KR102673923B1 - 나도미꾸리낚시 추출물을 이용한 항당뇨 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AMPK의 활성화(인산화)와 ACC의 불활성화(인산화)를 촉진하고 근육세포 내 포도당 흡수를 촉진시키는 나도미꾸리낚시 추출물을 이용한 항당뇨 조성물을 개시한다.

Description

나도미꾸리낚시 추출물을 이용한 항당뇨 조성물{Composition for Anti-Diabetes Using an Extract of Persicaria maackiana}

본 발명은 나도미꾸리낚시(Persicaria maackiana) 추출물을 이용한 항당뇨 조성물에 관한 것이다.

당뇨병이란 췌장의 베타세포에서 분비되는 글루코스 조절 호르몬인 인슐린이 부족하거나 제대로 작용하지 못하여 혈액 속의 혈당이 에너지로 이용되지 않고 혈액 속에 쌓여 고혈당을 유발하고 요중에 당이 검출되는 질병을 말한다.

당뇨병은 크게 췌장 베타세포의 파괴에 의한 인슐린 결핍으로 발생하는 인슐린 의존형 제1형 당뇨병과 인슐린 분비 및 작용의 결함에 의해 발생하는 인슐리 비의존형 제2형 당뇨병으로 분류된다(A balanced overview. Diabetes Care 1992, 15: 318-368).

제1형 당뇨병은 인슐린 의존형으로서 면역학적 기전에 의해 췌장 베타세포가 파괴되어 인슐린 생성장애가 오는 면역 매개성 제1형 당뇨병, 그리고 아직 그 원인이 밝혀지지 않은 특발성 제1형 당뇨병으로 구분되고(Lancet, 2006, 367:847-858), 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 인슐린 분비 장애가 모두 관련되는 질환으로서, 인술린 저항성이 주된 역할을 하는 형태를 인슐린 저항성 제2형 당뇨병, 인슐린 분비 장애가 주된 역할을 하는 인슐린 결핍성 제2형 당뇨병으로 구분된다(BMJ, 2000, 321:405-412).

현재 당뇨병의 90%가 제2형 당뇨병이며, 제2형 당뇨는 인슐린 내성, 인슐린 작용 저하 및 췌장에서 비효율적인 인슐린 생산 등으로 인하여 지속적인 고혈당 증상을 야기하므로(Int J Appl Res Nat Prod, 2016, 9:33-38), 만성화될 경우, 당뇨성 망막증, 신부전증, 고혈압, 동맥 경화증 등 매우 심각한 합병증을 동반한다. 따라서 제2형 당뇨병은 의학적으로나 사회경제적으로 해결해야 할 시급한 과제로 대두되고 있다.

현재 알려진 제2형 당뇨병 치료제로서, 근육세포로 당을 이동시키고 간에서 당의 합성을 억제하는 효과를 나타내는 비구아니드계(biguanides), 지방세포 분화에 관계되는 PPARγ를 활성화시키는 티아졸리딘디온계(thiazolidinediones), 간접적으로 인슐린의 분비를 유도하는 설포닐우레아계(sulfonylureas), 소장에서 포도당을 만드는 효소를 억제시키는 α-글루코시다제 저해제(α-glucosidase inhibitor) 등이 사용되고 있으나, 이들 약물을 이용한 당뇨병 치료는 많은 부작용이 따르고 있어(Diabetes, 2008, 57:737-745), 세계보건기구(WHO)는 당뇨병에 부작용이 적은 천연물의 이용을 적극 추천하고 있다(Journal of Ethnopharmacology, 2000, 73:461-470).

AMPK(AMP-activated protein kinase)는 세포 내의 에너지 항상성 유지에 센서 역할을 담당하여 세포의 에너지 수준인 AMP/ATP비율에 반응하여 그 활성이 조절되는 인산화 효소이다(Trends Mol Med, 2008, 14:539-549; Cell Metab, 2005, 1:15-25). AMPK는 세포의 에너지 대사에 관여하는 여러 가지 효소들의 인산화를 조절함으로써, 포도당 수송, 지방산 및 콜레스테롤 합성 등의 여러 가지 생리활성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007, 292:1308-1317). 특히 최근 연구에 따르면 운동에 의하여 촉진되는 근육세포에서의 포도당 흡수 촉진시키는데, 이는 AMPK를 활성화시키는 물질은 운동을 하지 않고도 운동을 한 것과 같이 근육세포에서 포도당의 흡수와 소비를 촉진하는 효과를 거둘 수 있음을 시사하고 있으며(J Appl Physiol, 2001, 91:1073-1083), 따라서 제2형 당뇨병 치료의 새로운 타겟으로 주목받고 있다(Therapie, 2007, 62:293-310; AM J Physiol 272, ppE262-E266, 1997). 현재 제2형 당뇨병 치료제로 많이 사용되고 있는 메트포민(Metformin)의 경우, AMPK를 인산화시켜 활성화시키는 물질로 알려져 있다. AMPK가 활성화되면 ACC이 인산화되어 불성화되는데, ACC는 지방산 합성의 초기 단계에 관여하는 효소로서, ACC가 불활성화되면 지방 산화가 촉진되어 혈당을 강하시킨다고 알려져 있다(Trends Biochem Sci 24:22-25, 1999; Biochem Soc Trans 2003, 31:162-168).

본 발명은 AMPK의 활성화(인산화)와 ACC의 불활성화(인산화)를 촉진하고 근육세포 내 포도당 흡수를 촉진시키는 나도미꾸리낚시 추출물을 이용한 항당뇨 조성물을 개시한다.

본 발명의 목적은 나도미꾸리낚시 추출물을 이용한 항당뇨 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 나도미꾸리낚시 추출물이 L6 근육세포(L6 myotube cell)에서 AMPK의 활성화(인산화)와 ACC의 불활성화(인산화)를 촉진하고 근육세포 내 포도당 흡수를 촉진시킴을 확인함으로써 완성된 것이다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 나도미꾸리낚시 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 조성물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, "나도미꾸리낚시 추출물"은 추출 대상인 나도미꾸리낚시 줄기, 가지, 잎, 뿌리, 전초 또는 이들의 혼합물 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물(즉 상기 추출 용매에 가용성인 추출물), 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등 극성 또는 비극성 고성상을 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물과, 그 추출물에서 추출용매를 제거하여 얻은 고형상의 물과 에탄올의 혼합 용매 추출물을 물에 현탁하고 이를 노르말 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 노르말 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 각층의 분획물을 의미한다. 특히 그 분획물 중에서도 아래의 실시예 및 실험예가 보여주듯이 AMPK 활성화와 ACC 불활성화 정도가 뛰어난 부탄올 층의 분획물이 바람직하다. 여기서 '순차적으로 분획한다'는 분획 후 잔여 물층을 계속적으로 사용하여 상기 열거된 순서대로의 분획 용매로 분획한다는 의미이다.

또 본 명세서에서 "항당뇨"는 혈당 강하와, 당뇨병의 예방, 치료, 개선 또는 발병 지연을 의미하는 것으로, 구체적으로 인슐린이 생성되지 않거나 인슐린이 부족함으로써 발생하는 고혈당, 요중에 당이 검출되는 등 병리적 증상의 예방, 치료, 개선 또는 이러한 병리적 증상의 발병 지연을 의미한다.

또 본 명세서에서 "당뇨병"이란 전술한 바의 인슐린 의존형 당뇨병과 인슐린 비의존형 당뇨병을 포함하는 의미이며, 나아가 다른 질병 등으로 인하여 췌장이 손상됨에 따라 발생하는 당뇨병 예컨대, 갑상선 기능 항진증, 부신피질 기능 항진증, 성장호르몬 과다증 또는 카테콜라민 과다증에 의한 당뇨병, 임신성 당뇨병을 포함하는 의미이다. 바람직하게는 인슐린 비의존성 제2형 당뇨병을 의미한다.

또 본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 항당뇨 효과 등을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 항당뇨 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조 유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코오스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 점안제, 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제, 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 점안제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 식염수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있으며 필요에 따라 염화벤잘코늄, 메필파라벤, 에틸파라벤 등을 방부 목적으로 첨가할 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 나도미꾸리낚시 추출물을 이용한 항당뇨 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 건강기능식품 등의 식품이나 천연물 의약품 등의 약품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 나도미꾸리낚시 추출물의 제조 과정을 모식화하여 나타낸 것이다.
도 2 및 도 4는 나도미꾸리낚시 추출물과 그 분획물 그리고 분획물 중 부탄올 분획물의 L6 근육세포에서 포도당 흡수능에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5는 부탄올 분획물이 L6 근육세포에서 APMK의 활성화 및 ACC의 불활성화에 미치는 정도를 웨스턴 블럿을 평가한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 나도미꾸리낚시 추출물의 제조

나도미꾸리낚시(전초) 건조 분쇄물 275 g에 500mL의 70% 에탄올 또는 물을 가하고 24시간 동안 상온에서 추출한 후 1시간 초음파를 방사하였다. 10,000×g로 20분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 남아있는 잔사에 대해 위와 동일한 방법으로 3회 추출한 후, 이들 추출물을 혼합하고 여과지(Whatman No 2)로 여과하고, 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 고형상 에탄올 추출물과 물 추출물을 얻었다.

상기 에탄올 추출물을 물로 현탁시킨 후, 여기에 동량의 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 분획하여, 헥산 분획물(PM-H), 클로로포름 분획물(PM-C), 에틸아세테이트 분획물(PM-E), 부탄올 분획물(PM-B) 및 잔여 물층 분획물(PM-W)을 얻었다. 이들 추출물과 분획물의 제조 과정을 모식화하여 도 1에 나타내었다.

<실험예> 나도미꾸리낚시 추출물의 항당뇨 활성

<실험예 1> 포도당 흡수능 평가

포도당 흡수능(Glucose uptake) 평가는 L6 근육세포(myotube cell)에 상기 나도미꾸리낚시 추출물, 분획물들을 2h 처리 후 포도당 흡수능 측정 키트(glucose uptake assay kit)(Glucose-Glo™ Assay, J6022, Promega)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 평가하였다.

구체적으로는 L6 근육세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배양액으로 37℃ CO₂ incubator를 이용하여 계대 배양한 후 적당량의 세포수(5×10⁴ cell) 를 96 well cultureplate에 배양하였다. 24시간 배양 후 2% FBS를 포함하는 DMEM 배양액으로 교체하여 분화 시켰다 (9~15일). 세포 분화 후 추출물 등의 시료를 처리하기 전 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배양액으로 교체하여 starvation 시켰다 (4~10시간). 추출물 등의 시료를 농도별로 처리한 후 (Total volume 100 μL) 2시간 배양하여 반응시켰다. 배양액을 제거하고 PBS로 2번 세척하고 1 mM 2-deoxyglucose (2-DG)를 100 μL 씩 처리하고 37℃에서 30분 반응시켰다. kit의 Stop Buffer를 25 μL씩 첨가하여 반응을 중지시키고 Neutralization Buffer를 25 μL씩 첨가하여 중화시켰다. 그 후 2DG6P Detection Reagent (Luciferase Reagent 100 μL, NADP⁺ 1μL, G6PDH 2.5 μL, Reductase 0.5 μL, Reductase Substrate 0.0625 μL / well)를 100 μL씩 처리하고 25℃에서 1시간 반응시킨 후 ELISA Reader를 이용하여 발광(Luminescence)를 0.3~1 초 간격으로 측정하여 대조군 대비 퍼센트로 분석하여 포도당 흡수능을 분석였다.

결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 나도미꾸리낚시 물 추출물과 70% 에탄올 추출물의 활성을 비교하여 에탄올 추출물의 활성이 물 추출물 보다 당 흡수 활성이 우수함을 확인하였고(도 2의 (A)), 70% 에탄올 추출물을 농도별 활성을 평가한 결과 농도의존적으로 활성이 증가함을 관찰하였다(도 2의 (B))

또 도 3에서 확인되는 바와 같이, L6 근육세포에서 분획물의 당 흡수능을 비교한 결과 부탄올 분획물에서 가장 높은 활성을 관찰하였다.

또 도 4에서 확인되는 바와 같이, 부탄올 분획물은 농도의존적으로 당 흡수능을 증가시켰으며(도 4의 (A)), 세포독성을 나타내지 않는 농도(도4의 (B))인 200 μg/ml을 처리하였을 때 대조군 대비 25.5% 증가하여 가장 높은 활성을 나타내었다.

<실험예 2> AMPK 및 ACC 활성 평가 - 웨스턴 블럿

상기 가장 활성이 우수한 부탄올 분획물을 L6 근육세포에 처리하여 AMPK 및 ACC 효소 활성화(인산화) 정도를 웨스턴 블럿 방법으로 측정하였다. 웨스턴 블럿은 문헌 (Schlattner U, et al., J Biol Chem. 279, pp 43940-51, 2004; Smwar R et al., Clin Ther. 20, 125-40, 1998)에 기재된 방법을 응용하여 수행하였다.

구체적으로 상기의 L6 근육세포를 배양하여 부탄올 분획물을 농도별로 2h 처리한 후, 상기 세포를 단백질분해효소 저해제 (protease inhibitor cocktail, Sigma, st. Louis, MO USA)를 첨가한 RIPA 완충용액 (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% NP-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 용해시켰다. 이후, 얻어진 세포 용해물을 4 ℃에서 5 min 간 12,000 ×g으로 원심분리한 후, BCA 단백질 키트를 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다. 세포에서 추출한 단백질에 전기영동용 완충용액 (sample buffer)을 첨가하고 100℃에서 5 min간 가열한 후 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 전기영동 후, 분자량별로 분리된 단백질은 젤에서 nitrocellulose (NC) membrane 에 전이시켰다. 이때, 비특이적 반응을 최소화하기 위해 완충용액(phosphate buffered saline; PBS (pH 7.4), 0.1% Tween 20, 5% skimmed milk)을 1 h 동안 상온에서 반응시킨 후, 1차 항체를 다음과 같이 희석하여 사용하였다. 항체 희석은 5% Skim milk 용액을 이용하여 상온에서 1 h 동안 반응시켜 희석하였다, 반응 후, 세척 완충액 (0.1 % Tween-20, PBS)으로 5 min 간 3~4회 세척한 후 1:5000으로 희석시킨 2차 항체 (HRP-conjugated anti-goat IgG antibody) 용액으로 1 h 동안 상온에서 반응시켰다. 2차 항체 반응 후, ECL (enhanced chemiluminescence) 시약을 사용하여 분석대상 단백질 밴드를 발색시켜 평가하였다.

결과를 도 5에 나타내었다. 부탄올 분획물은 농도 의존적으로 p-AMPK 및 p-ACC의 발현량을 증가시킴을 확인하여 AMPK의 활성화를 통하여, 상기 당 흡수능의 증가가 AMPK의 활성화 기전에 따른 것임을 확인하였다.

Claims (6)

1. 나도미꾸리낚시의 물과 에탄올 혼합용매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 항당뇨는 인슐린 비의존성 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료 활성인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 70% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 나도미꾸리낚시 전초의 물과 에탄올 추출물을 고형상으로 하여 물에 현탁하고 노르말 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는, 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.