KR20000009360A - 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터 - Google Patents

미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터 Download PDF

Info

Publication number
KR20000009360A
KR20000009360A KR1019980029701A KR19980029701A KR20000009360A KR 20000009360 A KR20000009360 A KR 20000009360A KR 1019980029701 A KR1019980029701 A KR 1019980029701A KR 19980029701 A KR19980029701 A KR 19980029701A KR 20000009360 A KR20000009360 A KR 20000009360A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
loach
growth hormone
gene
expression vector
growth
Prior art date
Application number
KR1019980029701A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100290007B1 (ko
Inventor
김철근
노재구
조규남
남윤권
김동수
Original Assignee
김철근
김동수
남윤권
노재구
조규남
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 김철근, 김동수, 남윤권, 노재구, 조규남 filed Critical 김철근
Priority to KR1019980029701A priority Critical patent/KR100290007B1/ko
Priority to US09/306,446 priority patent/US6372959B1/en
Priority to JP15434699A priority patent/JP3184182B2/ja
Publication of KR20000009360A publication Critical patent/KR20000009360A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100290007B1 publication Critical patent/KR100290007B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 어류의 성장을 촉진시킬 수 있는 발현 벡터 및 이 발현 벡터로 형질전환된 미꾸라지에 관한 것으로, 본 발명에서는 우리 나라의 대표적인 담수 어종으로 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되고 있는 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자를 순수 분리하여 염기 서열을 포함한 구조적 특성을 분석하고, 이를 동종의 베타-액틴 유전자 발현 조절 부위 단편에 재조합하여 어류 특이적 성장 호르몬 과발현 벡터를 제조하였으며, 이와 같이 제조된 발현 벡터로 형질전환된 본 발명의 수퍼 미꾸라지는 보통의 미꾸라지에 비해 25 배나 높은 성장율을 보인다.

Description

미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터
본 발명은 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터 및 이 발현 벡터로 형질전환된 수퍼 미꾸라지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한국산 미꾸라지에서 성장 촉진에 관여하는 성장 호르몬을 코오딩하는 유전자를 순수 분리하여 이의 염기 서열 및 구조적 특징을 분석하고, 어류에서 목적하는 유전자를 생체내로 전달하고 강력한 발현을 유도할 수 있는 어류 특이적 유전자 발현 벡터의 조절 부위로 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 조절 부위에 미꾸라지 성장 호르몬 유전자 단편을 재조합함으로써 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터를 제조하고, 이와 같이 제조된 발현 벡터로 미꾸라지를 형질전환시켜 고성장 미꾸라지를 생산하는 방법 및 이와 같이 생산된 수퍼 미꾸라지에 관한 것이다.
분류학적으로 잉어목, 미꾸리과에 속하는 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)는 중국, 대만, 일본, 러시아 등 동북 아시아 지방에 서식하고 있으며, 식품 영양학적 우수성과 강장 식품으로서의 가치를 인정받아 예로부터 식용 및 약용으로 널리 애용되고 있는 우리 나라의 대표적인 담수 어종이다(동의보감, 방약합편). 논과 하천 등 우리 나라 어디서나 흔히 볼 수 있었던 미꾸라지는 불과 몇 년 전까지만 해도 일본 등에 수출하여 외화 획득의 일익을 담당하기도 하였으나, 날로 심각해지는 하천과 농수로의 오염, 농약의 남용 등으로 자연 채취량은 매년 감소하고 있으며, 이에 따라 역으로 상당량이 중국 등에서 수입되고 있는 실정이다. 따라서, 미꾸라지를 비롯한 우리 나라 고유의 어종 및 어류 유전자 자원을 보존하고 이를 효율적으로 이용하기 위해서는, 새로운 양식 기술의 개발과 더불어 경제성과 유용성이 높은 보다 우수한 어류의 품종 개량이 필요하게 되었으며, 이를 위하여 어류의 유용한 유전자 자원을 확보하고 이들 유전자를 조작하여 어류에 이식하는 형질전환 어류 생산과 같은 연구들이 다양하게 이루어져야 할 것으로 여겨진다.
유전자 이식을 통한 형질전환 어류의 생산에 관한 연구는 1970년대 후반부터 시작되었는데, 여기에는 주로 성장 호르몬 유전자가 많이 이용되었다. 성장 호르몬은 프로락틴(prolactin; PRL), 융모막 소마토맘모트로핀(chorionic somatomammotropin; CS, placental lactogen), 소마토락틴(somatolactin; SL)과 구조 및 생물학적 특성을 공유하는 단백질성 호르몬이다. 모든 척추동물에서 성장 호르몬과 PRL은 뇌하수체의 소마토트로프(somatotroph)와 락토트로프(lactotroph)에서 각각 생산되는데, CS는 포유 동물의 태반에 있는 신사이토트로포블라스트(syncytotrophoblast)에서, SL은 어류 뇌하수체의 파스 인터메디아(pars intermedia) 세포에서만 합성되는 조직 특이성을 갖는다. 성장 호르몬 합성, 방출은 시상하부 호르몬인 GH 분비 호르몬(GH releasing hormone; GRH)과 GH 분비 억제 호르몬(GH release-inhibiting hormone; GIH, somatostatin)에 의해 조절되는데, 혈액내 글루코스 농도가 낮아지면 GRH 자극으로 성장 호르몬이 합성 및 분비된다(Ecker, R., 1988, Chemical messengers and regulators. In: Animal physiology. 3rd ed. Freeman and company. pp. 266-328).
성장 호르몬은 배아의 발생 과정 동안에도 발현되지만(Pantaleon, M., E. J. Whiteside, M. B. Harvey, R. T. Barnard, M. J. Waters, and P. L. Kaye, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94: 5125-5130), 출생 후에도 생장에 필요한 모든 정상적인 대사 과정에 관여하며 조직의 성장 특히 연골의 증식에 의한 뼈의 성장을 촉진시킨다. 조직의 성장은 세포 수의 증가에 기인하는데, 성장 호르몬은 직접 세포의 성장에 작용하지 않고 IGF-1과 같은 성장 촉진 요소(growth promoting factors; somatomedins)의 생산을 자극함으로써 성장이 이루어진다. 성장 호르몬의 생체내 생리 생화학적 기능을 살펴보면, 근육 세포내로의 아미노산 수송과 단백질 합성을 증가시키며, 인슐린과 길항적으로 작용하여 글루코스의 이용을 감소시키면서 간에서의 글루코스 합성을 증가시키는 탄수화물 대사 과정과, 지방 조직에서 지방산과 글리세롤의 방출을 촉진하는 지질 대사, 그리고 이온 균형을 촉진시키고 연골 형성 및 뼈의 성장을 촉진시키는 무기 염류 대사 과정 등에 관여한다(Bentley, P. J., 1982. Comparative vertebrate endocrinology. 2nd ed. Cambridge Univ. press, Cambridge pp. 179-209; Murray, R. K., D. K. Granner, P. A. Mayers, and V. W. Rodwell, 1993. Pituitary and hypothalamic hormones. In: Harper's Biochemistry. 23rd ed. Prentice-Hall Intl. Inc. pp. 499-508).
포유류의 성장 호르몬 유전자는 약 2.5 kb 염기 서열이 5개의 액손과 4개의 인트론으로 구성되어 있다. 무지개 송어, 연어, 틸라피아와 같은 일부 어류에서는 5번째 인트론에 의해 액손 5번이 나누어져 6개의 액손으로 구성되고 그 크기도 4.5 kb - 5 kb에 이르는데, 잉어의 경우에는 포유류 성장 호르몬 유전자와 같은 구조이며 크기는 3.5 kb이다. 성장 호르몬과 PRL의 조직 특이적인 발현은 전사 조절 단백질인 pit-1과, 5' 상위의 전사 조절 요소인 pit-1 결합 부위 AA/TA/TTANCAT에 의해 조절되며(Bodner, M., J. L. Castrillo, L. E. Theill, T. Deerinck, M. Ellisman, and M. Karin, 1988. Cell 55: 505-518), 이외에도 갑상선 호르몬인 T3나 T4, 글루코코르티코이드 등도 포유류 성장 호르몬 합성에 관여하는 것으로 알려져 있으나(Evans, R. M., N. C. Birnberg, and M. G. Rosenfield, 1982. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79: 7659-7663), 어류의 경우에는 불확실하다.
초기 형질전환 어류의 제조에는 포유류에서 얻은 유전자와 이들의 조절 부위가 이용되었다. 즉, 이식에 사용된 유전자들은 주로 포유류 기원의 성장 호르몬 유전자로서, 인간의 성장 호르몬(human growth hormone; 이하 hGH) 유전자를 금붕어에 이식(Zhu, Z., G. Liu, L. He, and S. Chen, 1985. Z. Angew. Ichthyol., 1: 31-34)한 이래, 틸라피아(Brem, G., B. Brenig, G. Horstgen- Schwark, and E. L. Winnacker, 1988. Aquaculture, 68: 209-219), 무지개 송어(Chourrout, D., R. Guyomard, C. Leroux, F. Pourrain, and L. M. Houdebine, 1988. J. Cell Biochem. Suppl., 12B: 188), 메기(Dunham, R. A., J. Eash, J. Askins, and T. M. Towners, 1987. Trans. Am. Fish. Soc., 116: 87-91)를 비롯한 많은 어종에서 hGH 유전자를 이용한 유전자 이식이 보고된 바 있다. 그 밖에 쥐(Penman, D. J., A. J. Beeching, S. Penn, and N. Maclean, 1990. Aquaculture, 85: 35-50)와 소(Gross, M. L., J. F. Schneider, N. Moav, C. Alvarez, S. Myster, Z. Liu, C. L. Hew, E. M. Hallerman, P. B. Hackett, K. S. Guise, A. J. Faras, and A. R. Kapuscinski, 1991. Aquaculture, 85: 115-128)의 성장 호르몬 유전자 등도 어류 유전자 이식에 사용된 바 있다.
그러나, 이들 형질전환 어류의 시험에서는 인위적으로 넣어준 유전자가 발현하여 생리적인 변화를 일으키기도 하지만, 유전자의 발현이 전혀 일어나지 않거나 유전자의 발현은 일어나더라도 생리적인 영향을 주지 못하는 경우 등이 나타났다. 유전자의 발현이 일어나지 않는 경우는 포유류의 유전자 조절 부위가 어류에서 인지되지 못하기 때문인 것으로 해석되고 있다. 또한, 특정 이질 유전자가 어류에서 발현되더라도 생리적 영향을 주지 못하는 이유는, 세포내에서 기질 특이적 단백질-단백질 상호 작용이 원만히 일어나지 못하기 때문이다. 예를 들어 성장 호르몬은 세포막 표면에 있는 성장 호르몬 수용체에 결합하여야만 신호를 전달하여 효과를 나타낼 수 있으므로, 포유류의 성장 호르몬 유전자가 어류에서 발현되어 생리적인 효과를 나타내려면 포유류 성장 호르몬-어류 성장 호르몬 수용체간의 상호 작용이 가능해야 한다. 즉, 어류에 이식하고자 하는 유전자의 발현 산물은 어류의 것과 구조적 유사성이 있어야 효과를 나타낼 수 있는 것이다.
실제로 여러 연구자들에 의해 포유류의 성장 호르몬 유전자가 어류 세포내로 성공적으로 이식되어 염색체 상에 삽입된 것은 확인되었으나, 대부분의 경우 성장률 향상을 유도하지 못하는 것으로 보아 어류 세포내에서 포유류 유전자의 발현은 한계가 있음을 보여주고 있다. 이는, 어류로부터 적절한 유전자 발현을 기대하기 위해서는 형질전환 어류에 이용하려는 유전자와 이들의 조절 부위는 동종 어류의 것이 최적이며, 가능한 한 유연 관계가 가까운 근연종의 것이라야 성공률이 높음을 시사해 주는 것이다. 따라서, 유전자 조작을 통한 어류의 품종 개량을 위해서는, 유전자 발현을 극대화할 수 있는 어류 특이적 프로모터 및 구조 유전자들의 클로닝과 이를 이용한 발현 벡터의 개발이 매우 중요시되고 있다.
이러한 요구에 따라, 1986년 무지개 송어의 성장 호르몬 유전자 cDNA가 클로닝되고 염기 서열이 밝혀진 이래(Agellon, L. B., and T. T. Chen, 1986. DNA, 5: 463-471), 잉어를 비롯한 십여종의 어류에 대하여 그들의 성장 호르몬 유전자의 cDNA 및 게놈 클론들이 분리되었으며, Zhang 등(Zhang, P., M. Hyat, C. Joyce, L. I. Gonzalez-Villasenor, C. M. Lin, R. A. Dunham, T. T. Chen, and D. A. Powers, 1990, Mol. Rep. Dev., 25: 3-13)은 무지개 송어 성장 호르몬 유전자 cDNA를 잉어에 이식하여 형질전환된 F1 개체들에서 성장 호르몬의 발현 가능성을 보고하였다.
그러나, 실제 배양중인 어류 세포나 발생 중인 배아에 외래 유전자를 전달하는 데 있어서는 벡터의 효율이 한계점으로 작용한다. 초기에는 대부분 포유류에서 기원한 벡터를 이용하였는데, 고등 척추동물과 바이러스의 여러 프로모터들이 어류 세포에서도 높은 효율로 외부 유전자 전사를 유도한다는 사실이 보고되었다(Foster, R., P. E. Olson, and L. Gedamu, 1989. Mol. Cell. Biol., 9: 4105-4108; Gedamu, L., P. E. Olson, and M. Zaffarullah, 1990. Regulation of rainbow trout metallothionein genes. In: Transgenic models in Medicine and Agriculture. Church, R. (ed.) Willy-Liss, pp. 101-108; Inoue, K., S. Yamashita, J. Hata, S. Kabeno, S. Asada, E. Nagahisa and T. Fujita, 1990. Cell Differ. Dev., 29: 123-128; Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. S. Guise, A. R. Kapuscinski, and P. B. Hackett, 1990. Bio/Technol., 8: 1268-1272; Friedenreich, H., and M. Schartl, 1990. Nucl. Acids Res., 18: 3299-3305; Bearzotti, M., E. Perrot, C. Michard-Vanhee, G. Jolivet, J. Attal, M. C. Theron, C. Puissant, M. Drano, J. J. Kopchick, R. Powell, F. Gannon, L. M. Houdebine, and D. Chourrot, 1992. J. Biotechnol., 26: 315-325). Zhu 등(Zhu, J., K. Xu, G. Li, Y. Xie, and L. He, 1986. Tongbao, 31: 988-990)은 생쥐의 메탈로치오닌(metallothioneine; MT) 프로모터에 사람의 성장 호르몬을 결합시켜 미꾸라지, 금붕어, 비단 잉어 등에 이식함으로써 대조군에 비해 3배 이상 큰 형질전환 어류를 만드는 데 성공했다. 그러나 척추동물과 바이러스의 프로모터를 어류에서 이용할 경우에는, 이들이 어류 세포내에서 발현하는데 필요한 전사 조절 인자(transcription factor)에 제한이 따를 수 있고, 상업적으로는 이렇게 만들어진 어류에 대해 소비자들이 거부감을 가질 수 있다는 문제점이 있다(Du, S. J., Z. Gong, C. L. Hew, C. H. Tan, and G. L. Fletcher, 1992. Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1(4/5): 290-300).
이러한 점을 고려할 때, 외래 유전자가 보다 안정적으로 잘 발현하는 형질전환 어류를 제조하기 위해 사용되는 프로모터와 유전자는 어류 자체에서 유래한 것이 가장 이상적이라 할 수 있다. 이에 따라 어류에서의 발현 벡터 제조시 조절 부위 영역으로 연어의 프로타민(protamine) 유전자(Jankowski, J. M., and G. H. Dixon, 1987. Biosci. Rep., 7: 955-963), 무지개 송어의 메탈로치오닌 B(metallothinein B; MT) 유전자(Zafarullah, M., K. Bonham and L. Gedamu, 1988. Mol. Cell. Biol., 8: 4469-4476), 잉어의 베타-액틴 유전자(Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. Guise, A. R. Kapuscinski and P. B. Hackett, 1990. Mol. Cell. Biol., 10: 3432-3440), 그리고 넙치의 항 동결 단백질(antifreeze protein; AFP) 유전자(Gong, Z., C. L. Hew, and J. R. Biekind, 1991. Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1: 64-72) 등의 프로모터들이 클로닝되어 이용되고 있다.
그러나 MT 유전자의 프로모터는 독성 물질, 중금속, 글루코코르티코이드 등의 처리에 의해 다양한 조직에서 강력한 발현을 나타내지만, 발현 유도를 위해 처리되는 유도체가 체내에서 대사과정을 거치는 동안 독성을 나타내거나 종양을 유발하는 경우가 있으며, 중금속 유도체의 경우에는 어류의 체내에 측적되어 최종 소비자에게 전달될 수 있다는 위험이 있다(Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. S. Guise, A. R. Kapuscinski, and P. B. Hackett, 1990. Bio/Technol., 8: 1268-1272). 이에 비해 베타-액틴 유전자의 조절 부위는 (1) 프로모터가 강력하여 모든 조직에서 발현을 유도하며, (2) 프로모터 구조의 복잡성을 이용해 다양한 단계에서 발현을 조절할 수 있으며, (3) 밝혀진 베타-액틴 유전자의 조절 부위 염기 서열이 종간에 높은 상동성을 보이므로 모든 어류 종에서 충분히 기능을 발휘할 수 있다는 이점을 갖고 있어(Liu, Z., B. Moav, A. J. Faras, K. Guise, A. R. Kapuscinski, and P. B. Hackett, 1990. Mol. Cell. Biol., 10: 3432-3440) 많이 이용되고 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 어류에서 유용 유전자를 생체내로 전달하고 강력한 발현을 유도할 수 있는 발현 벡터로서, 한국산 미꾸라지의 베타-액틴 유전자 조절 부위 영역을 포함하는 어류 특이적 발현 벡터를 제조하였으며, 이와 같이 제조된 재조합 벡터가 여러 가지 배양 세포에서 발현율이 높음을 발견하여 1998년 6월 1일자로 특허출원한 바 있다(김철근 외 4명, 1998년 대한민국 특허 출원 제 20225 호; 미꾸라지 베타-액틴 유전자의 조절 부위 영역을 포함하는 유전자 발현 벡터).
본 발명에서는 한국산 미꾸라지의 모든 유전자를 포함하고 있는 게놈 라이브러리(genomic library)로부터 성장 호르몬 유전자를 클로닝하여 그 염기 서열 및 구조적 특성을 밝히고, 클로닝된 동 종의 베타-액틴 유전자의 조절 부위 영역(1998년 대한민국 특허 출원 제 20225 호)과 성장 호르몬을 코오딩하는 유전자 부위를 재조합함으로써, 미꾸라지뿐만 아니라 다양한 어류에서 그 성장을 촉진시킬 수 있는 기능적인 성장 호르몬 발현 벡터를 제조하였으며, 이와 같이 제조된 발현 벡터로 형질전환된 미꾸라지는 보통의 미꾸라지 보다 25 배나 높은 성장율을 나타내는 것으로 밝혀져, 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 우리 나라의 대표적인 담수 어종으로 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되고 있는 미꾸라지를 비롯한 유용한 어류에 대하여, 유전자 조작에 의한 품종 개량을 통해 성장을 촉진시킬 수 있는 성장 호르몬 발현 벡터를 제조하고, 이와 같이 제조된 발현 벡터로 미꾸라지를 형질 전환시켜 고성장 미꾸라지를 생산하는 방법 및 이와 같이 생산된 수퍼 미꾸라지를 제공하는 것이다.
도 1은 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 클로닝을 위한 탐침의 제조에 필요한 프라이머 염기 서열의 결정 과정을 나타낸 모식도,
도 2는 미꾸라지 성장 호르몬 유전자를 포함하는 박테리오파아지 DNA의 제한 효소 지도,
도 3은 미꾸라지 성장 호르몬 유전자 cDNA의 클로닝 과정을 나타낸 모식도,
도 4는 미꾸라지 성장 호르몬을 코오딩하는 유전자와 동종의 베타-액틴 유전자 조절 부위를 재조합한 pmlβaGH 플라스미드 발현 벡터의 제조 과정을 나타낸 모식도.
도 5는 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 제 1 세대 수퍼 미꾸라지와 일반 미꾸라지의 성장을 비교한 그래프,
도 6은 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 제 1 세대 수퍼 미꾸라지와 일반 미꾸라지의 외형적 크기를 비교한 사진.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열 1에 기재된 염기 서열로 표시되는 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자를 포함하는 DNA를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자 및 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 미꾸라지 수정난에 상기 발현 벡터를 미세주입하여 부화시키는 단계를 포함하는 고성장 형질 미꾸라지의 제조 방법 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 고성장 형질 전환 미꾸라지를 제공한다.
본 발명에서는 한국산 미꾸라지의 모든 유전자를 포함하고 있는 게놈 라이브러리로부터 성장 호르몬 유전자를 클로닝하여 그 염기 서열 및 구조적 특성을 밝히고; 어류에서 목적하는 유전자를 생체내로 전달하고 강력한 발현을 유도할 수 있는 어류 특이적 유전자 발현 벡터의 조절 부위로 미꾸라지 베타-액틴을 코오딩하는 유전자의 조절 부위에, 상기 미꾸라지 성장 호르몬을 코오딩하는 유전자 부위를 재조합함으로써, 미꾸라지뿐만 아니라 다양한 어류에서 그 성장을 촉진시킬 수 있는 기능적인 성장 호르몬 발현 벡터를 제조하였으며; 이와 같이 제조된 발현 벡터로 미꾸라지를 형질전환시킴으로써 보통의 미꾸라지 보다 높은 성장율을 나타내는 수퍼 미꾸라지를 생산하였다.
이하, 본 발명을 단계별로 설명한다.
1. 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 검색 및 염기 서열 분석
어류 및 사람의 성장 호르몬 유전자의 액손 3, 4, 5에서 종간에 잘 보존된 염기 서열로부터 탐침의 제조에 필요한 프라이머를 제조하고, 이들 프라이머를 이용하여 미꾸라지의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한다. 적절한 크기의 단편을 선택하여 PCR II 벡터에 클로닝하여 탐침 제작에 충분한 DNA를 확보하고, 이를 [α32P] dCTP로 표지한 후 순수 분리한다.
미꾸라지 게놈 DNA의 증폭 라이브러리로 형질전환된 대장균 숙주 세포 KW251을 배양한 후, 파아지를 나일론 필터로 옮기고 견고하게 부착시킨다. 필터 상에 붙은 DNA와 앞서 제작한 미꾸라지 성장 호르몬 탐침을 하이브리드화시키고, X-선 필름에 노출시킨 후 현상하여 필름상에 나타난 양성 신호와 일치하는 플라크들을 회수하고, 이들 플라크들을 배양 및 재검색하여 양성 파아지 클론을 순수 분리한다.
대장균 숙주 세포 KW251에 파아지를 감염시킨 후 배양하여 파아지 용해질(lysate)을 얻고, 파아지를 침전시킨 후 단백질 껍질을 제거하여 단일 양성 파아지 DNA를 회수한다. 파아지 벡터내에 존재하는 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 제한 효소 지도를 만들기 위해 EcoR I, Sac I, Xba I, Xho I 등의 제한 효소를 단일 또는 적절히 조합하여 DNA를 각기 절단한 후, 전기영동하여 나타난 절편의 크기를 비교하여 각 제한 효소들의 위치를 지도화한다. 파아지 DNA에서 미꾸라지 성장 호르몬 유전자를 포함하는 단편을 확인하기 위해, 성장 호르몬 유전자의 검색에 사용한 것과 동일한 탐침을 이용하여 서던 블롯(Southern blot)을 수행한 결과, Sac I과 EcoR I의 5.1 kb 성장 호르몬 유전자를 포함하는 양성 신호를 나타내는 단편을 확인하였다.
파아지 DNA와 플라스미드 벡터인 pBluescript II KS(-)를 제한 효소 Sac I과 EcoR I으로 반응시킨 후 전기영동하고, 절단된 5.1 kb의 성장 호르몬 유전자 단편과 벡터를 회수하여 T4 DNA 리가제로 리게이션함으로써, 미꾸라지 성장 호르몬 유전자를 pBS 벡터로 서브클로닝한다. 리게이트를 대장균 숙주 세포 XL-1 blue MRF' 균주에 처리하여 형질전환시킨 후, 이 균주를 배양하여 플라스미드 DNA를 추출, 정확한 삽입체가 들어 있는지 여부를 확인하여 pmlGH51로 명명하였다.
pBS 벡터에 서브클로닝된 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자 부위 약 5.1 kb의 제한 효소 지도를 만들기 위해 Sac I, EcoR I, Hind III, Pst I, BamH I, Kpn I, Apa I 등의 제한 효소들을 적절히 조합하여 플라스미드 DNA를 절단하고, 전기영동하여 나타난 절편의 크기로 각 제한 효소들의 위치를 확인하여 정확한 제한 효소 지도를 작성한 후, 엑소뉴클레아제 III를 이용한 방법(Erase-a-base 방법)으로 한쪽 방향이 순차적으로 결손된 서브클론들을 얻어 염기 서열을 분석한다. 염기 서열 분석은 디데옥시 체인 터미네이션 방법으로 염기 서열 결정 키트를 사용하여 각각 결손된 클론들의 염기 서열을 읽어 중복되는 염기 서열을 통해 각 클론들의 염기 서열을 연결하고, 이를 블라스트 서버(BLAST server)를 이용한 유전자 은행(GenBank) 검색을 통해 아미노산 서열 및 유전자 구조 등을 분석한다(서열 1).
2. 미꾸라지 성장 호르몬 유전자 cDNA의 클로닝 및 염기 서열 분석
성장 호르몬 유전자 cDNA를 제조하기 위하여, 먼저 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 게놈 염기 서열을 기준으로, 액손 1의 번역 개시 서열인 ATG를 포함하는 19 bp의 앞 쪽 프라이머와, 액손 5의 번역 종결 신호인 TAG 이후 23 bp 떨어진 곳에서부터 20 bp의 뒤 쪽 프라이머를 제조한다.
미꾸라지 뇌하수체 총 RNA를 주형으로 cDNA를 합성한 후, 이 반응액을 주형으로 상기 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하고 전기영동하여 PCR 생성물을 확인한 후, pT7Blue-3 벡터에 성장 호르몬 유전자 cDNA를 클로닝한다.
염기 서열 분석은 앞서의 게놈 염기 서열 분석에서와 같이 디데옥시 체인 터미네이션 방법으로 염기 서열 결정 키트를 사용하여, 클로닝된 성장 호르몬 cDNA 유전자의 5' 쪽과 3' 쪽에서 읽어 전체 염기 서열을 연결하여 수행한다(서열 2).
3. 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터의 제조
성장 호르몬의 과발현을 유도하는 발현 벡터를 제조하는 데 있어서, 조절 부위로는 염기 서열 및 발현 조절 능력이 확인된 미꾸라지 베타-액틴 유전자의 번역 개시 코돈 상위 4151 bp의 조절 부위를 갖는 플라스미드 pmlβa41(KCTC 8889P)을 이용한다.
미꾸라지 성장 호르몬의 구조 유전자 부분만을 클로닝하기 위해 분석된 염기 서열을 기초로, 번역 개시 코돈인 ATG를 포함하고 5' 쪽에 Sac I 염기 서열을 갖는 프라이머와, 폴리 A 신호 서열인 ATTAAA로부터 3' 쪽으로 110 bp 떨어진 곳에서부터 역시 5' 끝에 Sac I 염기 서열을 갖는 프라이머를 제조한다. 플라스미드 pmlGH51을 주형으로 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고 전기영동하여 PCR 생성물을 확인한 다음, pGEM-T 벡터에 클로닝하고 Sac I으로 절단하여 2110 bp의 성장 호르몬 유전자 단편을 확보한다.
플라스미드 pmlβa41 또한 Sac I으로 절단한 후, 상기 2110 bp의 성장 호르몬 유전자 단편과 리게이션하여 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터 pmlβaGH를 제조한다.
4. 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 수퍼 미꾸라지의 생산
성숙된 미꾸라지 암컷과 수컷으로부터 채취한 난과 정자를 인공 수정시킨 후, 제조된 발현 벡터 pmlβaGH를 제 1 세포기의 미꾸라지 수정난에 미세주입하고 부화시킨다. 부화된 미꾸라지를 대상으로 하여 대조군 미꾸라지들과 성장율을 비교한 결과, 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 본 발명의 수퍼 미꾸라지는 보통의 미꾸라지에 비해 25 배 정도 높은 성장율을 보였다.
5. 수퍼 미꾸라지의 형질 전달 여부 시험
생산된 제 1 세대 수퍼 미꾸라지의 고성장 형질이 다음 세대로 전달되는지 여부를 분석하기 위하여, 몇몇 계통의 제 1 세대 수퍼 미꾸라지와 대조군 일반 미꾸라지를 교배하여 제 2 세대(F1) 수퍼 미꾸라지를 생산한다. 이들 각 계통으로부터 생산된 제 2 세대 집단들을 대상으로 하여 대조군과 성장율을 비교한 결과, 제 1 세대의 고성장 형질이 제 2 세대로 전달됨을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 1: 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 검색 및 염기 서열 분석
① 성장 호르몬 유전자 탐침의 제작
이미 클로닝되어 알려진 어류 및 사람의 성장 호르몬 유전자의 염기 서열을 비교 분석하여 액손 3, 4, 5에서 종간에 각각 잘 보존된 염기 서열을 확인하고, 아래와 같은 염기 서열을 갖는 프라이머를 제조하였다.
프라이머 1 (Forward) 5' CCT GTT GCC TGA KGA ACG CA 3'
프라이머 2 (Reverse) 5' CTC AGT GAK CTG GTT GGS G 3'
프라이머 3 (Reverse) 5' GTG CAT GTC CTT CTT GAA GC 3'
K = G 또는 T, S = G 또는 C
도 1은 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 클로닝을 위한 탐침의 제조에 필요한 프라이머 염기 서열의 결정 과정을 나타낸 모식도이다.
이들 프라이머를 이용하여 미꾸라지의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR은 미꾸라지의 게놈 DNA 0.4 ㎍, 프라이머 각각 0.05 ㎍, 4 mM dNTP 1 ㎕와 10배 PCR 완충 용액 5 ㎕, Taq 폴리머라아제 1 U으로 최종 반응액을 50 ㎕로 하여 미네랄 오일로 덮어준 후 94 ℃에서 1분, 63 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분 30초씩 35회를 수행하였다. 이어서 반응 산물 중 5 ㎕를 취해 1% 아가로스 젤에서 전기영동함으로써, 프라이머 1과 2를 이용한 경우 약 400 bp, 프라이머 1과 3을 이용한 경우 약 900 bp 크기의 PCR 생성물을 확인하였다. 이 중에서 약 900 bp의 단편을 PCR II 벡터(Invitrogen, 미국)에 클로닝하여 탐침 제작에 충분한 DNA를 확보하였다. 탐침 제작은 랜덤 프라임드 라벨링 키트(random primed labeling kit; B.M., 독일)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 [α32P] dCTP로 표지하고, 스핀 컬럼을 통해 너무 작은 단편들과 합성되지 않은 dNTP들을 제거하여 탐침을 순수 분리하였다.
② 플라크 하이브리드화
미꾸라지 게놈 DNA 라이브러리(1.5 X 106pfu/㎍ DNA)를 증폭한 1.26 X 109pfu/㎍ DNA의 증폭 라이브러리(대한민국 특허출원 1998-20225호)로부터, 각 5만개 정도의 플라크가 형성될 수 있도록 150 mm 플레이트 10개에 타이터를 조절하여 0.3 ㎖의 대장균 숙주 세포 KW251(Promega, 미국)과 혼합한 후 37 ℃에서 20분간 배양하여 파아지를 숙주에 감염시켰다. 벤톤과 데이비스의 방법(Benton, W. D. and R. W. Davis, 1977, Science, 196: 180-182)에 따라 형질전환된 대장균 숙주 세포 KW251을 7 ㎖의 0.7% 탑(top) 아가로스와 섞어 아가 배지가 깔린 150 mm 플레이트에 붓고 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서 나일론 필터를 배양 접시 위에 올려놓아 파아지를 필터로 옮기고, 1분 후 필터를 떼어 내어 순차적으로 변성 용액(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl)에 2분, 중성 용액(1 M 트리스; pH 7.4, 1.5 M NaCl)에 5분, 2X SSC(0.3 M NaCl, 30 mM 구연산 나트륨)에 1분간 담근 다음, 나일론 필터에 DNA가 견고하게 부착되도록 UV 교차 결합시켜 건조하였다.
필터 상에 단단하게 붙은 DNA와 앞서 제작한 미꾸라지 성장 호르몬 탐침을 서던의 방법(Southern, E. M., 1975, J. Mol. Biol., 98: 503-517)을 응용하여, 65 ℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화시킨 후 42 ℃에서 16시간 하이브리드화시켰다. 이어서 1차(2X SSC, 0.1% SDS) 및 2차(0.1X SSC, 0.1% SDS) 세척 용액으로 여분의 탐침을 씻어낸 다음, 증강 스크린(intensifying screen)을 덮고 -70 ℃에서 X-선 필름에 24시간 동안 노출시킨 후 자동 필름 현상기로 현상하였다. 필름상에 나타난 양성 신호와 일치하는 플레이트 상의 플라크들을 파스퇴르 피펫으로 회수하여, 1 ㎖의 SM 완충 용액을 넣은 후 클로로포름 2 방울을 첨가하고 파아지들이 용액내로 나오도록 실온에서 4시간 동안 정치하였다. 완전한 양성 단일 플라크의 분리를 위해 1차 검색으로 얻어진 플라크들을 약 50개 정도의 플라크가 형성되도록 타이터를 조절하여 배양한 후 2회에 걸쳐 위와 같은 방법으로 재검색하여 총 50만개의 플라크 중 4개의 양성 파아지 클론을 순수 분리하였다.
③ 파아지 DNA의 추출과 제한 효소 지도 작성
단일 양성 파아지 DNA를 분리하기 위해 밤새 배양한 대장균 숙주 세포 KW251 500 ㎕에 파아지 20 ㎕를 37 ℃에서 20 분간 감염시킨 후, 최종 농도 10 mM의 MgSO4가 들어있는 LB 100 ㎖에서 용해(lysis) 될 때까지 배양하여 500 ㎕의 클로로포름을 넣고 원심분리(8,000 g, 10분)하여 상층의 파아지 용해질(lysate)을 얻었다. 파아지 용해질을 250 ㎖ 원심분리관으로 옮겨 RNase A와 DNase I을 최종 농도 1 ㎍/㎖로 넣어 37 ℃에서 30 분 동안 반응시키고, NaCl 5.8 g과 PEG 8000 9.3 g을 넣어 얼음 위에서 1시간 동안 정치시킨 후 원심분리(10,000 g, 20분, 4 ℃)하여 파아지를 침전시켰다. 침전된 파아지를 10 ㎖의 파아지 완충 용액(20 mM 트리스-HCl; pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4)에 녹여 원심분리한 후 상층액에 10% SDS 100 ㎕, 0.5 M EDTA(pH 8.0) 100 ㎕ 씩을 넣어 68 ℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 동량의 페놀을 첨가하여 파아지의 단백질 껍질을 제거한 다음 5분 동안 원심분리하여 DNA가 든 상층액을 회수하였다. 잔존 페놀을 제거하기 위해 동량의 클로로포름을 처리하여 상층액 만을 취한 다음, 0.1배의 5 M NaCl, 1배의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시키고, 70% 에탄올로 무기 염류를 제거한 후 건조시켜 얻어진 DNA를 TE 1 ㎖에 녹였다.
λ Gem-11 파아지 벡터내에 존재하는 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 제한 효소 지도를 만들기 위해 EcoR I, Sac I, Xba I, Xho I 등의 제한 효소를 단일 또는 적절히 조합하여 DNA를 각기 절단한 후 전기영동하여 나타난 절편의 크기를 비교하여 각 제한 효소들의 위치를 지도화하였다.
도 2는 이와 같이 작성한 미꾸라지 성장 호르몬 유전자를 포함하는 박테리오파아지 DNA의 제한 효소 지도이다.
파아지 DNA에서 미꾸라지 성장 호르몬 유전자를 포함하는 단편의 확인을 위해 앞서 성장 호르몬 유전자의 검색에 사용한 것과 동일한 탐침을 이용하여 서던 블롯(Southern blot)을 수행한 결과, Sac I과 EcoR I의 5.1 kb 성장 호르몬 유전자를 포함하는 양성 신호를 나타내는 단편을 확인하였다.
④ 성장 호르몬 유전자의 플라스미드 벡터로의 서브클로닝
미꾸라지 성장 호르몬 유전자를 플라스미드 벡터인 pBluscript II KS(-) (Stratagene, 미국; 이하 pBS)로 서브클로닝하기 위해, 2 ㎍의 λ파아지 DNA와 pBS 벡터를 제한 효소 Sac I과 EcoR I 각 10 U 씩으로 2시간 동안 반응시킨 후 전기영동하고, 진클린 키트(Geneclean kit; Bio 101, 미국)를 이용하여 절단된 5.1 kb의 성장 호르몬 유전자 단편과 벡터를 회수하고, T4 DNA 리가제를 이용하여 리게이션하였다.
형질전환은 하나한(Hanahan, D., 1983. J. Mol. Biol., 166: 557-580)의 방법을 변형하여, 2 ㎕의 리게이트를 0.5 M CaCl2를 처리한 대장균 숙주 세포 XL-1 blue MRF' 균주 100 ㎕와 섞어 4 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 42 ℃에서 90초 동안 열처리하고 LB 배양액 1 ㎖을 첨가하여 37 ℃에서 45분간 배양하여 실시하였다. 이 형질전환체를 원심분리(13,000 rpm, 20초)하고 LB 200 ㎕에 재현탁하여 암피실린(50 ㎍/㎖)과 X-gal(50 ㎍/㎖)이 들어 있는 아가 플레이트에 도말하여 37 ℃에서 밤새 배양한 후, 나타난 흰색 콜로니를 무작위로 선택하여 37 ℃에서 2 ㎖ LB 배양액에 밤새 배양하였다. 이 중 1.5 ㎖을 알칼리 용해 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하여 일부를 제한 효소로 절단하고, 정확한 삽입체가 들어 있는지 여부를 확인하여, 이를 pmlGH51로 명명하였다.
⑤ 성장 호르몬 유전자의 염기 서열 분석
pBS 벡터에 서브클로닝된 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자 부위 약 5.1 kb의 제한 효소 지도를 만들기 위해 Sac I, EcoR I, Hind III, Pst I, BamH I, Kpn I, Apa I 등의 제한 효소들을 적절히 조합하여 플라스미드 DNA를 절단하고, 전기영동하여 나타난 절편의 크기로 각 제한 효소들의 위치를 확인하여 정확한 제한 효소 지도를 작성한 후, 엑소뉴클레아제 III를 이용한 방법(Erase-a-base 방법) (Henikoff, S., 1984. Gene 28: 357)으로 한쪽 방향이 순차적으로 결손된 서브클론들을 얻어 염기 서열을 분석하였다.
먼저 플라스미드 pmlGH51 12 ㎍을, 제한 효소 절단 가닥이 3' 말단을 형성하여 Exo III에 의해 분해되지 않는 Apa I과, 5' 말단을 제공하여 Exo III에 의해 분해되는 EcoR I로 절단한 후, 페놀·클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 절단된 DNA를 회수하여 72 ㎕의 증류수에 녹였다. 여기에 10배의 Exo III 반응 완충 용액을 8 ㎕, Exo III(175 U/㎕)를 3.4 ㎕ 넣고 37 ℃에서 반응시키면서 30 초 간격으로 2.5 ㎕씩을 분주하여, 미리 7.5 ㎕의 S I 뉴클레아제 혼합 용액을 넣어 얼음에 넣어 둔 시험관에 넣었다. 총 30개의 시험관으로 분주가 끝나면 실온에서 30 분간 S I 뉴클레아제와 반응시킨 후, S I 반응 정지 용액 1 ㎕씩을 넣고 68 ℃에서 10분간 열처리하여 반응을 중지시켰다. 각 시험관 당 10 ㎕의 반응액 중 2 ㎕를 전기영동하여 연속적인 결손을 확인하고, 나머지는 클레나우 혼합 용액 1 ㎕와 dNTP 혼합 용액 1 ㎕씩을 넣어 37 ℃에서 5분간 반응시켜 단일 가닥으로 남아있는 말단을 채우고, 여기에 리게이션 혼합 용액 40 ㎕씩을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켜 앞서와 같은 방법으로 대장균 숙주 세포 XL-1 blue MRF'에 형질전환시켰다.
다음은 이상의 단계에서 사용된 각 반응 용액의 조성을 나타내고 있다.
제한 효소 반응
pmlGH (1.2 ㎍/㎕) 10 ㎕
Apa I (10 U/㎕) 1 ㎕
EcoR I (10 U/㎕) 1 ㎕
10배 완충 용액 5 ㎕
증류수 33 ㎕
S I 뉴클레아제 혼합 용액
10배 S I 완충 용액 26.3 ㎕
S I 뉴클레아제 (50 U/㎕) 0.4 ㎕
증류수 236 ㎕
S I 반응 정지 용액
0.3 M Tris (pH 8.0)
0.05 M EDTA
클레나우 혼합 용액
클레나우 반응 완충 용액 50 ㎕
클레나우 (5 U/㎕) 1.5 ㎕
클레나우 반응 완충 용액
20 mM Tris (pH 8.0)
10 mM MgCl2
리게이션 혼합 용액
10배 리게이션 반응 완충 용액 140 ㎕
40% PEG 175 ㎕
0.1 M DTT 14 ㎕
T4 DNA 리가제(1 U/㎕) 10 ㎕
증류수 1061 ㎕
형질전환체를 도말하여 밤새 배양한 30개의 플레이트에서 각각 무작위로 콜로니를 선택하여 LB 2 ㎖에서 밤새 배양한 다음, 알칼리 용해 방법으로 플라스미드 DNA를 추출하고 이를 제한 효소로 절단하여 결손된 크기를 확인하였다. 염기 서열 분석은 생거 등(Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74: 5463-5467)의 디데옥시 체인 터미네이션 방법으로 염기 서열 결정 키트(Sequenase version 2.0, USB, 미국)를 사용하여 각각 결손된 클론들의 염기 서열을 읽어 중복되는 염기 서열을 통해 각 클론들의 염기 서열을 연결하고, 이를 블라스트 서버(BLAST server)를 이용한 유전자 은행(GenBank) 검색을 통해 아미노산 서열 및 유전자 구조 등을 분석하였다.
서열 1은 이와 같이 결정한 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 염기 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 우측 I - V의 표기는 액손을 의미한다.
⑥ 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 염기 서열
미꾸라지 게놈 DNA의 성장 호르몬을 포함하는 5.1 kb의 Sac I/EcoR I 단편의 염기 서열 분석 결과, 5' 쪽 Sac I으로부터 약 3 kb의 성장 호르몬 유전자 조절 부위를 포함하는 완전한 성장 호르몬 유전자가 확인되었다. 본 발명에 따라 얻어진 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자는 신호 서열을 포함하여 210개의 아미노산을 코오딩하는 630개의 염기가 4개의 인트론에 의해 구분되는 5개의 액손으로 구성되어 있었다(서열 1).
미꾸라지의 성장 호르몬 유전자는, 다른 어종과의 염기 서열 비교에서 잉어(common carp)와 86.8%, 백련어(silver carp)와 86.8%, 무지개 송어와는 59.9%의 상동성을 보이고, 염기 서열로부터 유추된 아미노산 서열에서는 각각 92.4%, 91.4%, 65.2%의 상동성을 갖고 있었다. 또한, 모든 척추동물의 성장 호르몬에서 잘 보존된 1개의 트립토판 잔기와, 2개의 이황화 결합을 하는 4개의 시스테인 잔기, 그리고 알파-나선 구조를 갖는 AGH,BGH,CGH,DGH의 4개 영역이 잘 보존되어 있어, 높은 상동성을 보여주었다(Kawauchi, H. and A. Yasuda, 1989. Evolutionary aspects of growth hormone from nonmammalian species. In: "Advances in growth hormones and growth factor research," Pythagona press. pp. 51-68). 이러한 상동성은 본 발명을 통해 얻어진 성장 호르몬 유전자가 미꾸라지뿐만 아니라 다른 어종에서도 기능적으로 작용할 수 있는 가능성을 보여주는 것이라 할 수 있다.
실시예 2: 미꾸라지 성장 호르몬 유전자 cDNA의 클로닝 및 염기 서열 분석
① 미꾸라지 뇌하수체 총 RNA의 추출
미꾸라지의 두개골을 절개하여 뇌하수체를 포함하는 시엽과 소뇌 부분을 적출하여 시험관에 넣고 액체 질소에 담가 조직을 급냉시킨 후, 제조 회사의 RNA 추출 방법(RNAzolTMB Isolation of RNA, Biotecx Lab. Inc., 미국)에 따라 RNAzol 1 ㎖과 함께 마쇄(homogenazation)하여 총 RNA를 추출하여 50 ㎕의 증류수에 녹였다.
② 성장 호르몬 유전자 cDNA의 제조 및 클로닝
실시예 1에서 클로닝한 성장 호르몬 유전자의 구조와 이로부터 스플라이싱 과정을 통해 유추한 성장 호르몬의 아미노산 서열이 실제 생체내에서 생산되는 기능적 성장 호르몬 유전자인지의 여부와, 성장 호르몬 유사 유전자(pseudogene)의 존재를 확인하기 위하여 성장 호르몬 유전자의 cDNA를 클로닝하였다. 성장 호르몬 유전자 cDNA를 제조하기 위한 프라이머는 앞서 염기 서열과 구조적 특징이 밝혀진 미꾸라지 성장 호르몬 유전자의 게놈 염기 서열을 기준으로, 액손 1의 번역 개시 서열인 ATG를 포함하는 19 bp의 앞 쪽 프라이머와, 액손 5의 번역 종결 신호인 TAG 이후 23 bp 떨어진 곳에서부터 20 bp의 뒤 쪽 프라이머를 제조하여 사용하였다.
GHcF (Forward) 5' CTA CCT GGA GCG AAA TGG C 3'
GHcR (Reverse) 5' GGC TAA TTG TCT ACT GGC GC 3'
미꾸라지 뇌하수체 총 RNA 0.1 ㎍을 주형으로 GHcF 프라이머 0.05㎍, 4 mM dNTP 1㎕, 0.1 M DTT 1㎕, RNasin 0.25 ㎕, 10배 반응 완충 용액 1㎕, M-MLV 역전사 효소(reverse transcriptase) 200 U과 증류수로 반응 용적 10 ㎕로 하여 55 ℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성한 후, 증류수 40 ㎕를 넣어 반응액을 희석하였다. 이어서 이 반응액 5 ㎕를 주형으로, GHcF, GHcR 프라이머 각각 0.05 ㎍, 4 mM dNTP 1 ㎕와 10배 PCR 완충 용액 5 ㎕, Taq 폴리머라아제 0.5 U으로 최종 반응 용적을 50 ㎕로 하고 미네랄 오일로 덮어준 후 94 ℃에서 30초, 63 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분씩 28회의 PCR 반응을 수행하였다. 반응 산물 중 5 ㎕를 취하여 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 670 bp의 PCR 생성물을 확인한 후, 제조 회사의 방법(Perfectly blunt cloning kits manual, Novagen)에 따라 pT7Blue-3 벡터(Novagen, 미국)에 성장 호르몬 유전자 cDNA를 클로닝하였다.
도 3은 미꾸라지 성장 호르몬 유전자 cDNA의 클로닝 과정을 나타낸 모식도이다.
③ 성장 호르몬 유전자 cDNA의 염기 서열 분석
염기 서열 분석은 앞서의 게놈 염기 서열 분석에서와 같이 생거 등 (Sanger, F., S. Nicklen and A. R. Coulson, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74: 5463-5467)의 디데옥시 체인 터미네이션 방법으로 염기 서열 결정 키트(Sequenase version 2.0, USB, 미국)를 사용하여, 클로닝된 성장 호르몬 cDNA 유전자의 5' 쪽과 3' 쪽에서 읽어 전체 염기 서열을 연결하였다.
서열 2는 미꾸라지 성장 호르몬 유전자 cDNA의 염기 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
④ 미꾸라지 성장 호르몬 유전자 cDNA의 염기 서열
미꾸라지 뇌하수체에서 발현하는 성장 호르몬 유전자의 mRNA로부터 얻어진 성장 호르몬 유전자 cDNA의 염기 서열 분석 결과, 게놈 염기 서열의 분석 결과와 동일하게 210개의 아미노산을 코오딩하는 630개의 염기가 정확하게 일치하는 것을 볼 수 있었다(서열 2).
실시예 3: 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터의 제조
① 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터의 조절 부위
성장 호르몬의 과발현을 유도하는 발현 벡터를 제조하는 데 있어서, 조절 부위로는 염기 서열 및 발현 조절 능력이 확인된 미꾸라지 베타-액틴 유전자의 번역 개시 코돈 상위 4151 bp의 조절 부위를 갖는 플라스미드 pmlβa41(KCTC 8889P)(대한민국 특허출원 제 1998-20255호)을 이용하였다.
② 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터의 제조
미꾸라지 성장 호르몬의 구조 유전자 부분만을 클로닝하기 위해, 분석된 염기 서열을 기초로, 번역 개시 코돈인 ATG를 포함하며 이 후 클로닝을 용이하게 하기 위해 5' 쪽에 Sac I 염기 서열을 갖는 프라이머와, 폴리 A 신호 서열인 ATTAAA로부터 3' 쪽으로 110 bp 떨어진 곳에서부터 역시 5' 끝에 Sac I 염기 서열을 갖는 프라이머를 제조하였다(서열 1 참조).
GHF (Forward) 5' GAG CTC GCG AAA TGG CTA AAG GTA TGG 3'
Sac I
GHR (Reverse) 5' GAG CTC CAT AGT GCA CAA GTG GTG TCT G 3'
Sac I
PCR은 플라스미드 pmlGH51 0.1 ㎍을 주형으로 GHF, GHR 프라이머 각각 0.05 ㎍, 4 mM dNTP 1 ㎕, 10배 PCR 완충 용액 5 ㎕, Taq 폴리머라아제 0.5 U으로 최종 반응액을 50 ㎕로 하여 미네랄 오일로 덮어준 후 94 ℃에서 1분, 63 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분 30초씩 35회를 수행하였다. 이어서, 반응 산물 중 5 ㎕를 취하여 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 PCR 생성물을 확인한 다음, pGEM-T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하고 Sac I으로 절단하여 2110 bp의 성장 호르몬 유전자 단편을 확보하였다.
플라스미드 pmlβa41도 Sac I으로 절단하고 페놀·클로로포름 추출과 에탄올 침전 후, 인산 잔기를 제거하기 위해 10 ㎕의 3차 증류수에 DNA를 녹여 송아지 장 포스파타제(CIP) 4 U을 넣어 37 ℃에서 30분 동안 반응시키고, 다시 페놀·클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 플라스미드 pmlβa41 벡터 절편을 정제한 후, 상기 2110 bp의 성장 호르몬 유전자 단편과 리게이션하여 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터 pmlβaGH를 제조하였다.
도 4는 미꾸라지 성장 호르몬을 코오딩하는 유전자와 동종의 베타-액틴 유전자 조절 부위를 재조합한 pmlβaGH 플라스미드 발현 벡터의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
이상과 같이 제조된 플라스미드 pmlβaGH는 대장균 숙주세포 XL-1 blue MRF'에 형질전환시켜 생명공학연구소에 1998년 6월 19일자 기탁번호 KCTC 8894P호로서 기탁되어 있다.
실시예 4: 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 수퍼 미꾸라지의 생산
성숙된 미꾸라지 암컷과 수컷을 300 ppm의 염산 리도카인으로 마취하고 어체중 g당 6 IU의 농도로 HCG(Human Chorionic Gonadotropin, Sigma)를 주사한 후 13 시간이 지나서 난과 정자를 채취하였다. 채취된 난과 정자를 인공 수정시킨 후, 제조된 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터 pmlβaGH를 100 ㎍/㎖의 농도로 완충 용액(1 mM 트리스, pH 7.8; 0.01 mM EDTA)에 녹여, 제 1 세포기의 미꾸라지 수정난 4,000 개에 미세주입(microinjection)을 수행하였다. 미세주입이 완료된 난들은 25 ℃ 항온 부화 수조로 옮겨 부화시켰다.
그 결과, 미세주입된 4,000 개의 수정난중 1,700 개가 부화되었으며, 이들을 대상으로 하여 동일수의 대조군 미꾸라지들과 2x4 m 순환 여과식 수조에서 사육하면서 성장을 비교하였다. 이 때, 각 수조의 온도는 25 ℃로 하였으며, 사료는 시판되는 잉어 사료를 공급하였다.
그 결과, 본 성장 호르몬 발현 벡터가 주입된 1,700 개체중 310 개체가 일반 미꾸라지의 성장을 훨씬 뛰어넘는 고성장 형질을 갖고 있음이 나타났다.
도 5는 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 제 1 세대 수퍼 미꾸라지와 일반 미꾸라지의 성장을 비교한 그래프이다. 여기에서 보듯이, 생산된 제 1 세대 수퍼 미꾸라지와 일반 대조군 미꾸라지의 성장은 부화 30 일 후부터 유의적인 차이가 나타나기 시작하였으며, 이러한 차이는 성장 기간이 지속될수록 현저하게 되었다. 즉, 부화 3 개월 후에 일반 미꾸라지의 평균 체중은 4 g인 반면, 수퍼 미꾸라지는 평균 체중 70 g이었으며, 부화 5 개월 후에는 대조군의 경우 평균 체중 9 g과 전장 10 cm를 나타내었으나, 수퍼 미꾸라지는 평균 체중 230 g에 전장 35 cm를 나타내었다.
도 6은 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 제 1 세대 미꾸라지와 일반 미꾸라지의 외형적 크기를 비교한 사진이다.
실시예 5: 수퍼 미꾸라지의 형질 전달 여부 시험
생산된 제 1 세대 수퍼 미꾸라지의 고성장 형질이 다음 세대로 전달되는지 여부를 분석하기 위하여, 몇몇 계통의 제 1 세대 수퍼 미꾸라지와 대조군 일반 미꾸라지를 교배하여 제 2 세대(F1) 미꾸라지를 생산하였다.
각 계통으로부터 생산된 제 2 세대 집단들을 대상으로 하여, 각 계통에서 무작위로 50 마리씩을 선발하여 상기와 동일한 방법으로 1x2 m 순환 여과 수조에서 사육하면서 성장을 대조군과 비교하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.
제 2 세대 체중(g)
부화 1개월 부화 2개월 부화 3개월
대조군 일반 미꾸라지 1.3±0.3 3.2±1.1 4.5±1.5
수퍼 미꾸라지 계통 #1 14.5±2.8 37.2±4.9 73.3±7.7
수퍼 미꾸라지 계통 #2 10.8±0.5 27.1±1.9 46.7±6.9
수퍼 미꾸라지 계통 #3 13.0±0.7 32.4±2.2 62.6±4.8
수퍼 미꾸라지 계통 #4 11.5±0.8 25.6±1.8 42.5±4.5
수퍼 미꾸라지 계통 #5 18.8±0.5 52.9±1.4 108±4.0
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 수퍼 미꾸라지는 제 1 세대의 고성장 형질이 제 2 세대로 전달됨을 알 수 있는데, 성장 증가의 정도는 사용된 제 1 세대 수퍼 미꾸라지에 따라 다양하게 나타났다. 도 5 및 표 1에서 보듯이, 일반 미꾸라지는 상품 크기인 10-12 g에 도달하기까지 최소 6개월 정도가 소요되는데 비해, 대부분의 수퍼 미꾸라지 계통들은 상품 크기에 도달하는데 40-50 일 정도 만이 소요되는 것을 알 수 있었다.
이와 같이, 본 발명의 방법에 따라 생산된 고성장 형질의 수퍼 미꾸라지와 종래의 미꾸라지의 수익성을 비교해 보면 다음 표 2와 같다.
표 2에서 보듯이, 종래의 방법에서 최소 6개월 이상 걸리는 미꾸라지 사육 기간을 본 발명의 방법을 통해 현저히 단축시킬 수 있으며, 이에 따라 사료비, 인건비 및 시설비 등 생산에 소요되는 제반 경비를 획기적으로 줄일 수 있다. 더욱이, 연중 다회의 생산이 가능하고 대형어 생산을 통한 새로운 상품 개발이 가능하다는 효과도 있다.
보통미꾸라지 고성장 형질미꾸라지
상품화되기까지 걸리는 시간 6-9 개월 40-50 일
연간 생산 가능한 회수 연 1 회 최소 연 7 회 이상
연간 최대 성장 20 g 이하 250 g 이상
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에서 밝혀진 미꾸라지 성장 호르몬 유전자는 잉어, 백련어 등과도 높은 상동성을 보여, 본 발명에 따라 제조된 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터가 미꾸라지뿐 아니라 다른 어종에서도 기능적으로 작용할 수 있는 가능성을 보여 주었다.
또한, 본 발명의 미꾸라지 성장 호르몬 발현 벡터로 형질전환된 수퍼 미꾸라지는 보통 미꾸라지에 비해 25 배나 높은 성장율을 나타내며, 이와 같은 제 1 세대의 고성장 형질은 제 2 세대로 전달되는 것을 볼 수 있었다.
따라서, 본 발명의 기술을 이용할 경우 종래의 방법에서 최소 6개월 이상 걸리는 미꾸라지 사육 기간을 현저히 단축시킬 수 있으며, 이에 따라 사료비, 인건비 및 시설비 등 생산에 소요되는 제반 경비를 획기적으로 줄일 수 있을 것이다. 더욱이, 연중 다회의 생산이 가능하고 대형어 생산을 통한 새로운 상품 개발이 가능하다는 점을 고려할 때 본 발명의 이점 및 효과는 명백할 것이다.
〔서열 목록〕
서열 번호: 1
서열의 길이: 5108
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: genomic DNA
기원:
생물명: 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)
서열 번호: 2
서열의 길이: 670
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: cDNA
기원:
생물명: 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)

Claims (6)

  1. 서열 1에 기재된 염기 서열로 표시되는 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자를 포함하는 DNA.
  2. 미꾸라지의 성장 호르몬 유전자 및 베타-액틴 유전자 조절 부위를 포함하는 발현 벡터
  3. 제 2 항에 있어서, 발현 벡터 pmlβaGH (KCTC 8894P)
  4. 제 2 항의 발현 벡터로 형질전환된 어류.
  5. 제 4 항에 있어서, 발현 벡터 pmlβaGH로 형질전환된 미꾸라지(Misgurnus mizolepis).
  6. 미꾸라지 수정난에 제 2 항의 발현 벡터를 미세 주입하여 부화시키는 단계를 포함하는 고성장 형질 전환 미꾸라지의 제조 방법.
KR1019980029701A 1998-06-01 1998-07-23 미꾸라지성장호르몬발현벡터 KR100290007B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980029701A KR100290007B1 (ko) 1998-07-23 1998-07-23 미꾸라지성장호르몬발현벡터
US09/306,446 US6372959B1 (en) 1998-06-01 1999-05-06 Expression vector of a mud loach growth hormone gene
JP15434699A JP3184182B2 (ja) 1998-06-01 1999-06-01 泥鰌成長ホルモン発現ベクター

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980029701A KR100290007B1 (ko) 1998-07-23 1998-07-23 미꾸라지성장호르몬발현벡터

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000009360A true KR20000009360A (ko) 2000-02-15
KR100290007B1 KR100290007B1 (ko) 2001-05-15

Family

ID=19545008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980029701A KR100290007B1 (ko) 1998-06-01 1998-07-23 미꾸라지성장호르몬발현벡터

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100290007B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100460852B1 (ko) * 2001-12-03 2004-12-17 부경대학교 산학협력단 미꾸라지 렉틴 유전자의 조절부위를 포함하는 발현벡터
KR100869985B1 (ko) * 2002-05-09 2008-11-21 후지쯔 마이크로일렉트로닉스 가부시키가이샤 반도체 기억 장치

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100460852B1 (ko) * 2001-12-03 2004-12-17 부경대학교 산학협력단 미꾸라지 렉틴 유전자의 조절부위를 포함하는 발현벡터
KR100869985B1 (ko) * 2002-05-09 2008-11-21 후지쯔 마이크로일렉트로닉스 가부시키가이샤 반도체 기억 장치

Also Published As

Publication number Publication date
KR100290007B1 (ko) 2001-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5545808A (en) Transgenic salmonid fish expressing exogenous salmonid growth hormone
Yoshiura et al. Duality of gonadotropin in a primitive teleost, Japanese eel (Anguilla japonica)
CA2296434C (en) Mutations in the myostatin gene cause double-muscling in mammals
Flanagan et al. Cloning of the cDNA for sea bream (Sparus aurata) parathyroid hormone-related protein
JPH06503949A (ja) 新規インシュリン様成長因子結合タンパク質ｉｇｆｂｐ―５
Anathy et al. Cloning, sequencing and expression of cDNA encoding growth hormone from Indian catfish (Heteropneustes fossilis)
Huang et al. Molecular characterization, sexually dimorphic expression, and functional analysis of 3′-untranslated region of vasa gene in half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)
Zhu Growth hormone gene and the transgenic fish
KR100290007B1 (ko) 미꾸라지성장호르몬발현벡터
Kusakabe et al. The guanylyl cyclase family in medaka fish Oryzias latipes
JP5997772B2 (ja) カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異配列、及び突然変異を誘発する方法と応用
US20030191301A1 (en) Cloning of a high growth gene
Lee et al. Gene Expression of Cotesiaplutellae Bracovlrus EP1-like Protein (CpBV-ELP1) in Parasitized Diamondback Moth, Plutellae xylostella
CN108588083B (zh) 适用于家蚕表达的改造血小板衍生生长因子基因及其表达载体和应用
JP3184182B2 (ja) 泥鰌成長ホルモン発現ベクター
WO2012083547A1 (zh) 海岛棉抗黄萎病基因及其应用
CN1365392A (zh) 果蝇重组相关蛋白质及其使用方法
WO2018079861A1 (ja) 放卵又は放精を誘起するペプチド
JP2000509255A (ja) 感覚神経障害と関連した遺伝子ファミリー
CN114751971B (zh) 一种牙鲆雄性相关Dmrt1重组蛋白及应用
CN114908097B (zh) 一种Dox调控的记录猪组织分化与器官发生的谱系示踪技术
CN102321163A (zh) 海岛棉脂质转运蛋白及其在纤维改良上的应用
KR101380742B1 (ko) 능성어 양식에서 사료첨가제로 사용하기 위한 능성어 성장호르몬을 발현하는 형질전환 누에 및 그 제조방법과 벡터
KR100460852B1 (ko) 미꾸라지 렉틴 유전자의 조절부위를 포함하는 발현벡터
Chevaillier et al. The amino acid sequence of the ram spermatidal protein 3: A transition protein TP3 or TP4?

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20050825

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee