KR19990022680A - 폴리사카라이드 항원-담체 단백질 콘쥬게이트 및유리 담체단백질을 포함하는 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 담체 단백질에 결합된 콘쥬게이트된 폴리사카라이드 항원을 포함하는 조합 백신으로서, 상기 담체 단백질이 콘쥬게이트중에 폴리사카라이드 대 담체 담백질의 비가 1:0.3 내지 1:2인 유리 항원으로 존재하는 조합 백신에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 백신 조성물은 다가 백신, 즉 한 가지 이상의 질환을 고치거나 치료하기 위한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약품중에서 상기 백신의 제조 및 사용에 관한 것이다.

Description

폴리사카라이드 항원-담체 단백질 콘쥬게이트 및 유리 담체 단백질을 포함하는 백신

본 발명은 담체 단백질에 결합된 콘쥬게이트된 폴리사카라이드 항원을 포함하는 조합 백신에 관한 것이고, 상기 담체 단백질은 또한 백신 조성물중의 유리 항원으로서 존재한다. 특히 본 발명의 백신 조성물은 다가 백신, 즉 한 가지 이상의 질환을 고치거나 치료하기 위한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약품중에서 상기 백식의 제조 및 사용에 관한 것이다.

폴리사카라이드를 이용하는 백신은 종래에 공지되어 있다. 예를 들어 인플루엔자균 b (Hib) 감염을 예방하기 위핸 백신은 담체 단백질로 콘쥬게이트된 캡슐형 폴리사카라이드(PRP)를 기초로 한다. 전형적으로 담체 단백질은 디프테리아 또는 파상풍 톡소이드이다. 또한 파상풍 또는 디프테리아 톡소이드와 같은 담체 단백질에 콘쥬게이트된 캡슐형 폴리사카라이드를 기초로 하는 연쇄 구균 폐렴의 예방을 위한 백신을 제조하는 것이 제안된다. 상기 콘쥬게이트 백신 항원의 예가 US 4 365 170, US 4 673 574, EP 208 375, EP 477 508 및 EP 161 188에 기재되어 있다.

동시에 다른 항원 또는 백신을 갖는 상기 콘쥬게이트 백신을 투여하는 것이 바람직하고 이는 여러번의 주사로 수행될 수 있다. 여러번의 주사와 관련된 문제는 보다 복잡한 투여 과정 및 전체 주사의 대부피를 포함하다. 이것은 백신이 유아에게 접종되는 경우에 특히 심각한 문제이다.

그러므로 조합 백신을 제조하는 것이 제안된다. 널리 공지된 조합 백신은 디프테리아, 파상풍 및 B. 백일해 감염에 대한 보호성을 제공한다. 이러한 백신은 백일해 성분[박멸된 전체 세포 B. 백일해 또는 비세포성 백일해(보편적으로 3개 이하의 항원 - PT, FHA 및 69kDa으로 이루어짐)] 및 톡소이드된 디프테리아 및 파상풍독을 포함한다. 상기 백신은 종종 DTPw(전체 세포) 또는 DTPa(비세포성 물질)로서 간주된다.

상기 조합체에 폴리사카라이드 콘쥬게이트 백신을 첨가하는 것이 바람직하다. 그러나 발명자들은 성분들의 단순한 혼합이 폴리사카라이드 성분으로 항체 적정물질을 환원시키고 상기 항체 적정물질의 보호 수준의 지속성이 감소되는 것을 발견하였다. 이와 같이 해독된 파상풍 톡소이드(TT)에 대한, 콘쥬게이트 PRP Hib 폴리사카라이드의 면역원성은 TT-PRP 콘쥬게이트 및 DTPa로 동시에, 그러나 분리 부위에서 면역된 유아에 비해, DTPa에 결합된 TT-PRP 콘쥬게이트로 면역된 유아에서 감소하는 것이 관찰되었다.

1가인 경우, 즉 백신이 담체 단백질에 콘쥬게이트된 단일 폴리사카라이드(PS)만을 포함하는 경우, 콘쥬게이트의 단백질 함량이 높을수록 더 많은 항체가 폴리사카라이드에 감응한다. 이것은 T 세포 의존 폴리사카라이드 특이 항체 감응의 유입은 폴리사카라이드에 단백질 담체의 공유 결합을 필요로 하기 때문인 것으로 생각된다. 단백질 담체는 담체에 대한 양호한 TH 세포 감응이 유도되고, 이러한 TH 감응이 공유 결합된 담체 단백질로부터 유도된 펩티드를 발현시키는 PS 특이 B 세포 클론을 인식할 수 있는 농도(즉 PS 대 단백질 비)로 존재할 필요가 있다.

보편적으로 종래 기술의 1가 백신의 폴리사카라이드:단백질 담체의 비는 1:3(중량:중량)이다.

1가 백신에서 위치에 대한 놀랍고 완전한 대조에서, 본 발명자들은 폴리사카라이드 콘쥬게이트 성분이 담체 단백질의 유리 형태를 포함하는 다가 백신의 일부인 경우에, 폴리사카라이드 성분의 면역원성은 콘쥬게이트 항원의 단백질 함량을 감소시킴으로써 개선된다.

따라서 본 발명은 담체 단백질에 콘쥬게이트된 폴리사카라이드 항원을 함유하는 조합된 백신을 제공하고, 상기 담체 단백질은 또한 폴리사카라이드 대 담체 단백질의 비가 약 1:0.3 내지 1:2인 유리 항원으로서 존재한다. 바람직한 비는 1:0.5 내지 1:1.5이고, 보편적으로는 1:1 이다.

폴리사카라이드 콘쥬게이트는 어느 공지된 결합 기술에 의해서나 제조될 수 있다. 예를 들어 폴리사카라이드는 티오에테르 결합을 통해 결합될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트 방법은 시아네이트 에스테르를 형성하기 위해 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 폴리사카라이드를 활성화시키는 것에 달려있다. 이와 같이 활성화된 폴리사카라이드는 담체 단백질상에서 직접 또는 아미노기에 스페이서기를 통해 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민과 결합되고 아미노 유도 폴리사카라이드는 티오에테르 결합의 형성과 관련된 헤테로결찰 화학을 사용하여 담체 단백질에 결합된다. 상기 콘쥬게이트는 PCT 공고 출원 WO93/15760 유니폼드 서비스 유니버서티에 설명되어 있다.

콘쥬게이트는 또한 US 4365170(제닝스) 및 US 4673574(안더손)에 설명된 직접적인 환원성 아미노화 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 방법이 EP-0-161-188, EP-208375 및 EP-0-477508 에 설명되어 있다.

추가 방법은 카르보디이미드 축합(Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256)에 의해 단백질 담체에 아디프산 히드라지드(ADH)로 유도된 시아노겐 브로마이드 활성화 폴리사카라이드를 결합시키는 것을 포함한다.

바람직하게는 담체 단백질은 파상풍, 또는 디프테리아, 바람직하게는 파상풍 톡소이드 또는 디프테리아 톡소이드로부터 유도된 항원이다. 담체는 또한

보르데텔라로부터 유도될 수 있다. 보편적으로 항원은 파상풍 또는 디프테리아로부터의 독소의 비독성 유도체이다.

바람직하게는 본 발명의 조성물은 적합한 보조제를 함유한다.

바람직한 보조제는 MPL(3-탈아실화된 모노포스포릴 리피드 A, 또한 3D-MPL로서 공지됨)이다. 3D-MPL은 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 리피드와 4, 5 또는 6 아실화된 쇄의 혼합물로서 GB 2 220 211(Ribi)로부터 공지되어 있고 Ribi Immunochem(Montana 소재)에 의해 제조된다. MPL의 바람직한 형태는 국제 특허 출원 92/116556에 기재되어 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 추가 보조제는 QS21로서 공지되어 있다. QS21은 더 바크 오브 더 사우쓰 아메리카 츄리 퀼라자 사포나리아 몰리나로부터의 사포닌의 Hplc 정제된 비독성 분획이고 이것의 제조 방법은 US 특허 제 5,057,540 호에 기술되어 있다(QA21로서 기술되어 있음).

QS21 및 3 D-MPL의 조합체는 상승적 효과의 백신 제형물을 생성하는 것으로 공지되어 있고 국제 특허 출원 WO 94/00153에 설명되어 있다.

본 발명의 Hib 성분 백신은 특정 담체를 전혀 필요로 하지 않고 수성 또는 다른 약제학적으로 허용되는 완충액중에서 제형되는 것을 필요로 하지 않을 것이다. 일부 경우에 본 발명의 전체 백신은 수유화액, 또는 다른 적합한 담체, 예를 들어 리포솜, 마이크로스피어 또는 캡슐화된 항원 입자중의 오일에 존재할 수 있다.

백신 제형물은 추가 항원을 함유할 수 있다. 항원 또는 종래 기술에 공지된 항원성 조성물은 HIV-1(예를 들어 gp120 또는 gp160), gD 또는 이것의 유도체와 같은 사람 또는 동물 헤르페스 바이러스 또는 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27와 같은 이미디에이트(Immediate) 어얼리(Early) 단백질, 시토메갈로바이러스(특히 사람)(예를 들어 gB 또는 이것의 유도체), 바리셀라 조스터 바이러스(에를 들어 gpI, II 또는 III), 또는 간염 B 바이러스와 같은 감염 바이러스 예를 들어 간염 B 표면 항원 또는 이것의 유도체, 간염 A 바이러스, 간염 C 바이러스 및 간염 E 바이러스, 또는 RS(Respiratory Syncytial) 바이러스, 사람 유두종 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스와 같은 다른 바이러스 병원균, 또는 불활성화된 폴리오 바이러스(IPV)와 같은 소아마비 바이러스 또는 디프테리아(D), 파상풍(T), 살모넬라, 나이세리아, 특히 나이세리아 뇌막염 A, B, 또는 C로부터 유도된 항원 또는 항원성 조성물을 포함하는, 본 발명의 조성물중에 사용될 수 있다. 보렐리아(예를 들어 OspA 또는 Ospb 또는 이것의 유도체), 또는 클라미디아, 또는 보르데텔라 예를 들어 B. 백일해(P), 또는 말라리아 원충 또는 톡소플라스마와 같은 기생충으로부터 유도된 P.69, PT 및 FHA을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 본 발명의 백신은 DTPa, Hib; 및 DTPa Hib Hep B; 및 DTPa Hib Hep B IPV를 포함한다.

본 발명의 조합 백신에서 Hib 성분은 단지 투여 이전에 다른 항원으로 제형화될 수 있는 것이 인지될 것이다. 이와 같이 동결건조된 Hib 성분은 다른 항원의 수성 제형물과 혼합함으로써, 사용하기 전에 재구성될 수 있다.

상기 조합체는 임의로 간염 A에 대해 보호성인 성분을 포함할 수 있다.

상기 백신에서 사용하기에 적합한 성분은 이미 시판되고 있으며 세부 항목은 세계 건강 기구로부터 수득될 수 있다. 예를 들어 IPV 성분 Salk 불활성화 폴리오 백신일 수 있다. 디프테리아, 파상풍 및 백일해 백신은 인판릭스 DTPa(스미쓰클라인 비참 바이올로지칼스 제품)와 같은 비세포형 생성물을 포함할 수 있다. 간염 A 에 대한 보호성을 제공하는 성분은 바람직하게는 HAV의 HM-175 스트레인으로부터 유도된 치사 감쇠 백신인 'Havrix'(스미쓰클라인 비참 바이올로지칼스)로서 공지된 생성물이다 [참고 문헌: 'Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A' by F.E. Andre, A Hepburn and E.D'Hondt, Prog Med. Virol. Vol 37, pages 72-95 (1990) and the product monograph 'Havrix', 스미쓰클라인 비참 바이올로지칼스에서 출판됨(1991)]. 간염 B 성분은 'Engerix-B'중의 'S' 항원을 포함할 수 있다.

유용하게는 인플루엔자균 B 백신 또는 본 발명에 따른 조합 백신은 소아 백신이다.

백신 제조는 일반적으로 하기 문헌에 설명되고 있다: Vaccine Design - the subunit and Adjuvant approach edited by Michael F Powell and Mark Newman, Plenum Press. 리포솜내의 캡슐화는 예를 들어 풀러톤(Fullerton)에 의한, US 특허 4,235,877에 설명되어 있다. 거대 분자에 단백질의 콘쥬게이션은 예를 들어 리크하이트(Likhite)에 의한, US 특허 4,372,945 및 아르모르(Armor)외에 의한, US 특허 4,474,757에 설명되어 있다.

각각의 백신 용량에서 항원의 양은 보편적인 백신에서 상당한 부작용 없이 면역 보호성 감응을 포함하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 특정 면역원이 사용되는 것에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 각각의 용량은 전체 면역원중 1-1000ug, 바람직하게는 2-100ug, 가장 바람직하게는 4-40ug을 포함할 것이다. 특정 백신에 대한 최적량은 피검자에서의 항체 적정 농도 및 다른 감응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신에 따라서, 피검자는 약 4주 간격으로 하나 또는 두 개의 부우스터 주사를 수용할 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명을 예시할 것이다.

실시예

실시예 1a) DTPa-Hib PRP-TT- 및 HBsAg를 포함하는 백신.

Hib TT 콘쥬게이트의 제조

재료 및 방법

재료

Hib PRP를 불활성화된 세포 배양액으로부터 추출시키고 정제시킨다. 정제된 재료는 잔여 단백질, 핵산, 내독소, 구조적 당 및 분자 크기 분포의 용어로 WHO 및 US 설명서를 충족시킨다.

베링베르케(Behringwerke)에 의해 제조된 파상풍 내독소는 또한 WHO 설명서를 충족시킨다. 재료는 추가로 산 pH 침전 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제되어 TT의 단량체 형태(150kDa)을 단리시킨다.

활성화 및 커플링 화학

Hib PRP의 20mg을 2M Na Cl 4ml중에 용해시켰다.

CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노-피리미디듐 테트라플루오로보레이트) 150mcl을 폴리사카라이드 용액(아세토니트릴중의 주용액 100mg/ml로부터 제조)에 첨가하였다. 1분 후에, 0.2M 트리에틸아민 300mcl을 첨가하였다. 폴리사카라이드의 활성화를 pH 9.5 내지 10, 0℃에서 2분 동안 수행하였다.

농도가 15mg/mlDLS 파상풍 톡소이드(PRP/단백질 초기비가 1/1 또는 1/2 임) 20mg 또는 40mg을 첨가하고 커플링 반응을 1시간 동안 25℃에서 수행하였다. 그 후 반응을 25℃에서 1시간 동안 1M 글리신 용액(pH 5.0) 3ml로 퀀칭시키고 4℃에서 밤새 두었다.

콘쥬게이트를 0.2M NaCl로 평형된 세프아크릴 HR 500 겔 여과 칼럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 용리된 분획중 탄수화물 및 단백질 함량을 결정하였다. 콘쥬게이트를 풀링시키고 살균 여과시킨다. 콘쥬게이트 제조중의 PRP/단백질 비 및 유리 PS 함량을 결정하였다.

실시예 1b)

DTP Hib PRP TT HBsAg 조합 백신 제형물

간염 B 백신을 사요하거나 사용하지 않는 DTPa(디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 페르탁틴 및 FHA를 포함)의 제조는 종래 기술에 공지되어 있다. 예를 들어 상기 백신은 국제 특허 출원 제 WO 93/24148호에 기재되어 있다. 실시예 1에 기재된 콘쥬게이트는 면역원성 연구를 위해 주사하기 전에 백신에 첨가되고 혼합된다.

본 연구에서 하기 단계를 수행하였다.

·페녹시-에탄올(정균성) 함량을 5mg/ml로 조절

·pH를 6.1±0.1 로 조절

·PRP 농도를 100mcg/ml 이하로 조절

·PRP-CDAP-TT 용액 0.1ml에 DTPaHBV(0.5ml)를 첨가

백신의 최종 조성물은 일회 투여량을 위한 것이다:

·PRP'P 10mcg

·D 25Lf

·T 10Lf

·PT 25mcg

·FHA 25mcg

·69K 8mcg

·Hep B 10mcg

·Al(OH)₃베링 0.35mg

·Al(OH)₃수퍼포스 0.15mg

·AlPO₄수퍼포스 0.20mg

·NaCl 150mM

·2φEt-OH 3mg(→5mg/ml)

·pH 61±0.1

·Vol 0.6ml

실시예 2

면역원성

2가지 상이한 커플링 화학을 이용한, 폴리사카라이드:단백질(중량:중량) 비 (1:3, 1:2 및 1:1)로 유도된 인플루엔자균 B형의 면역원성을 어린 OFA 쥐에서의 제 1 차 및 제 2 차 접종 후에 비교하였다.

제 1 차 백신 접종한지 28일 후에 수득한 자료는 콘쥬게이트 항원이 DTPa 간염 B에 결합되지만, 단독으로 주입되는 경우에, 콘쥬게이트 백신중의 감소된 단백질 함량과 관련된 개선된 안티 PS 항체 적정 농도를 명백하게 보여주고 있다. 이것은 콘쥬게이트 백신이 단독으로 제공되는 경우 관찰되는 상황과 명백한 대조를 이루고, 낮은 PS-TT 비(즉 더 많은 담체 단백질)은 폴리사카라이드에 더욱 양호한 항체 감응을 나타낸다(DTPa He B 백신과의 조합체가 제공되는 경우 42일 후 감소된 TT 양을 갖는 그룹 1 내지 3의 안티 PS 적정 농도는 25, 18 내지 5㎍/ml이고, 동일한 TT 함량을 갖는 그룹 1 내지 3의 안티 PS 적정 농도는 .3, 4 내지 8 내지 19 ㎍/ml임을 참조).

실시예 3

Hib와 DTPa의 적합성에 대한 TT/PS의 효과

10마리 쥐(OFA, 5주산, 암컷)의 그룹를 2가지 용량(0.5γ PS/쥐(표 2) 또는 0.05γ PS/쥐(표 3))으로 제공된 상이한 TT-PRP 백신을 사용하여 피하 경로에 의해 24시간 간격으로 2번 면역시켰다. Hib001 백신을 염수 또는 1회 용량의 DTPs(롯 119)로 재구성시켜 농도는 10γ PS/ml가 되었다. 액체 백신을 염수 또는 한 사람 용량의 DTPa로 희석시켜 농도가 10γ PS/ml가 되었다. 그 후 백신을 염수로 추가 희석시켜 농도가 2.5γ PS/ml 또는 0.25γ PS/ml가 되었다. 취를 희석후 한 시간내에 각각의 백신 200㎕로 주사하였다.

동물을 24일 및 38일 후에 방혈시키고 안티-PRP IgG Ab를 개개의 혈청에서 ELISA에 의해 측정하여 γ/ml로 나타내었다. GMT를 각각의 그룹에 대해 계산하였다.

실시예 4

낮은 비율 또는 '정상비' PRP:TT와 혼합된 DTPa, 및 DTPa 간염 B 백신의 면역원성의 비교

10마리 쥐(OFA, 1주산, 암컷)의 그룹를 한 사람 용량의 DTPa 또는 DTPa HepB의 1/20으로 주사하기 1시간 전에 PS 조합체 0.5㎍을 사용하여 2주 간격으로 3번(SC) 면역시켰다. 동물을 세 번째 투여 2주 후에 방혈시키고 백일해 톡소이드(PT), FHA, 페르탁틴(69K), 디프테리아 톡소이드(D) 파상풍 톡소이드(T) 및 간염 B 표면 항원(HBS)에 대한 항체를 엘리사(Elisa)에 의해 측정하였다. 참고 문헌을 이용하여 중간점 희석으로서 표현된 적정 농도를 표 4에 제시하였다.

실시예 3으로부터의 결과와 함께 상기 실험의 결과는 콘쥬게이트내의 단백질 양이 감소되는 경우에, Hib 감응이 조합 백신중에 향상되는 것을 증명한다. 더욱이, 백신의 다른 성분의 면역 감응에 대한 간섭은 전혀 없다.

Claims (13)

1. 담체 단백질에 결합된 콘쥬게이트된 폴리사카라이드 항원을 포함하는 조합 백신으로서, 상기 담체 단백질이 콘쥬게이트중의 폴리사카라이드 대 담체 담백질의 비가 1:0.3 내지 1:2인 유리 항원으로 존재하는 조합 백신.
2. 제 1 항에 있어서, 담체 담백질이 디프테리아 또는 파상풍 항원인 조합 백신.
3. 제 2 항에 있어서, 폴리사카라이드 대 담체 담백질의 비가 1:0.5 내지 1:1.5인 백신 조합.
4. 제 1 항에 있어서, 폴리사카라이드 성분이 인플루엔자균 b (Hib) 또는 연쇄 구균 폐렴, 또는 나이세리아 뇌막염 A, B, 또는 C로부터 유도된 조합 백신.
5. 제 4 항에 있어서, 디프레라아, 파상풍 및 백일해 감염에 대한 보호성 항원을 추가로 포함하는 조합 백신.
6. 제 4 항 또는 5 항에 있어서, 간염 B 백신에 대한 항원을 추가로 포함하는 조합 백신.
7. 제 4 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 A 백신에 대한 항원을 추가로 포함하는 조합 백신.
8. 제 4 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 소아바미에 대한 면역성을 제공하는 항원을 추가로 포함하는 조합 백신.
9. 제 4 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 연쇄 구균 폐렴 및 인플루엔자균 B에 대한 면역성을 제공하는 항원을 추가로 포함하는 조합 백신.
10. 제 4 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 적합한 보조제를 추가로 포함하는 조합 백신.
11. 제 1 항 내지 10 항에 있어서, 의약품에 사용하기 위한 백신.
12. 제 1 항 내지 10 항의 백신을 유효량으로 투여하여, 감염성 질환에 걸리기 쉽거나 이 질환으로 고생하는 사람을 치료하는 방법.
13. 폴리사카라이드 대 담체의 비가 1:0.3 내지 1:2인 담체 담백질에 콘쥬게이트된 폴리사카라이드 항원.