KR19990088117A - 간접중합표지항체및그제조방법 - Google Patents

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Abstract

고감도의 간접표지 중합항체가 개시된다.
그 항체는, 시료액내의 검출대상물로서 항원의 농도가 낮더라도, 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 간접중합 표지항체는, 다관능성시약을 통해 중합하고, 또한 이황화물결합에 의해서 단백질과 결합한 항체로 이루어지는 중합항체 컨쥬게이트가, 시아닌계색소, 예컨대 다음 식으로 표시되는 색소로 표지된 것이다.
여기에서, R1및 R2는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알카리 금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.

Description

간접중합 표지항체 및 그 제조방법{Indirect polymerized and labelled antibody and method for manufacturing the same}
본 발명은, 단백질 복합체 또는 중합된 항체 컨쥬게이트를 형성하기 위하여, 항체를 중합하고 그 중합된 항체에 단백질을 결합시키며, 그 컨쥬게이트를 시아닌계색소로 표지(標識)함으로써 준비되는 간접중합 표지항체및 그의 제조방법에 관한 것이다.
항체를 색소로 표지한 색소표지항체는, 시인성이 있으며, 시료액 중에 포함되는 항원 또는 면역원과 특이적으로 반응한다. 따라서, 예컨대, 면역학적 항원항체반응을 이용하여, 시료액 중에 포함되는 특정한 항원 또는 면역원의 검출을 행하는 면역 센서에 사용되고, 각종의료기관에서의 진단에 활용되고 있다.
항체를 표지하는 색소로서는 시아닌계 색소가 가장 빈번하게 사용되고 있는데, 이는 높은 몰흡광 계수를 갖고, 반응성이 높기 때문이다(Bioconjugate Chemistry VOL.4 No.2, pp105-111,1993 참조).
이러한 시아닌계 색소는, 그 관능기가 항체내에 존재하는 아미노기 또는 카르복실기와 반응하여 공유결합을 형성한다. 시아닌계 색소의 항체에 대한 결합률은 1분자의 항체에 대하여 20 내지 50분자이다.
이렇게 하여 제작된 시아닌계 색소표지 항체는, 일반적으로 시인성이 좋고, 예컨대 면역 크로마토그래피에 도입되어, 임부의 소변중에만 존재하는 인간융모성 고나도트로핀(gonadotropin)등과 같은 특정물질의 미량성분을 검출하는 데 효율적으로 사용하고 있다.
통상 항체에는, 수백으로부터 수천개의 아미노기 또는 카르복실기를 포함하고 있다. 그러나, 항체는 3차원의 입체구조를 갖기 때문에, 이와 같은 많은 아미노기 또는 카르복실기중에서 반응에 관여할 수 있는 것은 50개 정도라고 생각되고, 1분자의 항체에 대하여, 색소 50분자가 결합하는 것이 한계였다.
또한, 항체는 1 분자에 대하여 항원과 반응하는 부위가 2개소로 한정된 수를 가지기 때문에, 항원에 대한 항체의 결합감도가 낮았다.
그 때문에, 이와 같은 색소표지항체를 면역 센서 등에 이용한 경우, 그 센서의 감도에 한계가 있고, 시료액 중에 포함되는 항원의 농도가 낮으면, 그 검출대상물의 검출이 곤란하게 된다는 큰 문제를 발생하였다.
본 발명은, 상기 과제에 비추어, 시료액중의 검출대상물의 농도가 낮더라도, 검출을 가능하게 하는 고감도의 간접중합 표지항체를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 바와 같은 간접중합 표지항체의 제조방법을 제공함에 있다.
도1 은, 본 발명의 일 실시예에 있어서의 면역 크로마토그래피의 개략구성을 나타내는 사시도이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
1 : 판형상지지체 2 : 제1유리여과지
3 : 표지항체부 4 : 항체고정화부
5 : 항체고정용막 6 : 제2유리여과지
L1 : 조사광 L2 : 반사광
본 발명에 의한 간접중합 표지항체는, 다관능성 시약을 통해 중합하고, 또한 이황화물결합에 의해서 단백질과 결합한 항체로 이루어지는 중합항체 컨쥬게이트가, 식(1)∼(4)중 어느 하나로 표시되는 시아닌계 색소로 표지된 것이다.
(단, R1및 R2는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알카리 금속, n은 1 내지 4의 정수를 나타낸다.)
항체를 중합함으로써 마련되는 중합항체는, 항원과 반응하는 부위를 다수개 갖는 다가 항체이기 때문에, 통상의 2가 항체에 비해서 항원과의 결합감도가 우수하다.
또한, 상기 중합항체에 단백질을 결합시키면, 시아닌계 색소가 결합할 수 있는 면적이 넓어지기 때문에, 중합항체 컨쥬게이트에 결합하는 색소의 분자수가 많아진다. 그 결과, 상술한 방법에 의하여 얻어지는 간접중합 표지항체는, 시인성이 우수하다.
따라서, 본 발명에 의한 간접중합 표지항체를, 예컨대, 면역 크로마토그래피에 사용하면, 측정대상물, 즉 항원의 농도가 낮은 경우라도, 고감도로 검출할 수 있다. 또한, 그 고감도때문에, 본 발명의 간접중합 표지항체는, 어떠한 형식의 바이오센서에도 적용가능하다.
또한, 본 발명에 의한 간접중합 표지항체는, 상기 시아닌계 색소내에 존재하는 숙신(succuin)이미딜기 유래의 아실탄소와 상기 중합항체 컨쥬게이트내에 존재하는 아미노기 유래의 질소사이의 공유결합을 통하여, 상기 색소의 골격이 중합항체 컨쥬게이트에 결합하고 있는 구성인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 간접중합 표지항체에 있어서, 항체의 중합도는 통상, 2 내지 50의 범위인 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 간접중합 표지항체의 제조방법은, 중성 또는 약알카리 성의 인산완충액속에서 다관능성시약을 사용하여 항체를 중합시키는 공정과, 중성 또는 약알카리성의 인산완충액속에서 단백질을 환원하는 공정과, 상기 중합된 항체와 상기 환원된 단백질을 반응시켜 중합항체 컨쥬게이트를 형성하는 공정과, 식(1)∼(4)중 어느 하나로 표시되는 시아닌계 색소와 상기 중합항체 컨쥬게이트를 반응시켜 상기 중합항체 컨쥬게이트를 표지하는 공정을 포함하여 구성된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 중성 또는 약알카리 성의 인산완충액속에서, 다관능성시약을 사용하여 중합항체를 형성하도록 항체를 중합하는 공정과, 중성 또는 약알카리 성의 인산완충액속에서 단백질을 환원하는 공정과, 식(1)∼(4)중 어느 하나로 표시되는 시아닌계 색소와 상기 환원된 단백질을 반응시켜 단백질을 표지하는 공정 및 상기 중합된 항체와 표지에 기재된 단백질을 반응시키는 공정을 포함하는 구성이어도 좋다.
어느 경우의 방법이더라도, 인산완충액에 대한 pH는, 7.0 내지 8.0의 범위인 것이 바람직하다.
본 발명의 간접중합 표지항체에 사용할 수 있는 항체는, 특히 제한되지 않고, 그 유래나 서브클래스 등에 관계없이 사용할 수 있다. 예컨대, 적용가능한 항체는, 다양한 이뮤노글로브린(Ig)으로 하고, 마우스 IgG, 마우스 IgM, 마우스 IgA, 마우스 IgE, 래트 IgG, 래트 IgM, 래트 IgA, 래트 IgE, 토끼 IgG, 토끼 IgM, 토끼 IgA, 토끼 IgE, 염소 IgG, 염소 IgM, 염소 IgE, 염소 IgA, 양 IgG, 양 IgM, 양 IgA, 양 IgE 등을 들 수 있다. 이들 항체는, 시판품으로서 입수하여도, 직접 그 동물로부터 채취하여도 좋다.
다관능성 시약으로는, 항체와 결합가능한 숙신이미딜기, 피리딜 이황화물기 등과 같은 관능기를 동일분자내에 2개 이상 갖는 시약을 들 수 있다. 그와 같은 시약은, 예컨대, 식(5)에 나타내는 디티오술포숙신이미딜 프로피오네이트, 식(6)에 나타내는 비스(술포숙신이미딜) 수베레이트, 식(7)에서 나타내는 숙신이미딜 타트레이트, 식(8)에 나타내는 에틸렌글리콜 비스(숙신이미딜 숙시네이트), 식(9)에 나타내는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 등이 있다.
중합항체에 결합하는 단백질은, 항체로서의 기능을 발휘하지 않는 단백질이면 된다. 또한, 수용성이 풍부한 것이면 보다 바람직하다. 예컨대, 혈청유래의 알부민 등은, 항체의 반응을 저해하지 않을뿐더러, 높은 수용성을 갖고 있기 때문에 적합하다.
식(1)또는 식(2)으로 표시되는 시아닌계 색소는, 육안으로 확인하는 것이 용이한 적색계통의 색소이다.
식(1)로 표시되는 색소는, 공역탄소의 수가 적고, 수용성이 풍부하다. 식(2)로 표시되는 색소는, 강한 적색의 색소이며, 육안으로 가장 확인하기 쉽다.
또한, 기계로 확인하는 센서 등의 경우는, 적색으로 한정되는 일이 없고, 식(3) 또는 식(4)에 표시되는 것과 같은 청색계통의 색소이어도 좋다.
식(3) 또는 식(4)으로 표시되는 색소는, 장파장영역에서만 흡수 스펙트럼을 가지기 때문에, 시료용액내에 포함된 불순물의 영향을 쉽게 받지 않는다.
식(1)∼(4)에 있어서, X로 표시되는 할로겐으로서는, 예컨대, 불소, 염소, 취소 및 옥소를 들 수 있으며, 또한, M으로 표시되는 금속으로서는, 리튬, 나트륨 및 칼륨 등을 들 수 있다.
본 발명의 신규한 특징은 그의 구성 및 내용에 있어서, 첨부된 특허청구의 범위내에 특정하게 기재된 것과 같으며, 본 발명은 이하에 첨부된 도면과 관련된 상세한 설명에 의하여 그의 기타의 목적 및 특징이 보다 명백하게 이해가능하다.
먼저, 이하에서 식(2)으로 표시되는 시아닌계 색소의 합성경로의 일례를 나타낸다.
제 1 단계에서, 히드라지노벤젠술폰산(10)과 이소프로필메틸케톤을 산성용매에 용해하고 가열함으로써 인도레늄술포네이트(11)를 제작한다. 그리고, 인도레늄술포네이트(11)의 알콜용액에 금속수산화물의 포화알콜용액을 가함으로써, 인도레늄술포네이트의 금속염(12)을 얻는다.
다음 단계에서, 상기 금속염(12)의 유기용매용액에 할로겐화 알킬산을 가하고, 가열하여 카르복실알킬 인도레늄술포네이트의 금속염(13)을 얻는다. 할로겐화알킬산의 탄소수는, 물에서의 용해성을 생각하여, 1 내지 4가 바람직하다.
그리고 다음 단계에서, 상기 금속염(13)과 오르소개미산에틸을 염기성유기용매에 용해하고, 가열함으로써 카르복실산유도체(14)를 제작한다. 그리고, 카르복실산유도체(14)의 유기용매용액 중에, 히드록시숙신이미드와, 축합제로서 디시클로헥실 카르보디이미드를 가하여 교반함으로써, 식(2)에 나타내는 시아닌계표지색소를 최종적으로 얻는다.
식(1)에 나타내는 시아닌계 색소를 합성하기 위해서는, 상술한 오르소 개미산에틸 대신에, N-카르복시에틸-3,3-디메틸인도레닌을 사용한다. 또한, 식(3) 또는(4)로 나타내는 시아닌계 색소를 합성하기 위해서는, 각각 테트라-메톡시프로판 또는 글루타콘알데히드 테트라메틸아세탈을 사용한다.
또, 식(1) 내지 (4), 식(13) 및 식(14)에 나타내는 각 화합물에 포함되는 할로겐으로서는, 예컨대 불소, 염소, 취소, 요오드를 들 수 있다. 또한, 식(1) 내지 (4) 및 식(12) 내지(14)에 나타내는 각 화합물에 포함되는 금속으로서는, 예컨대 리튬, 나트륨, 칼륨 등을 들 수 있다.
이하에, 다관능성 시약에 의한 항체의 중합반응의 메카니즘을 설명한다.
우선, 최초반응은 식(15)에 나타낸 바와 같이, 항체에 대하여, 다관능성시약, 숙신이미딜기를 2개 이상갖는 디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트)를 배합하면, 식(16)에 나타낸 바와 같이 상기 다관능성시약의 하나의 숙신이미딜기의 에스테르결합부분에, 항체의 아미노기가 접근한다.
그리고, 식(17)에 나타낸 바와 같이, 상기 아미노기와 상기 에스테르결합부분이 반응하여, 상기 아미노기로부터 수소원자를 1개 빼앗긴다. 그리고, 이 아미노기로부터 탈리한 자유수소원자는, 상기 숙신이미딜기의 숙신이미드와 결합하고, 숙신이미드가 히드록시숙신이미드로 되어 숙신이미딜기로부터 탈리한다. 상술한 반응이 진행하는 동안, 상기 숙신이미딜기의 잔여부분과, 상기 수소원자를 1개 빼앗긴 아미노기가 아미드결합을 형성하고, 이 아미드결합에 의해서 상기 다관능성시약과 상기 항체가 결합한다.
상기 다관능성시약의 다른 숙신이미딜기에 있어서도 상기와 같은 반응이 일어나서, 식(18)에 나타낸 바와 같이, 상기 다관능성시약의 다른 분자와 다른 항체의 분자가 아미드결합에 의해 결합한다. 이 반응을 되풀이하는 것에 의해 항체가 중합된다.
또, 숙신이미딜기를 갖는 시아닌계표지색소와, 아미노기를 갖는 항체의 결합반응의 메카니즘도 상기와 동일하다.
이하에, 구체적인 실시예를 들어, 본 발명을보다 상세하게 설명한다.
(I) 중합항체의 제작
10 mg의 마우스 IgG(6.667×10-5mmol 상당)를, 1 ml의 인산완충액(이하, "PBS"라 한다)에 용해하였다. 이 다음, 35℃에서 교반하면서 디티오술포숙신이미딜 프로피오네이트(이하, "DTSSP" 라 한다)의 PBS 용액 한 방울(0.1ml)을 적하하였다. 사용된 DTSSP의 PBS 용액중에는, 4.057mg (0.006667 mmol 상당, 100등량)의 DTSSP가 포함되어 있었다.
이 다음, 35℃에서 30분간 교반한 후, 세파로스 겔(상품명:세파덱스 G25M 컬럼)을 사용하여 겔-여과하고, 약 6 ml의 다량화 IgG(IgGagg.)의 PBS용액을 얻었다. 그리고, 다량화 IgG의 IgG1분자의 농도, 즉IgGagg.를 다음과 같이 계산하여 구하였다:
그와 같이 합성된 용액을 0.5 ml 취하고, 280 nm에서의 흡광도를 측정한 결과, 흡광도는, 2.69이었다. 관측된 280 nm에서의 흡광은 IgG에 연유되기 때문에, 구하는 다량화 IgG, 즉 IgGagg. 는 다음과 같이 된다:
IgGagg. = 2.69/2.099 ×105= 1.282 × 10-5(M)
계산에 있어서, IgG의 280 nm에서의 몰흡광계수를 2.099 × 105로 하였다.
(II) 중합항체 컨쥬게이트의 제작
소혈청 알부민(이하, "BSA"라 한다)(0.001667 mmol 에 상당하는 110mg, IgG에 대하여 25등량)을 5ml의 PBS용액에 용해하고, 이것에 디티오슬레이톨(77mg)을 가하여 실온에서 30분간 교반하여 BSA를 환원하였다. 이것을 세파덱스 G25M 칼럼(2.5×30 cm)을 사용하여 겔-여과하고, 28 ml의 BSA(SH활성)의 PBS 용액을 얻었다.
그와 같이 하여 상기 (I)에서 얻어진 중합항체의 6 ml PBS를 가하고, 4℃에서 하루밤 교반한 후, 이 용액을 세파로스겔(상품명:세파크릴 S300HR컬럼)을 사용하여 여과하고, 50 ml의 중합항체 컨쥬게이트의 PBS용액을 얻었다.
(III)간접중합 표지항체의 제작
식(2)에 의하여 표시되고, 이하에서, "SLIC3"으로서 칭하는 색소 350.2 mg(0.34 mmol 상당, 총단백질량의 200등량)을 0.2 ml의 PBS에 용해하였다. 이것을 상기 (II)에서 얻어진 중합항체 컨쥬게이트용액 50 ml PBS중에 천천히 적하하였다. 단, 식(2)에 있어서의 X는 요오드, M은 칼륨, 탄소수 n은 2인 것을 사용하였다.
그리고, 4℃에서 20시간 교반한 후, 세파덱스 G25M칼럼(2.5×30 cm, 2.5×150cm)을 사용하여 겔-여과하고, 64 ml의 간접중합 표지항체의 PBS 용액을 얻었다. 그와 같이 얻어진 간접중합 표지항체에 대하여, IgG 분자당 SLIC3의 분자수를 다음과 같이 하여 구하였다:
얻어진 용액의 550 nm에서의 흡광도를 상술한 바와 같이 하여 측정하였다. 흡광도는 24.7이었다. 중합항체 컨쥬게이트는, 550 nm 에서 흡수되지 않기 때문에, 관측된 흡광은, 중합항체 컨쥬게이트에 결합한 SLIC3분자에서 연유되는 것이다. 따라서, SLIC3의 농도 [SLIC3]는, 다음과 같이 구할 수 있다:
[SLIC3] = 24.7/8.55×104= 2.889 ×10-4(M).
계산에 있어서, SLIC3의 550 nm에서의 몰흡광계수를 8.55×104으로 하였다.
따라서, 간접중합 표지항체의 하나의 IgG1 분자당 결합한 SLIC3 의 분자수는, 아래와 같이 된다:
[SLIC3]/[IgGagg.] = 2.889 × 10-4/1.042 × 10-6= 277.3 분자
계산에 있어서, 단백질에 결합한 IgG 한분자의 농도, 즉 IgGagg. 는 10 mg/64 ml (1.042×10-6M)으로 규정하였다.
(IV) 간접중합 표지항체의 평가
상기 (III)에서 얻어진 간접중합 표지항체를 면역크로마토센서에 사용하였다. 이 항체의 감도는 550 nm에 있어서의 흡광도를 측정함에 의해 조사하였다.
도 1은, 면역크로마토센서의 개략구성을 나타내는 사시도이다. 폴리염화비닐등의 플라스틱제의 판형상 지지체(1)의 위에, 제 1 유리여과지(2), 니트로셀룰로스제의 항체고정용 막(5) 및 제 2 유리여과지(6)가, 이 순서대로 배치되어 있다. 그리고, 제 1 유리여과지(2)의 항체고정용 막(5)에 접하는 측의 끝단부에는, (III)에서 얻어진 간접중합 표지항체를 함침시켜 두고, 이 부분이 표지항체 함침부(3)로 되어있다. 또한, 항체고정용 막(5)의 소정의 장소에, 색소표지중합항체와 같은 항원과 반응하는 다른 항체가 흡착에 의해 고정화되어, 항체고정화부(4)로 되어있다.
본 발명의 간접중합 표지항체의 흡광도는 상술한 구성을 가지는 면역크로마토센서를 사용하여 측정되었다. 측정의 한 방법은, 예컨대 다음과 같다:
제 1유리여과지(2)의 항체고정용막(5)에 접하는 측과 반대측의 끝단부에 시료액을 적하하면, 크로마토그래피의 원리에 의해, 시료액은 제 1 유리여과지(2)로부터 제 2 유리여과지(6)로 향하여 표지항체 함침부(3)를 통과하여 이동한다. 동시에, 표지항체 함침부(3)에 있어서, 시료액 중에 포함된 항원에 간접중합 표지항체가 결합한다. 그리고, 이 표지항체와 결합한 항원을 포함하는 시료액은, 항체고정화부(4)로 이동하고, 여기서 상기 항원은 고정화항체와 결합하여, 여기에 고정된다. 나머지의 시료액은 항체고정용 막(5)을 통과하여 계속 이동하여, 제 2 유리여과지(6)로 이동하고, 제 2 유리 여과지(6)내에 최종적으로 흡수된다.
흡광도는, 항체고정화부(4)에 파장 550 nm를 가지는 빛 L1 을 조사하고, 그 반사광 L2 을 측정함으로써 구하였다.
다음에, 색소에 식(1), (3) 및 (4)로 표시되는 시아닌계 색소를 각각 사용하는 것 외에는 상술한 바와 동일하게 하고, 간접중합 표지항체를 제작하였다. 상기와 같이 하여 제작된 항체를 면역 크로마토그래피에 도입하고, 각각 430, 640, 720 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 여기에서 사용된 색소에 있어서, 식(1), (3) 및 (4)중에 놓을 수 있는 X는 요오드, M은 칼륨, 탄소수 n은 2의 것을 사용하였다.
비교예로서, 중합항체 컨쥬게이트 대신에, 비중합항체를 사용한 이외는, 상기와 같은 방법에 의해, 색소표지항체를 제작하고, 이것을 면역크로마토센서에 사용하여, 상기와 같이 하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 각각 중합항체 컨쥬게이트를 포함하는 본 발명의 실시예에 의한 간접중합 표지항체를 사용한 경우는, 그 흡광도가 약 0.8이며, 비중합 항체만을 포함하는 비교예의 표지항체를 사용한 경우의 흡광도는 약 0.08이었다. 이 결과로부터, 본 발명의 간접중합 표지항체의 감도는, 비교예의 감도의 약 10배라고 말할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 간접중합 표지항체는, 항원과의 반응부위를 다수 갖고 있고, 또한 항체 1 분자당의 색소분자의 표지수도 많은 점에서, 고감도에서의 면역적 검출이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 간접중합 표지항체는, 예컨대 이 간접중합 표지항체를 면역 크로마토그래피에 도입하면, 고감도의 센서를 제작하는 것이 가능해진다.
본 발명은 현재의 바람직한 실시예의 관점에서 기술되었으나, 이러한 개시내용이 한정적으로 해석되어서는 안되는 것임은 이해가능하다. 상술한 개시내용을 일독한 후에는, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어서 다양한 변경 및 변형이 가능함을 알 수 있다. 따라서, 첨부된 특허청구의 범위는 본 발명의 요지 및 범위내에 속하는 모든 변경 및 변형사항을 포괄하는 것으로 의도된 것이다.

Claims (3)

  1. 항체를 표지하기 위하여 항체 및 색소를 포함하여 구성되며, 상기 색소는 식(1) 내지 (4)중 어느 하나로 표시되는 시아닌계 색소인 간접중합 표지항체로서:
    (여기에서, R1및 R2는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알카리 금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)
    상기 항체는 다관능성 시약을 통해 중합되고 이황화물결합에 의해서 단백질과 결합되어 중합항체 컨쥬게이트를 형성하며, 상기 중합항체 컨쥬게이트는 상기 시안계 색소로 표지되는 간접중합 표지항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 시아닌계 색소내에 존재하는 숙신이미딜기 유래의 아실탄소와 상기 중합항체 컨쥬게이트내에 존재하는 아미노기 유래의 질소와의 공유결합을 통하여 상기 시아닌계 색소의 골격이 상기 중합항체 컨쥬게이트에 결합하고 있는 간접중합 표지항체.
  3. 중성 또는 약알카리성의 인산완충액속에서 다관능성시약을 사용하여 중합된 항체를 형성하는 항체중합공정과,
    중성 또는 약알카리 성의 인산완충액속에서 단백질을 환원하는 단백질 환원공정과,
    상기 중합된 항체와 환원된 단백질을 반응시켜 중합항체 컨쥬게이트를 형성하는 공정, 및
    식(1) 내지 (4)중의 어느 하나로 표시되는 시아닌계 색소와 상기 중합항체 컨쥬게이트를 반응시켜 상기 중합항체 컨쥬게이트를 표지하는 공정을 포함하여 구성되는, 청구항 1 에 따른 간접중합 표지항체의 제조방법.
    (여기에서, R1및 R2는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알카리 금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)
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