KR19990063387A - 4'-오-데메틸-에피포도필로톡신-베타-디-글루코시드의 새로운 아세탈 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암세포의 성장 억제 효과가 우수하여 항암제로 사용 가능한 일반식(I)의 새로운 4'-Ο-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.
(I)
상기식에서, R1및 R2는 명세서에 정의된 바와 같다.

Description

4'-오-데메틸-에피포도필로톡신-베타-디-글루코시드의 새로운 아세탈 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물
본 발명은 4'-Ο-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 (4'-Ο-demethyl-epipodophyllotoxin-β-D-glucoside)의 당 부분인 글루코시드의 4-히드록시기와 6-히드록시기가 아세탈화된, 불포화기 또는 알콕시알킬기 등을 포함하는 새로운 글리코시드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.
에토포사이드(Etoposide) 및 테니포사이드(Teniposide)는 1960년대 산도즈사(Sandoz Limited)에서 천연물인 포도필룸 펠타툼 엘.(Podophyllum peltatum L.)로부터 분리, 정제한 포도필로톡신(podophyllotoxin)으로부터 반합성적으로 개발된 후 현재 방사선 치료시 병용투여로 폐암, 악성림프종, 백혈병, 고환암 등에 우수한 항암효과를 나타내고 있는 항암제이다(논문[C. Keller-Julsen, M. Kuhn, A. von Wartburg,J. Med. Chem. 1971,14(10), 936-940] 및 US Patent 3,524,844 참조).
이 화합물은 인간 유전자 위상이성질화 II 효소 (Human DNA Topoisomerase II)의 활성을 억제하여 유전자 합성을 저해함으로써 암세포에 대한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다 (논문[J. C. Wang,J. Biol. Chem., 1991,266(11), 6659-62] 참조).
그러나, 상기 에토포사이드 및 테니포사이드는 물에 대해 불용성이고 세포 독성이 큰 문제가 있어 이를 개선하기 위하여 에토포사이드의 변형에 의한 새로운 항암제 연구.개발이 최근에도 계속적으로 발표되고 있다. 예를 들면, 미합중국의 브리스톨-마이어스사(Bristol-Myers Squibb Co.) 및 일본의 미생물 화학 연구기관(Microbial Chemistry Research Foundation)에서 각각 에토포포스(ETOPOPHOSTM)와 NK-611을 개발하여, 에토포포스는 1997년에 항암제로 승인받았으며, NK-611은 현재 항암제개발을 위한 임상단계에 진입되어 있는 상황이다 (GB 2,207,674 A 및 EP 0,196,618 참조).
이러한 에토포사이드의 구조 중에서 글루코시드의 4,6-아세탈 작용기가 항암효과에 가장 직접적인 영향을 주고 있으나 아세탈 작용기 중 불포화 작용기를 갖는 화합물은 이중결합을 갖는 크로톤알데히드(crotonaldehyde) 자체 및 신남알데히드 유도체(cinnamaldehyde)만이 합성되어 보고되어 있는 상황이다 (US Patent 3,524,844 및 논문[C. Keller-Julsen, M. Kuhn, A. von Wartburg,J. Med. Chem. 1971,14(10), 936-940] 참조).
본 발명자는 현재까지 보고되어 있지 않은 입체적으로 비교적 작은 이중결합, 삼중결합 또는 알콕시알킬의 구조를 갖는 소수성의 그룹을 에토포사이드의 글루코시드 4,6-디올에 도입하여 그 항암효과 및 독성 및 약리학적 개선 효과 등을 연구하고자 이 계열의 화합물들을 합성한 후 인간 유전자 위상이성질화 II 효소 (Human DNA Topoisomerase II), 생체외 암세포 독성시험(in vitrocytotoxicity), 생체내 항암활성(in vivoanticancer activity)을 시험한 결과, 본 합성화합물들이 비교화합물 에토포사이드보다 우수한 활성을 나타내고 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 항암 활성이 우수한, 새로운 4'-Ο-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드의 새로운 아세탈 유도체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 하기 일반식 (I)의 새로운 4'-Ο-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 유도체를 제공한다.
화학식 1
(I)
상기식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 또는 알콕시, 페닐, 치환된 페닐, 할로겐, 니트로, 시아노, 히드록시, 카르복실 및 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 라디칼로 임의로 치환된 C2-C12알케닐, C2-C12알키닐, C2-C12알콕시알킬 또는 시클로프로필이거나; 이들이 결합된 탄소원자와 함께 상호 연결되어 알콕시, 페닐, 치환된 페닐, 할로겐, 니트로, 시아노, 히드록시, 카르복실 또는 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 라디칼로 임의로 치환된 C5-C15의 고리를 형성하며, 단, R1및 R2는 둘다 수소원자는 아니다.
상기 일반식 (I)의 화합물 중 특히 우수한 항암 활성을 보이는 화합물은 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-프로페닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-부테닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-부티닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-페닐-2-프로피닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-메틸-3-페닐-2-프로페닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-사이클로헥세닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메틸-2-부테닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-메틸-2-프로페닐리덴)-글루코시드4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메톡시-1-부틸리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-에톡시-1-프로필리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메톡시-1-프로필리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(시클로프로필메틸리덴)-글루코시드 등이다.
또한, 본 발명에서는 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드와 각각의 상응하는 알데히드 또는 아세탈 화합물을 반응시키는것을 특징으로하는 상기 일반식(I) 화합물의 제조방법을 제공한다.
더 나아가서 본 발명에서는 상기 일반식 (I)의 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 유도체를 포함하는 항암제 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일반식(I)의 신규한 4'-O-데메틸-에피-포도필로톡신-β-D-글루코시드 유도체는 다음 반응식 1 에 나타낸 방법으로 제조할 수 있다.
상기식에서, R1및 R2는 앞에서 정의한 바와 같고, R3는 C1-C3의 알킬기이다.
상기 반응식에서 보듯이 일반식(I) 화합물은 일반식(II)의 4'-Ο-데메틸-에피-포도필로톡신-β-D-글루코시드를 각각의 상응하는 약 5 내지 20 당량, 바람직하게는 10 내지 15 당량의 일반식(III)의 알데히드 화합물 또는 일반식 (IV)의 아세탈 화합물과 0℃에서 80℃의 온도 범위, 바람직하게는 실온에서 1 내지 48 시간, 바람직하게는 3 내지 24 시간 동안 반응시켜 합성할 수 있다.
본 발명에 적합하게 사용될 수 있는 용매의 예로는 니트로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 디메톡시에탄, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드와 같은 불활성 유기용매가 있고, 이 중에서 무수 아세토니트릴과 무수 니트로메탄이 바람직하다.
촉매로는 p-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 염화 아연, 산성 레진 (acidic resin)과 같은 산 촉매가 사용되며p-톨루엔술폰산 또는 염화아연이 바람직하다. 상기 산 촉매는 출발물질, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드를 기준으로 3 내지 30% 범위, 바람직하게는 5 내지 10 % 범위의 양으로 사용된다.
또한, 과량의 3Å 또는 4Å 분자체(molecular seive)를 반응계에 가하여 반응중에 생성되는 물을 제거할 수도 있다. 일반식(II)의 화합물의 중량을 기준으로 200중량%의 4Å 분자체를 사용하는 것이 바람직하다.
반응의 종결을 위해 유기염기로서 트리알킬아민 또는 피리딘류를 가하여 산 촉매를 중화하며 그 양은 촉매로 첨가된 산보다 약간의 과량을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 일반식 (II)의 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드는 보고된 문헌[P. Allevi, M. Anastasia, P. Ciuffreda, A. M. Sanvito and P. Macdonald,Tet. Lett. 1992,33, 4831-4834; S. Hashimoto, T. Honda, and S. Ikegami,Tet. Lett. 1991,32, 1653-1654]에 따라 합성할 수 있다.
일반식 (III)의 알데히드 화합물의 구체적인 예로는 시클로프로판카복스알데히드, 페닐프로파길알데히드, 메타크롤레인, α-메틸-트랜스-신남알데히드, 1,2,3,6-테트라하이드로벤즈알데히드, 3-메틸-2-부텐알데히드 등이 있고, 일반식 (IV)의 아세탈 화합물의 구체적인 예로는 아크롤레인디메틸아세탈, 3-부텐알디에틸아세탈, 3-메톡시부티르알데히드디메틸아세탈, 2-부틸-1-알데히드디에틸아세탈, 3-에톡시프로피온알데히드디에틸아세탈, 1,1,3-트리메톡시프로판등이 있으며, 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다.
이와 같이 제조된 본 발명의 일반식(I)의 화합물은 항암효과를 가진다.
본 발명에서는 일반식(I)의 화합물을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 항암제 조성물을 제조할 수 있다. 상기 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활탁제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 경구투여용 제제(예: 정제, 캡슐제 등) 또는 비경구 투여용 제제(예: 주사제, 현탁액)와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 이중에서 주사제가 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은, 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있고, 하루에 1 내지 100㎎/㎏체중, 바람직하게는 1 내지 20㎎/㎏ 체중 범위에서 1회 내지 수회, 바람직하게는, 1회 내지 3회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(알케닐리덴 또는 알키닐리덴)-글루코시드 계열 유도체(화합물 1 내지 12)의 합성
무수 아세토니트릴 (20 mL)에 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 (200 mg, 0.36 mmol)을 녹인 용액에p-톨루엔술폰산 (20 mg)과 각 각의 해당하는 과량의 아크로레인 디알킬 알데히드 또는 아세탈 유도체 (acrolein dialkyl aldehyde or acetal derivatives, 2.0 - 3.5 mmol)를 넣고 실온, 질소기류하에서 3 시간 내지 24 시간 동안 교반하였다. TLC 로 반응의 완결을 확인한 후 트리에틸아민 (0.2 mL)을 가하여 반응을 중단시킨 후 아세토니트릴을 감압증류하여 생성된 고체를 클로로포름 (100 mL x 2 회)에 녹여 유기층을 증류수 (10 mL)로 씻어준 후 무수 MgSO4로 탈수시켰다. MgSO4를여과한 후 여액을 감압증류하고 생성물을 관 크로마토그라피 (클로로포름:메탄올 = 40:1)로 분리하여 각각의 순수한 화합물을 얻었다. 분리된 화합물이 불순물을 포함한 경우에는 관 크로마토그라피 (헥산:에틸아세테이트 = 1:1) 로 다시 분리하여 하기 화합물들을 순수한 상태로 얻었다.
화합물 1 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-프로페닐리덴)-글루코시드
수율 : 72 %,
mp. 233 - 236 ℃
MS, m/z [M]+= 600
IR(KBr, cm-1) 3451, 2882, 1767, 1609, 1501.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.80(s, 1H), 6.52(s, 1H), 6.23 (s, 2H), 5.98(d, 1H), 5.95(d, 1H), 5.86(ddd, 1H), 5.51(d, 1H), 5.40(1H), 5.35(d, 1H), 4.99(d, 1H), 4.90(d, 1H), 4.62(d, 1H), 4.58(d, 1H), 4.40(dd, 1H), 4.24-4.19(m, 2H), 3.73(s, 6H + m, 1H), 3.63(m, 1H), 3.43(m, 1H) 3.37(m, 2H), 3.25(dd, 1H), 2.87(m, 1H), 2.81(d, 1H), 2.66(d, 1H).
화합물 2 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-부테닐리덴)-글루코시드
수율 : 55 %
mp. 210 - 214 ℃
MS, m/z [M]+= 614
IR(KBr, cm-1) 3457, 1771, 1610, 1513, 1483.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.83(s, 1H), 6.56(s, 1H), 6.26(s, 2H), 6.01(d, 1H), 5.99(d, 1H), 5.82(m, 1H), 5.46(s, 1H), 5.18-5.13(m, 2H), 4.93(d, 1H), 4.65-4.60(m, 3H), 4.42(dd, 1H), 4.25-4.20(m, 2H), 3.77(s, 6H), 3.75(m, 1H), 3.58(m, 1H), 3.45(t, 1H), 3.35-3.27(m, 3H), 2.89(m, 1H), 2.48(m, 2H).
화합물 3 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-부티닐리덴)-글루코시드
수율 : 61 %
MS, m/z [M]+= 612
IR(KBr, cm-1) 3441, 2889, 1768, 1610, 1502.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.79(s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.23(s, 2H), 5.98(d, 1H), 5.95(d, 1H), 5.41(s, 1H), 5.11(dt, 1H), 4.89 (d, 1H), 4.61(m, 1H), 4.57(d, 1H), 4.39(t, 1H), 4.20(m, 2H), 3.73(s, 6H), 3.70(m, 1H), 3.55(m, 1H), 3.41(m, 1H), 3.31(m, 1H), 3.25(dd, 1H), 2.85(m, 1H), 1.90(s, 3H).
화합물 4 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-페닐-2-프로피닐리덴)-글루코시드
수율 : 52 %
mp. 228 - 231 ℃
MS, m/z [M]+= 674
IR(KBr, cm-1) 3455, 3044, 1768, 1608, 1502.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.52-7.31(m, 5H), 6.83(s, 1H), 6.55(s, 1H), 6.26(s, 2H), 6.00(d, 1H), 5.98(d, 1H), 5.97(s, 1H), 5.43(s, 1H), 4.92(d, 1H), 4.67(d, 1H), 4.60(d, 1H), 4.45(dd, 1H), 4.23(t, 1H), 4.15(t, 1H), 4.05(dd, 1H), 4.00(t, 1H), 3.77(m, 1H), 3.76(s, 6H), 3.52-3.37(m, 3H), 3.28(dd, 1H), 2.90(m, 1H).
화합물 5 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-메틸-3-페닐-2-프로페닐리덴)-글루코시드;
수율 : 42 %
mp. : 216-221oC
MS,m/z M+= 692
IR(KBr, cm-1) 1769, 1616, 1506, 1231, 1076.
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : δ 7.23-7.38(m, 5H), 6.83(s, 1H), 6.69(s, 1H), 6.55(s, 1H), 6.25(s, 2H), 6.00(d, 1H), 5.99(d, 1H), 5.47(s, 1H), 5.02(s, 1H), 4.93(d, 1H), 4.66(d, 1H), 4.60(d, 1H), 4.20-4.59(m. 3H), 3.76(s, 6H), 3.80-3.86(m, 1H), 3.25-3.71(m, 4H), 2.86-2.98(m, 2H), 1.93(s, 3H).
화합물 6 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-사이클로헥세닐리덴)-글루코시드
수율 : 46 %
mp. : 207-209oC
IR(KBr, cm-1) 1769, 1616, 1507, 1231, 1077.
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : δ 6.83(s, 1H), 6.55(s, 1H), 6.25(s, 2H), 6.00(d, 1H), 5.98(d, 1H), 5.67(m, 2H), 5.44(s, 1H), 4.91(d, 1H), 4.59-4.70(m, 2H), 4.37-4.47(m, 1H), 4.18-4.26(m, 2H), 3.76(s, 6H), 3.60-3.86(m, 1H), 3.22-3.60(m, 4H), 2.60-2.92(m, 2H), 1.83-2.06(m, 7H).
화합물 7 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메틸-2-부테닐리덴)-글루코시드;
수율 : 54 %
IR(KBr, cm-1) 1770, 1616, 1508, 1230, 1037.
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : δ 6.83(s, 1H), 6.55(s, 1H), 6.26(s, 2H), 6.00(d, 1H), 5.98(d, 1H), 5.21-5.28(m, 2H), 4.91(d, 1H), 4.67(d, 1H), 4.61(d, 1H), 4.18-4.26(m. 3H), 3.76(s, 6H), 3.60-3.86(m, 1H), 3.21-3.50(m, 4H), 2.75-3.00(m, 2H), 1.76(s, 6H).
화합물 8: 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-메틸-2-프로페닐리덴)-글루코시드;
수율 : 42 %
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : δ 6.83(s, 1H), 6.55(s, 1H), 6.26(s, 2H), 6.01(d, 1H), 5.98(d, 1H), 5.21(s. 1H), 5.18(s, 1H), 5.05(s. 1H), 4.92(d, 1H), 4.67(d, 1H), 4.61(d, 1H), 4.25-4.23(m, 2H), 3.76(s, 6H), 1.80(s, 3H).
실시예 2
4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(알콕시알킬리덴)-글루코시드 유도체(화합물 9 내지 11)의 합성
4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드(170 mg, 0.30 mmol)을 무수 니트로메탄 (20 mL)에 녹인 용액에 ZnCl2(20 mg)과 각각의 해당하는 과량의 알콕시알킬알데히드 또는 아세탈 화합물(1.8-3.0 mmol)을 질소기류하에서 넣고 실온에서 3 시간 내지 24 시간 동안 교반하였다. 반응의 완결을 TLC로 확인하였으며 니트로메탄을 감압 증류하고 생성된 고체를 클로로포름(100 mL)에 녹여 유기층을 증류수(10 mL x 2회)로 씻어준 후 무수 MgSO4로 건조시키고 여과한 다음 여액을 감압증류하고 관 크로마토그라피 (클로로포름:메탄올 = 40:1)로 분리하여 하기 화합물들을 순수한 형태로 얻었다.
화합물 9 :4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메톡시-1-부틸리덴)-글루코시드
수율 : 55 %
mp. 225 - 228 ℃
MS, m/z [M]+= 646
IR(KBr, cm-1) 3424, 2954, 1772, 1610, 1512, 1462.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.80(s, 1H), 6.50(s, 1H), 6.21(s, 2H), 5.96(s, 1H), 5.93(s, 1H), 5.48(s, 1H), 4.89(d, 1H), 4.69(m, 1H), 4.59-4.55(m, 2H), 4.38(t, 1H), 4.20-4.14(m, 2H), 3.72(m, 1H), 3.72(s, 6H), 3.64(m, 1H), 3.56-3.47(m, 2H), 3.38(m, 1H), 3.27(m, 1H), 3.27(s, 3H), 3.12(br. 1H), 2.85(m, 1H), 1.84(m. 1H), 1.69(m, 1H), 1.12(d, 3H).
화합물 10 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-에톡시-1-프로필리덴)-글루코시드
수율 : 62 %
mp. 229 - 231 ℃
MS, m/z [M]+= 646
IR(KBr, cm-1) 3442, 2864, 1767, 1609, 1513, 1483.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.83(s, 1H), 6.54(s, 1H), 6.25(s, 2H), 6.00(s, 1H), 5.97(s, 1H), 5.48(s, 1H), 4.92(d, 1H), 4.73(t, 1H), 4.64-4.58(m, 2H), 4.42(t, 1H), 4.25-4.16(m, 2H), 3.75(s, 6H), 3.70(m, 1H), 3.57-3.25(m, 9H), 2.90(m, 1H), 1.96(m, 2H), 1.19(t, 3H).
화합물 11 : 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메톡시-1-프로필리덴)-글루코시드
수율 : 67 %
mp. 206 - 209 ℃
MS, m/z [M++ 1] = 633
IR(KBr, cm-1) 3450, 2875, 1767, 1610, 1513, 1483.
1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 6.83(s, 1H), 6.54(s, 1H), 6.25(s, 2H), 6.00(s, 1H), 5.97(s, 1H), 5.50(s, 1H), 4.92(d, 1H), 4.72(t, 1H), 4.63-4.58(m, 2H), 4.42(t, 1H), 4.25-4.18(m, 2H), 3.75(s, 6H), 3.73-3.26(m, 8H), 3.33(s, 3H), 2.89(m, 1H), 1.96(m, 2H).
실시예 12
4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(시클로프로필메틸리덴)-글루코시드(화합물 12)의 합성
4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드(100 mg, 0.18 mmol)을 질소기류하에서 무수 아세토니트릴 (10 mL)에 녹이고p-톨루엔술폰산(10 mg)과 시클로프로판카르복스알데히드(0.12 mL)를 넣고 실온에서 24 시간 교반하였다. TLC로 반응 완결을 확인하고 트리에틸아민으로 반응을 중단시켰다. 아세토니트릴을 감압증류한 후 생성된 고체를 클로로포름(20 mL)에 녹여 염화나트륨의 포화수용액(10 mL)로 씻어주고 유기층을 증류수(10 mL x 2 회)로 다시 씻어준 후 무수 MgSO4로 건조시키고 여과하였다. 여액을 감압증류하고 관 크로마토그라피(클로로포름:메탄올 = 40:1)로 1차, 관 크로마토그라피(헥산:에틸아세테이트=1:1)로 2차 분리하여 표제 화합물을 얻었다.
수율 : 72 %
mp. 229 - 232 ℃
MS, m/z [M]+= 614
IR(KBr, cm-1) 3448, 2884, 1769, 1609, 1508, 1482.
1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 6.80(s, 1H), 6.50(s, 1H), 6.21(s, 2H), 5.97(d, 1H), 5.94(d, 1H), 5.46(s, 1H), 4.88(d, 1H), 4.58(d, 1H), 4.55(d, 1H), 4.37(dd, 1H), 4.20-4.14(m, 3H), 3.72(s, 6H), 3.67(t, 1H), 3.50(t, 1H), 3.38(t, 1H), 3.30-3.23(m, 2H), 3.17(br, 1H), 3.00(br, 1H), 2.85(m, 1H), 1.12(m, 1H), 0.53(m, 2H), 0.45(m, 2H).
합성된 대표적인 일반식 (I)의 화합물을 표 1 에 요약하였다.
화합물 번호 R1 R2
1 H CH2=CH-
2 H CH2=CH-CH2-
3 H CH3-C≡C-
4 H Ph-C≡C-
5 H 페닐-CH=CH(CH3)-
6 H 사이클로헥스-3-에닐
7 H (CH3)2-C=CH-
8 H CH2=C(CH3)-
9 H CH3-CH(OCH3)-CH2-
10 H CH3CH2O-CH2-CH2-
11 H CH3O-CH2-CH2-
12 H 시클로프로필-
에토포시드 H CH3-
시험예 2 : 급성 독성시험
5 주령의 특정병원균 부재(specific pathogen free) ICR 마우스로서 체중 28.0-31.5g 의 숫컷 12마리를 온도 23±3oC, 습도 50±10 %, 조도 150-300 Lux.(12시간, 오전 7시-오후 7시)의 동물실 내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 7일 정도 순화시켰다. 실험동물용 고형사료(공급처: 제일사료 주식회사) 및 음료수를 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다.
본 발명의 화합물 번호 1을 멸균 생리식염수에 녹여 마우스의 체중 당 50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg의 투여량으로 각각 10 ml/kg의 투여액량으로 복강투여 하였다. 시료는 1회 복강 투여하였으며 투여 후 14일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사여부를 관찰하였다. 즉, 투여당일은 투여 후 1시간에서 6시간까지 매시간 마다 그리고 투여익일부터 14일째까지는 매일 1회 이상씩 일반 증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 14일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부장기를 검사하였다. 또한, 투여 당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 각 동물의 체중감소현상을 관찰하였다.
본 발명의 화합물 번호 1의 은 LD50값은 50.88 mg/kg으로 계산되었다.
시험예 2 : 생체외 항암활성
단계 1 : 세포 배양
항암활성 측정에 사용한 세포들은 A-549(비소형 세포 폐암), SK-OV-3(선암, 난소 악성 복수증), SK-MEL-2(악성흑색종, 대퇴부 피부로의 전이), XF498(중추신경계 종양) 및 HCT15(결장선암)이며, 이들 암세포는 모두 인간 유래의 종양세포주들로서 미국의 국립암연구소(NCI)로부터 분양받아 한국화학연구소에서 계대 배양중인 것을 사용하였다. 이 세포들은 모두 배양액으로서 5 % 소의 태아 혈청으로 보강된 RPMI 1640 배양액을 사용하여, 37oC 항온 항습 5 % CO2, 인큐베이터에서 배양하였다. 세포의 계대는 3-4일에 1회씩 하였으며, 세포를 부착면으로부터 분리하기위하여 PBS(인산염 완충 식염수) 용액에 0.25 % 트립신과 3 mM 트란스-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N,N,N-테트라아세트산(CDTA)을 용해시킨 용액을 사용하였다.
단계 2 : 생체외 항암 활성
1989년 미국의 국립암연구소에서 약물의 생체외 항암활성을 측정하기위하여 개발된 SRB분석법(sulforhodamine B assay method)을 사용하였다. 즉, 계대중인 세포들을 실험에 사용하기 위하여 트립신-CDTA 용액을 이용하여 세포들을 착면으로부터 분리시키고, 플레이트(96 well microplate, Falcon사 제품)에 웰(well)당 세포수가 5 x 103(A549, HCT15), 1 x 104(SK-MEL-2, XF498), 2 x 104(SK-OV-3)이 되도록 분주하였다. 분주된 세포들은 CO2인큐베이터내에서 24 시간 배양하여 바닥에 부착시킨 후, 아스피레이터로 배양액을 제거하고, 6 농도의 로그 투여량(log dose)으로 배양액에 희석된 화합물(화합물 번호 1 내지 12) 용액들을 세포가 들어 있는 웰에 각각 100 ml 씩 3배수로 넣어주고, 48 시간동안 더 배양하였다. 화합물을 용해시키기 위하여 필요에 따라 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하였다. 또한 이렇게 희석한 화합물 용액은 세포에 가하기 전에 0.22 ml 필터로 여과하여 실험의 무균 상태를 유지하였다.
세포를 약물과 48시간 배양한 후 각 웰의 배양액을 제거하고 10 % 트리클로로아세트산(TCA)를 100 ml씩 가하여 4oC에서 1 시간 동안 방치하여 세포들을 플레이트의 바닥면에 고정시켰다. 세포의 고정이 끝난 후 플레이트를 물로 5-6회 세척하여 남아있는 TCA용액을 완전히 제거하고, 남은 물기가 없도록 실온에서 건조시켰다. 완전히 건조된 플레이트는 웰당 100 ml의 1 % 아세트산 용액에 0.4 % SRB를 용해시킨 염색용액을 가하여 30 분간 세포를 염색하고, 다시 1% 아세트산 용액으로 5-6회 세척하여 세포에 결합하지 않은 SRB를 제거하였다. 이렇게 염색된 셀 플레이트(cell plate)들은 다시 실온에서 건조시킨 후 웰당 100 ml의 10 mM 완충되지 않은 트리스마 염기 용액(unbuffered trisma base solution)을 가하여 진탕기(titer plate shaker)로 10 분간 흔들어 염색약을 용출시킨후 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
암세포들에 대한 약물의 효과를 계산하기 위하여 약물을 가할때의 세포수(Tz)와, 약물이 들어있지 않은 배양액을 가하여 48시간 배양하였을때의 세포수(C) 및 각 농도의 약물과 함께 48시간 배양했을때의 세포수(T) 등을 측정하여 다음의 수식에 의하여 계산하였다:
항암활성=[(T-Tz)/(C-Tz)] x 100 (TzT인 경우) 또는
항암활성=[(T-Tz)/Tz] x 100 (TzT인 경우)
이렇게 계산된 값들로부터 로터스 프로그램(LOTUS program)의 데이터 회귀(data regression)를 이용하여 약물이 암세포의 성장을 50 % 억제하는 농도 즉, ED50를 계산하여 각 약물의 항암활성도를 비교하였다.
이상과 같은 시험관내의 활성측정 결과의 일부를 세계적으로 사용하고 있는 항암물질인 에토포사이드(Etoposide, 미국 BMS사 제품)와 비교하였다.
시험예 3: 인간 유전자 위상이성질화 II 효소 저해능 측정
단계 1 : 유전자 위상이성질화 II 효소 조제
본 실험에 사용한 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입한 HeLa 셀을 사용하였다. 즉 HeLa 셀을 10% 소 태아 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양한 다음 HeLa 셀을 모아 3배 용량의 1 mM의 에틸렌디아민 사초산(EDTA), 1 mM 머캅토에탄올, 0.5 mM 페닐메틸술포닐클로라이드(PMSF) 및 10 % 글리세롤을 포함하는 50 mM KH2PO4(pH 7.0) 완충액을 가하여 빙욕중에서 펄리트론으로 30초간 균질화하고 여기에 2 M KH2(PO4)(pH 7.0) 완충액을 가하여 최종농도가 0.3 M이 되게 한 후 다시 30초간 균질화하여 1시간 동안 빙욕중에 방치한 다음 30,000 x g에서 30 분간 원심분리하여 얻은 상청액을 포스포셀룰로스 크로마토그라피 등의 방법으로 부분정제하여 사용한다.
단계 2 : P4 언노팅(unknotting) 분석
합성한 Topo II억제제의 IC50결정을 위해 언노팅 분석을 행한다. 즉, 50 mM N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄술폰산](HEPES)(pH 7.0), 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 ㎍/ml 소 태아 혈청 알부민, 1 mM 아데노신 트리포스페이트(ATP), 0.4 ㎍ P4노팅된(knotted) DNA와 효소를 가하여 총반응액 량이 20 ㎕가 되게 한 후 37oC에서 30 분간 반응시킨다. 반응은 최종농도가 1 %되게 나트륨 도데실설페이트(SDS)를 가하여 정지시키고 50 mM 트리스 붕산염 (pH 8.3), 2.5 mM EDTA용액으로 평형화된 1 % 아가로스 겔에 가하여 전기영동한 후 0.5 ㎍/ml의 에티듐 브로마이드 용액에서 염색, 자외선하에서 사진을 찍어 활성을 측정한다. 효소활성은 0.4 ㎍의 노팅된 P4DNA의 50 %가 언노팅된 것을 1 유니트로 한다. 이상과 같은 방법으로 결정한 IC50를 기존의 Topo II 억제제인 에토포사이드와 비교하였다.
상기 시험예 1 및 2 에 따른 결과를 나타내었다.
합성화합물의 Topo II(IC50,㎍/㎖)와 생체외 항암활성(ED50,㎍/㎖)
사용화합물 ED50, ㎍/㎖ IC50, Topo II(㎍/㎖)
A549 SK-OV-3 SK-MEL-2 XF-498 HCT15
에토포사이드 2.05 1.12 0.97 0.69 2.52 10.0
1 0.09 0.03 0.33 0.04 0.01 2.0
2 0.87 0.52 1.60 0.77 1.19 10.0
3 1.57 0.81 2.24 1.33 1.75 5.0
4 0.48 0.44 1.16 0.39 0.52 15
5 0.03 0.11 0.09 0.10 0.04 5.0
6 0.03 0.16 0.12 0.13 0.03 2.5
7 0.21 0.42 0.10 0.24 0.12 7.5
8 0.42 0.97 0.54 0.52 0.40 25.0
9 1.74 1.28 2.83 1.41 1.82 7.5
10 2.78 1.79 3.03 1.66 3.34 7.5
11 3.30 2.16 3.74 2.72 3.23 7.5
12 1.26 0.93 2.47 1.07 1.46 5.0
상기 표 2에서 보듯이 본 발명의 일반식(I) 화합물들은 시험한 5가지 암세포 주에서 비교화합물 에토포사이드와 비슷하거나 우수한 암세포독성을 나타내었다. 특히, 화합물 1의 경우 250배 내지 3배 더 강한 암세포독성을 나타내고 있으며 또한, 인간 유전자 이성질화 II 효소에 대해서도 화합물 번호 1은 5배 강한 저해활성을 나타내고 있다. 화합물 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12번의 경우에도 에토포사이드보다 낮은 농도에서 이 효소를 저해하고 있음을 알 수 있다.
시험예 4: 생체내 항암활성 측정
6주령 BDF1 생쥐 8마리를 한 그룹으로 하여 DBA/2 mouse에서 계대중인 류케미아 L1210 세포를 각각의 생쥐에 1 × 105셀/0.1 ml 씩 복강내로 이식하였다.
시험약물은 1, 2, 3, 4, 5 일에 각각의 농도로서 복강내로 투여하였다.
생쥐를 매일 관찰하면서 생존시간을 측정하고 각 실험군의 평균 생존일으로부터 대조군에 대한 투여군의 평균 생존일의 증가된 비율(T/C %)을 계산하여 항암효과를 판정하였다. 그 결과를 하기 표 3 에 나타내었다.
화합물 투여량(mg/kg) T/C(%) 60일 이상 생존마리수
Etoposide 20105 508.0323.1251.9 521
화합물 1 20105 657.2657.2288.9 882
생체내 항암활성 시험 결과, 표 3에서 알 수 있듯이, 기준화합물 에토포사이드의 경우 최고 활성농도(20 mg/kg)에서 60일 이상 생존한 쥐가 5마리(T/C 508.0 %)였으나 화합물 1의 경우 이보다 2배 낮은 투여농도(10 mg/kg)에서도 시험한 8마리의 쥐가 모두 생존(T/C 657.2 %)하였다. 또한 에토포사이드와 같은 농도(20 mg/kg)로 시험하였을때에도 화합물 1은 시험한 8마리의 쥐가 또한 모두 생존(T/C 657.2 %)하였다. 이와같은 결과를 살펴볼 때 본 일반식 (I)의 화합물은 그 항암효과가 비교화합물보다 매우 우수함을 알 수 있었다.
본 발명의 일반식 (I)의 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 유도체는 인간 유전자 이성질화 II 효소에 대한 활성 및 암세포독성에서 기준화합물에토포사이드와 비슷하거나 우수한 활성을 갖고 있으며 매우 우수한 생체내 항암효과를 나타낸다.

Claims (5)

  1. 하기 일반식 (I)의 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 유도체:
    화학식 1
    (I)
    상기식에서,
    R1및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 또는 알콕시, 페닐, 치환된 페닐, 할로겐, 니트로, 시아노, 히드록시, 카르복실 및 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 라디칼로 임의로 치환된 C2-C12알케닐, C2-C12알키닐, C2-C12알콕시알킬 또는 시클로프로필이거나; 이들이 결합된 탄소원자와 함께 상호 연결되어 알콕시, 페닐, 치환된 페닐, 할로겐, 니트로, 시아노, 히드록시, 카르복실 또는 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 라디칼로 임의로 치환된 C5-C15의 고리를 형성하며, 단, R1및 R2는 둘다 수소원자는 아니다.
  2. 제 1항에 있어서,
    R1이 수소이고, R2가 페닐 또는 치환된 페닐로 임의로 치환된 C2-C12알케닐, C2-C12알키닐, C2-C12알콕시알킬 또는 시클로프로필기인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서,
    4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-프로페닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-부테닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-부티닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-페닐-2-프로피닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-메틸-3-페닐-2-프로페닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-사이클로헥세닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메틸-2-부테닐리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(2-메틸-2-프로페닐리덴)-글루코시드4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메톡시-1-부틸리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-에톡시-1-프로필리덴)-글루코시드, 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(3-메톡시-1-프로필리덴)-글루코시드 및 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-(시클로프로필메틸리덴)-글루코시드로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물.
  4. 하기 일반식 (II)의 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드를 하기 일반식 (III)의 알데히드 화합물 또는 하기 일반식 (IV)의 아세탈 화합물과 산 촉매하에서 반응시키는것을 특징으로하는 제 1항에 따른 일반식 (I)의 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-글루코시드 유도체의 제조방법:
    (II)
    (III)
    화학식 4
    (IV)
    상기 식에서, R1및 R2는 제 1 항에서 정의한 바와 같고, R3는 C1-3알킬이다.
  5. 제 1 항에 따른 일반식 (I)의 4'-O-데메틸-에피포도필로톡신-β-D-알킬리덴-글루코시드 유도체 항암 효과량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제 조성물.
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