KR19980080723A - 액체시료 성분의 분리방법 및 그 방법에 사용하는 장치 - Google Patents

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사토무라신지
하야시마사요시
아라시마히데요시
오쿠야마데츠시
하나후사노부히로
다니미즈고지
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다나카모토아키
와코쥰야쿠고교가부시키가이샤
후지와라기쿠오
가부시키가이샤시마츠세이사쿠쇼
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Abstract

본 발명은 시료도입부를 세정액으로 세정하지 않더라도 캐리오버를 피할 수 있음과 동시에, 다수의 액체시료를 동일한 분리기구를 사용하여 다수회 분리해도 칼럼의 압력이 상승하거나 분리가 나쁘게 되는 현상을 피할 수 있는 액체시료 성분의 분리방법 및 그 방법에 사용하는 분리장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 액체시료를 흡착제를 보유한 분리기구의 용출방향과는 역방향으로부터 분리기구로 도입하여 용리액과 함께 용출선단으로부터 분리용출시킴으로써, 미량의 불용물과 시료도입로에 부착한 시료를 용출조작에 의해서 제거할 수 있으므로, 캐리오버와 칼럼이 막힘으로써 칼럼의 압력이 상승하거나 분리가 나쁘게 되는 현상을 피할 수 있도록 한 것을 특징으로 한다.

Description

액체시료 성분의 분리방법 및 그 방법에 사용하는 장치
본 발명은 액체시료중의 복수의 성분을 흡착제에 대한 흡착력의 차이를 이용하여 분리하는 방법 및 그 방법에 사용하는 분리장치에 관한 것이다.
액체시료중의 복수의 성분을 흡착제에 대한 흡착력의 차이를 이용하여 분리하는 방법으로서는, 일반적으로 칼럼 크로마토그래피에 의한 방법이 알려져 있다.
이 방법에서의 칼럼으로의 일반적인 시료의 도입방법은, 칼럼 담체상에 직접 또는 시료도입장치(인젝터)를 사용하여 시료를 도입하는 것이고, 이들 시료의 도입은 모두 시료의 용출방향에 대하여 상류에서 행해지는 것이다.
상기 방법은 칼럼상류로부터 시료를 도입하기 때문에, 같은 칼럼을 혈청같은 칼럼을 통과할 수 없는 불용물을 함유한 시료의 분리·분석에 반복사용하는 경우, 시료중의 미량의 불용물이 칼럼을 막히게 하기 때문에, 칼럼내의 압력이 상승하거나 분리가 나쁘게 되는 현상이 생겨, 그 결과 칼럼수명이 줄어드는 문제가 있었다. 그 때문에, 일반적으로는 시료도입전에 여과 등의 전처리를 행하여, 불용물을 제거하여 분리를 행하고 있었지만, 조작이 번잡해지고 작업능률이 오르지 않는 문제가 있었다.
뿐만 아니라, 시료도입장치를 사용하는 경우는, 시료도입장치내에 미량의 시료가 남아서, 다음에 분석하는 시료를 오염시키는 캐리오버의 원인이 되는 문제가 있었다. 그 때문에, 시료도입후, 시료도입로를 다량의 세정액으로 반복세정할 필요가 있었다.
본 발명은 시료도입부를 세정액으로 세정하지 않더라도 캐리오버를 피할 수 있는 액체시료 성분의 분리방법 및 그 방법에 사용하는 분리장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다수의 액체시료를 동일한 분리기구를 사용하여 다수회 분리해도 분리기구내의 압력이 상승하거나 분리가 나쁘게 되는 현상을 피할 수 있는 액체시료 성분의 분리방법 및 그 방법에 사용하는 분리장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 특수한 시료도입장치를 필요로 하지 않는 액체시료 성분의 분리방법 및 그 방법에 사용하는 분리장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적에 따르는 본 발명의 분리방법은, 액체시료중의 복수의 성분을 흡착제에 대한 흡착력의 차이를 이용하여 분리하는 방법에 있어서, 상기 액체시료를 흡착제를 보유한 분리기구의 용출방향과는 역방향으로부터 분리기구로 도입하고, 측정대상물질과 측정에 영향을 미치고 또한 상기 액체시료중에 용해한 물질중의 어느 것인가가 거의 완전히 용출되는 조건하에서 다른쪽을 흡착제에 흡착시키고, 이어서 흡착된 물질을 용리액과 함께 용출선단으로부터 분리용출시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 분리장치는, 흡착제를 보유한 분리기구, 그 분리기구의 일단의 용출측에 위치하는 액체시료 도입부, 및 상기 분리기구의 타단에 접속된 분리기구내를 감압 또는 감압 및 가압하는 수단을 구비한 것을 특징으로 한다.
요컨대, 본 발명은 액체시료를 용출방향과는 역방향으로부터 분리기구로 도입함으로써, 미량의 불용물이 분리기구하단(용출선단부)의 흡착제 담지부에 부착하므로, 불용물은 용출 당초에 제거되어 분리기구내에 잔존하지 않기 때문에, 다수회 분리조작을 행하여도 분리기구내의 압력이 상승하거나 분리가 나쁘게 되는 현상을 피할 수 있도록 함과 동시에, 분리기구로의 시료도입로에 도입한 시료가 잔존하고 있더라도 용출조작에 의해서 제거될 수 있기 때문에, 캐리오버를 피할 수 있도록 한 것을 요지로 하는 것이다.
본 발명의 상기 및 다른 목적 그리고 이점들은 다음 설명으로 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명의 분리장치를 도시한 개략도이다.
도 2는 종래의 분리장치를 도시한 개략도이다.
도 3은 실시예 1의 형광강도의 측정결과를 나타내는 막대그래프이다.
도 4는 실시예 2의 칼럼압력 변동의 측정결과를 나타내는 꺾은선그래프이다.
도 5는 본 발명의 분리장치의 실시예를 나타내는 일부절취평면도이다.
도 6은 본 발명의 분리장치의 실시예를 나타내는 정면도이다.
도 7은 본 발명의 분리장치의 실시예를 나타내는 측면도이다.
도 8은 본 발명의 분리장치의 실시예를 나타내는 배관계통도이다.
도 9a는 1 시약, 2 용리액인 경우의 본 발명의 분리장치의 분석 시퀀스를 나타내는 것이다.
도 9b는 1 시약, 2 용리액인 경우의 본 발명의 분리장치의 동작 시퀀스를 나타내는 것이다.
도 10a는 2 시약, 3 용리액인 경우의 본 발명의 분리장치의 분석 시퀀스를 나타내는 것이다.
도 10b는 2 시약, 3 용리액인 경우의 본 발명의 분리장치의 동작 시퀀스를 나타내는 것이다.
도 11은 실시예 5에 의한 희석배율과 AFP 농도측정치의 관계를 나타내는 검량선도이다.
도 12는 실시예 6에 의한 희석배율과 AFP 농도측정치의 관계를 나타내는 검량선도 및 희석배율과 AFP-L3 분획비(%)의 관계를 나타내는 검량선도이다.
다음에, 본 발명의 실시 형태를 설명한다.
본 발명 방법에 있어서는, 액체시료를 분리기구로 용출방향과는 역방향으로부터 도입하기 때문에, 액체시료중의 불용물은 용리액을 흘리면 역세척의 원리에 의해서 그 대부분은 최초에 용리액과 함께 용출제거된다. 또한, 흡착제에 흡착된 성분은 흡착력의 차이에 의해서 분리된다.
본 발명에 사용하는 흡착제로서는, 측정대상 A와 측정에 악영향을 미치는 불순물 B(복수이더라도 좋다)에 대하여 흡착력의 차이가 큰 것을 사용하는 것이 좋다. 예컨대, 상기 측정대상 A와 불순물 B를 분리하는 경우, 어떤 조건에서, 측정가능한 양 이상의 A를 흡착하여 용출하지만, 측정에 영향을 미치지 않는 양 이하의 B만 흡착하여 용출시키지 않는 흡착제 또는, A에 대해서는 상기와 같지만, B에 대해서는 측정에 영향을 미치지 않는 양보다 많이 흡착해도, 측정에 영향을 미치지 않는 양 이하밖에 용출시키지 않는 흡착제, A에 대해서는 거의 흡착하지 않지만, B 에 대해서는 그 대부분을 흡착하고 또한 측정에 영향을 미치지 않는 양 이하밖에 용출시키지 않는 흡착제를 선택하면 좋다. 측정에 악영향을 미치지 않는 불순물 B'에 대해서는, 측정대상 A와 분리할 수 있어도 분리할 수 없어도 지장이 없다.
본 발명에 가장 효과적인 것은 측정대상과 불순물중의 한 쪽은, 다른 쪽이 용출되는 조건에서 거의 완전히 흡착되는 것 같은 흡착제를 선택하는 것이다. 이것은, 예컨대 하기한 바와 같은 성질을 가지는 것을 들 수 있고, 거의 완전히 흡착된 성분은, 아래와 같이 흡착의 종류에 따라서 용출시키면 좋다. 이 경우, 측정대상과 불순물중의 어느 쪽을 흡착시키도록 해도 좋지만, 불순물에는 일반적으로 여러가지 성분이 함유되어 있기 때문에, 측정대상을 흡착시키는 것이 좋다.
(이온교환)
이온적으로 차이가 있는 물질간의 분리에 사용된다. 이 경우, 흡착된 물질의 용출은 용리액의 이온성을 변화시키거나(염농도를 올리거나), pH를 변화시키는 등의 방법으로 행하면 좋다.
(소수성 흡착)
소수적으로 차이가 있는 물질사이의 분리이다. 흡착된 물질의 용출은 용리액의 소수성을 내림으로써(염농도를 내림으로써, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 등의 유기용매를 첨가함로써) 행한다.
(특이적 친화성)
항원항체반응, 기질과 효소, 리셉터와 리셉터 반응물질(예컨대, 호르몬), 렉틴과 당쇄, 아비딘(스트렙토아비딘)과 비오틴 등의 친화성 크로마토그래피에 사용되고 있는 특이적 흡착을 하는 물질을 사용하는 분리에 사용된다. 이 경우의 흡착된 물질의 용출은 특이적 흡착의 결합을 해리시키는 공지의 방법으로 행하면 좋다.
본 발명에 사용하는 흡착제는 바람직하게는, 상기 이온교환, 소수성 흡착 또는 특이적 친화성에 의해 흡착할 수 있는 흡착제, 예컨대, 이온교환수지, 소수성 담체, 히드록시아파타이트, 프로테인 A등이 고정화된 친화성 담체등을 들 수 있다.
또한, 흡착제 층의 두께도 특별히 두껍게 하지 않아도 되고, 이온교환능 등을 부여한 막이나 여지 등을 사용할 수도 있다.
액체시료로서 예컨대 혈청, 뇨등을 사용하는 경우는, 분리를 향상시키기 위해서 용매의 역할을 하는 완충액 등의 시액으로 희석하고 나서, 분리기구로 도입하면 좋다. 또한, 이러한 목적으로 사용하는 완충액으로서는, 이 분야에서 통상 사용되고 있는 것을 사용하면 좋다. 이 경우, 측정대상에 대한 항체를 첨가하면, 측정대상이 측정대상 + 항체의 면역복합체를 형성하기 때문에, 소수성이 변화하여, 소수성 흡착에 의해서 분리하기 쉽게 된다. 또, 이 항체에 이온기를 부가해 놓으면, 측정대상 + 항체 + 이온기의 면역복합체를 형성하기 때문에, 이온교환에 의해서 더욱 분리하기 쉽게 된다.
또, 이온기결합 항체와는 다른 항체에 표식를 결합시켜, 이 표식항체와 이온기결합 항체를 측정대상에 결합시키면, 측정대상에는 이온기와 표식이 도입되게 된다. 그리고, 표식으로서 생체성분에 없는 것을 사용하면, 측정대상검출의 특이성을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명방법에 의하면 생체성분중의 측정대상을, 유리 표식항체나 측정대상중에 함유할지도 모르는 검출을 방해하는 물질로부터 효과적으로 분리할 수 있기 때문에, 측정의 정밀도를 향상시킬 수 있다.
도 1은, 본 발명의 분리방법에 사용하는 분리장치의 한 실시예를 도시한 개략도이고, 분리기구인 칼럼의 용출선단에는, 시료도입관이 연결되고, 칼럼의 타단은 파이프를 통해 칼럼내를 감압 및 가압하는 펌프에 연결되어 있다.
본 발명에 사용하는 분리기구(분리튜브)는 시료도입구(용출구)와, 시료도입을 위해 분리기구내를 감압(흡인)할 수 있는 개구부를 가지며, 내부에 흡착제를 보유할 수 있는 것이면 되고, 그 형상 및 재질은 특별히 한정되지 않는다. 즉, 예컨대 칼럼 크로마토그래피에 있어서 통상 사용되는 흡착제를 충전한 원통형의 이른바 칼럼이 일반적이지만, 예컨대, 여지와 같은 시트상 흡착제 또는 막상의 흡착제를 튜브에 형성한 외측을 향한 팽출부(예컨대 원반상)내에 보유한 분리기구의 일단에 시료도입부를 위치시키고, 감압수단을 타단에 접속하던지 대기와 접하는 개구에 형성해도 좋다. 또한, 내부에 막형상의 흡착제를 보유한 원심여과 튜브(일본 밀리포어리미티드사 제 등)등도 물론 사용가능하다.
분리기구는, 통상 용출선단이 하단이 되도록 세로로 하여 사용하지만, 측정대상과 불순물중의 한쪽이 거의 완전히 흡착되는 경우는, 용출선단이 상단이더라도 옆이더라도 지장이 없다.
분리기구의 용출선단으로부터 액체시료를 도입하기 위해서는, 도 1에 도시한 바와 같이, 펌프에 의해 분리기구(칼럼)내를 감압으로 하여, 액체시료를 시료도입관으로부터 분리기구내로 용출방향과는 역방향으로 흡인한다.
이대로 용리액을 흘리더라도, 용출선단 및 시료도입관(시료도입로)은 용리액으로 세정되므로 캐리오버를 피할 수 있다.
그러나, 액체시료를 흡인후, 공기, 순수한 물 또는 용리액 등의 액체 또는 기체를 바람직하게는 시료도입로의 용량보다 많이 흡인하여 흡인유로내에 부착한 액체시료를 분리관내로 유입시키는 쪽이 측정감도가 향상하기 때문에 바람직하다. 즉, 시료도입후, 시료도입구로부터 분리기구내의 흡착제까지 배관용량이상의 기체 또는 액체를 도입함으로써, 시료의 거의 대부분을 분리기구내의 흡착제로 도입할 수 있어 측정감도를 향상시킬 수 있다.
사용하는 액체 또는 기체로서는 분리 및 측정에 악영향을 미치지 않는 것이면 되고, 특별히 한정되지 않는다.
분리기구의 베드량 이상의 기체를 흡입하는 경우는, 기체의 흡입으로 인한 분리능이 저하하지 않는 흡착제를 선택하는 것이 좋다.
액체를 도입하는 경우는, 시료의 확산을 적게 하기 위해서 흡입속도의 최적화 등을 행하면 좋다.
상기한 바와 같이 하여, 시료를 흡착제에 흡착시키면 분리기구의 상류로부터 용출선단을 향하여, 즉 용출방향으로 용리액을 흘린다. 용리액으로서는, 흡착제의 종류에 따라서, 통상 칼럼 크로마토그래피에서 사용되고 있는 것을 사용하면 좋다.
용리액은 분리기구의 상류로부터, 즉 도 1의 장치의 경우는 펌프와 칼럼(분리기구)사이의 파이프로 도입해도, 시료도입관으로부터 도입해도 좋다. 시료도입관으로부터 도입하면, 동시에 흡인유로에 부착한 시료를 도입할 수 있어, 장치가 간략화되는 이점이 생긴다.
용리액을 칼럼내로 도입하면, 펌프로 칼럼내를 가압하여 용리액을 시료성분과 함께 용출선단으로부터 직접 또는 시료도입관을 통해서 용출한다.
본 발명에 사용하는 펌프로서는, 분리기구내로 공기를 흡인할 수 있고, 또한 그 공기를 토출할 수 있는 것이면 되고 특별히 한정되지 않는다.
펌프를 사용하는 경우는 선택한 조건에 있어서, 펌프의 부하가 30 kgf/㎠ 이하가 되는 것 같은 흡착제를 선택하면 좋다. 이러한 흡착제를 선택함으로써, 시료도입관으로부터의 시료의 도입을 원활하게 행할 수 있음과 동시에, 분리기구내를 가압함으로써 행하는 분리용출을 원활하게 행할 수 있다.
감압 및 가압하는 수단으로서는, 펌프가 아니더라도 좋다. 예컨대, 주사통과 같이, 바깥 통에 막대모양체를 미끄럼운동할 수 있도록 밀접하게 끼워서, 액체시료를 흡인 및 토출할 수 있도록 해도 지장이 없다. 이 경우, 바깥 통은 분리기구자체이더라도, 분리기구와 다른 것이더라도 지장이 없다. 또한, 피펫과 같이, 캡을 부풀려 흡인하고, 캡을 찌그러뜨려 토출하도록 해도 좋다.
본 발명에서, 가압수단은 반드시 필요하지 않고, 흡인한 상태로 상기 감압 및 가압수단을 제거하여, 대기압하에서에 토출시키도록 해도 좋다.
액체시료중의 측정대상 A로부터 측정에 악영향을 미치는 불순물 B와 불용물을 분리하는 경우, 예컨대, 다음과 같이 하여 행할 수 있다.
흡착제로서 상기 A(혹은 B)의 전부 또는 대부분을 흡착하는 흡착제를 사용하여, 액체시료를 용출선단으로부터 흡입후, 흡착된 A(혹은 B)를 용출시키지 않는 소정량의 용리액을 용출선단으로부터 흡입하고, 가압하여 용리액을 용출방향으로 흘려, 불용물의 대부분 및 B(혹은 A)를 제거한다. 이어서 흡착된 A(혹은 B)를 용출시키는 소정량의 용리액을 용출선단으로부터 흡입하고, 가압하여 용리액을 용출방향으로 흘려, 흡착제에 흡착되어 있는 A(혹은 B)를 용출시켜 추출하도록 하면 된다.
A와 불용물을 함께 용출시키는 경우는, 용출액을 여러개의 분획으로 나눠, A를 분리해도 되고, 용출액을 여과하여 A를 분리해도 된다.
상기한 바와 같이 하여 흡착제에 흡착된 성분은, 모두 세정제거되므로, 상기 분리기구를 사용하여, 별도의 액체시료에 대하여 마찬가지로 상기 조작을 반복하여 행할 수 있다.
상기 실시예에서는, 용리액을 용출선단으로부터 도입하고 있지만, 분리기구의 상류로부터 도입해도 된다.
상기 실시예에서는, 가압하여 용리액을 용출시키고 있지만, 자연적하같은 상압에서 행하거나, 용출선단으로부터 흡인하여 용출시켜도 된다.
상기 실시예에서는, 용출선단에 시료도입관을 접속하고 있지만, 용출선단의 형상에 따라, 직접 시료를 흡인할 수 있는 경우는, 시료도입관은 사용하지 않더라도 물론 좋다.
또한, 상기 실시예에서는, 감압에 의해 액체시료를 흡인하고, 그 후, 가압하여 용리액을 용출시키고 있다. 분리기구의 용출선단을 윗쪽으로 하여 시료를 도입하고, 이어서, 용출선단을 하단으로 하여 상단으로부터 용리액을 주입하고, 적하하여 상압에서 실시할 수도 있다. 또한, 분리기구의 용출선단으로의 액체시료의 도입은, 예컨대 주사기와 같은 기구를 사용하여 분리기구의 용출선단에 액체시료를 주입함으로써 행해도 된다. 또한, 분리를 신속하게 할 수 있기 때문에, 최초에 서술한 실시예와 같이 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법 및 장치에 적용하는 시료로서는, 일반적으로 칼럼 크로마토그래피에 사용되는 액체시료이면 좋지만, 특히 미량의 불용물을 함유하는 혈청 등의 생체성분의 분리에 유용하다.
(실시예)
다음에, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 더욱 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1
(1) 사용한 시약류의 조제
① 항체액
퍼옥시다제 표식 항α-페토프로테인 항체 Fab' 프래그먼트(Fab'-POD, 와코쥰야쿠고교(주)제) 36.2μg/10밀리리터와, Fab'-POD와는 다른 에피토프를 인식하는 것을 확인한 항α-페토프로테인 항체에 황산화티로신펩티드를 결합한 Fab' 프래그먼트(Fab'-YS8, 와코쥰야쿠고교(주)제) 3.7μg/10밀리리터를 함유하는 50mM N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 완충액(pH 6.5)을 조제하여, 이것을 항체액으로 하였다.
② 시료
α-페토프로테인(AFP, 와코쥰야쿠고교(주)제)을, 50mM N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 완충액(pH 6.5)으로 희석하여, 100 ng/밀리리터가 되도록 조제하여, 이것을 시료로 하였다.
③ 기질액
32mM 4-아세트아미드 페놀과 38mM 과산화수소를 함유하는 10mM 시트르산 완충액(pH 6.5)을 조제하여, 이것을 기질액으로 하였다.
(2)분석방법
상기 항체액 100마이크로리터와 시료 10마이크로리터를 혼합하여, 8℃에서 5분간 반응시켰다. 이 혼합액 80 마이크로리터를, POROS-DEAE 칼럼(0.46×1cm, 퍼셉티브사 제)에, 하기 ①∼④의 방법에 의해 도입하였다. 이어서, 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(pH 8.0, 0.3M 염화나트륨 함유) 10밀리리터로 칼럼을 세정후, 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(pH 8.0, 3M 염화나트륨 함유) 3 밀리리터로, Fab'- POD, AFP와 Fab'-YS8의 면역복합체를 용출시켰다. 얻어진 용출액 2 밀리리터에, 상기 기질액 200 마이크로리터를 가하여, 37℃에서 10분간 반응시켜, 그 형광강도를 여기파장 328 nm, 형광파장 432 nm에서 측정하였다. 얻어진 결과를 도 3에 나타낸다. 또, 용리액(완충액)은, 모두 칼럼의 펌프측으로부터 도입하였다.
(3) 시료의 도입방법
① 비교예
도 2에 도시한 바와 같이, 펌프(시린지 펌프 SIL10A, 시마츠 세이사쿠쇼 제)에 인젝터(Model 7125형, RHEODYNE사 제), POROS-DEAE 칼럼(분리기구)의 순서로 결합시킨 장치를 사용하고, 인젝터에 의해서 시료 80 마이크로리터를 칼럼으로 도입하였다.
② 본 발명방법 - 1)
도 1에 도시한 바와 같이, 비교예와 같은 펌프에 POROS-DEAE 칼럼을 직접 결합하고, 칼럼 용출출구에 용량 100 마이크로리터의 시료도입관을 결합한 장치를 사용하였다. 시료도입관으로부터 시료 80 마이크로리터를 펌프로 흡인한 후, 공기 100 마이크로리터를 흡인하였다.
③ 본 발명방법 - 2)
상기 ②와 같은 장치를 사용하여, 시료도입관으로부터 시료 80 마이크로리터를 펌프로 흡인한 후, 공기 200 마이크로리터를 흡인하였다.
④ 본 발명방법 - 3)
상기 ②와 같은 장치를 사용하여, 시료도입관으로부터 시료 80 마이크로리터를 펌프로 흡인한 후, 정제수 200 마이크로리터를 흡인하였다.
(4) 결과
도 3으로부터 명백하듯이, 본 발명방법 - 2) 및 - 3)에 의해 얻어진 형광강도는, 비교예와 동등하지만, 본 발명방법 - 1)에 의해 얻어진 형광강도는, 비교예보다도 약 10% 정도 저하했다.
이것으로부터, 시료도입후, 도입로를 충분히 세정함으로써, 종래의 방법과 동등한 측정감도를 얻을 수 있는 것을 알 수 있다.
또, 데이터로 나타내지 않았지만, 여러가지 농도의 α-페토프로테인 용액에 대하여 본 발명방법 - 1), - 2) 및 - 3)에 의해 형광강도를 구하여, α-페토프로테인 농도와 형광강도의 관계를 나타내는 검량선을 작성한 바, 어느 방법에 의해서도 양호한 직선성을 가지는 검량선을 얻을 수 있었다. 이것으로부터, 본 발명방법 - 1)에 의해서도, 목적성분의 분석을 정밀도 좋게 실시할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 2
탁함이 인지되는 사람 혈장검체시료 100 마이크로리터를, 실시예 1과 같은 POROS-DEAE 칼럼에 하기 방법(도입법 1) 및 2))에 의해 도입하고, 도입마다 펌프로, 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(pH 8.0, 3M 염화나트륨 함유)을, 펌프측으로부터 도입하여 유속 3 밀리리터/분으로 칼럼으로 흘려, 칼럼에 걸리는 압력을 측정하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.
[도입법 1)] (비교예)
도 2에 도시한 바와 같이, 펌프에 인젝터, POROS-DEAE 칼럼(분리관)의 순으로 결합한 실시예 1에서 비교에 사용한 장치를 사용하여, 인젝터에 의해 시료 100 마이크로리터를 도입하고, 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(pH 8.0, 3M 염화나트륨 함유)을 1 밀리리터 토출시켰다.
[ 도입법 2)] (본 발명방법)
도 1에 도시한 바와 같이, 펌프에 POROS-DEAE 칼럼을 직접결합하고, 칼럼 용출출구에 용량 100 마이크로리터의 시료도입관을 결합한 실시예 1과 같은 장치를 사용하였다. 시료도입관으로부터 시료 100 마이크로리터를 펌프로 흡인하고, 또 정제수 200 마이크로리터를 흡인한 후, 펌프로 가압하여 흡인방향과는 역방향으로 50 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(pH 8.0, 3M 염화나트륨 함유)을 1밀리리터 토출시켰다.
도 4에서 명백하듯이, 비교예의 도입법 1)(종래법)에서는 도입회수가 증가함에 따라서 압력이 상승하지만, 본 발명방법의 도입법 2)에서는 도입회수가 증가해도 압력의 상승은 거의 인지되지 않는다. 이 결과로부터, 본 발명방법에 의하면, 불용물을 함유한 시료라도 직접 칼럼(분리기구)으로 도입할 수 있고, 더구나, 칼럼의 수명이 현저히 향상하는 것을 알 수 있다.
실시예 3
(1) 항체액, 시료 및 기질액
실시예 1과 같음.
(2)세정액 및 용리액
세정액 : 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액, pH 8.0, 0.3M 염화나트륨 함유.
용리액 : 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액, pH 8.0, 3M 염화나트륨 함유.
(3)분석방법 및 결과
항체액 100 마이크로리터와 시료 10 마이크로리터를 혼합하여, 8℃에서 5분간 반응시켰다.
또한, 용량 5 밀리리터의 주사통에, 사르토바인드 멤브레인 에드소버-D5F (SartobindTMMembrane Adsorber D5F, 약명 MAD5F, 사르토리우스사 제)를 결합하고, 또 그 MAD5F의 용출구에 용량 100 마이크로리터의 도입관을 결합한 장치를 준비하였다.
상기 주사통의 시린지를 끌어당김으로써, 상기 혼합액 80 마이크로리터를 도입관내로 도입하고, 이어서, 또 주사통 시린지를 끌어당김으로써, 세정액 5 밀리리터를 도입관으로부터 상기 MAD5F내로 흡인한 후, 주사통 시린지를 눌러 세정액을 토출시킴으로써 MAD5F를 세정하였다. 이 세정조작을 3회 반복하였다.
이어서, 용리액 3 밀리리터를 마찬가지로 흡인, 토출하여, Fab'-POD, AFP와 Fab'-YS8의 면역복합체를 용출시켰다. 얻어진 용출액 2 밀리리터에, 기질액 200 마이크로리터를 가하여, 37℃에서 10분간 반응시켜, 그 형광강도를 여기파장 328 nm, 형광파장 432 nm에서 측정한 바, 실시예 1의 본 발명방법 - 3)과 동등한 형광강도를 얻을 수 있었다.
이상의 것으로부터, 펌프 대신에 주사통을 사용해도, 같은 결과를 얻을 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 4 측정장치
1. 장치구성
장치구성에 관하여 도 5∼도 7의 장치외관도 및 도 8의 배관계통도를 사용하여 설명한다.
반응 디스크(1)는, 3중 라인구성의 턴테이블로서, 내주에는 시료용기(2), 중주에는 항원항체반응용기(3)와 용리액 A 수납용기(4), 그리고 외주에는 효소반응셀(5)이 배치되어 있다. 시료용기(2), 항원항체반응용기(3), 용리액 A 수납용기(4)는 쿨러유니트(27)에 의해 8℃로 보냉되어 있고, 효소반응셀(5)은 히터유니트(28)에 의해 40℃로 온조되어 있다.
제1 프로브(6)를 가지는 분주 유니트는 시료용기(2)에 수납된 시료, 제1 시약 (R1)(8), 제2 시약(R2)(9), 제3 시약(R3)(10)을 흡인하여 반응용기로의 분주를 행한다. 이 제1 프로브(6)는 정량 시린지펌프(12)와 세정 시린지펌프(13)에 배관되어 있고, 이 시린지펌프에 의해 프로브의 흡인토출이나 세정이 행해진다. 또, 이 배관내는 탱크(23)로부터의 순수한 물로 채워져 있다. 세정포트(7)는 제1 프로브(6)의 세정에 사용된다. 또한 제1 프로브(6)는 추가시료용기 설치부의 추가시료(11)의 흡인도 행할 수 있다.
제2 프로브(14)를 가지는 분주 유니트는 항원항체반응용기(3)중의 항원항체반응액의 흡인과 칼럼(18)으로의 도입, 용리액 A(20)에 의한 세정과 용리액 A 수납용기(4)로의 분주, 용리액 B(21) 및/또는 용리액 C(22)에 의한 면역복합체의 용출 및 용출액의 효소반응셀(5)로의 분주를 행한다. 이 제2 프로브(14)는, 칼럼용 시린지 펌프(17)에 관을 통해 접속되어 있고, 이 시린지펌프(17)에 의해 각 흡인토출이 행해진다. 이 배관내도 탱크(23)로부터의 순수한 물로 채워져 있다. 다련밸브(19)는, 용리액 A/B/C의 변경을 행하는 유로변환밸브이다. 세제(16)는, 칼럼 및 제2 프로브(14)배관내의 세정에 사용된다. 또한, 세정포트(15)는, 제2 프로브(14)의 세정 및 분석에 사용하지 않은 용출액의 배출에 사용된다.
검출기(25)는, 효소반응셀(4)의 형광강도를 측정하는 형광측광부이다. 검출기(25)는, 반응액에 여기광을 조사하여 반응액으로부터 발해지는 형광량을 포토멀 (광전자증배관)로써 측정하는 것이다. 또한 포토멀은 그 형광량에 따라서 게인(gain)을 조정할 수 있도록 되어 있다.
배출노즐(26)은, 분석종료 반응액을 도면에 도시되지 않은 펌프에 의해 배수하는 폐액처리부이다. 그 폐액은 드레인탱크(24)에 수납된다.
순수한 물탱크(23)는, 각 프로브 및 배관의 세정에 사용되는 순수한 물을 수납하고 있다.
드레인탱크(24)는, 각 프로브나 반응액의 폐액을 수납한다.
표시기(29), 키보드(30), 프린터(31)는, 분석의 의뢰나 결과표시 및 동작의 개시 등을 행하는 장치제어부이다.
2.분석 시퀀스
분석 시퀀스는 1 개의 시료를 분석할 때에, 장치의 각 유니트동작의 흐름을 나타내는 것이다. 즉 일련의 분석동작에 있어서, 어떤 타이밍에서 시료·시약이 분주·반응·측광·배출되는가를 나타내는 것이다.
(1) 1 시약, 2 용리액의 경우
전처리로서 제1 시약(R1)만의 항원항체반응을 행하고, 분석으로서 용리액 B만에 의한 면역복합체의 용출을 행하는 동작을 일으킨 경우의 분석 시퀀스를 도 9a에 나타낸다.
1) 준비
분석에 사용하는 시약, 용리액 A/B, 순수한 물, 세제, 칼럼을 세팅한다.
시료용기(2)를 반응 디스크(1) 내주에 세팅하여 보냉한다.
항원항체반응용기(3) 및 용리액 A 수납용기(4)를 반응 디스크(1) 중주에 세팅하여 보냉한다.
효소반응셀(5)을 반응 디스크(1) 외주에 세팅하여 40℃로 온조한다.
제1 프로브(6), 제2 프로브(14)의 배관내를 순수한 물로 세정한다.
2) 장치제어부에서 분석의뢰조작을 행한 후, 스타트를 건다.
1. 반응 디스크(1)가 동작하여, 용리액 A 수납용기(4)를 제2 프로브(14)의 액세스 위치로 이동한다[AD]. 다음에 제2 프로브(14)가 용리액 A 수납용기(4)에 용리액 A를 분주한다[A].
2. 반응 디스크(1)가 동작하여, 시료용기(2)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동한다[SD]. 다음에 제1프로브(6)가 시료를 흡인한다[S].
3. 반응디스크(1)가 동작하여, 항원항체반응용기(3)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동한다[SD]. 다음에 제1 프로브(6)가 시료를 항원항체반응용기(3)에 토출한다[S].
4. 반응 디스크(1)가 동작하여, 항원항체반응용기(3)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동한다[SD].
5. 제1 프로브(6)가 제1 시약(R1)을 흡인하여, 항원항체반응용기(3)에 분주한다[R1].
6. 항원항체반응이 시작하고, 약 4. 5분간 반응이 진행한다.
7. 반응디스크(1)가 동작하여, 항원항체반응용기(3)를 제2 프로브(14)의 액세스 위치로 이동한다[ID]. 다음에 제2 프로브(14)가 항원항체용액을 흡인한다[I].
8. 반응디스크(1)가 동작하여, 용리액 A 수납용기(4)를 제2 프로브(14)의 액세스 위치로 이동한다[AD]. 다음에 제2 프로브(14)가 용리액 A를 흡인하면서, 항원항체액을 칼럼(18)에 도입한다[I].
9. 제2 프로브(14)가 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 용리액 A로 칼럼(18)의 세정을 행한다[A액세정].
10. 제2 프로브(14)가 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 용리액 B로 칼럼의 세정을 행한다[B액용출].
11. 반응디스크(1)가 동작하여, 효소반응셀(5)을 제2 프로브(14)의 액세스 위치로 이동한다[B 분획분주]. 다음에 제2 프로브(14)가 효소반응셀(5)에 면역복합체의 용출, 분취를 행한다[B 분획분주]
12. 제2 프로브(14)가 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 용리액 B로 칼럼의 세정을 행한다[B액용출].
13. 반응디스크(1)가 동작하여, 효소반응셀(5)을 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동한다[R3D]. 다음에 제1 프로브(6)가 시약(3)을 흡인하여, 효소반응셀(5)에 토출한다[R3].
14. 이 시점에서 용출액의 효소반응이 시작된다.
15. 반응디스크(1)가 동작하여, 효소반응셀(5)을 검출기 액세스 위치로 이동한다[측광D]. 다음에 효소반응셀(5)의 형광강도를 측정한다[측광].
16. 형광강도의 측정은 약 10분간 측정한다.
17. 형광강도의 측정중에 제2 프로브(14)가 세정포트(15) 액세스 위치로 이동하여, 칼럼(18)과 제2 프로브(14)의 세정을 행한다[칼럼세정].
18. 도면에 도시되지 않은 장치 데이터처리부에 의해, 복수의 게인으로부터 얻어진 각 측광 데이터는 그 형광강도변화가 측정가능범위내에 있는 게인의 데이터를 선택하고, 연산되어, 시료중의 측정대상물의 농도를 산출한다. 동시에, 결과를 표시부 및 프린터로 출력한다.
19. 반응디스크(1)가 동작하여, 배출노즐 액세스 위치로 이동한다[반응액배출D].
20. 분석반응종료액은 도면에 도시되지 않은 펌프에 의해 배수된다.
이상으로, 시료의 일련의 분석동작이 종료한다.
이 분석 시퀀스에 있어서, 제1 시약(R1)을 제2 시약(R2)의 동작으로, 용리액 B를 용리액 C의 동작으로 변경할 수도 있다. 또한 제1 시약(R1) 동작시에 제2 시약(R2)을, 용리액 B 동작시에 용리액 C를 사용해도, 또 그 반대로 사용할 수도 있다.
(2) 2 시약, 3 용리액의 분석 시퀀스
상기 분석 시퀀스에 있어서, 항체액인 제1 시약(R1), 제2 시약(R2) 및 용리액 B, C의 동작을 모두 담아넣을 수도 있다. 그 분석 시퀀스 예를 도 10a에 나타낸다.
본 예에서는, 제1 시약(R1) 분주후 18.9분후에 제2 시약(R2)을 분주하고, 그 후 18.6분 후에 반응액의 칼럼(18)으로의 도입을 행한다. 그리고, 용리액 A로 세정후, 용리액 B 에 의한 용출, 용리액 C에 의한 용출이 계속해서 행해지고, 각각의 용출액의 효소반응을 측광측정하게 된다. 결과 데이터는, 용리액 B, C 에 의한 면역복합체량에 대하여 각각 연산, 산출하게 된다. 또한, 2개의 결과 데이터를 사용하여, 그 합계 면역복합체량 및 각 비율도 산출할 수 있다.
3. 동작 시퀀스
분석 시퀀스를 반복함으로써, 복수의 시료를 연속적으로 분석할 수 있다. 그러나, 분석 시퀀스를 반복하는 것만으로는, 일련의 분석 시퀀스가 실행되는 것에 필요한 시간마다 1건의 분석결과 밖에 얻을 수 없다. 따라서 처리능력을 올리기위해서 하나의 분석 시퀀스중에 다른 분석 시퀀스의 동작을 더욱 통합하여 장치를 작동시키는 것이 일반적으로 행해지고 있다. 하나의 분석 시퀀스중에 다른 분석 시퀀스의 동작을 통합한 것은 동작 시퀀스라고 불린다. 본 장치의 동작 시퀀스는, 반응 디스크 유니트의 동작을 기본으로, 다른 유니트 동작이 점유하는 시간을 기초로 제작되어 있다. 도 9b나 도 10b에 나타낸 동작 시퀀스는 하나의 분석 시퀀스중에 다른 분석 시퀀스의 동작을 최대한으로 통합한 경우이고, 1 동작 시퀀스를 실행하는데 요하는 시간은 150초이다. 이 동작 시퀀스를 반복함으로써, 복수의 시료를 연속적으로 분석한 경우, 150초 마다 분석결과를 얻을 수 있다. 즉, 이와 같이 동작 시퀀스를 설정함으로써, 1 시약, 2 용리액의 분석 시퀀스 처리의 경우에 7배, 또한, 2 시약, 3 용리액의 분석 시퀀스 처리의 경우에 20배 처리능력이 오르게 된다.
4. 동작 시퀀스에서의 각 유니트의 동작
각 유니트의 동작을 상세하게 이하에 설명한다.
(1) 반응 디스크의 동작.
① [AD]는 용리액 A의 분주를 행하기 위해서, 용리액 A 수납용기(4)를 제2 프로브(14)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다.
② [ID]는 항원항체반응액의 흡인을 행하기 위해서, 항원항체반응용기(3)를 제2 프로브(14)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다.
③ [측광]은 측광을 행하기 위해서, 효소반응셀(5)을 검출기(25)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다. 또, 이 측광의 동작은 동일주기(본 예에서는 30초 마다)로 반복된다.
④ [SD]는 시료를 흡인하기 위해서, 시료용기(2)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동시키고, 이어서, 시료의 토출을 행하기 위해서, 항원항체반응용기(3)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다.
⑤ [R1D]는 제1 시약(R1)의 분주를 행하기 위해서, 항원항체반응용기(3)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다.
⑥ [B분획분주D] 및 [C분획분주D]는 용리액 B 또는 용리액 C의 용출액의 분주를 행하기 위해서, 효소반응셀(5)을 제2 프로브(14)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다.
⑦ [R3D]는 제3 시약(R3)의 분주를 행하기 위해서, 효소반응셀(5)을 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다.
⑧ [R2D]는 제2 시약(R2)의 분주를 행하기 위해서, 항원항체반응용기(3)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다.
⑨ [교반 D]는 액의 교반을 행하기 위해서, 항원항체반응용기(3)를 제1 프로브(6)의 액세스 위치로 이동시키는 동작을 나타낸다. 또, 액의 혼합이 요구되지 않는 분석에서는, 이 동작은 선택되지 않는다.
⑩ [반응액배수 D]는 분석종료반응액의 배수를 행하기 위해서, 항원항체반응용기(3)를 배출노즐(26)의 액세스 위치로 이동하는 동작을 나타낸다.
(2) 제1 프로브(6)의 동작
① [S]는 시료용기(2)의 액세스 위치로 이동하여, 시료를 흡인하고, 이어서, 항원항체반응기(3)의 액세스 위치로 이동하여, 분주를 행하는 동작을 나타낸다. 또한, [S세정]에서, 세정포트(7)의 액세스 위치로 이동하여 프로브 세정을 행하는 동작을 나타낸다.
② [R1]은 제1 시약(R1)의 액세스 위치로 이동하여, 시약을 흡인하고, 이어서 항원항체반응용기(3)의 액세스 위치로 이동하여, 분주를 행하는 동작을 나타낸다. 또한, [교반]은 반응액을 흡인토출하여 액의 혼합교반을 행하는 동작을 나타낸다. 또, 액의 혼합이 요구되지 않는 분석에서는 이 동작은 선택되지 않는다. 또, [R1세정]은 세정포트(7)의 액세스 위치로 이동하여, 프로브 세정을 행하는 동작을 나타낸다.
③ [R2]는 제2 시약(R2)의 액세스 위치로 이동하여 시약을 흡인하고, 이어서 항원항체반응용기(3)의 액세스 위치로 이동하여 분주를 행하는 동작을 나타낸다. 또한, [교반]은 반응액을 흡인토출하여 액의 혼합교반을 행하는 동작을 나타낸다. 또한, 액의 혼합이 요구되지 않는 분석에서는 이 동작은 선택되지 않는다. 또, [R2세정]은 세정포트(7)의 액세스 위치로 이동하여 프로브 세정을 행하는 동작을 나타낸다.
④ [R3]는 제3 시약(R3)의 액세스 위치로 이동하여 시약을 흡인하고, 이어서 효소반응셀(5)의 액세스 위치로 이동하여 분주를 행하는 동작을 나타낸다. 또한, [R3세정]은 세정포트(7)의 액세스 위치로 이동하여 프로브 세정을 행하는 동작을 나타낸다.
(3) 제2 프로브(14)의 동작
① [A]는 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 칼럼용 시린지펌프(17)로 용리액 A를 흡인토출함으로써 배관내를 용리액 A로 치환하고, 이어서 용리액 A 수납용기위치(4)의 액세스 위치로 이동하여, 용리액 A의 분주를 행하는 동작을 나타낸다.
② [I]는 항원항체반응용기(3)의 액세스 위치로 이동하여 항원항체반응액을 흡인하고, 이어서 용리액 A 수납용기(4)의 액세스 위치로 이동하여, 다음 용리액 A를 흡인하면서, 항원항체반응액을 칼럼(18)으로 도입하는 동작을 나타낸다.
③ [A액세정]은 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 칼럼용 시린지펌프(17)로 용리액 A의 흡인토출을 반복함으로써, 용리액 A로 칼럼의 세정을 행하는 동작을 나타낸다.
④ [B액용출]은 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 칼럼용 시린지펌프(17)로 용리액 B의 흡인토출을 반복함으로써, 용리액 B로 칼럼에 흡착된 면역복합체의 용출을 행하는 동작을 나타낸다. 또한, [B분획분주]는 효소반응셀(5)의 액세스 위치로 이동하여 용출액의 토출을 행하는 동작을 나타낸다.
⑤ [C액용출]은 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 칼럼용 시린지펌프(17)로 용리액 C의 흡인토출을 반복함으로써, 용리액 C로 칼럼에 흡착된 면역복합체의 용출을 행하는 동작을 나타낸다. 또한, [C 분획분주]는 효소반응셀(5)의 액세스 위치로 이동하여, 용출액의 토출을 행하는 동작을 나타낸다.
⑥ [칼럼세정]은 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 칼럼용 시린지 펌프(17)로 순수한 물의 흡인토출을 반복함으로써, 칼럼(18) 및 제2 프로브(14)의 세정을 행한 후, 세제(16)의 액세스 위치로 이동하고, 세제(16)를 흡인하여 칼럼(18)까지 도입하고, 이어서 세정포트(15)의 액세스 위치로 이동하여, 다시 칼럼시린지 펌프(17)가 순수한 물을 흡인토출을 반복함으로써, 세제의 세정을 행하는 동작을 나타낸다.
(4) 배출노즐(26)의 동작
① [반응액배수]는 배출노즐(26)의 액세스 위치로 이동해 온 항원항체반응용기(3)로 배출노즐을 삽입하여, 분석종료 반응액의 배수를 행하는 동작을 나타낸다.
(5) 검출기(25)의 동작
① [측광]은 검출기(25)의 액세스 위치로 이동하여 온 효소반응셀(5)의 형광측광을 행하는 동작을 나타낸다. 또, 이 [측광]은, 효소반응중의 효소반응셀(5)의 연속적측광을 1회로 하여, 동일간격으로 1사이클중에 5회(본 예에서는 30초 마다) 반복된다.
5. 주기
본 설명중의 각 유니트의 동작시간, 반응시간, 시료용기나 각종 반응용기의 수량, 각 용액의 흡인토출량, 설정온도, 분석 시퀀스 및 동작 시퀀스 등은 본 내용에 한정되는 것이 아니고, 여러가지 변경할 수 있는 것은 물론이다.
실시예 5. AFP의 측정
(1)사용장치
실시예4의 장치를 사용하였다.
(2)사용한 시약류의 조제
① 항체액
실시예 1과 같은 항체액을 사용하여, 실시예 4의 장치의 제1 시약(R1)의 위치에 세팅하였다.
② 시료
AFP 농도 420ng/ml의 사람혈청을 생리식염수로 1/10, 2/10, 3/10, 4/10, 5/10, 6/10, 7/10, 8/10, 9/10배로 희석하여, 이것을 시료로 하였다. 또한, AFP 농도 100ng/ml의 표준품(와코쥰야쿠고교사 제)를 표준액으로서 사용하였다.
③ 기질액
실시예 1과 같은 기질액을 사용하고, 실시예 4의 장치의 제3 시약(R3)의 위치에 세팅하였다.
④ 용리액
용리액 A : 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액( pH 8.0, 0.3M 염화나트륨 함유)
용리액 B : 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액 (pH 8.0, 3.0M 염화나트륨 함유)
이들 2개를 용리액으로 하여, 실시예 4의 장치의 용리액 A, 용리액 B의 위치에 각각 세팅하였다.
(3)분석방법
실시예 4의 분석 시퀀스(1)(1 시약, 2 용리액)를 사용하고, 이하의 분석조건으로 분석하여, 각 시료에 관한 1분당 형광강도의 변화를 측정하였다. 얻어진 측정치와 AFP 표준액의 측정치의 비교로부터 각 시료중의 AFP 농도를 산출하였다. 또, 각 시료에 관하여 5회씩 측정을 행하였다.
시약 1 : 100μl
시료 : 3μl
항원항체반응액 칼럼도입량 : 20μl
기질량: 100μl
분획량 : 1 ml
칼럼세정액량 : 18ml
칼럼 : POROSE­DEAE 칼럼(5.5 × 6.9 mm)
결과
희석배율과 측정치의 관계를 도 11에 나타낸다. 도 11로부터 명백한 바와 같이 원점을 통하는 양호한 직선관계로 되는 것을 알 수 있다. 또한, 각 시료에 관하여 측정치의 변동계수를 구한 바 0.8%∼6.0%로 양호한 값이었다.
실시예 6. 당쇄구조가 다른 AFP의 분별측정
(1) 사용장치
실시예 4의 장치를 사용하였다.
(2) 사용한 시약류의 조제
① 제1 시약
렌틸렉틴(LCA, (주)호넨 코퍼레이션사 제) 10mg/10밀리리터와, 5개의 황산잔기를 가지는 황산화티로신펩티드[Ala­(Tyr(SO3)5)]가 결합한 항 α-페토프로테인 항체 Fab'프래그먼트(Fab'-YS5, 와코쥰야쿠고교(주) 제)를 1.75 nmo1/10밀리리터를 함유하는 50mM N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산(ACES) 완충액(pH 6.5)을 조제하고, 이것을 제1 시약으로 하여, 실시예 4의 장치의 제1 시약(R1)의 위치에 세팅하였다.
② 제2 시약
상기 Fab'-YS5와 인식부위가 다른 것을 확인한 퍼옥시다제 표식 항α-페토프로테인 항체 Fab'프래그먼트(Fab'-POD, 와코쥰야쿠고교(주) 제) 402pmo1/1밀리리터와, Fab'-YS5, Fab'-POD와 인식부위가 다른 것을 확인한 항α-페토프로테인 항체의 Fab' 프래그먼트에 8개의 황산잔기를 가지는 황산화티로신펩티드[Ala­(Tyr(SO3)8)]가 결합한 것(Fab'-YS8, 와코쥰야쿠고교(주) 제) 72pmo1/1밀리리터를 함유하는 50mM ACES 완충액(pH 6.5)을 조제하고, 이것을 제2 시약으로 하여, 실시예 4 장치의 제2 시약(R2)의 위치에 세팅하였다.
또, Fab'-YS8을 제작하기 위해서 사용된 항체는, LCA가 결합하고 있지 않은 AFP에만 결합하는 성질을 가지고 있다. 이것에 대하여, Fab'-YS5 및 Fab'-POD를 제작하기 위해서 사용된 항체는, LCA의 결합 유무에 관계되지 않고 모든 AFP에 결합하는 성질을 가지고 있다.
③ 시료
AFP 농도 690ng/m1로, AFP-L3 분획비(%)가 46%인 사람혈청을 생리식염수로 1/10, 2/10, 3/10, 4/10, 5/10, 6/10, 7/10, 8/10, 9/10배로 희석한 것을 시료로 하였다. 또한, AFP 농도 200ng/ml로, AFP-L3 분획비(%)가 0%인 표준품, 및 AFP 농도 200ng/ml로, AFP-L3 분획비(%)가 100%인 표준품(모두 와코쥰야쿠고교(주)사 제)을 표준액으로서 사용하여 검량선을 제작하였다.
④ 기질액
실시예 1과 같은 기질액을 사용하여, 실시예 4의 장치의 제3 시약 (R3)의 위치에 세팅하였다.
⑤ 용리액
용리액 A : 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액 (pH8.0, 0.3M 염화나트륨 함유)
용리액 B : 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액 (pH8.0, 0.78M 염화나트륨 함유)
용리액 C : 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액 (pH8.0, 3.0M 염화나트륨 함유)
이들 3개를 용리액으로 하여, 각각을 실시예 4의 장치의 용리액 A, 용리액 B 및 용리액 C의 위치에 세팅하였다.
(3)분석방법
실시예 4의 분석 시퀀스(2)(2 시약, 3 용리액)를 사용하여, 이하의 분석조건으로 분석하였다.
또, 용리액 B로 면역복합체 1(Fab'-POD-AFP-Fab'-YS5)이 칼럼으로부터 용출되고, 용리액 C로 면역복합체 2(Fab'-POD-AFP-Fab'-YS8-Fab'YS5)가 칼럼으로부터 용출된다. 얻어진 면역복합체 1 분획과 면역복합체 2 분획의 각각에 대하여 1분당 형광강도의 변화를 측정하여, 얻어진 각각의 측정치의 합계와, AFP 표준액의 측정치로부터 각 시료중의 AFP 농도를 산출하였다.
또한, 면역복합체 1 분획에 관한 측정치와 면역복합체 2 분획에 관한 측정치를 하기 식에 대입하여 각 시료의 분획비(%)를 구하고, 이것을, 미리 L3 분획비 0%의 표준액과 L3 분획비 100%의 AFP 표준액을 사용하여 마찬가지로 해서 얻어진 분획비를 사용하여 제작한 검량선에 맞도록 하고, 각 시료중의 AFP-L3 분획비(%)를 구하였다.
분획비(%) = 면역복합체 1 분획의 측정치/(면역복합체 1 분획의 측정치 + 면역복합체 2 분획의 측정치)
제1 시약 : 100μl
제2 시약 : 10μl
시료 : 10μl
항원항체반응액 칼럼도입량 : 80μl
기질량 : 100μl
면역복합체 1 분획량 : 1 ml
면역복합체 2 분획량 : 1 ml
칼럼세정액량 : 18 ml
칼럼 : POROSE-DEAE 칼럼(5.5 × 6.9 mm)
결과
희석배율과 측정치의 관계를 도 12에 나타낸다. 도 12로부터 명백한 바와 같이, AFP 농도는 원점을 지나는 양호한 직선관계가 되는 것을 알 수 있다. 또한, AFP-L3 분획비(%)는 시료를 희석해도 변화하지 않는 것을 알 수 있다. 이것은, 특정의 랙틴과 반응하는(특정의 당쇄구조를 가지는) AFP의 비율은 시료를 희석해도 변화하지 않기 때문이다.
본 발명은 수회 분리해도, 분리기구내의 압력이 상승하거나 분리가 나쁘게 되는 현상을 피할 수 있기 때문에, 분리기구내의 수명이 현저히 향상함과 동시에 캐리오버가 생기지 않는다는 종래 기술에서는 해결할 수 없던 과제를 해결한 것으로, 그 때문에 매우 획기적인 발명이다.
또, 펌프를 사용하여 가압용출하는 경우, 본 발명에 의하면, 용출선단의 해방단으로부터 시료를 도입하므로, 특수한 시료도입장치를 필요로 하지 않는 이점을 얻을 수 있다.

Claims (15)

  1. 액체시료중의 복수의 성분을 흡착제에 대한 흡착력의 차이를 이용하여 분리하는 방법에 있어서, 상기 액체시료를 흡착제를 보유한 분리기구의 용출방향과는 역방향으로부터 분리기구로 도입하여, 용리액과 함께 용출선단으로부터 분리용출시키는 것을 특징으로 하는 액체시료 성분의 분리방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 액체시료를 상기 분리기구로 흡인 또는 주입하여 도입하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 용리액을 상기 분리기구의 용출방향과는 역방향으로부터 분리기구로 흡인하여 도입하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 액체시료가 불용물을 함유한 시료인 것을 특징으로 하는 분리방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 액체시료에 용해되어 있는 측정대상과 측정에 악영향을 미치는 불순물중의 한 쪽의 대부분은 다른 쪽이 용출하는 조건에서 상기 흡착제에 흡착되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 액체시료를 흡인후, 기체 또는 액체를 흡인하여, 흡인유로에 부착한 액체시료를 상기 분리기구내로 유입시키는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 분리기구내를 용출방향으로 가압하여 상기 흡착시킨 액체시료의 분리용출을 행하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 액체시료의 흡착제로의 흡착과 용출을, 동일한 상기 분리기구를 사용하여, 별도의 액체시료에 관하여 반복하여 행하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 흡착제를 보유한 분리기구가 흡착제를 충전한 칼럼인 것을 특징으로 하는 분리방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 흡착제를 보유한 분리기구가, 시트상 또는 막상의 흡착제를, 튜브내 또는 튜브에 형성한 외측을 향한 팽출부내에 보유한 분리기구인 것을 특징으로 하는 분리방법.
  11. 흡착제를 보유한 분리기구, 그 분리기구의 일단의 용출측에 위치하는 액체시료도입부, 및 상기 분리기구의 타단에 접속된 분리기구내를 감압 또는 감압 및 가압하는 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 액체시료중의 성분을 흡착제에 대한 흡착력의 차이를 이용하여 분리하는 장치.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 분리기구내를 감압 또는 감압 및 가압하는 수단이, 분리기구내로 공기를 흡인할 수 있고, 또한 그 공기를 토출할 수 있는 펌프인 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 펌프에 걸리는 부하가 30 kgf/㎠ 이하가 되도록 상기 흡착제를 선택하는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 흡착제를 보유한 분리기구가 흡착제를 충전한 칼럼인 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제 11항에 있어서, 상기 흡착제를 보유한 분리기구가, 시트상 또는 막상의 흡착제를, 튜브내 또는 튜브에 형성한 외측을 향한 팽출부내에 보유한 분리기구인 것을 특징으로 하는 장치.
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