KR19990087546A

KR19990087546A - 하나 이상의 면역독소로 수집된 세포군에 있는 표적 세포를 괴사시키는 방법

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Publication number: KR19990087546A
Application number: KR1019980706983A
Authority: KR
Inventors: 군나르 크발하임; 시리 주엘; 멩 유 왕; 올라브 엥게브뢰텐; 오이스타인 포드스타드
Original assignee: 오이스타인 포드스타드
Priority date: 1996-03-13
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 1999-12-27
Also published as: NO984175D0; NO984175L

Abstract

본 발명은 말초혈액으로부터 유핵 응집된 세포 또는 CD34⁺또는 상기 유핵된 세포 또는 골수 아스피레이트로부터 선택된 유사한 초기 모세포를 포함하는 세포군에 있는 원하지 않는 표적 세포를 과사시키는 방법에 관한 것으로서 이 방법에서는 세포군이 선택적으로 악성 종양세포를 괴사시키는 2개 이상의 면역독소에 시험관내 또는 생체내에서 노출되는 것을 기술하고 있다. 또한 본 발명은 면역독소의 혼합물, 혼합물의 용도 및 본 발명 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

하나 이상의 면역독소로 수집된 세포군에 있는 표적 세포를 괴사시키는 방법

본 발명은 두 개 이상의 면역독소 조합물에 세포군을 노출시키므로서 표적 세포에 대한 세포군의 선택적인 정화에 관한 것이다.

소위 자가 유래 줄기 세포 이식체는 빨리 비-기능성 골수의 기능을 회복시키거나 재장치 후 보다 긴 시간에 걸쳐 수집되는 환자의 혈액에 있는 세포를 회복시키기 위하여 환자를 예비치료한 후 적당한 양의 미성숙 모세포 혈액과 면역세포를 함유하는 암 환자의 혈액 또는 골수로부터 분리된 세포를 포함한다.

항체를 사용하는 자가유래 조혈 이식체의 정화는 이식체가 비선택적인 골수 샘플을 나타낼 때 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 정화는 Myklebust, A.T, Godal, A., Juell, S. 와 Fodstad, O. 의 "Comparison of two antibody-based methods for elimination of breast concer cells from human bone marrow". Cancer Res. (USA) 1994, 54/1(209-214) 및 Myklebust, A.T., Godal, A., Pharo, A., Juell, S. 및 Fodstd, O. "Eradication of small cell lung cancer cells from human bone marrow with immunotoxins", Cancer Res. (USA) 1993, 53(16), 3784-88에 발표되어있다. 이들 발표는 모두 항체가 독소에 콘쥬게이트되는 면역독소를 사용한다. 그원리는 세포 현탁액을 환자에게 재주입하기 전에 수집된 골수 세포로부터 악성 세포를 괴사시키는 것이다.

최근에 그 원칙이 사실상 정반대인 방법이 발전되고 있다. 소위 줄기세포 이식을 사용하여 발명자는 세포가 환자에 재 장치된 후 정상적인 골수 기능을 회복할 수 있는 정상적인 세포의 아족을 혈액 또는 골수로부터 명확히 선택하려고 노력한다. 이들 "줄기 세포"는 혈액과 면역 세포에 대한 가장 미성숙한 모세포와 보다 분별화된 세포의 혼합물로 이루어진다. 이러한 세포의 수집은 하루 이상 걸리는 과정인 소위 말초 혈액의 아파레시스(apharesis), 또는 본 기술분야에 알려진 다른 기술을 사용하는 혈액 또는 골수로부터 CD34⁺세포(미성숙한 모세포)의 면역 흡수/선택에 의해 수행될 수 있다.

Stray, KM. 등의, "Purging tumor cell from bone marrow or peripheral blood using avidin, biotin, immuno adsorption" In : P.G.Adrian, G. Samuel 과 A. W-W. Diana(Eds), Advances in bone marrow purging and processing, pp. 97-103, Orlando : Willelis Inc., 1994는 골수 세포의 정화 또는 말초 혈액으로부터의 아파레시스 생성물을 기술하고 있다. 이 과정은 임파종을 가진 환자와 유방암을 가진 환자를 치료하는데 수행된다. 이 방법은 소위 아비딘 칼럼을 갖는 B-세포 또는 유방암 세포의 정제전에 CD34⁺세포에 대한 강화단계를 포함한다. 이 경우 세포 현탁액이 초기에 유방암 세포에 결합하는 기본 항체와 함께 배양되고, 세포 현탁액이 세척된후 기본 항체에 결합하는 항체와 한번 더 배양되는 간접적인 정화가 수행된다. 이 랫트 항체는 비오틴화, 즉 아비딘에 강하게 결합하는 분자에 연결된다. 세포 현탁액이 최종적으로 아비딘 콘쥬게이트된 비드를 갖는 칼럼에 장전될때 종양세포는 기본 항체-비오틴화 제 2항체-아비딘을 갖는 세포들 사이의 결합에 의해 포획된다. 이러한 시스템을 사용하는 정화 결과는 악성 종양세포의 기껏해야 3.2로그 감소였다. 이 원리는 세포 현탁액이 칼럼에 장전되기 전에 항체와의 배양 및 2회 세척을 포함하는 몇 단계로 처리되어야 하기 때문에 매우 시간 소비적이고 귀찮다. 따라서, 줄기세포의 손상을 피하기 어렵고 또는 칼럼에 있는 줄기세포의 비특이적포획이 있어서 그 결과 정상적인 골수 기능의 회복을 위해 결정적인 세포의 불행한 손실을 가져온다.

Tyer, C. L.등, "유방암 세포는 면역 자기 기술을 사용하여 말초 혈액 모세포로부터 효과적으로 제거된다". International Society for Hematotherapy and Graft Engineering, Orlando FL, 1993의 제 1모임에 대한 요약서는 상기 Myklebust등의 발표에 사용된 것들과 유사한 면역자기 방법을 기술하고 있다. 그러나, 이 방법 말초 혈액세포에 대하여 사용된다. 이 원리는 또한 전체적으로 면역독소의 사용과 다르고 제거의 효율성은 모델 실험에서 악성 종양 세포의 3.3-4.8로그 감소로 다양하다. 요약서는 기본항체의 배양, 세척 및 기본항체에 결합하는 항체에 결합된 비드와의 새로운 배양을 갖는 간접 시스템의 어떤 추가 사용도 언급하지 않았지만 이는 당연한 가정이다. 또한, 이 과정은 추가적이고 가능한 정상 세포의 외상성 치료를 포함하고 이 과정은 시간을 요구한다. 효과는 제한되는데 요약서는 CD34⁺세포 그자체의 선택이 시간과 노동력을 요구하므로 본 발명방법에서 주요 문제가 되는 CD34⁺세포군의 정화에 관해 어떤 것도 언급하지 않았다. 따라서, 대부분의 경우 면역자기 원리는 CD34⁺세포 선택에 사용되는데 이 실시예에서 이는 목적물을 정화하기 위해 하나 또는 2개의 면역자기 단계로 이어진다. 따라서, 세포파괴와 세포손실에 상당한 위험이 있어서 이 방법은 긴 지속 과정을 요구하고 고 비용을 포함한다.

이식을 위해 줄기세포를 분리함에 있어서 주 목적 중 하나는 환자에게 재장치될 놓여진 세포가 이식물이 어떤 악성종양 세포도 함유해서는 안되는 방법으로 선택적으로 분리된다. 선행기술에서는 줄기세포의 이러한 제조가 놀랍게도 상당 수의 시험된 경우에서 악성 종양 세포를 포함하는 것으로 최근에 나타났다. 지금까지 이러한 이식물에서 선택된 악성 세포를 제거하거나 괴사시키기 위해 매우제한 된 노력이 이루어져 왔다. 이것은 부분적으로 본 기술에 숙련된 필요를 알지못했고 또한 실제적으로 알려진 방법은 특이적이지않고 따라서 취약한 줄기세포를 죽이거나 제거하는 것으로 예상되기 때문이다. 더욱이, 환자로부터의 골수 또는 유동 말초 혈액의 공급은 단순하지 않고 비제한적이며 줄기세포 이식물의 그러한 정화 방법은 짧은 기간동안 수행되어야 하고 정상적인 세포 캔에 손상 및 그것의 손실을 피하기 위해 간단해져야 한다. 따라서, 상기에서와 같이 줄기 세포 이식물을 사용하는 이유는 부분적으로 이식물이 완전히 암 세포가 없어야되고, 부분적으로 골수 기능의 재형성이 비선택적 골수로의 이식후 보다 빠르기 때문이다. 이것은 취약한 정상 줄기세포를 손상되지 않게하고 줄기세포 분리과정과 조합하여 수행하는데 실시되는 방법을 발명하는데 절대적으로 필요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 단점을 포함하지 않는 줄기세포이식체를 정화하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 첨부된 청구범위에 의해 특징되는 본 발명에 의해 얻어진다.

본 발명은 고체 종양의 경우 수집된 줄기 세포군을 정화하는 것에 관련한 것으로서 이 방법에서 세포군은 박테리아성 독소에 연결된 2개이상의 항체의 조성물에 노출된다. 사용된 항체는 표적 세포 관련 항원으로 향해진다.

하기에서 본 발명은 유방암 세포를 제거하기 위해 말초 혈액으로부터 수집된 줄기세포 이식물을 정화하는 예를 사용하여 보다 상세히 기술된다.

세포를 수집하기 위해 알려진 기술은 혈액 또는 골수로부터 말초 혈액 줄기 세포(PBSC) 또는 CD-34⁺세포의 면역-흡착/선택을 포함한다. 그러나, 종양 세포에 대한 이들 세포군을 정화하기 위한 무해하고 충분히 효과적인 기술은 알려져 있지 않다. 이들 미성숙 세포가운데 조차도 선행 기술에 따르면 CD34 수용체를 소유해서는 안되는 악성 종양세포가 있는 것이 명백하다. 중요하게도, 하기 기술된 발명은 놀랍게도 정상적인 모세포에 대한 독성없이 암 세포를 정화했다.

말초 혈액으로부터 줄기 세포 이식체를 수집하기 전에 본 기술분야에 알려진 방법에 의해 화학요법 또는 성장 인자로와의 치료를 사용하므로서 골수로부터 줄기 세포를 이동시키는 것이 필요하다. 줄기세포를 수집하는 것은 어떤 종류의 세표가 바람직한지에 따라 하나 또는 몇가지 방법에 따라 수행될 수 있다. 하나의 방법으로 말초 혈액 줄기 세포가 수집된다. 이는 많은 용량의 화학요법과 전체 신체 방사선을 받은 후 10일과 11일 G-CSF 투여(10㎍/kg/일)로 백혈병을 겪는 환자에게 계획을 잡아 수행될 수 있다. 혈액 유속은 CS-300Plus 혈액 세포 분리기(미국, 일리노이주, 디어필드에 소재하는 Baxter Healthcare Corporation, Fenwal Division)를 사용하여 예를들면 70㎖/분으로 고정될 수 있다. 이러한 과정동안 처리된 혈액의 평균 용량은 이중-구경 중앙 정맥 카테테르에 대하여 21/2시간 동안 약 10ℓ일 수 있다. 50㎖의 PBSC는 수집되어 혈소판을 제거하기 위해 Cobe processor 2991에서 포스페이트 완충 염(PBS), 1% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 세척될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위해 세포의 농도(2-4×10¹⁶/아파레시스)는 면역독소로의 네가티브 선택(정화)을 위해 1×10⁸/㎖로 조절될 수 있다.

CD-34⁺세포가 요구될 경우 이것은 ISOLEX50 또는 ISOLEX300(Baxter)로의 포지티브 선택에 의해 얻어질 수 있다. 이 방법에서 약 4×10¹⁰-8×10¹⁰세포일 수 있는 아파레시스 또는 골수로부터의 생성물이 함께 혼합되어 약한 회전기에서 30분동안 4℃에서 0.5㎍/ℓ×10⁶세포에 있는 예를들면 항-CD34⁺-모노클로날 항체 9C5와 배양될 수 있다. 처리된 세포는 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 Cobe Processor에서 1% HSA를 갖는 PBS로 세척된다. DYNAL 비드 M-450 이 30분동안 4℃에서 1 유핵 세포당 0.5 비드로 CD34⁺프랙션에 첨가된다. 비표적된 세포로부터 로제테(orsettes)의 자성분리가 PBS, 1% ASA로 결합되지 않은 세포를 2 또는 3번 세척하므로서 수행될 수 있다. CD34⁺세포는 실온에서 15분간 200pKat/㎖의 최종 농도로 예를들면 ChymoCell-R(Chymopapain)을 첨가하므로서 Dynal 비드로부터 방출될 수 있다. 따라서 CD34⁺세포는 5% 소듐 시트레이트에서 PBS로 세척하므로서 수집될 수 있다. 줄기 세포/초기 모세포를 선택하기 위한 다른 과정도 알려져 있다.

유방암 세포주와 종양물질에서 몇가지 항체의 결합 프로파일은 다른 인간들에 의해 시험되고 부분적으로 본 발명자들에 의해 확인되었다. 많은 퍼센트의 유방암 세포에 결합하고 혈액과 골수에 있는 중요한 미성숙 정상적 세포에는 결합하지 않는 항체는 슈도모나스 외독소 A(Pseudomonas exotoxin A)(CPE)에 콘쥬게이트되어 배양물에 있는 유방암 세포를 괴사시키는 능력이 주로 콜로니 제조 평가에서 시험되었다. 항체의 결합 프로파일을 기초로 본 발명자는 모두 5개의 다른 면역독소를 제조했다 :

1. MOC31-PE : 이 콘쥬게이트(conjugate)는 매우 높은 퍼센트의 모든 유방암 세포에 결합하고 모델 실험과 정상적인 조혈 모세포에 대한 약간의 독성을 갖는 실제적인 농도에서 매우 효과적이었다.

2. NrLu10-PE : 이것은 상기한 바와같은 항원과 또다른 에피토프에도 결합한다. 이는 MOC31-PE보다 약간 덜 활성적이다.

3. BM7-PE : 이것은 주로 유방암 세포에서 발견되는 점액질의 단백질 부분에 결합한다. 항원은 전부는 아니지만 많은 비율의 유방암 세포에 존재한다. 면역독소는 암 세포에 대해 높은 특이적 활성을 나타내지만 두 개의 상기 면역독소 같이 효과적이지는 않다.

4. BM2-PE : 이것은 BM7-PE와 같은 항원상의 에피토프를 함유하는 당에 결합한다. 이 면역독소는 정상적인 세포에 매우 낮은 독성과 동시에 BM7-PE와 거의 같은 효과를 나타낸다.

5. MLuC1-PE : 이것은 전체적으로 다른 항원, Lewis^y-항원에 결합한다. 면역독소는 상기 하나보다 약간 덜 활성적이고 또한 정상적인 세포에 중간의 독성을 나타냈다.

1,2,5에 따른 면역독소는 개별적으로 그리고 암세포에 대한 정규 골수 샘플을 정화하는 모델 실험과 조합하여 시도되었다(Myklebust et al., 암 연구, 1994). 이미 언급된 바와같이 정상적인 골수 기능을 회복하기 위한 보다 짧은 간격 (즉 안전한 과정) 때문에 줄기 세포이식체를 사용하는 것이 매우 유익하다. 그러나, 기대된 것에도 불구하고 이러한 이식체는 종양 세포로 오염되고 정상적인 세포에 중대한 영향없이 이식체에서 모든 암 세포를 괴사시킬 수 있는 면역독소를 적용하는 것이 필요하다.

MLuC1-PE보다 유방암에 보다 특이적이고 유방암 정화에 보다 우수하게 자리잡은 면역독소의 조사가 개시되어 있다.

이 조사동안 MOC31-PE 와 BM7-PE의 조합이 놀랍게도 단독으로 사용된 상기 각각의 면역독소의 합계보다 더 효과적이라는 것이 발견되었다. 이것은 하기 표 1에서 입증된다. 항체와 세포주 사이의 결합연구는 조합물이 단일 항체보다 강한 결합을 가져온다고 나타났다.

MOC31는 대부분의 유방암 세포, 또한 덜 분별화된 것에 결합한다. BM7은 유방암 세포의 상당한 프랙션에서 발현되고, 또한 세포에서 보다 분별화된 세포상에서 발현되는 점액질 항원을 인식한다. NrLu110 과 BM2는 MOC31과 BM7 각각에 의해 인식된 항원에 결합하는데 생각으로는 그들이 MOC31과 BM7의 조합물에 어떤 것을 첨가하는 것이 매우 가능하지 않다. MLuC1-PE는 상기 언급된 면역독소와 다른 항원에 결합한다는 점에서 이론적으로 관심을 두었다. 그러나, MLuCI-PE는 정상적인 세포에 독성이었으며 모델 실험은 조합물에 이것을 포함하는 것에 따른 어떤 명백한 잇점도 나타내지 않았다.

하기 실험에서, 말초 줄기 세포이식체(아파레시스 생성물)의 정화가 기술된다. 또한, 본 발명자들은 종양세포가 CD-34⁺세포의 면역자성 포지티브 선택전에, 수집된 말초 줄기 세포 또는 골수에 첨가되는 경우의 실험에서 MOC31-PE와 BM7-PE 조합물을 사용하여 몇가지 실험을 수행했다. 이러한 실험으로부터의 결과는 표 2에 도시된다. 2개의 다른 세포주에서 CD34⁺세포자체의 포지티브 선택(어떤 다른 형태의 정화 없이)은 원래 수집된 세포군으로부터 3.8로그 이하의 종양세포를 제거하는 것으로 입증되었다. 다른 실험에서 CD34선택의 "정화" 선택은 또한 문헌에 언급된 2-3로그로 다양하다. 면역독소 처리가 포지티브하게 선택된 CD34군에 사용될 때 전체 정화효과는 두 세포주에서 4.7로그(표 2)이상이었다. 4.7로그 이상이라는 것은 이 경우에서는 모든 검출가능한 종양 세포가 제거되었다는 이것을 의미한다. 다른 실험에서 본 발명자들은 면역독소로 1시간 처리 후 CD34⁺개체군으로부터 취한 종양세포와 정상적인 모세포를 개별적인 평가에서 성장시켰다. 이들 실험에서 본 발명자들은 종양세포가 처리 후 곧 괴사된 반면에 정화되지 않은 대조군에 있는 종양세포는 성장하여 콜로니를 생성했으며 세포-부착 형 배양물에서 증식했다는 것을 관찰했다. 정상적인 줄기세포는 3개의 다른 시험 시스템에서 정상적인 모세포의 생존이 단지 조금 감소되는 정도로 처리에 의해 영향 받지 않는다. 표 3은 CD34⁺세포가 37℃에서 2시간 동안 면역독소와 함께 배양되는 유사한 실험을 나타낸 것으로서 이것은 줄기 세포가 기본적으로 면역독소 처리로 생존한다는 것을 입증한다.

PM1 유방암 세포를 괴사시키는 PE를 포함하는 면역독소의 효과
MAbs를 갖는PE-면역독소	실 험	하기의 면역독소 농도에서 로그 세포 괴사
		0.01 ㎍/㎖	0.1 ㎍/㎖	1.0 ㎍/㎖
		평균±s	평균±s	평균±s
BM2BM7MLuClMOC31BM2+MOC3lBM7+MOC3lMLuCl+MOC3lBM2+BM7MLuCl+MOC3l	33334442	0.01±0.010.13±0.110.10±0.130.81±0.100.20±0.260.16±0.260.14±0.360.15±0.2-1.55±0.6	0.27±0.090.64±0.150.36±0.192.83±0.29> 5> 5> 5> 5	2.38±0.382.55±0.402.10±0.68> 5> 5> 5> 5> 5

말초혈액 줄기세포에 대해 혼합된 (1%) PM1과 T-47D 유방암 세포로의 모델 실험에서 CD34⁺단독 및 항-유방암종 MOC31과 BM7 면역독소와 조합된 CD34⁺의 포지티브 면역자성 선택의 정화효과
방법	PM1	T-47D
방법	수행된 실험번호	감소된 세포 수	괴사된 로그 세포	첨가된 실험 번호	감소된 세포수	괴사된 로그 세포
CD 34⁺세포의 포지티브 선택CD 34⁺세포의 포지티브 선택에 이은 IT처리	22	5×10⁴5×10⁴	3.8±0.04>4.7	22	5×10⁴5×10⁴	3.7±0.04>4.7

a. 평판배양 효율을 고려할 때 처리에 의해 죽은 세포수의 관찰된 콜로니수로부터 계산된다.

b. 각각 세번씩 수행된 독립적인 실험에서 얻어진 결과의 평균

c. MOC3l-PE와 BM7-PE 면역독소는 각각 1㎍/㎖의 농도로 사용되었다.

이동된 말초 혈액으로부터 선택된 CD34⁺세포에서 콜로니의 생존에 대한 IT 효과. 1×10⁵CD34⁺세포는 37℃에서 2시간동안 면역독소와 함께 배양되어 CFU-GM과 CFU-GEMM (5×10³/디쉬) 배양물에 접종되고 실시예에서 "물질 및 방법"에 기된 바와같이 평가되었다.
처리	각의 IT의농도(㎍/㎖)^a	CFU-GEMM	BFU-E	CFU-GM
처리	각의 IT의농도(㎍/㎖)^a	콜로니의 수평균±SD^b	%^c	콜로니의 수평균±SD^b	%^c	콜로니의 수평균±SD^b	%^c
없음MOC3l-PE+BM7-PE	1.02.5	456±118432±56412±118	(100)(95)(90)	193±31172±31166±14	(100)(89)(86)	85±665±645±8	(100)(77)(53)

본 발명에 따라 상피 세포에 의해 발현되고 각각 슈도모나스 외독소 A 박테리아 독소와 조합된 항원을 향하는 두 항체의 사용은 말초혈액과 골수로부터의 수집물에 있는 정상적인 줄기 세포에 어떤 손상도 가하지 않고 악성 종양세포를 괴사시켰다는 것은 매우 놀라운 것이다. 세포가 박테리아 외독소에 의해 괴사될 수 있고 괴사 효과는 표적 세포에 의해 발현되는 에피토프로 향하는 항체에 독소를 결합시키므로서 증가된다는 것은 본 기술 분야에서 알려져 있다. 그러나, 만약 미성숙 세포가 하나 이상의 면역 독소에 노출된다면 이 처리는 세포군에 있는 정상적인 세포를 괴사시킬 충분한 가능성이 있다고도 알려져 있다. 더욱이, 이들 정상적인 줄기 세포는 기계적인 외상과 온도변화를 수반하는 생체 외 처리에 민감하다. 본 발명에서 세포군, 예를들면 말초 혈액으로부터 수집된 줄기세포 이식체는 각각 PE에 콘쥬게이트되는 2개의 항체 조성물에 노출된다. 면역독소 중 하나가 매우 활성적이기 때문에 박테리아성 독소에 결합된 2개 항체 조성물을 사용하므로서 제거 효과는 놀랍게도 면역독소가 개별적으로 사용될 때의 전체효과보다 크게 나타나는 것으로 입증되었다. 상승효과는 PM1 인간 유방암 세포를 괴사시키는데 있어서 슈도모나스 외독소 A에 결합된 항체 BM7과 MOC31을 사용하는, 명세서의 표 4에서 입증된다. 면역독소는 박테리아성 독소인 슈도모나스 외독소 A에 결합된 종양 관련 항원에 대해 향하는 모든 모노클로날 항체이다. 항체 중 하나는 대부분의 암종세포 대부분에 의해 발현되고 따라서 암종 (예를들면 유방암, 결장직장암, 전립선암, 난소암, 폐암 및 췌장암)을 포함하는 모든 경우에 사용될 수 있는 GA 733-2 유전자에 의해 코딩된 상피 항원을 인식한다. 다른 항체는 다른 것에 대해 하나의 암종 형태와 약간 다른 점액질, 점액 단백질로 향해진다. 일반적으로 항원은 유전자 MUC-1, MUC-2 및 MUC-3에 의해 엔코딩된 단백질로서 기술될 수 있다. 상기 언급된 모노클로날 항체의 예는 MOC31 과 BM7이다.

항체와 독소의 콘쥬게이션은 다른 알려진 방법으로 수행될 수 있다.

박테리아 외독소에 결합하기 위한 조성물에서 2개 이상의 항체 선택은 항체 결합이 정상세포에서가 아니라 대부분의 표적 세포에서 발현된 에피토프로 향해지는 방법으로 수행되었다. 선행기술에서의 문제는 악성 종양세포와 정상적인 혈액세포 모두 세포표면에서 공통의 항원을 발현시키는 것이다. 본 발명의 실시예에서는 2개의 모노클로날 항체 MOC31 과 BM7이 사용된다. 이들 항체의 전자는 말초 혈액에서 발견된다면 악성인 상피세포로 향해진다. 항원(전체 단백질)은 유전자 GA 733-2에 의해 엔코딩된다. 그러나, 이 항원은 몇개의 에피토프를 갖는데 이것은 가장 충분히 발현된 에피토프를 표적으로 하는 것이 중요하다.

BM7 항체는 MUC1 유전자에 의해 발현된 항원의 에피토프로 향하는 항체 중 하나이다. 몇개의 유전자가 유사한 항원 (예를들면MUC2, MUC3)을 엔코딩한다.

박테리아성 독소인 슈도모나스 외독소 A는 정상적인 줄기 세포와 악성종양세포에 상대적으로 중간의 독성 효과를 갖는다. 그러나, 표적 세포에서 발현된 항원으로 향하는 항체에 연결될 때 이들에 대한 독성효과는 매우 뚜렷해진다. 표 5에서는 본 발명에서 따른 면역독소의 혼합물이 60분 이하의 배양시간 후 조차에서도 선행기술에 알려진 다른 방법 보다 훨씬 높은 정도의 효율성으로 T-47 D세포, MCF7 세포 및 PM1세포를 괴사시킨다. 따라서, 이들 2개의 면역독소의 조합은 선택적인 효율성, 단순성 및 정상적인 모세포에 대한 단지 약간의 독성 때문에 예상될 수 있는 것에 관련하여 놀라운 결과를 제공한다.

3개의 다른 항체에 콘쥬게이트된 슈도모나스 외독소 A로 이루어진 몇개의 면역독소를 사용하는 것이 알려져 있다. 마이클버스트(Myklebust)등 1993과 1994를 참조. 항체 중 하나(MOC31)가 비선택적인 골수 세포를 정화하기 위해 본 발명과 유사한 방법으로 사용되었다. 그러나, 사용된 다른 항체들은 그들 중 하나가 MOC31과 같은 항원으로 향하고 다른 것(MLUCI)이 정상적인 세포와 교차반응하므로서 이 항체에 결합된 면역독소가 쉽게 대부분의 미성숙 줄기 세포에 독성을 나타낼 수 있기 때문에 다른 것들 가운데서 최적인 것으로 보이지 않는다. 본 발명에서 줄기 세포 제제를 정화할 때 본 발명자들은 MOC31의 효과에 추가되는 또다른 모노클로날 항체를 제조하고 면역독소로서 사용된 이들 2개의 항체조합물이 충분히 놀라운 결과를 제공하는 것을 관찰했다.

기술된 면역독소의 높은 특이적 활성때문에 다른 형태의 암종으로 고통받는 환자의 생체내 치료를 위한 혼합물을 투여하는 것이 가능해 보인다. 암 질병이 제한된다면 예를들면 골수로 질병의 확산이 입증되었을 때 이들 각각 또는 혼합물을 정맥내 주입 또는 투여하 것이 가능할 것이다. 복부체액(복수증) 또는 늑막 유출을 갖는 질병의 확산이 있는 환자에게 면역독소를 단독 또는 조합하여 주입하는 것이 또한 가능하다. 세 번째 가능성은 중앙 신경 계통에 암 확산을 갖는 환자를 치료하는 것이다. 이 경우 면역독소는 종양 조직, 척수액 또는 뇌에 혈액을 공급하는 동맥에 직접적으로 주입될 수 있다.

MOC13-PE가 작은 세포 폐 암에 대하여 유막 종양에 사용되어 온 것을 제외하고 생체내에서 이들 면역독소를 사용하는 것은 알려져 있지 않다. BM7-PE는 문헌에 전혀 기술되지 않는다.

생체내에서 면역독소를 사용할 때 중요한 문제는 그들의 반감기가 매우 짧고 즉 농도가 종양에서 적당하게 높아지기 전에 면역독소가 파괴되어 혈액으로부터 제거된다는 것이다. US PS 5,322,678에서 모간(Morgan)등은 생체내에서 짧은 반감기를 갖는 문제를 감소시키기 위해 면역독소의 항체 부분의 변성에 대하여 특허받았다. 본 발명자는 상기에서 수행되거나 알려져 있지 않지 않은 과정인, 독소 부분의 유사한 변형을 제시한다.

실시예 1

면역독소를 갖는 말초 혈액 줄기 세포 수집물로부터의 유방암 세포의 효과적인 정화.

서론

자가 유래 조혈 줄기 세포 지지물로의 높은 용량의 화학방사선 요법이 다양한 악성종양을 갖는 환자를 치료하기 위해 주파수를 증가시키면서 사용된다(1,2). 이 접근이 성공적이지 않은 경우에 대부분의 일반적인 이유는 독성, 감염 및 주입의 결핍보다 질병보다는 질병의 재발 때문이다(3). 중요하게, 고 복용량 치료를 받는 환자에서 클론원성 종양 세포를 함유하는 자가 이식체의 재주입은 재발시키고 결과에 영향을 끼치는데 기여할 수 있다는 확고한 증거가 있다(4). 자가이식된 세포의 유전자-마킹 연구는 재주입된 골수(BM)에 남아 있는 종양 세포가 질병의 재발에 기여한다는 것을 나타낸다(5). 이 결과는 또한 효율적인 BM 정화가 질병 없는 생존을 개선시킨다는 것을 나타내는, 소낭 임파종을 갖는 환자에게서의 결과에 의해 지지된다(6).

민감성 면역세포 화학기술을 사용할 때 종양세포 오염이 고 복용량치료를 받는 유방암 환자의 37-62% 범위에서 조직학적으로 정상적인 골수 자가이식체에서 관찰될 수 있다(7). 조혈성장 인자와 화학요법으로의 예비처리 후 아파레시스에 의해 수집된 말초 혈액 줄기 세포(PBSC) 자가이식체는 이들 생성물이 종양세포를 함유할 낮은 가능성을 가질거라는 믿음의 증가 정도로 사용된다. 그러나, 최근에 종양세포 병발(involvement) BM수집물과 비교할 때 PBSC 자가 이식체에서 덜 대규모일지라도 악성 종앙 세포는 여전히 종종 유방암 환자로부터의 이동된 PBSC 수집물에서 발견된다고 나타났다(4,7). 또한, 최근의 발견은 화학요법 및/또는 성장요소는 골수에서 먼저 검출가능한 암 세포가 있거나 없는 환자들의 말초혈액내로 종양세포를 이동시켜서(7,8) 그 결과 PBSC 이식체에서 종양세포 오염의 위험을 증가시키는 것으로 나타난다.

악성 종양 세포의 재주입을 피하기 위해 유방암 세포의 PBSC 자가이식체의 시험관내 정화가 요구된다. 여기에서 본 발명자들은 아파라시스 생성물에 직접적으로 첨가되는 ITs와의 60분 배양 과정이 5로그 이상의 종양세포를 선택적으로 괴사시킨다는 것을 입증하는 실제적이고 빠른 정화 방법을 보고한다.

물질과 방법.

세포주. PM1 유방암 세포주를 진행된 질병을 가진 환자로부터 나온 복수액으로부터 실험실에서 정립했다. MCF7과 T-47D 세포주를 American Type Culture Collection(메릴랜드, 로크윌)(각각, ATCC HTB 22와 ATCC HTB 133)으로부터 얻었다. 세포를 10%가 열 불활성된 태아 송아지 혈청(FCS)과 항체(100μ/㎖의 페니실린, 10㎍/㎖의 스트렙토마이신)가 보충된 RPMI 1640 배지(RPM 1)에서 5% CO₂분위기하의 37℃에서 배양했다. 배지와 보충물을 GIBCO(영국, 파이슬리)로부터 구입했다.

인간 골수와 말초 혈액 모세포. BM세포를 건강한 자원공여자로부터 얻었다. BM 단핵 세포(MNC) 프랙션을 Lymphoprep(노르웨이, 오슬로, Nycomed Pharma)에 의해 획득하고 실험에 사용하기 전에 포스페이트 완충염(PBS)으로 2번 세척했다. PBSCs를 비-호지킨(Hodgkin) 임파종 환자로부터 제조했다. PBSCs를 이동시키기 위해 환자를 화학요법과 조혈성장인자 (G-CSF, Neupogen, 스위스, 바젤, Amgen/Hoffman-La Roche)으로 예비처리했다. 말초혈액에서 CD34⁺세포의 수가 높을 때인 화학요법 11-12일후에 높을 때 줄기세포를 CS-3000 Plus 혈액 세포 분리기(일리노이, 디어필드, Fenwal Division, Baxter Heathcare Corp.)를 사용하여 수집했다.

독소, 항체 및 면역독소의 구축. 항-MUC1(9) 항체 BM7(IgG1)을 에스. 카울(S.Kaul) (독일, 하이델베르그 대학, 프라우엔클리닉)로 부터의 증여받았고, 항-EGP2(10) 항체 MOC-31(IgG2a)은 엘 디.레이(L. de Leij) (네덜란드, 그로니젠 대학)과 MCA디벨로프먼트(그로니젠)에 의해 제공받았다. PE는 Swiss Serum and Vacciene Institute(스위스, 베른)으로부터 얻었다. 각각의 항체를 상기 기술된 바와같이 설포-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(일리노이, 록포드, 피어스)와 형성된 티오에테르 결합을 거쳐 PE에 콘쥬게이트시켰다.

면역독소 처리. 클론원성 유방암세포 생존물에 대한 IT 처리 효과를 각 실험에 대하여 나타낸 바와같이 시간을 변화시키면서 약하게 교반(궤도배양기상에서 100rpm, 영국, 레이세스터셔, 갈렌캠프))하면서 37℃에서 ITs의 표시된 농도로 FCS와 함께 RPMI에서 2×10⁶지수함수로 성장하는 종양 세포를 배양시키므로서 시험했다. 세포를 클론원성 평가에 접종하기 전에 1% FCS를 갖는 PBS에서 2번 세척했다.

어떤 실험에서, 10% 종양세포를 BM단핵 세포 또는 PBSCs에 혼합시키고 세척된 ITs와 함께 배양한 다음 그 효과를 종양세포 또는 조혈 모세포 클론원성 세포 생존물에 대해 평가했다.

종양과 조혈 모세포에 대한 콜로니 평가. 사용된 종양세포에 대한 클론원성 연질 아가르 평가는 상기에 기술되었다(12). 세 개의 배양물을 5% CO₂, 5% O₂와 90% N₂에서 14일동안 37℃에서 배양하고 50세포 이상의 콜로니를 Zeiss 입체 현미경으로 세었다.

처리 및 비처리된 정상적인 모세포의 클론원성 능력을 ㎖당 5×10⁴PBSCs가 IMDM 배지(GIBCO)에 있는 표준 메틸셀룰로오스 배양물(HCC-4433 Methocult, Terry Fox Labs, Vancouver, BC)에서 개별적으로 배양된 CFU-GEMM 평가(13)로 평가했다. 배양 19일 후, BFU-E와 CFU-GM 콜로니를 역상 대조 현미경으로 세었다. 각각의 평가를 5% CO_2,100% 습윤 분위기에서 37℃에서 1㎖ 35mm 디쉬로 3개 배양물로 수행했다.

결과

연질 아가르에서 인간 유방암세포의 성장. 몇 개의 실험에서, 접정된 종양 세포의 수와 형성된 종양 콜로니의 수 사이의 선형관계를 관찰했다. PM1 세포주에서 클로닝 효율성은 20-30%범위 (도시되지 않음) 였다. t-47D와 MCF7 세포주로의 실험에서 각각 27%와 22%의 PEs와의 상기에 보고된 (14) 선형관계가 확인되었다. 이들 데이터는 치료로 얻어진 유방암 세포 감소의 효율성을 계산하기 위해 사용했다.

유방암 세포를 괴사시키는데 있어서 개개의 면역독소 및 면역독소들의 혼합물의 효율성. 모델 실험에서 3개의 다른 농도의 각각의 IT를 사용했다. 표 4에 서 입증되는 바와같이, 2개의 보다 낮은 농도에서 BM7 콘쥬게이트에서는 단지 약간의 효과를 얻었고 이에 반하여 2.5로그 세포 괴사가 알려진 3로그 세포 괴사에 가깝게 1.0㎍/㎖에서 이루어졌고 최고의 농도(1㎍/㎖)에서 효율성은 평가에서 평가가능한 최대 효과인 최소한 5로그 였다(14). 각각의 지시된 농도로의 두 ITs 혼합물에서 모든 종양세포는 0.1㎍/㎖에서 이미 괴사되었다(표 4). 이 결과는 2개의 ITs의 혼합물이 매우 효율적으로 유방암 세포를 괴사시킬 수 있는 것으로 나타나고 이 테이타는 또한 가산성이 2개의 콘쥬게이트를 조합하므로서 얻어질 수 있다는 것을 제시한다. 유사한 결과는 IT의 효과가 두개의 다른 유방암 세포 주에 대해 시험했을 때 얻어졌다(도시되지 않음). 표적 세포상의 항원 발현에서 예상되는 이종원성때문에 임상 사용을 위해 적당한 방법의 추가적인 개발에서 IT조합을 사용하는 것이 논리적으로 보였다.

PM 1이 유방암 세포를 괴사시키는데 있어서 슈도모나스 외독소A를 포함하는 면역독소의 효과.PM1 세포를 37℃에서 2시간동안 면역독소와 함께 배양하고 연질 아가르에 접종한 후 콜로니 형성을 "물질과 방법"에 기술된 바와같이 평가했다.
MAbs를 갖는 ITs	세포수	실험수	하기의 세포독소농도에서 로그세포 괴사^a
			0.01㎍/m1	0.1㎍/m1	1.0㎍/m1
			평균^b±SD	평균±SD	평균±SD
BM7MOC-31BM7 + MOC-31^C	PM 1MA 11PM 1MA 11PM 1MA 11	334	0.13±0.110.96±0.180.81±0.101.49±0.341.16±0.262.80±0.21	0.64±0.152.02±0.072.83±0.292.29±0.07> 5> 5	2.55±0.40> 5> 5> 5> 5> 5

a. 플레이딩 피복 효율성을 고려하여 관찰된 콜로니수로부터 계산되어 처리에 의해 괴사된 세포수의 대수로서 측정.

b. 각각 3번 수행된 독립적인 연질 아가르 실험에서 얻어진 결과의 평균

c. 표시된 농도로 사용된 면역독소

배양시간의 영향. 상기 실험에서, ITs와 함께 120분 배양이 사용되어다. 임상적인 적용에서는 실제적인 이유 때문에 보다 짧은 배양시간을 사용하는 것이 융익하다. ITs에 대한 노출시간이 특정 종양 세포치사에 영향을 미치지 않고 감소될 수 있고 각각 1㎍/ml의 농도로 사용된 2개의 콘쥬게이트 혼합물을 3개 유방암 세포주에 대해 다른 배양시간으로 시험했다. 모든 경우에서 ITs에 대한 120분 노출은 모든 종양세포의 박멸을 가져왔다. 중요하게, 처리는 배양시간이 90분 및 심지어 60분으로 감소될 때도 동등하게 효과적이었고(표6), 2 데이터는 사용된 IT농도에서 가장 짧은 배양시간이 종양세포 배양물에 존재하는 모든 클론원성 종양세포를 괴사시키기에 충분하다는 것을 입증한다.

유방암 세포를 괴사시키는데 있어서 MOC-31과 BM7 면역독소^a혼합물의 효과에 대한 배양시간의 영향.종양세포단독(2×10⁶/ml)또는 말초혈액 선구물질 세포에 혼합된 종양세포 (총 1×10⁷세포/ml) (비율1:10)를 지시된 시간동안 37℃에서 ITs와 함께 배양하고, 연질 아가르에 접송하고 표4에서와 같이 평가했다.
배양시간(분)	세포주로의 평균로그 종양세포 괴사
배양시간(분)	T-47 D	MCF7	PM1	PBPCs에 혼합된 PM1^C
6090120	> 5> 5> 5	> 5> 5> 5	> 5> 5> 5	> 5> 5> 5

a. 1㎍/ml의 농도로 사용된 각 IT

b. T-47D와 PM1 세포로의 2개의 개별적인 실험과 MCF7 세포로의 1개의 실험에서 얻어진 결과

유방암 세포에 대한 독성이 많은 수의 정상적인 조혈 세포 존재를 변화시키는 시험하기 위해 종양세포가 비율 1:10으로 아파레시스에 의해 수집된 PBPCs에 혼합시킨 실험을 수행했다. 표5에서 입증된 바와같이, ITs는 정상적인 세포 존재하에서 60분의 배양시간이 이미 지난 후에도 5로그 이상의 PM1 종양세포를 괴사시켰다. 결과가 3개의 모든 세포주와 동일하기 때문에 이 데이터는 IT 과정이 임상 적용에 있어서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

배양조건과 세포농도의 영향. 임상 샘플에 대해 사용되는 것들과 유사한 조건하에서 IT 과정의 효과를 시험하기 위해 ITs와의 배양하기 전에 아파레시스 백(bag)으로부터 직접 취한 세척되지 않은 세포를 ACD(원액 백, R 2220, Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division)를 갖는 정상적인 살린에 재현탁시킨 실험에서 PM1 종양세포를 1:10 비율로 PBDCs에 혼합시켰다. 결과를 세척되어 10% FCS를 갖는 RPMI에 재현탁시킨 세포로의 초기 실험에서 얻어진 것들과 비교했다. 두 경우에서 60분동안 ITs로의 치료가 모든 PM1 세포를 괴사시켜서 임상적인 사용에 있어서 ITs가 아파레시스에 직접적으로 주입될 수 있고 이러한 조건하에서 낮은 pH는 ITs의 세포독성에 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다는 것을 발견했다(표 6).

혈액세포 분리기 아파레시스에 의해 분리된 말초 혈액 선구물질 세포에 혼합된(비율 1:10) PM1 유방암 세포를 괴사시키는데 있어서 MOC-31과 BM7 면역독소 혼합물의 효과에 대한 배양조건의 효과.아파레시스 백으로부터의 세포를 각각 1×10⁸세포를 함유하게 3개 튜브에 넣었다. 두 개 튜브에서, 세포(500-700ml의 양)를 20% ACD와 1%인간 알부민을 갖는 PBS로 희석시켜 최종 부피 1ml로 만들었다. 튜브중 한 개를 대조군 및 IT배양을 위해 사용했다(그룹A). 세 번째 튜브에 있는 세포를 세척하고 10% FCS를 갖는 RPMI에서 1ml로 재현탁시켰다(그룹B). 처리그룹에서, 세포를 각각의 IT 1㎍/ml로 37℃에서 1시간 동안 배양하고 세척한 후 연질 아가르에 접종했다. 표1에서와 같은 평가 및 계산이 이루어졌다. 처리되지 않은 대조 배양물에서의 플레이팅 효율성은 20%-30% 범위였다.
그룹	배양조건	실험수	PBPCs의 다른수 존재하에서 로그종양세포괴사
그룹	배양조건	실험수	1 x 10⁷	5 x 10⁷	1 x 10⁸
AB	ACD를 갖는 정상적인 살린에서 처리된 세척되지 않은 세포10% FCS를 갖는 RPMI에서 세척 및 처리된 세포	22	> 5> 5	> 5> 5	> 5> 5

아파레시스 백에서 세포의 총수는 아주 높고 이러한 높은 세포농도에서 과정의 효과가 모델연구에 사용된 조건과 비교할 때 감소될 수 있다는 것을 상상할 수 있었다. 그러나, 이러한 가능성이 시험된 실험에서 세포의 총 농도가 처음 ml당 1×10⁷에서 5×10⁷으로, 그후 1×10⁸으로 증가되었을 때 효과의 차이가 없는 것으로 관찰되었다(표6).

정상적인 조혈 모세포에 대한 ITs의 독성. CFU-GM과 BFU-E의 생존에의 ITs의 효과를 상기에 기술된 바와 같은 배양조건하에서 연구했다. IT와 유핵 PBPCs 혼합물의 120분이상 배양은 세척하고 10% FCS를 갖는 RPMI에서 세포를 재현탁한 후 시험했든지 상관없이 또는 ACD를 갖은 정상적인 실란에 재현탁된 세척되지 않은 세포가 사용되었을 때 모세포의 생존을 감소시키지 않는다.

임상적인 적용에서 처리된 세포가 동결되어 환자에게 주입되기 전에 용해되기 때문에 모세포에 대한 이러한 과정의 효과도 연구했다. 동결과 용해는 CFU-GM과 BFU-E의 수만 감소시키는 것으로 발견되었다(표7). 명백하게, IT처리 그 자체는 세포가 낮은 pH조건하에서 처리되는 경우의 그룹에서 세포 콜로니의 평균수의 약간의 감소가 나타났지만 모세포의 생존을 중대하게 감소시키지 않았다. 데이터는 60분 배양후 종양세포를 효과적으로 박멸하는 ITs의 농도가 적어도 두 번 치료된 정상적인 클론원성 세포의 생존에 적은 영향만을 미친다는 것을 입증한다.

^a2개의 개별실험에서 3개의 배양물로부터 얻어진 결과의 평균±SD

토의

조혈 줄기세포를 순환하는 자기인식 이식은 최근에 BM 이식과 비교할때의 잇점 때문에 많은 관심을 끌었다(15,16). 골수기능의 빠른 재생이외에 PBSCs의 사용은 이식물을 오염시키는 종양세포를 재주사 수혈할 위험성을 제거할 수 있는 것으로 생각되어 왔다. 그러나, 종양세포오염의 문제는 감소는 되지만 제거되지는 않는 것으로 나타났다(4). 또한, 콜로니-자극인자의 사용을 포함하는 많은 용량의 화학요법은 말초혈액에 종양세포를 보충할 수 있다는 것을 알아야 한다(7,8). 따라서, 아파레시스 생성물을 정화하기 위한 빠르고 실제적인 과정이 매우 요구된다.

BM으로부터 유방암 세포를 제거하기 위한 몇 개의 방법이 보고되었는데 화학-면역분리법, 면역자기과정 및 면역독소의 사용을 포함한다(14,17,18,19). 이에 비해 PBSC 분리물을 정화하는 것에 대하여는 매우 적은 연구만이 설명되어지지만(20,21) 리보좀-불활성 단백질로 제조된 ITs(22,23)는 BM으로부터 제조된 CD34-양성세포 수집물에 첨가된 임파성 종양세포를 괴사시키는데 사용되어 왔다(24). 후자의 연구에서, 2 로그의 정화효과가 CD34 선택과정에 의해 달성된 3 로그 간접정제이외에 얻어졌다. 본 연구의 목적은 PBSCs로부터의 유방암 세포를 정화하기 위한 안전한 IT과정을 개발하는 것이다. 모델 실험에서 얻어진 결과는 항종양항체 및 PE를 포함하는 2 콘쥬게이트 각각 1㎍/ml와의 60분 배양이 정상적인 모세포에 대한 독성없이 PBSCs에 혼합된 모든 종양세포를 효과적으로 괴사시켰다는 것을 입증한다. 중요하게도 이 방법은 ITs가 아파레시스 생성물에 직접 첨가될 수 있게 하고 배양 후 세포는 세척, 원심분리되어 동결될 준비가 된다. 특히, 이것의 단순성과 효과 때문에 이 방법은 PBSCs의 이식과 조합된 고용량 화학요법과 관련한 유방암 환자의 선택된 그룹관리에 사용하는데 바람직하다. 본 발명방법의 고 선택적인 효과는 하기 요인에 기인한다:

첫째, MOC31 항체에 의해 인식된 항원은 거의 모든 검사된 유방암 표본에 있는 대부분의 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다(10). 또한, MUC-1유전자(9)에 의해 발현된 코어 단백질을 인식하는 BM7항체(9)는 유방암 세포의 고 프랙션에 결합한다(25). 이와함께 이들 두 모노클로날은 유방암에서 발견된 항원 발현의 이질성을 상당한 범위로 커버하는 것으로 보인다. 둘째, 본 발명자들은 ITs를 구축할 때 사용된 항체와 매치되는 독소를 사용하는 것이 중요하다는 것을 이미 입증했다(11). 본 발명자들은 여기에 사용된 것들을 포함하는 다수의 모노클로날을 포함하는 PE 콘쥬게이트가 매우 효과적이라는 것을 발견했다(14). 또한, PE를 갖는 ITs는 항상 유리 PE의 등몰 농도보다 높은 독성을 갖는데 (11,18) 이것은 그러한 ITs의 특이성을 입증한다.

정화과정은 효율적이고 안전함을 위해서 필요하고, 이 방법이 실시되어 임상규모로 사용되도록 하기 위해서도 필요하다. ITs가 아파레시스 백에 직접적으로 참가될 수 있다는 잇점이외에 본 발명은 클론원성 종양세포 모두를 괴사시키는데 단지 60분의 배양시간만을 포함한다. 또한, 이러한 치료는 정상적인 조혈 모세포에 대하여 비독성이고, BM 정화실험에서 훨씬 높은 IT농도도 잘 허용되었다(14). 또한, 본 발명자들은 ITs로 처리된 PBSCs의 동결 및 용해가 추가의 독성을 야기하지 않는다는 것을 알았으며, IT과정이 면역비드 또는 면역흡수로의 종양세포의 제거를 포함하는 방법에서 경험할 수 있었던 비특이적 세포손실을 포함하지 않는다는 것을 주목하고 있다.

본 발명자들은 이미 첨가된 총량의 약 0.75%가 되도록 세척한 후에 IT처리된 BM에 남아있는 콘쥬게이트의 양을 계산했다(26). 임상셋팅에 있어서, 2㎍IT/ml(1×10⁸세포)의 권장되는 농도로 약 2×10¹⁰단핵세포를 함유하는 PBSCs의 처리는 최종 생성물에서 최대 3㎍ IT가 될 것으로 예상되었다. 이것은 치료적으로 계산된 최대 내성 복용량보다 100-150배 적은 유리독성을 나타낸다(26). 따라서, 정화된 PBSCs의 재주입이 어떤 계통적 독성을 제공할 것으로는 예상되지 않는다.

자가유래 조혈 모세포 이식과 조합된 많은 복용량치료 실패의 성공은 그래프트 정화의 효과보다 더 계통성 치료의 효과에 좌우될 수 있다(1). 그럼에도 불구하고, 자가이식편에 존재할 수 있는 암세포를 제거하는 것이 논리적이며 다른 종양형태의 연구로부터의 최근 증거는 정화의 중요성을 입증한다(16). 유방암에서 본 발명자들은 여기에 기술된 것과 같이 간단하고 안전하며 안전한 과정을 사용할 것을 제안한다.

실시예 2

유방암 세포는 면역독소에 대하여 다른 민감도를 나타낼 수 있기 때문에 BM7 및 MOC31의 정화활성이 다른 환자로부터의 유방암 세포들에 대해서 다를 수 있도록 PM1 유방암세포로 상기 수행된 것과 같은 실험(실시예 1)이 또 다른 세포주, MA11로 반복되었다. 면역독소처리의 효과는 PM1세포와 비교할 때 MA11에 대해서 그 만큼 우수했거나 보다 더 우수했다는 것을 발견했다(표4). 그 결과는 면역독소 정화처리의 높은 특이적 활성도를 확인한다.

별개의 실험에서 면역독소의 세포괴사 활성의 동력학을 PM1 유방암 세포가 말초 혈액 모세포에 첨가된(비율1:100)경우의 실험에서 연구했다. 2시간 배양후 혼합된 세포 현탁액을 동결시킨후 세포를 접종하기 전에 용해시키고 암세포와 정상 모세포의 생육성을 같은 실험에서 평가했다. 유방암세포의 비독성화가 빠르게 발생했으며 약72시간내에 모든 종양세포가 죽었다는 것이 발견되었다. 비교로, 정상혈액 모세포의 생육성 차이는 같은 시간 프레임 내에서 면역독소처리 및 비처리 세포의 배양물에서 발견되지 않았다.

실시예 3-4

뼈 또는 골수, 흉강 및 복수, 뇌 및 척추조직 및 생식기관에 퍼진 암세포는 종양, 체액 또는 계통적으로 예를들면 혈액, 뼈 및 골수같은 조직에 있는 표적 전이 종양세포에 투여된 면역독소에 의해 선택적으로 괴사될 수 있다.

실시예 3

MA-11 인간 유방암 세포를 면역결핍 랫트의 좌심실에 주입했다. 비처리된 대조동물에 척추압박 증상을 발전시키고 세포주입 34-37일 후에 죽도록 하였다. 단일 용량의 MOC31-PE(20㎍/랫트)로 정맥주사 처리된 동물들은 연장된 무증상의 생존을 나타냈으며 일부 동물들은 50일이상 살았다.

같은 모델에서의 다른 실험은 그러한 결과를 확인했으며 이 경우에 일부 동물들은 110일의 관찰기간내내 생존했다. 이 실험에서 한 그룹의 랫트를 PE에 콘쥬게이트된 EGF-수용체에 대하여 향하는 425.3항체로 이루어진 면역독소로 처리했다. 이 그룹의 모든 동물이 생존하였다.

이 모델의 세 번째 실험에서, 대조 랫트는 코드압박 증상을 나타냈으며 세포주입후 40-60인 사이에 죽었다. 이 실험에서는 세 개의 처리그룹이 포함되었는데 하나는 20㎍ 425.3-PE로 처리하였고 하나는 두 면역독소를 각각 10mg 받은 것이다. 질병없는 생존의 많은 연장이 개별적으로 사용된 두 면역독소에서 이루어졌는데 MOC31-PE 및 425.3-PE로 각각 60% 및 80% 장기간 생존이 이루어졌다. 이러한 조합실험에서 모든 동물이 질병없이 생존했다.

이러한 모델에서의 네번째 실험에서는 MOC31-PE의 효과를 시스-플라틴 및 독소루비신과 비교했다. 이 실험에서 모든 MOC31-PE 처리동물이 70일이상 생존한 반면에 독소루비신은 단지 작은 효과만을 나타냈으며 시스-플라틴 처리 랫트는 살린 처리된 대조동물보다도 오래 살지 못했다. 이 데이타는 사용된 면역독소가 임상에서 가장 일반적으로 사용되는 약물중 두 개인 독소루비신 및 시스-플라틴보다 유방암 전이를 괴사시키는데 훨씬 우수하다는 것을 확실히 입증한다.

실시예 4

인간 유방암 세포주 MI-1을 두 개의 다른 실험에 사용했다. 첫 번째 실험에서는 세포를 좌심실에 주입하고 대조동물은 19일의 중간시간후에 척추 압박의 증상으로 인하여 죽었다. 세포주입 하루후에 425.3-PE를 정맥주사하여 처리된 동물 모두가 생존하였다. 다른 실험에서는 MI-1종양세포를 랫트 경골의 골수강에 직접 주입하였다. 모든 비처리동물이 성장경골 종양 때문에 20일후에 희생된 반면에 세포주입 하루후에 425.3-PE를 20㎍ 정맥주사하여 처리된 랫트는 모두 100일이상 생존하였다.

또한, MT-1 종양세포가 랫트경골의 골수에 직접 주입된 경우의 모델에서는 1일 또는 7일에 투여된 BM7-PE의 효과를 BM7-PE에 대해서와 같이 같은 일자로 처리된 동물그룹에서의 425.3-PE의 효과를 비교했다. 또한, 7일 및 14일에 정맥주사된 독소루비신(Adriamycin)의 효과도 연구했다. 1일이든지 7일이든지간에 두 면역 독소가 랫트의 80%를 치료한 것으로 발견되었다. 각 면역독소의 농도 반을 조합했을 때 모든 동물이 생존하였다. 비교로, 독소루비신은 확실히 덜 효과적이었는데 90일 후에 동물의 35%만이 살아남았다. 대조동물은 상기 실험에서와 같이 세포주입 20일후에 희생되었다. 데이터는 상기에 나타난 425.3-PE의 효과를 확인한다. 중요하게, BM7-PE는 425.3-PE와 동등하게 효과적인 것으로 발견되었다. 두 제제는 유방암에 대하여 가장 자주 사용되는 임상 약물중 하나인 독소루비신과 비교했을 때 효과에 있어서 확실히 우수했다. 또한, 두 면역독소의 조합물은 모든 동물의 그러한 질병을 치료했다.

실시예 5

두셋트의 실험에서, 재조합적으로 제조된 PE의 변종과 함께, erb2-유전자 생성물에 대하여 향하는, 재조합적으로 생성된 면역독소의 효과를 실험했다. 실시예 4에 기술된 모델에서 가장 높은 농도의 재조합 면역 독소가 생존기간을 매우 연장시켰는데 랫트의 35%가 생존했다. MT-1 유방암 세포가 면역 결핍 랫트에 포막내 주입된 경우의 모델에서 포막내 주어진 (1,2,3일째에) 재조합 면역 독소로의 치료는 동물 생존기간의 많은 연장을 가져왔다. 이러한 효과는 용량 의존적이고 두 개의 다른 용량은 면역독소의 두 개의 다른 용량에서 동물의 생존기간을 10, 6일(살린 처리 대조군)에서 23,4 일 및 32, 8일로 증가시켰다. 가장 많은 용량에서 20%의 랫트가 생존했다. 가장 높은 면역 독소 용량에서도 독성이 관찰되지 않았기 때문에 최적 용략에서의 효과가 보다 더 우수할 것으로 예상된다.

참고자료

Claims

세포군이 말초혈액으로부터 수집된 유핵세포, 또는 상기 유핵세포로부터 선택된 CD-34⁺세포, 또는 골수 흡인물로부터 수집된 CD-34⁺, 또는 다능성 줄기세포를 함유하는 골수 또는 혈액으로 부터의 다른 미성숙/초기 모세포, 또는 정상적인 간질 세포에 의해 지지된 악성종양세포를 포함하는, 세포군에 있는 원하지 않는 표적세포를 죽이는 방법에 있어서, 세포군이 하나 이상의 면역독소에 노출되고, 각 면역독소는 항체 및 세포독소 사이의 콘쥬게이트, 항체와 독소의 단편 또는 재조합적으로 생성된 항체, 독소, 면역독소 또는 이들의 단편으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 세포군이 둘이상의 면역독소에 노출되는 방법.
제 1항에 있어서, 세포군이 MOC31-PE 또는 BM7-PE 같은 하나의 면역독소에 노출되는 방법.
제 1항에 있어서, 세포군이 말초혈액으로부터 수집되는 방법.
제 1항에 있어서, 줄기세포/초기 모세포가 골수로부터 수집되는 방법.
제 1항 내지 제 2항에 있어서, 세포군이 2-3의 혼합물, 바람직하게는 표적 세포관련항원을 향하는 2 특이적 항체 또는 이들의 단편과 함께 배양되며, 각 항체는 같거나 다른 세포독소에 콘쥬게이트되는 방법.
제 4항에 있어서, 상피 세포 항원을 향하는 항체가 사용되는 방법.
제 7항에 있어서, 주로 상피세포에서 발현된 에피토프가 사용되는 방법.
상기 항 들 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 항체 중 최소한 하나가 유전자 GA 733-2에 의해 발현된 항원 EGP2상의 에피토프를 향하는 반면에 최소한 하나는 유전자 MUC1, MUC2 또는 MUC3 또는 이들의 조합에 의해 발현된 항원상의 에피토프를 향하는 방법.
상기 항 들 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 항체가 MOC31 및 유전자 MUC1, MUC2, MUC3 또는 이들의 조합에 의해 엔코딩된 항원을 향하는 항체인 방법.
제 6항에 있어서, 사용된 항체가 MOC31 및 BM7 또는 이들의 단편인 방법.
제 6항에 있어서, 사용된 항체가 MOC31 및 BM2 또는 12H12 또는 이들의 단편인 방법.
제 6항에 있어서, 사용된 항체가 MOC31 및 595A6 또는 이들의 단편인 방법.
상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 면역독소 중 사용된 독소부분이 천연 또는 재조합 슈도모나스 외독소 A 또는 이들의 단편인 방법.
상기 항 들 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 독소가 천연 또는 재조합 아브린, 리신, 겔로닌, 니그린 또는 미국 자니공 항바이러스성 단백질, 사포린, 에불린 또는 이들의 단편인 방법.
상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 세포군이 말초혈액으로부터 수집된 유핵세포이고 표적세포가 상피근원의 악성 종양세포인 방법.
상기 항들 중 어느 한 항에 있어서, 세포군이 필수 부분으로서 CD-34⁺세포, 또는 다른 표면 마커, 예를들면 p-글리코 단백질에 의해 선택된 유사초기 모세포를 함유하는 방법.
제 8항에 있어서, 표적세포가 암세포, 예를들면, 유방암세포, 결장직장암세포, 전립선암세포, 난소암세포, 췌장암세포, 및 폐암세포인 방법.
제 2항 및 제 3항에 있어서, 세포군이 생체내에서 특정 면역독소에 노출되는 방법.
제 19항에 있어서, 면역독소가 종양에 직접 투여되거나 흉강 및 복강에 투여되는 방법.
제 19항에 있어서, 면역독소가 특히 뼈 및 골수 같은 조직에 퍼진 악성종양의 경우에 계통적으로 투여되는 방법.
약성종양 세포에 존재하는 항원을 향하는 하나 이상의 면역독소를 함유하는, 제 1항의 방법에 따른 세포를 괴사시키는 면역 독소.
제 22항에 있어서, 항체가 MOC31 및 BM7, 595, BM2, 12H12 또는 이들의 조합으로부터 선택되고 독소가 슈도모나스 외독소 A인 면역 독소.
암에 대한 치료제를 제조하기 위한, 제 22항에 따른 혼합물의 용도.
약제학적으로 수용가능한 제형의 하나 이상의 면역독소로 이루어진 제제를 함유하는, 제 1항에 따른 방법을 수행하기 위한 킷트.