KR19980703088A - 신규의 침전탄산칼슘 안료를 포함하는 잉크젯 기록지 - Google Patents

신규의 침전탄산칼슘 안료를 포함하는 잉크젯 기록지 Download PDF

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KR19980703088A
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로버트 케네쓰 레스닉
미카엘 그레고리 맥파덴
더글래스 워드 도니쟌
Original Assignee
라카일레 지, 필리페
미네랄즈테크놀로지즈인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 3000 달톤 미만의 소분자량 성분을 포함하며, 다음과 같은 특성: (a) 동물의 담즙에서 추출가능하며; (b)시험관내또는생체내에서 대식세포와 단구를 자극할 수 있고; (c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있으며; (d) 측정가능한 양의 LI-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ을 함유하지 않고; (e) 악성생쥐 하이브리도마 세포주에서 항-증식 작용을 나타내며; (f) 인간 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cell) 또는 임파구에 대해 세포독성을 나타내지 않고; (g) 엔도톡신이 아닌 것의 특성을 갖는 면역조절제로 사용하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조성물을 제조하는 방법, 그것의 면역조절제로의 사용용도, 및 암 또는 자궁내막증식증과 같은 질환의 면역성분을 갖은 질환의 치료와 상태에서의 사용용도에 관한 것이다.

Description

담즙으로부터 분리한 면역계 장애의 치료를 위한 면역조절 조성물
적절하지 못한 면역계 반응의 직접적인 결과로서 발생하는 암, 자가면역, 감염 및 염증 질환 등의 예방과 치료를 위한 요법들이 꾸준히 개발되어 왔다. 이들 요법 중 몇몇은 면역계를 치료학적으로 이용하고자 시도하고 있어 왔다.
한가지 접근법은 면역계의 항원-특이적 요소, 즉 항체와 T-세포에 기초를 두고 있다. 예를 들면, 특정 항체 반응을 조절하거나 유도하기 위하여, 외부(foreign) 항원에 대한 백신을 개발하거나 또는 인터류킨과 같은 내부 화학적 전달물질(endogenous chemical)에 대한 백신을 개발하는 것을 목표로 하는 연구가 행해지고 있다. 두 번째 접근방법은 면역계의 비(非)항원-특이적 부분 (nonantigen-specific parts)으로부터 펩티드 및 단백질을 분리, 클로닝, 발현 및 생산하는 것에 기초를 두고 있다. 예를 들면, 백혈구에 의해 생산되는 인터류킨을 함유하는 단백질(예, 사이토킨(cytokines), 및 외부 항원을 소화하는 스캐빈져(scavenger) 세포와 임파구를 자극하는 인터페론 등은 새로운 치료법의 가능성을 제공한다.
예를 들면, 종양에 대한 초기 면역 반응을 증대시켜 종양이 치명적인 크기로 자라지 못하도록 하면, 암의 치료를 훨씬 향상시킬 수 있다. 종양에 대한 면역반응을 증대시키기 위해 제안된 전략으로는 다음의 것이 포함된다: 종양-관련 항원에 대해 특이적인 백신; IL-2 수용체와 같은 종양세포 표면 항원에 대한 단클론성 항체의 사용; 항종양 항체와 수퍼항원을 갖는 이중특이적(bispecific) 분자의 사용.
비교적 최근에 종양괴사인자(TNF; tumor necrosis factor)라고 알려진 생리학적으로 활성을 갖는 폴리펩티드의 역할이 연구되어 왔다. 특히, TNF는 생체의 다른 정상적인 조직에는 영향을 주지 않으면서 종양의 괴사를 일으키는 것으로 밝혀져 있다. TNF를 코딩하는 DNA의 염기서열 뿐만 아니라 TNF의 아미노산 서열이 미국특허 제 4,879,226호에 기재되어 있다.
TNF가 종양의 괴사를 일으키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 생체내에서(in vivo) TNF의 생산이나 생활성을 자극할 수 있는 모든 물질들은 여러 종양성 상황을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 가능성을 갖는다. 또한, 시험관내에서(in vitro) 단구(單球; monocyte)와 대식세포를 자극하여 TNF를 생산할 수 있는 모든 물질은 치료를 목적으로 하는 투여 뿐만 아니라 분석과 진단의 목적으로 TNF 공급원(源)을 제공하는 수단으로 유용하게 사용될 수 있다.
다른 질환들에서도 손상된 면역계 반응을 포함하고 있거나 손상된 면역계 반응이 관여되어 있다. 예를 들어, 자가면역 질환은 면역계가 생체에 대해 외부의 것이 아닌 물질에 대한 항체를 생산하여 염증과 그에 따른 조직 손상을 일으키는 질환이다. 예를 들어, 류마티스성 관절염(RA)는 몸의 면역계가 활액막이라고 불리우는 결합조직의 내막의 정상 세포를 외부의 것으로 잘못 인식하는 자가면역 질환의 일종이다. 자가면역 공격은 내막을 완전히 파괴시킬 수 있다. 가장 심한 경우에는, 결합조직이 더 이상 기능을 못하게 되어 수술을 통하여 인공 결합조직으로 대체하여야 한다. TNF는 RA의 손상을 중재하는 중재물질(mediator)이다. 가벼운 증세에서 심각한 변형으로 진전하는 것은 굉장히 빨리 일어날 수 있다. 아직까지는 RA 환자에게 적용할 수 있는 치료법이 없다. 근본적으로 치료가 안되는 다른 자가면역 질환으로는 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 다중 경화증(multiple sclerosis) 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 등이 포함된다.
세균, 바이러스 및 기타 다른 병원성 물질에 의해 유발된 감염성 질환은 몸의 면역계를 이기거나 피하는 경우에만 성공적으로 될 수 있다. 면역계는 이러한 병원성 물질들과 싸우기 위하여 비특이적 면역 반응과 특이적 면역 반응을 모두 준비하거나 이끌어낸다.
비특이적 면역 반응은 주로 대식세포에 의해 이루어지는 사이토킨의 생산에 촛점이 맞추어져 있으며, 특이적 항체 반응을 위한 서곡으로 작용한다. 염증성 사이토킨은 TNF-α를 포함하며 손상이나 감염 부위에 집중되는 급성 반응을 중재하는데, 이는 혈액공급의 증가로 나타난다. 병원성 세균이나 바이러스는 감염을 작은 조직 부위로만 봉쇄하기 위한 시도로서 호중구와 대식세포에 의해 먹힌다. 따라서, 대식세포는 다음과 같은 방법으로 감염성 질환에 대한 대항에서 중요한 역할을 담당한다:
(1) 항원을 가공하고 임파구에 제공하여 항체-중재 및 세포-중재 면역 반응이 일어날 수 있도록 한다;
(2) 면역반응에 중심이 되는 사이토킨을 분비한다;
(3) 항체-코팅된 세균, 종양 세포 또는 숙주 세포를 파괴한다.
대식세포는 세균, 진균 및 프로토조아(기생충)과 같은 매우 광범위한 병원성 물질을 삼켜서 죽일수 있다. 대식세포의 이러한 능력은 대식세포가 활성화되었을 때 증대된다. 활성화된 대식세포가 분비하는 생성물은 다른 모든 면역 세포가 생산해내는 산물들보다도 더 다양하다. 이들은 염증전(pre-inlfamator) 효과와 항염증 효과를 모두 조절하며, 다른 종류의 세포들을 조절한다. 이들 산물로는 TNF-α, IL-1β, IL-6, 가수분해효소 및 산화성 대사의 산물들이 포함된다. 이 세포-중재 면역과정에 의해 일차적으로 제거되는 세균에는 결핵균, 50% 가까운 AIDS 환자에게서 발견되는 부정형의 마이코박테리아성 감염과 같은 기타 다른 관련된 마이코박테리아성 감염균, 그리고 생물학전의 세균으로 쓰일 수도 있는 탄저균 등이 포함된다. 진균선 감염은 AIDS로 고생하는 환자나 기관이식 환자와 같은 면역억제 환자들에게 공통된 문제이다. 프로토조아는 말라리아균 같은 생명체를 포함한다.
염증성 질환에는 면역과정에 의해 중재되는 염증성 장 질환 및 자궁내막증식증이 포함된다. 자궁내막증식증은 원인이 규명되지 않은 모호한 질환이며, 월경을 하는 여성에게 영향을 주는 조직형성 질환이다. 이 질환은 자궁내막 세포가 비적절하게 착상, 증식 및 기능을 발휘하는 것을 특징으로 한다. 월경주기 동안에 정상적으로 방출되는 자궁내막 세포와 단편들이 팔로피오관(fallopian tube)을 통해 복강으로 전달되어, 그 곳에서 경우에 따라 착상 및 증식하고 자궁내막증식증 병변으로 발전하기도 한다. 그러나, 월경을 하는 모든 모든 여성의 복강내에는 자궁내막 세포가 존재하는 것으로 드러났기 때문에, 왜 모든 여성이 아니라 특정 여성의 경우에만 자궁내막증식증이 발달하는 지는 현재로서는 명확하지 않다. 자궁내막증식증의 경우에는 염증을 일으킨 조직의 통증, 비정상적 출혈, 광범위한 손상, 배뇨 또는 배변시의 통증, 여성의 생식기관에의 손상, 심지어는 불임을 유발할 수 있다. 자궁내막증식증의 치료방법은 알려져 있지 않으며, 일시적으로 증세를 경감시키는 방법으로서 임신을 중단하거나, 또는 자궁내막세포 공급원(源)을 제거하는 수술을 받을 수 있지만 이 경우 임신을 할 수 없다.
최근에, 수많은 연구보고에 따르면 자궁내막증식증이 면역계의 변화와 관련이 있다고 한다. 초기의 연구보고들은 붉은털 원숭이(rhesus monkey)에서 면역억제 치료가 자궁내막증식증의 증가와 관련이 있다고 밝히고 있다. 그 이후로, 자궁내막증식증을 앓는 사람에게서 세포-중재 면역 및 체액 면역 모두에 변화가 생겼다는 것이 관찰되었다.
지난 몇 년 동안에, 이 분야의 연구들은 자궁내막증식증에 있어서의 대식세포의 역할에 촛점이 맞추어져 왔다. 이들 연구의 근저가 되는 가설은 정상의 건강한 여성에 있어서는 단구/대식세포계가 자궁내막세포의 증식을 조절하고, 위치가 잘못된 자궁내막세포의 증식을 방지한다고 하는 것이다. 자궁내막증식증을 앓는 여성에 있어서는, 위치가 잘못된 자궁내막세포가 착상이 되도록 방치되어 자궁내막증식증의 원인이 된다는 것이다. 그 이후에 자궁내막증식증의 발달은 자궁내막세포 및 세포-유도 항원에 대한 자가항체(auto-antibody) 생산의 자극이 된다. 이들 자가항체는 활성화된 대식세포에서 생산되는 산물들과 함께 여성의 가임능력과 생식능력을 방해할 수 있다.
이들 연구에서 축적된 결과에 따르면 다름의 사실들이 밝혀지고 있다:
(1) 심한 자궁내막증식증이 있는 여성의 경우, 복강내에 있는 제 위치를 벗어난 자궁내막세포를 파괴하는 것에 관여하는 것으로 생각되는 복강 처리계(주로 대식세포로 이루어짐)에 결함이 있을 수 있다;
(2) 심한 자궁내막증식증이 있는 여성에게 있어서 복강내 대식세포 활성의 결함은 적어도 부분적으로라도 프로스타글란딘-중재 현상들과 관련이 있다. 즉, 대식세포 활성화 배양물에 프로스타글란딘 합성 억제물질이 포함되어 있을 때에만, 심한 자궁내막증식증이 있는 여성에게서 유래된 복강내 대식세포가 감마 인터페론과 엔도톡신 같은 대식세포 활성화물질에 반응하여 유의적으로 자극될 수 있다;
(3) 자궁내막증식증 환자의 순환성 단구의 산물은 자궁내막세포의 증식을 조절하는데 직접 관여할 수 있다. 독특한 공동배양 시스템에 있어서, 자궁내막증식증 환자의 대부분에게서 유래된 단구가 존재하면 자궁내막증식 세포가 원래의 장소에서 증식하는 것이 증강되는 반면, 대부분의 생식-조절 환자에게서 유래된 단구가 존재하면 증식이 억제되는 것이 관찰되었다;
(4) 자궁내막증식증 환자에서 유래된 자궁내막세포의 증식은 대식세포-유도 사이토킨에 의해 조절될 수 있다. 오늘날까지 얻어진 결과들은 제한적인 질환을 갖는 환자의 자궁내막의 증식성 반응을 인터류킨-1-β(IL-1β) 및 TNF-α에 의해 증강시킬 수 있다는 것을 시사한다. 반면, 심각한 질환을 갖고 있는 환자의 자궁내막의 증식성 반응은 IL-1β 및 TNF-α에 의해 억제된다.
따라서, 이들 연구의 결과들은 자궁내막증식증 환자의 단구 및 대식세포의 기능이 이 질환의 병리생리학에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 것이다. 나아가, 이들 몇몇 대식세포 기능들은 질환의 심각한 정도에 의해 다르게 영향을 받는 것으로 나타났다. 제한적인 질환을 갖는 여성에게 있어서, 대식세포는 복강에서, 그리고 아마도 순환도중에 과활성화되며, 이들의 자궁내막세포는 여러 상이한 대식세포-유도 성장인자에 대해 반응할 수 있는 것으로 나타났다. 반면, 심각한 자궁내막증식증은 부분적으로 면역조절성 프로스타글란딘의 과분비에 의해서 복강내에서 대식세포 활성화가 억제되는 것을 특징으로 한다. 대식세포 산물은 심각한 자궁내막증식증을 앓고 있는 여성의 자궁내막의 증식을 조절하는 것으로 나타났다; 그러나, 상이한 사이토킨에 대하여 자궁내막이 성격이 다른 반응을 나타낸다는 것은 이들 여성에 있어서 대식세포의 활성화에 결함이 있으므로 인하여 질환을 유발하거나 또는 아마도 질환을 조절하는 것일 수 있다.
염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD)은 위장관을 포함하는, 원인이 규명되지 않은 만성 염증성 장애군을 총칭하는 일반적인 용어이다. 이들 장애는 비특이적 궤양성 대장염 및 크론(Crohn) 질환을 포함한다. 이들 질환에 수반될 수 있는 장외(腸外) 발현 증후군(예를 들어, 관절염, 담도주위염)은 자가면역 현상을 드러내는 것일 수 있으며, 코르티코스테로이드 및 아자티오프린과 같이 IBD를 치료하기 위해 사용되는 치료약제들은 면역억제 메카니즘을 통해 그들의 효과를 나타내는 것일 수 있다. 염증성 장 질환을 갖고 있는 환자는 우유 단백질같은 외부 단백질, 리포다당류, 대장균(Escherichia coli)와 같은 세균 항원, 및 직장 세포에 대한 체액성 항체를 갖고 있을 수도 있다. 일반적으로, 이들 항체의 존재와 역가는 질환의 활성과 상호관련되어 있지는 않다; 그러나 이들 항원상피세포의 손상에 대해 이차적으로 관련있는 면역담당 세포(immunocompetent cells)에 접근할 수는 있는 것 같다. 또한 IBD는 IgA 결핍 뿐만 아니라 무(無)감마글로불린혈증과 관련하여 설명되어 왔다. 세포-중재 면역과 관련된 이상 증세에는 각질 아네르기(anergy), 각종 세포분열성 자극에 대한 반응위 감쇠, 및 말초 T-세포 수의 감소가 포함된다.
담즙은 간에 의해 분비되어 담낭에 저장되며, 여러 목적을 위해 연구되어 왔는데, 예를 들면 간기능에 의해 쉽게 대사되는 약제의 생체이용성을 증가시키기 위하여(WO 90/12583), 그리고 포유동물에서 백혈구증다증 촉진을 억제하기 위하여(Shinoda et al.,Chem. Pharm. Bull., 30, 4429-4434(1982)) 담즙 추출물을 이용하는 것을 들 수 있다. 그러나, 담즙이 신성형(新成形; neoplastic), 염증성 또는 감염성 질환과 관련하여 치료학적으로 유용한 조성물의 공급원으로 고려된 적은 없었다. 흥미롭게도 영국특허 제 337,797호에 따르면, 담낭 그 자체를 항암제의 잠재적인 공급원으로 사용하는 것이 제안되어 있긴 하지만, 담낭으로부터 담즙을 제거하고 담낭을 완전히 세척한 후에 사용하는 것만을 기술하고 있을 뿐이다.
본 발명은 면역조절 조성물, 이를 함유하는 제약학적 조성물 및 포유동물의 치료에 이들 조성물을 사용하는 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명의 조성물은 면역계의 장애에 관련된 질환의 치료를 위한 것이다.
본 발명의 보다 구체적인 설명은 첨부 도면에 도시된 예를 참고로 하여 하기에 기술될 것이다.
도 1은 본 발명의 농축 조성물의 역상-고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 프로필이다;
도 2는 본 발명의 농축 조성물의 역상-고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 프로필이다;
도 3은 본 발명의 농축 조성물의 역상-고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 프로필이다;
도 4는 말초 혈액 단핵세포 (PBMNs)에 의한 LPS-유도 TNF 방출에 미치는 조성물의 영향을 보여주는 그래프이다;
도 5는 PBMNs에 의한 LPS-유도 TNF 방출에 미치는 조성물의 영향을 보여주는 막대 그래프이다;
도 6은 본 발명의 조성물로 치료받은 췌장암 환자의 생존율을 보여주는 그래프이다;
도 7은 본 발명의 조성물로 치료받은 췌장암 환자의 생존율을 보여주는 그래프이다;
도 8은 본 발명의 조성물로 치료받은 모든 흑색종 환자의 생존율을 보여주는 그래프이다;
도 9는 본 발명의 조성물을 이용하여 두곳 이상의 종양 부위를 치료받은 흑색종 환자의 생존율을 보여주는 그래프이다;
도 10은 본 발명의 조성물을 이용하여 세곳 이상의 종양 부위를 치료받은 흑색종 환자의 생존율을 보여주는 그래프이다;
도 11은 본 발명의 조성물의 SDS 겔이다;
도 12는 친수성 HPLC 상에서 행한 본 발명 조성물의 용출 조건 및 시간 (a) 및 본 발명 조성물의 상층액의 용출 프로필 (b)을 보여준다;
도 13은 친수성 HPLC 상에서 행한 본 발명 조성물의 침전물의 용출을 보여준다;
도 14는 말초 혈액 단구 기능을 자극하는 데 있어서, 본 발명 조성물의 용량 반응을 보여주는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 연구를 주도하는 중심이 되는 가설은 강력한 생물학적 자극물질의 치료학적 효능은 대식세포 및/또는 단핵을 활성화하여 특정 사이토킨을 생산하거나 또는 외부 세포나 잘못위치한 세포와 같은 질환-유발 또는 질환-유도 세포를 찾아서 제거하거나 파괴하는 활성을 촉진하는 것과 같이 면역계의 적절한 조절을 일으킬 수 있는 능력에 의존할 수 있다고 하는 것이다. 예를 들어, 악성 질환을 포함하는 환경에서의 종양괴사 기능은 암에 대항하여 싸우는 유용한 요법이 될 수 있다. 이러한 기능은 종양의 미세환경에서 그곳에 상주하는 면역 세포를 직접 자극하므로써 유도할 수 있다. 또는, 순환중인 세포가 자극에 의해 악성 질환이 있는 부위로 가서 그 환경에서 기능을 발휘할 수 있는 경우라고 하면, 상기 순환 세포를 자극하는 것에 의해서도 상기와 같은 기능을 유도할 수 있다. 면역계 측면의 근저가 되는 다른 질환 및 상태들도 적절한 면역조절제를 이용하여 처리하는 것에 의해 극복하거나 또는 완화시킬 수 있다. 이러한 질환과 상태에는 자궁내막증식증 (이는 정상적인 자궁내막 세포가 적절하지 못한 부위에서 증식하는 질환 상태이다), 여러 감염성 질환, 그리고 아래에 보다 상세하게 기술하는 것과 같은 다른 질환들이 포함된다.
위에서 언급한 바 있듯이, 본 발명은 3000 달톤 미만의 소분자량 성분을 포함하며 다음과 같은 특성중 하나 이상을 갖고:
a) 동물의 담즙에서 추출가능하며;
b)시험관내또는생체내에서 대식세포와 단구를 자극할 수 있고;
c) 종양괴사인자 생산을 조절할 수 있으며;
d) LI-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ을 측정가능한 농도로는 함유하지 않고;
e) 악성 세포주에서 항-증식 작용을 가지며;
f) 인간 말초 혈액 단핵세포 또는 임파구에 대해 세포독성을 나타내지 않고;
g) 엔도톡신이 아니며;
면역조절제로 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로는, 본 발명자들의 연구에 따르면 본 발명의 조성물중 적어도 몇몇은 정상 단구를 자극하여 창 간암 세포(Chang hepatoma cells)에 대해 세포독성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이러한 세포독성의 발현여부는 단구 및 대식세포 활성화를 측정하는데 사용되고 있다. 암 환자 (자궁경관암, 자궁암, 귀/코/인후암, 폐암 및 자궁내막의 종양, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 및 만성 골수생성 백혈병 등 포함)에게서 얻은 단구 및/또는 대식세포도 또한 본 발명의 조성물에 의해 자극되어 그들의 특정 종양 세포를 공격 및 파괴하는 것으로 드러났다. 또한 자궁내막증식증으로 고생하는 환자에게서 얻은 대식세포도 역시 본 발명의 조성물에 의해 활성화되는 것으로 밝혀졌다 (실시예 26 참조).
본 발명의 조성물은 종양괴사인자(TNF) 생산을 조절할 수 있다. 소의 담즙에서 분리한, 본 발명의 바람직한 조성물은 인간 말초 혈액 단핵세포 및 전(前 ) 단구 세포주 U-937로부터 TNF가 방출되도록 자극하는데, 그 양은 생리학적 양인 것으로 나타났다. TNF는 염증성 및 항종양 사이토킨 효과의 캐스케이드(cascade)를 촉발하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명의 바람직한 조성물은 인간 백혈구를 자극하여 TNF(및 어쩌면 다른 종류의 사이토킨)을 방출하게 함으로써 항-신성형 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 종양 세포에 대항하는 임파구 및 대식세포의 세포독성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생쥐 하이브리도마 세포주 HYB-6-1의 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명 조성물이 생쥐 하이브리도마 세포에서 억제 작용을 나타낸다고 하는 것은 항증식 활성이 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 조성물이 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBNNs)와 임파구의 생존에 미치는 영향도 조사하였다. 본 발명 조성물은 인간 PBMNs와 임파구에 대해 세포독성을 나타내지 않는다.
아래에서 더 예시하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 무엇보다도 다음과 같은 특성을 갖는다:
1) PBMNs로부터 TNF가 방출되는 것에 관여하는 성분 또는 성분들은 C18RP-HPLC 칼럼에서 초기에 용출된다.
2) 인터류킨-1β(IL-1β)의 방출을 일으키는 조성물, 그리고 IL-1β 방출에 관여하는 성분은 RP-HPLC 칼럼에서 초기에 용출되는데, 이는 TNF를 방출하는 물질과 동일한 물질일 수도 있다는 것을 시사한다.
3) 본 발명의 조성물은 또한 소량의 인터류킨-2(IL-2)의 방출을 일으킨다.
4) 본 발명의 조성물은 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor; GM-CSF)의 방출을 일으킨다.
5) TNF 방출 대 GM-CSF 방출의 비율은 약 2:1이다.
6) 조성물의 성분중에서 TNF, IL-1β 및 GM-CSF의 방출에 관여하는 성분은 동일한 분자(들), 즉 동일한 성분(들)인 것 같다. 조성물이 여러종의 다른 사이토킨의 방출을 자극하도록 작용하거나, 또는 아니면 조성물이 하나의 사이토킨의 생산 및 방출을 유발하면, 이에 의해 차례로 다른 사이토킨의 생산 및 방출이 자극받는 것일 수도 있다.
7) SDS 겔 전기영동 및 분자체 HPLC에 의해 본 발명의 조성물(침전물 및 상층액 포함)을 물리화학적으로 분석한 결과는 주 성분이 2500달톤 미만의 것임을 시사한다.
8) 친수성(폴리히드록시에틸) 분자체 HPLC을 이용하여 추가적으로 물리화학적 분리를 한 결과는 조성물중의 성분의 분자량이 상기와 동일하다는 것을 확인해준다.
9) 산 가수분해 전후의 아미노산 분석은 펩티드 결합의 존재를 시사하는데, 이는 펩티드가 존재한다는 것을 암시하는 것이다.
상기에서 설명한대로, 본 발명이 조성물은 (a) 동물, 바람직하게는 소의 담즙을 물에 가용성이거나 또는 물과 혼화되는 용매, 바람직하게는 알콜, 그리고 바람직하게는 동부피의 알콜과 혼합하여 담즙/알콜 용액을 얻는 단계; (b) 바람직하게는 알콜-가용성 분획인 용액을 분리해내고, 열을 가하는 등의 수단을 이용하여 대부분의 알콜을 제거하는 것에 의해 상기 용액으로부터 실질적으로(substantially) 알콜을 함유하지 않는 용액을 단리하는 단계; (c) 상기 용액으로부터 담즙 색소를 제거하여 투명한 황색 액체를 수득하는 단계; (d) 투명한 황색 액체를 임의로 처리하여 잔류 알콜을 실질적으로 모두 제거하는 단계; (e) 상기 투명한 황색 액체를 에테르로 추출하므로써 지방 유기 물질을 제거하고 수상을 단리하는 단계; 및 (f) 임의로 상기 수상으로부터 잔류 에테르를 제거하는 단계에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 담즙을 생성하는 모든 동물의 담즙으로부터 얻어진다. 본 발명의 조성물이 서로 반대되는 종(種)의 담즙으로부터 얻어진 것이라면 특정 질환에 대해 서로 다른 활성을 가질 수 있지만, 일반적으로 적합한 담즙 제공원은 상어, 소, 양, 염소 및 돼지에서 얻은 것들이다. 대부분의 경우에, 본 발명의 조성물을 제조하기 위해서는 소, 양, 염소 및 돼지와 같은 도살된 건강한 식용 동물의 담즙을 얻는 것이 실용적이다. 이렇게 해서 수집한 담즙은 도살된 동물의 담낭 및/또는 간 기관(해당 종(種)의 해부학 및 생리학에 따라 적절하게 결정)으로부터 직접 얻은 것이어야 하고, 반드시 실질적으로 투명하여야 한다. 즉, 담즙 제제는 고름이나 혈액을 실질적으로 포함하지 말아야 한다.
본 발명 방법의 한 바람직한 구현예에서는, 소에서 얻은 담즙을 사용한다. 소의 담즙은 부분적으로는 각 동물 개체로부터 상당히 많은 양을 얻을 수 있기 때문에 양이 풍부하다. 또한 소는 흔히 건강-과련 규정하에 따라 도살 및 검사되기 때문에, 이러한 동물은 본 발명 조성물을 제조하기 위한 믿을만한 공급원을 제공한다. 나아가 인간은 소에서 유래된 물질에 대해서는 알레르기 반응을 덜 나타내는 것 같다.
담즙을 동부피의 알콜과 혼합하여 담즙/알콜 용액, 즉 50% 알콜을 얻는다. 알콜은 지방족 알콜, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 또는 프로판올일 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올이다.
50% 알콜-불용성 물질을 실질적으로 포함하지 않는 용액은 원심분리에 의해 단리할 수 있다. 바람직하게는 담즙/알콜 혼합물을 3000~5000rpm, 가장 바람직하게는 4200rpm에서, 2시간 이상동안, 약 15~25℃에서 원심분리한다. 이어 알콜과 물이 서로 상이한 휘발성을 갖는 것을 이용하는 분리 방법, 예를 들어 분획을 적당한 시간, 예를 들어 약 10시간 미만의 기간동안, 적절한 온도, 예를 들어 80~85℃로 가열하는 공지의 방법을 이용하여 담즙/알콜-가용성 분획에 함유되어 있는 알콜을 제거할 수 있다.
활성탄, 폴리아미드 미세과립 또는 여과법을 이용하여 용액으로부터 담즙 색소를 제거하므로써 투명한 황색 액체를 얻을 수 있다. 바람직하게는, 활성탄 처리법을 이용한다. 본 발명에 따른 방법은 용액이 광학 밀도 및 전도성에 관한 기준을 만족할 수 있도록 하기 위하여 반복해서 실시할 수 있다.
투명한 황색 액체를 통상의 방법을 이용하여 처리하므로써 잔류 알콜을 실질적으로 모두 제거한다. 바람직하게는 투명한 황색 액체를 약 1.0~3.5㎛ 보유능, 보다 바람직하게는 2.5㎛의 보유능을 갖는 필터를 이용하여 여과한다.
이어 투명한 황색 액체를 에테르로 추출하고 수층을 단리한다. 이 단계에서 사용되는 에테르는 바람직하게는 디메틸 에테르, 에틸 에테르, n-프로필 에테르, 이소프로필 에테르 또는 n- 부틸 에테르이며, 가장 바람직하게는 에틸 에테르이다.
수층에 포함되어 있을수도 있는 잔류 에테르는 예를 들어 용액을 55℃ 미만의 온도, 바람직하게는 약 40℃ 미만의 온도로, 약 5~15시간동안, 가장 바람직하게는 약 10시간동안 가열하므로써 제거할 수 있다.
본 발명의 조성물은 추가의 조작 없이 간단히 바이알에 충전하고 멸균하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 추가의 조작 없이 간단히 바이알에 충전하고 멸균하여 사용할 수 있다. 이 조성물은 농축된 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 농축형태는 다음과 같이 제조된다. 상기에서 설명한 공정중에서 (e) 단계를 실시하기 전에, 투명한 황색 액체를 예를 들어 약 85℃ 미만의 온도, 바람직하게는 약 60~70℃의 온도로 가열하므로써 담즙/알콜 용액의 부피의 약 8/1이 되는 정도로 임의로 농축할 수 있다. 단계 (f)를 실시한 후에, 예를 들어 약 80~85℃의 온도로 수상을 가열하여 담즙/에탄올 용액의 부피의 1/10이 되도록 농축할 수 있다.
본 발명의 조성물을 제조하기 위한 한 바람직한 방법에서는, 수집된 담즙을 동부피의 에틸 알콜과 혼합한다. 이어 담즙/알콜 혼합물을 약 20±2℃, 2.5시간 이상동안 약 4200rpm으로 원심분리한다. 상층액을 경사분리해내어 pH 및 에탄올 함량을 검사한다. 이어 활성탄을 이용하여 담즙 색소를 제거한다. 그리고 처리된 담즙/에탄올 용액의 광학밀도(O.D.) 및 전도성을 검사한다. O.D.값과 전도성이 허용가능한 규격을 벗어난 경우에는, 담즙/에탄올 용액을 예를 들어 활성탄으로 다시 처리하여 담즙 색소를 제거하므로써 규격 범위내에 들어가도록 해야 한다.
활성탄 처리 후에, 용액을 2.5㎛ 보유능을 갖는 필터를 통해 여과하고, 85℃ 미만으로 가열하여 알콜을 증발시켜 버리고, 용액을 담즙/에탄올 용액의 최초 부피의 약 1/8이 되도록 농축시킨다. 농축된 용액을 약 20~25℃로 냉각한다. 이어 이 용액을 에틸 에테르와 혼합하고 에테르 층을 버린다. 바람직하게는 비교적 소량, 예를 들어 0.1~1 부피, 바람직하게는 0.2~0.5 부피의 에테르를 이용하고 강력한 교반을 행한다. 이 단계를 한번 더 반복할 수 있다. 수층을 약 10시간동안 55℃까지 가열하여 잔류 에테르를 제거하고, 약 80~85℃로 더 가열하여 담즙/에탄올의 최초 부피의 1/10로 감소시킨다. 이 용액의 외관, 생물학적 활성, 및 에탄올과 에테르의 함량을 검사한다.
조성물의 pH는 염산(1%) 용액 및 수산화나트륨(1% 용액)을 이용하여 생리학적 pH, 즉 7.4~7.5로 조정할 수 있으며, 통상의 방법을 이용하여 이염기성 및 일염기성 인산 나트륨염을 완충액으로 사용하여 완충된 용액을 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물은 추가의 조작 없이 간단히 바이알에 충전하고 멸균하여 사용할 수 있다. 바람직한 멸균법은 오토클레이브(autoclaving) 및 그에 이은 배양(incubation)의 두단계로 이루어진 멸균 사이클을 조성물에 대해 3회 실시하는 것이다.
본 발명의 조성물은 농축 형태로 이용될 수 있다. 농축 형태의 제조는 위에서 설명한 바 있다. 조성물은 또한 동결건조될 수 있다.
본 발명의 조성물과 농축 조성물은 10ppm 이하의 에탄올과 5ppm 이하의 에테르를 함유하며, 필수적으로(essentially) 외부 물질을 함유하지 않는 투명한 황색 용액이다. 본 발명의 조성물은 실시예 2에 기재된 대로 단구/대식세포 활성화 분석법(TNF-방출)에 의해 측정된 바에 따르면,시험관내에서 PBMNs를 활성화하여 TNF를 방출한다. 또한, 본 발명의 조성물은 예를 들어 암 환자에게서 얻은 PBMNs를 활성화하고, 동일한 환자에게서 유도된 암성(癌性) 세포에 대하여 세포독성 활성을 중재한다. 정말로, 동물과 인간을 포함한 임상연구에 의하면, 본 발명의 조성물을 이용한 항-종양 치료에서 효능이 있음이 밝혀진 바 있다. 비슷하게, 본 발명의 조성물에 의해 활성화된 PBMNs는 자궁내막 세포에 대해 작용을 하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명은 자궁내막증식증 및 다른 염증성 질환을 치료하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 위에서 전반적으로 설명한 방법을 이용하여, 모든 배치에서 일정한 동일성(identity), 효능(potency) 및 순도를 가지며 반복생산가능한 형태로 제조할 수 있다. 동일성 및 효능은 역상 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 결정한다(실시예 1 참조). 본 발명의 조성물은 역상 HPLC에서 일정하게 반복재현가능한 패턴을 나타낸다. 세 개의 로트에서 얻은 본 발명의 농축 조성물의 HPLC 값은 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 본 발명의 조성물은 또한 위에서 설명한 성질, 예를 들어시험관내및생체내에서 단구 및 대식세포를 자극할 수 있는 능력 등의 성질에 의해 특성화될 수 있다.
본 발명의 조성물에 존재할 수 있는 화합물에는, 그의 공급원을 고려할 때, 설폰화 담즙산, 산화 담즙산, 다른 천연의 담즙산, 및 다른 아미노산(특히 글리신 및 타우린) 접합체 및 스테롤이 포함되어 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 적어도 하나 포함할 것으로 믿어진다.
상기 분자는 예를 들어 A와 B 사이의 결합, B와 C 사이의 결합, 또는 C와 D 사이의 결합이 단일 결합 또는 이중 결합이 될 수 있도록 완전히 포화되거나 또는 포화되지 않을 수 있으며,
상기 식중 X는 H, OH, =O, 또는 OSO3H이고; 및
Y는
,,,
,,, 또는
및
R은 예를 들어 글리실, 글루타밀, 또는 타우릴과 같은 아미노산 잔기이어서 글리신, 글루타밀, 또는 타우린 접합체를 형성한다.
특히, 본 발명의 조성물에 대하여 무기 및 유기 성분을 비롯하여 성분 화합물에 대해 분석하였다. 이러한 정보는 질량 분광분석법(MS)를 포함하여 표준 분석화학법을 이용하여 얻어진 것이다. 이러한 연구의 결과에는, 예를 들어 담즙 내에 존재할 것으로 생각되는 특정 담즙산 성분들, 예를 들어 콜산, 글리코콜산, 데옥시글리코콜산, 우르소데옥시콜산, 콜레스테롤 설페이트, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산 및 타우로콜산 등의 동정결과가 포함된다.
MS 결과로는, 특정 화합물의 OH와 H2가 MS에서 손실되는 일이 발생하거나 또는 이들 화합물의 데옥시, 디데옥시 및 불포화 유사체가 동일 시점에서 존재하면 이들을 구분할 수 없다. 이들 화합물은 암모늄염, 알킬암모늄염 및 무기 양이온의 형태로 존재할 수 있다.
MS 분석은 또한 본 발명의 조성물에 인지질, 스핀고리피드 및 미셀을 형성할 수 있는 관련 성분이 존재하고 있음을 뒷받침한다.
본 발명의 조성물내에 존재할 것으로 생각되는 구체적인 화합물들은 다음의 것들을 포함한다:
스테아린산 CH3(CH2)16COOH
팔미틴산 CH3(CH2)14COOH
올레인산 Z-9 옥타데카노산 CH3(CH2)2CH2CH=CHCH2(CH2)6COOH
산화된 또는 수산기가 첨가된/불포화 저급 지방산 : C6H8O3(예를 들어, CH3CH=CHCOCH2COOH 또는 2개의 이중결합과 하나의 수산기를 갖는 C6산
초산
스테아린산 디글리세리드
팔미틴산 디글리세리드
스테아린산, 팔미틴산 디글리세리드
스테아린산-모노글리세리드-포스포콜린 (리소레시틴)
스테아린산 모노글리세리드
스테아린산 트리글리세리드
팔미틴산 모노글리세리드
포스포콜린
포스포세린
포스포스핀고신
스핀고미엘린
포스포글리세롤
글리세롤
스테아린산-스핀고신
스핀고신
스테아린산 아미드
스테아린산 메틸아미드
콜린
글리세로포스포콜린
스테아린산, 올레인산 디글리세리드
스테아린산, 올레인산 포스포글리세롤
팔미틴산 아미드
레시틴
시알산(sialic acid)-글리세롤 다이머
또한, 1 내지 약 30개의 탄소원자를 갖는 것과 같이 보다 짧은 사슬의 지방산도 존재한다는 것을 보여주는 예비 HPLC 및 적정시험 결과도 얻어졌다.
본 발명 조성물의 공급원을 고려하면 인지질, 스핀고리피드, 및 관련 가수분해 산물 화합물들이 존재할 것으로 보이며, MS 및 HPLC 분석에서 유도된 정보에 따르면 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 적어도 1종 이상 함유되어 있는 것을 보여준다.
또는
상기 식중, R1, R2, R3은 서로 다르거나 동일하며, 각각 H, COR4, CH=CH-R5, X, -P(O)(OH)O- 또는 -S(O)2O- 이며; X는 콜린, 에탄올아민, N-알킬화 에탄올아민, 세린, 이노시톨, 유리 히드록실기를 갖는 당류, 아미노당류, 설폰화 당류 및 시알산으로 이루어진 군에서 선택된 것이고; R4는 포화 또는 불포화, 산화 또는 히드록시화된 C1- C30알킬이며; 및 R5는 알킬기 또는 산화 및/또는 히드록시화된 그의 유사체이다.
상술한 수성 추출물내에는 지방산 및 그들의 접합체가 염의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 화합물들의 용해도는 혼합물중의 다른 성분들에 의해 증강될 수 있다. 카복실산의 아미드, RCHNR1R2(식중 R1및 R2는 서로 동일하거나 상이하며, H 또는 알킬이다)도 존재하는 것으로 믿어진다.
본 발명 조성물의 공급원과 상술한 바 있는 그의 MS 분석결과를 고려하면, 제 3의 화합물들, 즉 뮤신 및 프로테오글리신 가수분해 산물들도 역시 존재할 것이다. 이러한 화합물에는 담즙과 담낭벽으로부터 얻어지는 뮤코단백질의 가수분해 산물들, 예를 들어 콘드로이틴 4- 및 6-설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히알루론산 및 이들 뮤신의 가수분해 산물 (모노머, 다이머, 올리고머 및 폴리머)이 포함된다. 키틴과 기타 다른 뮤신들도 비슷하게 가수분해될 수 있는데, 이 가수분해 산물에는 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민-4-설페이트, 갈락토스-6-설페이트, N-아세틸-D-글루코사민-6-설페이트, 글루코사민-6-설페이트, D-글루코사민 2-설페이트, D-글루코사민 2,3-디설페이트, D_갈락토스-6-설페이트, 글루쿠론산 2-설페이트, N-아세틸뉴라민산, 시알산, N-아세틸 콘드로신, 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트, D-글루코사민, D-갈락토사민, 글루쿠론산, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸로스, 이두론산, 헥소스, 헥소사민, 에스테르 설페이트, 글루쿠론산, 콘드로사민, 2-아미노-2-데옥시-D-갈락토스, 세린, 프롤린, 트레오닌, 알라닌 글리신 타우린, 글루탐산, 아스파르트산, 히스티딘 및 소분자량 펩티드류가 포함된다.
뮤신의 가수분해에 의해서도 비슷한 산물들이 얻어지게 되는데, 예를 들면 케라틴 설페이트류, 데르마탄 설페이트류를 들 수 있고, 다이머, 올리고머 및 폴리머 중의 천연 당-당 결합은 당 모노머들끼리 또는 인접한 당 사슬끼리의 -O-Si(OH)2-O- 다리에 의해 치환될 수 있다.
특히 본 발명의 조성물에 포함되어 있을 것으로 생각되는 특정 뮤신 및 프로테오글리칸 가수분해 산물 화합물에는 다음의 것들이 포함된다:
시알산 및 이의 모노 및 디아세틸화 및 글리콜릴화 모노머류; N-아세틸뉴라민산; 글루코사민과 같은 헥소사민류; L-푸코스; 헥소사민-헥수론산 (다이머) 디섶레이트; 글루쿠론산; 모노아세틸화된 글루쿠론산 또는 이두론산 디설페이트; 시알산-글리세롤(다이머); 및 상기 모노머들이 아세틸화 및 설페이트화된 형태의 다이머, 트라이머, 올리고머 및 폴리머류.
본 발명 조성물의 공급원 및 상술한 MS 분석결과를 고려할 때 조성물내에 존재할 수 있는 제 4의 화합물들, 즉 지용성 비타민류에는 예를 들어 비타민 A, D, 및 K (예를 들어 A2, D1, D3, D4, K1, K2, K5, K6, K7, K-S(II)) 및 비타민 E 아세테이트가 포함된다.
특히 본 발명 조성물에 포함되어 있을 것으로 생각되는 특정 지용성 비타민 화합물에는 비타민 A2, 비타민 D1, 루미스테롤 (그의 비타민 D1 복합체로부터 존재), 비타민 E, 비타민 K1 옥사이드 및 비타민 K5가 포함된다.
본 발명 조성물의 공급원 및 상술한 MS 분석결과를 고려할 때 조성물내에는 각종 유기 화합물들이 존재할 수 있다. 이런 화합물로는 다음의 것들이 포함된다: 우레아; 메틸아민, 디메틸아민, 데틸아민, 메틸에틸아민, 디에틸아민, 디프로필아민, 및/또는 부틸에틸아민을 포함하는 알킬아민류; 타우린, 글루탐산, 글리신, 알라닌, n-류신, 포스포세린, 포스포에탄올아민, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 사르코신, α-아미노 아디프산, 시트룰린, 발린, 이소류신, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 히드록시리신, 오르니틴, 및 리신을 포함하는 아미노산류; 빌리루빈 및 그의 글루코누라이드 접합체(gluconuride conjugate); 빌리베르딘 및 그의 글루코누라이드 접합체; 부틸화 히드록시 톨루엔 (BHT); 폴리에틸렌글리콜; 미량의 스테로이드류; 당류, 퓨린 및 피리미딘류와 같은 기타 다른 혈장 용질 물질들; 잡동사니 식이 지질류; 및 글루타치온 및 그의 가수분해 산물.
특히 본 발명의 조성물에 존재할 것으로 믿어지는 특정 잡동사니 유기 화합물은 우레아, 메틸아민, 디메틸아민, 에틸아민, 메틸에틸아민, 디에틸아민, 디프로필아민, 부틸에틸아민, 암모니아, 콜린, 타우린, 글루탐산, 글리신, 알라닌, p-ser, p-eu, p-ea, ast thr ser sar, a-aba, cit, val, ile, leu, B-ala, G-aba, OH-lys, orn, lys, 부틸화 히드록시 톨루엔 (BHT) 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군의 적어도 일종을 포함한다.
본 발명의 조성물에 존재하는 아민류, 특히 이차 아민류에는 공기에서 유래된 산화질소를 포함될 수 있는데, 이 산화질소에 의해 니트로소 화합물을 형성한다. N-산화물 및 N-카르바메이트 부산물들도 존재할 수 있다. 위에서 언급한 이 계열의 아민류에는 모든 일차, 이차 및 삼차 알킬아민이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
동정 및 정량분석(㎎/ℓ)이 완료된 특정 유기 원소는 다음과 같다 :
텅스텐 0.07
아연 0.666
인 378
카드뮴 0.01
코발트 0.008
니켈 0.022
바륨 0.032
철 0.022
망간 0.039
크롬 0.060
마그네슘 7.46
알루미늄 0.136
칼슘 5.97
구리 0.087
티탄 0.01
스트론튬 0.060
나트륨 9600
칼륨 483
염화물 15400
암모니아 218
바나듐 1ppm
본 발명의 조성물은 유용한 약리학적 특성을 갖는다. 특히 본 발명의 조성물은 신성형 생장, 및 종양 괴사 인자의 방출에 영향을 미치며, 대식세포와 단구를 활성화시킨다. 본 발명이 조성물은 유의할 만한 수준의 독성을 일으키지 않으며, 다만 일시적인 부작용(예를 들어, 미열, 조갈증 및 주사 부위에서의 통증)을 일으킬 뿐이다. 또한 유해한 면역반응을 일으킬 수 있는 고분자량 물질(즉, 약 5,000 달톤 이상)이 검출되지 않는다. 본 발명 조성물은 면역 반응의 변화가 요구되는 상태, 특히 감염성 질환(세균성, 진균성, 프로토조아 및 다른 가능한 감염 포함), 염증(자궁내막증식증 및 염증성 장 질환 포함), 백신화(HIV용 조보제로서의 사용 포함; 디프테리아, 백일해. 파상풍, 소아마비, 홍역, 이하선염, 루벨라, 바이러스성 인플루엔자 및 헤모필루스와 같은 흔히 발생하는 어린이 및 성인의 면역화 포함; 및 장티푸스, 콜레라, 역병, 세균성 수막염 및 말라리아와 같은 여행자를 위한 백신으로서의 사용 포함), 신성형 및 자가면역 질환의 예방 및 치료를 위한 약으로 사용될 수 있다. 상기한 질환들은 부적절한 면역계 반응과 관련이 있거나 또는 이것이 직접적인 원인이 될 수 있는 질환들이다. 상술한 발명의 배경란에 설명하였듯이, 체액 및 세포성 방어기작이 포함되어 있을 수 있다. 단구와 대식세포를 활성화시킬 수 있는 능력에 비추어 볼 때 본 발명의 조성물은 이들 두가지 측면의 면역반응을 모두 증강시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 동일종내 또는 이종간의 기관이식과 관련된 거부현상을 완화시키거나 또는 차단하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 방사선요법에 관한 병 증세(radiation sickness)를 치료하는데도 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물들은 특히 백혈병, 임파병, 흑색종, 아데노육종, 육종(sarcoma) 및 카르시노마(carsinoma)와 같은 각종 형태의 신성형증을 치료하는데 유용하다. 특히 본 발명의 조성물은 악성 흑색종, 췌장암, 자궁경부-자궁 암, 그리고 신장, 위(stomach), 폐, 직장, 난소, 유방, 장, 위(gastric), 간, 갑상선, 목, 경부, 침샘, 다리, 혀, 입술, 담즙관, 골반, 종격동(從隔洞; mediastinum), 요도, 기관지, 방광, 식도 및 결장, 그리고 후천성 면역결핍증(AIDS)를 갖고 있는 HIV-감염 환자와 관련이 있는 암 형태의 하나인 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma)을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 결함있는 면역반응을 일으키거나 또는 이에 의해 더 심해지는 기타 다른 상태를 치료하는데도 이용될 수 있다. 이런 상태에는 동맥경화증, 또는 특히 AIDS와 같은 바이러스겅 감염등의 기타 다른 감염이 포함된다. 또한 다중 경화증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, I형 당뇨병, 근 무력증, 애디슨 병(Addison's Disease), 자가면역 용혈성 빈혈증, 크론 병(Crohn's disease) 및 기타 다른 염증성 장 질환, 구드패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 그래이브스 병(Graves' disease), 해쉬모토(Hashimoto) 갑상선염, 특발성(特發性; idiopathic) 혈소판감소성 자반병, 악성 빈혈증, 연쇄상구균감염후 사구체신염(poststreptococcal glomerulonephritis), 건선, 공피증(scleroderma), 쇼그렌 증후 (Sjogrens's syndrome), 자연성 불임, 및 심상성(尋常性) 천포창을 포함하는 자가면역 질환의 치료에도 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 자궁내막증식증 및 염증성 장 질환과 같은 염증성 질환을 치료하는데도 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상의 방법을 이용하여 제약학적 조성물로 전환시킬 수 있다. 제약학적 조성물은 본 발명의 조성물을 단독으로 함유하거나 또는 다른 활성 물질과 함께 함유할 수 있다. 이러한 제약학적 조성물은 경구, 국소, 직장, 비경구, 국부, 흡입 또는 뇌내 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서 고형 또는 반고형의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면, 필(pill), 정제, 크림, 겔라틴 캡슐, 겔, 막 및 튜벨렛의 형태일 수 있다. 비경구 및 뇌내 투여를 위해서는, 근육내 또는 피하 투여를 위한 형태를 이용하거나 또는 주입(infusion), 정맥내 또는 내뇌 주사를 위한 형태를 이용할 수 있으며, 따라서 조성물의 용액으로 제조하거나 또는 상술한 용도에 적합한 제약학적으로 허용되는 1종 또는 그 이상의 부형제나 희석제와 혼합하여 사용할 수 있고 생리학적 액체(physilogical fluids)에 부합되는 삼투압을 갖는 활성 조성물의 분말로 제조할 수 있다. 국부(local) 투여의 경우에는 국소적으로 사용하기 위한 연고나 크림의 형태 또는 스프레이 형태를 고려할 수 잇으며, 흡입 투여의 경우에는 스프레이 형태, 예를 들어 코 스프레이를 고려할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 근육내 경로를 통해 투여된다.
제약학적 조성물은 환자에게 투여될 수 있는 제약학적으로 허용되는 조성물 제제를 제조하기 위한 그 자체로서 공지된 기존의 방법에 의해, 유효량의 활성 성분이 제약학적으로 허용되는 부형제와의 혼합물내에 배합될 수 있도록 하여 제조할 수 있다. 적절한 부형제는 예를 들어 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Nack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)에 기재되어 있다.
이에 기초하면, 본 발명의 제약학적 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1종 또는 2종 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제와 함께 본 발명의 조성물을 포함하며, 생리학적 액체에 적합한 pH와 등장성을 갖는 완충된 용액내에 포함되어 있다.
조성물은 그 단독으로서, 또는 기타 다른 치료제 또는 다른 형태의 치료와 함께 치료에 이용될 수 있다. 예를 들어 악성 종양의 경우 본 발명의 치료방법에 따르면, 이전에는 시술이 불가능했던 부위에서 종양을 수술에 의해 제거하는 것이 가능해진다. 또는 본 발명의 치료법을 화학요법 및/또는 방사선요법과 병행할 수 도 있다. 본 발명의 조성물과 치료제는 인간 또는 동물에 투여하고자 하는 것이다.
일반적으로 인간에게 투여하고자 하는 경우, 1일에 약 0.01~20㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 약 0.1~10㎎/㎏ 체중, 가장 바람직하게는 0.1~1㎎/㎏ 체중의 범위에 드는 용량을 사용할 수 있다. 정맥내 투여의 경우에는 1일에 약 0.1~5㎎/㎏ 체중의 용량을, 경구 투여의 경우에는 1일에 약 1~5㎎/㎏ 체중의 용량을 이용할 수 있다. 농축 조성물을 사용하는 경우에는, 상술한 양의 대략 반을 이용할 수 있다. 예를 들어, 근육내 투여의 경우 1일에 약 0.2~1.0㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.275~0.75㎎/㎏ 체중의 용량을 이용할 수 있다.
의료분야에 종사하는 사람들은 치료하고자 하는 동물의 체중과 상태, 치료하고자 하는 특정 질환, 원하는 치료와 투여경로의 특성에 따라 상술한 양을 변화시키고 벗어날 필요도 있다는 것을 이해할 것이다. 또한 동물의 종류와 약에 대한 각 개체의 행동 또는 제제의 특성, 투여시간과 간격에 따라서도 상기한 범위와는 다른 양을 투여할 수 있다. 즉, 어떤 경우에는 상기한 범위의 하한치보다 적은 양으로도 충분한 경우가 있는 반면, 다른 어떤 경우에는 상기 범위의 상한치를 초과하여야 하는 경우도 있다. 많은 양을 투여하는 경우에는 하루 동안에 여러번 나누어 투여하는 것이 바람직할 수도 있다.
본 발명은 (a) 동물에서 얻은 담즙을 수용성 용매와 혼합하여 담즙/용매 용액을 얻는 단계; (b) 상기 담즙/용매 용액으로부터 실질적으로 용매를 함유하지 않는 수용액을 단리하는 단계; 및 (c) 상기 실질적으로 용매를 함유하지 않는 수용액으로부터 담즙 색소를 제거하여 투명한 황색 액체를 얻는 단계를 포함하는 면역조절 조성물을 제조하는 방법을 포함하고 있으며, 이 방법에서 바람직하게는 수용성 용매는 알콜이고, 동물에서 얻은 담즙을 동부피의 알콜과 혼합한다. 상기 방법의 바람직한 측면에 따르면, 상기 투명한 황색 액체를 담즙/용매 용액의 최초 부피의 약 1/8, 또는 1/10으로 농축시킨다. 분명히 상기한 방법을 통해 제조된 조성물은 본 발명의 한 측면을 구성한다.
본 발명은 또한 분자량이 약 3000 달톤 미만인 성분을 적어도 1종 함유하며, 인간 말초 혈액 단핵 세포류에 대해 세포독성을 나타내지 않고, 다음 특성 (a)-(c)중 적어도 하나의 특성을 갖는, 면역조절제로 사용하기 위한 조성물로서
(a)시험관내또는생체내에서 단구 및 대식세포를 자극하여 하나 이상의 사이토킨을 생산할 수 있거나;
(b)시험관내또는생체내에서 단구 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있거나; 또는
(c) 악성 세포주에 대해 항-증식 작용을 갖는 것;
상기 성분은 엔도톡신, IL-1α, IL-1β, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF 또는 IFN-γ가 아닌 것을 특징으로 하는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 동물, 바람직하게는 소의 담즙으로부터, 또는 상술한 바 있는 기타 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다. 바람직한 구현에의 조성물에 있어서, 조성물은 외부 IL-1α, IL-1β, TNF, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF 또는 IFN-γ의 부재하에시험관내또는생체내에서, 그리고 가장 바람직하게는 인체내에서 종양괴사인자의 생산을 자극한다.
본 발명의 조성물은 또한 상기 조성물을 건조하여 고형 잔류물을 얻고, 이 고형 잔류물 2g을 메탄올에 용해시킨 10% 진한 수산화암모늄 용액 20㎖에 녹이고 불용성 물질을 모두 제거한 후, 5㎝×12.5㎝ 크기를 갖고, 60A 플래쉬 실리카 겔 102g을 포함하며, 1 인치2당 10 파운드의 압력 및 메탄올 용매에 용해시킨 10% 진한 수산화암모늄 용액을 이용하여 11㎖/분의 용출속도로 조작되는 칼럼 크로마토그래피했을 때, 상기 성분이 총 칼럼 용출이 약 180㎖ 내지 약 220㎖인 범위, 약 220㎖ 내지 약 260㎖인 범위, 또는 약 260㎖ 내지 약 300㎖인 범위내의 분획에서 용출되는 것으로서 특성화할 수 있다.
조성물의 성분은 또한 이온 교환 크로마토그래피에 의해서도 특성화할 수 있는데, 상기 조성물 10㎖ 내에 존재하는 실질적으로 모든 양의 음이온을 결합할 수 있는 양의 Bio-Rad AG-1 히드록사이드 형태의 수지을 포함하는 칼럼에 10㎖의 조성물을 넣어 음이온 교환 크로마토그래피를 했을 때, 상기 성분이 단계별 구배농도의 중탄산암모늄 완충액을 이용한 용출시에 상기 성분이 약 0.1M 내지 약 1.5M, 바람직하게는 약 0.2M 내지 약 0.4M, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.2M의 완충액 농도에서 용출되는 것으로서 특성화할 수 있다.
조성물 성분을 특성화하기 위해 역상 (C18) HPLC를 이용할 수도 있다. 기타 다른 적절한 칼럼, 용리액, 구배, 유속, 조작 온도 및 검출 시스템을 적용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 TLC에 의해서도 특성화할 수 있다. 즉, 메탄올에 용해시킨 10% 진한 수산화암노늄가 같은 적절한 용매계내에서 실리카겔 플레이트상에서 박막 크로마토그래피를 행하고 닌히드린과 같은 적절한 발색제를 사용하여 발색시켰을 때, 닌히드린과의 양성 반응이 예를 들어 Rf값이 약 0.80 내지 약 0.90인 범위에서 일어나는 것에 의해 특성화할 수 있다.
본 발명은 또한 다음의 화합물 (a) 내지 (d)중 적어도 하나를 함유하는 조성물을 유효량 투여함을 특징으로 하는, 인체내에서 종양괴사인자 생산을 자극하는 방법을 포함한다.
(a) 하기 일반식의 화합물:
상기 분자는 예를 들어 A와 B 사이의 결합, B와 C 사이의 결합, 또는 C와 D 사이의 결합이 단일 결합 또는 이중 결합이 될 수 있도록 완전히 포화되거나 또는 포화되지 않을 수 있으며,
상기 식중 X는 H, OH, =O, 또는 OSO3H이고; 및
Y는
,,,
,,, 또는
R은 아미노산 잔기이며;
(b) 하기 일반식의 화합물:
(R1O)CH2CH(OR2)CH2(OR3-X) 또는
상기 식중, R1, R2, R3은 서로 다르거나 동일하며, 각각 H, COR4, CH=CH-R5, X, -P(O)(OH)O- 또는 -S(O)2O- 이며;
X는 콜린, 에탄올아민, N-알킬화 에탄올아민, 세린, 이노시톨, 유리 히드록실기를 갖는 당류, 아미노당류, 설폰화 당류 및 시알산으로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
R4는 포화 또는 불포화, 산화 또는 히드록시화된 C1~C30알킬이며; 및
R5는 알킬기 또는 산화 및/또는 히드록시화된 그의 유사체이다.
(c) 뮤신 가수분해 산물 또는 프로테오글리칸 가수분해 산물; 또는
(d) 지용성 단백질.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 이용되는 조성물은 타우로콜산 및 그의 설페이트화 유도체; 글리코콜산 및 그의 설페이트화 유도체; 스핀고신; 디아실 글리세롤; 레시틴; 포스포콜린; 포스포글리세롤; 글리세로-포스포콜린; 포스포릴콜린 클로라이드; 길이에 있어 10개 미만의 사카라이드 단위를 갖는 올리고사카라이드로서 시알산, 푸코스, 헥소사민류 또는 설페이트화 헥소사민류를 함유하는 올리고사카라이드; 비타민 A, 레티놀산 유도체; 레티놀 유도체; 타우린; 및 글루탐산 및 그의 접합체로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종의 화합물을 함유한다. 조성물은 또한 암모니아; 일차 알킬 아민류; 이차 알킬 아민류; 삼차 알킬 아민류; 및 카르복실산 R6CO2H(식중 R6은 포화 또는 불포화된 C1~C30알킬, 및 산화 및/또는 히드록시화된 이들의 유도체이다)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종의 화합물을 더 함유할 수 있다. 보다 바람직하게는 이 조성물은 포스포콜린, 글리세로-포스포콜린, 글루코사민-3-설페이트 및 포스포릴콜린 클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종을 함유한다. 보다 바람직하게는 이 조성물은 포스포콜린, 글리세포-포스포콜린 또는 글루코사민-3-설페이트중 적어도 1종을 함유한다.
본 발명의 방법은 또한 타우로콜산 및 그의 설페이트화 유도체; 글리코콜산 및 그의 설페이트와 유도체; 스핀고신; 디아실 글리세롤; 레시틴; 길이에 있어 10개 미만의 사카라이드 단위를 갖는 올리고사카라이드로서 시알산, 푸코스, 헥소사민류 또는 설페이트화 헥소사민류를 함유하는 올리고사카라이드; 비타민 A; 레틴산 유도체; 레티놀 유도체; 타우린; 및 글루탐산 및 그의 접합체로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종의 화합물을 함유하는 조성물을 투여하므로써 TNF 생산을 자극하는 것을 포함한다.
본 발명은 췌장, 귀/코/인후, 난소, 폐 또는 자궁내막의 암, 그리고 만성 골수성 백혈병 및 카포시 육종을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 암으로 고생하는 환자에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명 조성물을 투여하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 자궁내막증식증 및 염증성 장 질환을 비롯한 염증성 질환, 류마티스성 관절염, 낭창, 다중 경화증 및 ALS와 같은 자가면역 질환, 세균성, 진균성, 미코플라즈마성, 프로토조아성 및 기타 다른 원인에 의한 감염을 비롯한 감염성 질환으로부터 유발되거나 또는 이들 질환의 결과로서 발생하는 기타 다른 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기한 질환중 한가지로 고생하는 환자에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명 조성물을 투여하는 것을 특징으로 한다. 나아가 본 발명은 HIV, 가종 어린이 질환 및 기타 다른 질환들의 예방을 위한 백신화 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 조성물을 상기 질환의 백신에 보조제로서 첨가하는 것이다.
본 발명은 또한 (1) 스핀고신 또는 스핀고신 염 착체의 미셀, 또는 (2) 레티놀산 또는 그의 유도체의 미셀을 함유하며, 다음 특성 (a) - (c)중 적어도 하나의 특성을 갖는 조성물을 제공한다:
(a)시험관내또는생체내에서 단구 및 대식세포를 자극하여 하나 이상의 사이토킨을 생산할 수 있거나;
(b)시험관내또는생체내에서 단구 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있거나; 또는
(c) 악성 세포주에 대해 항-증식 작용을 갖는 것.
미셀은 또한 디아실 글리세리드 또는 레시틴을 포함할 수도 있으며, 또 담즙산 염, 그리고 암모늄 또는 알킬 암모늄 이온의 공급원을 더 포함할 수 있다.
마지막으로 본 발명은 또한 (1) 스핀고신, 담즙산염, 그리고 암모늄 또는 알킬 암모늄 이온의 공급원, (2) 담즙산염, 스핀고신, 디아실 글리세롤, 암모늄 또는 알킬 암모늄 이온의 공급원 및 레티놀 유도체, (3) 디아실 글리세리드, 레시틴 및 담즙산 염, 또는 (4) (a) 디아실 글리세리드, (b) 레시틴, 및 (c) 뮤신 가수분해 산물 또는 프로테오글리칸 가수분해 산물을 함유하며, 다음 특성 (a) - (c)중 적어도 하나의 특성을 갖는 조성물을 포함한다.
(a)시험관내또는생체내에서 단구 및 대식세포를 자극하여 하나 이상의 사이토킨을 생산할 수 있거나;
(b)시험관내또는생체내에서 단구 또는 대식세포를 자극하여 종양괴사인자를 생산할 수 있거나; 또는
(c) 악성 세포주에 대해 항-증식 작용을 갖는 것.
발명의 요약
본 발명자들은 담즙이 대식세포와 단구와 같은 면역계 세포를 활성화할 수 있는 조성물의 중요한 제공원이며, 각종 암, 특히 췌장암과 악성 흑색종을 치료하는데 효과적이라는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명의 조성물이 예를 들어 대식세포로부터시험관내(in vitro)및생체내(in vivo)에서 모두 TNF 생산을 자극할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 성질은 감염성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 면역조절 작용(특히 TNF-α 생산을 감소시키는 방향으로 조절하거나 또는 억제하는 능력)이 자가면역 질환 및 염증성 질환과 장애와 같은 다른 면역계-관련 장애의 치료에도 유용하게 이용될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명의 담즙 조성물은 어린이 질환에 대한 백신용 보조 첨가제로서, 그리고 예를 들어 이종이식(異種移植)에 관련된 거부 현상에 대한 보호제로서도 유용하다고 믿어진다.
본 발명의 담즙 조성물은 담즙을 수용성 용매 또는 수혼화성 용매로 추출하여 얻는다. 이렇게 얻어진 추출물은 불필요하거나 바람직하지 않은 성분을 제거하기 위해 더 처리될 수 있다.
하기에 보다 상세히 설명된 방법대로 담즙을 추출하여 얻는 물질은 TNF-자극 활성(또는 공급원의 종(種 )에 따라 TNF-억제 활성)을 가지며, 암, 감염, 자가면역 장애, 및 염증성 장애에 대한 활성을 갖는 것으로 믿어진다. 특히, 본 발명의 담즙 추출물은 췌장암 및 다른 암에 대해 특히 활성을 갖는 것으로 믿어진다.
분명한 것은, 상기한 활성을 얻기 위해 전체 조성물이 모두 필요한 것은 아니라는 것이다. 따라서, 이렇게 하여 얻어진 산물을 더 분리, 분획화 또는 다른 방법으로 처리하는 것이 가능하며, 예를 들어 여러 질환의 근저를 이루는 면역계 장애에 대항할 수 있도록 TNF 생산을 자극할 수 있는 능력을 유지할 수 있다. 또한, TNF 생성을 자극하고 면역계 장애에 대항할 수 있는 동일 또는 유사한 능력을 갖는 산물을 합성법에 의해 얻는 것도 가능하리라고 예측된다. 즉, 본 발명의 산물의 성분을 동정하고 분석하여 다른 여러 생물학적 작용중에서도 면역계 장애에 대항하여 작용하는 능력 및 TNF 자극의 특성에 관여하는 것들을 확인할 수 있으리라 예측된다. 나아가 이러한 동정과 분석은 합성 형태의 산물을 제조하는데도 이용될 수 있으리라 예측된다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명은 3000 달톤 미만의 소분자량 성분을 포함하며 다음과 같은 특성중 하나 이상을 갖고:
a) 동물의 담즙에서 추출가능하며;
b)시험관내또는생체내에서 대식세포와 단구를 자극할 수 있고;
c) 종양괴사인자 생산을 조절할 수 있으며;
d) LI-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ을 측정가능한 농도로는 함유하지 않고;
e) 악성 세포주에서 항-증식 작용을 가지며;
f) 인간 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cell) 또는 임파구에 대해 세포독성을 나타내지 않고;
g) 엔도톡신이 아니며;
면역조절제로 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 조성물은 소의 담즙으로부터 추출되며 TNF의 방출을 자극할 수 있다.
본 발명의 조성물은 (a) 동물, 바람직하게는 소의 담즙을 수용성 용매 또는 물과 혼화되는 용매, 바람직하게는 알콜, 그리고 바람직하게는 동부피의 알콜과 혼합하여 담즙/알콜 용액을 얻는 단계; (b) 바람직하게는 알콜-가용성 분획인 용액을 분리해내고, 열을 가하는 등의 수단을 이용하여 대부분의 알콜을 제거하는 것에 의해 상기 용액으로부터 실질적으로(substantially) 알콜을 함유하지 않는 용액을 단리하는 단계; (c) 상기 용액으로부터 담즙 색소를 제거하여 투명한 황색(yellowish) 액체를 수득하는 단계; (d) 투명한 황색 액체를 임의로 처리하여 잔류 알콜을 실질적으로 모두 제거하는 단계; (e) 상기 투명한 황색 액체를 에테르로 추출하므로써 지방 유기 물질을 제거하고 수상을 단리하는 단계; 및 (f) 임의로 상기 수상으로부터 잔류 에테르를 제거하는 단계에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 추가의 조작 없이 간단히 바이알에 충전하고 멸균하여 사용할 수 있다. 이 조성물은 농축된 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 농축형태는 다음과 같이 제조된다. 상기에서 설명한 공정중에서 (e) 단계를 실시하기 전에, 투명한 황색 액체를 담즙/알콜 용액의 부피의 약 8/1이 되는 정도로 임의로 농축하고, 단계 (f)를 실시한 후에 수상을 농축하여 담즙/에탄올 용액의 부피의 1/10이 되도록 할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역조절 조성물을 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 환자에게 유효향의 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 환자의 치료(treatment) 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역반응의 조절을 필요로 하는 상태 및 질환; 바람직하게는 감염성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 백신화, 이종이식에 관련된 거부현상 및 신성형의 예방 및 처치에 사용하는 본 발명 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 이들 측면 및 기타 다른 측면들은 후술하는 상세한 설명 및 첨부 도면을 참고로 할 때 잘 드러날 것이다. 또한 본 발명에서는 여러 문헌들을 참조하고 있는데, 이들 문헌은 그 내용 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에서 인용되고 있는 것이다.
하기의 비제한적인 예들은 본 발명을 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
이 실시예는 본 발명의 조성물을 제조하는 것을 설명한다.
연령이 1.5년 이상인 건강한 소(웅성 및 자성)에서 꺼낸 담낭으로부터 소의 담즙을 수집하였다. dlef 소를 허가받고 검사완료된 도살장에서 식육으로 사용할 목적으로 도살하였다. 동물들은 도살 전에 건강상태에 대해 검사 및 평가를 하였고, 담낭을 간으로부터 분리하여 수의사로 하여금 검사하게 하여 담낭이 기생충을 갖고 있지 않고 감염되어 있지 않다는 것을 확인하므로써 본 발명의 담즙 제공원으로서 사용하기에 적절한 지를 확인하였다.
이러한 검사를 통과한 담낭을 다음 절차에 따라 처리하였다:
70% 에탄올 용액으로 담낭을 씻어내어 담낭의 외부를 소독하고, 주사기를 이용하여 담낭으로부터 담즙을 취하였다. 수의사로 하여금 주사기 내부에 있는 담즙을 시각적으로 검사하게 하여 혈액이나 고름이 섞여있지 않고 만족스럽다는 것을 확인하였다. 건강한 소에서 채취한 담즙은 피나 고름을 실질적으로 포함하지 않는 녹색 액체이다. 담즙을 채취한 동물로부터 간, 췌장 및 임파절의 색소들을 수집하고, 그 색소들에 대해 기생충의 유무 및 다른 질환의 징후가 있는 지를 검사하였다.
뚜렷하게 구분되는 담낭을 갖지 않는 종(예를 들어 상어)의 경우에는, 간 기관으로부터 직접 담즙을 얻는다.
만족스러운 것으로 평가된 담즙을 에탄올을 함유하는 눈금이 매겨진 황갈색 병에 옮겨 50% 담즙/50% 에탄올 용액(부피비)을 얻는다. 담즙/에탄올 용액은 실질적으로 외부 물질을 함유하지 않는 녹색을 띄는 액체이며, 미국약전 XXII, Part B (1994)에 언급된 방법에 따라 에탄올에 대해 양성의 시험결과를 나타냈다. 병에 각각 로트 번호를 부쳤다. 각 로트마다 최소한 50마리의 동물로부터 채취한 담즙을 수집하였다.
담즙/에탄올 20±2℃에서 2.5시간 이상동안 4200rpm에서 원심분리하였다.상층액을 경사분리해내어 예를 들면 2.5㎛ 보유능을 갖는 필터를 이용하여 여과하고, pH 및 에탄올 함량을 검사하였다. 경사분리된 액체를 활성탄으로 처리하였다. 처리된 액체에 대해 280㎚에서의 광학밀도 및 전도도를 검사하였다. 상기에서 정의한 특정 범위를 벗어나는 OD 값 및/또는 전도도가 얻어진 경우에는 이들 값이 특정 범위에 들때까지 활성탄으로 추가처리하는 것이 필요하다.
활성탄 처리 이후에, 처리된 액체를 예를 들면 2.5㎛ 보유능을 갖는 필터를 이용하여 여과하고, (예를 들어 약 85℃로 가열하므로써) 에탄올을 증발시키고, 처리된 액체를 담즙/에탄올 용액의 최초 부피의 약 1/8이 되도록 농축시켰다. 농축된 액체를 20~25℃로 냉각하고, 예를 들면 2.5㎛ 보유능을 갖는 필터를 이용하여 여과하고, 에틸 에테르와 혼합한 후 에테르 층을 경사분리해내었다. 이런 절차를 1회 더 반복하였다. 수층을 가열하여(예를 들어 약 55℃로 약 10시간동안 가열하여) 잔류 에테르를 제거하고 약 80~85℃로 가열하여 담즙/에탄올 최초 부피의 약 1/10이 되도록 농축시켰다. 얻어진 조성물에 대해 외관, 생물학적 활성 및 에탄올과 에테르의 함량을 검사하였다. 조성물은 실질적으로 외부 물질을 함유하고 있지 않으며, 10ppm 미만의 에탄올과 5ppm 미만의 에테르를 함유하는 투명한 황색 용액이다.
역상 고압 액체 크로마토그래피(역상 HPLC)를 이용하여 동일성 및 순도를 측정하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같은, 말초 혈액 단핵세포-종양괴사인자 분석법 (PBMN-TNF 분석법 또는 간단히 TNF 분석법)을 이용하여 효능을 분석하였다.
초기 배치(batch)의 본 발명 조성물은 완충되지 않은 용액으로서 제조하였다, 그 이후의 배치에서는 완충제로서 염산(1%) 용액과 수산화나트륨(1% 용액)을 이용하거나, 또는 이염기성 및 일염기성 인산나트륨염을 이용하여 조성물의 pH를 약 7.4±0.2로 조정하므로써 완충된 액체의 형태로 제조하였다. 104±2℃에서 60분간 증기 오토클레이브내에서 생물부담 환원(bioburden reduction)을 실시하였다. 총요액을 5㎖ 또는 10㎖ 멸균병에 담고 마개를 하였다. 충전이 완료된 후 마개를 막은 병에 대해 104±2℃에서 60분간 오토클레이브하고 이어 35℃에서 23±1시간동안 보온하는 절차로 이루어진 멸균 사이클을 3회 실시하였다. 각 멸균 사이클 (오토클레이브 + 보온)의 사이마다, 시료를 채취하여 생물부담을 평가하였다. 마지막 회의 멸균을 행한 후에는, 병을 흑백 배경에 대해 시각적으로 검사하여 침전물이 있는 지를 검사하였다.
검사후에, 로트로부터 시료를 채취하여 규격에 맞는지를 검사하였다. 검사항목에는 동일성, 멸균도, 발열원성, 엔도톡신, 생물검정, HPLC 및 일반적인 안전성이 포함된다. 표 1은 본 발명의 담즙 추출물에 대해 행해진 여러 시험의 결과를 요약해놓은 것이며, 필요한 경우 정상치의 범위를 기재하였다.
실시예 1의 방법에 따라 얻은 배치 조성물의 특성
최종 산물 시험 배치# BCO248 배치# BCO249 배치# BCO250
효능 (pg/㎖)*동일성/순도 (기준과 동일)안전성 (81 CFR §610.11에 따른 시험에 합격)발열원성 (체온이 0.4℃를 초과하지 않아야 함)내독소 ≤ 0.4EU/㎖멸균도(생육 무)pH(7.40±0.2)외관 - 시각관찰(침전물이 적거나 없는 투명한 옅은 황색 액체)외관 - OD(시험에 합격)삼투압( 1000)고형분(23 +/- 7㎎/㎖)에탄올(10ppm 초과하지 말아야 함)에틸 에테르(5ppm 초과하지 말아야 함)전도도(35 +/- mMho) 210합격합격합격≤0.25합격7.20합격1.3487718합격합격33 183합격합격합격≤0.25합격7.27합격1.3885415합격합격35 304합격합격합격≤0.25합격7.22합격1.8583220합격합격38
*효능은 실시예 2에 기재된 단구/대식세포 활성화와 관련하여 측정하였으며; 정상적인 TNF-α방출은 적어도 1000pg/㎖이다.
따라서 본 발명의 조성물은 손쉽게 구할수 있는 담즙 공급원으로부터, 표준 실험실법을 이용하여 표준화된 최종 산물의 형태로 제조할 수 있다.
실시예 2
이 실시예는 실시예 1의 조성물의 생물학적 활성을 설명한다.
말호 혈액 단핵 세포(PBMN) 및 /또는 (안정한 전-단구(pre-monocyte) 세포주인 U937 세포 (미국 매릴랜드 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC))로부터 사이토킨이 방출되는 것에 미치는 실시예 1의 조성물의 작용을 평가하였다. TNF-α, IL-1a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF 및 IFN에 대해 ELISA 분석을 행하였다. 이들 연구는 실시예 1에 따라 제조된 각 배치의 담즙 추출물의 효능을 정량적으로 평가하기 위한 표준화 시험의 기초를 제공하게 되는데, 이 시험은 담즙 추출물 또는 그의 성분이나 성분들이 PBMN 또는 U937 세포에서 TNF-α 생산을 자극하는 능력을 평가하는 시험이다.
다섯명의 건강한 인간에게서 채취한 전혈을 헤파린처리한 배큐테이너 튜브(heparinized Vacutanier tubes; 캐나다의 Beckton Dickinson)에 넣었다. 피콜-하이파크(Pharmacia) 상에서 농도구배 원심분리하여 PBMN을 단리하였다. PBMN을 인산-완충 생리액(PBS)으로 2회 세척하고, 계수한 후 RPMI 1640 배지(Gibco Labs)에 106세포/0.5㎖의 농도로 재현탁시켰다. 이들 세포를 24-웰 평편바닥 조직배양판 (Falcon, Boston, Dickinson)에서 배양하였다. PBMN 현탁액의 표본분획 0.5㎖를 각 웰에 넣었다. 이때 각 웰에는 하기 표에 기재된 것처럼 50ng 리포다당류(LPS;이. 콜리에서 유래), 10㎕의 태내 송아지 혈청 및 실시예 1의 조성물 10~300㎕가 포함되어 있다. 조성물의 고삼투압(hyperosmolar) 효과는 사용된 조성물의 부피의 10%에 해당하는 부피의 증류수를 배양 웰에 첨가하는 것에 의해 중화시켰다. 이어 RPMI를 이용하여 총 부피를 1 ㎖/웰로 만들었다. PBS는 대조군으로 사용되었다. 세포를 가습 조건의 5% CO2배양기에서 37℃에서 2, 6, 24, 48 및 72시간동안 배양하였다. 각 배양기간이 끝나면 세포를 수확하고, 9000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포-무함유 배양액을 얻었다. 시료를 사이토킨을 정량하기 위해 ELISA와 같은 면역분석에 이용할 때까지 -70℃에서 2주 미만으로 저장하였다.
실시예 1의 조성물을 각 웰당 100㎕ 및 200㎕의 양으로 이용하여 인간 PBMN을 자극한 후에 상층액에서의 사이토킨 합성을 측정하였다. 초기 조성물 제제는 사이토킨 합성에 대해 전혀 직접적인(즉, LPS 함유하지 않음) 자극 작용을 나타내지 않았다. 작용을 나타내는 경우에라도, 사이토킨 생산은 PBMN를 첨가물 없는 배지에서 배양했을 때 얻게되는 본질적 수준(constitutive level) 이하를 나타내었다.
24시간 후, 사이토킨 합성에 대한 실시예 1의 조성물의 직접적인 영향사이토킨 방출량(pg/㎖)1
분석된 사이토킨 중재물질 조성물 LPS
100㎕ 200㎕ 1㎍
IL-1α 61.6±12 59.6±7.8 54.3±6.0 315±117
IL-1β 199±184 218±165 188±174 965±99
TNF2 203±149 151±117 107±120 1501±284
IL-6 928±776 853±673 829±543 2016±41
IL-8 126±703 94±503 77±413 361±1653
GM-CSF 13±4 13±7 15±11 54±20
IFN-γ 11±18 9±14 5±6 54±94
IL-4 ＜3.0 ＜3.0 ＜3.0 ＜3.0
(주)1: 환자 8명 시료 2부의 중간값2: 환자 7명 시료 2부의 중간값3: ng/㎖
실시예 1의 조성물과 LPS를 병용하되 (또는 양성 대조군으로서 LPS를 단독으로 사용하여) 실시예 1의 조성물을 각 웰당 100㎕ 및 200㎕의 양으로 이용하여 인간 PBMN을 자극한 후에 상층액에서의 사이토킨 합성을 측정하였다. 최소 5pg/㎖의 사이토킨을 검출해내는 TNF-α ELISA 키트 (Endogen, Inc.)를 이용하여 TNF를 측정하였다. 본 발명에서 사용된 다른 ELISA 면역분석 키트는 다음의 것을 포함한다: IL-1α(Endogen, Inc.); GM-CSF(Endogen, Inc.); RFN-α(Endogen, Inc.); IL-2(Advanced Magnetics, Inc.); IL-6(Advanced Magnetics, Inc.); IL-1(Advanced Magnetics, Inc.); IL-4(RD Systems); 및 IL-8(RD Systems). 실험 결과는 TNF가 상층액에 존재하는 주요 사이토킨이며, 소량의 IL-1β 및 GM-CSF가 포함되어 있음을 시사한다.
여러 배치의 실시예 1의 조성물에 대해 LPS-유도 TNF 방출에 미치는 영향을 조사하였다. 요약하면, 동일한 동물로부터 동일한 방법으로 제조한 여러 배치의 조성물들이 동일한 효과를 유도한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 조성물의 제조방법을 바꾸거나 서로 다른 종의 동물로터 제조한 조성물을 사용하면 서로 다른 효과가 얻어진다. 예를 들어, 표 3에 나타낸 것처럼 배치 B29/3006, B0213, BC0241, BC0241, BC0241-01, BC0242(B = 소) 및 C0203(염소)는 LPS 단독에 의해 유도되는 것보다 강력한 TNF 방출 효과를 나타내는 한편, 배치 013/2109(양)은 모든 시험 용량에서 TNF 방출을 가장 적게 자극하였다. 반면, 배치 R0201(상어)는 도거의 대부분의 시험 용량에서 TNF 방출을 억제하였다. 표 3에 나타낸 TNF 값은 LPS에 의해 형성된 자극과 실시예 1의 조성물과의 병용에 의해 형성되고 LPS 단독에 의해 형성된 자극보다 낮은 자극에 있어 TNF-α 방출의 차이의 값으로서 게산되었다.
PBMNs로부터의 LPS-유도 TNF 방출에 대한 실시예 1의 조성물의 효과
배치 조성물의 부피(㎕) TNF(pg/㎖)
HO213 10100200 193±161858±8192131±1742
B29/3006 1050100200 121±102422±78834±8112252±676
CO203 1050100200 101±47643±2312650±13721851±980
BCO241 102550100200 199201162339552
BCO241-01 102550100200 170180219223589
BCO242 102550100200 294401409603574
O13/2109 50200300 -9±73179±162178±373
RO201 50200300 145±256-370±385-400±185
실시예 1의 조성물이 인간 PBMN으로부터의 LPS-유도 TNF 방출에 영향을 주는 것과 관련하여, 조성물이 시간에 따라 PBMN으로부터의 LPS-유도 TNF 방출에 미치는 조성물의 영향을 조사하기 위하여 일련의 실험을 행하였다.
시간 경과에 따른 PBMNs로부터의 LPS-유도 TNF 방출에 대한실시예 1의 조성물(배치 B0213)의 효과
시간(hrs) LPS 단독(50ng/㎖) LPS＋조성물(100㎕)
2 697±94 693±339
6 2006±736 1949±442
24 800±222 2301±658
48 170±149 1419±447
72 132±147 945±367
표 4는 PBMN으로부터의 TNF의 방출이 2시간째까지 697pg/㎖에 도달했다가 6시간째에 약 2006pg/㎖로서 피크에 달하는 것을 보여준다. 24시간, 48시간 및 72시간째에, TNF 방출은 서서히 감소된다. 사실 48시간 및 72시간째에는, LPS-유도 PBMN으로부터의 TNF 방출은 본질적 수준을 겨우 넘는다. 반면, 배치 B0213의 조성물과 배합한 LPS는 TNF 방출의 강력한 자극제이며, LPS의 자극효과가 떨어지기 시작하는 시점인 24시간째에 피크 TNF 방출을 유도한다. LPS 단독사용과 달리, 배치 B0213 조성물과 병용하는 LPS는 48시간째 및 72시간째에도 계속하여 본질적 생산 수준을 훨씬 초과하는 수준으로 TNF 방출을 자극하였다. 이러한 결과는 배치 B0213의 실시예 1의 조성물이 장시간에 걸쳐 TNF 생산을 자극하는데 효과적이라는 것을 보여준다.
상어로부터 유도되며 TNF 방출의 억제물질인 배치 R0201의 조성물은 2, 6 및 24시간째에 TNF 방출을 현저하게 억제하였다. 48시간째 및 72시간째에는, 배치 R0201은 최저 수준의 양성 효과 또는 음성 효과를 나타내었다.
요약하면, 상기 결과는 몇몇 배치의 조성물(예, 상어로부터 얻은 것)은 LPS-유도 PBMN로부터의 TNF 방출을 억제하는 반면, 소, 염소 및 양으로부터 얻은 것과 같은 다른 배치의 조성물은 LPS-유도 TNF 방출을 자극함을 보여준다. 결론적으로, 본 발명의 조성물은 TNF 생산을 양성 및 음성적인 방법 모두로 조절할 수 있다. 요약된 데이터를 도 5 및 표 5에 나타내었다.
실시예 1 조성물의 자극효과 및 억제 효과 정리
배치 # 근원 보통 또는 농축 완충액 TNF 방출
BO213 소 보통 Y 자극
CO203 염소 보통 Y 자극
13/2109 양 농축 Y 자극
RO201 상어 보통 Y 억제
B29/3006 소 보통 Y 자극
B27/2806 소 보통 Y 자극
B15/1606 소 농축 Y 자극
실시예 1의 조성물 100㎕ alc LPS 50ng을 이용하여 상술한 바 있는 PBMN-TNF 분석을 표준화하였다. 3인의 서로 다른 사람으로부터 상술한 방법에 따라 PBMN을 얻고, 그와 동일한 날에 사용하였다.(각 개인의 세포를 이용하여 실시한) 3회의 분석시험의 각 결과를 평균하여 개인차에 따른 반응의 편차를 보상하였다. 이 분석은 50 ng의 LPS의 존재하에, 그리고 RPMI 배지 단독에서 방출되는 TNF-α의 양을 측정하는 것을 포함하고 있다. 50ng의 LPS와 함께 사용한 실시예 1의 조성물 100의 존재하에 방출되는 TNF-α의 양도 측정하였다. 배지에 방출된 TNF-α를 LPS 값으로부터 빼서 LPS 단독 존재하에 방출된 TNF-α의 양을 얻었다. 조성물과 LPS를 함께 사용하여 얻은 값으로부터 배지 및 LPS 값을 빼서, 조성물 단독(pg/㎖로 표시) 존재하에 방출된 TNF-α의 양을 얻었다. 따라서, TNF 방출 분석법은 담즙 추출물의 효능을 정량화하는데 사용된다.
본 발명의 조성물은 또한 원래 조직구성 임파종(histocytic lymphoma)을 가진 환자에게서 유도된 U937 세포로부터 TNF-α 방출을 자극하며 많은 단구적 특성을 나타낸다. U937 세포는 ATCC에서 입수할 수 있다. 이 세포는 보통 10% 열-불활성화 내태 송아지 혈청(FCS, Gibco), 2mM L-글루타민(ICN Biomedical Inc, Costa Mesa, CA) 및 10㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트(Sigma, 캐나다 온타리오 미시사우가)를 보충한 RPMI-1640 배지 (Gibco, 뉴욕 그랜드 아일랠드)에서 37℃, 5% CO2의 조건하에 유지된다. 매 3-4일마다 U937세포의 계대배양을 실시하고, 종접종은 초기 농도 5 x 105세포/㎖의 농도로 행하였다. U937 세포는 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA; Sigma Chemical Co., 미주리 세인트루이스)에 노출시키므로써 분화되도록 자극할 수 있다. 얻어진 단구는 실시예 1의 조성물 단독에 의해 또는 조성물과 LPS와의 병용사용에 의한 자극을 받으면 TNF를 방출할 수 있다.
PMA를 먼저 10mM 농도로 디메틸 설폭시드 (DMSO, Sigma)에 용해시킨 후 PBS를 이용하여 1000배 희석하여 농도 10μM의 저장용액을 제조하고, 이를 -20℃에서 저장하였다. U937 세포 현탁액을 350×g, 실온에서 10분간 원심분리하고, 새로운 완전 RPMI-1640 배지에 2×106세포/㎖의 농도로 재구성하였다. 트립판 블루 배제법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였는데 통상적으로 95% 이상이었다. PMA를 완전 배지를 이용하여 500배 더 희석하여 20nM 농도로 만들었다.
U937 세포의 표본분획 0.5㎖ (106세포/㎖)를 24-웰의 평편바닥 조직배양판 (Becton Dickinson, 뉴저지 링컨 파크)에서 0.5㎖의 PMA (20 nM)의 존재하에 또는 부재하에 배양하고 37℃, 5% CO2조건에서 보온하였다. 각 웰당 최종 농도는 5×105세포이고 10nM PMA이었다.
72시간동안 보온한 후, 120㎕의 배지를 제거하고, 10㎕의 LPS (5 ng/㎕)의 존재 또는 부재하에, 실시예 1의 조성물 100㎕와 멸균 탈이온수 10㎕로 대체하였다. 24시간동안 보온한 후, 350×g에서 10분간 원심분리하여 모든 세포와 입자성 물질을 펠릿화하고, 얻어진 상층액을 TNF-α 분석에 이용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 버룰리진(Virulizin) 시료 모두에 대해 2회씩 별도로 시험하였다.
엔도젠(Cedarlane Laboratories, 온타리오 혼비)으로부터 구입한 TNF-α ELISA 키트를 이용하여 2 부위 샌드위치 ELISA (two-site sandwich ELISA)를 실시하므로써 U937 세포 배양 상층액중의 TNF-α를 정량하였다. 제작자에 의해 추천된 프로토콜을 이용하였다. 간단히 설명하면, 항 인간 TNF-α로 예비코팅된 96-웰 플레이트에 100㎕의 TNF-α 표준품 및 시험 시료를 첨가하고, 37℃, 5% CO2조건하에서 3시간동안 보온하였다. 세척용 완충액으로 철저하게 세척한 후, 알칼리성 포스파타제에 접합된 항 인간 TNF-α 100㎕를 플레이트에 넣고 37℃, 5% CO2조건하에서 2시간동안 보온하였다. 보온후, 플레이트를 상기한 방법으로 세척하고 각 웰당 100㎕의 TMB 기질 프리믹스를 첨가한 후, 실온의 암소(暗所)에서 30분간 효소적 발색반응이 일어나도록 하였다. 이어 각 웰당 100㎕씩의 중지 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고, SLT Lab Instrument ELISA 판독기를 이용하여 450㎚에서 판독하였다. 분석의 검출한계는 5pg/㎖이다.
U937 세포에 대한 TNF 값은 PBMN 세포에 대해 설명한 것과 같은 방법으로 측정하였다. 50ng의 LPS를 이용한 시험한 조성물의 결과를 표 3에 나타내었다.
U937 세포로부터의 TNF 방출에 대한 조성물의 효과
조성물 배치 #(100㎕) TNF(pg/㎖)
BC0241 4900
BC0241-01 4028
BC0242 6746
BC0247 5534
BC0248 6053
BC0249 5540
BC0250 5794
실시예 3
이 실시예는 실시예 1의 조성물의 물리적, 화학적 및 생화학적 특성을 설명한다.
실시예 1에 따라 제조된 세 개의 다른 배치의 조성물에 대해 전도성, 삼투압, 및 총 고형분 등의 물리화학적 특성을 측정하였다. 표 1에 정리된 결과는 제조된 제품의 멸균성, 효능 및 재현가능성을 입증하며, 따라서 제품 규격을 제공한다. 에탄올 및 에틸 에테르 시험은 공정중 시험만을 행하였다. 효능, 즉 TNF 방출은 실시예 2에 기재된 방법대로 측정하였다. 특성을 측정하는데 사용된 방법을 하기 표에 나타내었다.
제품으로서의 실시예 1 조성물의 특성
시험항목 시험결과 방법
효능(Potency) ＞ 100pg/㎖ TNF-α 단구/대식세포 활성화: TNF-α 방출
동일성(Identity)/순도 기준에 적합함 HPLC
안전성 시험 통과 일반 안전성 시험(쥐와 구아니아 돼지)(21 C.F.R.S 610.11)
발열성(pyrogenicity) 온도가 0.4℃를 초과하지 않음 발열시험(토끼) USP
내독소(endotoxin) ＜ 2EU/㎖ 리뮬러스 변형세포 리세이트 테스트USP
불임증(sterility) 성장하지 않음 불임증 테스트
pH 7.40±0.2 pH 테스트 USP
외관 침전물이 거의 없는맑고 옅은 노란색의 액체 육안 검사
고체 23±7㎎/㎖ 동결건조
삼투압 ＜ 1000mOsm 빙점 압축 USP
에틸알콜 10ppm 이하 직접 주입 기체 크로마토그래피
에틸에테르 5ppm 이하 직접 주입 기페 크로마토그래피
전도율(conductivity) 35 ± 5 mMHO 코펜하겐 복사계 모델
전도성, 삼투압 및 총 고형분과 같은 물리적 성질 및 화학적 성질들은 99% 이상이 염인 조성물과 일치한다. 조성물중의 고형분의 1% 미만이 유기물질이며, 고형분중 대략 반은 탄수화물이고, 나머지가 아미노산, 지질 및 인지질이다. 단백질과 펩티드도 존재하였다. SDS 겔 전기영동은 조성물 중에 단백질보다 펩티드가 더 많이 존재한다는 것을 확인해주었다. 고분자량 물질은 검출되지 않았다.
본 발명의 조성물에 대해 행해진 HPLC 및 생물검정법들은 완충처리된 액체 및 농축 제제 형태의 제품을 특성화하기 위해 이용되었다. 후술하는 HPLC 결과는 시험에 제공된 모든 제품이 동일하다는 것을 시사한다.
실시예 1의 조성물을 특성화하는 데에는 직렬 칼럼의 역상 HPLC 법이 이용되었다. 이 방법에 있어서는, 시료를 동결건조한 후 완충액 A(0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA))에 재구성하고, 이어 프라임-스피어 HC-C18 칼럼(250×4.6㎜; 캘리포니아의 Phenomenex)과 직렬로 연결된 WP60009-C18 칼럼 (W-Pore C18, 250×4.6㎜; Phenomenex)상에서 용출시켰다. 칼럼은 0.9 ㎖/분의 유속에서 완충액 A와 완충액 B (100% 아세토니트릴에 용해시킨 0.1% TFA)를 이용하여 주변온도에서 실시하였다. 첫 번째 칼럼에 150㎕의 시료를 넣고 완충액 A를 20분간 통액하였다. 이어 0 - 80% 완충액 B를 35분에 걸쳐 통액하여 첫 번째의 직선 구배를 형성하고, 이어 80 - 0% 완충액 B를 5분에 걸쳐 통액하여 두 번째의 직선 구배를 형성하였다. 용출되어 나온 화합물들은 190~284㎚에서 흡광도를 측정하여 검출하였는데, 대부분의 화합물들은 210~235㎚에서 검출되었다.
실시예 1의 조성물은 피크가 보이는 역상 HPLC에서 일정하게 재현가능한 패턴을 보여준다. 세 로트의 본 발명 조성물에 대한 역상 HPLC 결과는 각각 도 1 - 3에 나타내었다.
실시예 1에서와 같은 방법으로 제조하여 각각 A-F로 표지를 붙인 6개 배치의 담즙 추출물에 대해 생리학적 모드에서 작동하는 LKB 4151 Alphaplus 아미노산 분석기를 이용하여 아미노산 프로필을 분석하였다. 칼럼후 검출은 닌히드린을 이용하여 행한다. nmoles/100㎕의 단위로 나타낸 결과는 표 8에 나타내었다.
실시예 1의 조성물의 아미노산 및 요소 프로파일
아미노산과 요소 A B C D E F
P-세린(Ser) 0.342 0.429 0.473 3.239 1.454 1.048
타우린(Tau) 3.438 8.325 2.515 11.297 23.005 47.019
요소 23.318 35.224 146.806 608.984 98.489 115.26
아스파라긴산(Asp) 0.606 1.060 1.163 - - -
트레오닌(Thr) 0.649 0.483 - 0.345 12.646 1.548
세린(Ser) 1.104 0.833 0.452 0.821 - -
글루타민산(Glu) 2.112 8.257 8.029 13.333 36.169 43.632
글리신(Gly) 5.465 15.667 6.341 12.625 38.842 82.418
알라닌(Ala) 2.634 4.449 3.572 6.093 32.662 23.202
발린(Val) 0.942 0.645 0.550 1.311 15.521 4.362
이소로이신(Ile) - - - - 3.089 -
로이신(Leu) - - 0.186 1.079 7.300 1.197
β-알라닌(Ala) 0.387 0.503 0.450 1.060 1.461 2.640
오르니틴(Orn) - - - 0.102 0.412 0.336
시료 A-F에 대해 소 DNA가 존재하는 지를 평가하였다. 소 게놈 DNA로부터 생성시킨32P-표지화 소 DNA 탐침을 이용하여 시료들을 검사하였다. 이 분석에는 시료, 스파이크화 시료, 음성 및 양성 대조군 및 표준품이 포함되어 있다. 연구는 GLP 규정에 따라 실시되었다. 이 분석에 의해 기준이 되는 표준 DNA 3.0pg이 검출되었다. 각 시료는 4pg/㎖ 미만의 DNA를 포함하는 것으로 계산되었다.
시료 A-F에 대해 각종 전해질이 존재하는 지의 여부에 대해 검사하였다. 이 분석은 토론토 대학교 임상 생화학과 바이오테크놀로지 서비스 센터에 의해 실시되었다. 결과는 mmole/ℓ의 단위로 표시하여 표 9에 나타내었다.
실시예 1의 조성물의 전해질 함량
전해질 A B C D E F
Na 55 68 127 359 250 309
K 0.9 0.9 2.5 10.2 3.6 4.2
Ca 0.06 0.10 0.006 0.2 0.13 0.27
Mg 0.25 0.15 0.09 0.35 0.14 0.17
Cl 50 59 118 386 207 263
PO4 0.06 0.03 0.05 0.27 0.18 0.24
SO4 2.17 1.89 2.05 1.15 7.13 11.36
시료 A-F에 대해 표준 조건하에서 유도결합된 질량분석법(IPS-MS)를 이용하여 반(半) 정량적 다중원소분석을 실시하였다. 결과는 ppm단위를 이용하여 표 10에 나타내었다.
실시예 1의 조성물의 원소 분석
A B C D E F
스칸듐 0.620 0.820 1.030 1.030 2.020 1.900
티타늄 0.210 0.310 0.260 0.720 0.920 1.180
바나듐 0.030 0.040 0.080 0.180 0.140 0.160
크롬 0.030 0.040 0.060 0.080 0.170 0.190
철 0.300 0.380 0.510 4.310 0.690 0.760
망간 0.020 0.020 0.030 0.630 0.050 0.060
니켈 ＜det ＜det 0.030 0.250 0.130 0.160
코발트 ＜det ＜det 0.001 0.013 0.003 0.005
구리 0.700 0.940 0.840 1.520 2.140 2.470
아연 15.600 18.300 8.800 0.830 29.800 32.900
갈륨 0.008 0.008 0.004 0.003 0.013 0.015
셀레늄 1.020 1.590 2.060 7.710 3.810 7.860
비소 0.030 0.070 0.100 0.200 0.250 0.350
스트론튬 0.010 0.010 0.020 0.060 0.040 0.050
루비듐 0.090 0.110 0.190 0.320 0.410 0.490
루테늄 ＜det 0.001 ＜det 0.001 ＜det 0.001
팔라듐 0.002 ＜det 0.003 0.005 0.003 0.003
카드뮴 ＜det ＜det ＜det 0.002 0.005 0.003
은 ＜det ＜det 0.002 0.002 0.001 ＜det
텔루륨 0.003 0.003 0.050 0.090 0.080 0.070
안티몬 ＜det 0.002 0.003 0.002 0.007 0.006
바륨 0.017 0.019 0.035 0.040 0.057 0.080
세슘 0.001 0.002 0.004 0.008 0.005 0.006
(주) 용어 ＜ det는 검출농도 미만을 의미한다.
시료 A-F에 대해 음이온 및 양이온 분석을 행하였다. 이 분석을 실시하기 위하여,물 및 폐수의 검사를 위한 APHA 표준방법, 16판, 1985 또는환경시료에 대한 분석방법에 관한 MOE 핸드북, 1983에서 권장하는 방법에 따라 시료를 준비하였다. 음이온/양이온 분석에 사용된 장치는 다음과 같다: (1) 금속분석에는 Jarrell Ash 61E ICAP emission, Perkin Elmer 3030 Zeeman Graphite Furnace, 및 Perkin Elmer 2380 Cold Vapour AA가; (2) 음이온분석에는 Dionex 2000i Ion Chromatograph가; 그리고 통상적인 분석에는 Skalar SA5 Segmented Flow Analyzer가 사용되었다. 결과는 ㎎/ℓ 단위를 이용하여 표 11에 나타내었다.
실시예 1의 조성물의 음이온 및 양이온 분석
A B C D E F
은 ＜0.007 ＜0.007 ＜0.007 ＜0.007 ＜0.007 ＜0.007
베릴륨 ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003
카드뮴 ＜0.003 ＜0.003 ＜0.003 0.004 ＜0.003 ＜0.003
비스무트 ＜0.04 ＜0.04 ＜0.04 ＜0.04 ＜0.04 ＜0.04
코발트 ＜0.005 0.005 ＜0.005 0.006 ＜0.005 ＜0.005
구리 0.013 0.036 0.043 0.138 0.112 0.210
망간 0.007 0.006 0.007 0.283 0.018 0.029
몰리브덴 0.014 0.012 0.012 0.015 ＜0.006 ＜0.006
니켈 ＜0.01 0.012 ＜0.01 0.058 0.020 0.020
납 ＜0.025 ＜0.025 ＜0.025 ＜0.025 ＜0.025 ＜0.025
스트론튬 0.01 0.019 0.015 0.126 0.040 0.063
바나듐 0.009 0.008 0.004 0.011 ＜0.003 ＜0.003
아연 6.04 5.93 1.95 0.383 14.5 15.2
텅스텐 0.587 0.436 0.315 0.435 0.498 0.481
인 10.6 11.4 3.34 676 22.8 14.1
티타늄 ＜0.003 ＜0.003 0.006 0.005 ＜0.003 0.004
바륨 0.062 0.056 0.055 0.105 0.079 0.117
크롬 0.025 0.036 0.028 0.107 0.102 0.124
나트륨 1250 1570 2770 13900 5350 6570
칼륨 30.2 32.8 65.4 686 125 154
철 0.018 0.023 0.024 0.008 0.036 0.037
알루미늄 0.240 0.238 0.052 ＜0.025 0.790 0.361
칼슘 1.22 5.34 2.00 10.2 5.04 10.4
마그네슘 0.757 0.756 0.891 15.8 2.27 3.70
불화물 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100
염화물 2120 1860 3110 30400 10900 9110
황산염 144 154 152 332 1150 1590
인산염-P 1.8 1.3 1.5 ＜det ＜det ＜det
질산염-N으로 환산 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10
아질산염-N으로 환산 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100
브롬화물 ＜35 ＜35 ＜35 ＜35 ＜35 ＜35
암모니아-N으로 환산 98.0 125 130 492 425 592
세포증식 및 세포분화와 같은 많은 세포 현상의 조절에 여러 설페이트 에스테르가 관여하기 때문에, 시료 D에 대해 산 가수분해 전후에 설페이트 이온을 분석하였다. 전체 시료 D(즉, 분획화하지 않은 시료)를 이용하면, 비가수분해 시료로부터는 1000μM 설페이트가 얻어지는 반면, 가수분해 시료로부터는 1200μM 설페이트가 얻어진다. 산가수분해 후에 설페이트 이온 농도가 증가되기 때문에, 이런 결과는 시료내에 존재하는 총 설페이트 이온중 20%가 설페이트 에스테르 임을 나타내는 것이다.
실시예 1의 조성물에 대한 물리화학적 표준을 동정하였는데, 이는 실시예 4에 기술하는 그 이전의 연구 결과와 본질적으로 일치한다. 이들 표준은 일정한 제품을 반복적으로 얻을 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 4
이 실시예는 수많은 초기 배치의 실시예 1의 조성물의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성을 설명한다.
실시예 1에 기술된 방법에 따라 여러 배치의 다담즙 추출물을 제조하였다. 덧붙여, 실시예 3에 기술된 방법을 이용하여 각 배치의 화학 조성을 결정하고 각 배치의 아미노산 분석을 행하였다. 결과를 하기 표에 나타내었다.
실시예 1 조성물의 초기 배치들의 화학조성
조성물 배치 # 고체(㎎/㎖) 아미노산류(㎍/㎖) 당류(㎍/㎖) 지질류(㎍/㎖) 고분자량＞3kD폴리펩티드(㎍/㎖)
BO201 15.3 4.59 40.85 ND NA
BO202 15.7 13.16 54.95 ND NA
BO203 15.0 72.67 25.5 ND NA
BO208 7.8 4.53 30 ND ND
BO209 8.5 2.27 24 ND ND
BO211 5.6 1.47 19.2 ND ND
BO106 32.2 1.16 32.6 ND ND
BO706 32.7 1.42 26.2 ND ND
B1306 22.3 8.01 48 ND ND
B2006 21.7 9.73 38.4 ND ND
B2306 28.5 16.35 42 ND ND
B0213 31.6 21 61 ND ND
RO201/-pH 52.5 1553 216 ND ND
RO201/+pH 55.8 1530 280 ND ND
CO203 36.1 113 42 ND ND
0-13/2109 12.1 149 36 ND ND
B27/2806 17.5 28 37 ND ND
B29/3006 28.7 26 60 ND ND
B15/1606 26.8 41 45 75 ND
(주) ND는 검출되지 않았음을 의미하며,따라서 지질 0.5㎍/㎖ 미만, 및/또는 고분자량 폴리펩티드 1.0㎍/㎖ 미만을 의미한다.NS는 분석되지 않았음을 의미한다.
실시예 1 조성물의 초기 배치들의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성
조성물 배치 # pH 전도도(mMho) 삼투압(mOsM) 흡광도(O.D. 280㎚) UV, VIS피크 활성도(Units/㎖) 효능(pg/㎖)
BO201 7.37 16.9 361 0.98 404㎚ 10.5
BO202 7.35 17.3 298 0.777 없음 6.5
BO203 7.3 17.7 360 0.67 365㎚ 21.0
BO208 7.00 16.1 250 0.453 없음 9.1
BO209 7.31 11.2 259 0.594 없음 6.7
BO211 7.35 34.9 175 0.287 없음 7.5
BO106 7.57 34.3 627 0.341 없음 17.2
BO706 7.57 11.6 627 0.387 없음 23.0
B1306 8.02 35.6 790 1.147 없음 17.0
B2006 8.56 33.9 651 1.024 없음 21.0
B2306 8.01 35.1 623 1.054 없음 19.0
B0213 7.75 29.5 628 0.48 없음 858
RO201/-pH 7.95 44.5 877 1.59 271㎚0.65O.D. NA
RO201/+pH 7.60 50.0 1162 2.29 266㎚1.6O.D. NA
CO203 7.90 34.8 657 0.96 없음 NA
0-13/2109 7.73 17.0 316 0.83 없음 NA
B27/2806 7.71 22.0 453 0.49 없음 NA
B29/3006 7.67 28.8 605 0.55 없음 NA
B15/1606 7.84 35.0 753 1.04 없음 NA
(주) 1. 배치 B0106과 B0706에 완전 등장액인 PBS 고체를 첨가하였다.2. 배치 B1306, B2006 및 B2306은 pH를 조정하지 않고 2배 농축하였다.
실시예 1 조성물의 초기 배치들의 아미노산 조성
배치 #
B-0208 B-0209 B-0211 1/06 7/06 1306 2006 2306
아스파라긴 365 113 289
세린 69 12 7 17 144 119 308
글리신 22 449 274 279 417 3731 5314 10371
히스티딘 192 90 68 938 1335 2114
아르기닌 161 533
트레오닌 19 13 30 148 142 250
알라닌 173 112 24 64 949 1002 1423
프롤린 1092 74 817 639 1075
티로신 15 55 57 43 39 205 135 45
발린 121 63 31 10 15 367 335 224
메티오닌 970 461 462 13 107 121 70
시스테인 103 90 41 12 86 49 10
이소로이신 2721 84 95 17 232 216 68
로이신 58 9 221 242 84
페닐알라닌 57 200 16 45 80 23
리신 191 36 123 6 18 15
총 아미노산㎍/㎖ 4.53 2.27 1.47 1.16 1.42 8.01 9.73 16.35
실시예 5
이 실시예는 실시예 1의 조성물의 분획들의 생물학적 활성을 설명한다.
실시예 1의 조성물의 분획들의 생물학적 활성을 검사하였다. 분석결과는 소분자량 성분(즉, 3000 달톤 미만)에 의해 제공되는 조성물의 생물학적 활성과 일치한다. 상기 분석결과는 조성물을 실시예 3에 기술된 역상 HPLC에 통액시키고 용출된 분획을 단리하고 실시예 2에 기술된 PBMN-TNF 분석법에 의해 효능을 분석하는 실험을 통해 측정하였다. 초기에 용출되는 피크(F1), 즉 5.6분 내지 6.2분 사이에 용출된 분획에서만 유의적인 활성이 검출되었는데, 이는 분자량이 3000 달톤 미만인 것과 일치하는 것이다(표 15 참조).
LPS-유도 PBMNs로부터의 TNF 방출에 대한,역상 HPLC에 의해 용리된 실시예 1 조성물의 분획들의 효과
시료 HPLC(분) 웰 당 함량 TNF-α 방출(pg/㎖) 삼투압(mOsm)
총량 -LPS
LPS - 50ng 305±79 0 304
실시예 1의 조성물 :
전체 0 100㎕ 519±195 213 415
F1 5.60-6.20 100㎕ 508±82 203 344
F2 6.20-6.55 100㎕ 149±44 -157 281
F3 6.55-7.10 100㎕ 306±80 1 309
F4 7.10-7.90 100㎕ 316±123 11 309
F5 7.90-8.40 100㎕ 390±95 84 309
F6 8.40-8.90 100㎕ 282±103 -24 311
F7 8.90-9.40 100㎕ 296±108 -10 309
F8 9.40-10.00 100㎕ 341±112 36 309
F9 10.00-10.40 100㎕ 33±139 24 308
F10 10.40-12.00 100㎕ 316±101 11 311
F11 12.00-13.60 100㎕ 354±74 49 311
F12 13.60-14.20 100㎕ 344±107 39 315
F13 14.20-15.35 100㎕ 296±117 -9 311
F14 15.35-15.75 100㎕ 344±108 39 314
F15 15.75-18.20 100㎕ 300±104 -5 313
(주) 1. 시험 환자 수 : 32. 방출된 전체 TNF-α는 RPMI 중개물(13±4pg/㎖, 306mOsm)에 의한 방출을 위해 모았다.3. HPLC 분획 1~2는 물로 채웠고, 분회 3~15는 PBS 완충액으로 채웠다.4. 직렬식 칼럼은 W-Porex C18과 프라임스페어(PrimeSphere)이었고, 둘다 페노메넥스(Phenomenex)로부터 구입하였다. 250×4.6㎜5. 웰 당 LPS 부피 : 10㎕6. 웰 당 총 부피 : 1000㎕7. 시료 부피는 동일하였다.
다음과 같이 추가적인 실험을 행하여 활성 (TNF-방출) 성분이 3500미만의 분자량 및 1000달톤 미만의 것이라는 것을 밝혔다. 문헌(Tamari et al.,Agr. Biol. Chem.,40(10), 2057-2062(1977)에 기재된 방법에 따라 폴쉬(Floch) 추출을 행하여 배치 BC0241을 분획화하였다. 물 층을 로토뱁(rotovap) 상에서 건조시켜 밝은 갈색의 과립성 고형분을 얻었다. 이 고형분의 저장용액을 5㎎/㎖ 농도로 준비하였다. 저장 용액 일부를 한계 분자량이 3500달톤 또는 1000달톤인 막을 구비한 Centri/por 원심분리 농축장치(Spectrum Products, 텍사스 휴스턴)에 로딩하였다. 물질의 일부가 막을 통과할 때까지 농축장치를 대략 1500×g로 원심분리하였다. 막을 통과한 용액에 대해 PBMN-TNF 분석을 행하여 효능을 평가하였다. 결과를 표 16에 나타내었다.
실시예 1 조성물의 활성성분들의 분자량
시 료 TNF 방출(pg/㎖)
BC0241로부터의 폴치(Folch) 물층 1709
3500달톤 막을 통과한 폴치 물층 2318
1000달톤 막을 통과한 폴치 물층 2423
따라서, 분자량 분획들의 생물학적 활성을 분석한 결과는 TNF-방출 성분이 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 6
이 실시예는 실시예 1의 조성물이 배양액중의 T 임파구 및 B 임파구에 미치는 영향을 설명한다.
실시예 1의 조성물의 존재 또는 부재하에 주의깊게 조절된 조건하에서 인간 임파구의 성장을 검사하였다. 표준농도의 임파구를 각종 농도의 조성물을 포함하는 웰에서 보온하였다. 정상적인 T 임파구 및 B 임파구를 임상학적으로 사용되는 것과 비슷한 농도의 조성물과 함께 보온하였을 때에 트립판 블루 다이 배제법에 의해 판단하였을 때 부작용이 전혀 없었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 배양액중에서 정상적인 T 임파구 및 B 임파구에 대해 세포독성을 나타내지 않는다.
인간 PBMN의 생존에 미치는 본 발명 조성물의 영향을 검사하였다. 조직배양 배지 및 본 발명의 조성물을 각종 부피로 함유하는 플라스틱 마이크로웰 플레이트에서 PBMN을 24시간 및 48시간동안 보온하였다. 각 기간이 끝난 후, 살아있는 세포의 수를 트립판 블루 다이 배제법에 의해 계산하였다.
실시예 1 조성물로 배양한 후에, 생존가능한 PBMNs의 농도
농도(㎕/웰) 제로(0) 시간 트립판(Trypan) 블루에 의한 웰 당 살아있는 PBMN의 수(×106)1
24시간 후,수(% 생존가능한) 48시간 후,수(% 생존가능한)
환자 S.Z.
0 0.702 0.23 (33) 0.10 (14)
25 0.43 (61) 0.15 (21)
50 0.10 (14) 0.23 (33)
100 0.15 (21) 0.18 (26)
200 0.48 (69) 0.23 (33)
LPS(㎍/웰)
1 0.30 (43) 0.28 (40)
10 0.25 (36) 0.13 (18)
환자 E.S.
0 1.302 0.70 (54) 0.33 (25)
25 0.65 (50) 0.15 (12)
50 0.68 (52) 0.38 (29)
100 0.75 (58) 0.23 (18)
200 0.65 (50) 0.20 (15)
LPS(㎍/웰)
1 0.60(46) 0.53 (41)
10 0.15 (12) 0.15 (12)
(주)1: 웰 당 3벌씩 플레이티드된 세포 수 대략 1×106세포2: 웰 당 실제 카운트된 세포 수(×106)
상기 데이터는 생존 세포의 수가 24시간에서 감소하고 또 48시간에 더 감소하는 것을 보여준다; 그러나, 조성물의 존재시에 부재시에 각각의 생존 세포 수는 다르지 않다. 나아가, 조성물의 부피를 증가시켜도 생존율에는 영향을 미치지 않는다. 즉, 조성물은 인간 PBMN에 대해 세포독성을 나타내지 않는다.
본 발명 조성물이 임파구를 자극할 수 있는 능력을 다음의 3가지 지시 시스템을 이용하여 평가하였다: 1) 임파구 DNA 합성의 자극; 2) 임파구-중재 세포독성 기능의 유도; 및 3) 단구/대식세포-중재 세포독성 기능의 유도. 이들 방법은 악성 질환을 갖고 있는 환자의 여러 상이한 임상학적 변수와 관련이 있는 것으로 밝혀진 면역학적 기능을 평가하기 때문에 스크리닝의 목적으로 선택되었다. 이들 면역 기능의 지시 시스템은 IFN 또는 IL-2와 같이 여러가지 다른 생물학적 반응 조절제로 처리된 암 환자에 있어서도 조절될 수 있다. 초기 스크리닝 절차의 결과를 아래에 나타내었다.
1. 임파구 DNA 합성의 자극 :
최적 자극농도의 피토헤모글루티닌(phytohemagglutinin ; PHA)와의 비교
자극제 분(min) 당 점수
중재물질 374
PHA 125,817
조성물 (#222) 1,116
조성물 (1:10) 1,021
조성물 (1:50) 649
원형(原形) 유사분열물질인 PHA와는 달리, 실시예 1의 조성물은 임파구를 자극하지 않아 섬유아세포 형성 및 세포 분열을 일으키지 않았는데, 이는 조성물에 의해 DNA 합성이 전혀 자극되지 않거나 조금밖에 자극되지 않는 것을 보여준 결과들과 일치한다.
2. 임파구-중재 세포독성 기능의 자극 및 최적 자극농도의 IL-2와의 비교
자극제 세포용해성Units
중재물질 30.8
IL-2 472.5
조성물 (순수물) 48.1
조성물 (1:10) 33.3
조성물 (1:50) 44.8
임파구 세포독성 기능의 원형 자극물질인 IL-2와는 달리, 본 발명 조성물은 임파구 세포독성을 촉발하지 않는다. 조성물에 의해 자극된 분해 단위(lytic unit)의 수는 시각적으로 관찰할 때 음성 대조군 (즉, 배지)의 것과 동일하였다.
3. 조성물에 의한 단구-중재 세포독성 기능의 자극 : IFN-γ 및 LPS(IFN + LPS)와 비교
자극제 세포독성
중재물질 4.3
IFN + LPS 24.4
조성물 (순수물) 19.7
조성물 (1:10) 20.0
조성물 (1:50) 11.5
실시예 1의 조성물은 말초 혈액 단구를 자극하여 용량-의존적 방식으로 종양괴사 기능을 발현시킬 수 있었다. 자극의 크기는 IFN-γ와 LPS를 병용하여 원형 대식세포 활성화물질로 사용했을 때 유발되는 것과 비견할 수준이었다. 이들시험관내분석법에 있어서, 다른 모든 대식세포 활성화물질의 경우와 같이, 조성물이 활성을 나타내기 위해 엔도톡신의 첨가를 필요로 하지 않는다는 것에 주목하는 것은 중요하다.
실시예 7
이 실시예는 실시예 1의 조성물에 사이토킨이 존재하는지, 존재한다고 하면 어떤 종류가 존재하는 지를 조사하기 위해 실시한 분석의 결과를 보여준다.
실시예 1에 따라 제조한 담즙 추출물 시료(각 시험당 50㎕ 및 100㎕씩의 표본분획 이용)에 대해 다음의 사이토킨이 존재하는 지를 검사하였다(괄호 안에 사용된 ELISA 면역분석 키트의 공급원 및 검출한계를 표시하였다): TNF-α (Endogen, Inc.(5pg/㎖)); IL-1α(Endogen, Inc.(50pg/㎖)); IL-1β(4.3pg/㎖); GM-CSF (Endogen, Inc.); RFN-α(Endogen, Inc.); IL-2(Advanced Magnetics, Inc.); IL-6 (Advanced Magnetics, Inc.(7pg/㎖)); IFN-γ(5pg/㎖); IL-1(Advanced Magnetics, Inc.); IL-4(RD Systems(3pg/㎖)); 및 IL-8 (RD Systems(4.7ng/㎖)). 각 절차는 각 키트의 지시에 따라 수행하였는데, 이는 당업자가 용이하게 수행할 수 있는 것이다.
본 발명의 조성물이 표 18에 나타낸 것처럼, 사이토킨, 즉 TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF 및; IFN-γ을 측정가능한 농도로 함유하지 않는다는 것이 입증되었다.
엘리사(Elisa) 측정법에 의한 조성물 중의 사이토킨
사이토킨(pg/㎖) 50㎕ 100㎕
TNF ＜ 5 ＜ 5
IL-1β - 6.5
GM-CSF ＜ 5 -
IL-6 ＜ 7 -
IFNγ ＜ 5 -
IL-1α ＜ 50 -
IL-4 - ＜ 3
IL-8(ng/㎖) ＜ 4.7
실시예 8
이 실시예는 실시예 1의 조성물을 이용한 생쥐에서의 약물동력학 연구와 더불어, 버룰리진TM(VirulizinTM)의 직접적시험관내효과 및 생쥐의 복강 대식세포에 미치는생체내투여시의 버룰리진TM의 효과를 설명한다.
C57BL/6 생쥐에게 4% 프로테아제 펩톤 1.5㎖를 복강내 투여한지 72시간 후에 복강 대식세포를 수확하였다. 배지 단독, 50ng LPS, 또는 버룰리진TM을 이용하여 대식세포를시험관내자극하였다. 실험을 2회 반복하여, TNF(ELISA법 이용) 및 NO (Greiss 시약을 이용한 분광분석법을 이용) 농도를 측정하므로써 자극을 측정하였다. 2회 반복 실험간의 표준 오차는 10% 미만이었다. 표 19에 나타낸대로, 버룰리진TM은 배경(배지) 농도(120pg/㎖)와 비교할 때 TNF-α 생산을 약간 증가시켰지만 (60-232pg/㎖), 버룰리진TM은 LPS(2225pg/㎖)와 비교할 때 대식세포 TNF-α 방출을 자극하는 강력한 자극물질은 아니었다. 산화질소 생산은 0이었다.
시험관내에서, 대식세포에 대한 프로테아제 펩톤의 자극
자극받은 대식세포 TNF(pg/㎖) 중간값 NO(μM) 중간값
중개물 120 0
LPS (1㎍/㎖) 2225 11
버룰리진
1:2 62 0
1:5 181 0
1:10 206 0
1:20 202 0
1:40 232 0
1:80 142 0
1:200 122 0
TNF-α 방출에 있어서의 버룰리진TM과 LPS와의시험관내상승작용을 조사하였다. 상기에서 설명한 것과 동일하게 처리한 후 C57BL/6 생쥐로부터 복강 대식세포를 수확하였다. 50ng의 LPS 단독 또는 LPS와 여러 희석 농도의 버룰리진TM와의 혼합물을 이용하여 대식세포를 자극하였다. 상술한 바와 같이 ELISA를 통하여 TNF를 측정하였다. 표 20에 나타낸 바와 같이, 배지가 생쥐의 복강 대식세포로부터 262pg/㎖의 TNF-α 방출을 자극한 반면, LPS 단독은시험관내에서 약 2900pg/㎖의 TNF-α 방출을 유도하였다. LPS를 버룰리진TM과 혼합하였을 때에는, 버룰리진TM1:5 및 1:10의 희석비에서 TNF-α 방출이 약 800pg/㎖ 증가되었고, 최소한 1:40으로 희석될때까지 방출이 증강되었다.
버룰리진TM과 IFN-α 또는 LPS 사이의 상승적인 조합
자극받은 대식세포 TNF(pg/㎖) NO(μM)
중개물 262 1.6±1.1
LPS (5ng/㎖) 2900 8.6±1.3
LPS (5ng/㎖) + 실시예 1 조성물 :
1:5 3750 13.2±0.5
1:10 3750 16.9±2.7
1:20 3500 13.5±2.5
1:40 3600 27.1±11.6
1:80 3000 10.1±1.9
1:200 3400 9.7±1.3
1:1000 3200 9.4±1.2
IFN-γ(100U) + LPS (5ng/㎖) 6800 74.1±0.6
IFN-γ(100U) + 버룰리진 :
1:5 512 46.9±0.6
1:10 625 57.3
처리된 대식세포의 상층액에서 산화질소(NO)를 측정하는 것을 제외하고는 상기에서와 동일한 방법에 따라, 산화질소에 대하여 LPS와 버룰리진TM의 혼합물이시험관내상승작용을 나타내는 것을 시험하였다. 상술한대로 NO에 대한 분석은 분광분석법으로 하였으며, 그레이스(Greiss) 시약을 이용하였다. 상기 표에 나타낸대로, LPS는 NO를 어느 정도 (9μM) 방출시킨다. 버룰리진TM은 LPS와 함께 상승작용을 나타내어 1:40배로 희석될 때까지 NO 생산을 현저하게 (13~27μM) 증가시킨다. 버룰리진TM자체는 대식세포에 의한 NO의 생산을 유도하지 않는다.
상기한 방법으로 처리한 C57BL/6 생쥐로부터 유도된 동일한 생쥐의 복강 대식세포를 이용하여, TNF-α 방출에 미치는 버룰리진TM과 IFN-γ와의시험관내상승작용을 연구하였다. 결과는 상승작용 배합에 관한 상기 표에 포함시켰다. 표에 나타낸대로, 생쥐의 복강 대식세포는 24시간동안시험관내배양을 실시한 후에 기본적인 양(baseline value)의 TNF-α를 방출시켰다. LPS 또는 IFN-γ에 의해 자극된 동일 대식세포는 거의 3000pg/㎖의 TNF-α를 방출시켰다. 버룰리진TM과 IFN-γ를 함께 첨가하였을 때, TNF-α의 방출은 감소하였다. 반면, LPS와 IFN-γ의 병용은 TNF-α 방출을 증강시키는 효과를 나타내었다.
상기한 방법으로 처리한 C57BL/6 생쥐로부터 유도된 동일한 생쥐의 복강 대식세포를 이용하여, NO 방출에 미치는 버룰리진TM과 IFN-γ와의시험관내상승작용을 연구하였다. 결과는 상승작용을 나타내는 배합사용에 관한 상기 표에 포함시켰다. 표에 나타낸대로, LPS와 IFN-γ 단독은 각각 NO 생산을 증강시킨다 (각각 9μM 및 7μM). IFN-γ에 첨가된 버룰리진TM은 NO 생산을 현저하게 증가시키는데 (47~57μM), 이는 LPS와 IFN-γ와의 배합사용 효과 (74μM)와 거의 동일하다. 이러한 결과는 IFN-γ과 배합사용되는 버룰리진TM이 NO 생산을 증가시키는 반면 TNF-α 방출을 억제한다고 하는 결론과 일치되는 것이다.
아무런 처리를 행하지 않고 72시간 전에 1.5% 및 4% 프로테아제 펩톤을 복강내 주사하거나, 또는 72, 48 또는 24시간 전에 PBS를 이용하여 1:10으로 희석한 버룰리진TM1.0㎖를 복강내 주사한 C57BL/6 생쥐로부터 수확한 대식세포에 대해, 72시간에 걸쳐 TNF-α의생체내생산을 연구하였다. 대식세포 단층(monolayer)을 IFN-γ(50μ/㎖), LPS 단독(5ng/㎖), 또는 이들의 혼합물을 이용하여 24시간동안시험관내처리를 행하였다. TNF와 NO는 위에서 설명한 것과 같은 방법으로 측정하였다. 결과를 표 20에 나타내었다.
처치된 쥐로부터 회수한 대식세포로부터의 TNF와 NO의 방출
주사맞은 쥐로부터 회수한 대식세포 시험관내자극제 TNF(pg/㎖) NO(μM)
없음 중개물 315 0
IFN-γ 402 25.8±1.6
LPS 3,750 1.9±0.2
IFN-γ + LPS 6,300 40.9±3.8
프로테아제 펩톤(72시간 전) 중개물 335 0.9±0.5
IFN-γ 838 48.6±1.7
LPS 5,975 23.2±3.4
IFN-γ + LPS 10,875 55.8±1.9
버룰리진(72시간 전) 중개물 258 1.2±0.6
IFN-γ 425 37.5±2.6
LPS 3,300 4.0±0.9
IFN-γ + LPS 4,650 54.0±0.9
버룰리진(48시간 전) 중개물 350 8.5±1.8
IFN-γ 560 62.0±2.5
LPS 5,300 36.5±1.2
IFN-γ + LPS 12,475 58.5±1.6
버룰리진(24시간 전) 중개물 248 2.9±2.1
IFN-γ 475 44.1±0.7
LPS 9,025 12.5±2.4
IFN-γ + LPS 12,375 52.8±0.6
상술한 대로, 24시간동안시험관내배양한 후에 자극없는 조건하에, 또는 IFN-γ, LPS, 또는 LPS/IFN-γ의 존재하에 대식세포로부터 IFN-γ가 방출되는 것을 조사하였다. 생쥐의 복강 대식세포는 버룰리진TM에 의한생체내자극이 있은 후에 소량의 TNF-α를 방출하는 것으로 나타났다. 수확한 대식세포를 시험실시 24 시간 및 48 시간 저에 IFN-γ에 노출시키면, 이들 대식세포는 TNF-α의 생산에 있어 약간의 증가를 나타내었다. 반면, 시험 실시 24시간 및 48 시간전에 LPS로 자극받은 대식세포는 TNF-α의 방출이 증가되었지만, 72시간 전에 자극받은 대식세포는 그렇지 않았다. 비슷하게 시험 실시 24 시간 및 48시간 전에 자극받은 대식세포는 LPS와 IFN-γ에 의한 상승작용을 받았지만, 72시간 전에 자극받은 대식세포는 그렇제 않았다.
TNF-α 생산에 대하여 설명된 상기 방법과 동일한 조건하에서의 시험방법 및 대식세포를 이용하여 72시간에 걸쳐생체내NO 생산을 연구하였다. 버룰리진TM을 복강내 주사하고 (이하 IP 버룰리진TM으로 표시) 24시간 및 48시간 후에 측정된 바에 따르면, 소량의 자연적인 NO 생산이 검출되었다. 수확된 세포를 IFN-γ와 함께 보온하면, NO의 방출이 현저하게 증가되며, 시험 실시 24 시간 및 48 시간 전에 IP 버룰리진TM 처리를 받은 대식세포는 NO의 방출에 있어 대수적인 증가를 보였으며, 이 증가는 72시간째부터 IFN-γ 단독에 의한 기본적인 양의 수준까지 떨어진다. 수확 세포를 LPS로 자극시키면, 현저하게 증가된 양의 NO를 생산하는데, 이런 결과는 IP 버룰리진TM처리를 받지 않은 대식세포에 비교하였을 때 24 시간 및 48 시간째에 버룰리진TM처리를 받은 대식세포에서도 관찰된다. 72시간 전에 IP 버룰리진TM처리를 받은 대식세포는 버룰리진TM예비처리를 받지 않은 대식세포와 비교하여 전혀 다르게 반응하지 않는다. 마지막으로, IP 버룰리진TM처리를 받은 대식세포를 LPS/IFN-γ의 존재하에 보온하면, 이러한 처리를 받지 않은 대식세포와 비교하여 NO 생산에 있어 증가를 나타내지 않는다. 수확 및 시험실시 48 시간전에 버룰리진TM으로 예비처리된 대식세포가 가장 높은 반응을 나타낸다.
실시예 9
이 실시예는 실시예 1의 조성물을 이용하여 단구와 대식세포를 활성화하는 것과 이들을 시험하는 방법을 설명한다.
실시예 1의 조성물이 정상적인 단구를 활성화하므로써, 단구 세포독성을 측정하는데 사용되는 창 간암 세포주에 대해 세포독성을 나타내고, 또 암 환자 (예, 경부, 난소, 귀/코/인후 및 자궁내막/자궁, 및 만성 골수형성 백혈병으로 고생하는 환자)로부터 얻은 단구와 대식세포가 상기 조성물에 의해 자극되어 동일 환자에게서 유도된 종양 세포를 공격 및 파괴한다는 것이 연구에 의해 밝혀졌다.
보다 구체적으로 설명하면, 본 발명 조성물의 존재하에 단구의 종양사멸 기능을 시험하였는데 이 실험의 기본적인 절차를 아래에 설명하였다. 이 절차는 세포주 및 자생 종양 세포에 대한 단구/대식세포의 세포독성 분석법 (Monocyte/ Macrophage Cytotoxicity Assay to Cell Lines and Autologous Tumor Cells 또는 간단히 줄여서 세포독성 분석법이라고 명명되었다.
이 방법은 단구/대식세포의 단리를 필요로 하는데, 이는 다음과 같이 달성될 수 있다: 정맥 혈액을 무균적으로 헤파린처리된 베큐테이너 뉴브에 채취하였다. 멸균된 보존제-무함유 헤파린을 최종 농도 20 단위/㎖의 농도로 첨가하였다. 혈액을 행크스 염 평형용액(Hanks balanced salt solution (HBBS))에 3:1로 희석하고, 임파구 단리 배지에 한층이 되게 넣은 후 원심분리하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMN) 밴드를 얻었다. 원심분리 후에, 계면으로부터 단핵세포 층을 회수하여 배지 (배지는 10% 열-불활성화 태내 송아지 혈청, 50 단위/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신이 보충된 Roswell Park Memorial Institure [RPMI] 1640 배지이다)로 2회 세척하고, 라텍스 포집을 이용하여 단핵의 수를 계수하였다. 96-웰 플라스틱 플레이트를 이용하여(37℃에서 2시간, 그리고 이어 배지를 이용한 2회 세척) 단구를 부착시키므로써 단구를 단리하였다. 부착세포는 90% 이상이 단구인 것으로 평가되었다. 부착 세포를 포함하는 웰을 버룰리진TM존재하에 (1:10~1:2000 최종 희석비율) 밤새 보온하였다. 이어, 부착세포를 세척하여 버룰리진TM을 제거하고 종양 세포와 함께 밤새 보온하였다. 종양세포는 제작자가 엔도톡신 농도가 낮고 분석법의 실시에 있어 자극유발을 하지 않는 것으로 보장하는 배지에서 유지한다.
표준 세포주를 이용한 연구에 있어서는, 천연 킬러 세포의 세포독성에 대해 민감하지 않은51Cr (크로뮴) 표지화 창 간암 세포를 사용한다. 이들 간암 표적 종양 세포를 부착 세포 단층에 대해 효과 (Effector) 세포 : 표적 세포의 비율(E:T)이 20:1 내지 15:1이 되도록 첨가하였다. 상기 값의 E:T 비율은 E:T 비율을 5:1부터 30:1 까지 변화시켜가면서 제작한 곡선에서 안정기(plateau) 범위에 드는 값이다. 24시간 후에, 상층액을 모으고51Cr 방출의 양을 정량하였다. 비(比) 세포독성율은 다음 식에 의해 계산된다:
비 방출율 (%) = [(E - S) / (T - S)] × 100
상기 식에서, E는 효과세포의 존재하에 표적 세포로부터 방출된 CPM이고; S는 효과세포의 부재하에 표적세포로부터 방출된 CPM이며; T는 2% 소듐 도데실 설페이트로 처리한 후 표적세포로부터 방출된 CPM이다.
자생 종양 세포를 이용한 연구에 있어서는, 외과적 생검조직으로부터 이들 세포를 얻고,51Cr로 표지화한 후 상술한 간암 세포에서와 동일한 방법으로 사용한다.
복강 대식세포와 폐포 대식세포의 준비는 문헌 (Braun et al.,Cancer Research,53, 3362-3365 (1993))에 기재된 방법에 따라 행하였다.
이 프로토콜을 이용하여, 본 발명 조성물이 건강한 제공자에게서 얻은 단구로 하여금 창 간암 세포주에 대해 세포독성을 나타내도록 한다는 것을 밝혔다. 이어서, 암 환자에게서 얻은 단구와 대식세포가 본 발명 조성물에 의해 자극되어 그들 자신의 특정 종양을 공격 및 파괴할 수 있는지를 연구하였다. 표준 세포주 (창 간암 세포)에 대하여 설명한 것과 비슷한 프로토콜을 이용하여, 암 환자에게서 얻은 단구 및/또는 복강 대식세포를 단리하였다. 복강경 검사시에 채취한 복강액으로부터 복강 대식세포를 분리하였다. 본 발명 조성물은 경부암을 갖고 있는 환자에게서 얻은 복강 대식세포 및 말초 단구를 활성화하여 환자 자신의 종양 세포에 대하여 세포독성을 나타내도록 한다는 것이 밝혀졌다. 이 효과는 IFN과 LPS의 병용에 의해 얻어지는 것과 견줄만하거나 또는 그보다 높은 것이다. 난소암을 갖고 있는 환자에게서 얻은 복강 대식세포도 역시 본 발명 조성물에 의해 자극되어 배양액 중에서 난소 종양세포를 공격 및 파괴하는 것으로 드러났다.
조성물을 이용한 단구/대식세포의 연구
스크리닝 절차에 의해 본 발명 조성물이 임파구의 기능을 자극하지는 않지만 단구의 기능을 자극할 수 있다는 것이 입증되었기 때문에, 그 이후의 연구는 본 발명 조성물의 단구/대식세포 자극활성을 특성화하는 것에 목표를 두었다. 다수의 연구가 단구/대식세포의 종양사멸 기능을 자극하는데 있어서 본 발명 조성물의 용량 반응 특성을 결정하는 것을 목표로 하여 행해졌으며, 또한 여러 상이한 배치의 화합물을 시험하는 것을 목표로 하여 행해졌다. 이 연구에서 강조되는 사항은 본 발명 조성물이 암 환자의 여러 상이한 해부학적 부위로부터 유래된 단구 및 대식세포에서 종양사멸 기능을 자극할 수 있는 지의 여부를 시험하는 것이다. 이러한 연구를 위하여, (1) 암 환자 및 대조 대상으로부터 얻은 말초 혈액 단구; (2) 폐암 환자의 폐포 대식세포 및 비악성 폐 질환을 갖고 있는 대조 환자에서 유래된 폐포 대식세포; 및 (3) 악성 부인과 질환을 갖고 있는 환자에게서 얻은 복강 대식세포를 이용하였다.
모두 실시예 1에 따라 제조된 서로 다른 배치의 조성물을 이용한 용량 반응 연구를 완성하였다. 이들 연구는 말초 혈액 단구를 이용하여 서로 다른 용량의 자극 활성 및 서로 다른 배치 (배치 번호 216, 219 및 222)의 조성물의 자극활성을 시험하는 것이다. 각 배치의 조성물에 대해 희석하지 않고(순수), 1:10으로 희석하거나 1:50으로 희석하여 시험을 실시하였다. 결과를 도 14에 도시하였다.
배치 #222 및 #216은 단구의 종양사멸 기능을 자극하는 것으로 나타났지만, 배치 #219는 그렇지 않았다. 이 예비적 연구에서 배치 #222는 #216보다 우수한 것으로 나타났다. 배치 #222는 희석하지 않은 상태와 1:10 희석에서는 동등한 수준으로 종양사멸 기능이 자극되었지만, 1:50 희석에서는 감소된, 그러나 아직 검출이 되는 수준의 활성을 나타내었다. 배치 #216은 희석하지 농도에서 종양사멸 기능을 최고로 자극하였고, 1:10에서는 그 활성이 감소되었으며, 1:50 희석에서는 활성이 검출되지 않았다. 상술한 대로, 배치 #219는 모든 시험 농도에서 단구의 종양사멸 기능을 검출가능한 수준으로 자극하지 못하였다.
말초 혈액 단구에서의 종양사멸 기능을 평가하였다. 대조군으로부터 채취한 4개의 말초 혈액 단구 시료에 대해 시험을 행하였다. 이들 시험은 최적 자극농도의 조성물 (배치 #222의 1:10 희석) 및 최적 자극 농도의 IFN-γ + LPS를 사용하였다. 이 연구에서 표적 세포는 배양된 NK-둔감 세포주, 즉 창 간암세포주이었다. 결과를 하기 표에 나타내었다.
자극제(E/T-20/1) 세포독성(%)
중개물 5.4±1
IFN-γ + LPS 18.6±4
조성물 22.3±6
경부암을 갖고 있는 환자로부터 채취한 하나의 단구 시료에 대해서도 시험을 행하였다. 이 시험은 환자 자신의 종양 세포를 분석용 표적 세포로 이용했다는 점에서 중요하다. 이전의 시험에서처럼, 이번 시험에서도 최적 자극농도의 조성물 (배치 #222의 1:10 희석) 및 최적 자극 농도의 IFN-γ + LPS를 사용하였다. 또한 효과세포/표적세포의 비율을 15/1로 감소시켜 환자의 종양세포를 보존하였다. 이 시험의 결과를 하기 표에 나타내었다.
자극제(E/T-20/1) 세포독성(%)
중개물 5.5
IFN-γ + LPS 14.4
조성물 20.9
대조군으로부터 채취한 말초 혈액 단구에서는, 본 발명 조성물이 최적 자극농도의 IFN-γ + LPS와 동등하거나 그보다 높은 수준으로 창 간암 세포에 대해 단구 종양사멸 기능을 자극하였다. 경부암을 갖고 있는 환자의 말초 혈액 단구에 있어서는, 조성물은 IFN-γ + LPS에 의해 자극되는 것보다 30% 이상 증가된 수준으로 환자 자신의 종양 세포에 대항하여 종양사멸 기능을 자극하였다.
악성 부인과 질환을 갖고 있는 환자에게서 채취한 복강 대식세포의 종양사멸 기능을 시험하였다. 이 시험은 경부암을 갖고 있는 환자 한 명의 세척액 (lavage fluid) 및 난소암 환자 한 명의 세척액으로부터 분리한 복강 대식세포 시료에 대해 행해졌다. 이전의 시험에서처럼, 이번 시험에서도 최적 자극농도의 조성물 (배치 #222의 1:10 희석) 및 최적 자극 농도의 IFN-γ + LPS를 사용하였다. 또한 효과세포/표적세포의 비율을 15/1로 감소시켜 환자의 종양세포를 보존하였다. 이 시험의 결과를 하기 표에 나타내었다.
자극제 자궁경관암 난소암
중개물 8.2 0.6
IFN + LPS 29.8 4.1
조성물 13.2 8.9
이들 시험 결과는 국소적 종양 환경이 면역학적 활성화물질에 대한 면역 세포의 반응을 결정하는 인자일 수도 있다는 사실에서 중요하다. 경부암의 경우에, 복강내에는 악성 질환임을 보여주는 병리학적 증거가 없었으며, 본 발명 조성물을 이용한 경우보다 IFN-γ + LPS를 이용한 경우에 자생 종양에 대하여 종양사멸 기능이 더 발달되었다. 난소암 환자의 경우에, 복강에서 유의적인 종양이 발견되었다. IFN-γ + LPS 에 반응하여 환자 자신의 종양에 대항하여 나타내는 반응은 기껏해야 최저 수준인 반면, 본 발명 조성물에 반응하여 나타낸 반응은 훨씬 컸다.
폐암을 갖고 있는 환자 및 대조군으로부터 얻은 폐포 단핵세포에 대해서도 종양사멸 기능을 시험하였다. 이 시험은 비-소형세포 폐암을 갖고 있는 환자 한 명 및 폐에 비악성 질환을 갖고 있는 환자 세 명의 기관지폐포 세척액으로부터 분리한 폐포 대식세포 시료에 대해 행해졌다. 이전의 시험에서처럼, 이번 시험에서도 최적 자극농도의 조성물 (배치 #222의 1:10 희석) 및 최적 자극 농도의 IFN-γ + LPS를 사용하였다. 이 연구에서 표적세포는 창 간암 세포이고, 효과세포/표적세포의 비율은 20/1이었다. 이 시험의 결과를 하기 표에 나타내었다.
자극제 암환자들 대조군
중개물 2.6±2 19.5±4
IFN-γ + LPS 10.9±13 1.2±5
조성물 5.2±2 18.6±8
이 결과는 폐암 환자로부터 얻은 폐포 대식세포가 IFN-γ + LPS와 같은 종래의 대식세포 활성화물질에 반응하여 종양사멸 기능을 발달시키는 과정에서 손상되었다고 하는 관찰과 일치하는 것이다. 이 결과는 폐암 환자의 폐포 대식세포의 종양사멸 기능이 대조군에 비해 현저하게 감소된 것을 보여준다. 전에 보고된 데이터는 버룰리진TM이 폐포 대식세포의 활성화물질로는 형편없는 것이었음을 시사하였었다. 비-소형세포 폐암 환자로부터 얻은 폐포 대식세포를 이용하여 행한 추가의 연구를 실시예 23에 나타내었다. 폐포 대식세포에서의 활성은 버룰리진TM제제에 따라 다양하게 변하는 것으로 드러났다. 즉, 최초 배치 (222, 219, 216)를 이용한 시험에서는 폐포 대식세포 제제중 2/7에서만 폐포 대식세포의 세포독성이 유발된 반면, 후기 제제 (233, 238)에서는 폐포 제제중 3/4가 자극되었다. 이러한 차이는 제제의 나이 및 효능, 또는 환자 자신의 변수와 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 폐포 대식세포에서 종양사멸 기능을 활성화할 수 있다.
본 발명의 조성물을 갖고 행한 예비적시험관내시험에 의해 상기 조성물이 대식세포 활성화물질임이 입증되었다. 제공된 물질들은 NK 둔감성 세포주 및 새롭게 분리된 인간 종양세포 모두에 대해 표준 세포독성 분석법에서 조양사멸 활성을 유발시킬 수 있었다. 이들 시험에서 상기 활성은 농도-의존적인 방식으로 유발되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 조성물이시험관내에서 대식세포의 종양사멸 기능을 활성화시킬 수 있는 능력은 현재 사용중인 것중 가장 좋은 대식세포 활성화물질의 배합인 IFN-γ + 엔도톡신 (즉, LPS)의 능력과 견줄만한 것이다. 상기에서 언급한대로, 엔도톡신의 부재하에서 이러한 수준으로 종양사멸 기능을 유발시킬 수 있는 능력은, 만약 이 물질이 엔도톡신에 오염되어 있지 않다면 생물학적으로 중요하게 취급될 것이다. 본 발명의 조성물은 미국약전 (United States Pharmacoepeia; USP) 토끼 발열원 시험법에 의해 발열원을 포함하는지에 대해 시험했을 때 엔도톡신에 오염되어 있지 않았다.
다른 대식세포 활성화물질에 대해 밝혀진 바와 같이, 조성물이 대식세포의 종양사멸 기능을 자극하는 활성은 대식세포의 공급원에 따라 다양하게 변한다. 본 발명 조성물은 정상적인 제공자의 경우, 말초 혈액 단구의 활성화물질로는 IFN-γ + LPS와 동등한 수준으로 우수한 것이었으며, 제공자가 암 환자인 경우에는 IFN-γ + LPS보다 우수한 것일 수 있다. 악성 질환은 사용된 활성화물질에 따라 단구의 종양사멸 기능의 발달에 유의적인 충격을 준다(Braun et al., (1991)). 암 환자의 단구에서 여러 상이한 대식세포 활성화물질의 생물학적 활성을 결정하는 한가지 인자는 상기 활성화물질이 아라키돈산 대사에 민감한 정도 및 해당 세포가 프로스타글란딘을 분비하는 지의 여부이다. 조성물을 이용한 이들 초기 연구로부터, 화합물에 의해 자극된 활성은 프로스타글란딘의 억제효과에 대해 민감하지 않다는 것이 드러났다. 본 발명 조성물에 의해 자극된 암 화자의 단구에 대해 명확하게 프로스타글란딘 둔감성이 입증된다면, 이는 다른 많은 생물학적 활성화물질이 프로스타글란딘에 의해 제한을 받기 때문에 치료학적으로 중요할 것으로 생각된다. 2개의 표본을 이용하여 행한 예비적 연구에 따르면, 조성물은 특히 복강내에 악성 질환이 존재하는 경우에 복강 대식세포에 대해 우수한 활성을 나타낼 수 있다.
이러한 예비적 결과는 여러 다른 부인과 악성질환을 갖고 있는 환자의 복강 대식세포에서의 종양사멸 기능을 자극하는 다른 활성화화물질의 능력과 비교할 때 어떠한 사실이 발견되는가 하는 것을 시사한다. 이들 연구에 의해서, 복강내에 악성 질환이 존재하면 복강 대식세포가 특정 활성화물질에 대해 나타내는 반응성에 영향을 준다는 것이 밝혀졌다. 경부암을 갖는 환자에 있어서, 일반적으로 복강내에는 악성 질환이 존재하지 않으므로 상주(常主) 대식세포(resident macrophage)가 IFN-α + LPS에 대해 나타내는 반응은 정상이다. 그러나 복강내에 악성 질환이 존재하는 경우에는, 난소암의 경우와 마찬가지로, IFN-α + LPS에 대한 반응이 억압된다. 이는 부분적으로 악성 질환이 존재하는 경우에 복강 대식세포의 아라키돈산 대사가 변화되는 것에 관계되어 있다 (Braun et al., 1993). 난소암 환자에게서 얻은 복강 대식세포가 해당 환자 자신의 종양세포에 대하여 나타내는 종양사멸 기능이 본 발명 조성물에 의해 활성화된다고 하는 사실은 아라키돈산 대사경로에 무관한 활성화 메카니즘과 일치한다.
따라서, 상술한시험관내연구에서 나타난대로, 본 발명 조성물은 단구와 대식세포를 활성화시켜 그들의 면역계 기능을 증가시킬 수 있다.
실시예 10
이 실시예는 부인과 질환을 갖는 환자에게서 얻은 말초 혈액 단구 및 복강 대식세포에서 본 발명 조성물 및 다른 대식세포 활성화물질에 반응하여 종양사멸 기능이 작용하는 것을 보여준다.
환자 집단은 3명의 양성 질환을 갖는 환자 및 4명의 악성 질환을 갖는 환자 (즉, 2명의 난소암 환자, 1명의 자궁내막암 환자 및 1명의 경부암 환자)로 이루어진 총 7명의 환자이다. 이들 환자의 외과적 처치시에 시료를 채취하였다. 문헌 (Braun et al.,Cancer Immunol. Immunother.,32., 55-61 (1990))에 기재된 방법을 이용하여 혈액 시료로부터 말초 혈액 단구를 함유하는 제제를 분리하고, 문헌 (Braun et al.,Cancer Research,53., 3362 (1993))에 기재된 방법을 이용하여 혈액 시료로부터 복강 대식세포를 함유하는 제제를 분리하였다. 본 발명 조성물(저장 배치 # 222의 1:10 희석액) 및 기타 다른 활성화물질, 즉 IFN-γ(100U/㎖), IL-12(500U/㎖) 및 단구-CSF(500U/㎖)에 반응하여 나타내는 종양세포에 대한 세포독성을 상기 문헌(Braun et al.)에 기재된 단구 세포독성 분석법을 이용하여 평가하였다.
하기 표에 나타낸 결과는 본 발명 조성물이 악성 및 비악성 부인과 질환을 갖고 있는 환자로부터 얻은 말초 혈액 단구 및 복강 대식세포 모두에 있어서 종양사멸 기능을 자극한다는 것을 입증한다. 결과는 단구/종양세포 비가 15:1인 비율에서의 종양 세포독성 (±S.E.) 백분율로 표시하였다.
말초혈액 단구 및 복강 대식세포들의 자극
활성화제 말초혈액 단구 복강 대식세포
중개물 8.6±3 3.1±1
감마 인터페론 18.3±2 9.5±1
인터류킨-12 26.0±4 8.5±2
단구-CSF 16.0±2 7.0±2
본 발명의 조성물(버룰리진) 23.0±6 12.5±2
따라서, 본 발명 조성물에 의해 자극되는 종양 세포독성은 시험에 제공되었떤 다른 생물학적 자극물질에 의해 자극되는 세포독성과 동일하거나 또는 그보다 높았다.
실시예 11
이 실시예는 프로스타글란딘 합성 억제물질의 하나인 인도메타신이 본 발명 조성물에 반응하여 일어나는 종양사멸 기능의 발달에 어떠한 영향을 미치는지; 그리고 암환자에게서 얻은 말초 혈액 단구에 다른 대식세포 활성화물질이 어떤 충격을 주는지를 조사하였다.
실시예 10에서 사용했던 악성 질환을 갖는 환자에게서 얻은 시료에 대하여, 본 발명 조성물, IL-12(500U/㎖) 및 단구-CSF(500U/㎖)와 함께 인도메타신(5ng/㎖ 이하)을 동시에 첨가하는 것을 제외하고 실시예 10에 설명한 바 있는 것과 동일한 분석법을 이용하여 시험을 행하였다.
하기 표에 나타낸 결과는 인도메타신이 IFN-α, GM-CSF 및 M-CSF에 반응하여 일어나는 세포독성을 증강시키는 것을 보여준다.
인도메타신 : 세포독성 증강제
활성화 조건 제공자 # 세포독성(%)
IFN-γ 23 11.9±9
IFN-γ + 인도메타신 23 25.2±17
GM-CSF 10 7.8±6
GM-CSF + 인도메타신 10 17.8±8
PMA 6 27.3±14
PMA + 인도메타신 6 22.0±17
IL-12 3 24.7±5
IL-12 + 인도메타신 3 25.6±6
M-CSF 3 14.31±3
M-CSF + 인도메타신 3 19.0±3
조성물(버룰리진) 4 18.7±6
조성물(버룰리진) + 인도메타신 16.4±6
즉, IFN-α, GM-CSF 및 M-CSF에 반응하여 일어나는 종양사멸 기능의 발달은 인도메타신에 민감하에 조절되었다. 반면, 포르볼 에스테르(PMA), IL-12 및 본 발명 조성물에 반응하여 일어나는 종양사멸 기능은 인도메타신에 둔감한 방식으로 조절되지 않았다. 즉, 인도메타신은 본 발명 조성물, IL-12 및 PMA에 반응하여 일어나는 세포독성을 증강시키지 않았다.
실시예 12
이 실시예는 인도메타신의 존재하에서 본 발명 조성물에 반응하여 일어나는 종양사멸 기능의 발달에 프로스타글란딘 E2가 어떠한 영향을 미치는지 설명한다.
환자 집단은 1명의 정상인과 9명의 환자(즉, 1명의 건강한 사람, 췌장암 환자 1명, 머리와 목에 종양을 갖고 있는 환자 2명, 자궁내막증식증 환자 1명 및 HIV 환자 4명)로 이루어져있다. 문헌(Braun et al., (1990))에 기재된 방법을 이용하여 환자의 혈액 시료로부터 말초 혈액 단구를 함유하는 제제를 분리하였다. PGE2(10-8M)의 존재 또는 부재하에, 본 발명 조성물(저장 배치 # 222의 1:10 희석액) 및 인도메타신(5ng/㎖ 미만)에 반응하여 나타나는 종양세포에 대한 세포독성을 상기 문헌(Braun et al., 상동)에 기재된 단구 세포독성 분석법을 이용하여 평가하였다.
하기 표에 결과를 나타내었는데, 이 표에서 결과는 종양세포 비가 15:1인 비율에서의 종양 세포독성 백분율로 표시하였다.
실시예 1 조성물에 반응하여 발달된 종양사멸 기능에 대한 PGE2의 효과
진단 조성물(버룰리진) 조성물(버룰리진)+ 인도메타신 조성물(버룰리진)+ 인도메타신 + PGE
건강 19 20 27
췌장 15 14 22
HNSCC 9 8 12
HNSCC 11 3 12
자궁내막증식증 37 37 n.d.
HIV 6 7 8
HIV 15 12 19
HIV 21 16 20
HIV 23 22 n.d.
표에 나타낸 데이터는 병리생리학적 농도의 PGE2(10-8M)가 본 발명 조성물에 반응하여 발달된 종양사멸 기능을 억압하지 못한다는 것을 보여준다. 이러한 결론은 IFN-γ에 의해 자극된 단구에서의 종양사멸 기능을 PGE2가 억압했던 것과는 상반된다.
실시예 13
이 실시예는 본 발명 조성물에 의해 자극된 단구에 있어서, 자생 종양 세포에 대항한 종양사멸 기능의 발달을 설명한다.
7명의 환자(난소암 환자 3명, 자궁내막암 환자 1명, 경부암 환자 1명 및 ENT 환자 2명)로부터 문헌(Braun et al., (1990))에 기재된 방법을 이용하여 환자의 혈액 시료로부터 말초 혈액 단구를 함유하는 제제를 분리하였다. PGE2(10-8M)의 존재 또는 부재하에, 본 발명 조성물(저장 배치 # 222의 1:10 희석액) 및 인도메타신(5ng/㎖ 미만)에 반응하여 나타나는 종양세포에 대한 세포독성을 상기 문헌(Braun et al., 상동)에 기재된 단구 세포독성 분석법을 이용하여 평가하였다. 단 이때 창 간암 세포 대신에 환자 자신의 종양 세포를 사용하였다. 환자 자신의 종양 세포를 콜라게나제 및 DN아제로 처리하고, 단일 세포 제제를 준비한 후, 세포에 상기 문헌 (Braun et al., (1990))에 기재된 대로 라벨을 붙였다.
하기 표에 나타낸 결과는 본 발명 조성물이 환자 자신의 단구가 환자의 종양을 죽일수 있도록 활성화시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 1 조성물에 의해 유도된 단구 종양 기능
진단 배양 조건 종양 세포독성(E/T=15/1)
난소암 중재물 2
조성물(버룰리진) 11
난소암 중재물 1
γ-인터페론 + LPS 4
조성물(버룰리진) 9
난소암 중재물 0
γ-인터페론 + LPS 14
조성물(버룰리진) 11
자궁내막증식증 중재물 6
γ-인터페론 + LPS 14
조성물(버룰리진) 21
자궁경관암 중재물 8
γ-인터페론 + LPS 30
조성물(버룰리진) 13
ENT 암 중재물 11
γ-인터페론 + LPS 12
조성물(버룰리진) 25
ENT 암 중재물 18
γ-인터페론 + LPS 11
IL-12 11
M-CSF 3
조성물(버룰리진) 35
실시예 10 내지 13의 실험 결과는 실시예 1의 조성물이 단구를 활성화하여 종양사멸 기능을 나타내게 할 수 있다는 것을 보여주며; 상기 조성물이 복강 대식세포와 함께 혈액 내에서 작용한다는 것을 보여주고; 이러한 결과는 환자들에서 나타나는 중요한 면역억제의 한 형태인 프로스타글란딘의 억제작용을 받지 않는다는 것과 일치한다. 실험 데이터는 본 발명 조성물이 복강, 폐포, 및 부인과의 악성질환을 처리하는데 유용하다는 것을 뒷받침한다.
실시예 14
이 실시예는 본 발명 조성물내의 단백질을 측정하기 위해 행한 분석의 결과를 보여준다.
조성물의 단백질 측정은 피어스 마이크로 BCA 단백질 측정기술 (Smith et al.,Anal. Biochem.,150, 76-85 (1985))을 이용하여 실시하였다. 한 개 배치의 조성물 10㎕ 시료를 증류수를 이용하여 1㎖로 만들었다. 다섯가지 농도의 소 혈청 알부민(0.150㎍/㎖)도 표준품으로 사용할 수 있도록 만들었다. 블랭크로서는 0.1N NaOH를 사용하였다. 이들 모든 시료에 BCA(2% 비신콘산(bicinchonic acid) 소듐염; Pierce), 4% 황산구리 및 마이크로시약 A(0.2N NaOH에 용해시킨 NaCO3, NaHCO3, Na 타르트레이트)의 혼합물을 첨가하였다. 시료 혼합물을 60℃에서 1시간동안 보온하고, 냉각하고, 분광분석기를 이용하여 562㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 시료중의 단백질의 양을 표준곡선과 비교한 후 적절하게 계산하였다. 조성물의 단백질 농도는 매우 낮아서 32㎍/㎖인 것으로 계산되었다.
실시예 15
이 실시예는 요약하자면, 다음의 것을 입증한다: (1) 본 발명 조성물은 TNF-α 방출 활성을 가지며, 이 TNF-α 방출 활성은 엔도톡신의 오염과 전혀 관계가 없다; (2) 대식세포를 프라이밍(priming)하면 조성물이 TNF-α의 방출을 자극하는 활성이 증강된다; (3) 조성물의 높은 삼투압(hyperosmolarity)은 TNF-α 방출 활성에 관여하지 않는다.
엔도톡신 효과가 실시예 1의 조성물의 생물학적 활성과 관련이 있는지를 판단하기 위하여, 반응물에 폴리믹신을 첨가하여 추가의 조성물 실험을 행하였다. 폴리믹신(polymixin)은 백혈구에 작용하는 엔도톡신을 억제한다. 하기 표 및 그 아래에 기재한 설명은 수행된 조성물 실험 및 그 결과를 보여준다.
TNF-2 방출에 대한 엔도톡신 부재 효과 및 대식세포 프라이밍
시료 첨가제 TNF 방출(pg/㎖)
총량 - LPS
LPS 폴리마이신 11±7 0
없음 517±118 0
조성물(#B0213 폴리마이신 1591±413 1581
없음 5256±2585 4738
(주)1. TNF 총 방출량은 정확하게는 1640 중재물에 의한 TNF 방출이다.2. 폴리마이신(polymyxin) 농도 : 50,000 units/㎖.3. 조성물 부피 : 200㎕.4. 폴리마이신에 대한 시험환자수 : 8명. 무첨가제인 경우 시험환자수 : 3명.5. LPS 농도 : 50ng/10㎕.
상기 결과는 폴리믹신이 LPS에 의해 유도된 TNF-α 방출을 완전히 억제하는 것을 보여준다. 폴리믹신의 부재하에서는 LPS가 517pg/㎖의 TNF-α를 방출한 반면, 폴리믹신의 존재하에서는 11pg/㎖의 TNF-α가 방출되었다. 반면 본 발명의 조성물은 폴리믹신의 존재하에서 1591pg/㎖의 TNF-α를 방출하였다. 폴리믹신의 부재하에서는, LPS와 본 발명 조성물이 자극물질의 첨가효과를 겨우 넘는 작용을 보여주었는데, 이는 본 발명 조성물이 대식세포가 프라이밍되면 훨씬 큰 강도로 작용한다는 것을 시시하는 것이다.
TNF-2 방출에 대한 과삼투몰농도의 효과
배치 # pH 삼투몰농도(mOsm)
농축 :
B0222 pH 조정전 411
B0222 pH 조정 581
B0216 pH 조정 872
B0219 pH 조정 886
비농축 :
B0221 pH 조정전 652
B0221 pH 조정 533
B0213 pH 조정 675
B0225 pH 조정 590
B0226 pH 조정 540
BC 11-06 pH 조정 445
BC 11-09 pH 조정 603
표준방법을 이용하여 서로 다른 배치의 삼투압을 측정하였다. 결과를 상기 표에 나타내었다. B0213은 675mOsm으로 중간정도로 높았으며, B0213보다 높은 TNF 방출활성을 나타내었던 B0222는 581mOsm으로 낮은 삼투압을 나타내었다. 분획 B0226, BC11-06 및 BC11-09의 삼투압은 540~603mOsm의 범위내에 있다. 조성물의 높은 삼투압이 TNF-α 방출에 영향을 미치는 효과도 연구하였다. 조성물의 삼투압을 조정하여 낮은 삼투압이 되도록 하였을 때조차 TNF-α를 계속 방출시켰다.
실시예 16
이 실시예는 본 발명 조성물의 독성 연구를 설명한다. 하기 표에 나타낸 것과 같은 여러 동물 종에 대해 예비적 독성 연구를 행하였다.
(하기 표에 열거한) 모든 동물들에게 본 발명 조성물을 14일, 21일 및 30일째에 주사하면서 매일 임상학적 관찰을 행하였다. 처음 30일 동안에는 매 3일마다 혈액학적 데이터를 수집하고, 그 이후에는 한달에 한번 자료를 수집하였다. 이 연구에 포함되었던 358마리의 동물들에 있어서 주사가 이루어졌던 모든 기간과 그 이후의 기간 (개에 대해서는 4개월동안 추가 관찰을 하고, 그외의 동물들은 1개월동안 추가 관찰을 했다)에 걸쳐 부작용이 전혀 관찰되지 않았다.
동 물 수량 투여량
흰쥐 100 3일 간격으로 4회, 0.2㎖ i.m.
웅성 휘스타 랫트 100 3일 간격으로 4회, 2.0㎖ i.m.
금빛(golded) 햄스터 60 4일 간격으로 4회, 1.5㎖ i.m.
기니 픽 60 3일 간격으로 4회, 3.0㎖
토끼 15 3일 간격으로 4회, 5.0㎖ i.m.
고양이 10 3일 간격으로 6회, 3.0㎖ i.m.
개 12 일단 1회 2㎖/㎏ i.m.-4개월간 관찰
본 발명 조성물을 단일 다용량으로 근육내 주사했을 때의 효과를 알아보기 위해 2차 독성 연구를 행하였다. 13마리의 스프라그 다울리 쥐에게 조성물을 5㎖/㎏의 단일 용량으로 근육내 투여하였다. 세 마리의 쥐는 7일간 관찰하였다. 열마리의 쥐는 14일간 관찰한 후, 안락사시키고 시체를 해부하였다. 두 그룹중 어느 그룹에서는 독성의 징후가 관찰되지 않았으며, 시체를 해부한 모든 동물에게서 병리학적 사항도 관찰되지 않았다. 이러한 관찰을 근거로 할 때, 본 발명 조성물을 쥐에게 근육내 주사할 때의 LD50은 5㎖/㎏ 이상인 것으로 측정되었다.
온타리오 수의과대학에서 또다른 독성 임상실험을 행하였는데, 두 마리의 혼합 교배 개에게 조성물을 투여하였다. 프로토콜을 하기 표에 요약하였다:
동 물 나이 및 체중 투여량 1 투여량 2 투약 간격
웅성 혼성 사육 성인, 5㎏ 5.5㎖ i.m. 0.6㎖ i.m. 7일
자성 혼성 사육 6개월, 13㎏ 12.5㎖ i.m. 1.3㎖ i.m. 7일
각각의 경우에, 한번의 투여는 오른쪽 뒷다리에, 그리고 두 번째 투여는 7일 후에 왼쪽 뒷다리에 투여하였다. 두 마리의 개를 첫 번째 주사가 있은 후 14일동안 관찰하였다. 연구 전 기간에 걸쳐 하루에 두 번씩 식욕, 활동성, 체온, 맥박 및 호흡율을 측정하였다. 처치전에, 그리고 첫 번째 주사가 있은 후 24시간, 72시간, 7일 및 14일 째에 통상적인 뇨검사, 혈액검사 및 혈청 화학 프로필을 수행하였다. 두 마리 모두 두 번에 걸친 주사와 관련하여 통증의 징후를 보이지 않았다. 두 번째 주사와 관련된 아나필락시의 증거도 없었다. 약물에 기인한 것일 수 있는 물리적 또는 실험실적 변수에 있어서의 비정상적인 것이나 변화도 관찰되지 않았다. 약물은 건강한 개가 잘 받아들일 수 있는 것으로 나타났다.
온타리오 암 연구소에서 동물 모델 연구와 관련하여 버룰리진TM을 이용하여 17-일 반복 투여 독성연구를 행하였다. 사용된 모델은 자성 C57B1 생쥐이다. 다음과 같은 4개의 그룹을 만들었다(IM = 근육내 투여, IP = 복강내 투여) :
그룹 # 처치 투여량 수/그룹
1 염수, IM 0.05㎖ 10
2 버룰리진TM, IM 0.05㎖ 10
3 버룰리진TM, IM 0.05㎖×2 10
4 버룰리진TM, IP 0.5㎖ 10
각 그룹의 생쥐에게 0일 째에 B16F1 흑색종 세포 5×103+ 마이크로스피어를 주사하였따. 처음 17일간 매일 각 그룹의 생쥐에게 버룰리진TM또는 식염수를 상기 표에 나타낸 양으로 매일 투여하였다. 18일 째에, 동물을 희생시켰다.
동물을 희생시키기 전에, 음식물 섭취, 체중의 증가 및 행동은 정상이었다. 또한 검사의 대상이 되었던 모든 기관: 대장, 비장, 위, 췌장, 방광, 간, 뇌, 신장, 소장 및 심장에 대한 광현미경 검사에서 관찰된만한 변화를 일으킨 독성의 흔적을 찾을 수 없었다. 음식물 섭취 및 행동은 정상이었다. 체중 증가도 정상이었다.
피셔-344 (Fischer-344) 쥐(총 40마리의 웅성 및 40마리의 자성)를 이용하여 13주간 매 주마다 3회씩 버룰리진TM을 투여함으로써 13-주 반복 투여량 독성 연구를 행하였다. 가장 많은 투여량은 1.1㎖/㎏으로서 인간에 대한 투여량의 약 20배에 해당한다. 13주후에 동물에 대해 총체적인 조직병리학을 검사하였다. 약물투여와 관련하여 발견된 유일한 사항은 대조군과 비교하여 20배 투여량 그룹에서 약간의 체중증가 감소가 있었다는 것이다. 독성은 드러나지 않았다.
실시예 17
이 실시예는 함께 사는 동물들의 여러가지 악성 종양을 치료하는데 본 발명 조성물을 임상학적으로 이용할 수 있음을 설명한다. 진전된 신성형 질환을 갖고 있고 기존의 치료를 받지 않은 열마리의 개와 열한마리의 고양이에게 1주일 단위로 본 발명 조성물을 근육내 투여하여 치료를 행하였다. 하기 표는 이 연구에서의 개개의 임상학적 경우를 요약한 것이다.
동물들에게 있어서의 악성 종양과 관련된 요약
No. 이름 및 나이 종/성 진단 기간(From-To) 주사 수술 결과
1 Bandit-13 개-M/n 구비(orinasal) 섬유육종 87.01.31~87.05.19 16 3 미소한 부분반응진행성 질환안락사
2 Bob-5 고양이-M/n 골육종 발달과 함께 병소의 뼈에 전이, 방추 세포 육종, 고양이 섬유육종, 인부(隣部) 재발성 방추세포 육종-공격성(생검진단) 87.04.02~87.08.1088.11.08~90.02.21 1869 11 첫 재발 16개월모두 완전반응.
3 J.D.-7 개-M/n 경구의 멜라닌 결핍성 흑색종, 양성 파필로마, 재발성 둥근세포 육종 87.03.02~87.08.2487.12.14~88.04.0589.04.04~89.08.0189.11.09~89.11.3090.12.2425029169 2620141715494 3 완전반응.일반적으로 자각증상 없음(4개월)
4 Mini-7 개-F/s 재발성의 공격성 섬유육종 87.02.27~87.08.10 22 5 안정(변화없음) ;팔다리 절단수술.재발되지 않음.
5 Goliath-17 고양이-M/n 악성 흑색종섬유육종 87.04.02~87.09.1487.11.30~88.07.25 2231 3 초기에 주요 부분반응.그후 미소한 부분반응,진행성 질환. 안락사.
6 Oiablo-15 고양이-F/s 악성 인부 세포 종양 89.05.28~87.06.29 5 1 초기에 미소한 부분반응.그다음 진행성질환.안락사
7 Oliver-10 개-M/n 악성 둥근세포 육종 89.02.24~89.05.30 12 1 완전반응.자각증상 없이 1년.
8 Karu-7 개-M/n 점막 내장 육종-전이 87.06.02~87.09.14 14 1 초기에 미소한 부분반응.그다음 진행성질환.안락사
9 Pubby-12 고양이-M/n 이구증 샘 아데노종양 88.07.22~88.10.04 10 1 미소한 부분반응.그다음 진행성 질환.87/10/10 죽음
10 Grandpa-16 고양이-M/n 성형수술에 의한 신성형심한 악성 89.01.17~89.03.20 9 2 미소한 부분반응.그다음 진행성 질환.안락사 87/03/26
11 Sam-7 고양이-F/s 종격(終隔) 임파종 87.11.02~87.12.21 7 0 미소한 부분반응.그다음 진행성 질환.87/12/21 죽음
12 Pete-3 고양이-M/n 급성 고양이 87.04.13~87.05.11 5 0 일시적 미소한 부분 백혈병 반응.그다음 진행성 질환87/05/05 죽음
13 Midnight-8 고양이-M/n 고양이 백혈병 87.11.24~88.01.01 2 0 진행성 질환,안락사 88/01/07
14 Stormy-10 개-M/n 멜라닌결핍성 흑색종 87.03.02~87.07.04 진행성 질환,안락사 88/01/07
15 Penny-10 개-F 악성 흑색종 87.03.02~87.07.08 부분반응 진행성 질환
16 Muky-5 고양이-F 성형수술에 의한 종양 87.02.09~87.06.08 6 3 완전반응, 3개월 안정후 재발
동물들에게 있어서의 악성 종양과 관련된 요약
No. 이름 및 나이 종/성 진단 기간(From-To) 주사 수술 결과
17 George-10 고양이-M 악성 흑색종 87.03.02~87.08.04 15 1 미소한 부분반응26개월 안정후 변화 없음
18 Simon-13 개-M 양성 전립선 비대 87.04.02~87.08.31 10 1 미소한 부분반응
19 Tequila-14 개-F/s 악성 내장 아데노암 89.11.24~90.08.09 35 1 미소한 부분반응안락사 90/08/09
20 Sheba-12 개-F/s 공격성 골육종 두개(頭蓋) 89.12.06~90.06.28 25 1 초기에 미소한 부분반응,그럼다음 진행성 질환.안락사
21 Mesha-14 고양이-F/s 골육종 89.02.07~89.05.08 13 2 팔다리 절달수술.완전반응.1년동안 재발 또는 전이 없음
(주) M/n은 중성화한 웅성을, F/s는 난소를 제거한 자성을 의미한다.
조성물의 주사량은 2~69이었으며, 단일 근육내 주사 부위에는 7.5㎖ 미만씩 투여하였다. 각각의 경우에 대해 개별적으로 결정된 진단 테스트를 행하면서, 각각의 경우를 주의깊게 모니터하고 검사하기 위해 주단위 간격의 주사 프로토콜을 채택하였다. 임상학자들은 국소 자극이나, 아나필락시를 포함하여 심각한 알레르기성 반응이 없음을 관찰하였다. 임상학자 및 동물의 주인들은 부작용을 일으키는 징후를 전혀 관찰하지 못하였다. 연구자들은 고통 및/또는 불편함의 감소, 그리고 몇몇 동물에서의 현저한 체중증가, 개선된 식욕과 활동성, 약간의 전환(minor reduction) 등과 같은 임상학적 개선점을 발견하였다.
상기 표에 나타낸 임상학적 결과들은 버룰리진TM을 이용한 치료에 대한 동물의 반응을 설명하기 위한 몇가지 용어들을 포함하고 있다. 이들 용어들을 다음 챠트에서 정의하였다:
반응 정의
완전 반응 활동성 종양임을 보여주는 모든 임상학적 증거의 소멸. 환자는 적어도 4주 간격으로 2회 관찰하여 평가했을 때, 모든 공지된 질환을 갖고 있지 않아야 한다.
주요 부분반응 다른 부위에서 새로운 병변이 관찰되지 않으면서, 모든 측정가능한 종양의 교차 직경의 합계가 50% 이상 감소되는 경우
미소한 부분반응 모든 측정가능한 종양의 교차 직경의 합계가 25-50% 감소되는 경우; 수행 상태와 식욕의 증가, 그리고 좋다고 하는 느낌과 같은 개선을 포함하는 객관적인 반응; 초음파 또는 x-ray 상에서 관찰할때 종양이 괴사되거나 분해되었거나, 또는 종양 이동성이 증가되거나 흡착력이 감소되었음을 보여주는 종양의 일정성과 특성상의 변화가 있는 경우.
안정한 질환 종양의 분해는 일어나지 않거나 또는 새로운 병변이 관찰되는 한편, 하나 또는 그 이상의 측정가능한 병변의 크기가 25% 미만으로 증감되는 경우.
진행성 질환 종양의 분해는 일어나지 않거나 또는 새로운 병변이 관찰되는 한편, 하나 또는 그 이상의 측정가능한 병변의 크기가 25% 이상 증가되는 경우.
여섯 마리의 동물(10마리 개중 3마리, 그리고 11마리 고양이중 3마리)이 완전 반응을 경험하였다. 한 마리(11마리 고양이중 1마리)는 초기에 중요한 부분 반응을 나타내었다. 열한마리 동물(10마리 개중 5마리, 그리고 11마리 고양이중 6마리)은 미미한 부분 반응을 나타내었다. 한 마리의 동물(10마리 개중 1마리)은 안정한 상태를 유지하였고, 한 마리(11마리 고양이중 1마리)는 반응하지 않았다. 동물에서의 임상학적 경험은 본 발명 조성물이 악성 신성형물을 처리하는데 있어서 효능이 있음을 명백하게 뒷받침한다.
실시예 18
본 실시예에서는 암환자들에게 시행된 개방형(Open Phase) Ⅱ단계 임상연구의 결과를 설명한다.
1988년에, 개방형 Ⅱ단계 임상연구는 써르웰(Thirlwell) 박사에 의해 몬트리올 종합병원에서 처음으로 시작되어, 1989년에 막시미욱(Maksymiuk) 박사의 지도아래 새스카툰 종합병원에서 발전되었다. 이 시도는 각종의 충실성종양을 이전에 치료를 받아보았거나 받아보지 않았던 환자들(방사선 치료는 제외한다)에게 개방되어 있다. 환자들에게 7.5㎖의 버룰리진TM을 주 3회씩 근육내에 지속적으로 주사한 후에, 안전성(safety), 동양의 종양학 협회(Eastern Cooperative Oncology Group: ECOG) 수행상태(performance status), 삶의 질(quality of life) 및 생존율(survival)에 대해서 계속 체크하였다.
1994년 3월 31일까지 99명의 환자들을 치료하였다. 일반적으로 약하거나 중간 정도의 부작용(adverse events)을 나타냈다. 부작용으로 인해 5명의 환자들의 치료를 중단하였다. 18명의 환자들은 병이 호전되고 있었지만, 완전하게 또는 부분적인 반응이 전혀 관찰되지 않았다. 임상단점(endpoint)들에 대해, 버룰리진TM주사로 8주 동안 치료를 받은 후에, 삶의 질, 고통 및 ECOG 수행 상태를, 데이터를 활용할 수 있는 환자들에게서 관찰하면, 각 51%, 78% 및 56%의 환자에게서 어떠한 변화나 개선도 없었다. 췌장암이 진행되어 버룰리진TM치료를 받은 소집단의 환자들(n=12)은 29%가 버룰리진TM치료일로부터 1년의 생존율과 160일의 중간 생존기간(median survival)을 보였다. 이 집단은 생존율이 13.8%인 대조군에 비해 38%가 진단일로부터 1년의 생존율을 보였다.
따라서, 개방형 Ⅱ단계 임상 연구의 결과는 시험관 내와 동물 실험에서 서로 일치하였으며, 버룰리진이 암치료에 상당히 효과적이라는 것을 알 수 있다.
실시예 19
본 실시예에서는 췌장암의 임상연구, 특히, 측정가능하고 생검에 의해 확인된(biopsy-proven) 췌장암을 갖는 환자에 대해 본 발명의 조성물을 이용하여 행한 Ⅱ단계(프로토콜 CO2-104) 임상실험의 방법과 결과를 설명한다.
실시예 1에서와 같이 제조한 조성물을 이용하여, 둔군 맥시머스(gluteus maximus)에 아니면 엉덩이에 근육내 주사를 깊게 1회 0.11㎖/㎏(최소량 7.5㎖)씩 투여하였다. 환자들에게 첫주에는 3번 주사를 투여하며, 그 다음부터는 종양이 진행될 때까지 주 2회씩 주사를 투여하였다.
반응은 Miller et al.,Cancer,47, 207-214(1981)에 의해 인용된 표준 판정기준을 사용하여 정의하였다. 완전반응(complete response: CR)은 적어도 4주 동안에 발생하는 질환의 모든 완전 증상으로 정의하였다. 부분반응(partical response: PR)은 적어도 4주 동안에 어떤 새로운 증상이나 증상의 진행없이 측정가능한 최대 증상의 두 개의 최대 수평 직경이 적어도 50% 감소되는 것으로 정의하였다. 진행성 질환은 한 개 이상의 측정가능한 증상의 크기가 25% 이상 증가하거나 새로운 증상이 출현하는 것으로 정의하였다. 반응이나 진행 질환의 판정 기준과 부합하지 않는 질환은 안정한 질환이라는 용어로 정의하였다.
총 22명의 환자들을 임상 연구에 기록하였지만, 5명의 환자들은 효과면에서 평가불가능하다고 간주되었다. 이 환자들에게 어떠한 완전반응 또는 부분반응이 관찰되지 않았었다. 3명의 환자들은 첫 번째 달 안에 질환이 호전되었다. 6명의 환자들은 3달 이상(즉, 3.5, 3.5, 5, 8, 12+ 및 14+달) 동안에 질환이 안정되었다. 전체 집단의 중간 생존기간은 진단일로부터 8달이며, 치료 시작일로부터 5달이었다. 생검에 의해 확인한 결과 간전이가 되었으며 CEA 수준(level)이 37ng/㎖(정상은 3ng/㎖ 미만이다)인 한 환자는 8달 동안에 간전이와 CEA 수준이 상당히 안정되었다. 한 환자는 5달동안에 안정한 질환이 되었다. 한 환자는 휘플 과정(Whipple procedure) 후에 4달 동안에 췌장지지상(pancreatic bed)의 재발이 있었지만, 본 조성물의 사용으로 적어도 1년 안에 완만하긴 하였지만, CEA 수준이 상승하는 것을 제외하고는 안정화되며, 질환도 안정화되었다. 세 번째 환자는 종양 진행의 어떠한 증상이 없으므로, 적어도 14달 동안의 전시간에 경피 스턴트(stent)를 삽입하는 치료를 지속적으로 받았다.
22명의 모든 환자들은 총 500회 이상의 주사를 투여받아, 독성(toxicity)을 측정받았다. 어떤 환자에게도 약과 관련된 독성의 임상적 또는 실험적인 증상이 발견되지 않았다. 일반적으로 질환의 활성에 해당하는 생명의 질에도 어떤 유해한 효과가 없었다. 혈청 면역 글로불린에서의 총 백혈구 계산치 또는 총 임파구 계산치에 상당한 변화를 보이지 않았다.
진단일부터의 생존시간과 치료 시작일로부터의 생존시간을 표현하는 각 생존곡선은 도 6과 도 7에 도시한다. 비교를 위해, 구드존슨(Gudjonsson: 1987)의 프로토콜 생존곡선을 도 6에 중첩하여 도시하였다. 비교가능한 병력 생존곡선의 다른 예는 백케볼드(Bakkevold), 피터슨(Petterson), 아르네스조(Arnesjo) 및 에스펜하우(Espenhaug) (1990)에서 찾아낼 수 있다.
생존 분석의 결과를 요약하면 다음과 같다;
생존기간 환자수 평균 생존기간(일) 표준 편차 중간 생존기간(일)
진단일로부터의 생존기간 프로토콜 CO2-104 환자 281 203 182
프로토콜 CO2-104의 평가가능한 환자 304 157 219
치료 시작일로부터의 생존기간 프로토콜 CO2-104 환자 166 135 133
프로토콜 CO2-104의 평가가능한 환자 220 132 146
도 6에 나타난 바와 같이, 진단일로부터의 평균 생존시간은 281일이며, 중간 생존기간은 182일이었다(약 5달). 구드존슨(1987)은 그의 188명의 외과 환자들의 평균 생존기간은 208일이며, 중간 생존기간은 120일라고 보고하였다. 치료 시작일로부터의 평균 생존기간은 166일이며(도 7 참조), 중간 생존기간은 133일이었다(약 4달 1주).
또한, 생존시간은 적어도 13번의 주사를 투여받은 평가가능한 환자의 부분 집단중에서도 평가하였다. 22명의 환자 중에서 14명의 환자로 평가하였다. 상기 표로 알수 있는 바와 같이, 진단일로부터의 중간 생존기간은 219일(약 7달 1주) 이었으며, 치료 시작일로부터의 평균 생존기간은 146일(약 5달) 이었다.
평가가능한 환자들(n= 17)의 처음 버룰리진 치료로부터 1년 생존율은 18%이며, 중간 생존기간은 5달이었다. 이 환자들의 진단일로부터 1년의 생존율은 35%이며, 중간 생존기간은 7.3달이었다. 유사한 병력의 환자 집단에서, 진단일로부터의 1년 생존율은 13.8%이며, 중간 생존기간은 120일이었다. 버룰리진TM치료를 8주 이상 받은 후에, 데이터가 보고된 환자들의 삶의 질, 고통 및 ECOG 수행 상태는 각 57%, 71% 및 66%로 일정하거나 향상되었다. 안정한 수준을 유지하며 감소되는 CEA 수준은 질환이 임상적으로 안정화되었음을 지지하였다.
실시예 20
본 실시예에서는 악성흑색종에 대한 버룰리진TM치료를 한 임상시도에 대해 설명한다.
진행된 악성흑색종이란 단계 Ⅲ 또는 Ⅳ에 있는 모든 환자와, 1차 치료 후에 발생한 로코풀 영역(loco-regional) 또는 거리(distant)에서 재발되는 환자들의 증상으로 정의하였다. 그외 모든 치료에 의해 판단되는 표준치료는 DTIC (dacarbazine)이며, 약 15%의 반응율로 보고되었다. 중간반응 기간은 3∼5달이며, 심한 오심과 구토, 간정맥의 혈전증에 의한 간괴사의 치명적인 측면 효과(side effect)를 유발한다. 이 치료는 상기에서 정의한 어떠한 증상에 대해 생존가능에 대한 이점을 보이지 않는다.
이 연구는 악성흑색종이 진행된 환자들에게 사용할 때, 본 발명의 조성물의 안정성과 효능을 결정하며, 그것의 생존율과 삶의 질을 결정하기 위해 수행되었다. 이 연구는 비교에 의한 것이 아니라, 다중센터(multicenter) 시도를 하였다.
본 발명의 조성물로 이루어진 주사를 초기 투여량표(dosing schedule)에 따라 7.5㎖씩 주 3회 투여하였다. 어떠한 기관 또는 뼈에도 독성이 발견되지 않았으며, 그 후, 15일 동안에는 부하 시간표(loading schedule)에 따라 주사 투여량을 매일 증가시켜 투여한 다음에, 주사 회수를 주 3회로 유지하였다. 계속해서, 투여량을 30일 동안 증가시켰다. 치료기간은 36주이며, 16주간의 치료기간이 지난 후의 기간은 연장 프로토콜(continuation protocol)에 따라 환자 스스로 선택하도록 한다.
흑색종이 진행된 33명의 환자는 연령 범위가 17세∼85세인 연구집단(여자 17명, 남자 16명)에 포함시켰다. 연구집단 중에, 64%를 먼저 치료하였고, 36%는 치료하지 않았다. 33명의 환자 중에서 25명을 평가하였다. 카르노프스키 수행상태의 기본치(Karnofsky Performance Status: baseline)는 40∼100%의 범위 내에 있으며, 중간상태는 80%이었다. 11명의 환자들은 연구기간의 끝까지 생존하였으며, 이중의 5명은 계속하여 치료를 받았다.
최소 부분반응은 16/33명의 환자(48%)에서 관찰되었다. 한 환자에게서는 폐에서 부분반응이 33%로 감소되었으며, 6명의 환자는 고통이 감소되었으며, 8명의 환자들은 1달 이상 동안에 1000g 이상의 체중 증가(범위는 1000g∼2600g)를 보였다. 안정한 컨디션은 19/33명의 환자(58%)에게서 관찰되었다(범위는 60∼ 170일, 중간은 77일).
도 8, 9 및 10은 대조군과 비교하여 본 발명의 조성물에 따라 치료된 환자들의 생존기간, 전이/재발의 진단으로부터의 생존기간을 나타낸다. 실선(solid line)은 본 발명의 조성물로 치료된 환자들의 생존곡선을 나타내며, 파선(broken line)은 대조군의 생존 곡선을 나타낸다(Balch et al.,Cutaneous Melanoma, 2nd, ed. 1992, Chps. 14 and 39, pp. 165-187 499-508, Lippincott Co., Philadelphia, Penn.). 종양 부위가 한 부위로부터 세 부위 이상인 환자들을 포함하여 본 발명의 조성물로 치료된 모든 환자들의 생존기간은 도 8에 도시한다. 종양 부위가 두 부위인 환자와 세 부위 이상인 환자들의 생존기간은 각 도 9 및 도 10에 도시한다.
본 발명의 조성물로 치료된 모든 환자들의 집단은 39%가 1년의 생존율을 보였다(카플란-메이어 평가(Kaplan-Meier Estimate)). 종양부위에 매치시킨 대조군에서는 악성흑색종이 진행(advanced malignant melanoma: AMM)된 모든 환자들의 1년 생존율이 약 11%이다. 상기 집단은 중간 생존기간이 89일인 대조군과 비교하여 315일이었다.
종양 부위가 두 곳인 환자에 대해, 본 발명의 조성물로 치료된 환자들의 1년 생존율은 13%의 대조군과 비교하여 49%이었다. 이 집단은 중간 생존기간이 120일인 대조군과 비교하여 360일이었다. 종양 부위가 세 곳 이상인 환자에 대해, 본 발명의 조성물로 치료된 환자들의 1년 생존율은 31%이었다. 이 집단은 중간 생존기간이 60일인 대조군과 비교하여 205일이었다.
삶의 질은 체중 증가, 수행상태(Karnofsky), 삶의 질 지수(Quality of Life Index) (Spitzer) 및 고통 스케일(pain scale) (Linear Analogue)에 의해 평가되었다. 생존시간 동안에 체중 증가는 하기표로 나타낸다.
1번째달 2번째달 3번째달 4번째달 5번째달 6번째달
11/25 12/25 4/25 4/25 1/25 1/25
퍼센트 44% 48% 16% 16% 4% 4%
범위(gr) 100∼2400 200∼6000 100∼1000 100∼2000 - -
평균(gr) 900 1480 525 775 100 2000
카르노프스키와 스피저 스케일은 모두 주관적인 평가이며, 각 개인에 대해서는 대략적으로 정확하였다. 15명의 환자들에게서는 이 변수들에 대해 어떠한 변화도 보이지 않았다. 4명의 환자에게서는 나중에 이전의 수준으로 돌아가는 변동이 있었으며, 한명의 환자에서는 감소되었다(40-20%).
6명의 환자들에 대한 고통 평가의 결과는 4주 후에 고통이 5(최악의 상태)로부터 2(중간) 또는 0(고통이 없는 상태)으로 떨어졌다는 것을 보여주었다. 한 환자는 고통이 3에서 0으로 떨어졌다. 간전이가 된 한 환자는 11달 동안에 고통은 0으로 떨어지며, 안정화 상태가 되었다. 이 연구의 적용으로 고통이 0이 된 9명의 환자들은 연구 동안에도 그 수준을 유지하였다. 5명의 환자들은 적당한 수준의 고통 (2유닛)을 보였으며, 3명의 환자들은 2번째달 또는 3번째달에 일시적인 고통 증가(1∼2유닛)를 보였다.
1734회에 주사가 투여된 33명의 환자 중에서 21명은 약에 대한 부작용이 없었다. 12명에 환자에게는 14 항목의 약부작용이 있었다. 일반적으로, 약부작용은 4주 또는 8주때에 발생하며, 일시적으로 안정화되며, 가장 흔한 부작용은 미열이 나타나는 것이다.
대조군과 본 발명의 조성물로 치료된 프로토콜 집단 사이의 생존기간의 차이를 보면, 본 발명의 조성물이 환자들의 치료에 도움을 준다는 것을 시사한다. 19명의 환자는 암이 안정해졌다. AMM이 치료된 모든 환자들은 생존율 데이터에 포함되었다. 또한, 미리 치료된 21명의 환자들도 포함되었다(이전 치료의 실패로 병의 증상이 악화되므로, 많은 임상 시도는 치료받지 않은 환자들을 필요로 한다). 이 인구수는 종양에 대한 고통이 커졌다(82%는 한 부위 이상이 전이되었다).
생존율과 삶의 질 데이터는 대부분의 환자들이 치료로부터 어느 정도의 차도 가 있었다는 것을 시사한다. 11명의 환자들은 이 연구 기간의 마지막까지 생존하였으며, 이 11명 중에 5명은 치료를 계속받았다.
33명의 환자에 대한 예비 분석은 재발 진단으로부터의 1년 생존율이 39%라는 것을 설명한다. 이 연구의 결과에서, 최종 데이터는 45명의 환자에게도 적용되었다. 이 환자들 중에 41명은 전이거리가 있었다. 이 환자들의 전이거리 진단으로부터의 1년 생존율은 61%이며, 중간 생존기간은 529(17.6달)일이었다. 이 생존율과 중간 생존기간은 대조군의 생존율 13%와 중간 생존기간 92일의 데이터와 비교될 수 있다. 모든 환자들의 버룰리진의 초기 치료로부터 1년 생존율은 22%이며, 중간 생존기간(6.7달)은 200일이었다.
처음 8주 동안의 치료 후에, 삶의 질, 고통 및 ECOG 수행 상태는 데이터를 활용할 수 있는 환자들에 대해 각 63%, 93% 및 70%로 어떠한 변화나 향상도 없었다. 또한, 전후의 버룰리진 종양 병리학은 드문 형태의 종양 세포의 괴사, 섬유증 및 TNF-α 중재효과와 일치하는 혈관 혈전증(vascular thrombosis)을 설명한다.
실시예 21
본 실시예에서는 악성흑색종에 대한 병리학 프로토콜을 설명한다.
하기는 경구개와 잇몸에 악성흑색종이 진행된 73세 여성의 보고서이다. 악성흑색종을 현미경으로 관찰하였다. 상면(top)부터 바닥면(bottom)까지 관찰함에 따라, 케라틴을 수반하는 상피층을 볼 수 있었으며, 바닥면에 악성흑색종 세포가 보다 확실해지기 시작했다. 이 흑색종 세포들을 다량의 호산구증다증 세포질과 다형성 과색소성의 핵들과 함께 원형 또는 타원형으로 관찰할 수 있었다. 이 세포들은 정상의 점막 하조직으로 대체되고 있다. 정상으로 보이는 혈관에는 백혈구(다형핵과 단형핵 세포)의 출현(presence)으로 보이는 것과 같은, 어떤 종류의 염증/면역반응이 아주 약간 있는 것 같았다. 이것은 성장하고 있는 종양 조직의 한 예로서, 종양 구조(tumoral architecture)가 온전한 것을 보여준다.
종양 조직의 시료는 본 조성물로 2달 동안 치료받은 동일한 환자로부터 관찰하였다. 상면부터 바닥면까지 관찰을 시작함에 따라, 상피의 연속성이 괴사 과정에 의해 파괴받은 것을 볼 수 있다. 임계질량(critical mass)에 이른 어떤 종양의 중심을 공유하는 괴사는 주변(periphery), 특히 악성흑색종에서는 거의 볼 수 없으며, 괴사는 숙주의 면역 반응이 종양에 대해서 공격을 받는다는 신호이다. 사진을 통해서보면, 다수의 괴상(massive) 세포들은 본래의 종양세포와는 다르다. 이것은 호중구(neutrophli), 임파세포, 대식세포 등을 포함하는 면역세포로, 전형적인 종양 구조를 파괴한다. 혈관벽은 다수의 숙주 면역세포들과 함께 조밀하게 침윤되었다. 계속해서, 이 세포의 침윤물은 혈관파괴의 원인이 될 수 있으며, 번갈아 질소와 산소의 공급을 받아 종양(국소빈혈의 괴사)을 막을 수 있다. 이 환자의 조직 슬라이드에서 보이는 종양 파괴에 기여하는 면역 반응은, TNF(종양괴사인자)에 의해 유발된다고 알려진 보고와 일치하며, 이전 실시예에서 기술된 실험의 결과와 일치한다.
이 면역반응은 시험관 내에서 강한 결합을 하는 본 조성물로의 치료와, 생체내에서의 항종양(anti-tumour) TNF 효과로 알려진 본 조성물에 의한 TNF 면역 조절후의 반응을 설명하였다.
실시예 22
본 실시예에서는 암환자의 말초혈액 단구에서의 종양 기능용에 대한 버룰리진의 효과를 설명한다.
암환자의 정맥혈관으로부터 말초혈액의 단구를 얻고, 처리하여, 실시예 9의 과정에 따른 창(chang) 간암세포에 대한 종양의 활성을 분석하였다. 그 결과는 하기표에 제공하며, 하기표에서는 다음과 같은 단축용어를 사용한다;
ENT CA는 귀, 코, 인후에 발생하는 암을 나타낸다.
KS/HIV는 인간의 면역결핍 바이러스에 감염된 환자의 카포시육종을 나타낸다.
Ovarian CA는 난소암을 나타낸다.
Lung CA는 폐암을 나타낸다.
Endo CA는 자궁의 자궁내막암을 나타낸다.
CML 은 만성 골수성 백혈병을 나타낸다.
이 표에 사용된 용어에서는 환자가 걸린 암의 형태를 말하는 진단(diagnosis)이라는 용어가 있다. 시험을 위해 단구를 제공하는 전체 환자수는 전체 시험자수로 나타낸다. 단구를 제공한 전체 환자수에 대한 버룰리진TM에 의해 단구에 자극을 보이는 환자수는 자극자수/전체 시험자수(버룰리진)로 나타낸다. 단구를 제공하는 전체 환자수에 대한 100단위/㎖의 인터페론-γ(interferon-gamma: INF-γ)와 2ng/㎖의 대장균의 리포다당류의 조합(combination)으로 단구에 자극을 보이는 환자수는 자극자수/전체 시험자수(IFN/LPS)로 나타낸다. 자극자수/전체 시험자수(버룰리진TM또는 IFN/LPS)에 대해, 자극은 배지 단독으로 배양액(culture)에 의해 얻은 종양 사멸치(value)가 50% 이상으로 증가된 경우를 정의한다. 배치#/자극은 전체 시험자수에 대해 자극을 보이는 시험자수를 괄호안에 배치/로트로 표현하여 사용한 버룰리진TM배치 또는 로트를 나타낸다.
암환자의 말초혈액 단구에서의 종양 기능에 대한 버룰리진TM의 효과
진단 시험자수 자극자수/전체시험자수(버룰리진) 자극수/전체 시험자수(IFN/LPS) 배치/자극
ENT 암 10 8/10 5/10 222(3/4)219(2/3)216(1/2)233(3/3)238(1/2)
카포시육종 9 6/9 2/9 222(4/7)238(2/2)
난소암 3 2/3 2/3 222(2/2)216(0/1)
폐암 2 2/2 1/2 222(2/2)
자궁내막암 1 1/1 1/1 222(1/1)
CML 1 1/1 0/1 233(1/1)238(1/1)
총계 26 20/26(77%) 11/26(42%)
이 결과는 암환자들의 단구에서 버룰리진TM에 의해 유발된 종양의 활성이 종래의 단구세포의 활성화물질들(INF-α와 LPS)의 조합에 의해 반응하여 형성된 종양의 활성과 동일하거나 크다는 것을 보여준다. 또한, 버룰리진TM은 카포시육종 말기 환자에게도 HIV로부터 얻은 단구세포에 작용하는 종양을 자극할 수 있다. 따라서, 버룰리진TM의 작용은 헬퍼(helper) T임파구를 포함하여 또 다른 형태의 면역세포와 함께하는 공동작업(collaboration)과는 별개로 나타난다.
실시예 23
본 실시예에서는 암환자의 암과 관련된 대식세포에 대한 버룰리진TM의 효과를 설명한다.
폐암의 세포가 작지 않은 11명의 환자로부터 세기관지폐포 세정(bronchioalveolar lavage)에 의해 폐포 대식세포를 얻어, 실시예 9에서 기술한 과정에 의해 창 간암세포에 대한 종양의 활성을 분석하였다. 7명의 부인과 계통 암환자(2명은 자궁내막암, 3명은 난소암, 2명은 자궁경부암)로부터 복막의 대식세포를 얻어, 상술한 과정에 의해 창 간암세포에 대한 종양의 활성을 분석한다.
그 결과는 하기표에 나타내며, 하기표에는 실시예 9에서 정의한 용어 및 약어를 사용한다.
암환자로부터의 종양과 관계된 대식세포에 대한 버룰리진의 효과
시험자수 자극수/전체시험자수(버룰리진) 자극수/전체시험자수(IFN/LPS) 일괄/자극
폐암의 입자가 작지 않은 폐포 대식세포 11 5/11 5/11 222(2/7)219(1/4)216(1/4)233(2/3)238(3/4)
부인과 계통의 암에서의 복강 대식세포 7 7/7 6/7 222(6/6)219(2/2)216(0/1)
이 결과로 버룰리진TM이 말초혈액 단구와, 상당한 수의 종양을 사멸시키는 활성을 표현하도록 암환자의 종양과 관련된 영역의 대식세포를 자극할 수 있다는 것을 알 수 있다. 이 결과는 부인과 계통의 암이 있는 여성들로부터 얻은 복막 대식세포와 폐암이 있는 환자로부터 얻은 폐포 대식세포에서 관찰하여 얻었다. 이 결과로부터, 버룰리진TM은 감마 인터페론 플러스 내독소 등과 같은 종래의 활성화물질로 자극에 반응하지 않았던 암환자의 대식세포도 또한 자극할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 24
본 실시예에서는 암환자의 단구에서 자생(autologous) 종양세포에 대향한 종양 사멸 기능의 발달에 미치는 버룰리진TM의 효과를 설명한다.
말초혈액 단구를 얻어, 실시예 9에서 기술한 방법을 사용하여 자생 종양세포에 대한 종양의 활성을 분석하였다. 즉, 예를 들어, 귀/코/인후에 암이 걸린 환자로부터 얻은 단구를 환자 자신의 종양세포에 대한 종양의 활성을 분석하였다. 난소암, 자궁내막암 및 만성 골수성의 백혈병의 세포를 사용한 자생 시험도 또한 완성하였다. 그 결과는 하기 표에 나타내며, 실시예 22에서 정의한 약어 및 용어를 사용한다. 사용된 중재물질은 로스웰 파크 메모리얼 연구소(Roswell Park Memorial Institute: RPMI)소에서 제공한 10%의 열불활성화된 태내의 소혈청(heat inactivated fetal bovine serum), 50단위/㎖의 페니실린 및 50ug/㎖의 스트렙토마이신이 있다.
암환자의 단구에서 자생 종양세포에 대향한 종양사멸 기능의 발달에 미치는 버률리진TM의 효과
진단 배치# 중재물질 IFN/LPS 버룰리진
세포독소 %
ENT 암 222 14.9 11.5 10.9
ENT 암 222 11.6 12.0 24.9
ENT 암 222 13.7 10.5 25.7
ENT 암 222 17.7 11.4 35.2
ENT 암 240 3.2 15.6 15.7
난소암 222 0.0 17.2 14.0
난소암 233 2.9 16.1 12.3
난소암 238 2.9 16.1 15.0
난소암 239 2.9 16.1 13.0
난소암 240 2.9 16.1 9.2
자궁내막암 222 26.7 44.5 35.5
자궁내막암 222 1.2 4.5 9.2
CML 233 10.7 15.2 22.6
CML 238 10.7 15.2 17.0
자극수/전체 시험자수 5/10(50%) 9/10(90%)
이 결과는 암환자의 외과 생체법으로부터 준비된 자생 종양세포에 대향한 암환자의 대식세포에서의 종양사멸의 활성을 자극할 수 있다는 것을 보여준다. 이 결과로부터, 버룰리진은 감마 인터페론 플러스 엔도톡신 등과 같은 종래의 활성화물질로 자극에 반응하지 않는 암환자의 대식세포도 또한 자극할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 24
본 실시예에서는 버룰리진TM으로 자극된 단구에서 종양사멸 기능의 발달에 미치는 사이토킨 특이적(cytokine-specific) 자가항체의 효과를 설명한다.
폐암환자와 만성 골수성 백혈병(CML) 환자로부터 얻은 말초혈액 단구를 얻어, 실시예 9의 방법에 따라 창 간암세포에 대한 종양 활성을 분석하였다. 버룰리진 플러스(+) 항-IL1α, 또는 항-IL1β, 또는 항-TNFα 또는 이소타입 제어(isotype control) 자가항체뿐만 아니라 단구의 자극을 시험하기 위해서, 버룰리진만을 사용하였다. 사용된 자가항체의 양은 표준 방법에 따라서 적정 실험에 의해 결정된 분석 조건의 포화량이었다.
그 결과는 하기 표에 나타내며, 실시예 22에서 정의한 약어 및 용어를 사용한다. 또한, 항-IL1α는 인터류킨(interleukion) 1α에 대한 자가항체이며; 항-IL1β는 인터류킨 1β에 대한 자가항체이며; 항-TNFα는 종양괴사 인자 α에 대한 자가항체이며; 이소타입 제어는 상기한 사이토킨에 연결되지 않은 에피토프(epitope)에 대한 자가항체이다.
버률리진TM으로 자극된 단구들에서 종양사멸 기능의 발달에 미치는 사이토킨 특이적 자가항체의 효과
배양액 특이적 세포독소 %
실험 1(폐암 환자, 창 간암) λ-IFN/LPS 8.1
버룰리진(219) 10.6
버룰리진 + 항-IL1α 13.9
버룰리진 + 항-IL1β 10.1
버룰리진 + 항-TNFα 5.9
버룰리진 + 이소타입 제어 9.3
실험 2(CML 환자, 창 간암) 매개물 5.7
버룰리진(216) 11.0
버룰리진 + 항-IL1α 92
버룰리진 + 항-IL1β 9.1
버룰리진 + 항-TNFα 2.8
이 결과는 종양괴사 인자 α에 대한 자가항체가 버룰리진TM에 의해 유발된 종양사멸의 기능을 억제한다는 것을 알 수 있다. 인터류킨 1α 또는 인터류킨 1β에 대한 자가항체는 버룰리진으로 자극된 단구들의 종양사멸의 기능을 감소시키는 것을 실패하였다. 이 결과는 버룰리진TM에 반응하여 발달전하는 대식세포의 종양사멸의 기능이 단구에 의한 종양괴사 인자 α(TNFα)의 생산과 관계있다는 결론과 일치한다.
실시예 25
본 실시예에서는 버룰리진TM으로 자극된 말초혈액 단구에서 종양사멸 기능의 발달에 미치는 세포독성 치료법의 영향를 설명한다.
말초혈액 단구를 차도가 있는 감응 화학요법(remission induction chemotherapy)의 제 1 코스의 마지막 단계에 있는 암환자들로부터 얻어, 실시예 9의 방법을 사용하여 창 간암세포에 대한 종양의 활성을 분석하였다.
그 결과는 하기 표에 나타내며, 실시예 24에서 정의한 단축용어를 사용한다. 또한, Pt는 시스(cis)-백금을 나타내며; 5-FU는 5플루오로우라실을 나타내며; RT는 만틀방사선요법(radiotherapy)을 나타내며; Ara C는 사이토신 아라비노사이드를 나타낸다. 진단(diagnosis)이란 용어는 환자들이 걸린 암의 종류를 말한다. 하기와 같이 재발(recurrence)이라는 용어를 사용할 때는 암이 재발하였다는 것을 의미하며, 그러면 다시 진단을 받았다. 치료(Therapy)라는 용어는 암환자들이 하고 있는 암의 화학요법/만틀방사선요법의 양생법(regimen)을 말한다.
버률리진TM으로 자극된 말초 혈액 단구에서 종양사멸 기능의 발달에 미치는 세포독성 치료법의 영향
진단 치료제 중재물질 IFN/LPS 버룰리진
세포독소 %
ENT 암 Pt/5-FU 6.8 11.7 10.2
ENT 암 RT/Pt/5-FU 5.8 10.1 24.2
ENT 암 RT 28.8 31.2 44.3
ENT 암 RT/Pt/5-FU 11.6 120 24.9
ENT 암 RT/Pt/5-FU 460 56.8 801
ENT 암 RT 11.6 22.8 27.6
CML Ara C 13.5 10.7 35.6
자극자수/전체 시험자수 3/7(43%) 6/7(86%)
이 결과로 버룰리진TM이 세포독성 치료를 받고 있는 암환자로부터 얻은 대식세포에서의 종양사멸의 작용을 자극한다는 것을 알 수 있다. 따라서, 버룰리진이 적당한 또 다른 치료법의 양상과 상호작용한다는 것을 알 수 있다. 본 실시에에서, 버룰리진이 감마 인터페론 플러스 독성 등과 같은 종래의 활성화물질에 비해 종양 작용을 보다 효과적으로 자극한다는 것을 알 수 있다.
실시예 26
본 실시예에서는 자궁내막암 환자들의 대식세포의 세포독성에 대향한 버룰리진의 효과를 설명한다.
자궁내막암 환자들에게서 말초 혈액단구와 복막 대식세포를 실시예 9에서와 동일한 방법으로 얻었고, 창 간암세포에 대한 종양 활성과 자궁 생체검사로부터 준비한 자생 자궁내막세포에 대향한 세포독성에 대하여 테스트하였다.
그 결과를 하기 표에 나타내었고, 표에서 사용된 약어 및 용어는 실시예 25에서와 동일하다. 또한, 단계는 RAFS(Revised American Fertility Society) 분류계에 기초한 자궁내막암의 진행단계를 의미한다.
자궁내막암 환자들의 대식세포의 세포독성에 대향한 버룰리진의 효과
단계 배치 # 중재물질 IFN/LPS 버룰리진 효과
Ⅲ 219 9.5 ND 21.3 자극
Ⅱ 219 1.2 4.5 9.2 자극
Ⅳ 233 11.5 15.3 26.9 자극
Ⅳ 238 11.5 15.3 37.3 자극
Ⅲ 233 7.4 11.1 14.0 자극
Ⅲ 238 7.4 11.1 16.4 자극
상기한 결과는 버룰리진TM은 자궁내막암 환자들의 말초 혈액단구와 복강 대식세포를 자극하여 자궁 생체검사로부터 준비한 자궁내막세포를 사멸시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 자궁내막암의 치료에 유효하다.
실시예 27
본 실시예에서는 버룰리진TM배치의 예비시험 결과를 설명한다.
정맥혈(venous blood)로부터 말초 혈액단구를 얻고, 처리한 후, 실시예 9에서와 동일한 방법으로 창(Chang) 간암세포에 대한 종양사멸의 활성을 검사하였다. 버룰리진은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 준비하였다.
그 결과를 하기의 표에 나타내었고, 표에서 사용된 약자와 용어는 실시예 26에서와 동일하다. 또한, 혈액 제공자란에는 말초 혈액단구를 얻은 환자의 병의 상태를 나타내었다. 정상이란 병이 없는 환자를 의미하며, ENT CA는 머리와 목 부위(귀/코/인후)의 암에 걸린 환자를 의미한다.
버룰리진 로트 247, 248 및 249의 예비 시험
혈액 제공자 배치 # 중재물질 IFN/LPS 버룰리진
정상 247 11.7 21.0 31.1
정상 248 11.7 21.0 19.6
정상 249 11.7 21.0 29.1
ENT CA 247 11.6 22.8 27.6
ENT CA 248 11.6 22.8 26.7
ENT CA 243 9.3 15.3 29.6
ENT CA 247 93 15.3 17.9
ENT CA 248 9.3 15.3 11.4
ENT CA 249 9.3 15.3 26.2
상기한 결과로부터, 정상인과 암환자의 단구에서 버룰리진TM에 의해 유도된 종양사멸의 활성이 종래 대식세포의 활성화물질(IFN-γ 및 LPS)과의 혼합물에 의해 유도되는 활성과 동일하거나 더 크다는 것을 알 수 있다.
실시예 28
본 실시예에서는 활성 분획(active fraction)의 분리에 대하여 설명한다.
조성물 시료 300㎖를, 용기의 온도가 40℃ 이하인 로토베프(rotovap) 상에서 증발시켜 건조시켰다. 증발공정 동안, 용액을 알칼리성으로 유지시키기 위하여, 증발공정이 완료될 때까지, 조성물에 수산화암모늄 농축액 5방울을 30분마다 첨가하였다. 얻은 잔류물의 중량은 11.6g이었다.
그런다음, 메탄올에 수산화암모늄을 10% 농도로 용해시킨 용액 20㎖를 상기한 잔류물 2g에 가하였다. 불용물을 여과하여 제거한 후, 여액을, 5㎝×12.5㎝ 칼럼에 60Å의 플래시 실리카겔 101.93g이 충전된 칼럼을 통과시켜 크로마토그래피하였다. 용매계로는 메탄올에 수산화암모늄을 10% 농도로 용해시킨 용액을 사용하였다. 칼럼은 압력 10 p.s.i에서, 유속 11㎖/분으로 가동하였다. 용매 100㎖를 칼럼을 통과시킨 후, 12개의 20㎖ 분획들을 얻었다. 이들 분획들의 수는 칼럼 아래로 빠르게 이동하는 off-white 밴드의 출현과 관련되어 있다.
이들 분획들에 대하여 얇은막 크로마토그래피(TLC)를 실리카겔 판상에서 메탄올에 수산화암모늄을 10% 농도로 용해시킨 용액으로 전개하였고, 닌히드린을 분무하여 가시화하였다. TLC 상에 나타나는 양상이 유사한 분획들을 합쳐서 하기의 분획 혼합물을 얻었고, 로토베프 위에서 건조시켰다.
분획들 분획을 얻기 위해 칼럼을 통과시킨 부피 생성량(g)
1~4 100 - 180 0
5~6 180 - 220 0.1175
7~8 220 - 260 0.1969
9~10 260 - 300 0.0151
11~12 300 - 340 0.0053
분획 5~6, 7~8 및 9~10은 Rf= 0.81에서 닌히드린과 양성반응을 나타내었다.
분획 5~6 및 9~10에 대하여, 시험관내에서 TNF 자극 시험을 (실시예 9에 따라서) 실시하였다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
분획물 활성도
5~6 50pg/㎎
9~10 1814pg/㎎
시험결과로부터, 분획 9~10이 매우 유효한 TNF 자극물질임을 알 수 있다.
분획 5~6의 시료들에 대하여 전자충격 질량분광기(Electron Impact Mass Spectroscopy; EI MS)와 전자분무 질량분광기(Electrospray Mass Spectroscopy)로 분석하여 분획 중에 존재하는 특정 화합물들을 동정하였다. 전자분무 MS는, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) Sciex API-Ⅲ 분광계 상에서, 용질로서 물중의 5% 초산액을 사용하여 수행하였다. 몇몇 시료에서는, 메탄올을 가하여 용해를 도왔다. 직접 주사 프로브(direct insertion probe)를 사용하는 EI MS는, VG 분석 모델 ZAB-SE 분광계 상에서 매트릭스로서 글리세롤을 사용하여 수행하였고, 크래토스(Kratos) 분석 양상 질량 분광계 상에서 DCI 프로브를 사용하여 수행하였다.
그 결과 얻은 스펙트럼을 보면, 분획 5~6 중에 다음의 화합물들이 존재할 수 있음을 알 수 있다 : 포스포콜린(phosphocholine), 타우로콜산(taurocholic acid), 콜린-스테아린산 디글리세리드, 스테아린산, 스테아린산 디글리세리드, 팔미틴산-스테아린산 디글리세리드, 및 스핑코신-올레인산 접합체.
실시예 29
본 실시예에서는 활성 분획을 분리하기 위한 스케일-업(scale-up) 공정을 설명한다.
실시예 28을 다음과 같이 더 큰 규모로 반복실시하였다. 조성물 900㎖에 수산화암모늄 농축액 10㎖를 가하였고, 얻은 용액을, 용기의 온도가 40℃ 이하인 로토베프 상에서 증발시켜 건조시켰다. 증발공정 동안, 용액을 알칼리성으로 유지시키기 위하여, 증발공정이 완료되어 잔류물이 얻어질 때까지, 조성물에 수산화암모늄 농축액 5방울을 30분마다 첨가하였다.
그런 다음, 메탄올에 수산화암모늄을 10% 농도로 용해시킨 용액 150㎖를 얻은 잔류물 전체에 가하였다. 용액을 15분간 초음파처리하였고, 불용물을 여과하여 제거하였다. 여액을, 30㎝×12㎝ 크기의 칼럼에 60Å의 플래시 실리카겔 1695g이 충전된 칼럼을 통과시켜 크로마토그래피하였다. 용매계로는 메탄올에 수산화암모늄을 10% 농도로 용해시킨 용액을 사용하였다. 칼럼은 압력 6 p.s.i에서, 유속 30㎖/분으로 가동하였다. 칼럼의 결과를 하기 표에 정리하였다.
분획물 # 각 분획물의 부피(㎖) 관찰사항
1 550 맑음, 투명한 황색
2 450 맑음, 투명한 황색
3 400 맑음, 투명한 황색
4 150 맑음, 투명한 황색
5 100 맑음, 투명한 황색
6~7 75 맑음, 투명한 황색
8~13 50 맑음, 투명한 황색
14 50 황갈색으로 착색된 용액이 용출하기 시작
15~35 50 황갈색으로 착색된 용액
36~40 50 맑음, 투명한 황색
이들 분획들에 대하여 얇은막 크로마토그래피(TLC)를 실리카겔 판상에서 메탄올에 수산화암모늄을 10% 농도로 용해시킨 용액으로 전개하였고, 닌히드린을 분무하여 시각화하였다. TLC 상에 나타나는 양상이 유사한 분획들을 합쳐서 하기의 분획 혼합물을 얻었고, 로토베프 위에서 건조시켰다.
분획물 # 분획물을 얻기 위해 통과시킨 부피 생성량(g) 참고사항
3 1000 - 1400 0.0504 흰색 분말상의 고체
4~5 1400 - 1650 0.0855 흰색 분말상의 고체
6~8 1650 - 1850 0.1555 흰색 분말상의 고체
9~12 1850 - 2050 0.3014 흰색 분말상의 고체
13~14 2050 - 2150 0.3595 흰색 분말상의 고체
15~16 2150 - 2250 0.6914 다소 갈색의 고체가 끈적임
17~18 2250 - 2350 1.0284 황갈색의 고체가 덩어리짐
19 2350 - 2400 0.3432 황갈색의 고체가 덩어리짐
20~23 2400 - 2600 1.1531 갈색의 고체가 덩어리짐
24~30 2600 - 2950 0.8517 갈색의 고체가 덩어리짐
31~34 2950 - 3150 0.0813 갈색의 오일
분획 15~16에서 분획 31~34까지 모든 분획 혼합물들이, 실시예 28에서의 활성 분획들에 대한 Rf값과 매우 유사한 Rf= 0.87에서 닌히드린과 양성반응을 나타내었다. 또한, 분획 24~30 및 31~34는 Rf= 0.85에서도 닌히드린과 양성반응을 나타내었다.
분획 4~5, 15~16 및 17~18에 대하여 시험관내에서 TNF 자극 시험을 (실시예 9에 따라서) 실시한 결과, 어떤 TNF 자극활성도 나타나지 않았다. 상기한 분획들에 대하여 원소 분석을 수행한 결과, NH4Cl의 함량이 높은 것으로 나타났는데, NH4Cl은 TNF 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다.
분획 15~16 및 24~30의 시료들을 투석한 후, 실시예 28에서와 동일한 방법으로 질량 분광기로 분석하였다. 또한, 분획 17~18 및 24~30의 시료들에 대하여 투석하지 않고 분석하였다. 그 결과 얻은 스펙트럼을 보면, 다음의 화합물들이 존재할 수 있음을 알 수 있다 : 글리코콜산(glycocholic acid), 트리헥소사민 3량체(trihexosamine trimer) 및 타우로콜산(분획 15~16); 스테아린산 및 헥소사민 2량체(분획 24~30).
실시예 30
본 실시예에서는 다른 방법들을 적용하여 본 조성물의 활성성분들을 분별, 분석하는 것에 대하여 설명한다.
TNF, IL-1β 및 GM-CSF 방출물질(releasing activity)은 80%의 아세토니트릴에 의해 부분적으로 침전될 수 있으며, 대부분의 방출물질은 C18RP-HPLC로부터 초기에 용출된다는 것을 확인하였으며, 따라서 침전물 분획의 물리화학적 성질에 대하여 연구하여 왔으며, 조성물 전체 및 조성물의 상청액 분획과 비교하였다.
도 11은 조성물 전체, 조성물의 침전물 및 상청액의 SDS 겔 전기영동을 보여준다. 세 경우 모두에서, 조성물은 거의 SDS 앞에 나타났으며, 이것은 저분자량임을 나타낸다. 사용된 가장 작은 표준물질은 14,400 달톤이었다.
또한, 조성물의 분자 크기는 분자체(molecular sieve) HPLC 칼럼을 통과하는 시간을 측정함으로써 확인할 수 있다. 조성물 전체, 침전물 및 상청액의 용출시간을 표준물질들과 비교하였다. 세가지 모두, 24.5분에 용출한 인슐린 보다 늦게 용출하였다. 이러한 물리화학적 분석도 분자량이 2,400달톤 보다 작음을 나타낸다.
TNF-방출성분은 초기에 용출한다. 따라서, 반대되는 효과를 지닌 칼럼으로서, 유기용매 존재하에 친수성인 칼럼을 선정하였다. 폴리히드록시에틸 칼럼에 대하여 이상적은 용리 조건은 80%의 아세토니트릴이다. 그러나, 전술한 실시예에서 나타낸 바와 같이, 이 농도에서는 어떤 물질들은 준비중에 침전하였다. 결과적으로, 조성물은 낮은 농도의 아세토니트릴에서 분석하였고, 이때 칼럼은 대체적으로 분자망 칼럼으로서 작용한다. 도 12 및 도 13은 전체 상청액과 침전물의 양상을 보여준다. 앞장은 다른 피크들에 대한 용출시간을 정리한 것이다. 용출시간은 조성물중의 활성성분이 저분자량임을 나타낸다.
조성물과 그의 침전물 및 상청액은 이온교환 HPLC로 분리하였다. AX300(음이온 교환) 크로마토그래피 및 CMX 300(양이온 교환) 크로마토그래피 둘다에 의해서도 뚜렷한 성분 분리는 나타나지 않았다. 소수성 역상 크로마토그래피에 의해서도 피크들은 분리되지 않았다.
다른 일련의 실험에서, 버룰리진TM10㎖를 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad AG-1, 수산화물 형태, 전체 수지 습식 부피 : 10㎖, 밀리포어(Millipore) 탈이온수로 평형) 상에 로드하였다. 수지의 부피는 추출물중에 존재하는 모든 음이온을 고정하는데 충분하도록 산출한 것이다. 두 번째 통과에서 고정되지 않은 분획을 회수하여 모아두었다. 칼럼의 빈 틈사이에 잔류하는 고정되지 않은 물질들은 탈이온수(2×20㎖)로 씻어서 제거하였다. 고정된 분자들을 단계적인 농도의 탄산수소암모늄으로, 각 단계당 20㎖씩 용리시켰다. 유리 탄산수소암모늄은 동결건조시켜 제거하였다. 모든 분획들의 시료에 대하여, 단구/대식세포 활성화 분석에서 TNF-방출 활성을 시험하였다.
TNF-방출 활성은 고정되지 않은 분획(폐액)에서는 나타나지 않았고, 대부분은 0.2M의 탄산수소암모늄으로 용리하여 나온 용출액에서 나타났다. 이런 결과는 활성성분이 본래 극성이며, 음이온성 및 산성임을 나타낸다.
모든 분획들의 시료에 대하여 실시예 2에서와 동일한 방법으로 TNF 자극 활성을 분석하였다. 그 결과를 아래에 나타내었다.
샘플 TNFα 방출을 유도하는 활성-LPS(pg/㎖)
0 M -496
0.1 M -156
0.2 M 1638
0.3 M -36
0.4 M 256
0.5 M -27
0.6 M -175
1.0 M -246
1.5 M -346
버룰리진TM대조군 1961
활성분석 결과는, TNF 생성 자극이 0.2M과 0.4M 분획에서 나타남을 보여준다.
조성물을 투석한 후, 투석물을 다음과 같이 건조시켰다 : 조성물 100㎖를, 분자량이 100씩 새겨진 Spectra/PorRCE 막조직 관의 내부에 배치하였다. 관의 말단을 클립으로 밀봉하고, 관을 정제수 10ℓ가 채워진 교반기에 넣었다. 매일 투석관으로부터 용액 1㎖를 제거하고, 1/10N의 질산은 용액 3~4방울을 가하여 투석을 관찰하였다. 염화물의 존재는 투석이 완료되지 않았음을 나타낸다. 투석이 끝나지 않는 경우, 용기의 물을 신선한 정제수로 갈아 준다. 투석은 3~4일 후에 끝난다. 투성이 끝난 후에, 투석된 물질은 로토베프상에서 건조시켜 원래 부피 ㎖당 평균 0.3㎎의 고체를 얻었다.
그런 다음, 고형물 시료를 HPLC급 물에 용해시켰고, TLC를 실리카겔 판상에서 메탄올에 수산화암모늄을 10% 농도로 용해시킨 용액으로 전개시켰고, 닌히드린을 분무하여 시각화하였다. 닌히드린과의 양성 반응은 Rf= 0.83에서 나타났다.
또한, 고형물 시료를 실시예 28에서와 동일한 방법으로 질량 분광기로 분석하였다. 그 결과 얻은 스펙트럼을 보면, 다음의 화합물들이 존재할 수 있음을 알 수 있다 : 스핀고신-올레인산 접합체, 디아세틸 시알산(diacetyl sialic acid), 푸코스-헥소사민 2량체(fucose-hexosamine dimer), 데옥시글리코콜산, 타우로콜산, 시알산-푸코스 2량체 및 디(푸코스)헥소사민 3량체.
실시예 31
본 실시예에서는, 역상-HPLC(RP-HPLC)를 사용하여 본 조성물을 분석하는 것에 대하여 설명한다.
시료들을 동결건조시킨 후, 물중의 0.1% 트리플루오로아세트산 용액(완충액 A) 중에서 재구성하고, 이어서 하기의 칼럼 및 조건에서 수행하였다.
칼럼 : WP60009-C18 칼럼(W-포어 C18, 250×4.6㎜, Phenomenex, 캘리포니아)
열(row)로 제 1의 구형 HC-C18 칼럼(250×4.6㎜, Phenomenex, 캘리포니아)
용리액 : 완충액 A : 물중의 0.1%의 TFA
완충액 B : 물중의 0.1%의 TFA
농도경사(Gradient) : 칼럼에 시료 150㎕ 적용
20분간 완충액 A 전개
35분간 출발 선형 농도경사, 0~80%의 완충액 B 전개
5분간 80~0%의 완충액 B 전개
유속 : 0.9㎖/분
온도 : 주위 온도
검출 : 290~284㎚ 흡광도, 최고 전개는 210~235㎚에서 검출
주입으로부터 대략 하기 표에 나타낸 시간에, 15개의 용출 분획을 모았다. 또한, 각 분획에 대하여 실시예 2에서와 동일한 방법으로 TNF 방출 분석을 수행하였고, 다음의 결과를 얻었다.
분획 # 시간(분) TNF(pg/㎖)
1 5.6~6.25 203
2 6.25~6.6 -157
3 6.6~7.1 1
4 7.1~7.9 11
5 7.9~8.4 84
6 8.4~8.9 -24
7 8.9~9.4 -10
8 9.4~10.0 36
9 10.0~10.4 24
10 10.4~12.0 11
11 12.0~13.6 49
12 13.6~14.2 39
13 14.2~15.35 -9
14 15.35~16.75 39
15 16.75~18.20 -5
전체 버룰리진TM 213
따라서, 버룰리진TM의 활성성분들의 대부분은 분획 1에서 용출되었다. 활성은 또한 분획 4~5, 8~9, 11~12 및 14에서도 발견되었다.
모든 RP-HPLC 분획들의 시료들을 실시예 28에서와 동일한 방법으로 질량 분석기로 분석하였다. 그 결과 얻은 스펙트럼을 보면, 다음의 화합물들이 존재할 수 있음을 알 수 있다 : 타우로콜산, 시알산-글리세롤 2량체, NaCl, 트리메틸아민, 메틸에틸아민, 및 프로필아민.
실시예 32
본 실시예에서는 본 조성물에서 확인된 화합물들에 대하여 설명한다.
본 조성물은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 준비하였고, (1) 100 MWCO 투석막에서의 투석; (2) 폴치(Folch) 추출법(Tamari et al.,Agr. Biol. Chem.,40 (10), 2057-2062 (1976))을 포함하는 전형적인 유기 추출법; (3) 실리카 칼럼 크로마토그래피; (4) 이온 교환 크로마토그래피; 및 (5)「박층 및 종이 크로마토그래피용 염색 시약(Dying Reagents for Thin Layer and Paper Chromatography)」(E. Merck, Darmstadt, 독일, 1971)에 기재된 표준법을 활용하여, 용리액으로서 부탄올:초산:물 = 6:2:2 혼합액을, 시각화 시약으로서 닌히드린을 사용하여 실리카 TLC 예비 분별법을 포함하는 표준 분별법을 적용하였다.
화합물들은 다음의 기구와 기술들을 단독으로 또는 조합하여 활용함으로써 확인하였다 :
VG 70-2505 분광계는 EI-MS, CI-MS(OH-) 및 FAB-MS(글리세롤 또는 티오글리세롤 기질에서)를 얻는데에 사용하였다. VG 분석 모델 ZAB-SE 기구는 EI-MS, FAB-MS(글리세롤 또는 티오글리세롤 기질에서) 및 GC-MS를 얻는데에 사용하였다. 이 기구와 병용한 기체 크로마토그래피(GC)는 휴렛 팩커드 모델 5890이었다. 크래토스(Kratos) 프로파일 분광계는 EI-MS, LSIM-MS(글리세롤 및 NPOE 기질에서), 및 GC-MS 질량 스펙트럼을 얻는데에 사용하였다. 이 기구와 병용한 GC도 또한 휴렛 팩커드 모델 5890이었다. MS-MS, 용질로서, 물이나 물과 알콜(메탄올 또는 이소프로필 알콜)과의 혼합물을 사용하는 전자분무(electrospray), EI-MS, 글리세롤 및 트리글리세롤 중에서의 FAB-MS는 퍼킨-엘머 Sciex API-Ⅲ 분광계 상에서 수행하였다. MS 분석을 위하여, 무수 초산/피리딘을 처리하여 아세틸화하거나 디아조메탄으로 처리하여 메틸화하는데에 필요한 만큼의 분획들을 유도하였다. 전자분무 용질에 초산나트륨을 첨가함으로써 분자들을 소듐 부가체(sodiated species)로 전환시켰다. 전자분무 MS용 분자들의 양성자 첨가반응(Protonation)은 초산 또는 트리플루오로초산을 사용하여 실시하였다. 추출물과 표준물의 TLC를, 부탄올:초산:물=6:2:2 혼합물 또는 이동상으로서 공지된 용리액을 사용하여 실리카 TLC판 상에서 가동하였고, 시각화를 위하여 몇몇 시약을 분무하였다.
상기한 기구들과 관련된 표준법을 활용하였고, 이들에 대해서는 다음의 자료들에 자세하게 기재되어 있다 : Rigler et al.,J. Chromatography,277, 321-327 (1983); Sundaram et al.,Clinica Chimica Acta,34, 425-429(1971); Bandurski et al.,J. Biol. Chem., 193 405-410 (1951); 및 Larsen et al.,J. Chromatography, 226 484-487 (1981).
버룰리진TM의 활성 로트들(active lots)에 대한 실리카 판상에서의 대표적인 TLC 프로파일(용리액으로서 부탄올:초산:물=6:2:2)을 표로 나타내었다.
시각화 시약 TLC
황산 Rf= 0~0.25, 흰색 스폿
세륨을 함유한 황산암모늄 Rf= 0.05~0.42, 노란색 스폿
몰립덴산염(molybdate) Rf= 0~0.3, 옅은 파란색-초록색 스폿에서파란색-초록색 가장자리를 갖는 흰색 스폿까지
아니살데히드(anisaldehyde) Rf= 0.03~0.25, 흰색 스폿
8-아닐리노-1-나프탈렌 술폰산 Rf= 0~0.25, 노란색 스폿들(육안으로)
닌히드린 Rf= 0~0.13, 옅은 분홍색 스폿Rf= 0.12~0.3, 자주빛 스피어(spear)-헤드형 스폿Rf= 0.15~0.3, 포도주빛 스폿Rf= 0.3~0.45, 옅은 노란색 스폿Rf= 0.35~0.5, 진한 노란색 스폿Rf= 0.4~0.5, 포도주빛 스폿Rf= 0.5~0.6, 포도주빛 스폿
(주) Rf값들은 판상에 피복된 실리카겔의 활성도와 용리용매의 정확한 조성에 따라서다소 변할 수 있다.
상기한 기구들과 기술들을 이용하여 본 발명의 조성물을 분석한 결과, 다음의 화합물들이 함유되어 있음이 밝혀졌다 :
(1) 담즙산(bile acids) :
콜산;
글리코콜산;
데옥시글리코콜산;
콜레스테롤 설페이트;
데옥시콜산;
케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid); 및
타우로콜산
(주) 우선, MS로부터는 MS에 -OH 및 -H2가 있는지, 그리고 데옥시, 디데옥시 및 불포화 동족체들이 존재하는지가 구별되지 않는다. 이들 화합물들은 모두 암모늄, 알킬암모늄 및 무기 양이온의 염들로 존재할 수 있다.
(2) 인지질, 스핀고리피드(spingolipids) 및 관련된 (가수분해) 산물들 :
스테아린산 CH3(CH2)16COOH ;
팔미틴산 CH3(CH2)14COOH ;
올레인산 Z-9 옥타데칸산 CH3(CH2)2CH2CH=CHCH2(CH2)6COOH ;
산화된, 또는 수산기가 첨가된/불포화 저급 지방산, 예를 들면 C6H8O3(CH3CH=CH-COCH2COOH 또는 2중결합과 수산기를 지닌 C6산);
초산;
스테아린산 디글리세리드;
팔미틴산 디글리세리드;
스테아린산, 팔미틴산 디글리세리드;
스테아린산 모노글리세리드-포스포콜린(리졸레시틴(lysolecithin));
스테아린산 모노글리세리드;
스테아린산 트리글리세리드;
포스포콜린;
포스포세린;
포스포스핀고신;
스핀고미엘린(sphingomyelin);
레시틴;
스테아린산-스핀고신;
스핀고신;
포스포글리세롤;
글리세롤;
콜린;
글리세롤-포스포콜린;
스테아린산, 올레인산 디글리세리드;
스테아린산, 올레인산 포스포글리세롤;
스테아린산 아미드;
스테아린산 메틸아미드; 및
팔미틴산 아미드.
부가적으로, 예비 HPLC 및 적정시험 결과는 저급 지방산들(C1~C30)이 존재한다는 것을 보여주었다.
(3) 뮤신 가수분해 산물 :
시알산과 그들의 모노- 및 디아세틸레이티드 단량체들;
N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid);
헥소사민류, 예를 들면 글리코사민;
L-푸코스;
헥소사민-헥수론산 (2량체) 디설페이트;
글루쿠론산(glucuronic acid);
글루쿠론산 또는 이두론산(iduronic acid) 디설페이트, 모노아세틸레이티드;
시알산-글리세롤 (2량체); 및
상기한 단량체들의 아세틸레이티드 및 설페이티드 형태의 2량체, 3량체, 올리고머 및 폴리머.
(4) 지용성 비타민류 :
비타민 A2;
비타민 D1;
루미스테롤(lumisterol)(비타민 D1과의 착물로서 존재한다)
비타민 E;
비타민 K1 산화물; 및
비타민 K5.
(5) 기타 유기물 :
요소;
메틸아민, 디메틸아민, 에틸아민, 메틸에틸아민, 디에틸아민, 디프로필아민, 부틸에틸아민을 포함하는 알킬아민;
타우린, 글루타민산, 글리신, 알라닌, n-로이신, 포스포세린, 포스포에탄올아민, 아스파라긴산, 트레오닌, 세린, 사르코신(sarcosine), α-아미노 아디프산, 시트룰린, 발린, 이소로이신, β-알라닌, γ-아미노 부티르산, 히드록시리신, 오르니틴 및 리신을 포함하는 아미노산류;
부틸레이티드 히드록시 톨루엔(BHT); 및
폴리에틸렌글리콜.
실시예 33
본 실시예에서는 본 발명의 당성분들에 대하여 설명한다.
시료들의 단당류 조성은 가수분해 전후에 분석하였다. 단당류를 분석하는데 사용된 모든 시약들은 분석용 등급이었다. 앨드리치(Aldrich)로부터 얻은 THF(트리플루오로아세트산)는 탈이온수로 희석한 후에, 시료들의 가수분해에 사용하였다. 50%(w/w)의 NaOH 용액(탄산염이 적은)을 Fisher Scientific으로부터 구입하였다. 초산나트륨은 뉴욕에 있는 Fluka-Gerantie로부터 구입하였다.
단당류를 방출시키기 위하여, 시료들을 4M의 트리플루오로아세트산으로 100℃에서 4시간동안 처리하였다. 시료들을 동결건조시켰고, 고성능 액체 크로마토그래피-음이온 교환수지로, 카르보팩(Carbopack) Pal 분리 칼럼(250×4㎜ i.d.)과 25㎕의 시료 루프를 구비한 HPLC-AG6 가드 칼럼(50×4㎜ i.d.)으로 탄화수소용 Dionex Bio-LC 시스템을 활용하여 분석하였다. 용출되어 나오는 단당류들은 PAD, 즉 펄스 전류계로 검출하였다. 조건은 다음과 같았다 :
가수분해 전 :
이노시톨(inositol), 시알산 및 글루쿠론산을 검출하기 위하여, 이소크래틱(isocratic) 용출 용리액(100mM의 NaOH ＋ 150mM의 NaOAc 혼합물)을 사용하였다. 용리액을 헬륨 모듈 탈가스제(helium module degasser)로 대기로부터 차단하였다. 칼럼통과 유속은 1㎖/분으로 하였다.
푸코스, 갈락토사민, 갈락토스, 글루코스 및 만노스를 포함하는 단당류들도, 이소크래틱 용출 용리액(15mM의 NaOH)을 거쳐서, 포스트 칼럼 300mM의 NaOH로, 1㎖/분의 유속에서 검출하였다.
검출기는, E1=0.05V, E2=0.60V, E3=0.60V, t1=120㎳, t2=120㎳, t3=300㎳; 금 동작전극; 은-염화은 기준전극; 출력범위 1~3K nAmp 전범위 스케일; 기록 속도 0.5㎝/분로 설정하였다.
측정은 우론산과 단당류용 검출기로 수행하였다. 표준 혼합물의 점진적인 희석에 의한 0.5~2.5㎍/㎖의 농도변화에 대한 선형 반응을 얻었다.
가수분해 후 :
시료들을 가수분해시킨 후에, 경사 용리(gradient elution), 용리액 A(50mM의 NaOH) 및 용리액 B(50mM의 NaOH/150mM의 NaOAc 혼합물)을 적용하여 단당류를 검출하였다. 용리액을 헬륨 모듈 탈가스제(helium module degasser)로 대기로부터 차단하였다. 출력을 분석하기 위하여 스펙트라-피직스(Spectra-Physics(SP 4270) 적분기를 사용하였다. 표준 경사는 용리액 A 100%를 주입한 후, 그다음 10분간에 걸쳐 A 80% : B 20%에 이를 때까지 선형적으로 점차 변화시켜 주입하는 것이다. 이 조건은 20분동안 유지하였고, 그런 다음에 다시 용리액이 A 100%가 될 때까지 5분간에 걸쳐 주입한 후, 다음 시료를 주입하기 전에 적어도 10분간 평형상태에 있게 하였다.
단당류 분석의 결과를 다음의 표에 나타내었다.
시료 당 MU 100(Folch 추출로부터 얻은 물층) MU 148A(MU100B 투석) MU 115A(미리 섞어놓은A 로트 BC0241 투석) MU 100 GB(녹색담즙의에틸아세테이트추출물)
가수분해전 가수분해후 가수분해전 가수분해후 가수분해전 가수분해후 가수분해전 가수분해후
이노시톨 글리세롤의 동일rt 글리세롤의 동일rt 글리세롤의 동일rt
시알산 ＜279.3ng/㎎ 0 0 3.67㎍/㎎ 0
글루쿠론산 0 284.4ng/㎎ 0 0 0 3.02㎍/㎎ 4.04㎍/㎎ 826.58ng/㎎
갈락투론산
푸코스 0 0 0 0
갈락토사민 0 0 0 0
글루코사민 ＜139.6ng/㎎ 543.02ng/㎎ 234.5ng/㎎
갈락코스 0 0 0 0
글루코스 0 0 0 0
만노스 0 0 0 0
미확인된, 대부분글리세롤 포스페이트 yes 미확인물의 강한 피크
표에서 보는 바와 같이, 녹색 담즙의 에틸아세테이트 추출물만이 가수분해전에 어떤 단당류를 포함하고 있는 것으로 나타났으며, 이들은 수㎎/㎖ 농도의 시알산과 글루쿠론산이었다. 가수분해 후에는, 시알산을 검출되지 않았으며, 글루쿠론산은 대량 20%의 농도로 존재하였다. 다른 예비의 본 조성물들은, 가수분해 후에, 시알산, 글루쿠론산, 글루코사민, 및 이노시톨을 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다.
이상으로부터, 본 발명의 특정 구현예들이 설명을 위하여 제시되었지만, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위를 제외하고는 한정되지 않는다.

Claims (6)

  1. 췌장암, 악성 흑색종, 난소암, ENT 암, 자궁내막암, 폐암 및 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 암을 치료하는데 사용하기 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 3000 달톤 미만의 소분자량 성분을 포함하며 다음과 같은 특성:
    a) 동물의 담즙에서 추출가능하며;
    b)시험관내또는생체내에서 대식세포와 단구를 자극할 수 있고;
    c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있으며;
    d) 측정가능한 양의 LI-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ을 함유하지 않고;
    e) 인간 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cell)에 대해 세포독성을 나타내지 않고;
    f) 엔도톡신이 아닌 것;
    을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
  2. 자궁내막증식증 치료하는데 사용하기 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 3000 달톤 미만의 소분자량 성분을 포함하며 다음과 같은 특성:
    a) 동물의 담즙에서 추출가능하며;
    b)시험관내또는생체내에서 대식세포와 단구를 자극할 수 있고;
    c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있으며;
    d) 측정가능한 양의 LI-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ을 함유하지 않고;
    e) 인간 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cell)에 대해 세포독성을 나타내지 않고;
    f) 엔도톡신이 아닌 것;
    을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 췌장암, 악성 흑색종, 난소암, ENT 암, 자궁내막암, 폐암 및 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 암의 치료를 위한 약물을 제조하는데 사용하기 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 3000 달톤 미만의 소분자량 성분을 포함하며 다음과 같은 특성:
    a) 동물의 담즙에서 추출가능하며;
    b)시험관내또는생체내에서 대식세포와 단구를 자극할 수 있고;
    c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있으며;
    d) 측정가능한 양의 LI-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ을 함유하지 않고;
    e) 인간 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cell)에 대해 세포독성을 나타내지 않고;
    f) 엔도톡신이 아닌 것;
    을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 자궁내막증식증의 치료를 위한 약물을 제조하는데 사용하기 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 3000 달톤 미만의 소분자량 성분을 포함하며 다음과 같은 특성:
    a) 동물의 담즙에서 추출가능하며;
    b)시험관내또는생체내에서 대식세포와 단구를 자극할 수 있고;
    c) 종양괴사인자의 생산을 조절할 수 있으며;
    d) 측정가능한 양의 LI-1α, IL-1β, TNF, IL-6, IL-8, IL-4, GM-CSF 또는 IFN-γ을 함유하지 않고;
    e) 인간 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cell)에 대해 세포독성을 나타내지 않고;
    f) 엔도톡신이 아닌 것;
    을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 근육내 경로를 통해 주사됨을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 근육내 경로를 통해 주사됨을 특징으로 하는 용도.
KR1019970706498A 1995-03-16 1996-03-13 신규의 침전탄산칼슘 안료를 포함하는 잉크젯 기록지 KR19980703088A (ko)

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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040101569A1 (en) * 1996-05-16 2004-05-27 Lorus Therapeutics Inc. Immunomodulating compositions from bile
CA2206047A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-23 Romeo Rang (Deceased) Immunomodulating compositions for the treatment of viral disorders
US7799766B2 (en) * 1998-04-08 2010-09-21 Theta Biomedical Consulting & Development Co., Inc. Composition for treating hormonally-dependent cancers
AU5152799A (en) * 1998-06-03 1999-12-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Glycosyl-inosite-phospho-ceramide (gipc), method for the production and use thereof
WO2002038164A1 (en) 2000-11-08 2002-05-16 Lorus Therapeutics Inc. Combination preparation of a biological response modifier and an anticancer agent and uses thereof
WO2002102363A1 (en) * 2001-06-20 2002-12-27 Lorus Therapeutics Inc. Biological response modifier composition and uses thereof
WO2005016954A2 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 Boston Medical Center Corporation Immunologic activity measure(s) for t “helper” on-associated conditions
US7136936B2 (en) * 2003-10-03 2006-11-14 Asoka Usa Corporation Method and system for virtual powerline local area networks
US7457885B2 (en) * 2005-02-10 2008-11-25 Asoka Usa Corporation Powerline communication system and method using coupler design for additional users
US20050220912A1 (en) * 2004-03-30 2005-10-06 Theoharides Theoharis C Anti-inflammatory composition for treating pelvic endometriosis
WO2006094384A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Genesense Technologies Inc. Use of interleukin 17e for the treatment of cancer
US20100178652A1 (en) * 2007-01-05 2010-07-15 Litherland Sally A Materials and Methods for the Detection, Prevention and Treatment of Autoimmune Disease
US8042027B1 (en) 2007-01-16 2011-10-18 Marvell International Ltd. BM/LLR computation for multi-dimensional TCM/BCM
US8236354B1 (en) * 2012-02-17 2012-08-07 ZOR Pharmaceuticals, LLC Use of immunomodulators for the treatment of cancer
US8338383B1 (en) 2012-02-17 2012-12-25 Gregory Jr Daniel Tyree Use of immunomodulators for the treatment of cancer
CL2014003632A1 (es) * 2014-12-31 2015-06-26 Pontificia Universidad Católica De Chile Método que comprende el cultivo y expansión de células presentes en líquido ascítico de origen peritoneal, pleural, lavado peritoneal o lavados sistémicos que permite determinar el mejor tratamiento para pacientes con cáncer.
CN113143936B (zh) * 2021-02-10 2022-03-25 北京蕴汇医药科技有限公司 鹅去氧胆酸或其衍生物在制备egfr和/或stat3的抑制剂中的用途
CN114657125B (zh) * 2022-04-29 2023-08-08 中国科学院海洋研究所 鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB337797A (en) 1929-07-08 1930-11-10 Henry Leitner A specific for cancer
GB2046092B (en) 1979-03-05 1983-11-02 Toyama Chemical Co Ltd Pharmaceutical composition containing a lysophospholid and a phospholipid
US4562179A (en) 1982-04-19 1985-12-31 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Phospholipid derivatives, and pharmaceutical composition of the same
US4585762A (en) 1982-07-30 1986-04-29 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Phospholipid derivatives, processes for use thereof and pharmaceutical composition of the same
JPS5984824A (ja) 1982-11-08 1984-05-16 Takeda Chem Ind Ltd 抗腫瘍剤
US4879226A (en) 1984-04-06 1989-11-07 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel human physiologically active polypeptide
US4767610A (en) 1984-10-19 1988-08-30 The Regents Of The University Of California Method for detecting abnormal cell masses in animals
US4916249A (en) 1985-07-03 1990-04-10 Hans Brachwitz Glycero-3(2)-phospho-L-serine derivatives and salts thereof
IE59777B1 (en) 1985-12-04 1994-04-06 Max Planck Gesellschaft Medicaments
GB8706313D0 (en) 1987-03-17 1987-04-23 Health Lab Service Board Treatment & prevention of viral infections
US5087721A (en) 1987-10-23 1992-02-11 The University Of Michigan Radioiodinated phosphate esters
US4965391A (en) 1987-10-23 1990-10-23 The University Of Michigan Radioiodinated phospholipid ether analogues
US5138067A (en) 1987-12-17 1992-08-11 Shionogi & Co. Ltd. Lipid derivatives
EP0356765A3 (en) 1988-08-19 1991-08-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Carboxylic acid derivatives, their production and use
EP0378763A1 (en) 1988-10-27 1990-07-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lipids, their production and use
GB8909022D0 (en) 1989-04-20 1989-06-07 Cortecs Ltd Pharmaceutical compositions
US5109118A (en) 1989-07-06 1992-04-28 Yutaka Mizushima Modified biologically active proteins
GB8928580D0 (en) 1989-12-19 1990-02-21 Scras 3-(n-methyl-n-alkylamino)-methoxymethyl-propanol phosphocholine derivatives
US5369097A (en) 1991-04-25 1994-11-29 The University Of British Columbia Phosphonates as anti-cancer agents
US5352682A (en) * 1993-03-08 1994-10-04 Digestive Care Inc. Compositions containing salts of bile acid-aminosalicylate conjugates
EP0717631B1 (en) * 1993-09-09 2003-07-09 Lorus Therapeutics Inc. Immunomodulating compositions from bile
TW342436B (en) 1996-08-14 1998-10-11 Nippon Oxygen Co Ltd Combustion type harm removal apparatus (1)

Also Published As

Publication number Publication date
NO974257D0 (no) 1997-09-15
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WO1996028175A1 (en) 1996-09-19
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AU4873996A (en) 1996-10-02
CA2215339A1 (en) 1996-09-19
CN1182368A (zh) 1998-05-20
EP0814821A1 (en) 1998-01-07
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AU711294B2 (en) 1999-10-07
US6596319B2 (en) 2003-07-22

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