KR19980058722A - 항종양 활성을 갖는 새로운 수용성 다당체 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항종양 활성을 가지는 새로운 수용성 다당체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 생체의 면역 기능을 증가시켜 항종양 활성을 나타내는 다당체의 포도당 잔기에 아세트아마이드기가 결합하여 그의 안정성 및 수용성이 증가된 새로운 수용성 다당체 및 이를 복령으로부터 얻는 경제적인 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 다당체는 면역 기능을 활성화하여 종양을 예방하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며 그외에 고점성 물질로서도 다양하게 사용될 수 있다.

Description

항종양 활성을 갖는 새로운 수용성 다당체 및 그의 제조방법

본 발명은 화학식 1 로 표시되는 항종양 활성을 가지는 새로운 수용성 다당체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

상기 화학식 1 에서 R 및 R'은 아세트아마이드기 (-CH₂CONH₂)이고,

m 및 n 은 각 단량체의 갯수로서 m 은 40 - 60 이고, n 은 60 - 100 의 범위이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 생체의 면역 기능을 증가시켜 항종양 활성을 나타내는 다당체의 포도당 잔기에 아세트아마이드기가 결합하여 그의 안정성 및 수용성이 증가된 새로운 수용성 다당체 및 이를 복령으로부터 얻는 경제적인 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 다당체는 면역 기능을 활성화하여 종양을 예방하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며 그외에 고점성 물질로서도 다양하게 사용될 수 있다.

지금까지 식물 또는 버섯 등에서 여러 가지 종류의 다당체가 분리되고 그의 항종양 활성이 알려져 이를 이용한 다양한 연구가 아루어져 왔다. 구체적으로 버섯에서 추출한 다당체는 일반적으로 종양세포에 직접 작용하여 항종양 활성을 나타내는 것이 아니라, 생체반응 조절물질 (BRM : Biological Response Modifier)로서 생체의 면역 반응에 도움이 되는 생체의 작용을 강화시키거나, 그의 방어 체계를 활성화하는 매개물을 회복시키거나 증강시키는데 작용함으로써 항종양 활성을 나타내게 된다. 따라서 버섯에서 추출한 다당체는 항종양 활성이 큰 것에 비하여 세포 독성은 실제로 매우 경미한 것으로 보고되어 있다.

실제적으로 표고버섯의 자실체에서 분리한 다당체인 렌티난 (Lentinan), 구름버섯 자실체 및 배양 균사체에서 분리한 단백 다당체인 크레스틴 (Krestin, PS-K), 치마버섯 배양여액에서 분리한 다당체인 쉬조필란 (Schizophyllan) 등이 항종양 활성 등을 나타내는 의약품으로 시판되고 있으며, 상황의 배양 균사체의 열수 추출물도 국내에서 생산되어 시판되고 있다.

복령은 담자균류의 구멍장이버섯과 (Polyporaceae)에 속하는 포리아 코코스 (Poria cocosWolf.) 의 균핵으로서, 소나무 등의 뿌리 부분에서 생장하는 것으로 보고되어 있다. 지금까지 복령은 이뇨제, 진정제 및 심계항진, 근육경련, 갈증해소, 평간안신, 중풍불어, 또는 수종치료 등에 사용되는 전통적인 한방 약제로 사용되어 왔다.

이러한 복령은 주요 성분이 파키만 (Pachyman)이라고도 알려진 불용성의 복령 다당체이며, 실제적으로 복령 다당체인 파키만이 전체 건조 중량의 75 - 85 % 를 차지하고 있다. 파키만 이외에도 복령은 섬유질 2.1 - 2.2 %, 단백질 0.64 - 0.87 %, 지질 0.35 - 0.5 % 그리고 트리테르페노이드 (Triterpenoids) 계통의 화합물인 복령산 (Pachymic acid) 등으로 구성되어 있다.

또한, 복령을 구성하는 성분 중 대부분을 차지하고 있는 복령 다당체인 파키만 (Pachyman)은 β (1-6) 연결 가지를 갖는 β (1-3) 연결된 글루칸 ( Glucan )의 구조를 가지며 이를 구성하는 당류는 포도당 (Glucose)이다. 이러한 특성을 갖는 파키만 (Pachyman)은 지금까지 복령을 한방 제제로서 사용하고 난 다음 그의 나머지로서 버려졌다. 이들 파키만을 사르코마 180 를 사용한 쥐 실험에 응용하여 그의 항종양 활성을 조사하여 살펴보면, 파키만 10mg/kg 을 복강 주사한 경우 종양성장을 50% 정도 억제하는 것으로 나타나 그의 종양 억제율은 비교적 낮은 것으로 보고되어 있고 (水野 卓 ; 化學と 生物, Vol.21, No.7, 473, 1983), 일반적으로 물에 잘 녹지 않는 성질이 있어 이를 사용하는데도 어려움이 있다.

따라서 항종양 활성을 나타내는 파키만을 효과적으로 이용하기 위하여 이를 용이하게 용해시키려는 많은 연구들이 시도되었다. 일본 특허 JP 49-30547 에서는 파키만을 요소(Urea)로 처리하여 수용성 다당체인 U-파키만 (U-Pachyman)을 제조하였으며, 이는 사르코마 180 를 사용한 쥐 실험에서 91.4 % 의 항종양 활성을 나타낸다고 보고되었다 (Mushroom science IX, Part I, 477 - 487, 1974). 그러나 요소 (Urea)를 처리한 U-파키만은 이를 반복하여 용해시키거나 건조하는 과정에서 용해도가 낮아지는 단점이 있다.

미국 특허 4,207,312 에서는 파키만을 에틸렌옥사이드 (Ethylene oxide)로 반응시켜 얻은 수용성 다당체인 HE-파키만을 제조하였으며, 이는 사르코마 180 을 이용한 쥐 실험에서 0.5mg/kg 을 복강 주사한 경우 96 - 98 % 의 높은 항종양 활성을 보인다고 보고되었다. 그러나 에틸렌옥사이드를 취급하는 과정이 매우 까다롭고, HE-파키만은 그의 용해도가 2mg/ml 로 매우 낮은 단점이 있다.

또한 미국 특허 4,207,312 에서는 그외에도 파키만을 화학적으로 변성시켜 얻은 불용성 파키마란 (Pachymaran)을 클로로아세트산 (Chloroacetic acid)으로 반응시켜 수용성 다당체인 카르복시메틸 - 파키마란 (CM - Pachymaran)을 제조하였으며, 이는 사르코마 180 을 사용한 생체 실험에서 0.5mg/kg 을 복강 주사한 경우에 92 - 93 % 의 높은 항종양 활성을 보인다고 보고되었다. 그러나 이 경우도 파키만을 파키마란으로 변성시키는 제조 과정이 복잡하여 시간과 비용이 많이 소모되므로 실제적으로 사용하는데는 어려움이 있다.

이에 본 발명자들은 식물 또는 버섯에서 항종양 활성을 가지면서 사용이 용이한 새로운 수용성 다당체를 얻기 위하여, 복령의 균핵에서 얻은 다당체의 포도당 잔기에 아세트아마이드기를 결합시켜 그의 안정성 및 수용성이 탁월하게 증가된 새로운 수용성 다당체를 간단하고 경제적인 제조방법을 통해 얻은 다음, 상기 다당체로 사르코마 180 을 이용한 동물 실험을 수행하여 그의 높은 항종양 활성을 확인하고 이에 더하여 그의 고점성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 면역 기능을 증가시켜 항종양 활성을 나타내는 새로운 수용성 다당체를 제공함에 그 목적이 있다.

구체적으로 본 발명은 식물 또는 버섯에서 얻은 불용성 다당체의 포도당 잔기에 아세트아마이드기가 공유적으로 결합되어 안정성 및 수용성이 탁월하게 증가된 새로운 수용성 다당체를 제공하는데, 이 때 아세트아마이드기의 치환도가 0.1-5.0 인 다당체가 바람직하고, 아세트아마이드기의 치환도가 1.0-2.0 인 다당체는 더욱 바람직하다.

또한, 상기 식물에서 얻은 다당체는 셀룰로오스를 포함하고, 버섯에서 얻은 다당체는 복령 다당체 또는 저령 다당체를 포함한다.

또한, 본 발명은 항종양 활성을 가지는 새로운 수용성 다당체를 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

구체적으로 본 발명은 복령의 건조 분말을 알칼리로 추출하여 얻은 다당체에 반응 용매를 가하여 교반시키고, 다시 중화제를 첨가하여 격렬히 교반시킨 다음 반응 물질로 클로로 화합물을 가하여 반응시키고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻고 적당한 용매로 씻어 낸 다음 감압 건조시킴으로써 상기 수용성 다당체를 제조한다.

이 때 상기 반응 용매로는 저급 알코올이 바람직하고, 이소프로판올은 더욱 바람직하며 이를 상온에서 반응시킨다. 또한, 상기 중화제로는 10-50% 범위의 알칼리 용액이 바람직하고, 특히 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 용액이 바람직하다.

또한, 본 발명은 천연 또는 인공 재배한 복령을 포함하여 한방제제를 가공하고 남은 복령도 사용하여 상기 수용성 다당체를 제조한다.

또한, 상기 반응 물질로는 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 클로로아세트아마이드, 디클로로아세트아마이드, 트리클로로아세트아마이드, 클로로아세틸클로라이드, 디클로로아세틸클로라이드, 트리클로로아세틸클로라이드, 클로로아크릴산, 디클로로아크릴산, 트리클로로아크릴산을 포함한 클로로 화합물을 사용하는 것이 바람직하고, 특히 클로로아세트아마이드를 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 상기 반응 물질은 열을 가하여 온도 20-100℃ 범위에서 1 분 - 24 시간 동안 반응시키는 것이 바람직하고, 온도 40-70℃ 범위에서 반응시키는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 상기 원심분리한 침전물은 아세트산을 적당히 가한 70% 에탄올로 중화시켜 80% 에탄올 및 무수 에탄올 등으로 차례대로 씻어낸다.

또한, 본 발명은 상기 수용성 다당체를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 종양을 예방하고 치료하는 용도로 사용함에 그 목적이 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 종양 치료제, 항종양 기능성 식품 및 식품 첨가제 그리고 항종양 기능성 음료 및 음료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수용성 다당체를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을

면역 기능을 활성화하는 용도로 사용함에 그 목적이 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 면역 활성제, 면역활성 기능성 식품 및 식품 첨가제 그리고 면역활성 기능성 음료 및 음료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 근육 또는 정맥 주사제로 뿐만 아니라 경구로도 투여할 수 있고, 기존의 항종양 의약품과 병용하여 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 수용성 다당체를 항종양 활성이 있는 고점성 물질로 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 상기 고점성 다당체는 화장품 첨가제 및 보습제, 증점 안정제, 필름 코팅제 그리고 의약품, 화학제품, 제과류, 천연 식품 및 가공 식품류의 코팅제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 수용성 다당체의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 수용성 다당체의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 수용성 다당체가 고형암의 성장에 미치는 효과를 기존의 파키만 및 파키마란의 효과와 비교하여 나타낸 그래프이다.

본 발명은 화학식 1 로 표시되고 면역 기능을 증가시켜 항종양 활성을 나타내는 새로운 수용성 다당체를 제공한다.

본 발명은 식물 또는 버섯에서 얻은 불용성 다당체에 클로로 화합물을 반응시켜 다당체의 각 포도당 잔기가 치환되므로 안정성 및 수용성이 증가된 새로운 수용성 다당체를 제공한다. 이 때 식물에서 얻은 불용성 다당체는 셀룰로오스를 포함하고, 버섯에서 얻은 다당체는 복령 다당체 또는 저령 다당체를 포함한다.

구체적으로 본 발명의 수용성 다당체는 파키만 (Pachyman)으로 알려진 다당체 구조를 기본으로 하여 그의 각 포도당 잔기에 아세트아마이드기가 공유적으로 결합한 하기 화학식 1 의 구조를 나타낸다.

화학식 1

상기 화학식 1 에서 R 및 R'은 아세트아마이드기(-CH₂CONH₂) 이고,

m 및 n 은 각 단량체의 갯수로서 m 은 40 - 60 이고, n 은 60 - 100 의 범위이다.

본 발명의 수용성 다당체는 아세트아마이드기의 치환도가 0.1-5.0 인 것이 바람직하고, 아세트아마이드기의 치환도가 1.0-2.0 인 것은 더욱 바람직하다.

본 발명의 수용성 다당체의 물리 화학적 특성을 성상, 분자량, 비선광도, 융해점, 용해도, 용해 pH, 적외선 흡수 스펙트럼, 자외선 흡수 스펙트럼, 총당 분석 그리고 총단백질 분석 등으로 상세히 확인한다 (도 1 및 도 2 참조). 상기 다당체의 각 물리 화학적 특성을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

(1) 성상

본 발명의 다당체는 백색 또는 담황백색을 띠며 무미이면서 무취인 특성을 나타낸다.

(2) 분자량

본 발명의 다당체는 분자량이 보통 5-20 x 10⁵범위에서 나타나며 평균 분자량은 8.7 x 10⁵이다.

(3) 비선광도

본 발명의 다당체는 26℃ 에서 C = 1 인 경우 비선광도가 20.3^o로 나타난다.

(4) 융해점

본 발명의 다당체는 융해점이 명확하게 나타나지 않으며 170℃ 이상의 고온에서는 탄화되는 특성이 있다.

(5) 용해도

본 발명의 다당체는 물에 대한 용해도가 15.25 % 로 매우 높으며, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산에는 용해되지 않는다.

(6) 용해 pH

본 발명의 다당체는 주사제에 사용되는 중성 증류수에 0.5 % 로 용해시킨 경우 pH 가 6.0 - 7.0 범위에서 나타나는 특성을 나타낸다.

(7) 적외선 흡수 스펙트럼

본 발명의 다당체를 브롬화칼륨 디스크법을 이용한 적외선 흡수 스펙트럼으로 분석하면 도 1 에 보는 바와 같이 결과가 나타난다. 구체적으로 파수 3,400cm^-1, 2920cm^-1, 1,650cm^-1, 1,600cm^-1, 1,470 - 1,400cm^-1, 1,100 - 1,000cm^-1, 890cm^-1에서 흡수대가 나타난다. 3,400cm^-1의 흡수대는 수소 결합이 있는 수산화기(OH)에 의한 것이고, 1,100 - 1,000cm^-1의 흡수대는 당 부분에 존재하는 피라노스 고리의 C-O-C 결합에 의한 것이며 890cm^-1의 흡수대는 β-글리코사이드에 의한 것이다.

(8) 자외선 흡수 스펙트럼

본 발명의 다당체는 자외선 흡수 스펙트럼이 도 2 에서 보는 바와 같이 192nm 에서 최대 흡수대를 나타낸다.

(9) 총당 분석

본 발명의 다당체의 전체 당류는 페놀-황산법으로 분석하며, 그의 분석 결과는 100 % 모두 당류인 것으로 나타난다.

(10) 총단백질 분석

본 발명의 다당체의 전체 단백질은 로우리-폴린 (Lowry - Folin)법으로 분석하며, 그의 분석 결과는 0 % 로 나타난다.

또한, 본 발명은 항종양 활성을 나타내는 상기 수용성 다당체를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 복령의 건조 분말을 사이토 (Saito) 등의 방법에 따라 알칼리로 추출하여 복령 다당체를 분리한다 (Agr. Biol. Chem., Vol. 32, No. 10, 1261-1269). 상기 복령 다당체에 반응 용매를 가하여 교반시키고, 다시 중화제를 첨가하여 교반시킨 다음 반응 물질을 가하여 반응시키고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻어 적당한 용매로 씻어 낸 다음 감압 건조시킴으로써 상기 수용성 다당체를 제조한다.

보다 구체적으로 본 발명의 제조방법을 살펴보면, 사이토의 방법에 따라 얻은 상기 복령 다당체에 반응 용매로 저급 알코올인 이소프로판올 등을 가하여 상온에서 반응시키고, 이에 다시 알칼리 용액인 중화제를 첨가하여 젤이 형성되지 않을 정도로 격렬하게 교반시킨 다음, 반응 물질로서 클로로 화합물을 첨가하여 반응시키고, 이를 원심분리하여 얻은 침전물을 아세트산을 적당히 가한 70% 에탄올 용액으로 중화시키면서 80% 에탄올 및 무수 에탄올 등으로 차례로 씻어낸 다음 감압 건조시킴으로써 본 발명의 수용성 다당체를 제조한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 중화제로는 10-50% 범위의 알칼리 용액이 바람직하고 특히 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 이 때 젤이 형성되지 않도록 격렬하게 교반시키는 과정이 매우 중요하다. 또한, 본 발명은 천연 또는 인공 재배한 복령을 포함하여 한방 제제를 가공하고 남은 복령도 사용하여 상기 수용성 다당체를 제조할 수 있어 매우 유용하다.

또한, 상기 반응 물질로는 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 클로로아세트아마이드, 디클로로아세트아마이드, 트리클로로아세트아마이드, 클로로아세틸클로라이드, 디클로로아세틸클로라이드, 트리클로로아세틸클로라이드, 클로로아크릴산, 디클로로아크릴산 및 트리클로로아크릴산을 포함한 클로로 화합물을 사용하는 것이 바람직하고, 특히 클로로아세트아미이드를 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 상기 반응 물질은 열을 가하여 온도 20-100℃ 범위에서 1 분 - 24 시간 동안 반응시키는 것이 바람직하고, 온도 40-70℃ 범위에서 반응시키는 것은 더욱 바람직하다.

본 발명의 수용성 다당체를 각각 일정량의 증류수에 녹여 용해도를 조사한 결과, 각각의 용해도는 15 % 이상으로 매우 높음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 반응 물질로 클로로아세트아마이드를 사용한 수용성 다당체의 제조

(치환도 0.5)

복령에서 얻은 다당체인 파키만 1g 을 반응기에 넣고 이소프로판올 30ml 를 가하여 실온에서 30 분 동안 진탕한 다음 20% 수산화나트륨 용액 2.4ml 을 10 분에 1ml 의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90 분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.38g 을 넣어 50 - 60℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 이를 아세트산 10ml 이 첨가된 70 % 에탄올 200ml 로 씻고 다시 80 % 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압 건조시켜 0.98g 의 백색 분말인 수용성 다당체 (AA - 파키만)을 얻었다. 상기 다당체는 용해도가 5 % 이상이었으며, 5 % 수용액 상태로 4℃ 에서 3 달 동안 보관하여도 침전물이 전혀 생기지 않았다.

본 실시예에서 제조한 복령 다당체의 항종양 활성을 조사하기 위하여, 이를 생리 식염수에 용해시켜 실험예 1 의 방법에 따라 동물 실험을 수행하였다. 이를 1 번 시료로 명명하였다.

실시예 2 반응 물질로 클로로아세트아마이드를 사용한 수용성 다당체의 제조

(치환도 1.0)

복령에서 얻은 다당체인 파키만 1g 을 반응기에 넣고 이소프로판올 30ml 를 가하여 실온에서 30 분 동안 진탕한 다음 20% 수산화나트륨 용액 4.6ml 을 10 분에 1ml 의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90 분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.75g 을 넣어 50 - 60℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 이를 아세트산 10ml 이 첨가된 70 % 에탄올 200ml 로 씻고 다시 80 % 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압 건조시켜 1.01g 의 백색 분말인 수용성 다당체 (AA - 파키만)을 얻었다. 상기 다당체는 용해도가 5 % 이상이었으며, 5 % 수용액 상태로 4℃ 에서 3 달 동안 보관하여도 침전물이 전혀 생기지 않았다.

본 실시예에서 제조한 복령 다당체의 항종양 활성을 조사하기 위하여, 이를 생리 식염수에 용해시켜 실험예 1 의 방법에 따라 동물 실험을 수행하였다. 이를 2 번 시료로 명명하였다.

실시예 3 반응 물질로 클로로아세트아마이드를 사용한 수용성 다당체의 제조

(치환도 1.5)

복령에서 얻은 다당체인 파키만 1g 을 반응기에 넣고 이소프로판올 60ml 를 가하여 실온에서 30 분 동안 진탕한 다음 20% 수산화나트륨 용액 6.9ml 을 10 분에 1ml 의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90 분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 1.13g 을 넣어 50 - 60℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 이를 아세트산 10ml 이 첨가된 70 % 에탄올 200ml 로 씻고 다시 80 % 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압 건조시켜 1.10g 의 백색 분말인 수용성 다당체 (AA - 파키만)을 얻었다. 상기 다당체는 용해도가 5 % 이상이었으며, 5 % 수용액 상태로 4℃ 에서 3 달 동안 보관하여도 침전물이 전혀 생기지 않았다.

본 실시예에서 제조한 복령 다당체의 항종양 활성을 조사하기 위하여, 이를 생리 식염수에 용해시켜 실험예 1 의 방법에 따라 동물 실험을 수행하였다. 이를 3 번 시료로 명명하였다.

실시예 4 반응 물질로 클로로아세트아마이드를 사용한 수용성 다당체의 제조

(치환도 2.0)

복령에서 얻은 다당체인 파키만 1g 을 반응기에 넣고 이소프로판올 80ml 를 가하여 실온에서 30 분 동안 진탕한 다음 20% 수산화나트륨 용액 9.2ml 을 10 분에 1ml 의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90 분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 1.5g 을 넣어 50 - 60℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 이를 아세트산 10ml 이 첨가된 70 % 에탄올 200ml 로 씻고 다시 80 % 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압 건조시켜 1.13g 의 백색 분말인 수용성 다당체 (AA - 파키만)을 얻었다. 상기 다당체는 용해도가 5 % 이상이었으며, 5 % 수용액 상태로 4℃ 에서 3 달 동안 보관하여도 침전물이 전혀 생기지 않았다.

본 실시예에서 제조한 복령 다당체의 항종양 활성을 조사하기 위하여, 이를 생리 식염수에 용해시켜 실험예 1 의 방법에 따라 동물 실험을 수행하였다. 이를 4 번 시료로 명명하였다.

실시예 5 반응 물질로 클로로아세트아마이드를 사용한 수용성 다당체의 제조

(치환도 2.5)

복령에서 얻은 다당체인 파키만 1g 을 반응기에 넣고 이소프로판올 100ml 를 가하여 실온에서 30 분 동안 진탕한 다음 30% 수산화나트륨 용액 7.7ml 을 10 분에 1ml 의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90 분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 1.88g 을 넣어 50 - 60℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 이를 아세트산 10ml 이 첨가된 70 % 에탄올 200ml 로 씻고 다시 80 % 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압 건조시켜 1.10g 의 백색 분말인 수용성 다당체 (AA - 파키만)을 얻었다. 상기 다당체는 용해도가 5 % 이상이었으며, 5 % 수용액 상태로 4℃ 에서 3 달 동안 보관하여도 침전물이 전혀 생기지 않았다.

본 실시예에서 제조한 복령 다당체의 항종양 활성을 조사하기 위하여, 이를 생리 식염수에 용해시켜 실험예 1 의 방법에 따라 동물 실험을 수행하였다. 이를 5 번 시료로 명명하였다.

실시예 6 반응 물질로 클로로아세트아마이드를 사용한 수용성 다당체의 제조

(치환도 3.0)

복령에서 얻은 다당체인 파키만 1g 을 반응기에 넣고 이소프로판올 120ml 를 가하여 실온에서 30 분 동안 진탕한 다음 30% 수산화나트륨 용액 9.2ml 을 10 분에 1ml 의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90 분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 2.25g 을 넣어 50 - 60℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 이를 아세트산 10ml 이 첨가된 70 % 에탄올 200ml 로 씻고 다시 80 % 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압 건조시켜 1.02g 의 백색 분말인 수용성 다당체 (AA - 파키만)을 얻었다. 상기 다당체는 용해도가 5 % 이상이었으며, 5 % 수용액 상태로 4℃ 에서 3 달 동안 보관하여도 침전물이 전혀 생기지 않았다.

본 실시예에서 제조한 복령 다당체의 항종양 활성을 조사하기 위하여, 이를 생리 식염수에 용해시켜 실험예 1 의 방법에 따라 동물 실험을 수행하였다. 이를 6 번 시료로 명명하였다.

또한 본 발명은 생체의 면역 기능을 강화하여 탁월한 항종양 활성을 나타내고 세포 독성을 전혀 나타내지 않는 상기 수용성 다당체의 용도를 제공하는데, 구체적으로 상기 다당체는 면역 기능을 활성화시키는 용도, 종양을 예방하고 치료하는 용도 그리고 고점성 물질로서의 용도 등으로 사용된다.

본 발명의 수용성 다당체는 근육 또는 정맥 주사제 뿐만 아니라 경구로도 투여할 수 있고 기존의 항종양 의약품과 병용하여 사용될 수도 있으므로 매우 유용하다.

구체적으로 상기 수용성 다당체는 항종양 기능성 식품 및 식품 첨가제, 항종양 기능성 음료 및 음료 첨가제 그리고 면역 활성제, 면역활성 기능성 식품 및 식품 첨가제, 면역활성 기능성 음료 및 음료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 수용성 다당체는 항종양 활성이 있는 고점성 물질로서 화장품 첨가제, 보습제, 증점 안정제, 필름 코팅제 그리고 의약품, 화학제품, 제과류, 천연 식품 및 가공 식품류 등의 코팅제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

구체적으로 본 발명은 상기 수용성 다당체가 나타내는 항종양 활성 및 세포 독성 등을 조사하기 위하여, 실험예 1 및 실험예 2 의 방법으로 상기 각 다당체가 종양의 증식을 억제하는 정도 및 이에 의한 세포 생존율 등을 측정하여 비교한다.

실험예 1 항종양 활성 조사

본 발명에서 제조한 각각의 수용성 다당체를 가지고 실험 ICR 쥐를 대상으로 사르코마 180 을 우측 서혜부의 피하에 이식한 다음 복강에 투여하여 고형암의 성장이 억제되는 정도를 조사하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하였고, 다당체 처리군에는 각 수용성 다당체를 생리 식염수에 용해시켜 pH 6.5 - 7.5 로 조정한 다음 투여하였다. 각 다당체 처리군은 사르코마 180 을 피하에 이식한 다음 24 시간이 경과한 다음 각 다당체를 10mg/kg 의 농도로 10 일간 0.1ml 씩 연속으로 투여하였다. 그외에도 각 다당체 처리군에 투여한 다당체 용량에 따른 실험을 수행하기 위하여 각 다당체를 각각 1, 3, 10, 30 및 100mg/kg 의 농도로 10 일간 0.1ml 씩 연속으로 투여하였다.

다음 사르코마 180 을 피하에 이식한 다음 17 일째 부터 2 - 3 일 간격으로 종양을 적출할 때까지 외부에서 종양의 크기를 측정하여 평균 종양 부피를 다음과 같이 계산하였다 (도 3 참조).

a 1* b²1* 0.4

여기서 a 는 종양의 가장 긴 지름을, b 는 가장 짧은 지름을 나타낸다.

또한, 종양을 이식한 다음 28 일째에 종양을 적출하여 종양 증식 저지율을 살펴보았다. 종양 증식 저지율 (IR : Inhibition ratio)은 다음 식에 따라 계산하였다.

IR (% ) = ( C - T ) / C 1* 100

여기서 C 는 대조군인 쥐에서 적출한 종양의 평균 중량이고, T 는 다당체 처리군인 쥐에서 적출한 종양의 평균 중량이다.

이 때 종양이 생기지 않은 처리군은 종양 증식 저지율의 계산에 넣지 않았으며, 종양이 생긴 처리군에서 적출한 종양만의 무게를 재어 평균을 내었다. 종양이 생기지 않은 것은 따로 완전 퇴축으로 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 다당체 중에 사르코마 180 에 대하여 기존의 파키마란이나 U-파키만 보다 강력한 항종양 활성을 나타내는 처리군을 확인할 수 있었고, 구체적으로 표 1 및 표 2 에 그 결과를 나타냈다.

본 발명의 다당체의 사르코마 180 고형암에 대한 효과

시료	처리방법	처리농도(mg/kg)	평균 적출종양무게(g)	종양 증식저지율(%)	완전 퇴축
대조군	복강내	-	4.41±1.4	-	0/10
1 번	복강내	10	3.09±1.3	30	0/8
2 번	복강내	10	1.27±0.7	71	1/9
3 번	복강내	10	0.85±0.5	81	2/10
4 번	복강내	10	1.54±0.9	65	1/7
5 번	복강내	10	1.75±1.1	60	1/10
6 번	복강내	10	2.44±1.5	45	1/10
대조군	복강내	-	4.32±2.3	-	0/10
파키만	복강내	10	2.08±0.6	52	0/9
U-파키만	복강내	10	1.13±0.7	74	0/9
파키마란	복강내	10	1.23±0.9	72	0/9

표 1 에 보는 바와 같이, 본 발명의 다당체 (1 번 - 6 번 시료)를 처리한 모든 군에 항종양 효과가 있었으나, 특히 아세트아마이드기의 치환도가 1.5 인 3 번 시료의 경우는 기존의 파키만, U-파키만 및 파키마란을 처리한 군보다 월등히 적출된 평균 종양 무게는 작고 종양 증식 저지율은 높아 항종양 효과가 탁월함을 알 수 있었다.

따라서 3 번 다당체 시료로 처리한 군으로 다당체의 용량별로 그의 항종양 효과를 조사하여 표 2 에 그 결과를 나타냈다.

본 발명의 다당체 (3 번 시료)의 사르코마 180 고형암에 대한 효과

시료	처리방법	처리농도(mg/kg)	평균 적출종양무게(g)	종양 증식저지율(%)	완전 퇴축
대조군	복강내	-	3.59±1.8	-	0/10
3 번	복강내	1	2.10±1.4	42	1/9
3 번	복강내	3	2.02±1.1	44	1/9
3 번	복강내	10	0.55±0.5	85	1/9
3 번	복강내	30	0.93±0.5	74	2/8
3 번	복강내	100	2.23±1.1	38	1/9
대조군	복강내	-	4.32±2.3	-	0/10
파키만	복강내	10	2.08±0.6	52	0/9
U-파키만	복강내	10	1.13±0.7	74	0/9
파키마란	복강내	10	1.23±0.9	72	0/9

실험예 2 세포 독성 조사

본 발명의 다당체의 세포 독성을 조사하기 위하여, 3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(MTT)를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 사르코마 180 세포를 1 1* 10⁵세포/ml 의 농도가 되도록 인산완충용액(PBS)으로 조정하여 96-웰 마이크로플레이트 (Falcon, USA)에 웰 (well) 당 100μl 씩 넣었다. 다음 상기 수용성 다당체를 1mg/ml 농도로 인산완충용액에 용해시키고 1/3 씩 희석하여 0.3μlg/ml 농도가 되는 때까지 계속 희석하고 최종 부피가 200μl 가 되도록 맞추어 37℃, 5% CO₂배양기에서 48 시간 동안 배양하였다. 다음 MTT 시약이 5mg/ml 농도로 들어있는 인산완충용액을 20μl 씩 첨가하여 4 시간 동안 배양하고, 상층액 100μl 를 취한 다음 0.04N 염산-이소프로판올 100μl를 첨가하여 하룻밤 동안 방치하고 이를 자동 엘리자 판독기 (Molecular Devices Corp. USA)를 이용하여 560nm 에서 흡광도를 측정함으로써 세포 생존율을 조사하였다 (수학식 3 참조).

평균 생존율 (%) = 시료 처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

그 결과, 본 발명의 수용성 다당체는 직접적인 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었고, 상기 다당체의 항종양 활성은 종양 세포를 사멸시키는 결과가 아닌 생체의 면역 기능을 강화시킨 결과에 의한 것을 알 수 있었다 (표 3 참조).

본 발명의 다당체 (3 번 시료)의 사르코마 180 에 대한 직접적인 세포 독성 실험

시료 농도 (μg/ml)	평균 생존율 (%)
	HPBP - 파키만
1000.0	110.4
500.0	106.9
250.0	100.1
125.0	100.8
62.5	101.0
31.3	100.5
15.6	100.2
7.8	107.9
3.9	111.7

본 발명의 수용성 다당체는 생체의 면역 활성을 강화시켜 항종양 활성을 나타내므로 세포 독성이 거의 없고, 각 포도당 잔기를 아세트아마이드기로 치환시켜 안정성이 크고 파키만 및 그의 유도체에 비하여 수용성이 월등히 증가되므로 (15% 이상) 우수한 항종양 의약품으로 매우 기대된다.

또한, 상기 수용성 다당체는 간단한 제조방법을 통해 얻을 수 있고 이 과정에 비용이 적게 들므로 매우 경제적이고, 특히 한방 제제에 사용하고 남은 복령 등도 이의 제조에 이용될 수 있어 경제적이다. 특히 반응 물질로 클로로아세트아마이드를 사용하여 제조한 수용성 다당체는 용해도, 회수율, 제조의 용이성 및 항종양 효과 등에 있어서 매우 탁월하였다.

이외에도 상기 다당체는 경구로도 투여될 수 있어 기존의 항종양 의약품과 병용하여 다양하게 이용될 수 있다. 구체적으로 상기 다당체는 항종양 기능성 식품 및 식품 첨가제, 항종양 기능성 음료 및 음료 첨가제 그리고 면역 활성제, 면역활성 기능성 식품 및 식품 첨가제, 면역활성 기능성 음료 및 음료 첨가제 등으로 사용될 수 있다.

또한 상기 다당체는 항 종양 활성이 있는 고점성 물질로서 효과적으로 이용될 수 있는데, 구체적으로 화장품 첨가제, 보습제, 증점 안정제, 필름 코팅제 그리고 의약품, 화학제품 등의 코팅제로 개발될 수 있다.

Claims (23)

1. 면역 기능을 증가시켜 항종양 활성을 나타내는 다당체의 포도당 잔기를 치환시켜 얻은 새로운 수용성 다당체.
2. 제 1항에 있어서, 다당체는 식물 또는 버섯에서 얻은 것을 특징으로 하는 새로운 수용성 다당체.
3. 제 2항에 있어서, 식물에서 얻은 다당체는 셀룰로오스를 포함하고, 버섯에서 얻은 다당체는 복령 다당체 또는 저령 다당체를 포함하는 것을 특징으로 하는 새로운 수용성 다당체.
4. 제 2항에 있어서, 포도당 잔기에 아세트아마이드기가 공유적으로 결합된 새로운 수용성 다당체.
5. 제 4항에 있어서, 아세트아마이드기의 치환도가 0.1-5.0 인 새로운 수용성 다당체.
6. 제 5항에 있어서, 바람직하게는 아세트아마이드기의 치환도가 1.0-2.0 인 새로운 수용성 다당체.
7. 복령의 건조 분말을 알칼리로 추출하여 얻은 다당체에 반응 용매를 가하여 교반시키고, 다시 중화제를 첨가하여 격렬히 교반시킨 다음 클로로 화합물을 가하여 반응시키고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻고 알코올로 씻어 낸 다음 감압 건조시키는 제 1항의 수용성 다당체를 얻는 제조방법.
8. 제 7항에 있어서, 천연의 복령, 인공 재배한 복령 또는 한방제제를 가공하고 남은 복령을 사용하여 제 1항의 수용성 다당체를 얻는 제조방법.
9. 제 7항에 있어서, 반응 용매로는 저급 알코올을 사용하는 제조방법.
10. 제 7항에 있어서, 중화제로는 농도가 10-50% 범위인 알칼리 용액을 사용하는 제조방법.
11. 제 7항에 있어서, 클로로 화합물은 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 클로로아세트아마이드, 디클로로아세트아마이드, 트리클로로아세트아마이드, 클로로아세틸클로라이드, 디클로로아세틸클로라이드, 트리클로로아세틸클로라이드, 클로로아크릴산, 디클로로아크릴산 및 트리클로로아크릴산을 포함하는 제조방법.
12. 제 11항에 있어서, 바람직하게는 클로로 화합물이 클로로아세트아마이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
13. 제 7항 또는 제 11항에 있어서, 클로로 화합물을 온도 20-100℃ 범위에서 반응시키는 제조방법.
14. 제 13항에 있어서, 바람직하게는 클로로 화합물을 온도 40-70℃ 범위에서 반응시키는 제조방법.
15. 제 1항의 수용성 다당체를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 종양 치료제로 사용하는 용도.
16. 제 15항에 있어서, 기존의 항종양 의약품과 병용하여 사용하는 용도.
17. 제 15항에 있어서, 항종양 기능성 식품 또는 식품 첨가제로 사용하는 용도.
18. 제 15 항에 있어서, 항종양 기능성 음료 또는 음료 첨가제로 사용하는 용도.
19. 제 1항의 수용성 다당체를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 면역 활성제로 사용하는 용도.
20. 제 19항에 있어서, 면역활성 기능성 식품 또는 식품 첨가제로 사용하는 용도.
21. 제 19항에 있어서, 면역활성 기능성 음료 또는 음료 첨가제로 사용하는 용도.
22. 제 1항의 수용성 다당체를 항종양 활성이 있는 고점성 물질로 사용하는 용도.
23. 제 22항에 있어서, 화장품 첨가제, 보습제, 증점 안정제 또는 필름, 의약품, 화학제품, 제과류, 천연식품 및 가공식품의 코팅제로 사용하는 용도.