KR101651171B1 - Il-12를 발현하는 간엽 줄기세포를 포함하는 간암 치료용 조성물 및 이를 이용한 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 치료용 조성물과 포유동물의 간암 치료방법에 관한 것으로서 IL-12을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 포함하고, 상기 간엽줄기세포로부터 IL-12의 발현을 증가시키기 위해 방사선 요법과 병용되는 것을 특징으로 하며, IL-12을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 포함하는 간암 치료용 조성물을 방사선 요법과 병용함으로써, 간암 세포 내 항암 면역작용을 증진시켜 세포사멸 효과를 유도하므로 종래 화학요법과 병행하였을 때보다 부작용이 적고, 방사선 요법의 효능을 더 상승시킬 수 있다.

Description

IL-12를 발현하는 간엽 줄기세포를 포함하는 간암 치료용 조성물 및 이를 이용한 치료방법{Composition for treating hepatic cancer comprising mesenchymal stem cell transfected with IL-12 expressing vector and the treatment methods using the same}

본 발명은 IL-12를 발현하는 간엽 줄기세포를 포함하는 간암 치료용 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 IL-12를 분비하는 간엽줄기세포를 포함하는 간암 치료용 조성물은 방사선 조사요법과 병용되는 병용제로, 이러한 병용 치료는 간암 세포를 근절하는데 유용하다.

대한민국 중장년기(40~60세) 10만명을 기준으로 남자 74.8명, 여자 15.6명에게서 발병되는 간암은 1 년에 10만 명중 24.1명이 사망하게 되는 사망률 1위 질환이다(2013년도 국가암정보센터의 자료 참고). 조직학적으로 2011년의 간암 전체 발생 건수 1만 6,463건 가운데 암종(carcinoma)이 95.7%, 육종(sarcoma)이 0.2%를 차지한 것으로 조사되었다. 암종 중에서는 간세포 암이 74.5%로 가장 많았으며, 그 다음이 담관암 (cholangiocarcinoma)의 15.3% 이다. 암종이란 표피나 점막, 샘 조직 같은 상피조직에서 생기는 악성 종양을, 육종은 비상피성 조직에서 발생하는 악성 종양을 의미한다.

이러한, 간암을 치료하는 방법 중에 가장 잘 알려진 방법은 근치적 치료 방법으로써 간 절제술이 있다. 암에 대한 수술은 완치가 목표기 때문에 간경변증이 없거나 그 정도가 심하지 않아 간 기능이 충분하다고 판단되면 우선적으로 수행하게 된다. 최근 수술 후 환자 관리의 향상으로 간 절제술의 사망률은 1~3% 이하로 감소하였고 5년간 생존률은 50% 이상으로 높아졌지만 수술 받은 환자의 70%에서 재발하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 대부분은 수술을 받은 간에서 재발하며 그 이유는 간암의 원인이 되는 간염이나 간경변증이 계속 남아 있기 때문이다. 그리고 간 이식술의 수술 방법도 있지만 간 이식을 받기 위해서는 종양이 한 개 5cm 이하거나 여러 개의 종양이 있을 때 3개 3cm 이하의 암이 혈관을 침범하지 않아야 한다는 조건이 있다. 그리고 간 이식을 위한 기증자를 찾는데 상당한 어려움이 따르며, 찾는다고 하더라도 이식에 적합한 판정을 받는 과정에서 문제가 많이 발생하고 있다. 또 알려진 치료방법으로는 고주파 열 치료술 및 에탄올 주입술이 있는데 종양 주변에 혈관이 있거나 대장, 담낭 등 다른 장기가 인접한 경우 등에서는 효과적으로 치료를 하는데 곤란한 단점이 있으며 종양 내부에 격벽이 존재하는 경우 효과가 감소되는 문제점이 있다. 게다가 간암 환자는 초기에 이렇다 할 증세가 크게 나타나지 않기 때문에 임상치료를 시작하는 간암 환자는 대부분 중, 말기 환자가 대부분이라 위에서 언급한 치료를 수행할 수조차 없는 경우가 다수이다. 즉, 수술적 절제가 불가능 하거나 국소 치료술 등의 근치적 치료가 되지 않는 환자들이 다수 인데 그 환자들은 항암화학요법 들을 이용하여 치료한다. 하지만 이러한 치료법은 피부 부작용이나 탈모 등과 같은 합병증을 유발한다.

따라서, 상술한 바와 같은 임상적 배경을 바탕으로 간암 질환의 치료에 쉽게 적용가능하고 정상 간암 조직에 적게 영향을 주면서 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 시급하다.

또 다른 암 치료방법으로 고 에너지의 빔을 이용하여 암세포를 직접 파괴하는데 사용하는 방사선 치료요법이 있으며, 이는 수술적 절제나 국소 치료가 불가능한 환자에게 시행되는 방법의 일환이다 (Bujold A, Dawson LA. Stereotactic radiation therapy and selective internal radiation therapy for hepatocellular carcinoma. Cancer radiotherapie : journal de la Societe francaise de radiotherapie oncologique 2011;15:54-63). 비수술적 치료 후 재발한 경우에도 시행이 가능하고, 암에 대한 통증 등의 증상의 완화에도 효과적이며, 종양이 담도를 막아 황달을 보이는 경우 및 종양으로 인한 동정맥 단락이 심하여 색전술이 어려운 경우 등에도 이용이 가능하다. 그러나, 방사선 치료요법은 정상적인 간세포에도 손상을 입힐 수 있고, 전이성 간암의 경우 암 줄기세포가 방사선에 내성을 보이면서 추후에 재발이나 전이가 발생하는 단점을 가지고 있다(Vlashi E, McBride WH, Pajonk F. Radiation responses of cancer stem cells. Journal of cellular biochemistry 2009;108:339-342).

따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 방사선조사를 이용한 간암치료를 수행할 때 화학치료나 유전자 치료를 병행하는 치료방법이 개발되고 있다(Ohta K, Murata H, Mori Y, Ishima M, Sugawara F, Sakaguchi K, et al. Remodeling of the tumor microenvironment by combined treatment with a novel radiosensitizer, {alpha}-sulfoquinovosylmonoacylglycerol ({alpha}-SQMG) and X-irradiation. Anticancer research 2010;30:4397-4404., {alpha}-sulfoquinovosylmonoacylglycerol ({alpha}-SQMG) and X-irradiation. Anticancer research 2010;30:4397-4404). 그러나, 상기와 같이 방사선 치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들은 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료시 나타나는 방사선 치료부의의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등의 부작용과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있고, 환경 자체가 면역억제성이므로 종양의 완전 근절이 어렵고, 재발 가능성이 높다.

이에, IL-12는 대식세포, 단핵구와 같은 항원 제공 세포에 의해 분비되며, 림프구를 활성화시켜 종양을 공격하는 T 세포 및 자연 킬러 세포(NH 세포)의 분화를 증가시키는 등 각종 면역 반응을 조절한다. 이러한 IL-12는 면역 반응을 유도하여 항 종양효과를 내는데 효과적이기 때문에, 이를 이용한 다양한 유전자 치료 연구가 진행되고 있는 추세이다(Uekusa Y, Gao P, Yamaguchi N, Tomura M, Mukai T, Nakajima C, et al. A role for endogenous IL-12 in tumor immunity: IL-12 is required for the acquisition of tumor-migratory capacity by T cells and the development of T cell-accepting capacity in tumor masses. Journal of leukocyte biology 2002;72:864-873). 그러나, 직접적으로 IL-12 사이토카인을 투입할 경우 사망까지 유발하는 심각한 독성을 나타내므로, 이를 효과적으로 암 세포 치료에 이용하기 위해서는 치료 유전자의 효능과 고효율의 유전자 전달방법의 개발이 중요하다.

이를 위해, 골수 유래 간엽 줄기세포(MSCs)는 다능성의 줄기세포로써 다양한 세포로의 분화가 가능하여(Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284:143-147) 항암 작용을 유도할 수 있는 유전자의 전달 세포로 이용이 가능하다. 이러한, MSCs는 이식된 유전자를 최대 6개월까지 발현할 수 있고, 종양에 지향 능력을 가지고 있다. 이러한 성질을 이용하여 여러 암 동물 모델을 통한 연구가 진행되고 있다 (Kim SW, Kim SJ, Park SH, Yang HG, Kang MC, Choi YW, et al. Complete regression of metastatic renal cell carcinoma by multiple injections of engineered mesenchymal stem cells expressing dodecameric TRAIL and HSV-TK. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 2013;19:415-427). 그러나 이를 이용하여 충분한 항암 효과를 발휘하기 위해 고가의 간엽줄기세포가 다량 요구된다는 단점을 비롯하여 암의 완전 근절이 어렵고, 전이 억제 가능성이 낮다는 문제점이 여전히 존재한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 방사선 치료와 병용하여 정상세포에는 부작용을 주지 않으면서 소량의 간엽줄기세포에도 충분한 항암효과를 얻기 위하여, 방사선 요법과 병용하는 IL-12를 발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로하는 간암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 방사선 조사요법과 간암 치료용 조성물을 투여하는 병용치료를 통해 상기 간암 치료용 조성물의 항암 효과는 증진되고, 종양 전이는 억제하는 효과적인 간암 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, IL-12을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 포함하고, 상기 간엽줄기세포로부터 IL-12의 발현을 증가시키기 위해 방사선 요법과 병용되는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물을 제공한다.

상기 간암 치료용 조성물은 방사선 요법과 병용하여 1 회 이상 투여되는 것을 특징으로 한다.

상기 간암 치료용 조성물은 방사선 요법과 동시에 혹은 1~7 시간 후에 투여되고, 4~8일 이내에 한번 더 투여되는 것을 특징으로 한다.

상기 간암 치료용 조성물은 상기 간엽줄기세포의 세포수가 10⁴-10⁷개로 포함되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, (a) 간암에 걸린 포유동물의 종양 부위에 방사선을 조사하는 단계; 및 (b) IL-12를 분비하는 간엽줄기세포(MSCs)를 포함하는 간암 치료용 조성물을 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 간암 치료방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 방사선은 조사(irradiation)량이 2 Gy~10 Gy인 것을 특징으로 한다.

상기 (b) 단계에서 간암 치료용 조성물은 방사선 조사 후, 1~10 시간 후에 처리하는 것을 특징으로 한다.

상기 (b) 단계 후, 상기 간암 치료용 조성물을 방사선 조사 4~8 일 후에 추가로 투여하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, IL-12을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 포함하는 간암 치료용 조성물을 방사선 요법과 병용함으로써, 간암 세포 내 항암 면역작용을 증진시켜 세포사멸 효과를 유도함으로써, 종래 화학요법과 병행하였을 때보다 부작용이 적고, 방사선 요법의 효능을 더 상승시킬 수 있다.

또한, 고가의 간암 치료용 조성물을 방사선 요법과 병용 사용함으로써 적은 용량으로도 탁월한 항암 효과를 나타낸다.

도 1은 상기 HCa-1과 Hepa1-6의 간암세포주 각각에 방사선을 10 Gy로 처리한 후, 각 간암세포주 배양배지에서 시간별 MCP-1/CCL2의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 내인성의 MCP-1/CCL2의 발현량을 살펴보기 위하여, 방사선 조사 후, 시간별로 간암세포주로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후, PCR을 통해 MCP-1/CCL2의 발현을 측정한 RT-PCR 사진이고, 도 2b는 내인성의 MCP-1/CCL2의 발현량을 살펴보기 위하여, 방사선 조사 후, 시간별로 간암세포주로부터 내인성 MCP-1/CCL2의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 방사선 처리가 생체 내 MCP-1CCL2의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 간암세포주가 이식된 마우스 즉, 간암모델에 방사선을 조사하고, 상기 간암모델로부터 간암조직을 추출한 후, 면역형광염색을 통해 분석한 사진이다.
도 4는 방사선을 처리하지 않은 간암모델(tumor control), 10 Gy의 방사선을 단일로 처리한 간암모델(SIR) 및 방사선을 2 Gy씩 5 번으로 분할하여 처리한 간암모델(FIR)로부터 추출한 각 간암조직에서 세포용출액을 획득하여, 이를 웨스턴 블랏으로 분석한 사진(a)과 그래프(b)이다.
도 5는 본 발명의 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 제조하기 위한 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 배양한 MSCs/IL12에 방사선을 조사하여 MCP-1/CCL2 사이토카인을 증가시킨 후, 이와 관련 수용체인 CCR2의 증가를 나타낸 결과사진으로, 도 6a는 MCP-1/CCL2 사이토카인이 증가되기 전이고, 도 6b는 MCP-1/CCL2 사이토카인이 증가한 후의 사진이다.
도 7은 간암세포주에 방사선을 조사한 후 변화하는 MCP-1/CCL2 사이토카인의 농도인 0, 1, 6 ng/ml으로 처리하여 MSCs/IL12 세포의 이동능력을 나타낸 결과그래프이다.
도 8은 간암모델에 방사선을 조사한 후, MSCs/IL12를 간암세포에 직접 주입하였으며, 상기 주입된 MSCs/IL12의 간암세포 내에서 상주 상태를 확인하기 위하여 비침습적 영상 시스템으로 촬영한 사진이다.
도 9와 도 10은 간암모델에 방사선을 조사한 후, MSCs/IL12를 간암세포에 직접 주입하였으며, 상기 주입된 MSCs/IL12의 간암세포 내에서 상주 상태를 확인하기 위하여, 5일이 지난 후, CD73과 CD90을 마커로 면역형광염색하여 분석한 사진과 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 다양한 치료전략과정을 나타낸 도면이다.
도 12는 각 치료조건에서의 간암모델의 간암세포 성장을 살펴본 결과이다.
도 13은 간암세포 성장의 억제 정도에 따라 생존률이 증가하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 14는 Hepa1-6, HCa-1 각 간암모델은 상기와 같은 치료과정 시작하고, 각각 14일과 20일 후에 폐 전이를 관찰하여 촬영한 사진(a)과 그래프(b)이다.
도 15는 IL-12를 발현하는 아데노바이러스를 농도별로 간엽줄기세포에 감염시킨 후, 이의 IL-12 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 16은 간암모델의 간암세포로부터 단백질을 추출하여 각 치료그룹별로 IL-12의 발현을 웨스턴 블랏으로 분석한 사진(a)과 그래프(b)이다.
도 17은 각 치료그룹에서 IL-12의 수용체인 IL-12R의 발현을 확인한 결과 사진(a)과 그래프(b)이다.
도 18은 세포독성 T세포로 알려진 CD8 T세포의 분화정도 나타낸 그래프이다.
도 19는 자연 살상 세포 분화를 보기 위하여 CD57 마커를 염색하여 활성화된 자연 살상 세포를 나타낸 사진이다.
도 20은 각 치료그룹별 간암조직 내에서의 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.
도 21은 본 발명의 방사선 조사요법과 병용한 간암 치료용 조성물을 간암세포에 투여할 경우, 발생하는 일련의 면역반응 과정을 나타낸 도면이다.

이하에서, 본 발명에 대해 보다 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명은 치료효과가 증진된 간암 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, IL-12를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 포함하고, 상기 간엽줄기세포로부터 IL-12의 발현을 증가시키기 위해 방사선 요법과 병용되는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물을 제공한다.

상기 방사선 조사와 병용되는 IL-12을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포는 종래 방사선 요법 단독으로 시행되는 것보다 우수한 치료효과를 가지며, 방사선 조사에 의해 상기 간엽줄기세포의 이동능력이 향상되어 유전자 전달을 향상시켰다.

보다 구체적으로, 방사선에 노출된 조직은 다양한 종류의 사이토카인들을 분비하는데, 특히, 간암 세포에서 MCP-1/CCL2 사이토카인을 생성하고, 이는 본 발명의 IL-12를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 간암세포로 유도하는 역할을 하므로, 본 발명의 간암 치료용 조성물은 간암세포에 대한 특이성을 가지게 된다. 따라서, 방사선 조사와 병용하여 간암 치료용 조성물을 투여할 시, 다른 조직세포에 부작용을 주지않으면서 효과적으로 간암에 대한 항종양 효과를 가질 수 있다.

또한, 상기 간암 치료용 조성물은 IL-12을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 간엽줄기세포에 도입함으로써, 면역증가물질인 IL-12를 장시간 인체 내에 발현할 수 있도록 할 수 있고, 아데노바이러스-매개 유전자 치료 혹은 방사선 조사만을 이용한 단독 치료 요법에 비해 우수한 간암 억제능력 및 전이 억제능력을 가진다는 것을 하기 실시예를 통해 확인할 수 있다.

또한, 상기 간암 치료용 조성물은 간엽줄기세포를 기반으로 하여 간암세포로 표적화된 이동을 하므로, 매우 효과적이지만, 상기 간암 치료용 조성물은 매우 고가이므로 경제적 측면에서 치료에 한계가 존재한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 방사선 조사와 병용하는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물은 간암세포로부터 MCP-1/CCL2 사이토카인의 생성을 유도하므로 단독 치료보다 간암세포에 대한 특이성이 향상되고, 간암세포의 내부로 간암 치료용 조성물이 깊이 침투할 수 있으므로, 보다 우수한 치료 효과를 나타낸다.

상기 간암 치료용 조성물은 상기와 같은 특징으로 인해 원하는 조직 부위 즉, 간암세포로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여될 수 있어, 투여방식에 제한되지 않는다.

본 발명의 간암 치료용 조성물은 방사선 처리 후에 투여되어 IL-12를 분비하도록 유전적으로 조작된 간엽줄기세포를 포함한다는 점에 특징이 있고, 상기 간암 치료용 조성물에서 분비되는 IL-12는 세포독성을 나타내지 않으면서, T세포의 사멸을 방지하고, T세포의 분화 및 세포살상 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)의 활성을 유도할 뿐만 아니라 자연살해세포(natural killer cell, NK)의 활성을 증가시켜 간암에 대한 항암기작을 증진시킨다.

상기 본 발명의 간엽줄기세포는 사람 혹은 동물의 간엽줄기세포를 IL-12를 포함하는 벡터로 형질전환하여 제조될 수 있는데, 이때, 상기 벡터는 재조합 아데노바이러스를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 재조합 아데노바이러스 벡터는 많은 장점을 가지고 있으나, 세포 내 도입이 1차 수용체인 콕사키바이러스-아데노바이러스 수용체(Coxakievirus and Adenovirus receptor; CAR)의 발현에 의존하기 때문에, 암세포나 줄기세포와 같은 콕사키바이러스-아데노바이러스의 발현이 낮은 세포들로의 효과적인 유전자 이입이 어렵다.

따라서, 본 발명에서는 재조합 아데노바이러스 벡터를 3가 철이온과 함께 줄기세포에 도입하여 제조한다.

또한, 아데노바이러스 벡터를 간엽줄기세포에 효과적으로 도입하기 위하여 단백질 전달 부위(protein transduction domain, PTD)를 가지는 펩타이드를 상기 아데노바이러스 벡터와 결합시켜, 벡터의 세포 내 물질 전달 효율을 증가시켰다. 본 발명의 실시예에서는 상기 펩타이드로 HP4를 사용하였으며, [서열번호 1]로 표시할 수 있다.

[서열번호 1] RRRRPRRRTTRRRR

또한, 본 발명은 (a) 간암에 걸린 포유동물의 종양 부위에 방사선을 조사하는 단계; 및 (b) IL-12를 분비하는 간엽줄기세포(MSCs)를 포함하는 간암 치료용 조성물을 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 간암 치료방법을 제공한다.

가장 먼저, 간암에 걸린 포유동물의 종양부위에 방사선을 조사하면 간암세포로부터 간엽줄기세포를 유도하는 MCP-1/CCL2 사이토카인이 발현된다.

상기 (a) 단계에서 간암치료용 조성물은 방사선 조사와 동시 혹은 1~10 시간 후에 상기 포유동물의 생체 내로 투여하게 되고, 이때, 간암세포로부터 분비된 MCP-1/CCL2 사이토카인으로 인해 간암세포방향으로 간암 치료용 조성물이 이동하게 되는데, 이를 '지역화(localization)'라고 한다.

다음 간암세포로 이동한 간암 치료용 조성물은 IL-12를 발현하는데, 상기 IL-12는 T세포의 사멸을 방지하고, T세포의 분화와 세포살상 T림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)의 활성을 유도할 뿐만 아니라 자연살해세포(natural killer cell, NK)의 활성을 증가시킴으로써, 항암효과를 발휘한다.

즉, 상기 치료방법에서 방사선의 조사과정없이 간암 치료용 조성물만을 이용하게 되면 아래 실시예에서 확인된 바와 같이, 간암 치료용 조성물을 지역화시키는 MCP-1/CCL2 사이토카인이 발현되지 않으므로 간암세포로 이동이 일어나지 않아 치료효과가 낮고, 간암세포 내로 침투할 수 없으므로 면역반응 유도에 의한 치료효율이 떨어진다.

또한, 방사선 조사요법 단독으로 치료를 시행하게 되면 종양세포뿐만 아니라 정상세포의 사멸도 유발하므로, 다양한 부작용을 동반한다.

또한, 본 발명에서 주어진 방사선 조사는 포유동물에서 암 세포 위치에 대해서만 2 Gy~10 Gy/일이거나, 회당 1~5 Gy로 분할하여 1회 이상 조사할 수 있다.

본 발명의 방법은 방사선 치료횟수 및 방사선 치료와 간암 치료용 조성물 투여 사이의 시간량은 본 발명의 방법에 따라 다양할 수 있으나, 바람직하게는 상기 간암 치료용 조성물은 방사선 조사와 동시에 투여하거나 또는 방사선 조사 후, 1~10 시간 이내에 투여한다.

상기 방사선 초기 조사 후에 4~8일째부터 상기 간암 치료용 조성물의 활성이 감소하기 시작하므로, 추가로 상기 간암 치료용 조성물을 투여하여준다.

또한, 상기 간암세포의 성장을 감소시켜 종양을 치료하기 위한 간암 치료용 조성물의 1회 용량에는 상기 간엽줄기세포의 세포수가 10⁴-10⁷개로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 간암 치료용 조성물은 상기와 같은 특징으로 인해 원하는 조직 부위 즉, 간암세포로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여될 수 있으므로 이에 제한되지 않고 다양한 방법을 이용하여 생체 내로 투여할 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

실시예 1. 실험재료 및 방법

<1-1> IL-12를 발현하는 아데노바이러스벡터로 형질전환된 간엽줄기세포(MSCs/IL12) 준비 및 배양

Hank's balanced salt 용액을 이용하여 3~4 주령의 흰쥐 대퇴부와 경골로부터 골수세포를 추출하고, 적혈구 세포를 제거한 후 남은 세포들을 40 마이크로 사이즈의 필터망으로 분리하였다. 상기 분리된 세포는 간엽줄기세포이고, 이를 20%의 소혈청과 항생제가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's 배양액에서 10일 정도 배양한 다음, 각 간엽줄기세포 콜로니들을 수집하여 이후, 유전자 조작단계에서 활용하였다.

IL-12를 발현하는 재조합 아데노바이러스(이하, rAD/IL12M라고도 한다.)를 철 이온과 함께 30 분간 실온에서 배양한 후, 0.1 mM HP4를 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 더 배양하였다. 상기 배양된 rAD/IL12M과 상기과정으로 처리된 간엽줄기세포를 CAR-independent internalization 방법을 이용하여 IL-12을 발현하는 아데노바이러스벡터로 형질변환된 간엽줄기세포(이하, MSCs/IL12라고도 한다.)를 준비하였다.

<1-2> 동물 및 간암 모델

C3H/HeN과 C57BL6종의 6주령~7주령의 수컷 마우스를 오리엔트바이오로부터 구매하고, 이를 SPF 환경 내의 동물 사육 시설에서 연세대학교 동물윤리위원회의 규정에 따라 사육하였다(동물 연구계획서 심의 번호:IACUC-2012-0177).

마우스 간암세포주인 HCa-1과 Hepa1-6 세포를 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)에 배양하고, 상기 HCa-I 세포주는 PBS에 현탁시킨 후, C3H/HeN종의 마우스 오른쪽 뒷다리에 이식시켰으며, 상기 Hepa 1-6 세포주는 PBS에 현탁시킨 후, C57BL6종의 마우스 오른쪽 뒷다리에 이식시킨다.

<1-3> 방사선 조사

쥐 종양에 방사선을 조사(irradiation)하기 위해 종양을 키운 다리를 움직이지 못하게 하는 아크릴 챔버에 마우스를 위치시킨다. 리드 쉴드(lead shield)를 이용하여 다리를 제외한 다른 부위에 방사선 조사가 되지 않도록 잘 가려 주었다. 종양에 방사선 조사는 2.0 mm 알루미늄 필터를 장착 한 X-RAD 320 X-ray 조사기를 사용하여(300 kVp) 다양한 양으로 조사하였다.

<1-4> 비침습적 생체 영상 시스템

1-1로부터 제조된 간엽줄기세포(MSCs/IL12)를 eFluorㄾ670 Cell Labeling(5μM/1 ㅧ 106 cells)을 이용하여 염색하였다. Xenogen In Vivo Imaging System 100 시리즈를 이용하여 생체 이미지를 측정하였고, Xenogen사의 using Living imaging 소프트웨어를 사용하여 측정된 데이터를 분석하였다.

<1-5> 종양 전이 관찰

상기 1-3에 따라 간암 세포주가 이식된 마우스를 안락사하여 폐를 절개한 후, 이를 75 mL의 피크릭산과 25 mL의 40% 포르말린으로 만들어진 Bouin's solution에 6 시간 이상 담근 후, 70% 에탄올에 옮겨 세척하였다. 상기 과정을 통해 고정화된 폐로부터 nodule의 수를 조사하였다.

<1-6> 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)

간암세포주를 배양한 배지의 배양상등액과 침전물(pellet)로부터 BCA 분석법으로 단백질량을 조사하고, MCP-1/CCL2, 인터류킨-12, 인터페론-γ 및 알파 페토프로테인(AFP)의 농도를 측정하기 위하여 MCP-1/CCL2, 인터류킨-12, 인터페론-γ 및 알파 페토프로테인(AFP) ELISA 키트를 사용하여 분석하였다.

<1-7> 웨스턴 블롯(Western Blotting)

BCA 분석법을 이용해 정량한 세포 용출물을 전기영동을 통해 12-15%의 gel로 분리하였고, 이를 질산섬유소로 이루어진 멤브레인으로 전기이동시켰다. 상기 단백질이 전기이동된 멤브레인 상의 단백질들을 1:500으로 PBST에 희석한 각각의 MCP-1/CCL2, CCR2, 인터류킨-12 항체들과 4 ????℃에서 밤새 반응시키고, 상기 멤브레인을 PBST로 세척한 다음, 실온에서 1:1000 희석된 anti-rabbit 임뮤노글로불린 G conjugate과 함께 반응시켰다. 상기 항원-항체 반응을 거친 멤브레인을 검출 시약으로 처리하여 X-ray 필름에 노출 시켜 밴드(band)들을 탐지하였다. 이러한 결과는 Image-J 프로그램을 사용하여 정량분석하였다.

<1-8> 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR, Reverse transcription polymerase chain reaction)

간암세포주로부터 RNeasyㄾ mini 키트를 사용하여 총 RNA를 추출한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 상기 합성된 cDNA에서 1 μg/μl를 아래 [서열번호 2], [서열번호 3], [서열번호 4] 및 [서열번호 5]로 표시되는 프라이머들과 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

[서열번호 2] MCP-1/CCL2

5' AGGTCCCTGTCATGCTTCTG 3'

[서열번호 3] MCP-1/CCL2

5' TCTGGACCCATTCCTTCTTG 3'

[서열번호 4] GAPDH

5' CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC 3'

[서열번호 5] GAPDH

5' TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT 3'

<1-9> 면역형광염색법

다양한 조건의 간암 모델로부터 간암조직을 획득하여 5 um의 크기로 동결 추출한 후, 슬라이드에 붙이고, 이를 1:500으로 PBS에 희석된 anti-rabbit MCP-1/CCL2, CD90, CD73 또는 IL12R 1차 항체들과 각각 밤새 반응시켰다. 다음 PBS로 세척하고, 비오틴이 결합된 2차 항체를 1:1000으로 PBS에 희석하여 2 시간 동안 실온에서 반응시켜 녹색이나 붉은색 형광으로 염색하여 준 후, 이를 형광현미경으로 조사하였다.

<1-10> 면역조직염색법

다양한 조건의 간암 모델로부터 간암조직을 획득하여 파라핀 블록을 만들고, 5 um의 크기로 추출한 후, 슬라이드에 붙여 1:500으로 PBS에 희석 된 anti-rabbit CD38 또는 CD57 1차 항체들과 각각 밤새 반응시켰다. 다음 PBS와 3% NGS로 세척하고, 비오틴이 결합된 2차 항체를 1:200으로 PBS에 희석하여 2 시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 이를 DAB반응을 통해 상기 항체-항원 반응시킨 간암조직을 조사하였다.

<1-11> 세포 이동 분석법

세포이동능력을 확인하기 위한 장치로써, 구멍의 크기가 8 ㎛인 필터를 24-well 플레이트에 조립하였다. 상기 조립된 플레이트 상에 5x10⁵ 개의 다양한 조건에서의 간압줄기세포(MSCs/IL12)를 배양하고, 세포이동을 유인하는 물질로 MCP-1/CCL2 사이토카인 1, 6 ng/ml를 더 낮은 웰에 두어 48 시간 동안 더 배양하였다. 다음 상기 플레이트의 아래로 이동한 세포들을 분리하여 4%의 파로포름알데히드로 고정시켰다. 이후, 상기 고정된 세포들을 Hoechst33342로 염색하여 흡광도를 측정하였다.

<1-12> 면역세포염색법

다양한 조건에서의 간엽줄기세포(MSCs/IL12)를 24 시간 동안 둥근 모양의 커버슬립 상에 배양하고, 여기에 MCP-1/CCL2 사이토카인을 처리한 후 24시간 동안 재배양시켰다. 최종 배양된 MSCs/IL12 세포를 4%의 파라포름알데히드로 고정한 후, 1:1000으로 희석된 anti-rabbit MCP-1/CCL2, CCR2 항체를 각각 15 시간 동안 처리하였다. 다음 PBS로 세척하고, 비오틴이 결합 된 2차 항체를 1:2000으로 실온에서 2 시간 동안 처리하였다. 상기 항원 항체 반응을 마친 결과물에 녹색이나 붉은색 형광으로 염색하여 형광현미경으로 조사하였다.

<1-13> CD8+ T 림프구 분화 조사

다양한 조건의 간암 모델로부터 간암조직을 획득하고, 간암세포를 추출한 후, 10% FCS , 1%의 sodium azide 및 FITC가 붙은 CD8 항체 1 μg/ml가 혼합된 ice cold PBS에 상기 1x10⁶개의 간암세포를 섞어 4 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 다음, 상기 반응된 간암세포를 PBS로 2 번 세척하고, BD FACSVerseTMflowcytometer 장비로 분석하였으며, 이를 FlowJo 프로그램을 통해 조사하였다.

<1-13> TUNEL 염색 법 (세포사멸 분석)

다양한 조건의 간암 모델로부터 간암조직을 획득하여 파라핀 블록을 만들고 5 um의 크기로 섹션하여 슬라이드에 붙인 후, 이를 DeadEnd™ Colorimetric TUNEL 시스템으로 세포사멸이 일어난 부분을 염색하였다. 상기 간암 조직 중에서 임의로 선택된 10 군데에서의 총 세포수 대비 염색이 된 세포수의 비율을 계산하여 데이터로 활용한다.

<1-14> 통계분석

모든 데이터는 평균값 ± standard error (SEM) 값으로 나타내었다. 통계적 유의성은 Student's t-테스트 또는 Mann-Whitney rank sum 테스트를 활용하여 분석하였다. 모든 통계 값에서 P<0.05를 만족하는 데이터에 통계적 유의성을 부여하였고 이 분석은 Sigma Stat 프로그램을 사용하였다.

실시예 2. MCP-1/CCL2의 증가

방사선 조사에 따라 본 발명의 실시예 1-1로부터 제조된 간암 치료용 조성물의 이동이 증가하게 된다. 이러한 요인을 파악하기 위하여, 간암세포주를 방사선으로 처리하는 정도 및 각 조건에 따라 실시예 1-1로부터 제조된 간암 치료용 조성물의 이동을 유도하는 대표적인 사이토카인 MCP-1/CCL2의 발현량을 비교하였다. 상기 간암세포주는 마우스 간암세포주인 HCa-1과 Hepa1-6 세포를 DMEM 배지에 배양한 것(1-2)을 이용하였다.

도 1은 상기 HCa-1과 Hepa1-6의 간암세포주 각각에 방사선을 10 Gy로 처리한 후, 각 간암세포주 배양배지에서 시간별 MCP-1/CCL2의 발현량을 나타낸 그래프로, 방사선 조사 후, 7 시간정도 경과한 때부터 MCP-1/CCL2의 발현이 유의성있게 증가하였고, 1 일이 경과한 때에는 MCP-1/CCL2의 발현이 가장 높게 측정되었으며, 5 일이 경과한 때를 지나면서부터 MCP-1/CCL2의 발현량이 점차 감소함을 확인하였다. *P<0.05, **P<0.001.

도 2a는 내인성의 MCP-1/CCL2의 발현량을 살펴보기 위하여, 방사선 조사 후, 시간별로 간암세포주로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후, PCR을 통해 MCP-1/CCL2의 발현을 측정한 RT-PCR 사진이고, 도 2b는 내인성의 MCP-1/CCL2의 발현량을 살펴보기 위하여, 방사선 조사 후, 시간별로 간암세포주로부터 내인성 MCP-1/CCL2의 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 간암세포주에 방사선을 조사하기 전과 후를 비교하였을 때, MCP-1/CCL2의 발현은 방사선을 조사하고 1 시간이 지난 뒤 증가하기 시작하였고, 1 일이 지난 뒤부터 MCP-1/CCL2의 발현이 가장 높게 증가하였으며, 5 일이 지난 뒤부터는 MCP-1/CCL2의 발현이 점점 감소한다는 것을 확인하였다. *P<0.05; **P<0.001.

도 3은 방사선 처리가 생체 내 MCP-1CCL2의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 간암세포주가 이식된 마우스 즉, 간암모델에 방사선을 조사하고, 상기 간암모델로부터 간암조직을 추출한 후, 면역형광염색을 통해 분석한 사진이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 방사선을 처리하지 않은 간암조직(tumor control), 10 Gy의 방사선을 단일로 처리한 간암조직(SIR) 및 방사선을 2 Gy씩 5 번으로 분할하여 처리한 간암조직(FIR)을 비교하였을 때, SIR, FIR이 방사선을 처리하지 않은 간암조직에 비해 현저히 증가된 MCP-1/CCL2의 발현을 확인할 수 있었다. *P<0.05; **P<0.001.

도 4는 방사선을 처리하지 않은 간암모델(tumor control), 10 Gy의 방사선을 단일로 처리한 간암모델(SIR) 및 방사선을 2 Gy씩 5번으로 분할하여 처리한 간암모델(FIR)로부터 추출한 각 간암조직에서 세포용출액을 획득하여, 이를 훼스턴 블랏으로 분석한 사진(a)과 그래프(b)로, 방사선을 처리하지 않은 간암조직(tumor control), 10 Gy의 방사선을 단일로 처리한 간암조직(SIR) 및 방사선을 2 Gy씩 5 번으로 분할하여 처리한 간암조직(FIR)을 비교하였을 때, SIR, FIR이 방사선을 처리하지 않은 간암조직보다 우수한 MCP-1/CCL2의 증가를 확인하였다. *P<0.05; **P<0.001.

실시예 3. 간암 치료용 조성물(MSCs/IL12)의 이동능력 분석

앞선 실시예 2를 통해 방사선 조사에 의해 간암세포주 내에 MCP-1/CCL2가 증가한다는 것을 확인한 바 있으나, 상기 증가된 MCP-1/CCL2가 MSCs/IL12의 이동능력에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 1-1로부터 제조된 간암 치료용 조성물(MSCs/IL12)에 MCP-1/CCL2를 각각 0, 1, 6 ng/ml로 처리하여 이동능력을 조사하였다.

도 6은 배양한 MSCs/IL12에 방사선을 조사하여 MCP-1/CCL2 사이토카인을 증가시킨 후, 이와 관련 수용체인 CCR2의 증가를 나타낸 결과사진으로, 도 6a는 MCP-1/CCL2 사이토카인이 증가되기 전이고, 도 6b는 MCP-1/CCL2 사이토카인이 증가한 후의 사진이다.

도 6에 나타난 바와 같이, MCP-1/CCL2 사이토카인이 증가되기 전에 비해 증가되고 난 후, CCR2의 발현이 증가하였다는 것을 확인 할 수 있으며, 이를 통해 MCP-1/CCL2를 잘 인지하고 있음을 알 수 있다. *P<0.05

도 7은 간암세포주에 방사선을 조사한 후 변화하는 MCP-1/CCL2 사이토카인의 농도인 0, 1, 6 ng/ml으로 처리하여 MSCs/IL12 세포의 이동능력을 나타낸 결과그래프이다.

도 7에 나타난 바와 같이, MCP-1/CCL2 사이토카인이 1 ng/ml인 최저농도조건에서도, MSCs/IL12의 이동능력이 유의성 있게 증가한다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 간암세포주에 방사선을 조사하지 않아 MCP-1/CCL2가 발현되지 않은 것보다 방사선을 조사하여 MCP-1/CCL2가 미량이라도 발현된 경우, 본 발명의 MSCs/IL12의 이동능력을 향상시킨다는 것을 확인하였다. *P<0.05.

도 8은 간암모델에 방사선을 조사한 후, MSCs/IL12를 간암세포에 직접 주입하였으며, 상기 주입된 MSCs/IL12의 간암세포 내에서 상주 상태를 확인하기 위하여 비침습적 영상 시스템으로 촬영한 사진이다. 이를 통해 직접 간암세포에 MSCs/IL12를 주사하고 난 후 30분 후부터 간암세포 내에 잘 유지되는 것을 확인하였다.

도 9a와 도 9b는 간암모델에 방사선을 조사한 후, MSCs/IL12를 간암세포에 직접 주입하였으며, 상기 주입된 MSCs/IL12의 간암세포 내에서 상주 상태를 확인하기 위하여, 5일이 지난 후, CD73과 CD90을 마커로 면역형광염색하여 분석한 사진과 그래프이다.

이때, 상기 간암모델은 각각 방사선과 MSCs/IL12로 치료하지 않은 간암모델(tumor control), MSCs/IL12를 단독으로 처리한 간암모델(MSCs/IL12), 10 Gy의 방사선을 단일로 처리한 간암모델(SIR) 및 방사선을 2 Gy씩 5 번으로 분할하여 처리한 간암모델(FIR)이다.

도 9에 나타난 바와 같이, MSCs/IL12을 단독으로 처리한 간암모델에 비하여 방사선 조사와 MSCs/IL12 투입이 병행된 간암모델에서 간암세포 내 MSCs/IL12의 지역화가 가장 높게 확인되었다. *P<0.05; **P<0.001. IL12; interleukin 12, CCR2; C-C chemokine receptor 2, MSCs/IL12; IL-12-expressing mesenchymal stem cell, CD; cluster differentiation.

실시예 4. 방사선 조사, MSCs/IL12 투여의 병용치료를 통한 전이성 간암의 치료효과 확인

상술한 실시예 2, 3에서 간암세포에 방사선을 조사하면 화학주성 사이토카인인 MCP-1/CCL2가 증가하고, 이로 인해 간암세포 내에 MSCs/IL12의 지역화가 증가되는 것을 확인하였다.

따라서, 상술한 결과들을 종합하여 방사선 조사와 MSCs/IL12 투여의 효과적인 병행치료를 위한 전략을 수립하였다. 이러한 치료전략의 효과를 확인하기 위하여 다양한 치료조건을 적용한 간암모델로 치료그룹으로 나누고, 이의 항암효과를 비교분석하였다.

치료그룹 1(tumor control): 상기 간암모델에서 간암세포가 8 mm까지 성장하였을 때, 방사선 처리 및 MSCs/IL12 투여 모두 하지 않은 그룹

치료그룹 2(SIR): 상기 간암모델에서 간암세포가 8 mm까지 성장하였을 때, 10 Gy 방사선을 초기에 한번 단독 처리한 그룹

치료그룹 3(FIR): 상기 간암모델에서 간암세포가 8 mm까지 성장하였을 때, 10 Gy 방사선을 초기에 2Gy씩 5번으로 분할하여 처리한 그룹

치료그룹 4(MSCs/IL12): 상기 간암모델에서 간암세포가 8 mm까지 성장하였을 때, 초기에 MSCs/IL12를 단독으로 투여하고, 7 일 후 한번 더 투여한 그룹

치료그룹 5(SIR+MSCs/IL12): 상기 간암모델에서 간암세포가 8 mm까지 성장하였을 때, 10 Gy 방사선을 초기에 한번 단독 처리하면서, MSCs/IL12를 병용 투여하고, 7 일 이후에 한번 더 MSCs/IL12를 투여한 그룹

치료그룹 6(FIR+MSCs/IL12): 상기 간암모델에서 간암세포가 8 mm까지 성장하였을 때, 10 Gy 방사선을 초기에 2 Gy씩 5 번으로 분할하여 처리하면서, MSCs/IL12를 병용 투여하고, 7 일 이후에 한번 더 MSCs/IL12를 투여한 그룹

도 12는 각 치료조건에서의 간암모델의 간암세포 성장을 살펴본 결과로, 단일 방사선 또는 분할 방사선 조사와 MSCs/IL12 투여의 병행치료한 간암모델에서 가낭 간암세포 성장이 억제되었음을 확인하였다. *P<0.05; **P<0.001; #P<0.05.

도 13은 간암세포 성장의 억제 정도에 따라 생존률이 증가하는 것을 나타낸 그래프이다. 방사선 조사 및 MSCs/IL12 투여 모두 하지 않은 간암모델이 다른 간암모델에 비해서 일찍 사망한 시점에서, 단일 방사선과 MSCs/IL12 투여를 병행한 간암모델은 생존률이 60% 이상 증가하였고, 분할 방사선과 MSCs/IL12 투여를 병행한 간암모델은 생존률이 80% 이상 증가하였다는 것을 확인하였다. *P<0.05; **P<0.001.

도 14는 Hepa1-6, HCa-1 각 간암모델은 상기와 같은 치료과정 시작하고, 각각 14일과 20일 후에 폐 전이를 관찰하여 촬영한 사진과 그래프로, 생존률이 제일 높은 방사선 조사, MSCs/IL12 투여의 병행치료한 간암모델에서 페 전이가 효과적으로 억제되었다는 것을 확인할 수 있다. *P<0.05; **P<0.001.

실시예 5. MSCs/IL12의 종양 내 지역화에 의한 IL-12 사이토카인의 증가 확인

형질변환된 간엽줄기세포를 제조한 요인은 항암 치료가 필요한 종양 부위에 유효성분인 IL-12 사이토카인을 지속적으로 공급하기 위함으로, 우선, 본 발명으로 제조된 MSCs/IL12로부터 IL-12 사이토카인이 효과적으로 발현이 되는지를 확인하였다. 이의 결과는 하기 도 15에 나타내었다.

도 15는 IL-12를 발현하는 아데노바이러스를 농도별로 간엽줄기세포에 감염시킨 후, 이의 IL-12 발현량을 나타낸 그래프로, IL-12를 발현하는 아데노바이러스의 농도가 50 mol일 때, 유의성 있게 IL-12가 발현되었고, 100 mol일 때는 더 많은 IL-12를 발현하나, MSCs/IL12 세포가 만들어 진 후 세포의 생존률이 많이 떨어진다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서는 IL-12를 발현하는 아데노바이러스를 50 mol을 적정농도로 한다.

또한, 치료전략에 따라 간암세포 내에서 IL-12 사이토카인의 발현정도를 확인하였으며, 이를 도 16에 나타내었다.

도 16은 간암모델의 간암세포로부터 단백질을 추출하여 각 치료그룹별로 IL-12의 발현을 웨스턴 블랏으로 분석한 사진과 그래프로, 치료그룹 5와 6에서 IL-12의 발현이 가장 높은 것을 확인하였다. *P<0.05; **P<0.001.

도 17은 각 치료그룹에서 IL-12의 수용체인 IL-12R의 발현을 확인한 결과 사진과 그래프로, 치료그룹 5와 6에서 간암세포 내 MSCs/IL12의 상주 증가에 의해 IL-12의 발현이 증가되고, 이를 수용하는 수용체인 IL-12R 역시 증가하였음을 관찰하였다. *P<0.05; **P<0.001.

실시예 6. 종양미세환경 내 IL-12 사이토카인의 발현 증가에 의한 항암효과 관련 면역세포의 유도

생체 외에서 항원이 침입하면, 대식세포나 수지상 세포가 이를 인지하고, IL-12 사이토카인을 발현하게 된다. 상기 IL-12 사이토카인의 증가는 각종 T 세포나 자연 살상 세포의 분화를 촉진하여 세포독성을 활성화시키게 된다. 따라서, 본 발명에서는 방사선 조사와 MSCs/IL12 투여의 병행치료로 발현되는 IL-12 사이토카인이 간암세포의 미세환경 내에서 어떠한 면역반응을 보이는지 조사하였다.

도 18은 세포독성 T세포로 알려진 CD8 T세포의 분화정도 나타낸 그래프로, 아무치료도 받지 않은 치료그룹 1에서 약 7 %였고, 치료그룹 2, 3에서 각각 3.1%와 3.2 %로 오히려 분화가 감소되었으며, 치료그룹 4에서는 12.2 %로 IL-12에 의해 CD8 T세포의 분화가 증가하였으며, 치료그룹 5, 6에서는 각각 19.1 %와 28.8 %로 CD8 T세포가 유의성 있게 증가한다는 것을 확인하였다.

도 19는 자연 살상 세포 분화를 보기 위하여 CD57 마커를 염색하여 활성화된 자연 살상 세포를 나타낸 사진으로, 치료그룹 1, 2, 3 및 4에 비해 치료그룹 5, 6에서 활성화된 자연 살상 세포의 유입이 증가하고 있는 것을 확인하였다.

실시예 7. IL-12 유도 CD8 T세포 및 자연 살상 세포에 의한 세포사멸 정도 확인

간암 세포내에서의 MSCs/IL12 지역화로 인해 IL-12 사이토카인의 발현이 증가하므로 CD8 T세포와 자연 살상 세포를 유도하여 직접적인 항암 작용하는데, 이러한 과정을 확인하기 위하여 각 치료그룹별 간암조직 내에서의 세포사멸정도를 조사하였다. 이를 도 20에 나타내었다.

치료그룹 1은 세포사멸 부위가 약 5% 이내의 적은 부위에서 부분적으로 관찰되었고, 치료그룹 4는 세포사멸 부위가 치료그룹 1에 비해 약 27 % 정도로 증가되었으며, 치료그룹 2, 3은 세포사멸 부위가 치료그룹 1, 4에 비해 약 30~33 %로 유의성있게 증가되었음을 확인하였다.

한편, 방사선 조사의 본 치료목적은 고 에너지의 빔을 쏘아 암 세포를 파괴하는 용도이기 때문에 세포사멸을 보인 것으로, 방사선 조사를 수행 한 후 MSCs/IL12를 투여한 치료그룹 5, 6에서 치료그룹 1, 4에 비해 45~55 %로 더 증가하였음을 확인할 수 있었다.

보다 구체적으로, 고량의 방사선을 지속적으로 처리하는 치료방법은 방사선 피폭이나 정상조직의 파괴 등의 위험과 부작용이 존재하는데 반해, 적절한 농도의 방사선으로 종양 미세환경을 조절하여 MCP-1/CCL2의 발현을 증가시킴으로써, MSCs/IL12의 지역화가 유도되어 IL-12 사이토카인의 발현이 증가하게 되어 우수한 항종양 효과를 나타낸다.

따라서, 이와 같은 방사선 조사 및 간암 치료용 조성물의 병용치료는 면역세포를 간암세포로 유도하여 간암을 치료하므로, 간암에 대한 살상 능력이 뛰어나고, 정상세포의 파괴를 유발하지 않으면서, 세포사멸을 유발하는 방사선을 소량으로 조사하여도 우수한 항종양효과를 낼 수 있으므로 매우 바람직한 치료방법이자, 간암치료용 조성물이다.

Claims (8)

1. IL-12을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 간엽줄기세포를 포함하고,
   상기 간엽줄기세포로부터 IL-12의 발현을 증가시키기 위해 방사선 요법과 병용되는 것이고,
   상기 방사선 조사는 종양 부위에 2 Gy 내지 10 Gy로, 1회 내지 5회 분할하여 조사되는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 간암 치료용 조성물은 방사선 요법과 병용하여 1 회 이상 투여되는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 간암 치료용 조성물은 방사선 요법과 동시에 혹은 1~7 시간 후에 투여되고,
   4~8 일 이내에 한번 더 투여되는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 간암 치료용 조성물은 상기 간엽줄기세포의 세포수가 10⁴-10⁷ 개로 포함되는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
5. (a) 간암에 걸린 포유동물의 종양 부위에 2 Gy 내지 10 Gy로, 1회 내지 5회 분할하여 방사선을 조사하는 단계; 및
   (b) IL-12를 분비하는 간엽줄기세포(MSCs)를 포함하는 간암 치료용 조성물을 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 간암 치료방법.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 간암 치료용 조성물은 방사선 조사 후, 1~10 시간 후에 처리하는 것을 특징으로 하는 간암 치료방법.
8. 제5항에 있어서,
   상기 (b) 단계 후, 상기 간암 치료용 조성물을 방사선 조사 4~8 일 후에 추가로 투여하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 치료방법.

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