KR19980703205A - 세포 배양방법 - Google Patents

Abstract

시험관에서 이종 세포군으로부터 기선택된 아-세포군을 선택적으로 배양하는 방법으로 그 방법은; (a) 기선택된 아-집단에서 차별적 발현/활성을 나타내는 선택성 마커(예를 들면, 양성 및/ 또는 음성 선택성 마커)를 이종 세포군에 도입; 그리고 (b) 선택성 마커의 차별적 발현/활성을 기초로하여 기선택 아-집단을 선택적으로 배양하는 단계를 포함한다.

Description

세포 배양방법

본 발명은 세포 배양 방법, 특히 실험관에서 본질적 동종 세포군(예를 들어, 신경 세포)을 생산하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 도입된 선택성 마커(marker)(예를들면, 양성 및/또는 음성 선택성 마커)를 갖는 신경 세포에 관한 것이다.

중추 신경계는 현재 집중적 연구 대상이나, 세포 수준에 있어서 그것의 거대한 복잡성으로 인해 그것의 기능에 대한 완전한 이해가 어려웠다. 생체외에서 신경 세포의 특이적 아-집단(sub-population)을 표지하는 선택적 방법(원위치에 교잡 조직화학등의 면역얼룩을 만드는 것과 같은)이 점점 더 발전되어온 반면에, 그러한 아-집단을 생체 세로포 분리 및 정제하는 것은 매우 어려웠다.

이러한 문제를 해결하기 위한 다양한 시도가 있었다. 예를 들면, 차등적 원심 분리법과 같은 기술이 특이적 신경 세포 현상형(phenotypes)들을 증가시키기 위하여 사용되어 왔다. 다른 방법들은 세포의 아-집단을 표지하기 위하여 형광 세포 타입-특이적 기질의 사용을 기초로 하거나 주어진 한 세트의 뉴런의 특이적 말단 부위로 삽입된 형광 추적 염료의 사용을 기초로하여 하였다.(Schaffner et al. (1987) J. Neuroscience 7 : 3088). 각각의 경우에 있어서, 비표지된 세포로부터 표지된 것을 분리하는 것은 형광-활성 세포 분류(fluorescence-activiated cell sorting, FACS)에 의한다.

다른 방법은 주어진 세포 타입에 대해 특이적인 세포외 막-결합 마커(extracellular membrane-bound markers)를 확인하는 것에 기초한다(Urakami Chiu (1990) J. Neuroscience 10 : 620). 여기서, 이러한 예에서 분리법은 혼합된 세포 군을 점착성 항체층 상에 가려내어 세포-항체 복합체를 생산하는 것으로 이루어지며, 그것으로부터 목적하는 세포가 추후의 연구를 위해 뒤에 분리될 수 있다.

다른 잘 알려진 방법에 의하면, 특이적 세포군을 제공하는 프로제니터(projenitor) 세포는 종양 유전자 형질도입 또는 자생적 세포 부산물의 부차-배양에 의해 영속적이 된다.

앞의 영속화 기술을 제외하고는, 대부분의 이러한 방법들은 폭넓게 응용되지는 않는다. 이것은 부분적으로 중추 신경계내 현상형의 거대한 이종성에 기인하므로 사용된 분리기술과 마커는 불필요한 세포 형들과의 교차-반응을 피하기 위하여 극도로 특이적이어야 한다.

두번째로, 동종성을 억기위하여 요구되는 정제의 정도는 종종 100배 이상이다. 그러한 엔리치먼트(enrichment)는 FACS 또는 패닝(panning)에 의한 정제도 보다 너무나 크기때문에, 결과물은 오염의 정도에 지나지 않는다.

세번째로, 충분히 풍부하지만, 정확하게 특이적이며, 또한 더 좋게 특징지어진 신경 세포군들(예를 들면, 도파민작용성 세포, 또는 글루타민작용성 세포)에 공통적인 세포외 마커는 그 이용이 제한된다.

그러므로, 대부분의 이러한 잘 알려진 증식기술은 그 공정중에 그 세포들이 파괴되는 것을 막기위하여 상대적으로 미성숙한 신경 세포를 요구한다.

마지막으로, 적당량의 신선한 인간 뇌조직을 얻기 어렵기 때문에, 이러한 연구들은 인간의 신경 세포에 대해서는 훨씬 제한적이다.

본 발명은 시험관에서 이종 집단으로부터 기선택된 세포의 아-집단을 선택적으로 배양하는 방법을 제공하며, 이 방법은 : (a) 기선택된 아-집단내에서 차등적 발현/활성을 나타내는 선택성 마커(예를 들면, 양성 및/또는 음성 선택성 마커)를 이종 세포 집단에 도입하는 단계; 및 (b) 선택성 마커의 기선택된 아-집단내에서의 차등적 발현/활성을 기초로하여 기선택된 아-집단을 선택적으로 배양하는 단계를 포함한다.

세포의 기선택된 아-집단은 특정 세포 타입 또는 세포 류의 본질적으로 동종인 세포 집단일 수 있다. 예를 들면, 기선택된 아-집단은 신경 세포의 특정 류일 수 있다. 신경 세포의 경우에 있어서, 기선택된 집단은 전달자의 특징들, 예를 들면, 도파민-또는 아세틸콜린을 포함하는 뉴런이 본 발명의 방법에 따라 선택적으로 배양될 수 있다는 것을 기초로하여 선택될 수 있다.

선택성 마커는 이종 세포 집단을 이루는 모든 세포로 도입될 필요가 없다: 대부분의 목적을 위해서는, 세포의 상당 비가 선택성 마커를 갖는다면 충분하다.

그러나, 선택성 마커가 대부분(예를 들면 본질적으로 모든 부분)의 이종 세포 집단으로 도입되는 것이 바람직하다.

여기서 설명된 것처럼, 본 발명의 방법은 본질적으로 정상 신경 세포의 특정류의 선택적 배양에 특별히 이용된다. 그러나 본 발명의 방법은 일반적인 이용이고 다른 아-세포군을 선택적으로 배양하기 위하여 사용될 수 있다.

포유류 신경세포는 이형의 유전 물질을 사용하여 형질도입될 수 있다. 진핵 및 다른 세포들의 형질도입에는 많은 방법들이 존재하나, 신경 세포의 특성상 자연적 방법의 트랜스펙션(transfection)이 현재 가장 유용하다(Miller (1992) Nature 357 : 455). 그러므로, 예를 들면, 비루스로 포장된 유전물질을 사용한 트랜스펙션은 예를 들어, 인산 칼슘 침전, 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로프로젝틸 밤바러드먼트(microprojectile bombardment) 또는 마이크로인젝숀(microinjection)을 수행하는 것보다 좀더 효율적일뿐 아니라, 실제 공정동안 신경세포 사망율을 더 낮춘다. 생체내(Culver et al. (1992) Science 256 : 1550) 및 시험관내(Stringer Foster (1994) Brain Res 79 : 267)에서의 중추신경계로부터 포유류 신경세포로의 트랜스펙션이 모두 기술되어 있다.

생체 세포로 도입될 수 있는 유전물질은 양성 및 음성 선택성 마커를 모두 포함할 수 있다. 양성 선택성 마커는 선택적 현상형을 발현하지 않는 세포들을 죽이는 조건하에서 형질도입된 세포들이 생존하도록 하는 것이다. 음성 선택성 마커는 그것을 발현하는 세포들에게 민감성을 부여하여 다른 세포에 대해 상대적으로 무해한 조건하에서 그들을 파괴한다.

폭넓게 다양한 선택성 마커가 이용될 수 있다. 양성 선택성 마커들로 폭넓게 이용될 수 있는 유전자들은 박테리아 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo ; Colbere-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150 : 1), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hph ; Santerre et al. (1984) Gene 30 : 147) 및 크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(gpt ; Mulligan Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2027)을 포함한다.

헤르페스 심플렉스 비루스 타입 1 티미딘 키나아제(herpes simplex virus type thymidine kinase ; HSV-1 TK; Wigler et al. (1977) Cell 11 : 223), 아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(APRT ; Wigler et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76 : 1373) 및 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT ; Jolly et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80 : 477)가 또한 양성 선택성 마커로 사용된다. 이러한 후자의 마커들은 특정 돌연변이 유전자형(즉, 선택성을 갖게하는 유전자 생성물이 결핍하도록 하는 유전자형)을 갖는 세포내에서 사용되야 한다.

바람직한 음성 선택성 마커들은 조작된 세포 사망(apoptosis)과 관계된 생성물을 암호화하는 유전자, 예를 들어 p53을 위한 유전자를 포함한다. 그러한 음성 선택성 마커들은 문제의 유전자 발현을 유도함으로써 활성화될 수 있다(예를 들어 아래에 기술한 것처럼, 테트라사이클린-민감성 프로모터의 사용). 아포토시스에 관계된 생성물을 암호화하는 유전자를 사용하는 것은 유전자의 일시적인 발현(대부분의 경우 30분 이내)으로 세포를 죽게하기에 충분하므로, 확실하고 매우 엄격한 음성 선택성을 주는 이점이 있다.

상기 언급된 몇 유전자들은 또한 양성 선택적 현상형일뿐 아니라 음성적이기도 하다. 그들은 HSV-1, APRT, HPRT 및 gpt 유전자들을 포함한다. 이러한 유전자들은 어떤 뉴클레오사이드 또는 퓨린 아날로그를 세포독성 중간체(cytotoxic intermediates)로 변환하는 것을 촉매화할 수 있는 효소를 암호화한다. 예를 들면, 뉴클레오사이드 아날로그 갠시클로버(ganciclovir, GCV)는 HSV-1 티미딘 키나아제에 대해서는 좋은 기질이나 포유류 세포내에서 발견되는 천연 티미딘 키나아제에 대해서는 나쁜 기질이다. 결과적으로, GCV는 HSV-1 TK 유전자를 발현하는 세포에 대한 효율적인 음성 선택으로 사용될 수 있다(St. Clair et al (1987) Antimicrob. Agents Chemotherap. 31 : 844).

크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제는 야생형 세포들내에 발현된 양성 및 음성 선택 모두에 사용될 수 있다(Besnard et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7 : 4139). 사이토신 디아미나제는 또한 무해한 5-플루오로사이토신을 세포독성 5-플루오로우라실로 변화시키는 음성 선택성 마커로 사용될 수 있다(Polak Scholer (1976) Chemotherapy (Basel) 21 : 113).

선택성 마커들은 통상적으로 원핵(prokaryotic) 및 진핵(eukaryotic) 유전공학 모두에 사용되어 거의 유전적 변화를 겪지 않는 세포의 혼합 진단으로부터 회수된다. 예를 들면, 그들은 선택성 마커와 함께 다른 유전자를 잡아내는 세포를 선택하기 위하여, 목적 생성물을 암호화하는 또 다른 유전자와 물리적인 관계로 사용될 수 있다. 한 예로서, 네오(neo) 유전자는 유전자 치료가 이루어진 후 환자 샘플로부터 얻어진 유전적으로 수정된 세포를 모니터하기 위하여 사용되어 왔다.

유전자 치료의 안전 장치로서 음성 선택성 마커의 사용이 또한 제안되었다(Lupton et al. (1991) Mol. Cell Biol. 11 : 3374). 많은 유전자 치료법은 환자로부터 체강세포를 제거하고, 치료적 유전자를 체강세포로 도입(그것의 발현은 생화학적 손상을 치료한다)하고, 계속해서 그 세포를 환자에게 재도입 하는 것에 관계된다. 재도입된 유전적으로 수정된 세포들이 궁극적으로 환자의 건강에 해로운 것으로 나타날 수 있기 때문에(예컨대, 만약 그들이 면역학적으로 부적합하거나 해로운 것으로 입증된다면), 음성 선택성 마커가 치료적 유전자와 함께 도입되어 (만약 필요하다면) 유전적으로 수정된 세포를 차후에 선택적으로 제거할 수 있게 한다.

양성 또는 음성 선택성 마커를 포함하는 다수의 벡터들은 과년 기술분야의 전문가에게 쉽게 이용가능하며 만들어질 수 있다(for review see Miller (1992) Nature 357 : 455). 다른것들은 표준 유전자 클로닝 기술을 사용하여 쉽게 만들어질 수 있다.

본 발명의 방법은, 피부 성장 인자 또는 섬유아세포 성장 인자와 같은 보충물을 배양 배지에 사용하여, 태아 신경 세포의 혼합된 집단내에서 복제를 미리 유도하거나 죽지 않는 종양유전자를 미리 트랜스팩션시킴으로서 그러한 복제를 일으키는 것을 포함한다. 선택적으로, 비-증식 세포 배양물이 사용될 수 있다.

바람직하게는 평판배양후 초기 단계에서, 그 세포들은 둘다 모두 발현 인자에 작동가능하게 연결된 양성 선택성 마커 및 음성 선택성 마커를 사용하여 형질도입된다. 그 발현 인자는 주어진 중축 신경계 영역, 주어진 신경 세포 타입, 또는 뉴런의 특이적 아-집단에 대해 특이적일 수 있다. 배양물이 필요한 수준으로 증식된 후, 그 세포들은 적어도 부분적으로 차별화될 수 있다. 활성 특이적 발현인자가 없는 그러한 형질전환된 세포들과 비-형질전환된 세포들이 제거되는 반면에, 활성인자(하류 선택성 마커의 발현을 유도함)를 갖는 형질전환된 세포들은 남겨지도록 적당한 약품이 그때에 이용될 수 있을 것이다.

일예로서, 본 발명에 사용되는 발현인자들은 (ⅰ) 도파민성, 세로토닌성, GABA성, 콜린성 또는 펩티드성 뉴런들, 또는 그것의 아-집단들; (ⅱ) 쉬안 세포(Schwann cell)들, 과돌기신경교세포(oligodendrocyte)들, 성상교세포(astroycyte)들, 미크로글리아 및 그것의 아-집단들; (ⅲ) 배형성의 특정 단계들 및 (ⅳ) 다른 특이적 비-신경 조직들내에서 특이적으로 활성인 프로모터 및/또는 엔헨서(enhancer)들로 부터 선택될 수 있다. 본 발명에 사용되기에 특히 바람직한 것은 예를들면, 푸르트(Furth)등에 의해 기술된[(1994) PNAS USA (Vol. 91, pp. 9302-9306)] 테트라사이클린-민감성 프로모터들이다. 그러한 프로모터들은 테트라사이클린-민감성 조절계내의 한 인자로 사용되어 생체내 유전자 발현의 시간적 및/또는 공간적 조절에 영향을 줄 수 있다.

선택적으로, 그들은 (ⅰ) 신경전달자-특이적 수용체들; (ⅱ) 이온 채널들; (ⅲ) 이온-채널 게이팅에 관계된 수용체들, (ⅳ) 사이토킨, 성장 인자들 및 호르몬들 및 (ⅴ) 파라크린(paracrine), 오토크린(autocrine) 또는 엔도크린(endocrine) 방식으로 특이적으로 생산되고 분비되는 어떤 물질을 위한 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및/또는 엔헨서로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 표 1과 같다.

본 발명은 인간과 다른 포유류 세포들(예를 들어, 신경 세포들)을 배양하고, 그들내에 포함된 유전 물질을 기초로 하여 세포의 아-집단을 선택하는 것에 의해 단일 세포 타입의 동종 배양 세포들을 생산하는 방법을 제공한다.

그러한 배양 세포들은 기초적 전기생리학적(electrophysiological), 신경화학적 및 발생학적(developmental) 실험을 포함하여 다양하게 사용될 수 있다. 게다가, 정체적 신경 세포 집잔들은 중추 신경계 퇴행성 질환의 증상을 완화하고, 다양한 형태의 치료, 예방 및 진단에 이용하기 위하여 이식 가능성 평가와 같은 좀더 임상적으로 응용된 연구에 사용될 것이다.

그러한 질환에는 : (ⅰ) 세포의 기선택된 아-집단 흑질(substantia nigra)이 도파민성 뉴런인 파킨슨 병(Parkinson's disease) 또는 파킨슨 증후군; (ⅱ) 세포의 기선택된 아-집단이 선조체(striatum)의 신경세포인 헌팅톤 병(Huntington's disease); (ⅲ) 세포의 기선택된 아-집단이 네오-및 팔레오코르텍스(paleocortex)와 관계되며, 아세틸콜린, 세로토닌, 및/또는 노르아드레날린(noradrenaline)를 포함하는 뉴런인 알츠하이머 병(Alzheimer's disease); 또는 (ⅳ) 세포의 기선택된 아-집단들이 뇌과돌기신경교세포인 다발성 경화증(multiple sclerosis) 이 있다.

[표 1]

[실시예 1] 인간 도파민성 뉴런의 동종 배양세포의 제조

헤르페스 심플렉스 비루스(HSV) 티미딘 키나아제 유전자(tk) 및 네오 유전자를 단지 도파민을 포함하는 뉴런, 예를 들어 티로신 하이드록시라제의 발현을 조절하는 세포내에서만 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결한다(해링톤등에 의해 기술된(1987) Nucl. Acids Res. 15 : 2363 참조). 그 유전자 구조물을 레트로비루스 벡터의 적당한 클로닝 부위에 클론하고, 암포트로핀(amphotropic) 레트로비루스 팩킹 세포 라인을 트랜스펙션하기 위해 사용한다(e.g. Ψ-crip (for review see Molecular Virology : A Practical Approach (Eds. AJ Davison RM Elliott) IRL Press, 1993).

태아(임신 약 5-8 주) 중뇌(ventral mesencephalon)로부터 조직을 절개하여 분리적으로 배양한다. 섬유아세포 성장인자(Mayer et al. (1993) Neuroscience 56 : 389), 피부 성장 인자(Reynolds Weiss (1992) Science 255 : 1707)를 이용하여, 또는 종양 유전자 형질전환(Stringer et al. (1994) Brain Res. 79 : 267)을 이용하여 도파민성 전구체 세포들의 복제를 유도한다. 플레이팅(plating)후 바로 배양된 세포들을 레트로비루스로 패키지된 선택성 마커로 형질전환하고 그 배양세포들을 증식한다. 충분한 수의 세포들이 생성되었을 때, 신경 분열을 중지시키는 조건하에서 세포들을 배양시킨다. 그 배양세포들을 지네티신(geneticin)으로 처리하여 티로신 하이드록시라제를 발현하지 않지만, 형질전환된, 티로신 하이드록시라제를 포함하는 누런인 형질전환된 세포뿐만 아니라 비-형질전환된 세포를 제거한다.

[실시예 2] 인간 과돌기신경교세포의 동종 배양세포의 제조

헤르페스 심플렉스 비루스(HSV) 티미딘 키나제 유전자(tk) 및 네오 유전자를 단지 과돌기신경교세포내에서만 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결하여 과돌기 신경교세포-특이적 효소 칼라토세레브로시다제(glactocerebrosidase)의 발현을 조절한다. 그 유전자 구조물을 실시예 1에서처럼 비루스적으로 패키지한다. 아데노비루스와 같은 비루스를 선택적으로 사용할 수 있다. 태아 또는 성인 뇌의 조직을 절개하고 분리된 배양액에서 성장시킨다. 만약 필요하다면, 세포 복제를 유도(예를 들어 HS2ts6 쥐의 세포를 사용함(Noble et al. (1991) WO91/13150))하고, 평판 배양후 바로, 그 세포들을 예를 들어, 칼락토세레브로시다제 프로모터에 연결된 양성 선택성 마커, 및 구조적으로 활성인 프로모터에 연결된 음성 선택성 마커를 코딩하는 유전자-사이토메갈로비루스(cytomegalovirus)와 같은 유전자를 가지고 형실 전환한다. 세포 선택은 실시예 1에서와 같이, 순수한 집단의 과돌기신경교세포를 제공한다.

[실시예 3] 칼리토닌 유전자 관련 펩타이드를 발현하는 본질적으로 정상인 인간의 배측근 신경절 세포(dorsal root ganglion cell)들의 동종 배양세포의 제조

배측근 신경절(DRG)의 뉴런은 태아, 신생아 또는 성인 조직을 원료물질로서 사용하여 생체내에서 성장시킬 수 있다. 혼합된 세포 집단은 예를 들면, 미리 제조된 네오마이신 저항성 비-신경 세포의 바탕층상에서 성장하여 영양 지지물을 제공할 것이다(Brenneman et al. (1987) J. Cell Biol. 104 : 1603). 그 DRG 세포들을 칼시토닌 유전자(CG게) 관련 펩타이드의 발현을 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 네오 유전자와 아데노비루스 기술을 사용하여 트랜스펙숀한다. 프로모터의 활성과 그것으로 인한 신 발현의 유도를 위해 3-4일 경과후, 네오 유전자를 활성적으로 발현하지 않는 DRG 세포들은 네오마이신의 사용으로 파괴될 것이다. 시험관에서 사용하기 위한, 인간 DRG로부터 차별화된 순수 집단이 CGRP-양성 뉴런이 그 결과로 나타날 것이다.

[실시예 4] 신경세포의 형질전화

태아(임신 8주), 인간 대뇌피질, 선조체, 시상하부(hypothalamus), 중뇌(mesencephalon), 봉선 복합체(raphe complex), 연수(medulla oblongata) 및 복부각(ventral horn)의 척수의 원시 세포를 겔라틴/폴리-L-리신 코팅된 플라스크위에 개별적으로 배양했다. 그 배지는 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민(2mM) 및 기본적 섬유아세포 성장 인자(5ng/ml)를 포함하는 변경된 저장용액(Bottenstein and Sato, PNAS 76(1979) 514-517; Romijn et al., J. Neurophysiol. 40(1981)1132-1150)을 포함하는 DMEM/Ham's F12(1 : 1) 혼합용액이었다.

한번 세포들이 부착되면, SV40T 프로모터에 연결된 지네티신(G418^r)에 저항성 마커를 결합시킨 유전자 구조물(tsA58)를 갖는 레트로비루스 입자들을 0.8㎍/ml 폴리브렌(polybrene)과 함께 그 배지에 첨가되었다. 1시간후 그 배양 배지를 신선한 배지로 대치하였다. 5일후, 지네티신을 그 배양 배지(0.4 mg/ml)에 추가하여 레트로비루스 벡터를 포함하지 않은 세포를 제거하기 위하여 10일동안 유지하였다.

15일에서 20일 후, 인간 신경 전구체 세포의 집단은 FGF-포함 배지에서 복제할 수 있고 또한 지네티신 저항성인 상기 기재된 모든 영역으로부터 발견할 수 있었다. 모든 것들은 신경 현상형을 나타내었다(그들은 예를 들면 뉴런 특이적 에놀라제 양성이었다).

그러므로, 레트로비루스적으로 포장된 유전자 구조물을 사용하여 다양한 영역의 중추 신경계로부터 인간 신경 세포를 안정하게 형질전환하는 것이 가능하다. 두번째로, 그 유전자 구조물은 지네티신 저항체와 같은 선택 마커를 포함할 수 있다.

Claims (23)

1. (a) 기선택된 아-집단내에서 차별적 발현/활성을 나타내는 선택성 마커(예를 들면, 양성 및/또는 음성 선택성 마커)를 이종 세포 집단에 도입하며; 그리고

   (b) 선택성 마커의 기선택된 아-집단내에서의 차별적 발현/활성을 기초로하여 기선택된 아-집단을 선택적으로 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내의 이종 세포군으로부터 세포의 기선택된 아-세포군을 선택적으로 배양하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 선택성 마커가 기선택된 아-집단내에서 차별적 발현/활성을 나타내지 않는 음성 선택성 마커(예를 들면, 구조적으로 발현된 음성 선택성 마커)를 포함하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 그 세포들인 신경세포, 예를 들면 뉴런인 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 이종 세포 집단이 원시 세포 배양, 예를 들면 인간(예를 들면, 태아)신경 원시 세포 배양, 예를 들면 신경 대(stem)/전구체 세포를 포함하는 것인 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 기선택된 아-집단을 (ⅰ) 양성 선택성 마커의 발현/활성, 또는 (ⅱ) 음성 선택성 마커의 발현/활성의 결핍을 기초로하여 선택적으로 배양하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계에서 선택성 마커가 예를 들면 재조합 양쪽성 포장 레트로비루스(recombinant amphotopically packaged retrovirus)를 사용하여 레트로비루스 형질전환에 의해 도입된 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, 선택성 마커가 (ⅰ) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 헤르페스 심플렉스 비루스 타입 1 티민 키나아제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제로부터 선택된 양성 선택성 마커, 및/또는 (ⅱ) 헤르페스 심플렉스 비루스 타입 1 티미딘 키나아제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 사이토신 디아미나제 및 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제로부터 선택된 음성 선택성 마커인 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 선택성 마커가 발현 인자 또는 인자들, 예를 들면 조절 발현 인자 또는 인자들, 예를 들면, 조직-또는 세포-특이적 발현인자 또는 인자들에 작동가능하게 연결된 방법.
9. 제 7 항에 있어서, 발현 인자가

   (A)(ⅰ) 도파민성, 세로토닌성, GABA성, 콜린성 또는 펩티드성 뉴런 및 그것의 아-집단들; (ⅱ) 쉬완 세포, 과돌기신경교세포, 성상교세포, 미크로글리아 및 그것의 아-집단들; (ⅲ) 태아 발생의 특정단계들; (ⅳ) 내분비선(endocrine glands), 폐, 근육, 생식선, 장, 골격 조직 또는 그것들의 부분 또는 부분들; (ⅴ) 상피세포, 섬유아세포, 지방, 유선 간엽(mast mesenchymal) 또는 실질(parenchymal) 세포, 및 (ⅵ) 혈액계의 성분(예를 들면 T-임파구, B-임파구 및 대식세포(macrophages))내에서 특이적으로 활성인 프로모터 및/또는 엔헨서; 또는

   (B) (ⅰ) 신경전달자-특이적 수용체들; (ⅱ) 이온 채널들; (ⅲ) 이온-채널 게이팅에 관계된 수용체들 및 (ⅳ) 사이토킨, 성장 인자 및 호르몬을 위한 유전자 전사를 지시하는 프로모터/ 엔헨서로부터 선택된 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 기선택된 아-집단이 선택적 작용제 또는 약품, 예를 들면 네오마이신 또는 지네티신을 사용하여 세포들을 배양하는 것에 의해 선택적으로 배양된 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 이종 세포 집단이 성장인자(예를 들면, 상피 성장 인자 또는 섬유아세포 성장 인자) 및/또는 영양 지지물을 제공하는 세포의 존재하에서 시험관내 세포 배양의 에비적 단계에 의해 제공되는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계에서 이종 집단을 선택성 마커의 도입전 또는 후에 차별화시키기 위하여 증식 및/또는 유도하는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에의 방법으로 제조된 세포의 아-집단.
14. 치료, 예방 또는 진단에 사용되는 제 13 항의 세포.
15. 치료, 예방 또는 진단에 사용되는 약품의 제조를 위한 제 13 항의 세포의 용도.
16. 치료법이 이식 치료법인 제 14 항의 세포 또는 제 15 항의 용도.
17. 이식 치료법이 (ⅰ) 세포의 기선택된 아-집단 흑질의 도파민성 뉴런인 파킨슨 병 및/또는 파킨슨 증후군; (ⅱ) 세포의 기선택된 아-집단이 선조체의 신경세포인 헌팅톤무도병(Huntington's chorea); (ⅲ) 세포의 기선택된 아-집단이 파라에오-(palaeo-) 및 네오(neo)피질과 관계된 아세틸콜린-, 세로토닌- 및/또는 노르아드레날린-포함하는 뉴런인 알츠하이머 병; (ⅳ) 세포의 기선택된 아-집단이 척수 운동성 뉴런인 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis); 또는 (ⅴ) 기선택된 아-집단이 뇌 과돌기신경교세포인 다발성 경화증의 치료를 위한 것인 제 16 항의 세포 또는 용도.
18. 도입된 하나 이상의 선택성 마커(예를 들면, 양성 및/또는 음성 선택성 마커)를 갖는 신경 세포(예를 들면, 인간 신경 세포).
19. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나이상의 선택성 마커가 조절되는 세포.
20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 적어도 하나 이상의 선택성 마커가 구조적으로 발현된 음성 선택성 마커인 세포.
21. 제 18 항 내지 제 20 항중 어느 한 항에 있어서, 선택성 마커가 트랜스펙션이나 감염(예를 들면 레트로비루스 벡터)를 사용하여)에 의해 도입되는 세포.
22. 제 18 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 치료(예를 들면 이식 치료법, 예를 들면 제 17 항에 정의된 것과 같은), 예방 또는 진단에 사용되기 위한 세포.
23. 제 13항 또는 제 18 항 내지 제 22 항중 어느 한 항의 세포를 포함하는 조직이식.