KR19980018623A

KR19980018623A - 면역 검정 방법

Info

Publication number: KR19980018623A
Application number: KR1019970038464A
Authority: KR
Inventors: 제임스 더글라스 타커; 엘레 잘크 카젤; 스탠리 스티븐 스타빈스키; 슈광 후
Original assignee: 에들러마크에스; 롬 앤드 하스 큼파니
Priority date: 1996-08-12
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 1998-06-05
Also published as: AU3326597A; US5948406A; EP0824104A2; US5981196A; EP0824104A3; IL121534A; CA2212711A1; AU745546B2; IL121534A0

Abstract

본 발명은 디아실 히드라진 화합물을 측정하기 위한 면역원, 항체, 재료 및 이들을 이용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 사용하기 쉽고, 비용이 싸고, FIFRA 기준하에 사용할 수 있는 적절한 교차-반응성과 민감성을 제공한다.

Description

면역 검정 방법

본 발명은 디아실 히드라진 화합물을 측정하기 위한 면역 검정(immunoassay) 방법에 관한 것이다.

디아실 히드라진 화합물을 측정하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 가스 액체 크로마토그래피(GLC), GC-질량 분광계 및 HPLC-질량 분광계를 들 수 있으나 이들 방법들은 다수의 다수의 단점을 가지고 있다. 이들 방법들은 일반적으로 고가이고 복잡한 기기 설치를 필요로 한다. 나아가 시료 제조 및 실제 분석은 매우 장시간이 걸리고 상기 방법에는 특별히 훈련받은 화학자 및 기술자를 필요로 한다. 더욱이 상기 종래 기술 방법은 유사 물질이나 대사산물(metabolite) 혹은 이들 두가지 모두를 동일 단계에서 신속하게 선별할 수가 없다. 더욱이 검출되기 전에 개별 화합물을 분리하는 것이 필요하다. 결과적으로 이들 방법은 예를 들어 필드 시험이나 대량 시험에서 필요로 하는 신속하고, 저단가로 측정할 수 없는 것이다.

디아실 히드라진 화합물은 살충제로 사용될 수 있으며 특히 모충(caterpiller) 용해 촉진 화합물(molt accelerating compound, MAC)로서 유용하다. 모든 잠재적으로 유해한 화합물과 같이 이같은 살충제는 정부의 규제를 받는다. 법적 승인을 얻기 위하여는 이같은 용도에 대한 적절한 민감성을 갖는 검정을 필요로 하는 Federal Insecticide, Fungicide and Rodenticide Act(FIFRA) Registration Guideline, Subdivision 0에 따라 잔류물 분석을 필요로 한다. 더욱이 상기 검정은 FIFRA Registration Guideline, Subdivision N.이 요구하는 대사산물 및 환경 파괴 연구에 사용하기 적합하도록 디아실 히드라진 살충제의 주요 대사 산물에 정확한 교차 반응성을 가져야 한다. 검정은 또한 살충제의 사용량을 모니터하는데도 필요로 한다.

이에 FIFRA 기준에 부합하는 충분한 민감성과 교차 반응성을 갖으며, 신속하게 스크린되고 사용하기 간단하고 비용이 싼 디아실 히드라진 검정 방법을 제공할 필요가 있는 것이다.

본 발명자들은 FIFRA 기준에 부합하도록 충분히 민감성이 있고 사용 한정하기에 충분한 교차-반응성을 갖는 면역화학적 측정법을 개발하였으며, 이 방법은 간단하고 비용이 적게 드는 것이다.

도 1은 DEAE 이온 교환 칼럼으로 부터의 단백질 용출 프로파일을 나타낸 그래프이고,

도 2는 RH2703에 대한 억제 곡선을 나타낸 그래프이며,

도 3는 RH2651에 대한 억제 곡선을 나타낸 그래프이며,

도 4는 RH5992에 대한 억제 곡선을 나타낸 그래프이며,

도 5는 RH0345에 대한 억제 곡선을 나타낸 그래프이며,

도 6는 RH2485에 대한 억제 곡선을 나타낸 그래프이며,

도 7은 PBST 및 매트릭스 블랭크 시료에서 얻어진 외부 표준 곡선을 나타낸 그래프이며,

도 8은 브로콜리(Broccoli) 시료 20139-01에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 9는 브로콜리 시료 20139-02에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 10은 브로콜리 시료 20139-04에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 11은 브로콜리 시료 20139-05에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 12는 토양(soil) 시료 151에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 13은 토양 시료 157에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 14는 토양 시료 175에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 15는 토양 시료 187에 대한 계산된 선형 회귀선을 나타낸 그래프이며,

도 16a 및 b는 직접 검정 곡선 및 직접 검정 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 일견기에 있어서, 하기식을 갖는 화합물을 포함하는 면역원이 제공된다.

[화학식 1]

단, 상기 식에서 R, R¹, R², R³및 R⁴는 H, (C₁-C₆)알킬 및 치환된 (C₁-C₆)알킬, (C₂-C₆)알케닐 및 치환된 (C₂-C₆)알케닐, (C₁-C₆)알콕시, (C₁-C₆)알킬옥시 및 할라이드로 부터 각각 독립적으로 선택되고; 캐리어 물질과 결합된다.

본 발명의 제2견지에 있어서는, (A) 알려지지 않은 양의 디아실 히드라진을 포함하는 시료를 제공하는 단계; (B) 상기 시료를 고정된 디아실 히드라진의 존재하에 디아실 히드라진 항원에 결합 친화도(binding affinity)를 갖는 항체와 접촉시켜 결합된 그리고 결합되지 않은 항체-항원 복합물을 형성하는 단계; (C) 상기 결합되지 않은 항체-항원 복합물을 결합된 항체-항원 복합물로 부터 분리하는 단계; (D) 상기 결합된 항체 복합물을 검출가능한 라벨로 라벨링(labelling)하는 단계; (E) 상기 라벨에서 측정가능한 변화를 일으키는 단계; 및 (F) 상기 시료내의 디아실 히드라진을 측정하는 단계;를 포함하는 디아실 히드라진 혹은 이들의 유도체를 측정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제3 견지에 의하면, (A) 알려지지 않은 양의 디아실 히드라진을 포함하는 시료를 제공하는 단계; (B) 상기 시료를 디아실 히드라진 항원에 결합 친화도를 갖는 고정된 항체와 접촉시켜 고정된 항체-항원 복합물을 형성하는 단계; (C) 검출가능한 라벨을 갖는 디아실 히드라진 항원을 복합화되지 않은 고정화된 항체와 접촉시켜 라벨화된 항체-항원 복합물을 제조하는 단계; (D) 상기 라벨내에서 측정가능한 변화를 일으키는 단계; (E) 상기 시료내에서 디아실 히드라진을 측정하는 단계;를 포함하는 디아실 히드라진 혹은 이들의 유도체를 측정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제4 견지에 의하면, (A) 디아실 히드라진에 결합 친화성을 갖는 항체; (B) 상기 항체에 결합가능한 라벨; 및 (C) 상기 라벨의 존재하에 측정가능한 변화를 생성할 수 있는 기질; 을 포함하는 디아실 히드라진 측정 키트(kit)가 제공된다.

본 명세서에서 용어 항원은 항체 생성을 자극할 수 있는 어떠한 물질인 것으로 해석된다. 마찬가지로 용어 디아실 히드라진 항원은 제조된 항체가 디아실 히드라진 및 이들의 유도체에 결합 친화성을 갖는 항체 제조를 자극할 수 있는 어떠한 디아실 히드라진 화합물로 해석된다. 또한 용어 면역원은 면역성 반응을 유도하는데 사용되는 물질을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 면역원은 일반적으로 캐리어 분자 및 다른 성분(합텐, hapten)으로 이루어진다.

본 명세서에서 사용된 용어 측정이란 품성 분석, 즉 시료내에 분석자의 존재 확인, 뿐만 아니라 정량 분석, 즉 시료내에 분석자의 양을 측정하는 것,을 모두 포함하는 것으로 해석된다. 또한 상기 용어는 상기 제조, 표준물 제조 및 표준 곡선을 포함할 수 있는 것으로 여겨지며, 이같은 제조법은 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 디아실 히드라진 화합물이란 디아실 히드라진 뿐만 아니라 이로 부터 유도되는 대사산물, 합성 구조 유사물, 환경적 퇴화물 및 광화학적 퇴화물도의 범위를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 IC₅₀이란 저해제가 전혀 존재하지 않는 경우 측정된 1/2 흡수도로 흡수도를 감소시키는데 필요한 억제제의 농도를 의미한다. 상기 측정은 억제제의 농도에 대한 잔류하는 퍼센트(%) 활성도를 그림으로써 얻어지며, 잔류% 활성도는:

% 활성=(Ao-Ai/Ao)×100로 주어진다.

여기서 Ao는 억제제가 존재하지 않는 경우 측정된 흡수도이고 Ai는 억제제 i번째 농도에서 측정된 흡수도이다. 그런 다음 퍼센트 억제는 관계식 100-(% 활성)에 의해 얻어질 수 있다.

퍼센트 교차 반응성은 하기 방정식으로 유도될 수 있다:

% 교차-반응도=(IC_50,5992/IC_{50, 구조 유사물})×100

여기서 IC_50,5992는 상기와 같이 측정된 RH5992에 대한 IC₅₀농도이고 IC_{50, 구조 유사물}은 구조 유사물, 즉 RH2703, RH2651, 및 RH0345의 IC₅₀농도이다.

민감도(ng)는 하기 방정식에 기술된 바와 같이 표준 농도의 복제 분석(replicate analyse)의 표준 편차를 회귀 분석하여 측정된 억제제의 농도로 부터 계산된다:

S=(Yint/m)×V

상기에서 S(ng)는 민감도이고, Yint는 흡수 유니트에서 복제 분석의 표준 편차로 부터 회귀선의 Y-접점이며, m은 ng/ml당 흡수 유니트에서 회귀선의 기울기이며, V는 마이크로티터 판(microtiter plate)에 적용된 시료의 부피(ml)이다.

퍼센트 회수율(R)은 하기 관계식으로 부터 계산된다:

%R=(Co-Ca)×100

여기서 Co는 관찰된(측정된) 농도이며 Ca는 실제(스파이크, spika) 농도이다.

상기한 바와 같이, 디아실 히드라진에 대한 항체를 제조하는데 유용한 면역원이 제공된다. 일반적으로 상기 면역원은 합텐(부착체) 및 캐리어 분자를 포함한다.

상기 부착제는 일반적으로 디아실 히드라진 분자 혹은 이들의 유도체이다.

일 실시예에서 상기 부착제는 벤조일 히드라진이다. 상기 벤조일 히드라진 화합물은 상기식 (1)에 의한 화합물이다.

(C₁-C₆)알킬의 적합한 예로는, 한정되는 것은 아니나, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실 등을 들 수 있다. (C₁-C₆)치환된 알킬의 적합한 예로는, 한정되는 것은 아니나, 히드록시, 할라이드, (C₁-C₄)알콕시 및 니트로로 치환된 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실 등이다.

(C₂-C₆)알케닐의 적합한 예로는, 한정되는 것은 아니나, 에텐일, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부텐일, tert-부텐일, n-프로펜일, 이소펜텐일, 네오펜텐일, n-헥센일 등을 포함한다. (C₂-C₆) 치환된 알케닐의 적합한 예로는, 한정되는 것은 아니나, 히드록시, 할라이드 혹은 니트로기로 치환된 에텐일, n-프로펜일, 이소프로펜일, n-부텐일, 이소부텐일, tert-부텐일, n-펜텐일, 이소펜텐일, 네오펜텐일, n-헥센일 등을 포함한다.

(C₁-C₆)알콕시의 적절한 예로는, 한정되는 것은 아니나, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시, 이소펜톡시, 네오펜톡시 및 n-헥톡시를 포함한다.

(C₁-C₆)알킬옥시의 적합한 예로는, 한정하는 것은 아니나, 카복시(-COOH), 아세틸옥시(-CH₂COOH), 프로필옥시(-CH₂CH₂COOH) 및 N-부틸옥시(-CH₂CH₂CH₂COOH)를 포함한다. 할라이드의 적합한 예로는, 한정되는 것은 아니나, Cl-, Br-, F-. 및 I-를 포함한다.

바람직한 실시예에서, R은 -CH₂COOH이고 R¹및 R²는 각각 메틸이며 R³및 R⁴는 각각 수소이다. 보다 바람직한 실시예에서 R은 -COOH이고 R¹및 R²는 각각 메틸이며 R³및 R⁴는 각각 수소인 것이다.

캐리어 물질은 예를 들면 한정되는 것은 아니나 소 혈청 알부민, 오발부민(ovalbumin), 혹은 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH)과 같은 단백질; 덱스트란, 세파로스(sepharose), 아가로스(agarose) 혹은 셀룰로오스와 같은 다당류; 혹은 폴리아르콜레인, 폴리아미드, 폴리아크릴아미드, 폴리부틸레이트, 폴리우레아, 폴리우레아미드, 혹은 폴리스티렌과 같은 합성 중합체나 공중합체;일 수 있다.

바람직한 실시예에서 상기 캐리어 물질은 캐리어 단백질이고, 보다 바람직하게는 소 혈청 알부민(BSA) 혹은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)이고, 가장 바람직하게는 키홀 림펫 헤모시아닌이다.

본 발명의 면역원은 디아실 히드라진 화합물에 대한 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 면역원은 적절한 동물내로 주입되고 항체가 수집, 분리 및 정제된다. 결과물인 항체는 디아실 히드라진 화합물 및 이들의 유도체, 특히 벤조일 히드라진 및 이들의 유도체에 높은 결합 친화도 및 교차 활성을 갖는 폴리클론 항체(polyclonal antibodies)이다.

대체적으로, 상기 면역원은 이 기술 분야에서 잘 알려진 하이브리도마(hybridoma) 기술의 사용을 통하여 모노클론(monoclonal) 항체를 제조하는데 이용될 수 있다.

일 실시예에서, 항체는 캐리어 물질과 결합된 식 (1)의 면역원으로 융기된다. 바람직한 실시예에서 항체는 R은 -CH₃COOH이고 R¹및 R²는 메틸이며 R³및 R⁴는 수소이고, 케리어 물질에 결합된 식(1)의 면역원으로 융기된다. 보다 바람직한 실시예에서 항체는 R은 -COOH이고 R¹및 R²는 메틸이며 R³및 R⁴는 수소이고, 케리어 물질에 결합된 식(1)의 면역원으로 융기된다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 디아실 히드라진 혹은 이들의 유도체를 측정하는 방법을 제공한다. 초기에, 상기 방법은 알려지지 않은 양의 디아실 히드라진을 포함하는 시료를 제공하는 단계 (A)를 포함한다.

상기 시료는 일반적으로 디아실 히드라진을 포함할 수 있는 어떠한 물질이다. 적합한 예로는 공기, 물, 토양 및 생물적 물질을 포함한다. 일 실시예에서 상기 시료는 공기 시료 혹은 공기 시료로 부터 유도된 시료일 수 있다. 또다른 실시예에서 상기 시료는 물 시료 혹은 물 시료로 부터 유도된 시료일 수 있다. 나아가 또다른 실시에에서 상기 시료는 토양 시료 혹은 토양 시료로 부터 유도된 시료일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 시료는 생물학적 물질 혹은 생물학적 물질을 함유하는 시료 혹은 생물학적 물질로 부터 유도된 시료일 수 있다. 생물학적 물질의 적절한 예로는 한정되는 것은 아니나, 식물 물질; 피, 혈청, 형질(plasma), 임파액, 위 세척(gastric lavage), 담즙(bile), 유리체(초자체)액과 같은 생물학적 유체; 식물 및 동물 조직과 같은 생물학적 조직; 및 박테리아 및 비루스와 같은 미생물 표본;을 포함한다.

바람직한 실시예에서 상기 시료는 토양 혹은 식물 물질 혹은 이로 부터 유도된 시료이다.

상기 디아실 히드라진 화합물은 식 1에 상기 기재된 것뿐만 아니라 그 유도체이다. 상기 유도체는 한정하는 것은 아니나 대사산물, 합성 구조 유사물, 환경적 퇴행, 이로 부터 유도된 광화학적 퇴행물이다. 특히 유용한 디아실 히드라진은 하기표 1에 나타낸 식 1에 의한 벤조일 히드라진이다.

단계 (A)의 시료는 단계 (B)에서 고정화된 디아실 히드라진 항원 의 존재하에 디아실 히드라진에 결합 친화도를 갖는 항체와 접촉된다.

상기 항체는 상기 기술된 것으로서 KLH에 결합된 RH2651을 포함하는 면역원으로 부터 융기된 항체가 바람직하다.

상기 고정화된 디아실 히드라진의 항원은 상기 기술된 캐리어 분자중 어느 것과 결합된 상기 기술된 디아실 히드라진의 어떠한 것일 수 있다. 바람직한 실시예에서 고정된 항원은 캐리어 단백질에 결합된 RH2651 혹은 RH2703이며, 보다 바람직하게는 BSA에 결합된 RH2703이다. 상기 항원과 캐리어 분자의 결합은 코팅 항원(coating antigen)으로 불리어진다.

상기 코팅 항원은 이같은 항원 부착을 받아들이는 표면을 갖는 고체 지지체상에 일번적으로 고정화된다. 적절한 예로는 한정하는 것은 아니나 마이크로티터 플레이트; 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카보네이트 등과 같은 막(membrane) 물질; 시험 튜브; 비드, 칼럼 충진재 등과 같은 입자; 및 상부에 부착된 항원을 결합할 수 있는 결합 도메인을 갖는 유도된 표면;을 포함한다.

일반적으로 상기 코팅 항원은 고체 지지체에 적용되어 흡수된다.

일 실시예에서, 상기 코팅 항원은 마이크로티터 플레이트에 흡수된다.

단계 (B)에서는 디아실 히드라진에 높은 친화도를 갖는 항체상의 결합 부위에 대한 경쟁이 자유 항원, 즉 시료중 미지량의 벤조일 히드라진과 고정화된, 즉 결합된 항원 사이에서 일어난다. 그 결과 결합되고 결합되지 않은 항원-항체 복합물이 형성된다. 단계(C)에서는 결합된 복합물은 결합되지 않는 복합물로 부터 분리된다. 분리는, 한정되는 것은 아니나, 중력 분리, 자기 분리 및 수세와 같이 이 기술 분야에 알려진 어떠한 수단에 의해 수행되어 결합되지 않은 복합물을 제거한다.

상기 결합되지 않은 항원-항체 복합물로 부터 일단 분리되면 단계 (D)에서 검출가능한 표지(라벨)로 라벨링된다. 상기 표지는 결합된 항원-항체 복합물로 고정되어 검출될 수 있는 어떠한 물질이다. 상기 표지는 기질과의 상호 작용에 의해 직접 혹은 간접으로 검출될 수 있다. 적절한 예로는, 한정하는 것은 아니나, 효소, 착색된 염료, 형광 물질, 화학 발광(chemiluminescent) 물질, 생물 발광(bioluminescent) 물질 및 방사성 동위원소를 포함한다. 바람직한 실시예에서 검출가능한 표지는 효소이다. 일반적으로 상기 효소는 결합된 항체-항원 복합물에 대하여 결합 친화도를 갖는 물질과 결합된다. 상기 복합물에 대한 표지의 결합은 항체-항원, 단백질-리간드 혹은 아비딘(스트레파비딘)-비오틴 결합에 의할 수 있다. 바람직한 실시에에서, 결합은 라벨(표지)이 결합된 항체-항원 복합물에 결합 친화도를 갖는 항체에 결합되는 항체-항원 결합이다. 상기 결합 결과는 이 기술 분야에서 공지된 전형적인 샌드위치 구조를 낳는다. 라벨에 결합된 상기 항체은 폴리클론 혹은 모토클론일 수 있다. 더욱이 상기 인용된 항체중 Fab 분획과 같은 항체의 결합 영역을 함유하는 어떠한 항체 분획이 사용될 수 있다. 라벨에 결합된 특징 항체는 물론 항원에 결합된 항체의 종류에 좌우된다. 즉, 라벨에 결합된 항체는 고정화된 항체-항체 복합물에 결합 친화도를 갖도록 선택될 것이다.

예를 들어 바람직한 실시예에서 본 발명에서 항원에 결합된 항체는 토끼에 융기된다. 결과적으로 라벨에 결합된 항체는 토끼 항체에 결합 친화도를 갖는 항-토끼 항체이다.

고정화된 항체-항원 복합물이 일단 라벨링되면, 단계 (E)에서는 그 라벨(표지)에 측정가능한 변화를 일으킨다. 상기 측정가능한 변화는 VU-VIS 광, 형광, 전기 파형 혹은 측정가능한 변화를 만들도록 라벨과 상호작용하는 기질의 도입에 의해 행해질 수 있다. 측정가능한 변화는 예를 들어 표지에 고유적일 수 있으며 상기 라벨(표지)는 방사능 측정 수단을 단지 도입함으로써 방사능, 예를 들어 γ-선,을 간단히 일으킬 수 있는 방사선 동위원소일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 측정가능한 변화는 기질과 라벨링된 복합물을 접촉시킴으로써 수행된다. 이같은 기질은 이 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 물론 사용된 라벨의 종류에 좌우된다. 바람직한 실시예에서, 상기 라벨은 효소이고 상기 기질은 효소와 상호반응하여 측정가능한 변화를 일으키는 화합물이다. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 효소는 포스파타제(phosphatage)이고 기질은 포스페이트 화합물이다. 효소와 기질의 상호반응은 일반적으로 측정가능한 특성을 갖는 화합물을 낳는다. 예를 들어 형광성 물질은 강한 흡수도를 갖는다.

최종적으로 일단 측정가능한 변화가 단계(E)에서 수행되면, 단계 (F)에서는 디아실 히드라진이 측정된다. 이 측정은 이 기술 분야에서 공지된 방법으로, 예를 들어 UV-VIS 분광광도계, 형광광도계, γ 계수기 등에 의한다.

상기 인용된 검정은 일반적으로 간접 검정으로 알려져 있다. 또한 본 발명의 범위내에 직접 검정이 포함되는 것으로 해석된다. 초기에 직접 방법은 미지량의 디아실 히드라진을 포함하는 시료를 제공하는 단계 (A)를 포함한다. 상기 시료 및 디아실 히드라진은 상기한 바와 같다.

단계 (A)의 시료는 단계(B)에서 디아실 히드라진에 결합 친화도를 갖는 고정화된 항체와 접촉되어 고정화된 항체-디아실 히드라진 복합물을 형성한다. 상기 항체는 상기한 바와 같으며 RH2651에 융기된 항체가 바람직하다.

상기 항체는 일반적으로 이같은 항체가 부착가능한 표면을 갖는 고체 지지체상에 고정된다. 적절한 예로는 마이크로티터 플레이트; 니트로셀룰로오스, 셀룰로소스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카보네이트 등과 같은 막 물질; 시험 튜브; 비드, 칼럼충진재등과 같은 입자; 및 상부에 결합된 항체를 결합할 수 있는 결합 도메인을 갖는 유도화된 표면;을 포함한다. 바람직한 실시예에서 상기 항체는 코팅 항원에 관련하여 기재된 바와 같은 고체 지지체에 고정하는 코팅 항체이다.

단계 (B)에서는 고정화된 폴리클론 항체상의 결합 부위가 자유 항원 즉, 시료내의 미지량의 벤조일 히드라진에 의해 채워져서 고정화된 항체-항원 복합물을 형성한다. 단계 (C)에서는 검출가능한 표지로 라벨링된 디아실 히드라진 항원이 시료로부터 벤조일 히드라진에 결합되지 않은 고정화된 항체 부위와 접촉된다. 따라서 라벨링된 항원은 항체상에 남아있는 결합 부위를 채울 것이다. 그리하에 고정화된 항체는 라벨링된 그리고 라벨링되지 않은 항원에 결합될 것이다. 상기 디아실 히드라진 항원 및 라벨은 상기 기재된 바와 같다. 그러나 바람직한 실시예에서 상기 항원은 RH2661이고 상기 라벨은 효소이며, 바람직하게는 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)이다.

최종적으로 단계(D)에서는 측정가능한 변화는 라벨에서 일어나며 디아실 히드라진이 단계(E)에서 측정된다. 측정가능한 변화를 일으키고 디아실 히드라진을 측정하는 것을 간접 검점용에 대하여 상기한 바와 같다.

RH5992 및 이들의 유도체 RH2703, RH2651, RH0345 및 RH2485와 같은 디아실 히드라진에 대하여 여기 기술된 검정은 FIFRA 등록에 의해 요구되는 필드 잔류물 연구에 적용하기에 충분히 민감하다. 더욱이 상기 검정은 RH0345와 같은 구조적으로 유사하지 않은 구조 유사물와 충분한 교차-반응성을 가지며, 이 검정은 치환된 N-t-부틸-N,N'-벤조일 히드라진 살충제의 전체 부류에 대하여 적용가능한 것으로 믿어진다.

검정의 민감도(PPM) 및 RH5992로 대표되는 살충제의 그룹에 대한 전반적인 이용성 외에 최대 잇점은 증가된 실험 효율일 수 있다. 예를 들면 한명의 분석자가 하루 20개 시료를 쉽게 처리할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 측정값은 시료 제조 및 결과 계산을 계산된다. 하루 10시간으로 감안하면, 시료당 단지 약 30분만이 소요되는 것이다.

본 발명의 항체에 대한 다른 이용은 시료 매트릭스로 부터 잔기물을 농축시키기 위해 고체 지지체에 항체를 결합시키는 것을 포함함으로써 형광 태그로 라벨화하고 세포 구획내에 살충 잔기의 위치를 확인하기 위한 조직 연구에 사용될 수 있는 것이다. 이 정보는 특정한 디아실 히드라진 화합물의 작용 모드 혹은 특성 및 대사산물의 메카니즘에 관한 중요한 정보를 제공한다. 또한 직접 면역 측정 방법이 필드 분석 및 적용처의 관찰 형태를 위해 딥-스틱(dip-stick) 시험에 편입될 수 있다.

하기 약어가 명세서의 다른 부분뿐 아니라 실시예에서 사용되었다.

BCA 비신크로니산

BSA 소 혈청 알부민

DCC 디시클로헥실카보디이미드

DEA 디에탄올아민

DMF 디메틸포름아미드

HRP 양고추냉이 퍼옥시다제

KLH 키홀 림펫 헤모시아닌

NHS N-히드록시술신이미드

PBS 포스페이트 완충 염수

PBST PBS 및 0.01% Tween 20

PNPP P-니트로페닐포스페이트

실시예 1

면역원 합성

5ml 배형 플라스크에 부착체 RH2651 21μmol을 첨가하고 DMF 200㎕내에서 용해시켰다. 별도의 4ml 시험 튜브내에서 DCC(EM Sciences) 16mg 및 NHS(Sigma Chemical) 9.1mg을 용해시켰다. 상기 DCC 및 NHS를 부착체를 함유하는 플라스크로 옮기고 반응물을 실온에서 약 2시간동안 교반하였다. 반응물을 냉각실로 옮겨 4℃에서 밤새 교반하였다.

PBS(재현되는 경우 pH 7.2)에 용해된 케리어 단백질, KLH(Imject^ⓡ, Pierce Chemical Co.,) 20mg을 탈이온수 5.4ml에 재현하였다. 반응성화된 부착체를 미세원심분리기(Microcentrifuge model 235B, Fisger Scientific)로 옮기고 5분간 원심분리하여 치환된 우레아 침전물을 제거하였다. 상층액을 재현된 케리어 단백질 용액으로 옮기고 실온에서 4시간동안 계속 교반하였다.

상기 단백질 반응 혼합물을 @14000rpm에서 5분간 원심분리하여 침전된 단백질을 제거하였다. 상층액의 총 부피를 Swift^ⓡ폴리아크릴아미드 탈염 칼럼(Pierce Chemical Co.)에 적용하고 3ml 분획으로 0.01M PBS(pH 7.3)와 함께 용출시켰다. 분획들은 시료가 칼럼상에 완전히 적재된 다음 수집하였다. 3ml 분획 10개를 취하여 280nm에서의 흡수도를 각 분획마다 평가하였다. 면역원을 함유하는 분획을 저장하고 단백질 농도를 BCA 방법(BCA Protein Assay Reagent Instruction-Pierce Chemical Co.,)에 의해 평가하였다.

부착체/단백질 결합비를 하기와 같이 측정하였다. 254nm에서 0㎍/ml~1200㎍/ml에 걸쳐 KLH의 흡수도의 표준 곡선을 그렸다. BCA 방법으로 평가된 면역원 분획의 단백질 농도를 상기 표준 곡선으로 부터 254nm에서의 흡수도로 전환하였다. 부착체 RH2651 및 RH2703의 254nm에서의 흡수도의 표준 곡선을 RH2703에 대하여 26-260nmol/ml의 농도 범위에서 그리고 RH2651에 대하여는 6.5-210nmol의 범위에서 그렸다.

상기 면역원의 흡수도를 254nm에서 평가되었으며(Aconj) KLH(Aklh)로 부터 254nm에서의 흡수도에 대한 계산된 기여분을 감하여 부착체로 부터 발생하는 흡수도(Ahap)를 얻었다. 이 값, AHap를 부착체에 대한 표준 곡선으로 부터 농도(nmol/ml)로 전환하였다.

부착체의 단백질에 대한 몰 결합비를 부착체의 계산 농도(nmol/ml)를 면역원의 측정된 농도로 나누어 계산하였다. KLH에 대한 평균 분자량 6.7×10⁶달톤이 사용되었다. KLH 10,000 amu당 부착체 분자의 수평균은 몰 결합비를 670으로 나누어 계산하였다. 그 결과를 하기표 2에 나타내었다.

실시예 2

부가적인 면역원 합성

사용된 부착체가 RH2703인 것을 제외하고는 실시예 1의 방법에 의해 면역원을 제조하였다. 그 결과를 하기표 2에 나타내었다.

실시예

코팅 항원 합성

캐리어 단백질로서 KLH대신 BSA(Imject^ⓡ, Pierce Chemical Co.)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에서의 면역원 제조 방법에 따라 코팅 항원(RH2703 및 RH2651)을 제조하였다. 몰 결합비의 계산에서 사용된 BAS의 평균 분자량은 68,000달톤이었다. BSA 10,000amu당 부착체 분자의 수 평균은 몰 결합비를 6.8로 나눔으로써 계산되었다. 제조된 코팅 항원에 대한 결과를 하기표 2에 나타내었다.

(1)N은 단백질 10,000amu당 부착제의 분자 수이다.

실시예 4

항체의 제조

면역원(0.01M PBS에서 1mg/ml로 재현된 실시예 2의 생성물) 2.5ml, M.투베르쿠로시스(tuberculosis) 서스펜션 25mg 및 Freund's 첨가제 2.5ml로 부터 1차 접종물을 제조하였다. 상기 혼합물을 두껍고 크림형으로 될 때까지 균질화시켰다.

항체 제조에는 New Zealand White 토끼(5)를 사용하였다. 토끼는 무게가 4.75-5.5파운드인 질병이 없는 암컷이었다. 상기 토끼를 우선 Bordetella pertussis(B. pertussis 접종물은 0.6ml 염수내에 부유된 6×10¹⁰셀을 함유하도록 제조된다)에 대하여 근육 접종하고 배경 티터를 제공하기 위하여 채혈하였다.

토끼 한 마리당 1차 접종물 투여량은 피하주사에 의해 1.0ml였다. 토끼를 접종하고 21일마다 추가 예방주사를 놓았다. 4번째 추가 주사후 8일째되는 날에 토끼를 채혈시켜 항체를 수집하였다. 추가 기간후, 추가 주사를 재개시하였고 4번째 추가 주사후 다시 채혈하였다.

실시예 5

토끼 안티세라(Rabbit Antisera)의 검정

코팅 항원을 코팅 완충액(PBS, pH 7.2)에서 초기 농도 약 10㎍/ml로 재현하였다. 96 웰(well) 마이크로티터 플레이트의 칼럼 1 및 2의 웰(well)을 대조 시료를 위하여 비축하였다. 칼럼3에서의 웰로 부터 시작하여 코팅 항원 3,200㎕을 초기 농도에서 첨가하기 시작하엿다. 칼럼4-12에서의 웰은 코팅 완충액 100㎕을 함유하였다. 칼럼 3의 웰내에 코팅 항원 분획 100㎕을 옮기고 칼럼 4의 웰내에 코팅 완충액과 혼합하고 동일한 방법으로 코팅 항원을 웰의 각 연이은 칼럼내에서 코팅 완충액과 연속적으로 1:2 희석시켰다. 상기 희석 공정은 코팅 항원의 1:256 희석액인 칼럼 11을 통하여 계속하였다. 최종 100㎕를 버렸다. 칼럼 12내의 웰은 음(-)의 대조군으로서 항원이 없이 단지 코팅 완충액만을 함유하였다. 웰 A1 및 A2는 공기 블랭크이고 반응물을 받지 않았다. 웰 B1 및 B2는 코팅 항원으로 피복되었으며 배경 웰이었다. 웰 C1 및 C2는 양(+)의 대조군으로서 코팅 완충액(약 10㎍/ml)내에서 KLH 100㎕로 코팅하였다. 나머지 웰 D1-H2는 처리되지 않았다. 이같이 제조된 플레이트는 밀폐 테이프로 밀봉하고, 커버를 씌우고 플라스틱 랩으로 싸고 밤새 보온을 위하여 4℃ 냉장고에 방치하였다.

밤새 보온한 다음 상기 플레이트를 냉장고로 부터 제거하고 비웠다. 웰내(A1 및 A2 제외)에 결합하지 않은 결합 부위를 BSA 블록킹 용액(1% BSA, PBS 100ml에 용해된 BSA 1.0g으로부터 제조된 pH 7.2) 300㎕로 차단하였다. 상기 용액을 실온에서 최소 10분간 배양하였다.

시험 시료를 블록킹 용액으로 1:1000 희석시키고 200㎕를 웰 A3로 부터 시작하여 열(Row) A에 있는 웰에 적용하였다. 열 B3-H3내의 웰은 블록킹 용액 100㎕를 함유하였다. 열 A웰내의 시험 시료(100㎕)를 열 B 웰로 이동하고 완전히 혼합하였다.

이런 방식으로 시료를 연차적으로 열 G3(1:64000)의 웰을 통하여 1:2희석하였고 마지막 100㎕은 버렸다. 열 H3의 웰은 항체가 없고 음(-)의 대조군이었다. 배경 웰 B1 및 B2는 블록킹 용액으로 1:500 희석된 예비-피(pre-bleed) 혈청 100㎕로 배양하였다. 양의 대조 웰 C1 및 C2를 시험 시료의 1:1000 희석액으로 배양하였다. 플레이트를 약 1시간동안 시험 시료와 함께 배양하였다.

배양후 시험 시료를 제거하고 웰을 세척 완충액으로 세척하였다. 웰을 완충액으로 4-5회 충진하였다. 3 혹은 4회 세척동안, 완충액을 버리기 전에 3-5분간 웰내에 잔류하게 하였다. 알칼리 포스파타제(Pierce Chemical Co.)에 연결된 염소, 항-토끼 IgG 0.6mg을 50% 글리세롤 1ml로 재현하고 블록킹 용액으로 1:5000으로 희석하였다. 이 용액 100㎕를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 최소 1시간동안 실온에서 배양하였다. 여분의 항-토끼 항체는 세척하여 버리고 PNPP 용액(탈이온수 8ml 및 DEA 완충액 2ml에 용해된 PNPP 5mg) 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 30분간 실온에서 배양하였다. 그런 다음 2N NaOH 50㎕를 첨가하여 효소 반응을 중지시켰다. 각 웰내에 흡수도를 Dynatech MR5000 마이크로티터 플레이트 판독기를 사용하여 410nm에서 측정하였다. 그 결과를 하기표 3에 나타내었다.

¹항체 티터가 측정되지 않았음

²귀 상처로 인해 이들 동물에서 시험 브리드를 취득할 수 없었다.

실시예 6

항체의 분리 및 정제

실시예 3에서 주사동안 수집된 면역 혈청을 수집하고 BCA법으로 총 단백질에 대하여 검정하였으며 66mg/ml임을 발견하였다. 면역 혈청의 부피를 측정하고 각 90ml인 2개의 동등한 분획으로 나누었다. 하나의 분획을 탈이온수 2당량 부피로 희석하였다. 결과물인 용액 부피를 다시 4M 황산암모늄의 동일 부피로 희석하여 최종 2M 황산암모늄 용액을 얻었다. 상기 서스펜션을 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 단백질 침전물을 원심분리기에서 10,000g-평균에서 30분간 수집하였다. 단백질 펠릿을 0.1M 인산나트륨 완충액의 희석액으로 부터 제조된 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 8.0)의 최소 부피내에 용해시켰다.

재현된 단백질 용액을 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 8) 2L에 대하여 실온에서 4시간 동안 투석시킨 다음 4℃에서 4L에 대하여 밤새 투석하고 최종적으로 실온에서 4L에 대하여 4시간동안 투석하였다.

수집된 항 혈청으로 부터 IgG의 이온 교환 정제를 2.6cm 칼럼내에 약 26cm의 단 높이로 충진된 DEAE 셀룰로오스(DE52, Whatman, Inc.,)을 이용하여 2가지 분리된 분획, 150ml 습윤 부피로 수행하였다. 상기 칼럼을 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 8.0)으로 평형화하였다. 상기 칼럼은 약 1.5g(10mg/ml 습윤 부피)의 단백질 용량을 가졌다. 투석된 단백질 용액의 전체 부피를 상기 칼럼상에 펌프하고 0.02M 인산 나트륨 완충액, pH 8.0으로 용출하기 시작하였다. 유속은 약 5ml/min으로 조절하고 5ml 분획을 얻었다. 최초 150ml 용출액은 어떠한 보류하지 않은 단백질을 함유하였다.

최초 150ml후 몰 농도는 0.03M까지 선형 기울기로 계속하여 변화되었다. 경사는 제 1 챔버내에 0.02M 완충액 250ml 와 제2 챔버내에 완충액 0.3ml의 250ml를 함유하는 2개의 챔버 기울기 형성기에서 형성되었다. 제1 챔버는 용출하는 동안 계속하여 교반되었다. 다음 용출액 500ml를 5ml 분획으로 수집하였다. 상기 단백질의 용출을 크로마토그램을 얻기 위하여 용출 부피(분획 #)에 대하여 표시된 280nm에서의 흡수도를 측정하여 모니터하였다.

각 분획의 등분을 본 명세서에 기재된 간접 방법으로 IgG를 검정하였다. IgG를 함유하는 분획을 수집하고 Amicon 필터(분자량 추출 한계-10,000달톤)로 교반된 셀농축기를 사용하여 부피를 감소시켰다. 수집되고 농축된 IgG 분획의 단백질 농도를 표준 BCA방법으로 검정하였다. 소디움 아지드화물을 멸균 여과된 단백질 용액에 첨가하고 (0.02% w/v) -20℃에서 동결시켜 저장하였다. DEAE 이온 교환 칼럼으로 부터 단백질 용출 프로파일을 도1에 도시하였다. 개방 원은 280nm에서의 흡수도로 부터 측정된 총 단백질을 나타낸다. 폐쇄 원은 410nm에서 간접 검정에 의해 측정된 각 분획에 대한 항체 티터를 나타낸다. 분획 51-80을 단백질 친화도 크로마토그래피에 의한 다음 정제를 위해 수집하였다.

DEAE 정제된 IgG(1mg/ml)는 Protein A AffinityPak^ⓡColumn 및 ImmunPure^ⓡIgG Buffers(ImmunoPure^ⓡIgG Purification kit, Pierce Chemical Co.,)를 사용하여 친화도 정제시켰다. 단백질 A 칼럼 및 완충액으로 실온까지 내렸고 칼럼을 결합 완충액 5ml로 세척하였다. DEAE 정제된 IgG를 1:9로 희석하여 단백질 농도 6mg/ml를 얻었고 1ml분획을 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 또다른 결합 완충액 15ml로 세척하였다.

IgG의 용출을 ImmunoPure^ⓡIgG 용출액 완충액 5ml로 수행하고 1ml 분획을 수집하였다. 각 분획의 흡수도를 280nm에서 측정하고 현저한 흡수도를 갖는 분획(분획 3)을 앞서 0.02M PBS(인산 나트륨 20mM, NaCl 100mM, pH 7.4)로 조절된 Excellulose^ⓡ칼럼 5ml를 사용하여 탈염화하였다. 0.02M PBS의 1ml 분획 10개를 용출용으로 사용하고 1ml 분획을 수집하였다. 각 분획의 흡수도를 BCA 방법으로 총 단백질에 대하여 검정하였다.

단백질 A 친화도 크로마토그래피 정제된 IgG를 1:5로 희석하여 단백질 농도 1mg/ml를 얻었다. 66mg/ml의 총 혈청 단백질로 부터 추정 9mg/ml IgG 농도가 주어졌을 때, 추정 IgG의 회수율은 67%였다.

실시예 7

간접 검정의 최적화

RH2703-BSA를 코팅 항원으로 사용하였다. 최소량의 항원(RH2703)의 존재하에 판독가능한 반응(@ 410nm에서 0.3-0.5 흡수도 단위)을 얻는데 필요로 하는 농도를 체커보드형 검정(Voller 등의 Bull of World health Organization, 53,35(1976) 참조)에 의해 일정량의 단백질 A 정제된 IgG(20㎍/ml용액 10㎕, 100ng/웰)의 존재하에 최적화하였다. 단백질 A 정제된 IgG의 농도는 일정량의 코팅 항원(EH2703-BSA, 10㎍/ml용액의 100㎕)의 일정량의 존재하에 미리 최적화시켜 RH5992의 최소량에 판독가능한 반응을 얻었다.

항체 농도는 약 20㎍/ml(100ng/마이크로웰)되게 최적화하고 코팅 항원은 25ng/ml 혹은 2/5ng/마이크로웰이 되도록 최적화하였다. 부착체/단백질 결합비가 55라고 추정하고 몰 기준으로 변환시킨 경우, 상기 부착체는 첨가된 IgG의 3배 몰 과량이었다.

RH2703, RH2651, RH5992, RH0345 및 RH2485에 대한 %억제를 최적화된 농도의 RH2703-BSA 코팅 항원의 존재하에 단백질 IgG에 측정하였다. 각 시험 물질을 시험 물질 0ng/ml로부터 1000ng/ml 범위의 7개의 농도에서 검정하였다. 각 농도에서의 검정은 7회 반복하였다. 항원 음성(-) 및 항체 음성(-) 웰이 음성(-) 대조군을 제공한 반면 KLH/항 KLH웰은 양성(+) 대조군으로 사용되었다.

시험 물질 모액을 0.1% Tween 20을 함유하는 코팅 완충액으로 희석시켜 1000ng/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml, 0.1ng/ml 및 0.01ng/ml 검정 농도를 얻었다. 코팅 완충액 w/0.1% Tween 20을 0 ng/ml 검정 농도로서 사용하였다. 시험 물질 검종 농도(각 190㎕)를 1시간동안 실온에서 단백질 A IgG(20㎕/ml) 10㎕로 배양하였다. 배양기간후 시험 물질-IgG 혼합물 100㎕를 적절한 마이크로티터 웰에 옮겼다. 상기 마이크로티터 웰은 앞서 RH2703-BSA의 최적화된 농도로 미리 피복되었으며 과량의 단백질 결합 부위를 코팅 완충액내의 1% BSA 용액 0.3ml로 차단하였다. 플레이트를 다시 1시간동안 실온에서 배양하였다.

2차 배양후 플레이트를 세척하고 알칼리 포스페이트(50% 글리세롤 1ml로 재현되고 이어서 차후 블록킹 용액으로 1:5000으로 희석된 0.6mg-Pierce Chemical Co.)에 결합된 염소, 항-토끼 면역글로부린을 첨가하였다. 상기 판을 배양하고 세척하고 실시예 5에 기술된 바와 같이 PNPP를 첨가하였다. NaOH 중지 용액을 첨가하지 않았으며 플레이트를 410nm에서 흡수도를 판독하기 전에 2시간동안 전개시켰다. 상기 억제 곡선을 도 2-6에 나타내었다. 정제된 항체 특성화에 대한 특정 데이터를 하기표 4에 나타내었다.

IC50을 상기 기술된 바와 같이 측정하였다. 억제 농도에 대한 % 반응도의 그래프를 Microsoft Excel^ⓒAnalysis ToolPak(Microsoft Corporation, Copylight 1993)과 잘 맞는 지수(exponential) 곡선으로 분석하였다. IC50을 계산하기 위하여 식 y=bmⁿx의 지수 방정식을 y가 50인 경우, 즉 50% 반응성 잔류 혹은 50% 억제인 경우 x에 대하여 해를 구하였다. Microsoft Excel^ⓒ, Ver 5.0그래픽스(Microsoft Corporation, Copylight 1993)를 사용하여 그래픽화하였다.

% 교차-반응성을 상기 기술된 IC50으로 부터 계산하였다. 7가지 농도의 억제제의로 부터 얻어진 7회 반복 분석의 평균 흡수도의 그래프를 Microsoft Excel^ⓒ, Ver 5.0그래픽스(Microsoft Corporation, Copylight 1993)를 사용하여 만들었다. 선형 동적 범위(linear dynamic range)는 여러 가지 억제제 농도로 부터 410nm에서의 흡수도의 그래프로 부터 얻어진 곡선의 선형부로서 가시화되었다.

검출의 한계는 측정된 배경 노이즈(noise) 3배로서 정의하였다. 배경 노이즈를 평가하기 위하여 억제제의 각 농도에서 반복 분석 결과의 표준 편차를 계산하고 회귀 분석의 최소 제곱법을 수행하였다. 회귀선의 y-절편은 노이즈로 부터 발생하는 배경 흡수도로서 취하였다.

배경 흡수도는 인자 3으로 곱해지고 선형 범위에 걸쳐 얻은 표준 곡선의 기울기로 나눔으로써 억제제 농도로 전환되었다. 결과 농도를 억제제의 검출 한계로서 정의하였다.

실시예 8-19

간접 검정

마이크로티터 플레이트를 RH2703-BSA 코팅 항원(10㎍/ml)의 10㎕/웰로 피복하여 웰당 1㎍ 코팅을 얻었다. 상기 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 결합되지 않은 단백질 결합 부위를 사용전에 코팅 완충액에서 1% BSA 용액 300㎕/웰로 차단하였다.

브로콜리 및 토양의 시료 약 1g 분획을 취하였다. 브로콜리 시료 #03(1.0191g) 및 토양 시료 #49(1.0180g)을 규준으로서 확인하고 RH5992 50ng 혹은 500ng로 스파이크하여 회수율을 측정하였다. 시료 확인 및 사용된 시료 질량을 하기표 6에 나타내었다.

시료 분획을 25ml 원추형 튜브에 재치하고 회수 시료를 RH5992 모액 표준(아세토니트릴에서 1mg/ml)을 PBST로 희석하여 제조된 RH5992 50ng 혹은 500ng로 스파이크하였다.

시료를 3분간 80% 분말로 음파 셀 분쇄기(Model H-1 마이크로팁 프로우브를 갖는 Sonicator^ⓡ, Heat Systems, inc. Model W-225R)로 음파 파쇄하여 PBST 5ml분획으로 추출하였다. 상기 추출 혼합물을 5분간 4,000g에서 원심분리하고 PBST층을 따라내었다. 각 시료의 분획을 PBST로 희석하여 원 시료 추출물의 1:100 희석액(브로콜리 시료) 및 1:500 희석액(토양 시료)를 얻었다.

희석된 시료의 분획(180㎕)에 각각의 RH5992 표준(2,10,20,100,200 및 2000ng/ml) 및 IgG(10㎕) 10㎕와 혼합하여 최종 RH5992 농도가 각각 0.1, 0.5, 1, 5, 10 및 100ng/ml인 시료를 얻었다. 이들 시료를 12×8, 96웰 포맷으로 배열된 보로실리케이트 유리관에 완전히 혼합시켰다. 항원 음(-) 웰에 상응하는 관은 완충액 10㎕를 함유하였다. 항체 음(-) 웰에 해당하는 관은 IgG를 첨가하지 않았으며 PBST에 100ppb RH5992를 함유하였다. KLH 양(-) 규준에 해당하는 관은 빈채 남겨두었다.

1시간 배양후 스파이크 시료 100㎕를 마이크로티터 플레이트에 옮기고 1시간동안 배양을 계속하였다.

배양후 플레이트를 앞서 기재된 바와 같이 수세하고, 알칼리 포스파타제에 결합된 염소, 항-토끼 IgG 100㎕를 첨가하고 실온에서 1시간동안 배양시켰다. 배양후 플레이트를 다시 세척하고 PNPP 기질 100㎕를 첨가하였다. 기질과의 배양을 1-2시간동안 계속하고 흡수도를 Dynatech MR5000 Microplate 판독기를 사용하여 410nm에서 측정하였다. 항원 음(-) 웰에서 측정된 흡수도를 평균화하고 시험 웰로 부터 자동적으로 감하였다. 이 방법에서는 특별하지 않은 항체의 결합으로 부터 발생하는 흡수도를 제거하였다.

시료내에 잔류물 수준을 표준 첨가법에 의해 정량화하였다. 첨가된 억제제 그래프의 농도에 대한 역 흡수도는 Microsoft Excel^ⓒ, Ver 5.0그래픽을 사용하여 복제 시료의 흡수도를 뺀 비-특정 결합의 평균 역수로 부터 얻었다. 결과 데이터는 Microsoft Excel^ⓒ, Analysis ToolPak를 사용하여 식 y=mx+b의 방정식에 잘 맞았다.

상기 관계식에서 y는 실험적으로 측정된 역 흡수도, b는 상수, m은 계산된 기울기 그리고 x는 첨가된 억제제의 농도였다. 선형 방정식에 대한 추정 해로 부터 얻은 계산된 값에 대한 각 데이터 점의 표준 오차를 계산하였으며 중심에서 벗어난 값은 최종 해로 부터 제거하였다.

시료 농도는 y가 억제제가 첨가되지 않고 측정된 역 흡수도와 동일한 값일 때 x에 대한 선형 방정식의 해를 구함으로써 얻었다. 결과값을 해당하는 희석 인자로 곱하여 총 ng로 전환되었다. ng/g으로 된 최종 결과값은 상기 총 g를 취해진 시료의 질량으로 나눔으로써 계산하였다.

표준 곡선은 외삽 표준 방법에 의해 시료 잔류물의 정량화에 위해 만들어졌다. 지수 곡선 적합성 및 선형 회귀 분석은 Microsoft Excel^ⓒAnalysis ToolPak를 사용하여 수행하였다. % 회수율을 상기한 바와 같이 계산하였다.

50ng/g 및 500ng/g에서 스파이크된 회수 시료를 분석의 외삽 표준 및 내삽 표준(첨가 방법) 모두로 분석하였다. 괄호에 %회수율을 갖는 결과를 하기표 5에 나타내었다. PBST 및 매트릭스 블랭크 시료(블로콜리 시료#03 및 토양 시료 #49)에서 얻어진 표준 곡선의 그래프를 도 7에 나타내었다.

브로콜리 및 토양 시료의 내삽 표준 분석 결과를 하기표 6에 나타내었다. 2개의 브로콜리 및 토양 추출물을 1주일후 재분석하여 시료 매트릭스의 안정성을 평가하였다. 결과를 괄호로 나타내었다. 각 시료로 부터 계산된 선형 회귀선을 도 8-15에 나타내었다.

실시예 20

표지 항원(labeled Antigen)의 합성

RH2651 4.6mg(10.5μmole)을 5ml 배형 플라스크에 놓고 DMFF 100ml에 용해시켰다. 별도의 시험관에서 NHS 4.6mg 및 DCC 8.8㎕를 DMFF 각각 100㎕에 용해시켰다. NHS 및 DCC를 RH2651에 첨가하고 실온에서 약 1시간동안 교반하였다. 밤새 4℃에서 교반하였다. 다음날 HRP 10mg을 0.01M PBS 2.7ml, pH7.2에 용해시켰다.

RH2651/NHS/DCC 반응 혼합물을 Beckman Microfuge E(Beckman Instruments)에서 3분간 원심분리하였다. 교반하면서 상층액을 HRP에 점적 첨가하였다. 혼합물을 4분간 실온에서 교반한 다음 미세원심분리로 3분간 원심분리하였다. 결합된 단백질을 함유하는 상등액을 PBS로 평형화된 Swift^ⓡ탈염 칼럼(Pierce Chemical Co.)으로 탈염화하였다. 단백질을 PBS로 용출하고 3ml분획을 수집하였다. 280nm에서 흡수도로 측정된 바와 같이 단백질 결합물을 함유하는 분획을 수집하고 그 단백질 농도를 BCA Protein Assay(Pierce Chemical Co.)에 의해 측정하였다.

RH2651의 HRP에 대한 결합은 다음과 같이 확인되었다. 마이크로플레이트 웰을 2651-HRP 10㎍/ml의 100㎕로 피복하고 밤새 4℃에서 저장하였다. 플레이트를 비운 다음 웰을 PBS에 용해된 1% BSA로 차단하였다. 블록킹후, 실시예 6에 따라 제조된, 단백질 A정제된 2651 IgG의 1:2 희석액(1:500으로 시작)을 RH2651에 대하여 시험하도록 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 실온 배양한 다음 0.01% Tween 20 PBS로 세척하였다. 알칼리 포스파타제 표지된 염소 항-토끼 IgG를 첨가하고 추가로 1시간동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고 p-니트로페닐포스페이트 기질을 첨가하였다. 15분 전개후, 흡수도를 Dynatech MR500 Microplate Reader으로 410nm에서 측정하였다.

양고추냉이 퍼옥시다제에 대한 RH2651의 결합 평가는 2651IgG 1:32000의 2651-HRP 1㎍에 대한 피터를 나타내었다. 이는 성공적인 결합 반응을 나타낸 것이다.

실시예 21

코팅 항체의 최적화

마이크로플레이트를 2651 IgG로 코팅하였다. 칼럼 1부터 시작하여, 각 웰에 2651IgG 10㎍/ml 10㎕를 첨가하고 1:2 희석액을 플레이트에 제조하였다. 상기 플레이트를 밀폐하고 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 비운후, 플레이트를 PBS에 용해된 0.01% Tween 20으로 세척하고 PBS에 용해된 1% BSA로 1시간동안 실온에서 차단하였다. 차단후, 플레이트를 비우고 BPS 150㎕를 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 2651-HRPP 희석액 50㎕를 10㎕/ml로 시작하여 플레이트의 하부에 첨가하고 연속하여 1:2 희석액으로 플레이트 하부에 첨가하였다. 1시간 실온에서 배양한 다음, 플레이트를 전처럼 세척하고 1-Step^ⓡSlow-TMB(Pierce Chemical Co.로 부터 퍼옥시다제 기질) 150㎕를 각 웰에 첨가하였다. 1시간 전개한 다음, 1N H₂SO₄150㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고 각 웰의 흡수도를 Dynatech MR5000 Microplate Reader으로 450nm에서 측정하였다.

대조균(규준)은 코팅 항체를 갖지 않은 웰과 2651-HRP가 첨가되지 않은 웰을 포함하였다. 2651IgG 코팅 항체 농도 0.625㎍/ml 및 2651-HRP 농도 1.25㎍/ml가 1-Step^ⓡSlow-TMB 기질에 이용하기 위한 최적 농도인 것으로 판단되었다.

실시예 22

직접 검정

마이크로플레이트의 웰을 0.625㎍/ml²⁶⁵¹IgG 각 100㎕로 코팅하였다. 하나의 열을 대조군으로서 코팅하지 않고 남겨두었다. 플레이트를 4℃에서 밤새 유지하였다. 다음날 플레이트를 PBS에 용해된 0.01% Tween 20으로 세척하고 PBS에 용해된 1% BSA로 최소 30분동안 차단하였다. RH5992, RH2651, RH2703 및 RH2485의 표준 용액을 1mg/ml 모액 용액으로 부터 제조하였다. RH0345 표준 용액을 0.1ng/ml, 0.5ng/ml, 1ng/ml, 5ng/ml, 10ng/ml 및 100ng/ml로 부터 제조하였다. 블록킹 용액을 비운 다음, 표준물 150㎕를 적절한 웰에 첨가하였다. 0대조를 위하여 PBS 150㎕를 첨가하였다. 45분 실온에서 배양한 다음, 2651-HRP 1.25㎍/ml 50㎕를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 성분히 혼합되도록 교반시켰다. 항체와 표준 물질을 함유하는 한개의 칼럼에는 음성(-) 대조군으로서 2651-HRP를 수용하지 않고 PBS 50㎕를 수용하였다. 45분간 실온에서 배양한 다음, 플레이트를 이전처럼 세척하고 2651-HRP 150㎕를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 성분이 혼합되도록 교반하였다. 항체와 표준 물질을 함유하는 한개의 칼럼에는 음(-) 대조군으로서 2651-HRPP를 수용하지 않고 PBS 50㎕를 수용하였다. 45분간 실온에서 배양한 다음, 플레이트를 이전처럼 세척하고 Step1^ⓡ150㎕를 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 2시간후, 1N H₂SO₄150㎕를 각 웰에 첨가하고 각 웰의 흡수도를 Dynatech MR5000 Microplate Reader로 450nm에서 측정하였다.

도 16a는 검정으로 부터 만들어지는 전형직인 곡선을 예시한다. 곡선의 선형부는 0.01ng/ml-10ng/ml 사이에서 가시화된다. 검정의 선형 범위내에서 전형적인 표준 곡선이 양(+)의 기울기를 생성하는 역 흡수도를 사용하여 도 16b에 예시되어 있다. 검출의 한계는 0.096ng/ml로 계산되었고 민감도는 RH5992에 대하여 0.005ng로서 계산되었다. RH5992 및 동족체에 대한 데이터가 하기표 7에 나타나 있다.

상기와 같이, 본 발명에 의한 방법은 사용하기 용이하며, 값싸고 FIFRA 기준에 부합하는 충분한 교차-반응성 및 민감성을 제공하는 것이다.

Claims

하기식을 갖는 화합물; 을 포함하며,

케리어 물질에 결합된 면역원

단, R, R¹, R², R³및 R⁴는 각각 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬 및 치환된 (C₁-C₆)알킬, (C₂-C₆)알케닐 및 치환된(C₂-C₆)알케닐, (C₁-C₆)알콕시, (C₁-C₆)알킬옥시 및 할라이드로 부터 선택된다.
제1항에 있어서, 상기 캐리어 물질은 단백질, 다당류, 합성 중합체 혹은 공중합체로 부터 구성되는 그룹으로 부터 선택됨을 특징으로 하는 면역원
제1항에 있어서, 상기 R은-COOH이고 R¹및 R²는 각각 메틸이며, R³및 R⁴는 수소임을 특징으로 하는 면역원
제1항에 있어서, 상기 R은 -CH₂COOH이고 R¹및 R²는 메틸이며, R³및 R⁴는 수소임을 특징으로 하는 면역원
청구범위 제1항의 면역원에 융기된 항체
청구범위 제3항의 면역원에 융기된 항체
청구범위 제4항의 면역원에 융기된 항체
(A) 알려지지 않은 양의 디아실 히드라진을 포함하는 시료를 제공하는 단계;

(B) 상기 시료를 고정된 디아실 히드라진의 존재하에 디아실 히드라진 항원에 결합 친화도(binding affinity)를 갖는 항체와 접촉시켜 결합된 그리고 결합되지 않은 항체-항원 복합물을 형성하는 단계;

(C) 상기 결합되지 않은 항체-항원 복합물을 결합된 항체-항원 복합물로 부터 분리하는 단계;

(D) 상기 결합된 항체 복합물을 검출가능한 라벨(표시)로 라벨링하는 단계;

(E) 상기 라벨에서 측정가능한 변화를 일으키는 단계; 및

(F) 상기 시료내의 디아실 히드라진을 측정하는 단계;를 포함하는 디아실 히드라진 혹은 이들의 유도체를 측정하는 방법
제8항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 효소, 착색된 염료, 형광 물질, 화학발광물질, 생물발광 물질 및 방사성 동위원소로 부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
제8항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 항체에 결합할 수 있는 효소-항체 결합물임을 특징으로 하는 방법
(A) 알려지지 않은 양의 디아실 히드라진을 포함하는 시료를 제공하는 단계;

(B) 상기 시료를 고정된 디아실 히드라진의 항원에 결합 친화도를 갖는 고정된 항체와 접촉시켜 고정화된 항체-항원 복합물을 형성하는 단계;

(C) 검출가능한 라벨로 라벨링된 디아실 히드라진 항원을 복합화되지 않은 고정화된 항체와 접촉시켜 라벨화된 항체-항원 복합물을 형성하는 단계;

(D) 상기 라벨내에서 측정가능한 변화를 일으키는 단계; 및

(E) 상기 시료내에서 디아실 히드라진을 측정하는 단계;를 포함하는 디아실 히드라진 혹은 이들의 유도체를 측정하는 방법
제11항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 효소, 착색된 염료, 형광 물질, 화학발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 동위원소로 부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
제11항에 있어서, 상기 라벨은 항체에 결합할 수 있는 효소-항원 결합체임을 특징으로 하는 방법
(A) 디아실 히드라진에 결합 친화성을 갖는 항체;

(B) 상기 항체에 결합가능한 라벨; 및

(C) 라벨의 존재하에 측정가능한 변화를 생성할 수 있는 기질; 을 포함하는 디아실 히드라진 측정 키트(kit)
제14항에 있어서, 나아가 디아실 히드라진 항원을 포함함을 특징으로 하는 키트
제14항에 있어서, 상기 라벨은 항체에 결합 친화도를 갖는 항체에 결합된 효소임을 특징으로 하는 키트
제14항에 있어서, 상기 라벨은 항체에 결합 친화도를 갖는 디아실 히드라진 항원에 결합된 효소임을 특징으로 하는 키트