸이클의 신장 또는 조합된 어닐링/신장 단계동안 형광이 획득되고 생성물 농도와 관련된다. 삽입물질 YO-PRO-1을 사용하여 헤파티스 C RNA 정량분석이 당해분야에 공지된다. 형광 삽입물질의 존재하에서 PCR에 의한 헤파티스 C 바이러스 RNA의 균질 정량분석(Anal. Biochem. 229:207-213, Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, Y. Mitoma, 1995)참조. 본 발명 이전에는 각 싸이클내에서 연속 형광 모니터링이 효과적이고 정확하게 수행되지 못했다.
연속 형광 모니터링을 제공하는 2-칼라 형광 광학과 집적된 신속한 온도 싸이클러가 발표된다. DNA 증폭에 선호되는 3개의 형광 기술이 본 발명의 특수예로서 제공된다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형광기술에서 에티듐 브로마이드의 사용에 익숙할 것이다. SYBR Green I(Molecular Probes of Eugene, Oregon)이 이중쇄 특이성 염료로 사용된다. 본 발명에 따라서 시간, 온도 및 형광이 200msec마다 획득된다. 이러한 데이타는 기존의 장치 및 방법으로는 얻을 수 없는 신속한 싸이클링동안 생성물 변성, 재어닐링 및 신장의 세부사항을 나타낸다. 게다가, 5'-엑소누클레아제 퀀칭 프로브를 사용하여 수득되는 결과는 이중쇄 특이성 형광 사용으로 수득된 결과와 비교된다. 게다가, 형광제로 부터 공지된 시아닌 염료 Cy5으로의 공명 에너지 전달과 인접한 교합 프로브에 기초한 신규한 형광 스킴의 사용이 발표된다. 이소티오 시아네이트 기를 함유한 시아닌 염료 라벨링 시약(Cytometry 10:11-19, Mujumdar, R.B., L.A. Ernst, S.R. Mujumdar, A.S. Waggoner, 1989).
DNA 증폭을 겪고 있는 다중샘플의 싸이클마다 한 번 모니터링은 강력한 정량도구이다. 한 싸이클내에서 연속 모니터링은 프로브 형광의 성질을 식별하여 공지기술에서는 얻을 수 없는 DNA 증폭 메카니즘에 대한 직관을 제공한다.
도 11 에서, 형광을 탐지하는 온도 싸이클러(300)가 개략적으로 도시된다. 고온 공기원(302)은 1600와트 가열코일과 팬을 포함한 시판장치이다. 냉각 공기원(304)은 Dayton(Niles, Illinois)으로 부터 모델번호 4C006B로 구매가능한 2200rpm 송풍기이다. 냉각 공기원(304)은 주변공기를 보통 제공하지만 주변공기보다 낮은 온도의 유체를 제공하는 수단을 활용할 수도 있다. 도 11 에서, 2.5㎝ 직경의 주름진 흑색 나일론 튜브(306, 308)가 고온 공기원(302)과 냉각 공기원(304)을 샘플챔버(310)에 연결시키는데 사용된다. 통기구(312)와 방출팬(314)을 샘플챔버(310) 밖으로 공기를 제거한다. 샘플챔버(310)의 내부는 외부의 빛으로 부터 차단된다.
샘플챔버(310)내의 샘플온도는 Idaho Technology(Idaho Falls, Idaho)로 부터 모델번호 1844로 구매가능하며 모세관 튜브에 담긴 샘플의 열응답에 일치되는 관형 금속외장 열전쌍(316)에 의해 모니터링된다. 샘플챔버(310)내의 온도 균일성은 중앙 샘플챔버팬(318)에 의해 달성된다. 샘플 챔버팬은 Idaho Technology로 부터 모델번호 1862로 구매가능한 1.7×11㎝ 팬날개와 샘플챔버(310)내에서 800 내지 1000m/분의 공기속도를 일으키는 모터(Idaho Technology, 모델번호 1861)를 포함한다.
샘플챔버(310)내에 모세관 튜브(320)에 담긴 복수의 샘플이 회전가능한 카루셀(322)에 수직으로 위치된다. 카루셀(322)은 14㎝ 직경을 가지며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)에 의해 제어되는 400스텝/회전 스테핑 모터(324)에 회전된다. 스테핑 모터(324)는 New England Affiliated Technologies(Lawrence, Massachusetts)로 부터 모델번호 2198364로 구매가능하며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)은 New England Affiliated Technologies로 부터 모델번호 MDM7로 구매가능한 것으로서, 카루셀(322) 회전당 12,800 스텝을 제공한다.
도 11 에서, 형광 활성화 소스(328)가 제공된다. 형광 활성화 소스(328)는 타원형 반사기로 촛점이 잡히는 75와트 크세논 아아크 소스이며, Photon Technology International (South Brunswick, New Jersey)로 부터 모델번호 A1010으로 f/2.5 타원형 반사기와 함께 구매할 수 있다. 혹은, 광방출 다이오드가 사용될 수 있다. 형광 활성화 소스(328)에 의해 방출된 빛은 Rolyn(Covina, California)로 부터 모델번호 75.0125로 구매가능한 홍채(334)를 사용하여 2㎜까지 촛점이 잡힌다. 형광 활성화 소스(328)로 부터 방출된 빛은 Rolyn으로 부터 모델번호 60.4400으로 구매가능한 저온 거울(330)상에 입사하고 Rolyn으로 부터 모델번호 65.3130으로 구매가능한 열흡수 유리(332)를 통과한다. Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 렌즈(336)를 통해 조준된 후 Omega Optical (Brattleboro, Vermont)로 부터 모델번호 470RDF40으로 구매가능한 450-490㎚ 대역 간섭 필터(338), Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 촛점 렌즈(340), Omega로 부터 구매가능한 1㎜ 실리카 창(342)을 통과한다. 기술된 활성화 경로를 사용하여 모세관 샘플 튜브(320A)의 5-7㎜ 섹션이 조사된다.
샘플(320A)로 부터 방출된 형광을 수집하기 위한 수집 경로가 도 11 을 참조로 기술될 것이다. 수집 경로의 광학성분은 다른 광학 성분상의 응축을 막기 위해서도 포함되는 1㎜ 실리카 유리(344)를 포함한다. 방출된 형광을 2×10㎜ 슬릿(348)에 촛점을 잡게 하며 Rolyn으로 부터 모델번호 17.1175로 구매가능한 비구면 렌즈(346A, 346B)가 대향하며, 슬릿은 공간 필터로서 기능을 하는 X-선 필름을 절단하여 제조된다. 공간 필터(348) 이후에 방출된 형광은 전자 셔터 제어기(352)를 통해 작동하는 35㎜ 전자 셔터에 입사한다. 35㎜ 전자셔터(350)는 Uniblitz 셔터 모델번호 VS35이며 전자 셔터 제어기(352)는 드라이버 모델번호 D122로서, 둘다 Vincent Associates (Rochester, New York)으로 부터 구매가능하다. Rolyn 모델번호 17.1175 조준 비구면 렌즈(354)가 제공된다.
SYBR Green I 방출의 탐지가 요구될 때 필터(356)가 포함된다. 필터(356)는 Omega로 부터 모델 550RDF60으로 구매가능한 520-580㎚ 대역 통과 필터이며 단색 습득을 위해 사용된다. 다른 방출의 탐지를 위해 2색 필터(358)과 파장 필터(358A, 358B)의 조합이 필터블럭에 사용된다. 형광제와 로오다민 방출의 분리를 위해 Omega로 부터 모델 560 DRLP로 구매가능한 560㎚ 통과 2색 필터와 Omega로 부터 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용), Omega 모델 660DF40으로 구매가능한 580-620㎚ 대역 통과 필터(358B)(로오다민 탐지용)로 구성된 2색 필터(358)이 사용된다. 형광제와 Cy5 방출의 분리를 위해 2색 필터(358)는 Omega 모델 590 DRLP로 구매가능한 590㎚ 대역 통과 2색 필터와 Omega 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용)와 Omega 모델 670DF20으로 구매가능한 660-680㎚ 대역 통과 필터(358B)(Cy5 탐지용)가 사용된다.
도 11 에서, 필터(358) 이후에 형광은 Edmund(Barrington, New Jersey)으로 부터 모델 32970으로 구매가능한 두 개의 평철 렌즈(360A, 360B)를 통해 광전 배중관(362A, 362B)상에 촛점이 잡힌다. 광전 배증관(362A, 362B)은 Hamamatsu (Middlesex, New Jersey)로 부터 모델 R928로 구매가능하며 Photon Technology International으로 부터 모델 714로 구매가능한 하우징에 수용된다. PMT 및 데이타 획득제어 모듈(364)이 또한 제공된다. 당해분야에 공지된 수동 PMT 셔터(366A, 366B)가 제공된다.
앞서 기술된 광학 성분은 5㎝ 직경을 가지며 Rolyn으로 부터 모델 90.0190으로 구매가능한 5㎝ 범용 렌즈 장착부에 장착된다. 필요한 구조성분은 black Delrin으로 부터 기계가공된다.
도 11 에 도시된 장치를 사용하여 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl2, 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민, 0.5μM 프라이머, 0.5mM 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트, 5㎕ 샘플당 Tag 폴리메라제 0.2U에서 DNA 증폭이 수행된다. 인체 유전자 DNA(1분간 끓여서 변성된) 또는 정제된 증폭 생성물이 DNA 템플레이트로 사용된다. 정제된 증폭 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 수득된다[Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), S.L. Berger, A.R. Kimmel (Eds.), 대규모 및 소규모 페놀 추출 및 핵산의 침전(33-48)(Wallace, D.M. 1997) 참조]. 이어서, Centricon 30 마이크로농축기(Amicon, Danvers, MA로 부터 구매가능)를 통해 반복된 세척에 의해 프라이머가 제거된다. 템플레이트 농도는 260㎚에서 흡수에 의해 결정된다. 템플레이트의 A260/A280비는 1.7 이상이다.
프라이머는 표준 포스포아미다이트 화학, 예컨대 Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, NJ)에 의해 합성된다. 헤파티스 B 표면 항원 유전자의 180 염기쌍 조각은 프라이머 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1)와 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO:2) (Genbank sequence HVHEPB)를 사용하여 증폭된다. SYBR Green I은 몰레큘라 프로브(Eugene, Oregon)으로 부터 수득된다. β-액틴 프라이머와 형광제/로오다민 이중 프로브는 Perkin Elmer (Foster City, California)로 부터 모델 N808-0230으로 획득된다. 인체 β-글로블린 프라이머 RS 42/KM29(536 염기쌍) 및 PC03/PC04(110 염기쌍)은 고온공기를 사용한 모세관 튜브에서 자동화된 PCR, Nucl. Acids. Res. 17:4353-4357, (Wittwer, C.T., G.C. Fillmore, D.R. Hillyard)에 기술된다.
단일 라벨링된 프로브5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-fluorescein
-3' (SEQ ID NO:3)와 5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-phosphate-3' (SEQ ID NO:4)은 형광제 포스포아미다이트(Glen Research (Sterling, Virginia)로 부터 모델 10-1963으로 구매가능한), Cy5 포스포아미다이트(Pharmacia로 부터 모델 27-1801-02로 구매가능)과 화학적 인산화 작용제(Glen Research로 부터 모델 10-1900)으로 구매가능)를 사용하여 합성된다. 이러한 인접한 프로브는 동일한 DNA쇄상에서 PC03/PC04 β-글로블린 프라이머쌍에 내부적으로 교합하고 한 개의 염기쌍만큼 분리된다. 프로브는 역상 C-18 HPLC에 의해 정제되고 균일성은 폴리아크릴아미드 전기영동 및 흡수성(A260과 형광단의 최대 흡수)에 의해 검사된다. 교합 프로브(β-액틴 및 β-글로블린)가 0.2μM로 각각 사용된다.
5㎕의 증폭샘플이 모세관 튜브(230)에 충진된다. 모세관 샘플 튜브는 Idaho Technology로 부터 모델 1705로 구매가능한 1.02㎜ 외경과 0.56㎜ 내경을 가진 튜브이다. 충진후 모세관 샘플 튜브는 부탄 화염으로 밀폐된다. 모세관 샘플 튜브는 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)의 카루셀(322)에 들어가기 이전에 광학등급 메탄올로 세정된다.
도 11 에 도시된 성분의 제어는 LabView(National Instruments, Austin, Texas)으로 알려진 그래픽 프로그램 언어와 120㎒의 클록속도로 작동하는 80486 Intel 마이크로프로세서를 사용하는 PC상용성 컴퓨터(366)에서 12-비트 다기능 입/출력 카드(National Instruments, AT-MIO-E2)를 사용하여 이루어진다. 입/출력 카드상의 아날로그 출력 채널은 민감도 제어, 즉 각 광전 배증관(362A, B)의 PMT 전압을 제어하는데 사용된다. 입/출력 카드상의 아날로그 입력채널은 광전 배증관(362A, B)으로 부터 신호를 수신한다. PC상용성 컴퓨터는 입/출력 카드를 통해서 카루셀의 운동 방향, 위치 및 속도를 제어한다. 다중 모세관 샘플튜브가 충진될 때 카루셀(322)은 100msec동안 모니터링 위치에서 각 모세관 샘플 튜브(320)를 순차적으로 위치선정한다. 단일 모세관 샘플튜브(320A)의 연속 모니터링 동안 데이타는 200mses마다 평균되고 습득한다. 온도, 시간 및 형광 2채널은 싸이클 횟수대 형광과 온도대 형광 플롯으로 표시된다. 카루셀은 최대 형광 및 신호가 습득되는 곳에 위치되어야 한다. 단일 모세관 샘플 튜브(320A)가 분석될 때 신호는 200msec마다 습득되며 광전 배증관(364)상의 적분시간상수는 50msec로 설정된다. 다중 광전배증관(366A, B)이 사용될 때 시간상수는 0.5msec로 설정되고 각 모세관 샘플튜브(320)가 각 채널에 최대 형광을 제공하는 정확한 위치를 선정하기 위해서 카루셀이 다시 회전한다. 최대 형광이 수득되는 지점에 모세관 샘플 튜브(320A)가 위치선정된 이후에 각 PMT(362A, B)의 민감도가 조절되고 모든 모세관 샘플튜브(320)의 위치를 계산 및 선정하기 위해서 카루셀이 다시 한 번 회전한다. 100msec동안 모니터링 위치에서 카루셀(322)상에 각 모세관 샘플 튜브(320)를 위치시킴으로써 신장동안 각 증폭싸이클마다 신호가 수득된다. Systronics(Salt Lake City, Utah)로부터 BCI51로 구매가능한 8051 크로스 컴파일러와 Dallas development system(Systronics로 부터 DPB2로 구매가능한)을 사용하여 Idaho Technology로 부터 Rapidcycler로 구매가능한 신속한 온도 싸이클러로 부터 온도제어 프로그램이 변경된다.
사실상, 형광 탐지용 신속 온도 싸이클러(300)의 온도 응답은 도 11a 에서 시간대 온도 차트로 표시된 20-30초 싸이클(10-15분후에 30싸이클)을 허용하는 도 8a-b 의 장치로 수득되는 응답과 유사하다. 2중쇄 특이성 형광 염료가 증폭동안 존재할 경우에 더 많은 2중쇄 생성물이 형성되므로 형광이 증가한다. 특이성 DNA 서열의 동시증폭 및 탐지, Bio/Technology 10:413-417 (Higuchi, R., G. Dollinger, P.S. Walsh, R. Griffith, 1992) 참조.
형광은 온도 싸이클링동안 온도와 교란 효과의 영향을 받으며, 이것은 일정한 신장온도에서 싸이클마다 형광을 고려함으로써 제거된다. 그러나, 신속한 싸이클 증폭동안 200msec마다 온도, 시간 및 형광이 수득된다면 도 12 에 표시된 공간에 3차원 나선이 나타난다. 도 12 에 표시된 3차원 곡선은 도 12 에서 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광의 2차원 플롯으로 투영된다. 도 12 의 시간대 온도 투영은 싸이클마다 반복되고 도 11a 와 동일한 정보를 제공한다. 형광은 온도에 대해 반비례하므로 매 싸이클마다 도 12 에 도시된 시간대 온도 투영은 시간대 온도 플롯의 거울 영상이다. 생성물이 축적됨에 따라 2중쇄 생성물의 경우 형광이 모든 온도에서 증가한다. 그러나 변성온도에서 형광은 기준선으로 복귀하는데, 그 이유는 단일쇄 DNA만이 존재하기 때문이다.
도 12 에 도시된 2중쇄 염료의 온도대 형광 투영도는 시간축을 제거하고 DNA 증폭동안 쇄 상태의 온도 종속성을 보여준다. 도 12 에 도시된 온도대 형광 투영도는 헤파티스 B 바이러스 DNA의 180 염기쌍 조각에 대한 것이다.
도 13 에 도시된 온도대 형광 투영도는 인체 β-글로블린 DNA의 536 염기쌍 조각에 대한 것이다. 도 13 에 표시된 초기 싸이클은 동일하게 나타나며 저온에서 형광이 비선형으로 증가한다. 증폭이 진행함에 따라 이후 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에 상승하는 루우프로서 나타나는데 이것은 상당한 히스테리시스를 보여준다. 즉, 가열동안 관찰되는 형광이 냉각동안 형광보다 크다. 샘플이 가열될 때 형광은 변성이 나타날때까지 높다(형광에서 예리한 강하). 샘플이 변성온도로 부터 어닐링 온도로 냉각될 때 2중쇄 신호는 빠르게 증가한다. 형광은 신장동안 계속 증가하며 온도는 일정하게 유지된다.
다중 샘플이 SYBR Green I에 대해 싸이클마다 모니터링될 때 초기 템플레이트 농도중 107-108범위가 도 14 에 표시된다. 데이타가 각 모세관 샘플튜브(320)의 최대형광 비율로 정규화될 때 100개의 초기 복제물이 명백히 10개의 복제물과 분리된다. 그러나, 1개의 복제물과 10개의 복제물간의 차이는 적으며 모세관 샘플튜브(320)마다 0과 1개의 평균 복제물간의 차이는 없다.
이에 비해서 서열 특이성 프로브는 도 15 의 플롯과 유사한 동적 범위를 가지지만 단일한 초기 템플레이트 복제물과 음의 비교를 구별해낸다. 5'-엑소누클레아제 프로브로 신호 발생은 DNA 합성에 종속될 뿐만 아니라 이중 라벨링된 프로브의 형광단 사이에 교합과 가수분해를 필요로 한다. 이러한 가수분해는 퀀칭을 감소시키며 로오다민에 대한 형광제의 형광비가 증가한다. 2중쇄 염료에서 나오는 형광은 과도한 싸이클링으로 평균화 되지만 엑소누클레아제 프로브에서 나오는 신호는 각 싸이클에서 계속 증가한다. 순 생성물이 합성되지 않을지라도 프로브 교합과 가수분해는 계속 일어난다. 템플레이트 복제물 갯수가 103이하로 감소하면 신호의 세기는 감소하지만 음의 비교 신호가 안정적이므로 적은 수의 복제물도 정량될 수 있다.
5'-엑소누클레아제 프로브의 온도대 형광 플롯은 프로브 가수분해가 신호발생 메카니즘임을 확인시켜 준다. 도 16 에서, 2-온도 싸이클링의 온도대 형광 플롯이 β-액틴 엑소누클레아제 프로브에 대해 도시된다. 싸이클마다 형광비는 온도에 따라 선형으로 변하며 히스테리시스는 거의 없다. 프로브 가수분해가 일어날 때 어닐링/신장 단계동안 각 싸이클마다 신호가 증가한다. 형광제와 로오다민의 형광이 온도 증가시 감소할지라도 변화율은 로오다민이 더 커서 온도 증가시 비율이 증가한다. 5'-엑소누클레아제 프로브에서는 온도 종속적 교합 효과가 명백하지 않다. 도 16a 는 도 18 에 따라서 다양한 초기 템플레이트 복제물 갯수에 대한 싸이클 횟수대 형광의 플롯이다.
이에 반하여, 형광 신호가 교합에만 의존할 때 도 17 에 도시된 바와 같이 2-온도 싸이클링동안 온도대 형광비 플롯은 다양한 패턴을 보이며 히스테리시스가 명백하다. 2개의 인접한 교합 프로브, 형광제로 3' 라벨링된 상류 프로브와 Cy5으로 5'라벨링된 하류 프로브가 존재한다. 이 프로브는 1개의 염기쌍만큼 분리된다. 어닐링/신장 단계동안 프로브는 축적생성과 Cy5, 형광제로 교합하여서 형광비가 증가한다. 생성물 변성 온도까지 가열하는 동안 프로브는 65 내지 75℃에서 해리되어서 기준 레벨까지 형광비가 복귀된다. 교합동안 형광비의 변화는 공명에너지 전달로 부터 Cy5 형광의 증가 때문이다.
DNA 증폭동안 형광 모니터링은 강력한 분석기술이다. 실시간 모니터링을 제공하는 장치를 사용하여 존재하는 초기 템플레이트 복제물 갯수에 따라서 서열 특이성 탐지 및 정량화가 5 내지 20분후에 달성될 수 있다. 에티듐 브로마이드 또는 SYBR Green I과 같은 2중쇄 특이성 염료가 증폭의 표시물질로서 사용될 수 있다. SYBR Green I은 형광제 근처에서 최대의 활성을 가지며 에티듐 브로마이드의 가시적 활성화보다 DNA에 더 강한 신호를 제공하므로 선호된다. 2중쇄 염료는 증폭 프라이머에 고유한 특이성에 종속된다. 높은 싸이클 횟수에서 비특이성 증폭은 100개의 초기 템플레이트로 탐지 민감도를 한정하지만 (도 14) 본 발명은 증폭 특이성을 더욱 개선한다.
적은 수의 복제물 탐지 및 정량이 필요할 때 신호발생을 위해 교합을 필요로 하는 형광 프로브에 의해서 추가 특이성이 제공될 수 있다. 이중-라벨링된 엑소누클레아제의 절단이 한가지 방법이다(형광 프로브를 사용한 닉-번역 PCR에 의한 대립형질 판별, Nucl. Acids Res. 21:3761-3766, L.G., C.R. Connell, W. Bloch. 1993; 반대 단부에서 형광 염료를 갖는 올리고누클레오타이드를 사용하여 PCR 생성물과 핵산 교합의 탐지에 유용한 퀀칭된 프로브 시스템, PCR Meth. Appl. 4:357-362, Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, 1995 참조). 이것은 음의 비교 신호로 부터 단일한 템플레이트 복제물을 구별할 수 있다(도 15). 적은 수의 복제물이 증폭될 때 감소된 증폭 효율로 인하여 최종형광신호가 감소될지라도 0과 백개의 복제물간의 정량화가 가능하다. 엑소누클레아제 프로브에 의해 발생된 신호는 축적적이며 간접적으로 생서물 농도에 관련된다. 그러므로 생성물의 양이 평형에 도달한 후에도 형광 신호는 계속 증가한다. 증폭 및 절단 효율의 제어에 대한 표준이 절대적인 정량화에 필요하다.
5'-엑소누클레아제 프로브의 디자인, 합성 및 정제는 주의를 필요로 한다. 교합은 엑소누클레아제 유도 신호를 위한 필요조건이지만 충분조건은 아니며; 모든 프로브는 효과적으로 절단되지 않는다(형광 프로브를 사용한 닉-번역 PCR에 의한 대립형질 판별, Nucl. Acids Res. 21:3761-3766, L.G., C.R. Connell, W. Bloch. 1993; 반대 단부에서 형광 염료를 갖는 올리고누클레오타이드를 사용하여 PCR 생성물과 핵산 교합의 탐지에 유용한 퀀칭된 프로브 시스템, PCR Meth. Appl. 4:357-362, Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, 1995 참조). 이중-라벨링된 프로브의 합성에는 로오다민의 수동첨가가 관련되며 역상 HPLC가 뒤따른다.
이중-라벨링된 프로브의 가수분해 중속성 대신에 공명에너지 전달을 통해 교합이 직접 탐지될 수 있다(에너지 전달 탐지 및 형광 퀀칭, 311-352, L. J. Kricka(Ed.), 비방사성 동위원소 DNA 프로브 기술, Academic Press, San Diego, Morrison, L.E., 1992). 형광제 및 Cy5와 별도로 라벨링된 2개의 인접한 프로브를 사용하여 Cy5로의 에너지 전달은 증폭 싸이클마다 생성물 축적과 더불어 증가한다(도 17). 엑소누클레아제 프로브에 비해서 형광제 및 Cy5의 아미다이트는 자동합성동안 직접 포함될 수 있으므로 프로브 합성이 비교적 간단하다. 공지기술은 공명에너지 전달쌍으로서 형광제와 Cy5의 사용을 발표하지 않았다. 스펙트럼 중첩이 작을지라도 Cy5의 몰흡수계수 및 흡수파장은 로오다민에 비해서 높다. 3가지 인자(중첩, 흡수성 및 파장)가 에너지 전달률을 결정하는 중첩 적분에 기여한다. Cy5는 형광제 흡수 파장에서 낮은 흡수성을 가지며 받게의 직접 활성화를 감소시킨다.
겔 전기영동에 의한 DNA 증폭의 종래적인 종말점 분석은 생성물 크기를 분류하고 순도를 추정한다. 그러나, 증폭이 처음에 확률적이고 이후에 지수함수적이며 마지막으로 정체적이므로 종말점 분석의 활용성은 정량화에 제한된다. 본 발명에 의해 제공되는 싸이클별 모니터링은 비교적 단순한 정량화를 제공하며 폐쇄된 튜브 형광 모니터링은 추가 장점을 가진다.
종말점 및 싸이클별 분석에 비해서 본 발명은 온도 싸이클내내 형광을 모니터링 할 수 있다. 2중쇄 특이성 염료를 사용한 연속 형광 모니터링이 온도 싸이클링 매개변수 조절에 사용될 수 있다. 특정량의 생성물이 합성된후 증폭이 중단되어 또다른 템플레이트의 과증폭을 방지할 수 있다. 각 싸이클의 신장 단계는 형광이 증가하는한 계속될 필요가 있다. 생성물 변성이 실시간으로 보장되며 형광이 기준선에 도달할때까지 온도를 증가시킨다. 생성물이 변성온도에 노출되는 시간을 제한하는 것은 긴 생성물의 증폭에 특히 유용하다.
형광 염료를 연속 모니터링의 추가 사용은 본 발명의 범위내에 있다. 예컨대 정확한 온도 제어와 2중쇄 특이성 염료를 사용하여 생성물 순도가 용융곡선에 의해 추정될 수 있다. 신속한 온도 제어를 사용하여 생성물의 절대농도가 재어닐링 반응에 의해 결정될 수 있다. 유일한 필요조건은 형광능력, 신속한 온도변화능력 및 샘플온도 균일성이다. 공기혼합의 용이성과 모세관 샘플튜브의 높은 부피대 표면적 비는 다른 디자인으로는 불가능한 속도로 샘플온도를 정확히 제어할 수 있게 한다. 예컨대, 모세관 튜브에서 시간대 샘플온도 플롯은 변성 및 어닐링 온도에서 예리한 스파이크를 보이지만 공지기술에서 사용된 원추형 플라스틱 튜브에서 평형에 도달하기 위해서 수초가 필요하다. 게다가 높은 부피대 표면적비가 에칭된 실리콘 또는 유리칩상에서 가능하지만 모세관 샘플튜브를 사용하는 본 발명에 의해 달성된 비에 도달하는데 보고된 싸이클 횟수가 없으며 샘플에 노출된 큰 칩표면에서 온도 균일성을 달성하기가 어렵다.
본 발명을 사용하여 DNA 증폭의 여러 측면이 구별될 수 있다. 예컨대, 생성물 변성이 1초 미만에 일어나며, 반면에 공지기술에서는 변성에 10초 내지 1분이 필요하다. 본 발명에 따라서 2중쇄 염료의 실시간 형광 모니터링에 의한 생성물 용융 관찰(도 12, 13)은 더 짧은 변성시간의 사용이 효과적임을 보여준다. 도 13 에 도시된 바와 같이 생성물 재어닐링은 매우 빠르다. 사실상 증폭의 후반 싸이클동안 프라이머 어닐링 온도에 도달되기 이전에 냉각동안 대부분의 생성물은 재어닐링 된다. 이것은 본 발명에 의해서 5-10℃/초의 냉각 속도로 일어난다. 더 느린 공지기술의 온도 싸이클러 사용시 생성물 재어닐링은 더 크다. 생성물 재어닐링은 "평탄화 효과"의 주원인이다.
싸이클별 모니터링을 사용한 모니터링을 위한 신속한 싸이클 PCR의 형광 모니터링
공지 기술에서, PCR 생성물의 분석은 증폭이 완료된 후에 보통 수행된다. PCR 정량에 사용될 때 종말점 방법은 정확한 결과를 위해 초기 템플레이트 농도의 양호한 추정을 필요로 한다. 정량적인 PCR을 위해 PCR 샘플의 형광 모니터링은 에티듐 브로마이드를 사용하였다. 본 발명은 싸이클마다 PCR 샘플을 형광 모니터링한다. 형광은 조합된 어닐링/신장단계동안 싸이클마다 보통 한 번 필요하다. 에티듐 브로마이드 형광은 dsDNA에 삽입될 때 향상되며 생성물 농도의 정도이다. dsDNA 사용시 싸이클마다 한 번 생성물의 양을 모니터링하면 초기 템플레이트 농도의 넓은 동적 범위가 분석될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면 2중쇄 DNA특이성 염료가 사용된다. 예컨대, SYBR Green I이 PCR 생성물 축적을 위해 선호되는 민감한 염료이다. 도 18 에서, 108배 범위에 걸쳐서 초기 템플레이트 복제물 갯수의 정량이 가능하다. 도 18 에서, 형광 곡선이 초기 템플레이트 농도에 따라서 수평으로 변위된다. 도 18 에 도시된 바와 같이 증폭 특이성이 완벽하지 않으므로 민감도는 낮은 초기 템플레이트 농도에 한정된다. 템플레이트가 존재하지 않을 때 프라이머 다이머와 같은 바람직하지 않은 생성물이 증폭된다. 따라서 0, 1 및 10개의 초기 템플레이트 복제물간에 차이가 적다.
매우 적은수의 복제물의 정량은 예전에 dsDNA 염료로는 달성되지 못했을지라도 본 발명은 이러한 염료를 단순성 때문에 사용할 수 있다. dsDNA 염료는 모든 증폭에 사용될 수 있으며 이러한 염료를 사용할 때 형광 라벨링된 올리고누클레오타이드가 불필요하다. dsDNA 염료를 써서 매우 적은 수의 복제물을 정량하기 위해서는 매우 양호한 증폭 특이성 또는 비특이성 증폭으로 부터 필요한 생성물을 분별하는 수단이 필요하다.
도 18 에서, dsDNA 염료 SYBR Green I 염료를 사용하여 모니터링된 DNA증폭의 싸이클 횟수대 형광 플롯이 제공된다. 도 18 의 플롯은 SYBR Green I 1:10,000 희석물의 존재하에서 0 내지 109평균 템플레이트 복제물로 증폭된 인간 β-글로블린 유전자의 536 염기쌍 조각을 사용하여 수득된다. 정제된 템플레이트 DNA는 PCR 증폭, 페놀/클로로포름 추출, 에탄올침전 및 초원심분리(Danvers(MA)의 Amicon으로부터 구매가능한 Centricon 30)에 의해 수득되고 260㎚에서 흡수에 의해 정량된다. 각 온도 싸이클은 28초였다(95℃ 최대, 61℃ 최소, 72℃에서 15초, 온도간의 평균속도 5.2℃/초). 모든 샘플은 동시에 증폭되었고 신장단계 5초 내지 10초 사이에서 100밀리초동안 모니터링 되었다. 모든 샘플의 각 싸이클마다 디스플레이가 갱신되었고 21분후에 45싸이클이 완료되었다. 각 모세관 튜브에 대한 데이타는 각 튜브의 최대값과 최소값간의 차이의 평균으로 정규화 되었다(도 18 에서 Y-축으로 표시됨).
본 발명의 또다른 측면에 따라서, 서열 특이성 형광 모니터링이 제공된다. PCR 생성물의 서열 특이성 탐지는 본 발명에 의해 올리고누클레오타이드 프로브상에 두 개의 상이한 형광단을 포함시킴으로써 획득된다. 도 19a-d 에 도시된 본 발명의 범위내에서 2개의 배열이 선호된다. 배열은 받게의 흡수 스펙트럼을 중첩하는 방출스펙트럼을 갖는 도너를 필요로 한다.
도 19a-d 는 PCR동안 서열 특이성 형광 모니터링을 위해 선호되는 두가지 배열을 보여준다. 도 19a 는 단일 올리고누클레오타이드 프로브상에 함께 존재하므로 초기에 받게(A)에 의해 퀀칭되는 도너(D)를 보여준다. 폴리메라제 5'-엑소누클레아제 활성에 의한 가수분해 이후에 도너와 박게는 분리되고 도너의 형광이 증가된다(도 19b). 도 19c 에 도시된 배열에서 도너는 프로브상에 있고 받게는 프라이머상에 있다. 프로브 및 프라이머상의 염료는 교합에 의해 근사된다. 이것은 받게로의 공명 에너지 전달을 가져와 받게의 형광을 증가시킨다(도 19d).
도너와 받게가 동일한 올리고누클레오타이드상에서 합성된다면 받게 염료는 근접성 때문에 도너의 형광을 퀀칭시킨다(도 19a). 온도 싸이클링 동안 일부 프로브는 단일쇄 PCR 생성물에 교합하고 폴리메라제 5'-엑소누클레아제 활성에 의해 가수분해된다. 도너와 받게는 더 이상 연결되지 않으므로 도너는 받게의 퀀칭으로부터 해방되어 도너 형광이 증가한다. 형광신호는 교합이 아니라 프로브 가수분해에 달려있으므로 이러한 부류의 프로브를 "가수분해" 프로브라 칭한다.
도 19c 및 d 에 따라서, 도너와 받게가 상이한 올리고누클레오타이드상에 위치된다면 상이한 형광 스킴이 가능하다. 도 19c 및 d 에서 도너는 프로브의 3'단부에 위치되고 하나의 프라이머가 받게로 라벨링된다. 이들은 별도의 올리고누클레오타이드상에 존재하므로 염료간의 상호작용은 최소이다. 온도 싸이클링 동안 프로브는 라벨링된 프라이머 근처에서 교합하고 공명 에너지 전달이 일어난다. 형광 신호는 프로브 교합에 종속되므로 이러한 부류의 프로브를 "교합" 프로브로 칭한다.
도너 형광이 퀀칭되는지 또는 받게 형광을 증가시키는지 여부는 특이적 형광과 용매 조건에 의해 좌우된다. 도너 형광 증가가 가수분해 프로브를 사용한 PCR동안 관찰되지만 받게 형광 증가는 교합 프로브를 사용할 때 모니터링된다.
가수분해 프로브상의 추가 정보 및 데이타가 제공된다. dsDNA 염료에 비해서, 서열 특이적 프로브는 도 20 에 도시된 바와 같이 매우 적은 수의 템플레이트를 정량할 수 있다. 단일 템플레이트 복제물은 템플레이트 부재로 부터 구별될 수 있다. 증폭의 효율은 초기 복제물 갯수가 1500미만으로 떨어질 때 감소한다. 가수분해는 누적적이고 엄밀하게 생성물 농도에 관련되지 않으므로 수많은 싸이클 후에도 형광 신호는 계속 증가한다.
도 20 에서, 이중-라벨링된 가수분해 프로브를 써서 모니터링된 DNA 증폭의 싸이클 횟수대 형광비(형광제/로오다민) 플롯이 나타난다. 가는선은 각 곡선의 긴-선형 부위를 표시한다. 인간 β-액틴 유전자의 280염기쌍 조각이 튜브마다 0.15 내지 15,000 평균 인간 유전자 DNA 복제물로 증폭된다. 활용되는 가수분해 프로브는 (0.2μM로 포함됨) Perkin Elmer (Forster City, California)로 부터 구매할 수 있다. 각 온도 싸이클은 26초이다(94℃ 최대, 60℃에서 15초, 온도간의 평균속도 6.2℃/초). 모든 샘플은 동시에 증폭되고 어닐링/신장 단계의 5초와 10초 사이에 100밀리초동안 모니터링된다. 모든 튜브의 각 싸이클마다 디스플레이가 갱신되고 20분 미만에 45 싸이클이 완료된다.
가숩누해 프로브에 비해서, 교합 프로브에서 나오는 형광신호는 누적적이 아니며 각 어닐링 단계동안 새로 전개된다. 교합은 의사-1차 반응이기 때문에 형광은 생성물 농도의 직접적 지표이다(용액 교합의 정량분석, 핵산교합: 실제적 방법, Hames B., Higgins S., eds, p.47-71, Washington D.C. IRL Press, Young B, Anderson M., 1985). 프로브의 농도는 생성물보다 훨씬 높으므로 프로브에 교합된 생성물의 비율은 생성물 농도와 무관하다.
SYBR Green I, 가수분해 프로브, 및 교합 프로브에서 나오는 형광신호가 도 21a-d 에서 직접 비교된다. 모든 프로브는 싸이클 20 부근에서 발생한 탐지가능한 형광으로 거의 동일한 민감도를 보인다. 연장된 증폭으로 신호는 가수분해 프로브의 경우 증가하고 SYBR Green I의 경우 그대로이며 교합 프로브의 경우 약간 감소한다. 교합 프로브의 경우 35 싸이클후 신호감소는 폴리메라제 엑소누클레아제 활성으로 인한 프로브 가수분해 때문에 초래된다. 가수분해 프로브에서 나오는 형광비의 변화가 교합프로브에서 나오는 것보다 클지라도(도 21b, c) 가수분해 프로브에서 나오는 형광의 분산계수가 더 크다(도 21d). 즉, 교합 프로브에서 나오는 형광이 절대 신호레벨을 낮을지라도 가수분해 프로브보다 정확하다.
도 21a-d 는 PCR동안 3개의 형광 모니터링 방법에 대한 비교를 제공한다. 형광 프로브는 dsDNA 염료 SYBR Green I(도 21a), 이중-라벨링된 형광제/로오다민 가수분해 프로브(도 21b), 및 Cy5 라벨링된 프라이머를 갖는 형광제 라벨링된 교합 프로브(도 21c)이다. 모든 증폭은 15,000 템플레이트 복제품(50ng 인간 유전자 DNA/10㎕)을 사용하여 10번 복제로 수행된다. 온도 싸이클은 31초이다(94℃ 최대, 60℃에서 20초, 온도간 평균속도 6.2℃/초). 어닐링/신장단계 15초와 20초 사이에 각 샘플에 대해 형광이 수득된다. 평균±표준편차가 각 점에 대해 도시된다. SYBR Green I이 프라이머 KM29와 PC04로 부터 205 염기쌍 인간 β-글로블린 조각의 증폭에서 1:10,000 희석비에서 사용된다. 가수분해 프로브와 조건은 도 20 에 도시된다. 가수분해 프로브 TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-형광제(SEQ ID NO:5)(Glen Research(Sterling, Virginia)로 부터 구매가능한 형광제 CPG)가 KM29 및 Cy5-라벨링된 프라이머 CAACTTCATCCACGTNCACC (SEQ ID NO:6)와 함께 사용된다. 여기서 N은 Cy5(Amersham (Arlington Heights, Illinois)로 부터 구매가능)으로 라벨링된 아미노-변성제 C6dT (Glen Research)이다. 3가지 형광 모니터링 기술의 정확도가 도 21D 에서 비교된다. 데이타는 기준선(평균 11-15싸이클)위의 형광비의 분산계수(표준편차/평균)로서 도시된다.
싸이클별 모니터링을 사용한 정량화 알고리즘이 기술된다. 초기 템플레이트 농도에 대한 정량적인 정보가 도 18 및 20 에 도시된 형광 곡선에 포함될지라도 당해분야 숙련자는 이러한 정보를 최상으로 추출하는 방법은 잘 모를 것이다. 도 22 에서 50ng의 유전자 DNA의 증폭에 비교된 정제된 템플레이트의 104및 105복제물의 증폭 곡선이 도시된다. 이러한 데이타는 유전자 DNA가 104이상의 타겟 복제물을 포함함을 알 수 있게 하지만 복제물의 정확한 수에 대해서는 정보를 제공하지 않는다.
도 22 에서, PCR 형광 곡선의 정량화를 위한 내삽 방법을 비교하는 플롯이 제공된다. 도 22 에 주어진 싸이클 횟수에서 미지 및 표준 형광을 비교하는 종말점 내삽이 도시된다. 또한 각 곡선이 주어진 형광레벨을 초과하는 싸이클횟수를 결정하는 한계치 내삽이 도시된다.
본 발명에 따라서 2가지 데이타 내삽 방법이 발표된다. 한가지 방법은 전체곡선을 내삽시켜서 모든 관련 데이타 포인트를 사용하는 것이다. 이러한 방법은 가장 정확한 결과를 제공한다. 또다른 방법은 단일 수직선 또는 수평선을 따라 미지값을 내삽하는 것이다. 단일 수직선 내삽은 종래의 종말점 분석과 유사하다. 특정 싸이클 횟수에서 미지의 형광이 기지의 값 사이에 내삽된다. 표 1 에 싸이클 20-24의 수직 내삽 결과가 열거된다. 수평선을 따른 내삽은 형광 한계 확립을 필요로 한다. 10, 20, 30 및 40% 한계로 부터의 내삽이 표 1 에 또한 열거된다.
형광 정량화를 위한 단일선 내삽 방법(도 22 참조)
종말점 한계
싸이클 복제물 형광(%) 복제물
20 41,000 --- ---
21 12,000 10 17,000
22 12,000 20 14,000
23 13,000 30 15,000
24 14,000 40 18,000
평균 18,000 평균 16,000
종말점 또는 한계값 내삽은 많은 이용가능한 값을 사용하지 않으며 단일한 정도에서 벗어난 데이타 포인트에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 예컨대 싸이클 20에서 종말점. 본 발명은 향상된 내삽방법을 제공한다. 예컨대, 각 곡선의 로그-선형 부위내에서 데이타의 지수함수 F = AN(1+E)n이다. 여기서 F는 형광신호이고 A는 형광계수인자이고 N은 출발 복제물 수이고 E는 증폭효율이고 n은 싸이클 횟수이다. A와 E는 미지값을 제외한 N의 값에 대해 먼저 결정될 수 있다. 이후에 미지의 N에 대한 최상의 값이 결정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하면 50ng의 게놈 DNA에서 유전자 복제물 수는 표 1 의 중앙값에 가까우며 허용치 1.5×104에 가까운 1.7×104이다. 다른 곡선은 위 지수함수 예보다 더 양호할 수 있다. 지수함수는 로그-선형 싸이클(45중 7)에 의존하며 이것은 형광 정확도가 낮은 지역에 해당한다(도 21d).
본 발명에 따라서 유도단계, 로그-선형단계 및 정체단계를 기술하는 매개변수를 포함하며 모든 이용가능한 데이타를 사용하는 S자곡선이 사용된다. 데이타 포인트의 기대되는 정확도를 반영하기 위해서 가중된다. 곡선모양의 다양성 때문에 상이한 형광 프로브에 대해서 상이한 매개변수가 필요하다(도 21a-d).
각 PCR 싸이클내에서 여러번 모니터링하는 본 발명의 연속 모니터링의 특징이 기술될 것이다. PCR동안 형광 모니터링이 각 싸이클에 한 번 일정 온도에서 수행될 수 있을지라도 본 발명은 PCR 싸이클내내 연속 모니터링하는 장점을 제공한다. 형광이 온도의 함수로서 변하기 때문에 온도가 중요하다. 그러나, 본 발명에 따르면 온도변화동안 형광 모니터링하면 많은 정보를 얻을 수 있다. 예컨대, 형광이 온도 싸이클링내내 연속으로 수득된다면 가수분해 프로브는 온도에 따라 형광비가 선형으로 변하며 더 많은 프로브가 가수분해되므로 형광이 증가함을 보여준다(도 23a). 이에 비해서 교합 프로브의 형광비는 온도에 따라 급변한다(도 23b). 저온에서 프로브 교합동안 형광비가 증가하고 교합 프로브가 템플레이트를 용융시킬 때 기준선까지 감소한다.
PCR동안 생성물 쇄상태의 온도 종속성이 도 24 에 도시된 바와 같이 SYBR Green I을 사용하여 온도대 형광 플롯으로 나타난다. 증폭이 진행될 때 온도 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에서 상승 루우프로서 나타난다. 샘플이 냉각될 때 형광이 증가하는데, 이것은 생성물 재어닐링을 나타낸다. 신장동안 온도가 일정할 때 증가하는 형광은 추가 DNA 합성과 상관된다. 도 24 는 dsDNA 염료 SYBR Green I을 사용한 DNA 증폭의 온도대 형광 플롯을 제공한다. 인간 β-글로블린 유전자의 536 염기쌍 조각이 정제된 템플레이트 106복제물과 1:30,000 희석률의 SYBR Green I으로 부터 증폭되었다. 다른 조건은 도 18 과 관련하여 기술된 것과 동일하다. 싸이클 15-25 가 표시된다. 형광대 온도 데이타가 변형되어 온도가 형광에 미치는 효과를 제거한다.
생성물 변성 및 재어닐링을 모니터링하는 본 발명은 DNA 정량화를 위한 추가적인 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 DNA 정량방법은 각 온도 싸이클내에서 형광 모니터링을 필요로 하며 싸이클마다 한 번만 형광이 수득될 때 사용될 수 없다. 예컨대, PCR 생성물은 생성물의 GC/AT 비율과 길이에 종속적인 특성용융곡선을 가진다(도 25). 용융온도를 예견하는 실험적인 알고리즘을 사용할 경우 다양한 PCR 생성물은 50℃ 범위에 걸쳐서 용융해야 한다. 비특이성 생성물은 필요한 PCR 생성물과는 다르게 용융하므로 dsDNA 형광이 특이성 성분과 비특이성 성분으로 분리될 수 있다. 본 발명의 방법 사용시 SYBR Green I 또는 에티듐 브로마이드와 같은 게놈 dsDNA 염료를 사용하여 매우 적은수의 복제물 정량이 가능하다. 도 25 는 3가지 정제된 PCR 생성물의 용융곡선을 보여준다. PCR 생성물은 도 18 과 관련하여 설명된 바와 같이 정제되어 정량된다. 1:100,000 희석율의 SYBR Green I이 50nM Tris, pH 8.3 및 3mM MgCl210㎕에든 50ng의 DNA에 첨가되었다. 온도는 0.2℃/초로 증가되었고 형광이 수득되고 온도에 대해 도시되었다.
경쟁적인 정량화를 위해 용융곡선을 사용하는 본 발명의 특징이 기술될 것이다. 본 발명에 따라서 용융곡선의 추가 용도는 PCR의 경쟁적인 정량이다. 본 발명의 방법은 원시 템플레이트와 함께 증폭시키기 위한 경쟁 템플레이트를 필요로 한다. 비교용 템플레이트는 천연 앰플리콘과 용융 온도에서 상이하다. 생성물의 GC 비율을 7-8% 변화시킴으로써 용융곡선이 3℃ 이동될 수 있다(핵산 하이브리드, 형성 및 구조, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Meyers R., ed. pp. 605-608, New York: VCH, Wetmur, J., (1995)). 용융온도에서 3℃ 이동은 생성물 용융곡선의 원시 성분과 경쟁성분을 분리시키는데 충분하다(도 25). 증폭동안 수득되는 용융곡선은 용융피크로 미분되어서 경쟁자와 템플레이트의 상대적 양을 결정하는데 사용될 수 있다(Hillen, W., Goodman T., Benight, A., Wartell R. and Wells, R., (1981), High resolution experimental and theoretical thermal denaturation studies on small overlapping restriction fragments containing the Escherichia coli lactose genetic control region, J. Biol. Chem. 256, 2761-2766). 이러한 방법 사용은 온도 싸이클링후 샘플을 분석할 필요성을 제거해야 한다.
본 발명에 따라서 절대적 정량화를 위한 교합반응이 토론될 것이다. 본 발명은 변성후 생성물-생성물 재어닐링의 모니터링을 허용하여 직접적이고 절대적인 DNA 정량방법을 제공한다. 샘플온도가 변성온도로 부터 급격히 하강되어서 더 낮은 온도에 유지될 때 생성물 어닐링 속도는 2차반응에 따른다(Young B. and Anderson, M., 1985, Quantitive analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B., Higgins, S. eds., pp. 47-71, Washington, D.C.: IRL Press). 상이한 농도의 DNA가 테스트될 때 재어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도에 따른다(도 26). 도 26 은 상이한 농도의 PCR 생성물에 대한 재어닐링 곡선을 보여준다. 상이한 양의 정제된 DNA의 536 염기쌍 조각이 50mM Tris, pH 8.3 및 3mM MgCl25㎕에든 1:30,000 희석비의 SYBR Green I과 혼합된다. 샘플은 94℃에서 변성되고 85℃까지 빠르게 냉각된다. 주어진 PCR 생성물과 온도에서 2차속도 상수가 측정될 수 있다. 속도상수가 알려지면 미지의 DNA 농도가 재어닐링 실험 데이타로 부터 결정될 수 있다. 속도 상수의 초기결정이 도 27 에 도시된다. 냉각은 순간적이지 않으며 일정한 온도에 도달하기 이전에 재어닐링이 일부 일어난다. 본 발명의 장치에 의해 가능한 신속한 냉각은 속도상수나 DNA 농도 결정에 이용가능한 데이타의 양을 최대화 한다. 도 27 은 2차 재어닐링 속도상수의 결정을 보여준다. 곡선은 비선형 최소자승 회귀분석과 일치하며 F최대, F최소, t0및 k 는 부동 매개변수이다. 속도 상수(k)가 결정되면 DNA 농도가 미지의 샘플에 대해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 순수 PCR 생성물을 필요로 하지만 이것은 온도 싸이클링동안 수득된 용융곡선에 의해 보장될 수 있다. 재어닐링 반응에 의한 본 발명의 정량 방법을 모세관 샘플 튜브간의 신호 차이에 무관하다.
신속한 싸이클 PCR의 연속 모니터링
본 발명은 생성물 순도 모니터링, 템플레이트 정량 및 PCR 동안 돌연변이 탐지에 단색 형광 방법을 사용한다. 이중쇄 DNA(dsDNA)의 존재는 PCR 동안 형광염료를 사용하여 추구될 수 있다. 각 싸이클 내에서 dsDNA가 변성될 때 형광은 감소하고 생성물 재어닐링 및 프라이머 신장으로 형광이 증가한다. 이들 염료는 서열 특이성이 아닐지라도 DNA 용융곡선의 모양을 분석하여 생성물 순도가 평가될 수 있다. 순수한 PCR 생성물은 예리한 용융전이를 가지지만 불순물은 넓은 온도범위에 걸쳐 용융한다.
PCR의 결쟁적인 정량화는 경쟁자로부터 천연 앰플리콘(amplicon)의 분리를 필요로 한다. 용융곡선이 상이한 용융온도를 가지는 생성물은 구별하는데 사용될 수 있다. 초기 템플레이트 복제물 갯수는 천연 앰플리콘과 용융곡선에서 상이한 비교 템플레이트를 사용한 경쟁적인 증폭에 의해 정량된다.
용융곡선은 PCR동안 돌연변기 탐지에 사용될 수 있다. 이질접합 DNA의 증폭동안 형성된 헤테로듀플렉스는 완전 상보적인 생성물보다 저온에서 용융한다. 삭제 및 단일 염기 돌연변이를 식별하는 능력이 용융곡선 분석을 사용하여 설명될 것이다.
dsDNA 형성의 연속 모니터링이 직접적이고 절대적인 DNA 정량에 사용된다. 변성된 DNA가 급냉되어서 일정한 재어닐링 온도에 유지된다면 절대적인 DNA 농도가 재어닐링 속도에 의해 결정된다.
본 발명은 PCR 동안 서열 특이성 탐지를 위해 프로브 교합(가수분해가 아닌)에 종속되는 이중색 형광방법을 제공한다. 재어닐링 반응 및 교합 프로브의 용융은 형광단간의 엑소누클레아제 가수분해에 의존하는 프로브를 사용할때는 이용할 수 없는 정보를 제공한다. 초기 템플레이트 복제물 갯수는 템플레이트를 구별하기 위해서 프로브 용융온도를 사용하는 경쟁적 증폭에 의해 정량된다. 단일 염기 돌연변이가 프로브 용융온도 이동에 의해 탐지된다. 생성물 절대농도의 결정은 프로브 어닐링 반응의 분석에 의해 이루어진다.
게다가, 본 발명은 신속한 싸이클 증폭동안 형광을 연속 모니터링하며 상업적으로 사용될 수 있는 값싼 기기를 제공한다. 본 발명의 열 싸이클러는 10-20분후에 증폭을 할 수 있으며 하나, 둘 또는 3개의 형광단을 탐지하는 광학 모듈에 연결된다. 본 발명의 선호되는 구체예는 24개의 샘플을 1 내지 10회/초의 속도로 모니터링한다. 본 발명에 따르면 샘플은 복합 플라스틱/모세관 용기에 96웰 포맷으로 준비되고 열 싸이클링 및 분석을 위한 장치(도 11)에 옮겨진다. 선호되는 구체예는 형광 데이터를 분석하여 표시장치에 연속으로 표시하는 사용자 중심 그래픽 인터페이스를 포함한다.
본 발명은 또한 증폭의 실시간 제어 및 최적화를 위해 형광 피이드백을 사용한다. 형광이 온도 싸이클링 제어에 사용된다. dsDNA 특이성 염료의 연속 모니터링으로 형광 증가가 중단되후에 각 싸이클마다 신장이 종료된다. 변성 조건은 생성물이 완전 용융될때까지 온도를 증가시킴으로써 자동으로 제어된다. 프라이머 어닐링은 Cy5-라벨링된 올리고누클레오타이드로의 공명에너지 전달로 모니터링된다. 온도 싸이클링은 특정량의 생성물이 형성된 이후에 자동으로 종료된다.
신속한 온도 싸이클링의 장점이 인식되고 있다. 최소의 어닐링 및 변성 횟수와 신속한 온도 싸이클링은 PCR 정량을 개선하며 대립유전자 특이성 증폭의 구별능력을 개선한다. 신속한 싸이클링은 서열화 모호성을 감소시키며 디누클레오타이드 반복 증폭에서 "섀도우 밴딩"을 최소화 시킨다. 35kb까지의 긴 PCR의 경우에 높은 변성온도에 샘플이 가능한 적게 노출될 때 수율이 향상된다.
PCR 용으로 효과적이며 경제적인 신속한 싸이클러는 당해 산업에 큰 진보를 가져올 것이다. 공지 기술의 장치는 비싸고 복잡하다. 예컨대, Perkin Elmer 9600은 한시간 정도 이후에 두가지 온도 프로파일(60℃, 94℃)을 30싸이클 진행시키지만 비싸며 샘플내 온도 균일성이 문제이며 상당한 샘플내부 대류가 있다(Wittwer, C.T., G.B. Reed and K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification, in K. Mullis, F. Ferre, and R. Gibbs (Eds.), The Polymerase Chain Reaction, Springer-Verlag, Deerfield Beach, Florida, pp. 174-181, 1994 and Haff L., J.G. Atwood, J. Dicesare, E. Katz, E. Picozza, J.F. Williams, T. Woudenberg, A high-performance system for automation of the polymerase chain reaction, BioTechniques 10:102-112, 1991). 또다른 예는 kodak에 의해 개발되어 PCR증폭 및 탐지를 위해 열밀봉된 플라스틱 "PCR 포치"를 활용하는 폐쇄 용기 시스템을 사용하는 장치이다. kodak의 장치에서 샘플은 두 개의 가열/냉각 플레이트 사이에서 샌드위치로서 온도 싸이클링된다. 2개의 온도 프로파일(62℃, 94℃)의 30싸이클에 걸리는 시간은 약 30분이다. 이들 두가지 장치 모두 상당한 문제가 있다.
본 발명을 따르면, PCR반응 패러다임이 적절하다. PCR을 3가지 상이한 온도에서 일어나는 3개의 반응(변성, 어닐링, 신장)으로 생각하지 않으면 PCR 반응 패러다임은 더욱 적절할 수 있다(도 28). 반응 패러다임을 사용하면 온도대 시간 곡선은 중접 반응간의 연속 전이로 구성된다. 완전한 분석을 위해서는 모든 온도에 걸쳐 관련된 속도상수에 대한 지식이 필요하다. 모든 반응의 속도상수가 알려지면 "PCR의 물리학적 표현"이 개발된다. 이러한 속도상수 결정은 정확한 샘플 온도 제어를 필요로 하며 온도 싸이클링동안 반응을 모니터링 함으로써 도움을 받는다.
본 발명은 샘플의 연속 모니터링으로부터 발생하는 장점을 제공한다. PCR 정량을 위해 싸이클마다 형광을 모니터링 하는 장점을 제공하며 에티듐 브로마이드를 사용할때도 좋다. 싸이클마다 한 번 모니터링 할 경우에 조합된 어닐링/신장 단계동안 싸이클마다 한 번 형광이 수득되어서 생성물 농도에 대한 상대적 값을 제공한다.
본 발명에 따라서, 시간, 온도 및 dsDNA 형광이 200msec마다 수득되므로 생성물 변성 및 재어닐링에 대한 세부사항이 신속한 온도 싸이클링동안 관찰될 수 있다. 이러한 세부사항은 용융곡선에 의해 생성물 식별을 가능케 하며 상대적 및 절대적 생성물 정량 수단을 제공하며 돌연변이 탐지 및 온도 제어를 위한 순간적인 피이드백 수단을 제공한다. 연속 모니터링에 추가적으로 서열 특이성 프로브의 용융은 공명 에너지 전달에 의해 결정될 수 있다. 프로브 용융은 생성물 정량화 및 단일 염기 돌연변이 탐지에도 이용되는 특정 온도에서 일어난다.
PCR 정량에 본 발명의 적용이 기술될 것이다. 공지의 PCR 정량 방법은 노동 집약적이고 비싸다. 대개의 공지 방법은 종말점 분석을 사용하므로 정확한 결과를 위해서 양호한 초기 추정을 필요로 한다. 염료를 사용하여 싸이클마다 한 번 dsDNA 형광 모니터링하는 것은 넓은 동적 범위의 초기 템플레이트 농도가 분석될 수 있게하는 중요한 진보이다. 그러나, 온도 싸이클내에서 본 발명의 연속 모니터링은 생성물 순도 확인, 경쟁자와의 동시적 상대적 정량화, 및 생성물의 절대농도 결정을 가능케한다. 이러한 모든 정보는 10 내지 20분의 온도싸이클 내에서 게놈 dsDNA 인디케이터를 갖는 하나의 모세관 샘플 튜브로부터 수득될 수 있다. 내부 서열 특이성에 기초한 정량화 역시 두가지 색깔 분석과 공명에너지 전달을 사용하여 가능하다.
돌연변이 탐지에 본 발명의 응용이 기술된다. 유전자에서 돌연변이 스크린잉은 어려운 일이다. 공지 방법(변성 그레디언트 겔 전기영동, 온도 그레디언트 겔 전기영동, 단일쇄 구조다형성 및 서열화)은 전기 영동 이후의 PCR 증폭 및 후속 탐지를 필요로한다. dsDNA 염료를 사용한 용융곡선은 PCR 동안 헤테로듀플렉스를 생성하는 이질접합성 돌연변이를 식별할 수 있다. 추가 샘플처리나 설비의 필요성 없이 증폭동안 분석이 이루어진다. 예컨대, 이질접합 탐지는 유방암에 대한 게놈 민감성 평가에서 중요하다(Shattuck-Eidens D., M. McClure, J. Simard, F. Labrie, S. Narod, F. Couch, D. Hoskins, B. Wever, L. Castilla, M. Erdos, L. Brody, L. Friedman, E. Ostermeyer, C. Szabo, M.C. King, S. Jhanwar, K. Offit, L. Norton, T. Gelewski, M. Lubin, M. Osborne, D. Black, M. Boyd, S. Steel, S. Ingles, R. Haile, A. Lindblom, H. Olsson, A. Borg, D.T. Bishop, E. Solomon, P. Radice, G. Spatti, S. Gayther, B. Ponder, W. Warren, M. Stratton, Q. Liu, F. Fujimura, C. Lewis, M.H. Skolnick, D.E. Goldgar, A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarian cancer susceptibility gene, Implications for presymptomatic testing and screening, J. Amer. Med. Assoc. 273:535-541, 1995). BRCA1 및 BRCA2 유전자(〉10,000염기)를 서열화 함으로써 돌연변이를 탐지하는 것은 임상 테스트로서 가능하지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 헤테로듀플렉스 스크린잉을 사용하여 테스트 비용이 크게 절감될 수 있다. 특이적 돌연변이가 PCR동안 공명에너지 전달을 통한 서열 특이성 프로브를 사용하여 탐지될 수 있다.
PCR의 연속 모니터링에 최상의 프로브는 특이적이며 값이 싸야 할 것이다. 이중쇄 DNA(dsDNA)가 모든 증폭에 사용될 수 있으며 값이 싸다. 예컨대, SYBR Green I은 10㎕당 0.01센트이다. 추가로, 생성물 특이성이 용융곡선의 분석에 의해 가능하다. 그러나, 서열 특이성이 필요할 때 형광성 올리고누클레오타이드 프로브가 각 서열에 대해 합성되어야 한다. Perkin Elmer의 "TaqMan" 프로브는 각 프로브에 2개의 형광단을 포함시킨다. 프로브가 폴리메라제 엑소누클레아제 활성에 의해 가수분해될 때 형광이 발생된다. 이러한 프로브는 제조가 어렵고 비싸다; 프로브 0.1μmol당 1,200$. 타겟의 경쟁적인 정량에 두가지 프로브가 필요하다. 이에 비해서 가수분해에 종속되지 않는 형광 교합 프로브가 디자인될 수 있다. 교합프로브는 프로브마다 단일한 형광단을 필요로 하며 합성이 훨씬 쉽다. 이들의 형광은 가수분해가 아니라 교합에서 나오므로 프로브 형광의 온도 종속성이 돌연변이 탐지 및 정량에 사용될 수 있다.
공지의 탐지 기기는 수많은 결점을 갖는다. 과거에는 기기의 한계 때문에 가수분해 프로브의 경우 종말점 탐지만 가능했었다. 본 발명의 시스템에 의해서 신속하고 정확한 온도 싸이클링이 제공된다. 본 발명의 시스템에 의해 제공된 연속 형광 모니터링을 사용하여 교합의 온도 의존성이 추구될 수 있다. 온도 싸이클링동안 교합을 추구함으로써 필요한 스펙트럼 색깔 또는 프로브의 갯수가 최소화될 수 있다. 경제적인 이유로 샘플 조사용 레이저 대신에 높은 세기의 빛을 방출하는 다이오드가 사용되며 포토다이오드가 탐지에 사용된다. 샘플은 유리 모세관 샘플튜브나 열밀봉을 필요로 하지 않은 96-웰 포맷으로 복합유리/플라스틱 샘플 튜브에 채워진다. 본 발명은 저렴한 비용으로 실시간 형광 분석을 제공한다. 온도 싸이클링의 실시간 형광 제어는 증폭질을 향상시킨다. 예컨대, 변성이 일어날때까지만 샘플의 온도가 증가된다면 고온에 생성물의 노출이 최소화된다. 이것은 생성물 및 효소의 분해를 제한시켜 수율을 증가시키고 높은 용융온도로 생성물의 증폭을 제한함으로써 특이성을 증가시킨다.
도 29 는 증폭의 로그-선형 부위에서 10배 동적범위에 걸친 모니터링이 완전 수행됨을 보여준다. 게다가, 더 적은양의 템플레이트를 갖는 곤란한 증폭 뿐만 아니라 루틴 증폭(15,000 게놈 DNA 복제물/샘플튜브)을 수행한다.
도 29 에 도시된 바와 같이, 형광비는 싸이클 횟수와 초기 템플레이트 농도에 따라 증가한다. 각 곡선의 로그-선형부위(직선, 가는선)는 4싸이클이다(DNA 농도에서 24 또는 16배 범위). 도 29 는 템플레이트의 단일 복제물이 무 템플레이트(0.15 평균 복제물 샘플중 하나가 단일 복제물을 포함)와 구별될 수 있음을 보여준다. 높은 초기 템플레이트 농도(15,000 및 1,500/샘플 튜브)에서 증폭 효율은 높고 일정하지만 더 낮은 초기 농도를 갖는 샘플에서 효율이 감소된다. 모든 샘플은 동시에 증폭되며 각 싸이클마다 데이타의 정량 표시와 분석이 된다. 20분 미만에 45싸이클 증폭이 완료된다.
도 30 은 단일 샘플의 연속 모니터링을 위한 구체예를 보여준다. 연속 모니터링 수행에 있어서 단일 샘플이 온도제어된 기류와 선형 광학 경로의 교차점에 놓인다. 모세관의 한면이 광방출 다이오드를 써서 조사되고 다른면은 포토다이오드를 써서 관찰된다. 공기가 샘플위로 일정하게 흐르며 상류 가열코일에 의해 온도가 제어된다. 샘플 및 용기의 모양 및 방향이 dsDNA 염료 SYBR Green I으로 염색된 인간 게놈 DNA를 써서 연구된다.
도 31 은 PCR 샘플의 연속 모니터링을 위한 또다른 구체예의 광학적 배치도이다. 모세관 샘플 튜브의 길이를 따른 총내부 반사("광 파이핑")가 이용되어서 활성화 및 방출률을 증가시킨다. 광학 경로가 선형으로 부터 변화되어서 활성화 및 방출되는 빛이 동일한 광학 경로를 따른다. 최대의 광 파이핑을 위해서 광학적 축이 모세관의 길이와 평행하며 모세관 팁이 촛점이 된다. 샘플의 굴절계수가 1.33이면 방출된 빛의 12.3%가 팁에 안내되어야 한다. 도 32 는 모세관 측부(개방원)보다는 팁(폐쇄된 다이아몬드)을 관찰함으로써 신호세기의 10배 증가로서 광파이핑의 효율을 보여주는 차트를 보여준다. 도 32 에서 두 개의 상이한 크기의 모세관 샘플튜브는 SYBR Green I으로 염색된 dsDNA를 써서 상이한 길이로 충진된다. 더 많은 샘플이 튜브에 첨가될 때 형광효율은 감소하지만 관찰된 형광은 증가한다.
도 11 에서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)가 연속 모니터링에 사용될 수 있다.
형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)가 도 11 에 표시된 유사기능 성분 대신에 광방출 다이오드(LED)와 포토다이오드를 사용하여 구축될 수 있다. 따라서, 형광 활성화 소스(328)는 광방출 다이오드를 가진다. 광 배증관(362A, B)이 포토다이오드 대신 사용될 수 있다. 민감성은 백그라운드 형광에 의해 한정되는데, 이의 대부분은 탐지 시스템이 아니라 프로브로 부터 나온다. 절대감도보다 안정성이 중요하다.
본 발명은 모세관 샘플 사용시 편광효과 때문에 발생하는 문제를 극복한다. 형광을 관찰하면 샘플의 편광은 광학 시스템이 편광된 빛을 무질서하지 않게 하는 것을 필요로 한다. 모세관 팁으로 부터 나오는 형광 모니터링은 다중 반사 때문에 편광을 무질서하게 만든다. 둥근 유리 모세관 측부에 편광된 빛이 조사될 때 관찰되는 편광은 도 33 에 도시된 활성화 비임에 대하여 튜브의 정확한 위치선정에 의해 좌우된다.
본 발명에 따라서 형광 편광 프로브가 사용될 수 있다. 편광 프로브는 상이한 길이의 아미노링커에 의해 연결된 5'-형광제를 써서 30-머 로서 합성된다. PCR동안 폴리메라제의 5'-엑소누클레아제 활성은 프로브를 절단하여 증폭동안 편광을 감소시킨다. 완전한 프로브는 포스포디에스테르아제 I로 가수분해될 때 35mp까지 감소되는 약 90 밀리편광 단위(mp)의 편광을 가진다. 도 34 는 템플레이트로서 게놈 DNA를 사용한 단일 복제물 유전자의 증폭에서 0.2μM로 포함되는 하나의 프로브를 사용하여 수득되는 결과를 보여준다. 편광은 20 내지 30싸이클에서 감소되며 적어도 50싸이클까지 계속 감소한다. 수직 편광에 평행한 비율로서 표현된 감소는 11%이다. 링커의 길이, 아미노링커의 종류 및 5'-비상보성 테일의 존재/부재는 PCR동안 관찰되는 변화를 크게 바꾸지는 않는다. 용액의 점도를 증가시키기 위해서 설탕을 첨가하면 완전한 프로브와 가수분해된 프로브의 편광을 증가시키지만 증폭후 발생된 신호차이를 변화시키지 못한다.
엑소누클레아제 가수분해에 의해서 편광이 감소하지만 가수분해없는 교합은 편광을 증가시킨다. 본 발명에 따르면 형광제로 라벨링된 15-단위 펩티드 핵산이 사용된다. 아미드 기본골격으로 인하여 엑소누클레아제 활성에 의해 가수분해되지 않는다. 10배의 정제된 상보적 단일쇄 PCR 생성물에 교합될 때 이의 편광은 85로부터 97mp로 증가한다.
요약하면, 형광제 라벨링된 프로브는 교합 또는 가수분해될 때 편광변화를 보인다. 이러한 변화가 PCR 모니터링에 사용될 수 있지만 변화는 작다. 본 발명은 쇄 변위 증폭을 위해 교합의 작은 편광 신호를 증가시키는 방법에 사용될 수 있다. 절단 활성이 부족하지만 결합 특이성을 유지하는 엔도누클레아제 EcoRI의 유전학적으로 변경된 형태가 복합물의 편광을 증가시키는데 사용되었다.
공명에너지 전달 프로브가 본 발명에 사용될 수 있다. 공명에너지 전달 프로브는 더 높은 신호세기로 인하여 PCR 모니터링을 하는데 편광 프로브에 비해 우월하다. PCR에서 공명에너지 전달의 공지기술의 사용은 단지 종말점 분석에 국한된다. 프로브 디자인은 신호 발생을 위한 엑소누클레아제 활성에 달려있다. 이중라벨링된 형광제/로오다민 프로브가 5'-엑소누클레아제 활성에 의해서 폴리메라제 신장동안 절단되고 형광단을 분리시키고 형광제/로오다민 방출비를 증가시킨다. 도 35 는 형광제와 로오다민 라벨사이에 5개의 염기가 있는 프로브에서 나오는 형광 PCR 결과를 보여준다. 도 11 의 형광탐지용 신속한 온도 싸이클러(300)를 사용하여 20분후에 45싸이클 증폭이 완료된다. 싸이클마다 형광비를 모니터링함으로써 초기 템플레이트 농도의 109배 범위가 구별될 수 있다. 증폭곡선은 초기 템플레이트 농도에서 10배 변화마다 약 3-4싸이클 이동된다. 초기 템플레이트 농도가 낮을 때 효율이 감소하지만 무템플레이트와 단일 복제물이 구별될 수 있다.
가수분해 모니터링에 의해 발생된 신호는 누적되어서 생성물 농도에 간접적으로 관련된다. 도 35 에 도시된 바와 같이 생성물의 양이 평형이 된 이후에도 형광비는 계속 증가한다. 그럼에도 불구하고 형광신호는32P-dATP 포함에 의해 측정된 PCR 생성물의 양과 적어도 평형단계까지 잘 상관된다.
도 36 에 도시된 바와 같이 프로브의 농도는 민감성에 거의 영향을 주지 않는다. 프로브 농도를 40배 증가시키면 곡선을 단지 2싸이클 이동시킬뿐이다. 더 낮은 프로브 농도는 약간 더 민감하지만 더 낮은 신호세기로 인하여 더욱 가변적이다. 도 36 의 데이타는 각 프로브 농도에서 최대 신호로 정규화된다. 프로브 농도 감소가 동일한 양의 가수분해된 프로브에 더 큰 신호를 제공하지만 이러한 장점은 더 낮은 교합률에 의해 상쇄된다. 타겟에 프로브의 교합률은 프로브 농도에 의해 직접적으로 좌우된다.
형광제, 로오다민, 에오신 또는 BODITY 염료(Molecular probes로 부터 구매가능)로 라벨링된 수많은 가수분해 프로브가 사용될 수 있다. 일반적으로, 형광단간의 간격이 감소할 때 퀀칭 또는 에너지 전달은 증가하지만 PCR동안 가수분해는 감소한다. 가수분해를 필요로 하는 공명에너지 전달 프로브는 주목할만한 특성을 가진다. 한가지 특성은 일부 프로브가 가수분해에 대해 저항성이다는 점이다. 또다른 특성은 합성이 곤란하며 적어도 하나의 라벨의 수동 첨가와 정제를 위해 HPLC를 필요로 한다는 점이다.
Cy5는 올리고누클레오타이드에 직접 포함시키기 위한 아미다이트로서 최근에 이용되는 적색 염료이다. 광학 성분으로 선택될 때 적색/적외선 지역의 스펙트럼에서 작용하는 것이 이득이 된다. 조사를 위해 레이저 다이오드가 사용되며 포토다이오드 탐지기는 탁월한 감도를 가지며 관련 스펙트럼 지역에서 대부분의 물질은 최소의 자가 형광을 가진다. 본 발명과 관련하여 Cy5/Cy7 프로브가 개발되었다. 이러한 프로브를 사용할 때 신호가 약하지만 증폭이 탐지가능하다. 이 프로브가 포스포디에스테르아제에 의해 완전 가수분해되면 단지 2배의 신호증가가 관찰된다. PCR의 20과 40싸이클 사이에서 도 37 에 도시된 대로 1.3배의 신호증가가 일어난다. Cy5/Cy7 프로브의 합성은 Cy7의 수동 첨가를 필요로 한다.
이중 라벨링된 형광제 및 Cy5 프로브는 자동화된 올리고누클레오타이드 합성기에서 용이하게 제조된다. 형광제/Cy5 프로브는 포스포디에스테르아제에 의해 완전 가수분해될 때 탁월한 형광비 변화를 보인다. 형광제와 Cy5의 방출 파장이 분리되고 도 38 에 도시된 대로 형광단 사이에 효과적인 공명에너지 전달이 일어난다. 스펙트럼 중첩이 작지만 Cy5의 몰 흡수계수와 흡수파장은 높다. 스펙트럼 중첩, 받게 흡수성, 및 받게 파장은 모두 에너지 전달속도를 결정하는 중첩 적분에 기여한다. Cy5는 형광제 활성화 파장에서 낮은 흡수성을 가지므로 Cy5의 직접적인 활성화는 최소이다.
형광제/Cy5 프로브는 PCR동안 효과적으로 가수분해되지 않는다. 완전 가수분해로 형광비가 200배 증가할 수 있지만 선호되는 형광제/Cy5 프로브는 PCR의 20과 40 싸이클 사이에 단지 1.45배 증가를 제공한다(도 37). 형광단 사이에 다양한 스페이서로 그리고 5'단부에 형광제 또는 Cy5를 써서 여러 형광제/Cy5 프로브가 합성된다. 모든 프로브는 PCR에 낮은 신호를 제공한다. 가수분해 프로브를 사용한 결과가 아래에 요약된다:
엑소누클레아제 프로브를 사용한 형광신호발생
형광단 완전가수분해로 형광비 증가 PCR 40싸이클로 형광비 증가
형광제 로오다민 25배 8배
형광제 Cy5 200배 1.45배
Cy5 Cy7 2배 1.3배
이중 라벨링된 형광제/Cy5 올리고누클레오타이드의 가수분해에 대한 저항성은 프로브 가수분해 대신에 프로브 교합에 의존하는 공명 에너지 전달 스킴을 개발함으로써 장점이 될 수 있다. 이중 라벨링된 프로브의 가수분해 대신에 PCR동안 공명에너지 전달에 의해 교합이 직접 탐지될 수 있다. 이중라벨링된 엑소누클레아제 프로브에 비해서 단일 라벨링된 프로브의 합성은 비교적 간단하다.
PCR동안 교합의 공명에너지 전달 탐지를 위해 두가지 상이한 방법이 도 39 에 도시된다. 첫 번째 방법은 하나는 형광제로 3'이 라벨링되고 다른 하나는 Cy5로 5'이 라벨링된 두 개의 인접 교합 프로브를 사용하는 것이다. PCR동안 생성물이 누적될 때 각 싸이클의 어닐링 단계동안 프로브는 서로 인접하게 교합한다. 두 번째 방법은 Cy5로 라벨링된 프라이머와 단일 교합 프로브를 사용하는 것이다. 라벨링된 프라이머는 증폭동안 PCR 생성물에 포함되므로 단일 교합만이 필요하다. 두 방법에서 Cy5로의 형광 에너지 전달은 교합에 따라 증가하고 형광제에 대한 Cy5의 형광비로서 도시된다. 형광은 2-온도 어닐링/신장 세그멘트의 단부 근처에서 매 싸이클마다 모니터링 된다. 교합 프로브의 민감성은 가수분해 프로브와 유사하다(도 29 와 도 39 비교).
교합 프로브에서 나오는 형광의 온도 종속성이 도 40 의 형광대 온도 플롯으로 설명된다. 이 플롯은 200msec의 온도싸이클링마다 단일 샘플을 모니터링 함으로써 발생된다. 어닐링/신장 단계동안 프로브는 단일쇄 생성물로 교합하므로 형광비(Cy5/형광제)가 증가한다. 생성물 변성온도로 가열하는 동안 프로브는 70-75℃ 부근에서 해리하고 형광비는 백그라운드 비율로 복귀한다. 이에 비해서, 가수분해 프로브는 이러한 온도 종속성을 보이지 않는다(도 41). 가수분해 프로브 사용시 형광대 온도 플롯은 온도에 따라 형광의 선형 종속성을 보일 뿐이다. 온도 싸이클링 동안 형광으로 교합을 모니터링하는 것은 강력한 도구이다. 서열 특이성 프로브의 용융온도는 PCR동안 생성물을 식별 및 판별할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면에 따라서 이중쇄 특이성 염료가 사용될 수 있다. PCR 생성물의 쇄 상태는 dsDNA의 존재하에서 형광을 발휘하는 염료를 사용하여 추구될 수 있다. 증폭동안 SYBR Green I이 존재할 때 더 많은 dsDNA가 형성됨에 따라 형광이 증가한다. 그러나, 형광은 도 42a 및 42b 에 도시된 바와 같이 온도에 반비례하므로 온도 싸이클링은 교란효과를 도입한다. 형광이 PCR동안 온도 및 시간의 함수로서 연속 모니터링될 때 데이타는 도 12 에 도시된 대로 3차원 나선을 형성한다. 도 12 에 도시된 3차원 곡선은 온도대 시간, 형광대 시간, 형광대 온도의 2차원 플롯으로 투영될 수 있다. 도 12 의 온도대 시간 투영도는 싸이클마다 반복되며 유사한 형태가 도 42b 의 하부에 도시된다. 도 12 의 형광대 시간 투영도는 도 42b 에 도시된 온도대 시간 플롯의 거울상이다. 생성물이 축적됨에 따라 변성온도에서를 제외하고는 형광이 증가하며, 변성 온도에서 형광은 도 12 에 도시된 대로 기준선으로 복귀한다.
형광대 온도 투영도는 PCR동안 쇄 상태의 온도 종속성을 보여준다(도 24, 도 24a). 증폭이 진행함에 따라 온도 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에서 상승 루우프로서 나타난다. 샘플이 가열될 때 변성이 일어날때까지 형광은 높다. 샘플이 냉각될 때 dsDNA 형성으로 나오는 형광이 증가하는데, 이것은 생성물 재어닐링을 반영한다. 신장동안 온도가 일정할 때 증가하는 형광은 추가 DNA 합성과 상관된다. 형광대 온도 데이타는 온도가 형광에 미치는 효과를 제거하기 위해서 변형될 수 있다(도 24). 본 발명에 따라서, 생성물 Tm과 용융곡선이 증폭 특이성 평가에 사용된다. 많은 경우에 이 방법은 교합프로브 합성 필요성을 제거한다. 교합온도에 기초한 판별은 식별 및 정량에 강력한 도구이며 다색 분석에 의한 스펙트럼 판별과 더불어 사용될 수 있다.
PCR 연속 모니터링용 프로브의 요약은 다음과 같다. 다음 테이블은 PCR의 연속 모니터링에 유용한 dsDNA 염료, 가수분해프로브, 교합 프로브를 비교한다. dsDNA 염료의 형광은 DNA의 쇄 상태에 종속된다. 이중라벨링된 가수분해 프로브는 퀀칭된다. 퀀칭된 형광단의 형광은 프로브가 가수분해될 때 증가한다. 교합프로브는 교합이 2개의 형광단을 가깝게 할 때 증가되는 공명에너지 전달에 종속적이다.
PCR의 연속 모니터링용 형광 프로브
형광 프로브
dsDNA 염료 가수분해 프로브 교합 프로브
메카니즘 쇄 상태 퀀칭 전달
프로브 합성 불필요 곤란 단순
특이성 생성물 Tm 서열 서열
용융 분석 예 아니오 예
다색 분석 아니오 예 예
도 11 에 도시된 형광 탐지용 신속 온도 싸이클러(300)는 신속한 온도 제어를 할 수 있는 형광장치의 특성을 포함한다. PCR은 10 내지 20분의 온도 싸이클링동안 수행되고 분석될 수 있다. 1) 각 온도 싸이클내에서 연속 형광 모니터링, 2) 교합의 온도 및 시간 종속성 분석의 조합은 장점을 제공한다.
본 발명은 PCR동안 생성물 순도 모니터링, 템플레이트 정량 및 돌연변이 탐지를 위한 단색 형광 방법을 제공한다. SYBR Green I은 이중쇄 DNA와 착물이 될 때만 고형광성이 되는 민감성 염료이다. PCR 반응에서 신장온도에서 변성온도로 가열될 때 SYBR Green I의 형광 강하로서 변성이 관찰될 수 있다. 용융곡선은 변성되는 생성물의 특성이다. 작은 PCR 생성물의 경우에 용융전이는 좁은 온도 범위에서 일어나며 용융의 종말점이 Tm이다. 3개의 정제된 PCR 생성물의 형광 용융곡선이 도 43a 에 도시된다. 도 43a 의 데이타는 온도를 0.2℃/초의 속도로 증가시키는 동안 SYBR Green I으로 형광을 모니터링 함으로써 수득된다. 상대적 용융 위치가 GC 함량과 길이를 Tm에 관련시키는 실험식으로 부터 예견될 수 있다. PCR 생성물의 겉보기 Tm은 도 43 과 같이 가열속도에 달려있다. 가열속도가 감소하면 용융곡선은 저온으로 이동하므로 더 예리해진다. 용융곡선의 최대 상세화 및 Tm의 정확한 추정을 위해서 반응속도의 효과가 최소화될 필요가 있다. PCR 생성물의 겉보기 Tm은 도 44 와 같이 dsDNA 염료의 농도에도 의존한다. 염료 농도가 높을수록 이중나선의 안정성과 관찰된 Tm의 안정성이 증가한다.
상이한 dsDNA 염료의 특성이 PCR동안 용융곡선을 위한 최적의 염료 선택을 위해 기술되고 PCR 생성물 순도 평가와 증폭동안 돌연변이 탐지를 위해 용융곡선이 설명될 것이다. 마지막으로 경쟁적인 PCR 정량과 생성물 절대 정량에 dsDNA 염료의 사용이 설명될 것이다.
다양한 dsDNA 염료가 설명된다. 본 발명에 사용가능한 이중쇄 특이성 염료는 많다. 선호되는 염료는 활성화 스펙트럼이 형광제와 비슷하기 때문에 에티듐 브로마이드 보다 선호되는 SYBR Green I이다. 1) PCR 억제, 2) 탐지 감도, 3) 가열속도가 용융곡선에 미치는 효과, 4) 염료농도가 용융곡선에 미치는 효과를 평가하기 위해서 다양한 이중쇄 염료가 테스트된다. 먼저, 신속한 싸이클 PCR과 상용적인 염료의 최고 농도가 결정된다. 이러한 농도는 최적의 광학 필터를 써서 PCR동안 연속 모니터링 함으로써 탐지 감도를 평가하는데 사용될 수 있다. 전이속도 및 염료농도가 용융곡선에 미치는 효과는 염료 특이성이다. 데이타는 도 43 및 도 44 에 표시된다. 아래 열거된 염료가 SYBR Green I과 비교된다:
용융곡선을 위한 또다른 dsDNA 염료
(Fu Y-H, DPA Kuhl, A Pizzute, M Pieretti, JS Sutcliffe, S Richards, AJMH Verkerk, JJA Holden, RG Fenwick, ST Warren, BA Oostra, DL Nelson, and CT Caskey, Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox, Cell 67:1047-1058, 1991)
염료 활성화 방출 주석
피코 그린 490㎚ 520㎚ 정량화 촉진
에티듐 브로마이드 520 590 값싼 삽입물질
아크리딘 오렌지 490 550 620㎚에서 단일쇄 방출
티아졸 오렌지 510 540 결합 DNA상의 높은 형광
YO-PRO-1 490 510 AT 선호
크로모마이신 A3 440 550 GC 선호
SYBR Green I의 경우에 0.1-0.5℃/초의 가열속도와 1:7,000-1:30,000의 희석비를 사용한다. GC 고함량 및 GC 저함량 PCR 정제 생성물의 용융 곡선이 각 염료에 대해 수득된다. 상이한 염료를 사용한 용융곡선은 AT/GC 선호 및 결합방식에 따라 다양한다. 에티듐 브로마이드와 같이 상이한 DNA 도메인의 용융동안 염료가 재분배될 수 있다. 본 발명에 따라서, 용융곡선을 위해 필요한 최상의 염료, 농도 및 가열속도가 결정될 수 있다.
생성물 순도가 설명될 것이다. 크기 및 GC 함량에서 이질성 때문에 PCR 생성물은 40-50℃ 범위에 걸쳐서 용융할 수 있다. 예컨대, 프라이머 다이머는 저온에서 용융해야 하며 불균질 비특이성 생성물은 넓은 범위에 걸쳐서 용융해야 하며 순수한 PCR 생성물은 특정 Tm에서 예리하게 용융해야 한다. 이러한 특성은 필요한 생성물을 제공하기 위해서 최적화된 PCR 증폭의 아가로스 겔 전기영동에 대해 형광 용융 곡선을 비교함으로써 설명된다. 긴 PCR 생성물은 식별의 지문으로 사용될 수 있는 내부 용융 도메인을 가지지만 더 작은 DNA 조각(〈300bp)은 하나의 전이에서 용융한다. 서열에 따라서 DNA 용융 도메인은 40 내지 600 염기쌍일 수 있다.
돌연변이 탐지가 본 발명에 따라서 고려되어야 한다. 용융곡선을 사용하여 유전적 다형성 및 돌연변이가 결정된다. 반복 다형성(VNTRs, 디누클레오타이드 반복)은 크기가 다양하지만 서열은 크게 변하지 않는다. DNA 조각에서 동질접합 돌연변이(염기 치환)은 변성 그레디언트 겔 전기영동과 온도 그레디언트 겔 전기영동에 의해 탐지될 수 있지만 온도 이동은 〈1℃이므로 이러한 차이는 정밀기술을 사용할때만 탐지가능하다. 그러나, PCR에서 DNA 타겟이 이질접합형일 때 헤테로듀플렉스가 냉각동안 형성되며 관찰된 온도이동이 1-5℃이다. 이질접합 돌연변이의 대부분은 PCR동안 단순한 용융곡선에 의해 탐지될 수 있다. 가장 일반적인 낭포성 섬유증 돌연변이의 3-염기쌍 삭제 지점을 에워싸는 지역(△F508)이 본 발명에 따라서 DNA로 부터 증폭된다. 동질접합 야생형, 이질접합 △F508, 동질접합 △F508의 용융곡선이 비교된다. 동질접합 샘플은 거의 구별불가능하지만 이질접합 곡선은 낮은 Tm의 헤테로듀플렉스 용융을 보이며 정상적인 "호모듀플렉스" 용융이 뒤따른다. 앰플리콘이 적을수록 이러한 효과는 더욱 심오하다.
혈전증의 유전적 위험인자는 인자 V유전자의 단일지점 돌연변이이다. 돌연변이를 둘러싸는 이질접합 및 동질접합 DNA가 증폭되고 용융곡선이 수득된다. 동질접합 돌연변이는 동일한 양의 야생형 DNA와 함께 증폭시켜 탐지된다. 관찰한 혼성 용융곡선은 이질접합 증폭과 동일하게 나타난다. 야생형 DNA가 1:2 비율로 테스트 샘플과 혼합되면 이질접합자는 2:1의 야생형:돌연변이 용융을, 동질접합 돌연변이는 1:2의 야생형:돌연변이 용융을 보인다.
BRCA1은 유방암의 5%의 원인으로 식별된 제 1 유방암 민감성 유전자이다. 대개의 돌연변이는 단지 한 개나 두 개의 염기의 치환, 삽입 또는 삭제이며 민감성은 돌연변이의 이질접합성에 의해 부여된다. 이질접합자는 자동 서열화에 의해 탐지될 수 있지만 5,000 코드 염기 이상을 서열작업하는 임상테스트는 공지장치 및 방법을 사용해서는 비싸고 어렵다. 영향받은 앰플리콘을 증폭하고 용융곡선을 관찰하고 야생형과 비교함으로써 본 발명을 사용하여 10개의 알려진 BRCA1 돌연변이가 테스트 되었다. 프라이머와 알려진 DNA 샘플은 Myriad Diagnostics 로부터 구매가능하다.
본 발명을 사용하여 경쟁적인 PCR 정량이 가능하다. 생성물 용융온도에서 차이를 탐지할 수 있는 능력이 본 발명에 의해 PCR 정량에 이용되어서 PCR 생성물과 경잴물질사이를 구별할 수 있다. 초기 템플레이트 복제물 갯수는 동일한 프라이머를 사용하지만 천연 앰플리콘으로 부터 용융온도에서 상이한 비교 템플레이트와 함께 경쟁적인 증폭함으로써 정량된다. 이러한 방법의 잇점은 도 45 및 도 46 에 도시된다. 도 45 는 Tm이 2℃ 차이가 나는 두 개의 정제된 PCR생성물이 혼합될 때 수득되는 용융곡선을 보여준다. 온도가 형광에 미치는 효과를 보정하고 온도에 대한 형광의 도함수를 도시함으로써 각 PCR 생성물의 상대적인 양이 도 46 에 도시된대로 정량될 수 있다.
본 발명에 따라서 경쟁적인 템플레이트가 앞서 기술된 프라이머로 부터 헤파티스 B 표면 항원 유전자의 180 염기쌍 조각의 증폭을 위해 발생된다. Tm에서 3℃ 차이가 나는 경쟁 템플레이트가 템플레이트 길이, GC 함량 또는 둘의 조합을 변화시킴으로써 수득될 수 있다. 더 작은 헤파티스 B 조각의 PCR 증폭과 말단 중첩을 통한 연결에 의해 다음과 같은 템플레이트가 합성된다.
야생형과 T m 이 3℃ 차이가 나는 경쟁적인 헤파티스 B PCR 템플레이트
템플레이트 GC 함량 길이 추정도 Tm이동(℃)
야생형 50.0 180 0
#1 50.0 87 -3
#2 57.3 180 +3
#3 42.7 180 -3
템플레이트(#1,#2,#3)는 싸이클마다 한 번 SYBR Green I을 사용한 모니터링에 의해 결정되는 증폭효율과 A260에 의해 정량된다. 3가지 템플레이트(#1,#2,#3)에 의한 야생형 DNA의 경쟁적인 정량화가 교합을 사용한 표준 임상방법에 비교된다.
생성물의 절대적인 정량도 본 발명에 의해 가능하다. 이중쇄 DNA 형성의 연속 모니터링은 재어닐링 반응에 의해 직접적이고 절대적인 DNA 정량을 허용한다. 샘플온도는 변성온도로 부터 빠르게 떨어지고 프라이머 어닐링을 방지하기에 충분히 높은 더 낮은 온도에서 일정하게 유지된다. 생성물 재어닐링 속도는 2차 반응을 따른다. 상이한 농도의 DNA가 테스트될 때 재어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도의 특성이다(도 26). 주어진 PCR 생성물 및 온도에서 2차 속도 상수가 측정될 수 있다. 속도상수가 알려지면 미지의 DNA 농도가 실험적인 재어닐링 데이타로 부터 결정될 수 있다. 원리는 도 27 에 도시된다. 곡선은 앞서 설명된 LabView 프로그램잉 환경을 사용하여 실시간으로 온도 싸이클링 하는 동안 비선형 최소 자승 회귀분석에 의해 조절된다. 냉각은 순간적이지 않으며 일정온도 도달전에 일부 재어닐링이 일어나지만 회귀분석은 이를 허용한다(도 27). 이 기술은 순수한 PCR 생성물을 필요로 하지만 온도 싸이클링 동안 수득되는 용융곡선에 의해 보장받을 수 있다. 재어닐링 반응에 의한 정량은 신호 레벨과 무관하며 사소한 샘플 차이에 의해 영향받지 않는다.
생성물 재어닐링의 2차 반응 가정이 상이한 DNA 농도에서 속도상수를 결정함으로써 확인된다. 일부 형광 염료는 농도 종속 방식으로 재어닐링에 영향을 준다. 관계가 한정되고 정량이 가능하다. 재어닐링 반응에 의한 정량이 각 신장기간의 말엽에 형광을 사용하는 정량에 비교된다.
본 발명은 PCR동안 서열 특이성 탐지를 위해 프로브 교합(가수분해가 아니라)에 의존하는 이중색상 형광방법을 제공한다. 본 발명에 따라서 형광제와 Cy5로 라벨링된 인접 교합 프로브간의 공명에너지 전달이 증폭 모니터링에 사용될 수 있다. 그러나, 프로브간의 최적 거리, 프로브 길이, 프로브 농도의 효과도 고려되어야 한다.
본 발명은 인접한 교합 프로브의 최적화를 제공한다. 프로브간의 거리의 효과가 결정된다. 본 발명에 따라서 형광제 조절된 기공 유리(Glen Research) 및 Cy5 아미다이트(Pharmacia)를 써서 5, 3'-형광제 라벨링된 30-단위 및 5, 5'-Cy5-라벨링된 30-단위가 합성된다. 형광제와 Cy5간의 프로브간 거리가 0 내지 25 염기인 β-글로블린 지역에서 프로브가 동일쇄에 교합하도록 설계된다. HPLC와 형광 모니터가 정제에 사용된다. 순도는 분석 겔 전기영동과 A260:A490또는 A260:A650비율에 의해 검사된다. PCR동안 프로브는 0.2μM로 포함되고 2-온도 싸이클링이 사용된다. PCR동안 형광비 변화가 프로브간 거리에 대해 도시되어서 프로브간 최적의 거리를 결정한다.
최적의 프로브간 거리를 사용하여 20, 25 및 35 염기로된 프로브 길이가 합성되고 30-단위 프로브와 비교된다. 이들 프로브의 용융온도가 PCR동안 관찰되고 프로브 길이에 대해 도시된다. 더 긴 프로브의 사용은 프라이머 어닐링 단계와 프로브 어닐링 단계가 있는 3-온도 싸이클의 사용을 허용한다. PCR동안 프로브 농도가 탐지 민감도 및 신호 세기에 미치는 효과가 측정된다.
교합 프로브로의 공명에너지 전달을 위한 라벨링된 프라이머 사용은 본 발명의 또다른 측면이다. 인접한 공명 에너지 전달 프로브중 하나가 도 39 에 도시된 대로 PCR 프라이머에 포함될 수 있다. 도시된 경우에 라벨링된 프로브가 라벨링된 프라이머를 포함하는 단일쇄 PCR 생성물에 교합한다. 라벨링된 프라이머는 Cy5(Amersham/BDS)로의 수동 커플링을 위해 아미노링커(Glen Research)를 갖는 변성 dT 아미다이트를 써서 합성된다. 본 발명은 PCR를 방해하지 않으면서 프라이머의 3'-단부에 변성된 Cy5-dT를 폐쇄하는 방법을 포함한다. 이것은 상이한 위치에서 라벨링된 염기를 갖는 여러개의 라벨링된 프라이머를 필요로 한다. 다음에 여러개의 3'-형광제-라벨링된 프로브를 합성 및 테스트 함으로써 형광단 간의 최적의 거리가 발견된다.
공명에너지 전달에 의해 교합을 탐지하기 위해서 다른 포맷을 사용하는 것도 본 발명의 범위내에 있다. 선호되는 방법에서 인접한 교합 프로브 스킴은 "비경쟁적 포맷"으로 칭한다. 이것은 두 개의 상보적인 올리고누클레오타이드가 형광단으로 단일 라벨링되는 "경쟁적 포맷"과 비교된다. 프로브는 서로에 대해 교합하거나(에너지 전달이나 퀀칭을 가져옴) 경쟁 타겟에 교합한다. 이것은 축적되는 PCR 생성물이다. 20-, 25-, 및 30-단위 5'-Cy5 라벨링 및 3'-형광제 라벨링된 상보적 프로브의 합성 및 테스트가 본 발명에 따라 수행될 수 있다.
Morrison의 "삽입물질 포맷"은 교합할 때 이중쇄 특이성 염료와 상호작용하는 라벨링된 프로브를 필요로 한다(Morrison L.E., Detection of energy transfer and fluorescence quenching, in L.J. Kricka (ed.), Nonisotopic DNA probe techniques, Academic Press, San Diego, pp. 311-352, 1992). 이중쇄 특이성 염료로서 SYBR Green I의 사용과 3' 및 5' 단부에서 Cy5로 이중라벨링된 20-, 25-, 및 30-단위 프로브의 합성이 본 발명의 범위내에 있다. PCR생성물 형성은 Cy5의 증가된 방출로서 관찰가능한 교합을 가져온다. 이 방법은 서열 특이성 생성물과 이중쇄 DNA가 동시에 모니터링 될 수 있는 장점을 가진다.
본 발명은 돌연변이 탐지, 경쟁적 PCR 정량, 생성물 정량을 위한 이중색상 서열 특이성 방법을 적용한다. 교합 프로브의 Tm은 단일 염기 불일치가 존재하면 10℃ 이동한다. 교합 프로브가 돌연변이 지점에 놓이면 프로브 용융에서 10℃ 이동으로서 단일염기 돌연변이가 탐지가능하다. 단일 염기 판별을 위에서 언급된 인자 V돌연변이와 인접한 형광제/Cy5 프로브를 사용하여 설명된다.
경쟁적 PCR 템플레이트가 내부 염기 변화를 디자인될 수 있다. 상이한 온도에서 상이한 타겟을 순차적으로 용융시키는 탐지 프로브가 사용된다면 상대적인 정량이 가능하다. 프로브 어닐링 반응에 의해서 생성물의 절대적인 정량이 가능하다. 라벨링된 프라이머와 교합 프로브가 사용된다면 어닐링 반응은 의사 1차반응이며 공지의 템플레이트 농도를 써서 테스트된다.
도 47 은 모세관 샘플 튜브의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)를 보여준다. 형광 탐지를 포함한 본 발명의 다양한 특징의 비교가 아래에 제공된다.
특성 단일샘플 구체예 다중샘플 구체예 다중샘플 구체예
용량 단일샘플 다중샘플 다중샘플
광원 LED 크세논 아아크 LED
탐지기 포토다이오드 PMTs 포토다이오드
광학경로 선형 분리된 에피플루오레센트
방출밴드 1, 2 1, 2 1,2,3 연속
모세관 조사 측부/팁 측부 팁
편광 가능성 예 아니오 아니오
도 47 에 도시된 모세관 샘플 튜브의 팁에서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러가 특히 이득이 된다. 샘플 챔버내 온도는 400W 가열 카트리지(Reheat, Inc.)와 챔버팬을 구동하는 DC 희토유 브러쉬 모터(Escap AG., RPM MAX=15,000, 고장시간 10,000시간)를 사용하여 조절된다. 가열동안 카트리지는 비례적으로 조절되고 팬은 저속으로 움직여서(12V, 0.5A) 전체 샘플 챔버에 온도 균일성을 제공한다. 냉각동안 가열 카트리지는 작동 중지되며 팬은 최대 속도로 움직인다(27V, 1.4A). 팬은 공기를 중심구멍에 유입시키고 배출구멍을 통해 방출시킨다. 가열 및 냉각요소는 중심축 주위에 대칭적이며 스테핑 모터를 써서 위치선정되는 원형카루셀에 최대 24샘플이 놓인다. 스테핑 모터(New England Affiliated Technologies)는 카루셀 1회전마다 10,000 스텝 이동시킨다.
도 47 에 도시된 구체예의 광학 디자인은 모세관 팁의 에피플루오레센트 조사에 기초한다. 활성화 소스는 "매우 밝은" 청색광 방출 다이오드(LEDtronics)이다. 형광신호는 집적된 탐지기/필터 모듈(Ealing Electronics, TO5 패키지에 고성능 실리콘 포토다이오드를 갖는 0.5인치 간섭 필터)로 부터 획득된다. 활성화 및 탐지 성분은 관련 전자장치와 함께 하나의 회로 보오드에 직접 장착된다. 모든 광학요소는 0.5인치 직경을 가진다.
샘플은 도 47a-d 에 도시된 복합 플라스틱/유리 샘플용기에 충진된다. 5㎕ 샘플이 각 튜브에 첨가되고(도 47a) 저속으로 원심분리되어 샘플이 모세관 팁에서 1㎝ 유체 칼럼으로 놓이게 된다(도 47b). 이후에 복합 플라스틱/유리 용기의 입구가 플라스틱 플러그로 밀봉되고(도 47c) 모세관 샘플 튜브의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에 놓인다(도 47d). 도 47a-d 에서 모세관 샘플 튜브에 플라스틱 충진 및 밀봉 구조물의 첨가는 바람직한 열적 특성을 유지시키면서 유리 모세관 튜브의 효과적인 사용을 제공한다. 샘플은 복합 플라스틱/유리 샘플용기에 첨가되고 96-웰 포맷으로 원심분리될 수 있지만 기기에 개별적으로 충진된다. 복합 플라스틱/유리 샘플 용기는 도 47 에 도시된 바와 같이 팁을 광학적 촛점에 정렬시키는 황동 슬리이브에 끼워진다. 이러한 끼워 맞춤은 축을 벗어나서 제조 순간에 각 슬리이브의 정확한 정렬을 허용한다.
복합 플라스틱/유리 샘플 용기는 편리하고 값싼 샘플 홀더를 제공한다. 0.8㎜ 내경과 1.0㎜의 외경을 가지며 한 단부는 밀폐되고 다른 단부는 개방된(도 47a-d 에 도시된 플라스틱 밀봉장치를 수용하는) 유리 모세관 튜브가 값싸게 제조될 수 있다. 플라스틱 성분 역시 값싸게 제조될 수 있다. 이들 성분이 조립되어 충진의 용이성 및 보호를 위해 96-웰 랙에 놓인다. 평평한 팁 뿐만 아니라 다양한 외부 곡률 및 내부 곡률을 갖는 팁이 본 발명에서 사용가능하다.
샘플에서 1-10회/초 형광을 수득하는 도 47 의 구체예에서 샘플이 비교적 빠르게 회전될 필요가 있다. 24 샘플을 위치시키는 스테핑 모터를 사용할 경우 각 샘플은 4.2-42msec 할당된다.
도 47 에 도시된 구체예의 경우 사용자 인터페이스와 기기 제어는 도 11 에서 설명된 것과 동일 또는 유사하다. 도 47 에 도시된 구체예의 제어기는 광 방출 다이오드의 디지탈 I/O 제어를 제공하며 스테핑 모터의 방향, 히터 및 챔버팬을 제어한다. 효과적인 사용자 인터페이스가 제공된다.
도 48 은 형광 교합 모니터링의 온도대 시간 세그멘트를 보여준다. 변성온도까지 느린 온도 증가동안 생성물 용융곡선이 획득된다. 변성후 온도를 일정한 온도로 신속히 낮춤으로써 생성물, 프로브 또는 프라이머 어닐링이 보조적으로 행해진다. 프로브 용융곡선은 프로브 Tm주변온도로 느리게 가열함으로써 수득된다. 도 47 의 구체예는 즉각적인 실시간 표시를 제공하며 온도 싸이클링 동안 모든 분석을 제공한다.
본 발명의 구체예가 한가지 또는 두가지 색상 분석을 활용하지만 도 47 에 도시된 구체예는 수집 광학장치에 또다른 이색 포토다이오드/필터 어셈블리를 첨가함으로써 3-색 분석도 가능하다(도 31). 게다가, 다색 획득을 위해 선형 포토다이오드 배열상에 파장의 동시적 분리를 허용하는 것도 본 발명의 범위내에 있다. 선형 포토다이오드 배열이 사용될 때 도 47 에 도시된 수집 광학장치는 다중 파장 탐지를 위해 프리즘 또는 회절 격자, 렌즈, 및 포토다이오드 배열 또는 CCD로 대체된다. 선형 포토다이오드 배열은 500 내지 800㎚ 사이에서 10-20㎚의 15-30 파장 빈을 수집한다. 다양한 구성(대개의 단색측정기에서 사용된 회절격자를 위한 Littrow 자가조준 구성)이 사용되어서 수집효율, 스펙트럼 분해 및 공간 조건의 균형을 잡을 수 있다.
본 발명은 증폭의 최적화 및 실시간 제어를 위하여 형광 피이드백을 활용한다. 실시간 형광 모니터링은 온도 싸이클링 조절에 사용된다. 이중쇄 특이성 염료를 사용하여 형광이 증가를 중단한 이후에 신장이 싸이클마다 종결될 수 있다. 변성을 위해서는 생성물이 완전 용융될때까지만 온도가 증가할 필요가 있다. 마지막으로, 일정량의 생성물이 형성된후 온도 싸이클링이 자동으로 종결될 수 있다. 이러한 실시간 제어는 형광 온도 싸이클러에서 옵션으로서 프로그램된다.
어닐링의 제어 및 실시간 모니터링이 본 발명에 의해 제공된다. 프라이머중 하나는 Cy5로 3'-라벨링 될 때 신장은 일어날 수 없다. 라벨링된 프라이머(1-10%)가 라벨링안된 프라이머(90-99%)와 혼합된다면 증폭 효율이 약간 감소되지만 이중쇄 특이성 염료로 부터 Cy5로의 형광 에너지 전달로서 어닐링이 관찰가능하다. 이것은 위에서 기술된 "삽입물질 포맷"이다. 최저의 Tm(최근 열역학에 의해 결정되는)을 갖는 프라이머가 이중쇄 특이성 염료로서 SYBR Green I을 사용하여 라벨링된다. 어닐링동안 증폭효율 및 Cy5 형광이 라벨링된 프라이머의 백분율에 대해서 비교된다.
본 발명의 직접 모니터링은 Cy5 라벨링된 프라이머를 써서 직접 수행되거나 등가의 상보적인 올리고누클레오타이드를 써서 간접적으로 수행된다. 최저의 용융 프라이머로서 동일한 길이 및 Tm의 올리고머누클레오타이드가 증폭된 서열에 대한 상보성 없이 디자인된다. 이러한 올리고누클레오타이드는 Cy5로 5'-라벨링되고 이의 상보물은 형광제로 3'-라벨링된다. 쌍의 교합으로 Cy5로의 공명 에너지 전달이 일어난다. 형광제 라벨링된 올리고누클레오타이드(0.005μM)와 Cy5 라벨링된 올리고누클레오타이드(0.5μM)는 프라이머 어닐링 반응과 유사한 의사 1차 반응으로 어닐링된다. 이러한 방식으로 어닐링 효율이 모니터링 되어서 어닐링 시간 및 온도 조절에 사용된다. 어닐링 효율 모니터링에 의한 어닐링 조건의 제어부는 제어장치에 보조적으로 포함된다.
전통적인 PCR은 증폭 이전에 모든 싸이클링 매개변수를 프로그램하여 수행된다. 연속 모니터링을 위해 온도 싸이클링 조건의 결정이 증폭동안 어닐링, 신장 및 변성의 연속 관찰에 기초하여 이루어진다. 최저 용융 프라이머와 등가의 상보적 올리고누클레오타이드를 사용하여 초기 싸이클 동안에도 어닐링 효율이 조절된다. 그러나, 신장 및 변성은 충분한 생성물이 형성되는 나중 싸이클동안에 dsDNA 염료를 써서 모니터링 될 수 있다. 변성 및 신장 조건은 대개의 생성물 증폭에 충분히 허용적이므로 이것은 문제가 아니며 제 1 증폭으로 부터 나오는 데이타가 후속 시행을 최적화 하는데 사용될 수 있다.
폴리메라제 연쇄반응동안 DNA 용융곡선의 분석에 의한 생성물 분리의 추가예가 기술될 것이다.
PCR은 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl2, 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민, 0.5mM 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트, 0.5μM 프라이머, 5㎕ 샘플마다 0.2U의 Taq 폴리메라제에서 수행된다. SYBR Green I이 별도 언급이 없는한 1:20,000 희석비로 포함된다.
템플레이트로서 사용된 증폭 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전, Centricon 30 농축기(Amicon, Danvers, MA)를 통해 반복된 세정에 의해 정제된다. 템플레이트 농도는 260㎚에서 흡수성에 의해 결정되며 1.7이상의 A260/A280비를 가진다.
프라이머는 표준 포스포아미다이트 화학(Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus of Piscataway, New Jersey)에 의해 합성된다. 180 염기쌍 헤파티스 B 표면 항원 유전자 증폭을 위한 프라이머는 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1) 및 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SE1 ID NO:2)이다. 292 염기쌍 프로스테이트 특이성 항원 유전자 증폭을 위한 프라이머는 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID NO:7) 및 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO:8)이다. 536 염기쌍 인간 β-글로블린 유전자 증폭을 위한 프라이머는 RS42 및 KM29이다.
도 8a 및 8b 의 24 샘플 열 싸이클러와 집적되며 광학 모듈이 장치된 (모델번호 2210, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho) 마이크로볼륨 형광측정계를 사용하여 SYBR Green I에서 나오는 형광을 습득하여 DNA 용융곡선이 획득된다. PCR 시약(5㎕ 부피)을 복합 유리/플라스틱 반응튜브의 개방된 플라스틱 저장원에 피펫으로 옮기고 저속으로 원심분리하여 샘플을 유리 모세관의 팁에 위치되고 플라스틱 플러그로 내부가 밀봉된다. 용융 곡선을 위한 형광 데이타가 0.1-10.0℃/초의 속도로 95℃까지 선형온도 전이하는 동안 0.25-2.0초에 걸쳐 신호를 적분함으로써 획득된다. 이 데이타는 제어장치를 사용하여 연속으로 표시된다.
일련의 변환이 용융곡선을 용융피크로 전환시키는데 사용된다(도 49). 정제된 PCR 생성물의 용융 온도 이상에서 용융 곡선에 대해 선형 회위분석(L1)을 수행함으로써 배경 형광이 제거된다(T1). 근사로 (R2 = 0.96, 도 49 용융곡선) 이 라인은 온도의 함수로서 배경 형광을 표현한다. 생성물 용융온도 아래에서 용융곡선의 선형 회귀분석(L2)이 사용되어 온도가 형광에 미치는 영향을 제거한다. 마지막으로 분광학적 용융곡선을 용융피크로 전환하는데 사용된 것과 유사한 방법에 의해서 온도에 대해서 형광의 도함수(-dF/dT)를 도시함으로써 데이타가 용융피크(T2)로 재매핑된다. 전체 용융 피크에 걸쳐 적분에 의해 분할된 특이성 생성물의 예견된 용융범위에 걸친 용융 피크 곡선의 적분은 비특이성 생성물의 비율에 대한 상한을 제공한다.
PCR동안 온도의 함수로서 dsDNA 특이성 염료에서 나오는 형광 그래프(도 50)는 각 반응 싸이클 동안 쇄의 상태의 모니터링을 허용한다. 초기 온도 싸이클은 그래프의 하부에 걸친 배경 형광으로 나타난다. 증폭생성물이 축적될 때 어닐링온도로 전이동안 및 폴리메라제 활성이 새로운 생성물을 합성할 때 형광이 싸이클마다 상승한다. 변성온도를 향한 가열동안 생성물 변성을 나타내는 별도의 스팬 위로 배경 레벨까지 형광이 갑자기 떨어진다. 이것은 PCR의 형광대 온도 플롯의 시계방향 나선 구조를 가져온다.
25 온도 싸이클 이후에 용융곡선 습득 싸이클이 개시된다(도 51). 생성물이 변성되고 마지막 어닐링되고 이후에 0.2℃/초의 속도로 변성온도에서 느리게 가열된다. 용융은 85℃에서 시작하고 형광은 87℃ 정도에서 배경 레벨로 떨어진다.
PCR 생성물 용융 곡선의 절대위치는 SYBR Green I의 농도의 영향을 받는다(도 52a). 염료의 농도가 증가될 때 용융곡선은 더 고온으로 이동된다. 1 내지 7,000 이상의 농도는 PCR에 의한 증폭을 방지한다.
변성온도를 통한 신속한 온도전이는 반응효과 때문에 용융곡선을 더 높은 겉보기 Tm으로 이동시킨다(도 52b). 5℃/초 이상의 온도 전이 속도는 겉보기 Tm은 3℃정도 이동시킨다. 겉보기 Tm은 전이속도를 0.1에서 0.2℃/초로 증가시킴으로써 0.2℃ 이동된다. 후속의 용융곡선 분석이 0.2℃/초의 전이속도로 행해진다. 이러한 속도에서 용융곡선 분석은 도 50 에 도시된 8분의 반응에 30초를 추가한다.
3개의 상이한 정제 PCR 생성물에 대한 용융곡선이 수득된다(도 53). 3개의 생성물은 예리한 용융 곡선을 가지며 2℃내에서 용융한다. 180 염기쌍 헤파티스 B 조각(50.0% GC)의 겉보기 Tm은 536 염기쌍 β글로블린 조각(53.2% GC)보다 2도 낮으며 이들은 쉽게 구별가능하다. 292 염기쌍 프로스테이트 특이성 항원 조각(60.3% GC)의 겉보기 Tm은 더 큰 β-글로블린 조각보다 거의 5도 높은 용융온도를 가진다.
정제된 PCR 생성물이 혼합될 때 용융곡선이 중첩된다(도 54). 용융피크로 전환 이후에 2℃ 미만 Tm에서 차이가 나는 반응 생성물의 혼합물을 별도의 피크로 분해하는 것이 가능하다(도 55).
용융곡선 분석이 프라이머 다이머와 같은 비특이성 생성물로 부터 의도된 생성물을 분리하는데 사용된다(도 56). 프라이머 다이머는 75-85℃ 범위에서 넓은 용융 피크를 가지므로 특이성 PCR 증폭 생성물의 예리한 용융 피크와 구별된다. 낮은 어닐링에서 여러번 수행하여 나타난 더 큰 이질 생성물은 순수한 PCR 생성물에 비해서 더 낮고 더 넓은 용융곡선을 가진다.
본 발명의 생성물 순도 결정 방법은 dsDNA 특이성 염료의 형광을 싸이클마다 한 번 모니터링한 것에 기초한 정량적인 PCR을 개선시키는데 사용된다. 초기 템플레이트 농도에서 상이한 일련의 반응동안 생성물의 폴리메라제 신장이후에 싸이클마다 한 번 형광이 수득된다(도 57). 배경 형광위로 로그-선형 증가는 초기 템플레이트 농도에 의존한 싸이클 횟수에서 시작한다. 반응마다 106내지 102복제물에 대한 5개의 반응 플롯이 약 4싸이클 분리된다. 반응마다 102복제물을 갖는 반응은 반응효율의 감소를 보이며 100미만 초기 복제물 갯수를 갖는 반응은 덜 유용한 형광 프로파일을 제공한다. 10 및 1개의 복제물 함유 반응동안 형광 프로파일은 역순으로 상승하고 음의 비교는 30싸이클후 증폭을 보인다. 이것은 dsDNA 특이성 염료의 싸이클마다 한 번 형광 모니터링에 의한 의도된 생성물로 부터 구별될 수 없는 프라미어 다이머 및 기타 비특이성 증폭 생성물 때문에 일어난다.
각 샘플에 대해 용융 피크가 수득되며(도 58) 전기영동 결과와 잘 상관됨이 발견된다(도 60). 0 및 1개의 초기 템플레이트 복제물 함유 반응은 예견된 536 염기쌍 위치에서 구별할 수 없는 전기영동 밴드를 생성한다. 10 내지 100개의 초기 복제물 함유 반응은 약한 전기영동 밴드를 보인다. 이것은 용융 피크 분석과 잘 일치하며, 이 경우 0 및 한 개의 초기 복제물 함유 반응동안 의도된 생성물의 범위(90-92℃)에서 DNA 용융이 발견되지 않으며 10 및 100개의 복제물에 대한 온도 범위에서 작은 피크를 보인다. 103-106초기 복제물 함유 반응동안 강한 전기영동 밴드는 90-92℃에서 큰 용융 피크와 잘 상관된다.
총생성물에 대한 의도된 생성물의 비는 용융 피크 적분에 의해 결정되는데 105복제물에 대해서는 0.28이고 0 초기 복제물에 대해서는 0.0002이다. 도 57 의 각 데이타 포인트는 적절한 비율이 곱해져서 보정된 플롯이 된다(도 59). 이러한 과정은 10 및 1개의 초기 복제물까지 정량화의 유효동적범위를 연장시킨다.
PCR 생성물 탐지와 분석은 증폭동안 온도 싸이클링과 동시에 이루어진다. 생성물 크기, 서열 또는 용융 프로파일과 같은 DNA의 기본적인 성질이 PCR동안 생성물을 선택적으로 식별할 수 있다면 더 이상의 분석은 불필요하다.
증폭동안 서열 특이성 탐지가 형광 프로브를 써서 가능하다. 단일 프로브는 2개의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 염료를 써서 라벨링될 수 있다. 폴리메라제 엑소누클레아제에 의한 프로브의 가수분해는 퀀칭으로 부터 도너염료를 방출시킨다. 증폭이 진행함에 따라 도너염료에서 나오는 형광은 누적으로 증가한다. 혹은 FRET 염료가 인접 교합하는 2개의 단일 라벨링된 프로브상에 위치될 수 있다. 가수분해와 교합 기술은 증폭과 서열 특이적 생성물 탐지를 가능하게 한다. 그러나 각 타겟에 대해서 고유한 프로브가 필요하다. 프로브 합성 및 정제는 특히 이중라벨링된 프로브의 경우에 사소하지 않다.
나선 안정성이 PCR 생성물 식별에 사용될 수 있다. 예컨대 단일쇄 구조 다형성, 변성 그레디언트 겔 전기영동 및 온도 그레디언트 겔 전기영동은 상이한 구조의 안정성에 기초하여 생성물을 분리한다. 교합 안정성은 FRET를 써서 실시간으로 모니터링 될 수 있다. 용융곡선의 모니터링은 교합 기술에 의한 서열화에 있어서 추가 판별 기준으로 사용된다.
에티듐 호모다이머와 에티듐 브로마이드가 DNA 변성 모니터링에 사용된다. PCR은 에티듐 브로마이드와 SYBR Green I을 포함한 많은 dsDNA 특이적 염료와 양립할 수 있다. 이들 염료는 싸고 구매가 용이하며 프로브 합성이 불필요하다. 에티듐 브로마이드가 PCR에 포함되면 유리 모세관 샘플튜브내 샘플에서 나오는 형광이 증가한다. 자외선 조사 및 CCD 카메라를 써서 PCR 반응은 모니터링 할수도 있다. 생성물 종류가 확인되므로 이러한 게놈 염료를 사용한 모니터링은 증폭후 별도의 분석단계 필요성을 제거한다. 절대적인 서열 특이성이 드물게 필요하지만 생성물 분리가 종종 필요하다.
PCR 생성물은 그의 모양이 GC 함량, 길이 및 서열의 함수인 용융곡선의 분석에 의해 증폭동안 분리될 수 있다. PCR 생성물이 용융하는 온도는 다양하다. 당해분야에 공지된 실험식을 사용하여 DNA의 GC 함량이 용융온도(Tm)에 미치는 효과가 알려지며 0% GC 듀플렉스는 100% GC 듀플렉스보다 41℃ 더 낮은 온도에서 용융한다. GC 함량이 주어지면 40염기쌍 프라이머 다이머는 1000염기쌍 생성물보다 12℃ 아래에서 용융한다. 그러므로 PCR 생성물의 Tm범위는 적어도 50℃에 걸쳐 있다. 이러한 넓은 범위는 대개의 PCR 생성물이 용융곡선에 의해 구별될 수 있게 한다. 길이 차이로 인하여 프라이머 다이머는 원하는 PCR 생성물보다 낮은 온도에서 용융한다. 이질 생성물은 순수한 PCR 생성물보다 넓은 범위에서 용융한다. 긴 PCR 생성물은 식별을 위한 지문으로 사용될 수 있는 내부 용융 도메인을 가지지만 작은 PCR 생성물은 하나의 주 전이온도에서 용융한다(도 53).
겔 전기영동과 다르게 용융곡선 분석은 길이가 같지만 GC/AT 비가 상이한 생성물을 구별할 수 있다. 추가로, 길이와 GC 함량이 같지만 GC 분포에서 상이한 2개의 생성물은 상이한 용융 곡선을 가진다. 헤테로듀플렉스가 형성되는 경우에 이질접합성 DNA의 증폭에서 작은 서열 차이가 관찰될 수도 있다. 이질접합성 DNA에서 단일 염기 차이는 완전 상보적인 DNA에 비해서 헤테로듀플렉스의 경우에 1-5℃의 온도 이동을 가져온다.
2℃ 미만 분리된 PCR 생성물이 본 발명을 사용하여 혼합물내에서 구별될 수 있다(도 56). 게다가, 존재하는 상이한 생성물의 상대적 양을 추정하기 위해서 용융곡선이 생성물 피크로 분해될 수 있다(도 61). 상이한 PCR 생성물의 상대적 양 결정능력은 매우 유용하다. 예컨대, 총 dsDNA에 대한 의도된 생성물의 상대적 양을 알면 반응이 dsDNA 염료에 의해 모니터링될 때 비특이적 증폭에 대해 보정할 수 있다. 에티듐 브로마이드 또는 SYBR Green I을 사용하여 초기 템플레이트 농도의 6-8배 크기에 대한 정량이 가능하다. 그러나, 낮은 초기 템플레이트 복제물 갯수에서 민감성은 비특이적 증폭에 의해 제한된다(도 57). 용융곡선(도 58)는 특히 적은 갯수의 초기 복제물에서 다중 PCR 생성물을 보이며 이것은 겔 전기영동후 관찰되는 다중 생성물과 잘 상관된다(도 60). 총 생성물에 대한 예견된 범위에서 용융하는 생성물의 비는 비특이적 증폭에 대한 보정에 사용될 수 있다(도 59). 이 비율은 총 생성물에 대한 예견된 양의 상한을 제공한다. 두 개이상의 생성물이 함께 이동함으로써 전기영동 결과를 오판할 수 있는 것처럼 예견된 범위에서 용융하는 생성물의 일부가 의도된 생성물이 아닐 수 있다. 그러나, 예견된 생성물의 범위에서 dsDNA가 용융하지 않는다면 예견된 생성물이 존재하지 않는다고 결론내릴 수 있다.
용융곡선 분석은 더 작은 갯수의 복제물까지 정량화의 동적 범위를 연장하는데 사용될 수 있다. 용융 곡선 분석은 비특이적 증폭보다 의도된 생성물로 부터 형광을 유도할 더 큰 확실성을 제공한다. PCR에서 형광 모니터링의 유용성은 생성물 식별에 겔 전기영동이 필요하다면 제한된다. 용융 피크 분석은 후속의 전기영동 없이도 PCR동안 생성물을 식별할 수 있게 한다.
2PCR 생성물의 상대적 양을 분해하는 능력은 경쟁적인 PCR 정량에 유용하다. 동일한 프라이머를 갖는 경쟁적 템플레이트가 본 발명에 따라서 생성물의 길이 또는 GC/AT 비를 변화시킴으로써 천연 앰플리콘으로 부터 용융온도가 2-3℃ 다르게 디자인된다. 경쟁물질의 일정량이 미지의 양의 천연 템플레이트에 첨가되고 템플레이트가 증폭되고 용융곡선이 수득되고 생성물 피크가 분해된다. 생성물이 동일한 효율로 증폭한다고 가정하면 생성물간의 비는 초기 템플레이트간의 비이다.
용융곡선 분석은 몇가지 한계를 가진다. 용융곡선의 폭과 절대위치는 온도전이속도(도 52b)와 염료농도(도 52a)의 영향을 받는다. 에티듐 브로마이드의 첨가는 용융온도를 증가시키고 용융전이를 넓힌다. 평형 보장을 위해서 용융곡선이 0.5℃/분의 속도로 획득되지만 12℃/분의 속도가 용융온도에서 2℃ 이하 차이가 나는 생성물을 구별하는데 사용될 수 있다(도 53). 전이 속도가 느리거나 샘플 온도 균일성이 크면 더욱 미세한 분해가 가능하다.
본 발명의 용융 피크 분석은 PCR과 완전 일체가 되는 생성물 구별방법을 제공한다. 겔 전기영동에 의한 크기분리와 유사하게 용융 피크 분석은 DNA의 기본 특성을 측정하고 증폭된 생성물 식별에 사용될 수 있다. 용융 곡선 분석과 PCR 형광 모니터링의 조합은 동시 증폭, 탐지, PCR 생성물 구별을 위한 전망이 있는 방법을 제공한다.
신속한 열 싸이클링을 사용한 온-라인 DNA 분석 시스템에 관한 정보가 미국특허 출원 08/381,703 (1995. 1. 31 출원)에 발표된다.
프로그램 코드 부록 A
서열표 리스트
(1)일반정보
(i)출원인; 위터, 칼 티
리리 커크 엠
라스센, 랜디 피
힐야드, 데이비드 알
(ii) 발명의 명칭; 셍물학적 공정을 실행하고 이를 모니터하는 시스템 및 방법
(iii) 서열의 수; 6
(iv) 통신 주소
(A) 주소: 토르프, 노스 ＆ 웨스턴 일일피
(B) 거리 : 사우스 700 이스트 9035, 슈이트 200
(C) 도시 : 샌디
(D) 주 : 유타
(E) 나라 : USA
(F) 우편코드 : 84070
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A)매체형태; 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 용량
(B)컴퓨터; 도시바 T2150CDS
(C)작동시스템; 윈도우 95
(D)소프트웨어; 워드 퍼펙트 7.0
(vi) 현재 출원 데이터
(A) 출원번호;
(B) 출원일자; 1997년 6월 4일
(C) 분류
(vii) 우선권 출원 데이터
(A) 출원번호; US08/658,993
(B) 출원일자; 1996년 6월 4일
(vii) 우선권 출원 데이터
(A) 출원번호;
(B) 출원일자;
(viii) 대리인 정보
(A) 이름; 그랜트 알. 클레톤
(B) 등록번호; 32,462
(C) 서류 번호; 8616.CIP5
(ix) 통신 정보
(A) 전화번호; (801) 566-6633
(B) 팩스번호; (801) 566-0750
(2)서열 1에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 단일 쇄
(D)위상; 선형
(xi)서열 1
(2)서열 2에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일 쇄
(D)위상;선형
(xi)서열 2
(2)서열 3에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 35bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 단일 쇄
(D)위상; 선형
(xi)서열 3
(2)서열 4에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 30bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일 쇄
(D)위상; 선형
(xi)서열 4
(2)서열 5에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 22bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 단일 쇄
(D)위상; 선형
(xi)서열 5
(2)서열 6에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 단일 쇄
(D)위상; 선형
(xi)서열 6

Claims (28)

  1. 타겟 서열의 인접지역까지 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 존재하에서 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 서열을 증폭하고, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 타겟 서열과 두 프로브의 교합시 도너와 받게 형광단이 서로의 0 내지 25 누클레오타이드내에 있도록 하는 형광에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되며, 상기 폴리메라제 연쇄반응은 타겟 핵산서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 생물학적 샘플에 첨가하고 적어도 변성온도와 신장온도사이에서 생물학적 샘플을 열싸이클링을 받게하는 단계를 포함하며;
    도너 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 생물학적 샘플을 빛으로 활성화시키고 생물학적 샘플에서 나오는 방출을 탐지하는 단계를 포함하는 DNA 서열 다형성, 이질접합성 또는 돌연변이 여부를 확인하기 위해 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열을 분석하는 방법.
  2. 타겟 서열의 인접지역까지 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 존재하에서 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 서열을 증폭하고, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 타겟 서열과 두 프로브의 교합시 도너와 받게 형광단이 서로의 0 내지 25 누클레오타이드내에 있도록 하는 형광에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되며, 상기 폴리메라제 연쇄반응은 타겟 핵산서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 생물학적 샘플에 첨가하고 적어도 변성온도와 신장온도사이에서 생물학적 샘플을 열싸이클링을 받게하는 단계를 포함하며;
    도너 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 생물학적 샘플을 빛으로 활성화시키고;
    생물학적 샘플에서 나오는 온도종속성 형광을 모니터링하는 단계를 포함하는 DNA 서열 다형성, 이질 접합성 또는 돌연변이 여부 확인을 위해 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열을 분석하는 방법.
  3. (a) 생물학적 샘플에 유효량의 두 개의 핵산 프라이머와 핵산 프로브를 첨가하고, 상기 프라이머 및 프로브중 하나는 받게 형광단과 도너 형광단을 포함하는 형광 에너지 전달쌍중 하나로 라벨링되며 라벨링된 프로브는 라벨링된 프라이머의 0 내지 25 누클레오타이드내에서 타겟 핵산 서열의 증폭된 복제물로 교합하며;
    (b) 타겟 핵산 서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 첨가하고 적어도 변성온도와 신장온도 사이에서 생물학적 샘플을 열싸이클링을 받게하는 단계를 포함하는 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 핵산 서열을 증폭하고;
    (c) 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 사용하여 생물학적 샘플을 조사하고 샘플의 형광 방출을 탐지하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 타겟 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간으로 모니터링하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 샘플의 온도 종속성 형광을 모니터링하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  5. (a) 생물학적 샘플에 타겟 서열의 인접지역에 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 유효량을 첨가하고, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되며 다른 하나는 타겟 서열과 두 프로브의 교합시 도너와 받게 형광단이 서로의 0 내지 25 누클레오타이드내에 있도록 하는 형광 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되고;
    (b) 예정된 온도 및 시간 매개변수를 사용하여 생물학적 샘플이 열싸이클링을 받게하는 폴리메라제 연쇄반응을 사용하여 타겟 핵산 서열을 증폭하며;
    (c) 폴리메라제 연쇄반응동안 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛으로 생물학적 샘플을 조사하고;
    (d) 상기 샘플에서 나오는 형광 방출을 모니터링하고;
    (e) 단계(d)로 부터 발생된 데이터에 따라서 온도 및 시간 매개변수를 조절하여 생성물 수율 또는 특이성을 최적화하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 타겟 핵산 서열을 증폭하는 방법.
  6. 제 1 항, 2 항, 3 항, 4 항 또는 5 항에 있어서, 공명 에너지 전달쌍이 도너로서 형광제와 받게로서 Cy5를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. 챔버;
    높은 부피대 표면적비를 가지며 광학적으로 투명한 재료로된 모세관 튜브;
    모세관 튜브 홀더;
    상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 모세관 튜브를 조사하도록 위치되는 광원;
    상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 모세관 튜브에서 나오는 형광을 측정하도록 위치되는 광탐지기를 포함하는 샘플의 형광을 모니터링하는 장치.
  8. 제 7 항에 있어서, 모세관 튜브 홀더가 복수의 모세관 튜브를 유지하는 카루셀을 포함하고 상기 카루셀이 상기 챔버에 회전가능하게 장착되며 상기 장치가 상기 카루셀을 회전시키는 스테핑 모터와 상기 카루셀을 상기 모터에 연결시키는 수단을 더욱 포함함을 특징으로 하는 장치.
  9. 제 7 항 또는 8 항에 있어서, 챔버의 온도를 빠르게 순환시키도록 챔버와 공기 흐름이 교환되게 장착되는 팬과 히터가 챔버에 더욱 설비됨을 특징으로 하는 장치.
  10. 챔버;
    챔버와 공기 흐름이 교환되도록 상기 챔버에 장착되는 히터와 팬;
    상기 챔버에 회전가능하게 장착되어 복수의 모세관 튜브를 유지하는 카루셀;
    광학적으로 투명한 재료로된 모세관 튜브;
    상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해서 모세관 튜브중 적어도 하나를 조사하도록 위치되는 광원;
    상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해서 모세관 튜브중 적어도 하나로부터 나오는 형광을 측정하도록 위치되는 광 탐지기를 포함하는 PCR 수행장치.
  11. 광학적으로 투명한 재료로된 모세관 튜브에 샘플을 넣고;
    모세관 튜브의 단부를 통해 형광을 탐지하는 단계를 포함하는 형광단 포함 샘플에서 형광의 습득 효율 및 탐지를 개선하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 형광이 샘플의 형광단-활성화 조사에 의해 유도되고 모세관 튜브의 단부를 통해 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 형광이 샘플의 형광단-활성화 조사에 의해 유도되고 탐지된 형광의 광학 경로를 따라 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항, 12 항, 또는 13 항에 있어서, 모세관 튜브의 부피에 대한 표면적의 비가 4mm-1이상임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11 항 또는 12 항에 있어서, 생물학적 샘플의 형광이 온도종속적이며 형광탐지동안 생물학적 샘플을 가열 또는 냉각하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11 항, 12 항 또는 15 항에 있어서, 샘플이 형광 에너지 전달쌍을 포함하고 형광에너지 전달쌍중 적어도 하나의 형광단의 형광이 탐지됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11 항 또는 12 항에 있어서, 샘플이 핵산프로브를 포함하는 핵산을 포함하고 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 프로브는 형광에너지 전달쌍중 도너 형광단으로 라벨링되고 탐지된 형광이 도너 형광단 또는 받게 형광단 또는 둘 다의 형광임을 특징으로 하는 방법.
  18. 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 모세관 튜브를 충진하는 퍼넬 캡과 샘플 전달 포트를 가지는 모세관 튜브를 포함하는 샘플 취급 시스템에 있어서,
    모세관 튜브의 부피에 대한 표면적의 비가 4mm-1이상이며 상기 퍼넬 캡이 제 1 샘플 수용 구멍, 샘플 전달 구멍 및 모세관 튜브의 샘플 전달 포트와 착탈식으로 맞물리는 수단을 가져서 퍼넬 캡의 샘플 전달 포트와 모세관 튜브의 샘플 전달 포트가 일직선이 됨을 특징으로 하는 시스템.
  19. 제 18 항에 있어서, 퍼넬 캡의 샘플 수용 포트와 마찰식 밀봉 정렬을 하는 플러그를 더욱 포함하는 샘플 취급 시스템.
  20. 챔버;
    챔버와 공기 흐름 교환 방식으로 장착되는 히터 및 팬과 예정된 초기 온도 및 시간 매개변수에 따라 챔버내 온도를 순환시키는 제어기;
    복수의 모세관 튜브를 유지하며 상기 챔버에서 회전가능하게 장착되는 카루셀, 상기 모세관 튜브는 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 높은 부피대 표면적비를 가져서 신속한 열전달을 제공하며;
    상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 모세관 튜브중 적어도 하나를 조사하도록 위치되는 광원;
    상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 적어도 하나의 모세관 튜브에서 나오는 형광을 탐지하도록 위치되는 광탐지기;
    탐지된 형광에 기초하여 반응의 상태를 표시하는 수단을 포함하는 PCR을 수행해서 실시간 반응을 모니터링하는 시스템.
  21. 제 20 항에 있어서, 하나이상의 반응 매개변수가 실시간으로 조절되도록 제어기를 조정하는 수단을 더욱 포함하는 시스템.
  22. 제 20 항 또는 21 항에 있어서, 모세관 튜브가 0.02 내지 1.0㎚의 내경을 가짐을 특징으로 하는 시스템.
  23. 제 20 항 또는 21 항에 있어서, 조사 및 형광 탐지를 위해 상기 카루셀에 의해 유지된 모세관 튜브를 순차적으로 위치 선정하기 위해서 카루셀을 회전시키는 스테핑 모터를 더욱 포함하는 시스템.
  24. 타겟 서열의 인접지역까지 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 존재하에서 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 서열을 증폭하고, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 타겟 서열과 두 프로브의 교합시 도너와 받게 형광단이 서로의 0 내지 25 누클레오타이드내에 있도록 하는 형광에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되며, 상기 폴리메라제 연쇄반응은 타겟 핵산서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 생물학적 샘플에 첨가하고 적어도 변성온도와 신장온도사이에서 생물학적 샘플을 열싸이클링을 받게하는 단계를 포함하며;
    도너 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 생물학적 샘플을 빛으로 활성화시키고;
    생물학적 샘플에서 나오는 온도종속성 형광을 모니터링하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 타겟 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭의 실시간 모니터링 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 공명에너지 전달쌍이 도너로서 형광제와 받게로서 Cy5를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  26. (a) 생물학적 샘플에 유효량의 두 개의 핵산 프라이머와 핵산 프로브를 첨가하고, 상기 프라이머 및 프로브중 하나는 받게 형광단과 도너 형광단을 포함하는 형광 에너지 전달쌍중 하나로 라벨링되며 라벨링된 프로브는 라벨링된 프라이머의 0 내지 25 누클레오타이드내에서 타겟 핵산 서열의 증폭된 복제물로 교합하며;
    (b) 타겟 핵산 서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 첨가하고 적어도 변성온도와 신장온도 사이에서 생물학적 샘플을 열싸이클링을 받게하는 단계를 포함하는 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 핵산 서열을 증폭하고;
    (c) 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 사용하여 생물학적 샘플을 조사하고 샘플의 형광 방출을 탐지하는 단계를 포함하는 DNA 서열 다형성, 이질 접합성 또는 돌연변이 여부확인을 위해 생물학적 샘플의 DNA 서열을 분석하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 샘플의 온도 종속성 형광을 모니터링하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 공명에너지 전달쌍이 도너로서 형광제와 받게로서 Cy5를 포함함을 특징으로 하는 방법.
KR10-1998-0709729A 1996-06-04 1997-06-04 형광에의한dna증폭모니터링방법 KR100479767B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1998-0709729A KR100479767B1 (ko) 1996-06-04 1997-06-04 형광에의한dna증폭모니터링방법

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/658,993 1996-06-04
US8/658,993 1996-06-04
KR10-1998-0709729A KR100479767B1 (ko) 1996-06-04 1997-06-04 형광에의한dna증폭모니터링방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000016161A true KR20000016161A (ko) 2000-03-25
KR100479767B1 KR100479767B1 (ko) 2005-07-05

Family

ID=43667681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1998-0709729A KR100479767B1 (ko) 1996-06-04 1997-06-04 형광에의한dna증폭모니터링방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100479767B1 (ko)

Also Published As

Publication number Publication date
KR100479767B1 (ko) 2005-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0912760B1 (en) System and methods for monitoring for dna amplification by fluorescence
US7670832B2 (en) System for fluorescence monitoring
US7745205B2 (en) Container for carrying out and monitoring biological processes
US7081226B1 (en) System and method for fluorescence monitoring
JPH07163397A (ja) 複増幅反応の同時観測および分析方法
KR100479767B1 (ko) 형광에의한dna증폭모니터링방법
KR100479782B1 (ko) 생물학적공정모니터링방법및시스템
JPH08298998A (ja) 遺伝子変異の検出方法及び装置

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130311

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140311

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150309

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160309

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170315

Year of fee payment: 13

EXPY Expiration of term