KR19990016720A - 재조합 효모에서 인간 알파-인터페론을 고수율로 생산하는방법 - Google Patents

재조합 효모에서 인간 알파-인터페론을 고수율로 생산하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 알파-인터페론 (IFN-α)을 재조합 효모 균주에서 발효 배지의 pH 를 조절하여 고수율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 ADH2/GAP 프로모터 조절하에 IFN-α 를 발현하여 분비하는 재조합 효모를 1) 발효 배지의 pH 를 발효 공정 전 기간 동안 효모 성장에 최적인 pH 보다 높게 유지시키거나 2) 효모를 성장 최적 pH 에서 발효시킨 다음 IFN-α 분비 단계에서 발효 배지의 pH 를 높게 유지시킴으로 상기 재조합 효모 균주에서 IFN-α 의 생산량을 크게 증대시키는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 효모에서 인간 알파-인터페론을 고수율로 생산하는 방법
본 발명은 인간 알파-인터페론 (IFN-α)을 재조합 효모 균주에서 발효 배지의 pH 를 조절하여 고수율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 ADH2/GAP 프로모터 조절하에 IFN-α 를 발현하여 분비하는 재조합 효모를 1) 발효 배지의 pH 를 발효 공정 전 기간 동안 효모 성장에 최적인 pH 보다 높게 유지시키거나 2) 효모를 성장 최적 pH 에서 발효시킨 다음 IFN-α 분비 단계에서 발효 배지의 pH 를 높게 유지시킴으로 상기 재조합 효모 균주에서 IFN-α 의 생산량을 크게 증대시키는 방법에 관한 것이다.
유전공학적 기술을 이용하여 재조합 대장균에서 인간 인슐린 (human insulin)이 생산된 이후, 인터페론 (interferon, IFN), 간염 백신 및 인간 성장 호르몬 (human growth hormone) 등 여러 종류의 유용한 의약 단백질들이 미생물에서 대량 생산되어 시판되고 있다. 그러나 유전공학적 기술로 의약용 단백질들을 미생물에서 발효·생산하는 공정은 그 수율이 낮기 때문에 지금까지 이들 방법은 고가의 의약 단백질 또는 효소 등을 생산하는데 주로 이용되어 왔다.
구체적으로 미생물을 이용한 의약 단백질의 생산 과정은 우선, 유전공학적 방법으로 동 단백질을 생산할 수 있는 미생물을 개발하고, 발효 공정으로 그 단백질을 생산하며, 최종적으로 제품 단백질을 분리·정제하는 다단계 공정으로 구성되어 있다. 따라서, 생산성을 향상시키기 위해 미생물의 발효 공정을 개선하여 의약 단백질의 생산 수율을 향상시키려는 연구가 계속 이루어져 왔고, 재조합 의약 단백질이 시판되기 시작하면서 이에 대한 연구는 더욱 가속화되고 있다.
미생물의 발효 생산성을 향상시키려면 우선, 유전자 수준에서 발현 벡터를 조작하여 재조합 유전자의 발효 효율을 증가시킬 수 있다. 재조합 유전자의 발현 속도와 세포의 성장 속도는 서로 반비례 관계를 가지므로 세포 성장 시기와 제품 단백질의 발현 시기를 분리하면 고수율로 제품 단백질을 얻을 수 있다. 상기와 같이 세포 성장 시기와 제품 단백질 발현 시기가 분리된 조건을 형성하기 위해 일반적으로 조절 프로모터 (regulated promoter)를 유전자 스위치 (genetic switch)로 사용하는데, 조절 프로모터는 환경 인자인 온도, 영양소 및 유도자 (inducer) 등에 의해 조절되어 단백질의 발현이 효과적으로 유도되므로 세포 성장 시기와 제품 단백질 발현 시기를 쉽게 분리할 수 있다. 예를 들어 재조합 효모에 사용되는 ADH2/GAP (알코올 디하이드로게나제 2 /글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 ; alcohol dehydrogenase 2 / glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase) 프로모터는 효모의 성장 시기와 제품 단백질의 발현 및 분비 시기를 분리할 수 있는 유전자 시스템을 제공한다.
다음, 반응기 수준에서 유가식 배양법 또는 이단 연속 배양법으로 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다. 구체적으로 발효 초기에는 세포의 성장 속도를 최대로 유지하여 최단 시기에 세포의 농도를 높인 다음, 제품 단백질을 암호하는 유전자가 발현되는데 적합한 환경 조건에서 제품 단백질의 생산 속도를 높여 다량의 제품 단백질을 생산할 수 있다.
따라서 각 재조합 미생물과 제품 단백질마다 최적인 발효 조건으로 발효시키는 것이 제품 단백질을 대량 생산하는데 중요하다. 예를 들어 분자 올리고당 생산 효소인 아밀라아제 (amylase)를 배지 조성을 최적화하여 발현시킴으로 생산성이 4 배로 향상되는 것이 보고되었다 (남 승헌,한국식품과학회지, Bacillus licheniformis아밀라아제의 생산성 향상을 위한 재조합 대장균의 배지 최적화, 26 : 411-416 (1994)).
IFN-α 는 바이러스나 바이러스 RNA 에 감염된 세포에서 분비되는 항바이러스 활성을 가지는 단백질로서, 1980 년대 초반에 처음으로 IFN-α 유전자가 분리된 이래 많은 연구가 이루어졌다. IFN-α 의 항바이러스 활성은 바이러스성 질환을 치료하는데 유용하게 이용될 수 있으므로 IFN-α 를 유전공학적으로 대량 생산하기 위하여 IFN-α 을 미생물에서 생산하는 방법이 많이 개발되었다.
효모는 진핵세포로부터 유래한 외래 단백질을 발현시키는데 유용한 균주로서, 효모 발효시 외래 단백질이 효모 세포외로 분비되면 세포내에서 발현될 때보다 단백질의 정제가 간편하며 발효 단계에서 단백질의 천연구조가 갖추어져 단백질의 생리활성을 높이기 위한 별도의 공정이 별도로 필요하지 않은 장점이 있다 (Masakazu Kiduchi and Morio Ikehara,TIBTECH,Conformational features of signal sequences and folding of secretory proteins in yeasts, 208-211 (1991. 6)).
구체적으로 본 발명자들은 효모에서 IFN-α 를 생산하기 위하여, ADH2/GAP 프로모터와 효모의 α-인자 선도 서열(α-factor leader sequence) 및 IFN-α 의 유전자를 포함하여 효모에서 IFN-α를 생산할 수 있는 재조합 플라스미드를 제조하고 이를 효모 균주에 형질전환시켜 재조합 효모Saccharomyces cerevisiaeDCO4 균주 (한국 특허출원 제 92-16766 호, 수탁번호 : KCTC 0051 BP)를 얻고 이로부터 IFN-α 를 생산한 바 있다.
상기 재조합 플라스미드에서 사용한 발현 프로모터인 ADH2/GAP 프로모터는 배지 중에 포도당이 존재하면 발현이 억제되고 포도당이 고갈되면 발현이 시작되는 특성을 가지며 이로부터 발현된 외래 단백질은 효모의 α-인자 선도 서열에 의해 효모가 발아하여 분열할 때 분비되는 특징이 있다. 발효 배지 중에 원하는 재조합 단백질을 고농도로 축적하기 위해서 상기 ADH2/GAP 프로모터에 의한 발현과 효모의 α-인자 선도 서열에 의한 분비가 계속되도록 유지되는 것이 바람직하므로 발효 배지에 포도당이 고갈되어 발현이 시작되는 시점부터 효모의 비성장속도가 적정수준 (0.08 - 0.12 hr-)으로 유지되도록 발효 공정이 시작되는 때부터 일정하게 공급되던 포도당의 첨가 속도를 지수적으로 조절하여야 한다. 이 경우 포도당을 효모가 완전히 이용하여 배지내에 포도당이나 에탄올이 축적되지 않아야 한다 (한국 특허출원 제 94-22289 호 참조).
그러나 상기의 IFN-α 를 생산하는 효모를 일반적인 방법으로 발현시키는 경우 생성된 IFN-α 의 약 50 % 정도만이 폴딩 (folding)되는데, 나머지 폴딩되지 않은 IFN-α 는 기존의 정제 공정으로 분리가 용이하지 않고 분리되더라도 그 수율이 급격히 감소되는 문제점이 있었다. 단백질의 폴딩 정도는 발현된 단백질의 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 폴딩되지 않고 장시간 발효기 내에 노출되면 단백질이 분해나 변성될 가능성이 크며, 특히 정제를 시작하기 위해 발효액을 농축하는 과정에서 단백질끼리 엉기어 생리 활성이 떨어지게 된다. 일반적으로 분리·정제시 단백질을 폴딩시키기 위하여 금속 이온을 이용한 산화 공정 (Journal of Biological Chemistry,258 (19), 11834-11830)을 이용하기도 한다.
상기와 같은 사실을 이용하여 IFN-α 유전자가 형질전환된 효모 균주를 금속 이온이 첨가된 발효 배지에서 유가식으로 증식시켜 IFN-α 를 생산하는 경우, 분비된 IFN-α의 폴딩이 촉진되어 그 수율이 현저히 향상되었다 (한국 특허출원 제 96-26844 호). 또한 상기의 제조 방법에서 구리 이온만 합성 배지에 첨가해 주어도 IFN-α의 폴딩이 촉진되어 그 수율이 향상됨을 확인하였다 (한국 특허출원 97-9188 호 참조). 그러나 상기의 발명에서 IFN-α 은 유가식으로 대량 생산되는데, 유가식 배양은 회분식 배양에 비하여 높은 효모 세포 농도를 얻을 수 있지만 분비되는 IFN-α 의 양이 높은 세포 농도에 비해 상대적으로 많지 않고 공정이 복잡하며 원료비가 많이 든다는 문제점이 있었다.
한편, 녹말을 발효시키는 효모 균주 (starch-fermenting yeast)인스와니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius)에서 분비 단백질인 아밀라아제 (amylase)를 생산하는 경우, 효모 발효 배지의 최적 pH 보다 높은 pH 에서 효소를 분비시키면 효모의 페리플라즘 (periplasm)에 머무르는 시간이 짧아져서 단백질의 분비가 촉진되는 현상이 일어난다고 보고되었다 (G. B. Calleja et al.,Critical Reviews in Biotechnology,volume 5, issue 3, 177-184 (1987)).
이에 본 발명자들은 재조합 효모Saccharomyces cerevisiae에서 IFN-α 를 고수율로 대량 생산하기 위하여, 재조합 효모 균주를 발효 공정 전 기간 동안 효모 성장에 최적인 pH 보다 높게 유지시키거나, 효모를 성장 최적 pH 에서 발효시킨 다음 단백질 분비 단계에서 발효 배지의 pH 를 높게 유지시키는 과정으로 IFN-α 의 생산량을 증대시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 재조합 효모 균주에서 발효 배지의 pH 를 조절하여 IFN-α 의 생산량을 크게 증대시키는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1은 본 발명의 방법으로 발효 배지의 pH 를 조절하면서 재조합 효모 균주를 회분식으로 배양하는 경우 pH 에 따라 변화되는 인간 알파-인터페론의 생산량을 비환원성 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인한 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IFN-α 를 생산하는 재조합 효모를 발효 배지의 pH 를 발효 공정 전 기간 동안 효모 성장에 최적인 pH 보다 높게 유지시킴으로 IFN-α를 고수율로 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 효모의 성장 최적 pH 에서 재조합 효모를 발효시킨 다음 IFN-α 분비 단계부터 발효 배지의 pH 를 높게 유지시킴으로 IFN-α를 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 재조합 효모 균주로부터 IFN-α를 생산하는 발효에 있어서, 발효 배지의 pH 를 조절하여 IFN-α 의 생산량을 증대시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 효모에서 IFN-α 를 고수율로 대량 생산하기 위하여, ADH2/GAP 프로모터, 효모의 α-인자 선도 서열, IFN-α 유전자를 포함하여 효모에서 IFN-α 를 생산할 수 있는 재조합 플라스미드를 효모 균주에 형질전환시켜 얻은 재조합 효모사카로마이세스 세레비시애DC04 (Saccharomyces cerevisiaeDC04) 균주를 사용한다 (한국 특허출원 제 92-16766 호; 수탁번호 : KCTC 0051 BP).
구체적으로 본 발명은 IFN-α 를 생산하는 재조합 효모 균주를 발효 배지의 pH 를 발효 공정 내내 효모 성장에 최적 pH 인 5.0 보다 높게 유지시킴으로 INF-α 의 생산량을 증대시키는데, 이 때 발효 배지의 pH 는 6.0 내지 7.5 범위로 유지시키는 것이 바람직하다 (도 1및 표 1 참조).
또한, 본 발명은 IFN-α를 생산하는 상기 재조합 효모 균주를 세포 성장 단계에서는 발효 배지의 pH 를 성장 최적 pH 로 유지시키고, IFN-α 분비 단계에서는 pH 를 높게 유지시키는 2단계 방법을 제공한다. 상기와 같이 2단계로 pH 를 조절하는데 있어서, pH 를 바꾸어주는 시점은 포도당이 고갈되어 IFN-α 의 발현이 시작되는 시기인 것이 가장 바람직하다. 이 때, 효모를 성장 최적 pH 인 5.0 에서 발효시킨 다음 IFN-α 분비 단계에서는 발효 배지의 pH 를 6.0 내지 7.5 범위로 유지시키는 것이 바람직하다 (표 4 참조).
본 발명의 방법은 IFN-α 를 생산하는 재조합 효모 균주를 회분식으로 또는 유가식으로 배양하는 모든 경우에 이용할 수 있다.
상기 본 발명의 방법으로 IFN-α를 발현시킨 결과, SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 및 세포변병법 등으로 IFN-α 의 농도 및 역가를 측정하여 구체적으로 발효 배지의 pH 가 높아짐에 따라 IFN-α 의 생산량이 크게 증대됨을 확인하였다 (도 1, 표 1 및 표 4 참조).
재조합 효모를 회분식으로 pH 6.0-7.5 범위에서 발효시킨 경우, 효모의 성장 최적 pH 인 5.0 에서 발효시킨 경우 보다 세포 성장은 약간 감소하지만 배지로 분비되는 IFN-α 의 생산량은 최소 2 배에서 최대 10 배 이상 증대된다. 또한, 재조합 효모를 높은 pH 에서 단순히 회분식으로 발효시키는 경우가 복잡한 유가식으로 pH 5.0 에서 발효시킨 경우 보다 최대 4 배 이상 증대되며, 2 단계 유가식으로 pH를 변화시켜 발효시키는 경우는 pH 를 5.0 으로 유지하여 발효시키는 유가식에 비해 최대 4 배 이상 IFN-α 의 생산량이 증대된다.
이하 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
(비교예 1) 발효 배지의 pH 를 5.0 으로 조절한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (수탁번호 : KCTC 0051 BP) 0.4 ml 을 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 10 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30 ℃ 로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효시켰다. 이 때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 5.0 로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.
도 1은 비환원성 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 IFN-α 의 양을 확인한 결과로서, 모든 시료는 종배양액을 발효기에 접종하여 31 시간이 경과한 다음 채취되었다.도 1의 윗부분이 폴리아크릴아마이드 젤에서 SDS 를 첨가한 IFN-α 가 로딩 (loading)된 홈이 있는 쪽인데, 이 때 환원된 IFN-α (Red)이 산화된 IFN-α (Ox) 보다 이동 속도가 느린 것으로 나타난다. 그러나 환원된 형태의 IFN-α도 산화된 형태와 비슷한 활성을 나타내므로 산화된 형태와 환원된 형태의 합한 양이 결국 생산된 총 IFN-α 의 양이 된다. 여기에서 M 열은 표준 단백질의 분자량 표지이고, 제 2 열은 발효 배지의 pH 가 5.0 인 경우 생산된 IFN-α 의 양이다. 표 1 은 IFN-α 의 역가를 세포변병법으로 분석하여 나타낸 것으로 발효 배지의 pH 가 5.0 인 경우 IFN-α 의 역가는 1.8×107IU/ml이다.
(실시예 1) 발효 배지의 pH 를 4.5 으로 조절한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (수탁번호 : KCTC 0051 BP) 0.4 ml 을 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 10 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30℃ 로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효시켰다. 이 때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 4.5 으로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.도 1의 제 1 열은 발효 배지의 pH 가 4.5 인 경우 생산된 IFN-α 의 양이다. 표 1 에서 보는 바와 같이 발효 배지의 pH 가 4.5 인 경우 IFN-α 의 역가는 4.8×106IU/ml이다.도 1및 표 1 에서 알 수 있듯이 비교예 1 의 pH 가 5.0 인 경우 보다 pH 를 효모 성장에 최적인 pH 보다 낮은 pH 4.5로 유지시켰을 때 IFN-α 의 생산량이 더 낮게 나타났다.
(실시예 2) 발효 배지의 pH 를 6.0 으로 조절한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (수탁번호 : KCTC 0051 BP) 0.4 ml을 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 10 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30 ℃로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효시켰다. 이 때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 6.0 로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.도 1의 제 3 열은 실시예 2 의 발효 배지의 pH 가 6.0 인 경우 생산된 IFN-α 의 양이다. 표 1 에서 보는 바와 같이 발효 배지의 pH 가 6.0 인 경우 IFN-α 의 역가는 3.6×107IU/ml이다.도 1및 표 1 에서 알 수 있듯이 비교예 1 의 pH 가 5.0 인 경우 보다 pH 를 효모 세포 성장에 최적인 pH 보다 높게 6.0 으로 유지시켰을 때 IFN-α 의 생산량이 2 배 더 높게 나타났다.
(실시예 3) 발효 배지의 pH 를 6.5 으로 조절한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (수탁번호 : KCTC 0051 BP) 0.4 ml을 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 10 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30 ℃로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효시켰다. 이때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 6.5 로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.도 1의 제 4 열은 실시예 3 의 발효 배지의 pH 가 6.5 인 경우 생산된 IFN-α 의 양이다. 표 1 에서 보는 바와 같이 발효 배지의 pH 가 6.5 인 경우 IFN-α 의 역가는 7.2×107IU/ml이다.도 1및 표 1 에서 알 수 있듯이 비교예 1 의 pH 가 5.0 인 경우 보다 pH 를 효모 성장에 최적인 pH 보다 높게 pH 6.5 로 유지시켰을 때 IFN-α 의 생산량이 4 배 더 높게 나타났다.
(실시예 4) 발효 배지의 pH 를 7.0 으로 조절한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (수탁번호 : KCTC 0051 BP) 0.4 ml을 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 10 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30 ℃ 로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효시켰다. 이때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 7.0 로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.도 1의 제 5 열은 실시예 4 의 발효 배지의 pH 가 7.0 인 경우 생산된 IFN-α 의 양이다. 표 1 에서 보는 바와 같이 발효 배지의 pH 가 7.0 인 경우 IFN-α 의 역가는 7.8×107IU/ml이다.도 1및 표 1 에서 알 수 있듯이 비교예 1 의 pH 가 5.0 인 경우 보다 pH 를 효모 성장에 최적인 pH 보다 높게 pH 7.0 로 유지시켰을 때 IFN-α 의 생산량이 4.3 배 더 높게 나타났다.
(실시예 5) 발효 배지의 pH 를 7.5 으로 조절한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (수탁번호 : KCTC 0051 BP) 0.4 ml을 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 10 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30 ℃로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효시켰다. 이때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 7.5 로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.도 1의 제 6 열은 실시예 5 의 발효 배지의 pH 가 7.5 인 경우 생산된 IFN-α 의 양이다. 표 1 에서 보는 바와 같이 발효 배지의 pH 가 5.0 인 경우 IFN-α 의 역가는 3.7×107IU/ml이다.도 1및 표 1 에서 알 수 있듯이 비교예 1 의 pH 가 5.0 인 경우 보다 pH 를 효모 성장에 최적인 pH 보다 높게 pH 7.5 로 유지시켰을 때 IFN-α 의 생산량이 2 배 더 높게 나타났다.
상기 실시예에서 보듯이 pH 4.5 일 때 가장 낮은 양의 IFN-α 을 나타내고, pH 가 높아짐에 따라 IFN-α 의 양이 증가됨을 보여준다. 그 결과, 효모에 가장 최적인 pH 로 알려진 5.0 보다 높은 pH 6.0 내지 7.5 로 pH 가 조절이 될 경우 생산되는 IFN-α 의 양이 크게 증대됨을 알 수 있다.
(실시예 6) 세포변병법에 의한 IFN-α 의 역가 확인
본 발명은 세포에 대한 항바이러스 활성을 시험하는 생물학적 분석법인 세포변병법으로 IFN-α의 역가를 좀 더 민감하게 확인하였다. 구체적으로 수송아지 신장세포인 MDBK (ATCC CCL 32)에 감염시킨 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular Stomatitis Virus; ATCC VR 158)에 대한 항바이러스 활성을 측정하여 상기 IFN-α 의 활성을 확인하는데, 본 발명에서 사용한 세포변병법의 결과는 오차가 최대 50 % 이하이다.
종배양을 본배양에 접종한 후 31시간 동안 발효시킨 다음 채집된 견본의 IFN-α 역가를 세포변병법으로 확인하여 표 1 에 정리하였다. 표 1 에서 보는 바와 같이 발효 배지의 pH 가 7.0 인 경우 가장 높은 IFN-α 의 역가를 나타내는데, 이는 발효 배지의 pH 가 효모 성장에 최적인 5.0 인 경우보다 IFN-α 의 역가가 4.3 배 이상 높은 것이다.
비교예 1 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
배지 pH 5.0 4.5 6.0 6.5 7.0 7.5
역가(IU/ml) 1.8×107 4.8×106 3.6×107 7.2×107 7.8×107 3.7×107
(실시예 7) 발효 배지의 pH 를 7.0 으로 조절하고 포도당의 농도를 변화시킨 배지를 사용한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (KCTC 0051 BP) 0.4 ml 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 포도당 농도가 1 내지 5% 인 YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 10-50 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30 ℃ 로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효하였다. 이 때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 7.0 로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.
그 결과, 발효 배지 중의 포도당의 농도가 2% 일 때 IFN-α 의 생산량이 1.3×108IU/ml 로 가장 높음을 확인할 수 있었다.
(실시예 8) 발효 배지의 pH 를 2 단계로 조절한 회분식 발효
형질전환되어 IFN-α 을 분비, 생산하는사카로마이세스 세레비지애DC04 균주 (KCTC 0051 BP) 0.4 ml 을 150 ml YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 80 g/L)에 접종하여 진탕교반기에서 30℃ 로 교반속도 200 rpm 에서 16 시간 동안 발효한 다음, 상기 종배양액을 포도당 농도가 2% 인 YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, 효모 펩톤 20 g/L, 포도당 20 g/L) 에 5% (v/v) 의 비율로 접종하여 발효기에서 30℃로 교반속도 500 rpm 에서 통기 속도는 1vvm 으로 72 시간 동안 발효하였다. 이 때 pH 는 본 배양 접종시부터 암모니아수를 사용하여 5.0 으로 유지시킨 다음 포도당 고갈 직후에 pH 를 7.0 로 조절하였는데, pH 의 오차는 ±0.1 이었다.
가장 높은 생산량을 가진 pH 7.0 으로 발효한 실시예 7 과 2 단계로 발효한 실시예 8 의 결과를 세포변병법으로 비교하면 실시예 8 의 경우가 실시예 7 의 경우보다 40% 높은 IFN-α 역가를 나타냄을 알 수 있었다.
(비교예 2) 발효 배지의 pH 를 5.0 으로 조절한 유가식 발효
비교예 1 과 동일한 과정으로 종배양한 후, 종배양액 16.6 ml 를 이용하여 8% YEPD 배지에서 2차 종배양 (발효부피 0.7 L)하고 발효시작 배지 8.3 L 에 접종한 후 표 2 및 표 3 의 조성을 갖는 첨가 배지 2.7 L 를 일정 속도 (1L/hr) 로 첨가하며 발효 (15 L 발효기, 키맵사, 스위스)를 시작하였다. 배지내 에탄올이 고갈되는 시점부터 첨가 속도를 지수적으로 증가시키기 시작하였다. 배지내 용존 산소 (pO2)는 교반 속도, 통기량, 발효기내의 압력조절을 통해 10 % 이상으로 유지시켰고 발효 공정 내내 pH 를 5.0 으로 유지시켰다. 표 4 는 IFN-α 의 역가를 나타낸 것으로, 본 비교예의 경우 IFN-α 의 역가는 3.2 ×107IU/ml 으로 나타났다.
배지의 조성
성분 발효 초기 첨가량 (/L) 공급량 (/L)
CaCl2 0.18 g -
시트르산 나트륨 4.0 g -
KH2PO4 4.0 g -
(NH4)2SO4 4.0 g -
소포제 0.20 ml -
d-비오틴 2.0 mg -
미오-이노시톨 0.06 g -
나이아신 0.04 g -
Ca-펜토테네이트 0.04 g -
피리독신-HCl 0.02 g -
티아민-HCl 8.0 mg -
KI 4.0 mg -
포도당 - 375 g
금속용액 - 9.4 ml
MgCl2·6H2O - 11.3 g
아데닌 - 3.8 g
효모 추출액 - 75 g
금속 용액의 조성
성분 함량
FeSO4·7H2O 16.2 g
ZnSO4·7H2O 16.2 g
MnSO4·2H2O 13.5 g
CuSO4·5H2O 0.54 g
NaMoO4·2H2O 1.35 g
CoCl2·H2O 1.50 g
H3BO3 4.05 g
H2SO4 20.0 ml
(실시예 9) 발효 배지의 pH 를 5.0과 6.0 의 2 단계로 조절한 유가식 발효
비교예 1 과 동일한 과정으로 종배양한 후, 종배양액 16.6 ml를 이용하여 8% YEPD 배지에서 2차 종배양 (발효부피 0.7 L)하고 발효시작 배지 8.3 L 에 접종한 후 표 2 및 표 3 의 조성을 갖는 첨가 배지 2.7 L 를 일정 속도(1L/hr)로 첨가하며 발효 (15 L 발효기, 키맵사, 스위스)를 시작하였다. 발효 배지의 pH 는 효모 세포 성장에 최적인 5.0 으로 유지시킨 다음 배지내 에탄올이 고갈되는 시점부터 pH 를 6.0 으로 높게 유지시키면서 첨가 속도를 지수적으로 증가시키기 시작하였다. 배지내 용존 산소 (pO2)는 교반 속도, 통기량, 발효기내의 압력 조절을 통해 10 % 이상으로 유지시켰다. 표 4 는 IFN-α 의 역가를 나타낸 것으로, 비교예 2 의 발효 배지의 pH 를 5.0 으로 유지시키는 경우 보다 본 실시예의 경우와 같이 pH 를 2 단계로 조절하는 방법이 IFN-α 의 생산성이 4배 더 높았다.
(실시예 10) 발효 배지의 pH 를 5.0 과 7.0 으로 조절한 유가식 발효
비교예 1 와 동일한 과정으로 종배양한 후, 종배양액 16.6 ml를 이용하여 8% YEPD 배지에서 2차 종배양 (발효부피 0.7 L)하고 발효시작 배지 8.3 L 에 접종한 후 첨가 배지 2.7 L 를 일정 속도(1L/hr) 로 첨가하며 발효 (15 L 발효기, 키맵사, 스위스)를 시작하였다. 발효 배지의 pH 는 효모 세포 성장에 최적인 5.0 으로 유지시켰다. 배지내 에탄올이 고갈되는 시점부터 pH 를 7.0 으로 높게 유지시키면서 첨가 속도를 지수적으로 증가시키기 시작하였다. 배지내 용존 산소 (pO2)는 교반 속도, 통기량, 발효기내의 압력 조절을 통해 10 % 이상으로 유지시켰다.
표 4 에서 보는 바와 같이 비교예 2 의 발효 배지의 pH 를 5.0 으로 유지시키는 경우 보다 본 실시예와 같이 pH 를 2 단계로 조절하는 방법이 IFN-α 의 생산성이 2.2 배 더 높았다.
비교예 2 실시예 8 실시예 9
배지 pH 5.0 5.0→6.0 5.0→7.0
역가 (IU/ml) 3.2×107 1.3×108 7.0×107
이상에서 살펴본 바와 같이, 재조합 효모를 회분식으로 pH 6.0-7.5 범위에서 발효시킨 경우 pH 5.0 에서 발효시킨 경우 보다 IFN-α 생산량이 최대 4.3 배 증가하였으며 포도당 농도를 2% 로 하고 높은 pH 에서 발효한 경우는 7.2 배 증가하였고 발효 pH 를 2 단계로 조절한 경우는 10 배 까지 증가하였다. 또한, 단순히 회분식으로 pH 를 높게 유지시켜 배양한 경우가 pH 를 5.0 으로 유지시킨 복잡한 유가식 배양인 경우보다 최대 4 배 이상 생산량이 증대된다. 효모를 최적 pH 에서 성장시킨 다음 단백질 분비 단계부터 pH 를 높게 유지시키는 2단계 유가식 배양 방법은 기존 유가식 배양 방법보다 최대 4 배 이상 생산량이 증대된다.
따라서, 본 발명의 방법은 재조합 효모 균주를 효모 성장에 최적 pH 인 5.0 보다 높은 pH 에서 발효시킴으로 pH 5.0 에서 계속 발효시킨 경우보다 최소 2 배에서 최대 10 배의 고수율로 IFN-α를 생산하므로 IFN-α 를 고수율로 대량 생산하는데 매우 유용하다.

Claims (8)

  1. 재조합 효모 균주로부터 인간 IFN-α 를 생산하는 발효 공정 중, 발효 배지의 pH를 조절하여 IFN-α 의 생산량을 증대시키는 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 재조합 효모 균주는사카로마이세스 세레비시애DCO4 (수탁번호 : KCTC 0051 BP)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 발효 배지의 pH 를 발효 공정 전 기간 동안 효모 성장에 최적인 pH 5.0 보다 높게 유지시키는 제조 방법.
  4. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 발효 배지의 pH 를 6.0-7.5 범위로 유지하는 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 재조합 효모 균주를 성장 최적 pH 에서 발효시키는 단계, IFN-α 분비 단계에서 발효 배지의 pH 를 높게 유지시키는 단계로 구성되는 2 단계 발효 제조 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 발효 단계에서는 배지의 pH 를 5.0 으로 유지하고 IFN-α분비 단계에서는 pH 를 6.0-7.5 범위로 유지하는 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 재조합 효모 균주를 회분식으로 발효시키는 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 재조합 효모 균주를 유가식으로 발효시키는 제조 방법.
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