KR19990063611A - 로도코커스 종 igts8에 의한 dbt의 탈황반응에 사용되는dszd - Google Patents

로도코커스 종 igts8에 의한 dbt의 탈황반응에 사용되는dszd Download PDF

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케빈 에이. 그레이
찰스 에이취. 스콰이어스
다니엘 제이. 몬티셀로
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다니엘 제이. 몬티셀로, 죤 에이치. 웹, 마아크 더블유. 죤, 폴 지. 브라운 더 써드, 로버트 이. 레비
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Abstract

본 발명은 생촉매에 산화환원 효소를 첨가함으로써 화석 연료의 탈황 반응 속도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 a) 화석 연료를 탄소-황 결합을 절단할 수 있는 생촉매 및 속도 증가 양의 산화환원 효소를 함유하는 수성상과 접촉시켜서, 화석 연료와 수성상 혼합물을 형성시키는 단계;
b) 생촉매로 유기 황 분자의 탄소-황 결합을 절단하기에 충분한 조건하에 단계 a)의 혼합물을 유지시켜서, 유기 황 성분이 감소된 화석 연료를 생성시키는 단계; 및
c) 생성된 수성상으로부터 유기 황 성분이 감소된 화석 연료를 분리하는 단계를 포함하여, 유기 황 화합물을 함유하는 화석 연료의 탈황반응의 속도를 증가시키는 방법을 나타내었다. 본 발명은 또한 유기 황 분자를 함유하는 화석 연료를 탈황시킬 수 있는 생촉매를 코드화하고, 산화환원 효소를 코드화하는 하나 이상의 재조합 DNA 분자를 함유하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 유기 황 분자를 함유하는 화석 연료를 탈황시킬 수 있는 생촉매 및 (b) 산화환원 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

로도코커스 종 ＩＧＴＳ8에 의한 ＤＢＴ의 탈황반응에 사용되는 ＤｓｚＤ
화석 연료의 미생물 탈황반응은 오십년에 걸친 활발한 연구 분야였다. 이러한 연구의 목적은 석탄, 원유 및 석유 증류물과 같은 화석 연료로부터 황을 연소전 제거하기 위한 생물공학 기본된 방법을 개발하는 것이다. 화석 연료에서 황 수준의 증가와 황 방에 대한 더욱 더 엄격한 규제가 탈황반응 방법의 발달에 대한 원동력이다. [참고 문헌 : Monticello et al., "Practical Considerations in Biodesulfurization of Petroleum," IGT's 3d Intl. Symp. on Gas, Oil, Coal and Env. Biotech., (Dec. 3-5, 1990) New Orleans, LA.].
미국 특허 제 5,356,801호, 제 5,358,870호, 제 5,358,813호, 제 5,198,341호, 제 5,132, 219호, 제 5,344,778호, 제 5,104,801호 및 제 5,002,888호에 기재된 생촉매 및 방법을 포함하는 많은 생촉매 및 방법은 화석 연료를 탈황시키기 위해 발달되어 왔으며, 상기 문헌은 본원에서 참고 문헌으로 인용하였다. 경제적인 면에서 분석하여 보면, 상기 기술을 상업화하는데 있어서의 한가지 한계는 탈황반응과 관련된 박테리아 및 효소와 같은 생촉매의 특이적 활성 및 반응 속도를 개선시키는 것임을 나타낸다. 관련 문헌에서 보고된 반응 속도 및 특이적 활성(제거된 황/시간/생촉매의 그램)은 최적의 상업상 기술에 필요한 값 보다 훨씬 낮다. 따라서, 생촉매의 장명 및 특이적 활성에서의 개선이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 단백질의 한 종(이들중 하나는 최근에 로도코커스 종. IGTS8로부터 정제되었음)이 화석 연료의 탈황반응과 관련된 두 가지의 모노옥시게나아제(DszC 및 DszA)를 활성시킴을 발견한 것에 관한 것이다. DszC 및 DszA 둘 모두는 균질하게 정제될 경우 효소적으로 활성화되지 않는다; 그러나, 상기 부가 단백질(본원에서는 DszD로 칭함)을 첨가하자, 효소적 활성이 회복되었다. 상기 단백질의 기능은 NADH의 산화를 기질 분자의 산소화와 결부시키는 것으로 여겨진다. 서열 데이터베이스를 탐색하여 보면, DszD가 최근에 확인된 또 다른 로도코커스 단밸질 즉, ThcE와 동등함을 나타내며, 상기 로도코커스 단백질은 아트라진, 티오카르바메이트 제초제 및 일차 알코올의 존재하의 배양에 의해 유도된다. 서열 상사성에 의하면, ThcE는 그룹 Ⅲ 알코올 탈수소효소 또는 산화환원 효소(알코올 : N,N'-디메틸-3-니트로소아닐린 산화환원 효소로 칭함)의 한 성분으로 여겨진다. DszD는 분자량이 약 50,000(SDS-PAGE에 의해)인 단량체를 갖지만, HPLC 크기 배제 크로마토그래피상에서 다중제 단백질(데카머(decamer))로서 작용한다. DszD에 의한 DszC 및 DszA의 활성화는 포화 반응과정을 따른다.
따라서, 본 발명은 화석 연료의 미생물 탈황반응이 생촉매 또는 반응 배지에 산화환원 효소를 첨가함으로써, 또는 첨가함에 의존하여 증가되거나 활성화됨을 발견한 것에 관한 것이다. 본 발명은
a) 화석 연료를 탄소-황 결합을 절단할 수 있는 생촉매 또는 생촉매들(예, Dsz A, Dsz B 및/또는 Dsz C) 및 속도 증가 양의 산화환원 효소를 함유하는 수성상과 접촉시켜서, 화석 연료와 수성상 혼합물을 형성시키는 단계;
b) 생촉매로 황 분자의 탄소-황 결합을 절단하기에 충분한 조건하에 단계 a)의 혼합물을 유지시켜서, 유기 황 성분이 감소된 화석 연료를 생성시키는 단계; 및
c) 생성된 수성상으로부터 유기 황 성분이 감소된 화석 연료를 분리하는 단계를 포함하여, 유기 황 화합물을 함유하는 화석 연료의 탈황반응 속도를 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 DszA 및/또는 DszC에 의해 촉매된 반응의 속도를 속도 증가 양의 산화환원 효소로 증가시키는 것에 관한 것이다. 이들은 예를 들어, 산화환원 효소를 생촉매에 첨가함으로써 또는 생촉매중의 산화환원 효소를 과발현시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명은 유기 황 분자를 함유하는 화석 연료를 탈황반응 시키기 위한 방법에서 하나 이상의 단계를 촉매시킬 수 있는 생촉매를 코드화하고, 산화환원 효소를 코드화하는 하나 이상의 재조합 DNA 분자를 함유하는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 (a) 유기 황 분자를 함유하는 화석 연료를 탈황반응 시키기 위한 방법에서 하나 이상의 단계를 촉매시킬 수 있는 생촉매 및 (b) 산화환원 효소를 포함하는 조성물을 포함한다.
도 1은 이온 교환 크로마토그래피 후의 DszC 및 DszA 활성 그래프이다. DszC(15㎍)을 각각의 분획에 첨가하고, DBT에서 DBTO 및 DBTO2까지의 전환을 시험하였다. DszA(5㎍)을 각각의 분획에 첨가하고, DBT 술톤에서 BHBP로의 전환을 시험하였다. 내생적 DszC 활성을 또한 시험하였다.
도 2는 슈퍼덱스(Superdex) 75 크기 배제 크로마토그래피 후의 DszC 활성 그래프이다. DszC(15㎍)을 각각의 분획에 첨가하고, DBT에서 DBTO2까지의 전환을 시험하였다. 슈퍼덱스 75 크기 배제 크로마토그래피후의 DszA 활성 그래프이다. DszA(5㎍)을 각각의 분획에 첨가하고, DBT 술톤에서 BHBP로의 전환을 시험하였다.
도 3은 DszD의 정제를 위한 SDS-PAGE(14% 아크릴아마이드)를 나타내는 전기영동 겔이다. 레인 1은 표준 분자량(바이오래드(상표명:Biorad), 200, 116, 97.4, 66, 45, 31, 21.5 및 14.5 kDa); 레인 2는 정제하지 않은 세포 분해질; 레인 3은 Q-세파로오즈후의 세포 분해질; 레인 4는 토이오펄(Toyopearl)-DEAE후의 세포 분해질; 레인 5는 모노큐(Mono Q) 후의 세포 분해질; 레인 6은 슈퍼덱스 75후의 세포 분해질을 나타낸다.
도 4는 DszD의 양을 증가시키면서 첨가함에 따른 DszC의 활성을 나타낸다. DszC(0.33nmol)의 고정된 양에 DszD의 양을 증가시키면서 적정하였다.
도 5는 DszD의 양의 증가에 따른 DszA의 활성을 나타낸다. DszA(0.16nmol)의 고정된 양에 DszD의 양을 증가시키면서 적정하였다.
도 6은 ThcE(DszD) 유전자의 DNA 서열 및 추정되는 아미노산 서열이다.
석유 추출 및 정제 기술 분야에서, 본 원에서 사용된 용어 "유기 황"은 하나 이상의 황 원자(헤테로원자로 칭함)가 공유적으로 결합되는 탄화수소 골격을 갖는 유기 분자를 언급하는 것으로서 일반적으로 이해된다. 상기 황 원자는 예를 들어, 하나 이상의 탄소-황 결합에 의해 탄화수소 골격에 직접적으로 결합될 수 있거나, 분자의 탄화수소 골격에 결합된 치환기, 예를 들어 황산염 기에 존재할 수 있다. 하나 이상의 황 헤테로원자를 갖는 유기 분자의 일반적인 종은 "유기황 화합물"로서 언급된다. 상기 화합물의 탄화수소 부분은 지방족 및 방향족, 또는 부분적으로 지방족 및 부분적으로 방향족일 수 있다.
하나 이상의 황 헤테로원자가 방향족 탄소-황 결합에 의해 탄화수소 골격중의 인접한 탄소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되는 고리형 또는 축합된 다중고리 유기황 화합물은 "황 함유 헤테로고리"로서 언급된다. 많은 유형의 황 함유 헤테로고리에 존재하는 황은 황 헤테로 원자가 존재하는 5 원 방향족 고리를 고려하여 "티오펜 황"으로 언급된다. 가장 단순한 이러한 황 함유 헤테로고리는 조성물이 C4H4S인 티오펜이다.
황 함유 헤테로고리는 수소화탈황반응(HDS)과 같은 통상적인 탈황 처리에 안정한 것으로 공지되어 있다. 황 함유 헤테로고리는 상대적으로 단순하거나 상대적으로 복잡한 화학 구조를 가질 수 있다. 복잡한 헤테로고리에는, 다중으로 축합된 방향족 고리가 존재하는데, 이들 고리중 하나 이상은 헤테로고리일 수 있다. 탈황반응의 어려움은 분자의 구조적 복잡성과 함께 증가된다. 이것은 내화 작용이 디벤조티오펜(DBT, C12H8S)과 같은 황 함유 헤테로고리에서 가장 두드러질 수 있음을 의미한다.
DBT는 5 원 티오펜 고리가 두 개의 6 원 벤질 고리에 의해 측면에 정위되는 축합된 다중의 방향족 고리를 갖는 황 함유 헤테로고리이다. 화석 연료 정제 중간물 및 가연 생성물에서 많이 잔류하는 후-HDS 유기 황은 티오펜 황이다. 이러한 잔류 티오펜 황의 대부분은 측면의 벤질 고리의 한쪽 또는 양쪽 모두에 존재하는 하나 이상의 탄소 원자에 부착된 하나 이상의 알킬기 또는 아릴기를 갖는 DBT 및 이들의 유도체로서 존재한다. DBT 자체는 티오펜 황과 관련된 반응에서 DBT 및 이들의 유도체를 포함하는 화합물의 종의 작용물의 예증이 되는 모델 화합물로서 관련 분야에서 취급되고 있다. [참고 문헌 : Monticello and Finnerty, Annual Reviews in Microbiology 39 : 371-389 (1985) at 372-373]. DBT 및 이들의 유도체는 특정 원유, 석탄 및 역청의 총 황 함량의 상당한 퍼센트를 차지한다. 예를 들어, 상기 황 함유 헤테로고리는 웨스트 텍사스 원유의 총 황 함량의 70 wt% 정도 및 미들 이스트 원유의 총 황 함량의 40 wt% 이하를 차지하는 것으로 보고되어 왔다. 따라서, DBT는 특정 지역 원유, 석탄 또는 역청과 같은 화석 연료 및 이들로 부터의 다양한 정제 중간물 및 연료 생산물에서 발견된 티오펜 황의 형태에 대한 모델 화합물로서 특정하게 관련된 것으로 여겨진다. DBT 및 이들의 유도체의 또 다른 특징은 환경으로 화석 연료의 방출후에, 상기 황 함유 헤테로고리가 상당히 생물 분해되지 않고 장 기간 동안 잔존한다는 것이다. [참고 문헌 : Gundlach et al. Science 221 : 122 - 129 (1983)]. 따라서, 화석 연료 또는 유기황을 함유하는 다른 탄소성 물질로부터 유기황 화합물을 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 탈황 처리에 적합한 화석 연료 또는 탄소성 물질은 유기 황을 함유한 물질이다. 이러한 화석 연료는 "기질 화석 연료"로서 언급된다. 특히, 티오펜 황이 풍부한 기질 화석 연료는 본 원에 설명된 방법에 따른 탈황반응에 적합하다. 이러한 기질 화석 연료의 예는 세로 네그로(Cerro Negro) 또는 오리노코(Orinoco) 중 원유; 아타바스칸 타르(Athabascan tar) 및 다른 유형 역청; 고리형 오일, 대기압 가스성 중유 및 제 1 디젤 오일과 같은 석유 정제 분획; 및 포카혼타스(Pocahontas) #3, 루이스-스톡(Lewis-Stock), 오스트레일리안 글렌코(Australian Glencoe) 또는 웨닥(Wyodak) 석탄과 같은 원료로부터 제조된 석탄 유도 액체를 포함한다.
생촉매적 탈황반응 또는 BDS는 생촉매로 상기 화합물중의 탄소-황 결합을 산화 절단(바람직하게는 선택적으로)함으로써, 황 함유 헤테로고리와 같은 내화성 유기황 화합물을 포함하는 유기황 화합물로부터 황을 삭제, 유리 또는 제거시키는 반응이다. BDS 처리는 분별 증류법 또는 물 추출법과 같은 공지된 기술에 의해 서로 쉽게 분리될 수 있는 무기 황 물질과 함께 상기 내화성 유기황 화합물이 탈황된 탄화수소 골격을 생성시킨다. 예를 들어, DBT는 BDS 처리로 처리할 경우, 히드록시비페닐로 "전환"된다.
BDS는 생촉매(들)에 의해 수행된다. 생촉매는 유기황 화합물에서 황 함유 헤테로고리를 포함하는 화합물로부터 황의 산화 및/또는 탄소-황 결합의 절단에 의한 황의 제거를 단독으로 또는 서로 서로 제휴하여 지시하는 하나 이상의 효소를 기능적으로 발현시키는 하나 이상의 비사람 유기체(예를 들어, 재조합 및 비재조합 미생물, 생육 가능한 및 불가능한 미생물); 이러한 유기체로부터 수득된 하나 이상의 효소; 또는 이러한 유기체 및 효소의 혼합물을 포함한다. 화석 연료 또는 다른 탄소성 물질의 탈황반응에 필요한 하나 이상의 생촉매 활성을 나타내는 유기체는 본원에 Dsz+로서 언급하였다. 생촉매 활성이 결여된 유기체는 본원에서 Dsz-로서 언급하였다. "생촉매"는 본원에서 생물학적 물질 또는 생물학적 기원의 물질로서 정의되었고, 이들은 예를 들어, 적당한 조-인자 및/또는 조-효소의 존재하에 하나 이상의 반응을 촉진시키는 능력을 갖는다.
본 발명은 탄소성 물질을 탈황시킬 수 있는 생촉매에 속도 증가 양의 산화환원 효소를 첨가함을 포함하여, 유기 황 분자를 함유하는 화석 연료와 같은 탄소성 물질로부터 황을 제거하는 개선된 방법에 관한 것이다.
본 원에 사용된 생촉매은 일반적으로 당해분야에 공지되어 있다. 몇몇의 연구자들은 DBT를 이화시킬 수 있는 돌연변이 계통으로의 천연 박테리아의 유전적 변이를 발표하였다. [참고 문헌 : Kilbane, J.J.,Resour. Cons. Recycl.3:69-79 (1990), Isbister, J.D., and R.C. Doyle, U.S. Patent No. 4,562,156 (1985), and Hartdegan, F.J. et al.,Chem. Eng. Progress63-67 (1984)]. 많은 이러한 돌연변이체는 DBT를 비특이적으로 탈황시킨다. 따라서, 연료 가치의 일부가 이러한 미생물의 작용을 통하여 손실된다. 이스비스터(Isbister) 및 돌리(Doyle)는 DBT로부터 황을 선택적으로 유리시킬 수 있는 것으로 나타난 슈도모나스(Pseudomonas)의 돌연변이 계통의 유도체를 발표하였다.
킬반(Kilbane)은 혼합된 박테리아 배양물의 돌연변이 유발을 발표하였으며, 산화 경로에 의해 DBT로부터 황을 선택적으로 유리시킬 수 있는 박테리아를 상기 돌연변이 유발에 의해 생산하였다. 상기 배양물은 하수구의 침전물, 석유 정제 폐수, 정원 흙, 석탄, 타르로 오염된 흙 등과 같은 천연 공급원로부터 수득될 수 있는 박테리아로 구성되어 있으며, DBT 존재하의 지속적인 황 부족 조건으로 배양을 유지하였다. 그 후, 배양물을 화학적 돌연변이원 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘에 노출시켰다. 상기 돌연변이체 배양에 의한 DBT 물질대사의 주요 이화 작용의 생성물은 히드록시비페닐이며; 황은 수용성 무기 황산염으로서 방출되고, 탄화수소 부분 분자는 모노히드록시비페닐로서 본질적으로 손상되지 않으면서 유지된다. 본원에서 문헌[Kilbane, J.J.,Resour. Cons. Recycl.3: 69-79 (1990)]의 설명은 참조로 인용한다.
킬반은 또한 상기 혼합된 박테리아 배양으로부터 로도코커스의 돌연변이 계통을 분리하였다. 상기 돌연변이체, 즉 IGTS8 또는 ATCC 제 53968번은 본 발명에 이용하는 데에 특히 바람직한 생촉매가다. 상기 돌연변이체의 분리 및 특징은 문헌[J.J. Kilbane, U.S. Patnet No. 5,104,801]에 상세히 설명되어 있으며, 이는 본원에 참고 문헌으로 인용되었다. 상기 미생물은 부다페스트 조약에 의거한 미국 20852 메릴랜드 록빌 파크 론 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC)에 기탁되어 있으며, ATCC 기탁 번호 제 53968번으로서 선정되었다. 하나의 적합한 ATTC 번호 53968번 생촉매 제제는 미국 특허 제 5,104,801호에 설명된 방법에 의해 일반적으로 제조된 살아있는 미생물, 및 이들의 돌연변이체 또는 유도체의 배양으로 달성된다[참고 : 미국 특허 제 5,358,869호]. 미국 특허 제 5,132,219호, 제 5,344,778호 및 제 5,358,870호에 설명된 방법에 의해 일반적으로 제조된 ATCC 제 53968번 또는 이들의 돌연변이체로부터 수득된 세포 유리 효소 제제가 또한 이용될 수 있다. 더욱이, 상기 효소 제제가 정제되고 사용될 수 있다.
동일하거나 유사한 방식으로 작용하는 것으로 나타난 미생물의 또 다른 예는 문헌[Kilbane (1990), 3 Resour. Conserv. Recycl. 69-79]에 개시된 미생물 조합체(몇몇 미생물의 혼합체) 및 킬반의 미국 특허 제 5,002,888호(1991년 3월 26일자 허여됨), 제 5,104,801호(1992년 4월 14일자 허여됨), 제 5,344,778호, 제5,132,219호, 제 5,198,341호, 제 5,344,778호, 제 5,356,813호, 제 5,356,801호, 제 5,358,869호, 제 5,358,870호(또한 문헌[Kilbane(1990), Biodesulfurization: Future Prospects in Coal Cleaning, in Porc, 7th Ann. Int'l. Pittsburgh Coal Conf. 373-382]에 기재됨), 및 제 5,198,341호(1993년 3월 30일자 허여됨); 및 문헌[Omori et al. (1992), Desulfurization of dibenzothiophene byCorynebacteriumsp. strain SY1, 58 Appl. Env. Microbiol. (No. 3) 911-915]; 및 문헌[Izumi et al., Applied and Environmental Microbiology 69:223-226 (1994)]에 기재된 미생물을 포함하며, 상기 문헌은 본원에 참고 문헌으로 인용되었다.
상기 미생물 각각은 본 발명에서 생촉매로서 작용할 수 있으며, 그 이유는 이들 각각은 황이 내화성 유기황 화합물로부터 삭제됨으로써 특이적 화학 반응(들)을 수행하는 하나 이상의 효소(단백질 생촉매)를 생성하기 때문이다. 상기에 기재된 미국 특허에 의해 예시된 것으로서, 상기 미생물 일부의 돌연변이 또는 유전자 조작된 유도체는 적당한 생촉매 기능이 유지되는 한 본 원에서 생촉매로서 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 탈황 과정에서 생촉매 또는 생촉매 공급원으로 사용하기에 적합한 추가의 미생물은 공지된 기술에 의해 천연 미생물로부터 유도될 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이, 이러한 방법은 단독 황 공급원으로서의 황 함유 헤테로고리와 같은 내화성 유기황 화합물의 존재하에 미생물을 배양하는 선택적인 배양 조건하에 하수구 침전물, 석유 정제 폐수, 정원 흙, 석탄 또는 타르로 오염된 흙과 같은 천연 공급원으로부터 수득된 미생물의 제제를 배양시키는 방법; 화학적 또는 물리적 돌연변이원에 미생물의 제제를 노출시키는 방법; 또는 상기 방법을 조합한 방법을 포함한다. 이러한 기술은 이즈비스터와 돌리(Isbister and Doyle)의 미극 특허 제 4,562,156호(1985년 12월 31일자 허여됨); 문헌[3 Resour. Conserv. Recycl. 69-79 (1990)], 미국 특허 제 5,002,888호, 제 5,104,801호 및 제 5,198,341호 및 문헌[Omori and coworkers in 58 Appl. Env. Micorbial. (No. 3) 911-915(1992)]에 상세히 설명되 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고 문헌으로 인용되었다.
상기에 설명한 바와 같이, 효소는 살아있는 세포로부터 생성될 수 있는 단백질 또는 펩티드 생촉매가다. 효소는 이들의 생성물을 위해 자신을 소모시키지 않으면서 특이적 화학 반응 또는 일련의 반응(경로로서 언급됨)의 발생을 촉진하거나, 지시하거나, 용이하게 한다. 효소는 하나 이상의 비변형된 폴리펩티드 사슬, 복사 또는 합성 후 변형된 폴리펩티드 사슬, 또는 이들의 단편 또는 일부를 포함할 수 있으며, 적당한 추가적 조효소, 조인자 또는 조반응물이 존재하는 경우, 원하는 반응 또는 일련의 반응을 촉매한다. 본 발명의 한 구체예에 관련된 반응 또는 일련의 반응은 황 함유 헤테로고리와 같은 내화성 유기황 화합물의 탄화수소 골격으로부터 황의 삭제를 최고에 이르게 한다. 상기 내화성 유기황 화합물의 탄화수소 골격는 실질적으로 손상되지 않은 채로 유지될 수 있다. 바람직하고 유리하게도, 본 발명에 생촉매로서 사용된 미생물 또는 효소는 성장을 위한 탄소 공급원으로서의 상기 내화성 유기황 화합물의 탄화수소 골격을 소모하지 않는다. 그 결과, BDS 처리된 물질 화석 연료의 연료 가치는 저하되지 않는다.
본원에 생촉매로서 살아있는 미생물(예를 들어, 배양된)이 이용될 수 있지만, 필요한 것은 아니다. 본 발명에 유용한 생촉매 효소 제제는 통상적인 방법에 의해 수득된 미생물 분해질, 추출물, 분획, 아류분획 또는 정제된 생성물을 포함하며, 원하는 생촉매 기능을 수행할 수 있다. 일반적으로, 이러한 효소 제제는 손상되지 않은 미생물 세포로부터 실질적으로 유리될 수 있다. 본원에 사용하기에 적합한 효소 제제는 예를 들어, 킬반과 모티셀로(Kilbane and Moticello)의 미국 특허 제 5,132,219호(1992년 7월 21일자 허여됨), 및 제 5,358,870호 (1992년 6월 11자 출원)에 기재되어 있다. 본원에 사용하기에 적합한 재조합 미생물 및 효소 제제는 로도코커스 종. ATCC 번호 제 53968호로부터 가공되었으며, 이는 람보세크(Rambosek) 등의 미국 특허 제 5,356,813호에 기재되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 생촉매는 재조합 숙주 세포(예, 유전자 또는 유전자들의 하나 이상의 복제물을 함유하는 세포)에서 과발현된다. 예를 들어, 로도코커스 종. IGTS8에 의한 디벤조티오펜의 탈황반응은 3개 이상의 효소(DszA, Dszb 및 DszC)를 포함하는 것으로 보여지고, 이들 효소중 DszA 및 DszC는 현재 모노옥시게나아제로서 인식된다. 이와 같이, 특히 바람직한 구체예에서, 생촉매는 하나 이상의 효소, 즉 DszA, Dszb 및/또는 DszC를 포함한다.
본원에 사용하기에 적합한 효소 생촉매 제제는 임의적으로 고형 지지체 예를 들어, 막, 필터, 중합체 합성수지, 유리 입자 또는 비드, 또는 세라믹 입자 또는 비드에 고착될 수 있다. 고정화된 효소 제제의 사용은 내화성 유기황 화합물이 고갈되도록 처리된 화석 연료와 같은 반응물로부터 생촉매의 분리를 용이하게 한다.
제공된 생촉매의 특이적 활성은 단위 중량당 이들의 생촉매 활성치이다. 따라서, 특정 생촉매의 특이적 활성은 사용된 또는 생촉매 효소의 공급원로서 사용된 미생물의 성질 또는 항등성, 및 생촉매 제제를 제조하고/거나 저장하기 위해 이용된 방법에 의존적이다. 특정 생촉매의 농도는 특정 환경에 이용하기 위해 원하는 대로 조절할 수 있다. 예를 들어, 생촉매 제제로 살아있는 미생물(예를 들어, ATCC 번호 제 53968번)의 배양물이 사용되는 경우, 황 함유 헤테로고리외에 황 공급원이 결핍된 적합한 배양 배지에 적합한 미생물을 접종하고, 원하는 배양 밀도에 도달할 때까지 발효시킬 수 있다. 생성 배지를 추가적 배지 또는 다른 적합한 완충제로 희석시키거나, 배지에 존재하는 미생물 세포를 예를 들어, 원심분리에 의해 회수하고, 최초의 배양의 농도보다 훨씬 높은 농도로 재현탁시킬 수 있다. 미생물 및 효소 생촉매의 농도를 유사하게 조절할 수 있다. 이러한 방식으로, 예정된 특이적 활성 및/또는 농도를 갖는 적당한 부피의 생촉매를 수득할 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이, 생탈황 경로에 필요한 두 개의 모노옥시게나아제(DszC 및 DszA)의 활성을 활성화시키고 증가시키는 단백질(DszD로 칭함)을 로도코커스 종. IGTS8로부터 정제하였다. 상기 단백질의 기능은 NADH의 산화제를 DszA 및 DszC에 의해 기질 분자의 산소 부가제와 커플링시키는 것으로 여겨진다. 서열 데이터베이스의 탐색은 DszD가 최근에 분리된 또 다른 로도코커스 단밸질, 즉 ThcE와 동등함을 나타내며, 상기 로도코커스 단백질은 아트라진, 티오카르바메이트 제초제 및 일차 알코올의 존재하의 배양에 의해 유도될 수 있는 것으로 보고되었다. ThcE는 그룹 Ⅲ 알코올 탈수소효소 또는 산화환원 효소(알코올 : N,N'-디메틸-3-니트로소아닐린 산화환원 효소로 칭함)의 한 성분이고, 이는 문헌[Nagy et al., Arch. Microbiol (1995) 163: 439-446]에 설명되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고문헌으로 인용되었다. DszD는 분자량이 약 50,000(SDS-PAGE에 의한)인 단량체를 갖지만, HPLC 크기 배제 크로마토그래피상에서 다중제 단백질(데카머)로서 작용한다. DszD에 의한 DszC 및 DszA의 활성은 포화 반응과정을 따른다.
상기 설명된 발견에 있어서, DBT의 탈황반응은 산화환원 효소의 첨가에 의해 증가될 수 있다. 적합한 산화환원 효소는 모노옥시게나아제 또는 N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린(NDMA) 의존 알코올 산화환원 효소(MNO)와 같은 알코올 산화환원 효소를 포함한다. 그룹 Ⅲ 알코올 탈수소효소 또는 산화환원 효소는 일차 알코올을 산화시키고, 비생리학적 화합물 NDMA와 같은 전자 수용체를 환원시키는 것으로 보고되어 왔다. 이들은 일반적으로 NAD+의 단단하지만 비공유적인 결합 분자를 함유하며, 알코올과 전자 수용체(예를 들어, NDMA)사이의 전자 이전을 중개한다. 본원에 사용된 용어 "산화환원 효소"는 내생형 또는 야생형 효소, 이들의 재조합적으로 생산된 효소, 융합 단백질, 활성 단편, 돌연변이체 또는 조합물을 포함하는 것으로 본원에서 정의되었으며, 상기 효소는 DszA 및/또는 DszC의 활성을 증가시키고/거나 활성화시키는 능력을 가진다. 돌연변이체는 대립유전자적 변형체, 아미노산, 또는 부위 유도 돌연변이체 또는 유도체(재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 것과 같이)를 포함한다. 대안적인 돌연변이체는 숙주 미생물에 다른 화학적 또는 물리적 돌연변이 유발 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 효소를 IGTS8 또는 로도코커스 종. N186/21과 같은 로도코커스 또는 로오도코컬 오리진(rhodoccocal origin)의 로도코커스로부터 분리하는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 구체예는 상기 효소의 아미노산 서열에 대한 높은 상동성(약 90% 이상과 같이)을 갖는 재조합 산화환원 효소를 포함한다. 아미콜라톱시스 메타놀릭스(Amycolatopsis methanolics) 및 마이코박테리움 가스트리(Mycobacterium gastri)로부터 분리될 수 있는 산화환원 효소와 같은 대안적인 상동 산화환원 효소가 이용될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 본원에 사용된 산화환원 효소는 일반적으로 당해분야에 공지된 효소를 포함하며, 천연에서 발견된 효소(예를 들어, 단백질 또는 효소를 함유하는 미생물 분획) 또는 상업적으로 수득된 효소를 직접 이용할 수 있거나, 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, DszD의 DNA 및 아미노산 서열은 문헌[Nagy et al., Arch Microbiology (1995) 163:439-446]에 기록되어 있으며(도 6에 도시됨), 당해분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제 5,356,801호에 기재된 바로서의 적합한 숙주 미생물을 형질전환시키기 위해 이용될 수 있다. DNA 서열은 PCR과 같은 잘 공지된 기술을 이용하여 적합한 로도코커스로부터 분리될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 산화환원 효소는 탈황반응 미생물(예, IGTS8)에 의해 과발현될 수 있다. 이들은 예를 들어, 돌연변이 유발에 의해 달성될 수 있다. 적합한 돌연변이원은 방사능, 예를 들어, 자외선, 및 N-메틸-N'-니트로소구아니딘, 히드록실아민, 에틸메탄술포네이트 및 질산과 같은 화학적 돌연변이원을 포함한다. 돌연변이 유발 및 그 후, 증가된 효소적 활성을 갖는 돌연변이체에 대한 스크리닝은 당해분야에 일반적으로 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
산화환원 효소가 재조합되는 경우 단백질은 재조합 미생물의 첨가에 의해서와 같이 동일계에서 제조되고, 바람직하게는 과발현될 수 있으며, 상기 재조합 미생물은 산화환원 효소를 코드화하는 DNA 서열의 하나 이상의 복제물을 함유한다. 특히 바람직한 구체예에서, 산화환원 효소를 코드화하는 재조합 미생물은 또한 화석 연료의 생탈황반응에서 하나 이상의 반응을 촉매시킬 수 있는 하나 이상의 효소 특히, DszA 및/또는 DszC를 갖는다. 예를 들어, 적합한 프로모터의 지배하에 산화환원 효소를 코드화하는 DNA는 IGTS8로 또는 화석 연료를 탈황시킬 수 있는 또 다른 미생물로 형질전환될 수 있다. 또 다른 예에서, 산화환원 효소를 코드화하는 DNA는 탈황 생촉매(들) 또는 효소를 코드화하는 DNA를 갖는 일반적 숙주 세포로 동시에(예를 들어, 단일 플라스미드 또는 벡터에 존재하는) 또는 독립적으로 형질전환된다. 산화환원 효소를 코드화하는 DNA는 예를 들어, 동일하거나 상이한 프로모터의 지배하에 화석 연료를 탈황시킬 수 있는 생촉매를 코드화하는 DNA일수 있다. 한 구체예에서, 산화환원 효소 DNA는 IGTS8의 탈황 유전자 집합체 또는 오페론으로 혼입되거나 결찰된다.
산화환원 효소는 속도 증가 양으로 반응 혼합물에 첨가된다. 본원에 사용된 용어 "속도 증가 양"은 원래 수득되는 생촉매의 반응(생촉매의 활성을 포함) 속도를 현저하게 증가시키는 양이다. 예를 들어, 생촉매가 IGTS8, 세포 유리 분획 또는 이들의 정제된 효소 제제인 산화환원 효소의 "속도 증가 양"은 수득된 생촉매에 존재하는 고유의 탈황반응 속도에 더하여 탈황반응 속도를 현저하게 증가시키는 산화환원 효소의 양이다. 탈황반응 속도는 원래의 생촉매를 사용한 속도와 비교하여 예를 들어, 25%, 50% 또는 100% 이상 증가될 수 있다. 한 구체예에서, 산화환원 효소는 포화 반응과정을 달성하거나 접근시키는 양으로 반응 배지에 첨가되였다.
DszD를 코드화하는 DNA 서열을 갖는 미생물은 유전자 발현을 최대화시키는 조건하에 배양될 수 있다. 상기 유전자를 함유하는 로도코커스 종은 예를 들어, 알코올(예, 에탄올, 에탄올아민, 글리세롤 또는 프로판올), 알데히드(예, 프로피온알데히드), 티오카르바메이트 또는 아트라진의 존재하에 배양될 수 있다. 상기 화합물은 미생물에서의 유전자의 발현을 유도하거나 증가시킬 수 있다.
상기에서 요약한 바와 같이, 한 양태에 있어서, 본원에 설명된 본 발명은 산화환원 효소 및/또는 유기황 화합물을 함유하는 화석 연료를 탈황시킬 수 있는 생촉매를 코드화하는 유전자 또는 유전자들을 함유하는 DNA 분자 또는 이들의 단편에 관한 것이다. 상기 DNA 분자 또는 이들의 단편은 예를 들어, 천연 공급원으로부터 수득된 DNA로부터 정제되고, 분리될 수 있거나, 예를 들어, 비사람 숙주 유기체에 존재하는 재조합(이종 또는 외래) DNA일 수 있다. 상기 DNA는 도 6에 도시된 누클레오티드 서열로부터의 올리고누클레오티드 프라이머를 설계한 PCR과 같은 잘 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 재조합 DNA 분자는 탄소-황 결합을 선택적으로 절단할 수 있는 생촉매 및 산화환원 효소를 코드화하는 하나 이상의 유저자를 화학적 또는 생물학적 방법으로 DNA 사슬로 삽입시킴으로써 유도된 DNA를 포함하며, 상기 유전자는 원래의 DNA 사슬에는 존재하지 않는 것이다. 재조합 DNA는 제한 핵산효소를 이용한 처리, 핵산 혼성화, DNA 클로닝, DNA 합성 또는 상기 방법의 임의의 조합에 의해 합성된 임의의 DNA를 포함한다. 구성 방법은 마니아티스 등(Maniatis et al.) 및 당업자에 의한 다른 공지된 방법에서 알 수 있다.
본 발명의 DNA 플라스미드 또는 벡터의 구성을 위한 처리는 마니아티스 등이 설명한 처리법 및 당업자에 의해 공지된 다른 방법을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "DNA 프라스미드" 및 "벡터"는 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 DNA로 삽입된 이종 또는 외생 DNA를 가질 수 있으며, 그 후, 적당한 비사람 숙주 유기체로 형질전환될 경우, 이종 또는 외생 DNA 삽입물의 생성물을 발현(예를 들어, 본 발명의 생촉매 또는 산화환원 효소를 발현)시킬 수 있는 임의의 복제 수용능력이 있는 프라스미드 또는 벡터를 포함하도록 유도된다. 게다가, 프라스미드 또는 벡터는 상기에정의된 본 발명의 유전자 또는 유전자들, 즉 생촉매를 코드화하는 상기 유전자 또는 유전자들을 함유하는 DNA 분자 또는 이들의 단편의 삽입을 잘 받아들인다. DNA 프라스미드 벡터의 구성을 위한 처리는 마니아티스 등이 설명한 처리법 및 당업자에 의해 공지된 다른 방법을 포함한다.
본 발명의 프라스미드는 산화환원 효소 및/또는 생촉매를 코드화하는 유전자 또는 유전자들을 함유하는 임의의 DNA 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "프라스미드"는 임의의 DNA 단편을 포함하도록 의도된다. DNA 단편은 예를 들어, 형질전환 또는 접합에 의해 숙주 미생물로 전이되야 한다. DNA 프라스미드의 구성 또는 추출을 위한 처리는 마니아티스 등에 의해 설명된 처리법 및 당업자에 의해 공지된 다른 방법을 포함한다.
본 발명의 형질전환된 비사람 숙주 유기체는 당업자에 의해 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 마니아티스 등에 의해 설명된 일렉트로포레이션(electroporation)이 이용될 수 있다. 본 원에 사용된 용어 "비사람 숙주 유기체"는 이종, 외생 또는 재조합 DNA를 받아들이고 발현시킬 수 있는 임의의 비사람 유기체이다. 바람직하게는, 숙주 유기체는 박테리아, 더욱 바람직하게는 슈도노마드(pseudonomad)이다.
생촉매 탈황반응 단계에서, 황 함유 헤테로고리를 함유하는 탄소성 물질 또는 화석 연료는 생촉매 및 산화환원 효소와 조합된다. 생촉매 산화환원 효소 및 화석 연료와 같은 탄소성 물질의 상대적인 양이 특정 조건에 적합하게 또는 처리되어 탈황된 물질중에서 잔류 황의 특정 수준을 생산하기 위해 조절될 수 있다. 기질의 주어진 양과 조합된 생촉매 제제의 양은 기질에 존재하는 무기 및 유기 황 화합물의 특성 및 상대적인 다량 뿐만 아니라 이용된 특정 생촉매(들) 및 산화환원 효소의 특성, 농도 및 특이적 활성, 및 추구되거나 허용되어지는 탈황반응의 정도를 반영할 것이다.
본 발명의 화석 연료를 탈황시키는 방법은 두가지 양태를 포함한다. 제 1 양태에 있어서, 숙주 유기체 또는 이들로부터 수득된 생촉매 제제 및 산화환원 효소를 탈황되기 위한 화석 연료와 접촉시킨다. 이것은 선택적으로 교반 또는 혼합 장치가 설비된 임의의 적당한 콘테이너에서 수행될 수 있다. 혼합물은 완전히 조합되며, 유기황 화합물중의 탄소-황 결합을 상당히 절단하여 탈황된 화석 연료가 생성될 수 있는 충분한 시간으로 인큐베이팅한다.
한 구체예에서, 수성 에멀션 또는 마이크로에멀션은 유기체 또는 효소 분획 및 화석 연료의 수성 배양으로 생성되며, 발현된 생촉매가 탄소-황 결합을 절단하는 동안 에멀션에서 유기체가 증식된다.
온도, 혼합 속도 및 탈황반응의 속도와 같은 변수는 사용된 유기체 생촉매 및/또는 산화환원 효소에 따라 다양해진다. 상기 변수는 다만 일정한 실험을 통해서 결정될 수 있다.
탈황반응의 속도 및 정도를 모니터링하기 위한 몇몇의 적합한 방법은 잘 공지되어 있고, 당업자에 의해 쉽게 이용될 수 있다. 베이스라인(baseline) 및 시간 경로 샘플은 배양 혼합물로부터 모아질 수 있고, 화석 연료에서 잔류의 유기 황을 측정하기 위해 제조될 수 있다. 생촉매으로 처리되는 샘플에서, DBT와 같은 유기황 화합물로부터의 황의 제거는 예를 들어, X-레이 형광(XRF) 또는 원자 방출 분광학(플레임 분광학)을 이용하여 모니터링될 수 있다. 바람직하게는, 샘플의 분자 성분은 예를 들어, 가스 크로마토그래피에 의해 첫 번째로 분리된다.
청구된 본 발명의 방법 및 생촉매 조성물(재조합 미생물을 포함)은 초기에 기록된 탈황 방법을 걸쳐 현저하고, 예상치 못했던 향상된 점을 유도한다. 정제된 DszA 및 DszC에 의해 촉매된 생체외 반응은 산화환원 효소의 첨가에 의해 활성화된다. 특히, 이것은 FAD가 DszC에 직접 결합하고[문헌 : Denome et al., J. Bacteriol., 176:6707-6716, 1994], NADH는 단지 시스템에 필요한 조인자라고[문헌 : Ohsiro et al., FEMS Microbiol. Lett. 118:341-344, 1994] 시사한 최근의 문헌에 논의된 관점에서는 예상치 못했던 것이다. 또 다른 문헌은 DszABC가 발생하는 탈황반응을 초래하는 유일한 효소라고 시사한다[문헌 : Piddington, et al., Appl. Env. Microbiol., 67:468-475, 1995].
임의의 특정 메카니즘 또는 이론을 제한하지 않고, 탈황반응의 경로는 하기에 기재된 것으로 여겨진다:
상기 식에서, 산화환원 효소는 NADH(또는 다른 전자 공여체)로부터 효소 즉, DszC 및/또는 DszA(가능한 산화환원 효소의 생리학적 전자 수용체)로 환원 당량을 이동시키기 위한 짧은 전자 수송체로 여겨진다. 효소 DszC는 DBT에서 DBTO2로의 산화 반응의 생촉매작용을 초래하는 것으로 여겨진다. 효소 DszA는 DBTO2에서 페놀페닐술피트(PPS)로의 산화를 초래하는 것으로 여겨진다.
특히, 조인자 즉, FMN 및 전자 공여체 즉, NADH 또는 NADPH를 반응 배지에 첨가하는 것이 바람직하다. 또한 당해분야에 공지된 방법에 따라 NAD+를 NADH로 전환시키기 위한 NADH 또는 NADPH 재생 시스템의 첨가가 바람직하다.
본 발명은 하기 실시예로 더욱 상세히 설명될 것이다.
로도코커스 종. IGTS8의 성장:
피드딩턴(Piddington) 등에 의한 문헌[Appl. Environ. Microbiol. 61:468-475 (1995)]에 설명된 플라스미드 pENOK3(DszA-B-C+의 유전자형)를 함유하는 로도코커스 종. IGTS8 계통의 동결된 저장 샘플을 48시간 동안, 30℃에서 2000㎖ 진동 플라스크에서 500㎖의 리치(rich) 배지로 배양시켰다. 이러한 배양을 동일한 배지에서 15리터 NBS 발효제를 접종(4% 접종물)하는 데에 이용하였다. 상기 배양물의 pH를 조정하면서 48시간 동안 30℃에서 교반 배양하여, 산소를 용해시켰다(＞50% 포화됨). 최종적으로, 5% 접종물을 기본 염 배지, 0.5g/L의 이반호(Ivanhoe) 거품방지제, 8g/L의 에탄올 및 1.5mM의 디메틸 술폭시드를 함유하는 생산-스케일 발효제(300 리터 켐멥(Chemap))로 이동시켰다. 11의 최적 농도를 달성한 배양물을 수행의 첫 24시간 동안 4.3시간의 배가 시간을 갖도록 45시간동안 배양시켰다. 세포 현탁액을 약 2.5㎏의 습성 세포 페이스트(paste)를 유도하는 웨스트팔리아(Westfalia) 원심분리를 통하여 농축시켰다. 페이스트를 정제에 사용할 때 까지 -70℃에서 저장하였다.
DszD의 정제
상기와 같이 배양한 150g(습성의 세포 페이스트)의 로도코커스를 100mM의 NaCl, 0.5mM의 DTT, 1mM의 PMSH 및 DNAse를 함유하는 pH 7.5(완충제 A)의 25mM의 NaPi에 재현탁시켰다. 세포 현탁을 프랑스 압력 세포(20,000 psi에서)를 통하여 2시간 통과시킨 후, 30,000 x g에서 45분 동안(5℃) 원심분리시켜서, 깨지지 않은 세포 및 세포 잔해물을 제거하였다. 그 후의 모든 크로마토그래피 단계를 팔마시아(Pharmacia) FPLC 시스템을 이용하여 4℃에서 수행하였다. 상등액을 100mM의 NaCl를 함유하는 완충제 A와 평형한 Q-세파로오즈 컬럼(2.6㎝ x 20㎝)에 로딩(load)시켰다. 로딩후에, OD280의 용리제가 영에 급접할 때까지 컬럼을 동일한 완충제로 광범위하게 세척하였다. 컬럼을 5mL/분의 유량 속도로 180분 동안 완충제 A중의 100mM의 NaCl에서 500mM의 NaCl로의 직선 기울기로 전개시키고, 10mL의 분획을 모았다. DszD 활성을 나타낸 분획을 풀(Pool)하고, 용량액 완충제 A로 밤새 투석시켰다. 투석물을 완충제 A와 평행한 토이오펄 DEAE-650M 컬럼(2.6㎝ x 10㎝)상에 로딩하였다. 컬럼을 4mL/분의 유량 속도로 90분 동안 0mM의 NaCl에서 200mM의 NaCl로의 직선 기울기로 전재시키고, 4mL의 분획을 모았다. DszD 활성을 함유하는 분획을 풀하고, 용량액 완충제 A로 밤새 투석시켰다. 투석물을 완충제 A와 평행한 팔마시아 모노Q 컬럼상에 로딩하였다. 컬럼을 0.5mL/분의 유량 속도로 30분 동안 160mM에서 300mM의 NaCl로의 직선 기울기로 전개시키고, 0.5mL의 분획을 모았다. DszD 활성을 나타내는 분획을 풀하고, 아미콘(Amicon) 미세농축기를 이용하여 0.2mL로 농축시켰다(10kDa의 분자량 차단). 그 후, 농축된 샘플을 100mM의 NaCl을 함유하는 완충제 A와 평행한 팔마시아 슈퍼덱스 75 크기 제외 컬럼에 적용시켰다. 컬럼을 0.2mL/분의 유량 속도로 동일한 완충제로 용리시키고, 0.2mL 분획을 모았다. DszD 활성을 함유하는 분획을 풀하고, 미세농축기를 이용하여 농축시키고, 단백질을 사용할 때까지 아이스에 저장시켰다. 최종 제제의 SDS-PAGE 분석(14% 폴리아크릴아미드)는 약 50,000Da의 단량체 분자량을 갖는 단일 밴드를 나타낸다.
효소 분석
DszD 활성을 DszC와 DszD의 조합물에 의해 촉매된 DBT로부터의 DBTO 및 DBTO2를 모니터링함으로써 측정하였다. 이콜라이 발현 시스템으로부터 수득된 DszC는 상기에 설명되어 있다. 분석(pH 7.5인 25mM의 NaPi, 100mM의 NaCl 및 0.5mM의 DTT에서)은 DszC(6 내지 15㎍ 사이의), 3mM의 NADH, 10μM의 FMN, 100μM의 DBT 및 DszD를 함유하는 샘플을 함유한다. 분석 혼합물을 30℃에서 약간 동안(일반적으로 15 내지 60분) 300rpm으로 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 반응을 아세토니트릴을 첨가함으로써(50% 까지) 중단시키고, 생성물을 역상 HPLC로 분석하였다. DszD에 의한 DszA의 활성을 기질이 DBT 술톤이고, 생성물이 2,2'-디히드록시비페닐(BHBP)인 것을 제외한 동일한 방식으로 분석하였다(DszA 또한 이콜라이 발현 시스템에서 수득되었다).
결과:
DszD의 정제
도 1은 1차 음이온 교환 컬럼(Q-세파로오즈)로부터 분획의 DszD 활성 프로필을 나타낸다. 상기 데이터에서 알 수 있듯이, 활성은 분획 20에서 시작하고, 약 분획 60까지 확장한다. DszA 및 DszC 활성 모두는 상기 반응에서 발생하고, 게다가, 내생적 DszC 활성은 또한 상기 분획(특히 분획 40 내지 50)에 존재한다. 분획 40 내지 60을 풀하고, 또한 토이오펄-DEAE 상에서 분리시켰다. 낮은 염 농도에서 용리된 활성 및 나중 분획에서 발생한 내생적 DszC 활성(분획 40에서의 작은 양의 활성)을 제외한 Q-세파로오즈 컬럼과 유사한 활성 패턴을 토이오펄-DEAE 크로마토그래피 후에 관찰하였다. 또한 상기는 DszC가 분획 45 및 50사이의 피크로 용리됨(도시되지 않았음)을 나타내는 웨스턴 분석에 의해 실증되었다. 분획 15에서 35를 풀하고, 모노Q 컬럼에 적용시켰다. 상기 컬럼으로부터의 활성 분획을 풀하고, 농축시키고 또한 슈퍼덱스 75 FPLC 컬럼 크로마토그래피로 분리하였다. 상기 컬럼의 활성 프로필을 도 2에 도시하였다. 상기 도면은 DszA 및 DszC 모두가 동일한 분획에서 단백질(들)에 의해 활성화됨을 나타낸다. SDS-PAGE 분석(도 3)은 약 50,000 분자량의 단일 폴리펩티드로 구성된 최종 제제를 나타낸다. 휄리트 팩카드(Hewlett Packard) 1050 HPLC 시스템상에서 토소하스(TosoHaas) TSK3000SW 크기 제외 컬럼을 이용한 HPLC 분석은 원래의 단백질이 거의 데카머임을 나타내는 약 500,000 Da의 매스에서 용리된 단일 단백질 피크를 나타낸다.
DszC 및 DszA의 DszD 활성
도 4는 포화 반응과정 후의 DszD에 의한 DszC의 활성을 도시한 것이다. DszD 및 DszC의 비율이 증가함에 따라 증가된 비율의 DBTO2 형성물이 관찰되었다. 초기 비율 용량액 DszD:DszC의 플롯은 포화가 성취됨을 나타낸다. 도 5는 동일한 제제에 의한 DszA의 활성의 결과를 도시한 것이다. 동일한 효과가 관찰되었다. 즉, DszD를 첨가함에 따라, DszA 반응율에서의 증가가 발생한다.
DszD의 아미노산 서열
DszD를 N-말단 서열로 처리하고, 하기 서열을 수득하였다(한 레터의 아미노산 생략):
(서열 번호: 3)
데이터-베이스의 탐색은 로도코커스 단백질(ThcE로 칭함)과의 100% 배합을 유도한다[참고 문헌: Nagy et al., Arch. Microbiol. 163:439-446 (1995)). 오픈 리딩 프레임의 DNA 서열 및 추정 아미노산 서열은 도 6에 도시되어 있다. 상기 단백질은 다른 그람-파지티브 유기체에서 발견된 알코올: N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린(NDMA) 산화환원 효소에 높은 상동관계를 가지며, 알코올의 산화 및 전자 수용체의 수반된 환원과 관계있다. 상기 유기체에서의 생리학적 전자 수용체는 밝혀지지 않았다.
균등물
당업자는 더 이상 상세히 설명하지 않더라도 본원에 설명된 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물을 알 수 있거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 및 다른 모든 균등물도 하기 청구 범위에 의해 포함되는 것이다.

Claims (39)

  1. a) 화석 연료를 탄소-황 결합을 절단할 수 있는 생촉매 및 속도 증가 양의 산화환원 효소를 함유하는 수성상과 접촉시켜서, 화석 연료와 수성상 혼합물을 형성하는 단계;
    b) 생촉매로 유기 황 분자의 탄소-황 결합을 절단하기에 충분한 조건하에 단계 a)의 혼합물을 유지시켜서, 유기 황 성분이 감소된 화석 연료를 생성시키는 단계; 및
    c) 생성된 수성상으로부터 유기 황 성분이 감소된 화석 연료를 분리하는 단계를 포함하여, 유기 황 화합물을 함유하는 화석 연료의 생탈황반응의 속도를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 산화환원 효소가 타입 Ⅲ 알코올 탈수소효소임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 산화환원 효소가 N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린 의존 알코올 산화환원 효소임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 산화환원 효소가 로도코커스로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, NADH 또는 NADPH, 및 플라빈 첨가를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 화석 연료가 액체 탄화수소임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 탄소-황 결합의 절단이 산화 경로에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 탄소-황 결합을 절단할 수 있는 생촉매가 미생물임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 미생물이 탄소-황 결합을 절단할 수 있는 하나 이상의 효소를 코드화하는 재조합 DNA 분자를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 재조합 DNA 분자가 로도코커스 종(ATCC 53968)으로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 탄소-황 결합을 절단할 수 있는 생촉매가 세포 유리 분획임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 생촉매가 로도코커스 종(ATCC 53968)의 세포 유리 분획임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, 생촉매가 탄소-황 결합 절단 능력을 갖는 미생물로부터 유도된 하나 이상의 효소 또는 효소 분획을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 미생물이 로도코커스 종(ATCC 53968)임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 7 항에 있어서, 탄소 황 결합을 절단할 수 있는 생촉매 및 산환 환원효소가 단일 미생물로부터 재조합적으로 제조됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 산화환원 효소를 코드화하는 DNA 및 유기 황 분자를 함유하는 화석 연료를 탈황시킬 수 있는 생촉매를 코드화하는 DNA를 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  17. 제 16 항에 있어서, 산화환원 효소가 타입 Ⅲ 알코올 탈수소효소임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  18. 제 16 항에 있어서, 산화환원 효소가 N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린 의존 알코올 산화환원 효소임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  19. 제 16 항에 있어서, 산화환원 효소가 로도코커스로부터 유래됨을 특징으로 하는 DNA 분자.
  20. 제 19 항에 있어서, 생촉매를 코드화하는 DNA 분자가 로도코커스 종(ATCC 53968)로부터 유도됨을 특징으로 하는 DNA 분자.
  21. a) 산화환원 효소; 및
    b) 하나 이상의 생탈황반응 효소를 코드화하는 재조합 DNA 분자를 함유함을 특징으로 하는 미생물.
  22. 제 21 항에 있어서, 산화환원 효소가 타입 Ⅲ 알코올 탈수소효소임을 특징으로 하는 미생물.
  23. 제 21 항에 있어서, 산화환원 효소가 N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린 의존 알코올 산화환원 효소임을 특징으로 하는 미생물.
  24. 제 21 항에 있어서, 산화환원 효소를 코드화하는 DNA가 로도코커스로부터 유래됨을 특징으로 하는 미생물.
  25. 제 24 항에 있어서, 하나 이상의 생탈황반응 효소를 코드화하는 DNA가 로도코커스 종(ATCC 53968)으로부터 유도됨을 특징으로 하는 미생물.
  26. a) 산화환원 효소; 및
    b) 유기 황 분자를 함유하는 화석 연료를 탈황시킬 수 있는 생촉매를 함유하는 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 산화환원 효소가 타입 Ⅲ 알코올 탈수소효소임을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 26 항에 있어서, 산화환원 효소가 N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린 의존 알코올 산화환원 효소임을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 26 항에 있어서, 산화환원 효소를 코드화 하는 DNA가 로도코커스로부터 유래됨을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 생촉매가 로도코커스 종(ATCC 53968) 또는 이들의 효소임을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 27 항에 있어서, 플라빈, 및 NAD 또는 NADH를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  32. a) 탄소성 물질을 탄소-항 결합을 산화시킬 수 있는 생촉매 및 속도 증가 양의 산화환원 효소를 함유하는 수성상과 접촉시키는 단계; 및
    b) 생촉매로 유기 황 화합물을 반응시키기에 충분한 조건하에 단계 a)의 혼합물을 유지시키는 단계를 포함하여, 유기 황 화합물을 함유하는 탄소성 물질의 반응 속도를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 산화환원 효소가 타입 Ⅲ 알코올 탈수소효소임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 산화환원 효소가 N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린 의존 알코올 산화환원 효소임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, 산화환원 효소가 로도코커스로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 생촉매가 모노옥시게나아제임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서, 생촉매가 DszA 또는 DszC임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, NADH 또는 NADPH, 및 플라빈 첨가를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 화합물을 함유하는 황이 치환되거나 비치환된 디벤조티오펜임을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000197485A (ja) * 1999-01-07 2000-07-18 Daicel Chem Ind Ltd 酸化還元酵素の生産能を有する微生物において酸化還元酵素の電子受容体再生活性を高める方法、および該方法により調製された微生物の利用
WO2000042122A1 (en) * 1999-01-14 2000-07-20 Energy Biosystems Corporation Growth of biocatalyst within biodesulfurization system
ES2168945B1 (es) * 2000-03-20 2003-12-01 Consejo Superior Investigacion Un procedimiento para desulfurar dibenzotiofeno utilizando como biocatalizador una cepa de pseudomonas putida recombinante.
JP2001359165A (ja) 2000-06-15 2001-12-26 Mitsubishi Electric Corp モバイル通信システム
CN110358743A (zh) * 2019-06-03 2019-10-22 华南理工大学 一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198341A (en) * 1990-01-05 1993-03-30 Institute Of Gas Technology Useful for cleavage of organic C-S bonds Bacillus sphaericus microorganism
US5002888A (en) * 1990-01-05 1991-03-26 Institute Of Gas Technology Mutant microorganisms useful for cleavage of organic C-S bonds
US5104801A (en) * 1990-01-05 1992-04-14 Institute Of Gas Technology Mutant microorganisms useful for cleavage of organic c-s bonds
US5344778A (en) * 1990-02-28 1994-09-06 Institute Of Gas Technology Process for enzymatic cleavage of C-S bonds and process for reducing the sulfur content of sulfur-containing organic carbonaceous material
US5132219A (en) * 1990-02-28 1992-07-21 Institute Of Gas Technology Enzymes from Rhodococcus rhodochrous strain ATCC No. 53968, Bacillus sphaericus strain ATCC No. 53969 and mixtures thereof for cleavage of organic C--S bonds of carbonaceous material
US5358870A (en) * 1990-02-28 1994-10-25 Institute Of Gas Technology Microemulsion process for direct biocatalytic desulfurization of organosulfur molecules
US5356813A (en) * 1992-04-30 1994-10-18 Energy Biosystems Corporation Process for the desulfurization and the desalting of a fossil fuel
EP0651808B1 (en) * 1992-07-10 2001-12-12 Energy Biosystems Corporation Recombinant dna encoding a desulfurization biocatalyst

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US5846813A (en) 1998-12-08
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