KR102673401B1 - 지방 유래 줄기세포를 포함하는 생체재료 및 이를 생산하는 방법 - Google Patents

지방 유래 줄기세포를 포함하는 생체재료 및 이를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방 유래 줄기세포 (ASC), 생체적합성 재료 및 세포외 기질을 포함하는 생체재료에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 생체재료는 오스테오프로테게린 (OPG)을 분비한다. 본 발명은 또한 생체재료를 생산하는 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

지방 유래 줄기세포를 포함하는 생체재료 및 이를 생산하는 방법
본 발명은 줄기세포의 분야 및 다차원 생체재료(biomaterial)의 생산을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 지방 유래 줄기세포 (ASC)를 포함하는 생체재료, 치료를 위해 이러한 생체재료를 제조하고, 사용하는 방법에 관한 것이다.
골 결손(bone defect)은 골이 정상적으로 존재해야 하는 신체 영역에 골 조직이 부재하는 것이다. 골 결손은 다양한 수술 방법으로 치료할 수 있다. 그러나 종종 진성 당뇨병, 면역억제 요법, 부적절한 운동 상태와 같은 골 치유를 방해하는 인자 및, 절차가 예정된 경우 고려해야 하는 인자가 존재한다.
골 결손 재구성의 외과적 방법은 특히 박피술, 절개 및 고정, 해면골 이식 및 일리자로프 층간 골 수송 방법 (Ilizarov intercalary bone transport method)을 포함한다. 그러나 환자는 일반적으로 기능적 및 미적 결과가 최적의 상태가 아닌 보행 장애가 지속된다.
조직공학은 살아있는 세포의 사용을 통한 조직 구조 또는 기능의 복원을 포함한다. 일반적인 과정은 세포 단리 및 증식으로 구성되며, 이후 스캐폴드 재료 (scaffold material)가 사용되는 재 이식 절차가 이루어진다. 중간엽 줄기세포 (MSC)는 성숙한 조직으로부터의 세포에 대한 양호한 대안을 제공하고, 골 및 연골 조직 재생을 위한 세포 공급원으로서 다수의 장점을 갖는다.
정의에 따르면, 줄기세포는 자가 재생을 진행시키는 능력 및 다중 계통 분화를 진행시키고, 최종 분화 세포를 형성하는 능력을 특징으로 한다. 이상적으로, 재생 의약 용도를 위한 줄기세포는 다음의 일련의 기준을 충족해야 한다: (i) 풍부한 양 (수백만 내지 수십억개의 세포)으로 존재해야 하고; (ii) 최소 침습 절차에 의해 수집 및 수확될 수 있고; (iii) 재현 가능한 방식으로 다중 세포 계통 경로를 따라 분화될 수 있으며; (iv) 자가 또는 동종이계 숙주에 안전하고 효과적으로 이식될 수 있다.
연구에 의해, 줄기세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래의 세포로 분화하는 능력을 갖는 것으로 나타났다. MSC의 소성(plasticity)은 대부분 종종 계통 장벽을 통과하고, 다른 조직에 고유한 세포의 표현형, 생화학적 및 기능적 특성을 채택하기 위해 줄기세포 내에 보유된 고유 능력을 지칭한다. 성체 중간엽 줄기세포는 예를 들어 골수 및 지방 조직으로부터 단리될 수 있다.
지방 유래 줄기세포는 다능성이며, 완전한 재생 능력을 갖는다. 동일한 지방 조직 세포 집합을 확인하기 위해 다음의 용어가 사용되었다: 지방 유래 줄기/기질세포 (ASC); 지방 유래 성체 줄기 (ADAS) 세포, 지방 유래 성체 기질세포, 지방 유래 기질세포 (ADSC), 지방 기질세포 (ASC), 지방 중간엽 줄기세포 (AdMSC), 지방아세포, 혈관주위세포, 전구지방세포, 가공된 지방흡인물 (PLA) 세포. 이러한 다양한 명칭의 사용은 문헌에서 상당한 혼란을 초래하였다. 이 문제를 해결하기 위해, International Fat Applied Technology Society는 “지방 유래 줄기세포”(ASC)라는 용어를 채택하여, 단리된 소성-부착성 다능성 세포 집합을 확인하는 합의에 도달하였다.
골형성 분화 ASC는 다양한 스캐폴드, 예컨대 β-인산삼칼슘 (β-TCP), 하이드록시아파타이트 (HA), I형 콜라겐, 폴리-락트-코-글리콜산 (PLGA) 및 알기네이트에 시딩 (seeding)되는 경우, 다양한 전임상 모델에서 큰 치유 잠재력을 갖는 것으로 나타났다. 국제 특허 출원 WO2013/059089는 줄기세포 및 인산칼슘 시멘트 (cement) 예컨대 인산삼칼슘과 하이드록시아파타이트의 혼합물을 포함하는 골 페이스트 (paste)에 관한 것이다. US2011/104230은 합성 세라믹 재료를 포함하는 스캐폴드 재료, 중간엽 줄기세포 및 신호전달 분자를 포함하는 골 패치 (patch)를 개시한다.
그러나, 소형 동물 모델에서의 고무적인 결과에도 불구하고, 스캐폴드 상에 적용된 ASC를 이용한 임계 크기 골 재구성은 큰 크기의 골 결손 및 결과적으로 조작되는 이식재의 크기에 의해 제한된다. 시딩된 세포의 세포 생착은 또한 산소 및 영양소의 부적절한 확산에 의해 제한된다. 또한, 스캐폴드 내의 세포 위치는 시험관내 및 생체내 생존의 주요 제한이다. 스캐폴드 유동 관류의 생물반응기는 더욱 균일한 세포 분포, 이식재의 코어에 산소 및 영양소의 전달에 의한 세포 생존 및 (유체 전단력에 의한) 골형성 세포 분화를 위해 이식재 내의 세포 이동이 개선되도록 설계되었다. 이러한 기술이 유망하지만, 대형 동물 모델의 관련 전임상 및 임상 데이터는 제한적이다.
따라서, 당 업계에는 완전 생체적합성이며, 소정의 용도에 적절한 기계적 특징을 제공하는 골 조직 재생을 위한 조직 조작 재료에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 따라서, 본 발명은 생체적합성 재료에 의한 다차원 골형성 구조로 분화되는 ASC로 이루어진 이식편에 관한 것이다.
본 발명은 골형성 분화 지방 유래 줄기세포 (ASC), 생체적합성 재료 및 세포외 기질(extracellular matrix)을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체재료에 관한 것이며, 생체재료는 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin) (OPG)을 분비한다.
본 발명의 청구범위는 다음과 같다.
[청구항 1]
인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함하는 골형성 분화 배지 중 골형성 분화 지방 유래 줄기세포 (ASC), 생체적합성 재료 및 세포외 기질(extracellular matrix)을 포함하는 다차원 구조를 갖는 스캐폴드-무함유 생체재료(biomaterial)로서,
상기 생체재료는 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin) (OPG)을 분비하는, 생체재료.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 생체재료는 생체재료 g당 적어도 약 5 ng의 OPG를 분비하는, 생체재료.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 생체재료는 생체재료 g당 적어도 약 10 ng의 OPG를 분비하는, 생체재료.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 재료는 입자 형태인, 생체재료.
[청구항 5]
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM)의 입자인, 생체재료.
[청구항 6]
제5항에 있어서, DBM 입자는 약 50 내지 약 2500 μm의 범위의 평균 직경을 갖는, 생체재료.
[청구항 7]
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 재료는 인산칼슘 입자인, 생체재료.
[청구항 8]
제7항에 있어서, 상기 인산칼슘 입자는 약 50 μm 내지 약 1500 μm의 범위의 평균 크기를 갖는, 생체재료.
[청구항 9]
제7항에 있어서, 상기 인산칼슘 입자는 하이드록시아파타이트 (HA) 및/또는 β-인산삼칼슘(β-TCP)의 입자인, 생체재료.
[청구항 10]
제7항에 있어서, 상기 인산칼슘 입자는 10/90 내지 90/10의 범위의 비율의 HA/β-TCP의 입자인, 생체재료.
[청구항 11]
제7항에 있어서, 상기 인산칼슘 입자는 20/80 내지 80/20의 범위의 비율의 HA/β-TCP의 입자인, 생체재료.
[청구항 12]
제1항에 있어서, 상기 생체재료는 생체재료 g당 적어도 약 10 ng의 VEGF를 포함하는, 생체재료.
[청구항 13]
제1항에 있어서, 상기 생체재료는 3차원 (3D)인, 생체재료.
[청구항 14]
제1항에 따른 다차원 생체재료를 포함하는 의료 장치.
[청구항 15]
제1항에 따른 다차원 생체재료를 생산하는 방법으로서,
- 지방 유래 줄기세포 (ASC) 증식 단계,
- 인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함하는 골형성 분화 배지 중 제4 계대에서의 ASC 골형성 분화 단계, 및
- 생체적합성 재료의 존재 하에 다차원 유도 단계
를 포함하는 방법.
[청구항 16]
제15항에 있어서, 다차원 유도가 3차원 (3D) 유도인, 방법.
[청구항 17]
제15항에 따른 방법에 의해 수득 가능한 다차원 생체재료.
[청구항 18]
골 및/또는 연골 결손 치료용으로 사용하기 위한, 제1항에 따르는 생체재료를 포함하는 약제학적 조성물.
일 실시형태에서, 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 5 ng의 OPG, 바람직하게는 적어도 약 10 ng/g을 분비한다.
일 실시형태에서, 생체적합성 재료는 입자 형태이다.
일 실시형태에서, 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM)의 입자이다. 일 실시형태에서, DBM 입자는 약 50 내지 약 2500 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 생체적합성 재료는 인산칼슘 입자이다. 일 실시형태에서, 인산칼슘 입자는 약 50 μm 내지 약 1500 μm의 범위의 평균 크기를 갖는다.
일 실시형태에서, 인산칼슘 입자는 하이드록시아파타이트 (HA) 및/또는 β-인산삼칼슘 (β-TCP)의 입자이다. 일 실시형태에서, 인산칼슘 입자는 10/90 내지 90/10의 범위의 비율의 HA/β-TCP의 입자이다. 또 다른 실시형태에서, HA/β-TCP의 입자는 20/80 내지 80/20의 비율로 존재한다. 또 다른 실시형태에서, HA/β-TCP의 입자는 65/35의 비율로 존재한다.
일 실시형태에서, 생체적합성 재료는 젤라틴의 입자이다. 바람직한 실시형태에서, 생체적합성 재료는 돼지 젤라틴의 입자이다.
일 실시형태에서, 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 10 ng의 VEGF를 포함한다.
일 실시형태에서, 생체재료는 3차원이다.
특정 실시형태에서, 생체재료는 성형가능(moldable)하거나 형성가능(formable)하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 다차원 생체재료를 포함하는 의료 장치 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따른 다차원 생체재료를 생산하는 방법이다:
- 지방 유래 줄기세포 (ASC) 증식 단계,
- 제4 계대에서의 ASC 골형성 분화 단계, 및
- 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능한 다차원 생체재료에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 골 및/또는 연골 결손 치료용으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 생체재료이다.
정의
본 발명에서, 다음의 용어는 다음의 의미를 갖는다:
- 값에 선행하는 용어 "약"은 상기 값의 + 또는 - 10%를 의미한다.
- 용어 "지방 조직"은 임의의 지방 조직을 지칭한다. 지방 조직은 피하, 대망/내장, 유방, 생식선 또는 다른 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 이러한 세포는 1차 세포 배양물 또는 불멸화 세포주를 포함할 수 있다. 지방 조직은 지방 조직을 갖는 살아있거나 사멸된 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 동물, 더욱 바람직하게는 포유류이고, 가장 바람직하게는 지방 조직은 인간이다. 지방 조직의 편리한 공급원은 지방흡입 수술에 의한 것이지만, 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 단리 방법은 본 발명에 중요하지 않다.
- 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "지방 유래 줄기세포" (또한 이른바 "지방 조직 유래 줄기세포")는 지방 조직의 "비-지방세포" 분량(fraction)을 지칭한다. 세포는 새로운 것이거나 배양물 중의 것일 수 있다. "지방 유래 줄기세포" (ASC)는, 다음에 제한되는 것은 아니나, 지방세포, 골세포, 연골세포와 같은 다양한 상이한 세포 유형에 대한 전구체로서 작용할 수 있는 지방 조직으로부터 유래된 기질세포를 지칭한다.
- 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "세라믹 재료"는 무기 비금속 고체 재료를 지칭한다. 세라믹 물질은 인산칼슘 (CaP), 탄산칼슘 (CaCO3), 황산칼슘, 수산화칼슘 (Ca[OH]2), 또는 이들의 조합의 입자일 수 있다. 세라믹 재료는 입자 형태일 수 있다. 세라믹 재료는 분말, 비드 또는 과립 형태일 수 있다. 세라믹 재료는 다공성일 수 있다.
- 용어 "재생" 또는 "조직 재생"은 다음에 제한되는 것은 아니나, 본 개시내용의 ASC로부터의 새로운 세포 유형 또는 조직의 성장, 생성 또는 재구성을 포함한다. 일 실시형태에서, 이들 세포 유형 또는 조직은 다음에 제한되는 것은 아니나 골형성 세포 (예를 들어, 골아세포), 연골세포, 내피 세포, 심근 세포, 조혈 세포, 간세포, 지방세포, 신경 세포 및 근관을 포함한다. 특정 실시형태에서, 용어 "재생" 또는 "조직 재생"은 본 개시내용의 ASC로부터의 골형성 세포 (예를 들어, 골아세포)의 생성 또는 재구성을 지칭한다.
- 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "성장 인자"는 조직 성장, 세포 증식, 혈관화 등을 촉진하는 분자이다. 특정 실시형태에서, 용어 "성장 인자"는 골 조직 형성을 촉진하는 분자를 포함한다.
- 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "배양된"은 시험관내, 생체내 또는 생체외 환경에서 세포 분열이 진행되거나, 세포 분열이 진행되지 않는 하나 이상의 세포를 지칭한다. 시험관내 환경은 예를 들어 적합한 액체 배지 또는 한천과 같은 시험관내 세포를 유지하는데 적합한 당 업계에 공지된 임의의 배지일 수 있다. 세포 배양에 적합한 시험관내 환경의 특정 예는 문헌[Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3rd edition), 1994, R. I. Freshney (ed.), Wiley-Liss, Inc.; Cells: a laboratory manual (vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan John Wiley and Sons, Ltd]에 기재되어 있다.
- 용어 "컨플루언시 (confluency)"는 세포 배양 표면 (예를 들어, 배양 접시 또는 플라스크)에서의 부착성 세포의 수, 즉 세포로 도포된 표면의 비율을 지칭한다. 100%의 컨플루언시는 표면이 세포로 완전히 도포되어 있음을 의미한다. 일 실시형태에서, "세포가 컨플루언스에 도달하다" 또는 "세포가 컨플루언스 상태(confluent)이다"라는 표현은 세포가 표면의 80 내지 100%를 도포한 것을 의미한다. 일 실시형태에서, "세포는 서브컨플루언스 상태(subconfluent)이다"라는 표현은 세포가 표면의 60 내지 80%를 도포한 것을 의미한다. 일 실시형태에서, "세포가 과컨플루언스 상태이다"이라는 표현은 세포가 수 시간 또는 수 일 이후 표면의 적어도 100%를 도포하고/거나, 100% 컨플루언스 상태임을 의미한다.
- 용어 "냉장 상태" 또는 "냉장"은 예를 들어, 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 약 1시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 1주, 적어도 약 4주, 적어도 약 6개월 등 동안 대상체의 정상적인 생리학적 온도보다 낮은 온도, 약 -196℃ 내지 약 +32℃의 범위에서 선택되는 하나 이상의 온도에 도달되도록 하는 처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, "냉장 상태" 또는 "냉장"은 0℃ 미만의 온도에 도달되도록 하는 처리를 지칭한다. 냉장 상태는 수동으로 수행될 수 있거나, 바람직하게는 냉장 프로그램을 실행할 수 있는 특수 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 용어 "냉장"은 당 업계에 "동결" 및 "저온보존"으로 공지된 방법을 포함한다. 당업자는 냉장 방법이 그 목적을 위한 시약의 첨가를 포함하는 다른 단계를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
- 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "비 배아 세포"는 배아로부터 단리되지 않은 세포를 지칭한다. 비 배아 세포는 분화되거나 분화되지 않을 수 있다. 비 배아 세포는 자궁외 동물로부터 단리된 세포와 같은 거의 모든 체세포를 지칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 비 배아 세포는 생식 세포를 포함한다. 이러한 예는 제한하는 것을 의미하지 않는다.
- 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "분화 세포"는 특수화되지 않은 표현형으로부터 특수한 표현형으로 발달한 전구체 세포를 지칭한다. 예를 들어, 지방 유래 줄기세포는 골형성 세포로 분화될 수 있다.
- 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "분화 배지"는 분화 세포를 생성하기 위해 본 발명의 배양 시스템에 사용되는 화합물의 집합 중 하나를 지칭한다. 화합물의 작용 방식은 제한되지 않는 것으로 의도된다. 예를 들어, 제제는 표현형의 변화를 유도 또는 지원하거나, 특정 표현형을 갖는 세포의 성장을 촉진 시키거나, 다른 것의 성장을 지연시킴으로써 분화 과정을 지원할 수 있다. 이는 또한 그렇지 않으면 경로를 통해 의도되지 않은 세포 유형으로의 분화를 유도할 수 있고, 세포 집합에 의해 합성되거나, 배지에 존재할 수 있는 다른 인자에 대한 억제제로서 작용할 수 있다.
- 용어 "치료", "치료하는" 또는 "완화"는 골 결손을 예방하거나 지연 (감소)시킬 목적의 치료학적 치료를 지칭한다. 치료를 필요로하는 자에는 이미 장애가 있는 자뿐만 아니라, 장애의 소인이 있는 자 또는 골 결손을 예방해야 하는 자가 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 치료량의 생체재료가 제공된 후, 환자가 다음 중 하나 이상의 관찰 가능하고/거나, 측정 가능한 감소 또는 부재를 나타내는 경우, 대상체의 골 결손이 성공적으로 "치료되었다": 골 결손의 감소 및/또는 골 결손과 관련된 하나 이상의 증상의 일정 정도의 경감; 이환율(morbidity) 및 치사율 감소, 및 삶의 질 문제의 개선. 질병의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 공지된 통상적인 절차에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
- 개시된 생체재료의 치료적 사용과 관련하여, "동종이계" 요법에서 공여체 및 수용체는 동일한 종의 상이한 개체지만, "자가"요법에서는 공여체 및 수용체는 동일한 개체이며, "이종"요법에서는 공여체는 수용체와 다른 종의 동물로부터 유래되었다.
- 용어 "유효량"은 임상 결과를 포함하여 유익하거나 바람직한 결과를 초래하기에 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다.
- 용어 "대상체"는 포유류, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 대상체의 예는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 말, 소 및 이들의 트랜스제닉 (transgenic) 종을 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 의료 관리를 받기 위해 대기 중이거나, 받는 중이거나, 의료 절차의 대상이었거나, 이거나, 일 것이거나, 질병의 발병에 대해 모니터링되고 있는 "환자", 즉 온혈 동물, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 성인 (예를 들어, 18세 초과의 인간 대상체)이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 소아 (예를 들어, 18세 미만의 인간 대상체)이다. 일 실시형태에서, 대상체는 남성이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 여성이다.
- 용어 "생체적합성"은 세포, 세포 배양, 조직 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 적합할 수 있는 비 독성 재료를 지칭한다.
- 용어 "탈무기질화 골 기질" 또는 "DBM"은 탈세포화 및 탈무기질화된 골 단편을 지칭한다. 일 실시형태에서, DBM은 현장에서의 최적의 실시 방법에 따라 제조된다. 일 실시형태에서, DBM은 인간 사체 동종이식 골의 일정한 크기로의 분쇄 후, 무기질화된 상의 경도의 무기산 추출에 의해 제조된다.
- 용어 "다차원"은 예를 들어 2차원 (2D) 또는 3차원 (3D)과 같은 1차원 초과를 지칭한다. 일 실시형태에서, 다차원 구조를 갖는 생체재료는 2D 또는 3D 구조를 갖는 생체재료를 지칭한다.
상세한 설명
본 발명은 지방 조직 유래 줄기세포 (ASC), 생체적합성 재료 및 세포외 기질을 포함하고, 오스테오프로테게린 (OPG)을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체재료에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다차원 구조를 갖는 생체재료"는 본 발명 전반에 걸쳐 용어 "다차원 생체재료"로 교체될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포는 지방 조직으로부터 단리되고, 이후 본 명세서에서 지방 유래 줄기세포 (ASC)로 지칭된다.
일 실시형태에서, ASC 조직은 동물 유래, 바람직하게는 포유류 유래, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, ASC는 동물 ASC, 바람직하게는 포유류 ASC, 더욱 바람직하게는 인간 ASC이다. 바람직한 실시형태에서, ASC는 인간 ASC이다.
지방 조직으로부터 줄기세포를 단리하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Zuk et al. (Tissue Engineering. 2001, 7:211-228)]에 개시되어 있다. 일 실시형태에서, ASC는 지방흡입에 의해 지방 조직으로부터 단리된다.
예로서, 지방 조직을 바늘 생검 또는 지방흡입 흡인에 의해 수집할 수 있다. 선택적으로 항생제, 예를 들어 1% 페니실린 (penicillin)/스트렙토마이신 (streptomycin) (P/S)을 포함하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 조직 샘플을 먼저 광범위하게 세척함으로써 ASC를 지방 조직으로부터 단리할 수 있다. 이어서, 조직 분해를 위해 콜라게나제 (예를 들어, 2% P/S를 포함하는 PBS 중에 제조된 콜라게나제 유형 I)와 함께 샘플을 멸균 조직 배양 플레이트에 배치하고, 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션(incubation)할 수 있다. 배양 배지 (예를 들어, 10% 혈청을 포함하는 DMEM)를 첨가함으로써 콜라게나제 활성을 중화할 수 있다. 분해시, 샘플을 튜브로 옮길 수 있다. 샘플을 (예를 들어, 2000 rpm에서 5분 동안) 원심분리함으로써 ASC를 포함하는 기질 혈관 분량 (SVF)을 수득한다. 1차 지방세포로부터 기질세포의 분리를 완료하기 위해, 샘플을 격렬하게 진탕하여, 펠렛을 완전히 파괴하고, 세포를 혼합할 수 있다. 원심분리 단계를 반복할 수 있다. 스피닝(spinning) 및 콜라게나제 용액 흡인 후, 펠렛을 용해 완충액에 재현탁시키고, 얼음상에서 (예를 들어, 10분 동안) 인큐베이션하고, (예를 들어, PBS/2% P/S로) 세척하고, (예를 들어, 2000 rpm에서 5분 동안) 원심분리할 수 있다. 이어서, 상청액을 흡인하고, 세포 펠렛을 배지 (예를 들어, 기질 배지, 즉 α-MEM, 20% FBS, 1% L-글루타민 및 1% P/S로 보충됨)에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 (예를 들어, 70 μm 세포 여과기를 통해) 여과할 수 있다. 세포를 포함하는 샘플을 마지막으로 배양 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ASC는 지방 조직의 기질 혈관 분량으로부터 단리된다. 일 실시형태에서, 지방흡인물은 실온에서 수시간 동안 또는 사용 전에 +4℃에서 24시간 동안 또는 장기간 보존을 위해 0℃ 미만, 예를 들어 -18℃에서 유지될 수 있다.
일 실시형태에서, ASC는 새로운 ASC 또는 냉장된 ASC일 수 있다. 새로운 ASC는 냉장 처리를 거치지 않은 단리된 ASC이다. 냉장 ASC는 냉장 처리를 거친 단리된 ASC이다. 일 실시형태에서, 냉장 처리는 0℃ 미만의 임의의 처리를 의미한다. 일 실시형태에서, 냉장 처리는 약 -18℃, -80℃ 또는 -180℃에서 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 냉장 처리는 저온보존일 수 있다.
냉장 처리의 예로서, ASC는 80 내지 90% 컨플루언스(confluence)에서 수확될 수 있다. 접시로부터 세척 및 분리 단계 후, 세포를 냉장 보존 배지로 실온에서 펠렛화하고, 바이알(vial)에 배치할 수 있다. 일 실시형태에서, 냉장 보존 배지는 80% 소 태아 혈청 또는 인간 혈청, 10% 디메틸술폭사이드 (DMSO) 및 10% DMEM/Ham F-12를 포함한다. 이어서, 바이알을 -80℃에서 밤새 저장할 수 있다. 예를 들어, 바이알을 알코올 동결 용기에 배치하여, -80℃에 도달할 때까지 1분마다 대략 1℃씩 바이알을 천천히 냉각시킬 수 있다. 마지막으로, 동결 바이알을 장기간 저장을 위해 액체 질소 용기로 옮길 수 있다.
일 실시형태에서, ASC는 분화 ASC이다. 바람직한 실시형태에서, ASC는 골형성 분화 ACS이다. 즉, 바람직한 실시형태에서, ASC는 골형성 세포로 분화된다. 특정 실시형태에서, ASC는 골아세포로 분화된다.
골형성 분화를 제어하고, 평가하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 조직의 골-분화는 (예를 들어, 폰 코사(von Kossa)에 의한) 오스테오칼신 (osteocalcin) 및/또는 포스페이트의 염색; (예를 들어, Alizarin 레드에 의한) 인산칼슘 염색; 자기 공명 영상 (MRI); 무기질화된 기질 형성의 측정; 또는 알칼리성 포스파타제 활성의 측정에 의해 평가될 수 있다.
일 실시형태에서, ASC의 골형성 분화는 골형성 분화 배지 (MD) 중 ASC의 배양에 의해 수행된다.
일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 인간 혈청을 포함한다. 특정 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함한다. 일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 임의의 다른 동물 혈청을 포함하지 않으며, 바람직하게는 이는 인간 혈청 이외에 다른 혈청을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 덱사메타손, 아스코르브산 및 인산나트륨으로 보충된 증식 배지를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 항생제, 예컨대 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 (gentamycin) 및/또는 암포테리신 B (amphotericin B)를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 모든 배지는 동물 단백질을 무함유한다.
일 실시형태에서, 증식 배지는 당업자에 공지된 세포의 성장을 지원하도록 설계된 임의의 배양 배지일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 증식 배지는 또한 이른바 "성장 배지"이다. 성장 배지의 예는 제한 없이, MEM, DMEM, IMDM, RPMI 1640, FGM 또는 FGM-2, 199/109 배지, HamF10/HamF12 또는 McCoy 5A를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 증식 배지는 DMEM이다.
일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민 (Ala-Gln, 또한 이른바 'Glutamax®' 또는 'Ultraglutamine®'), hPL, 덱사메타손, 아스코르브산 및 인산나트륨으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL, 덱사메타손, 아스코르브산 및 인산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B로 보충된 DMEM을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL (약 5%, v/v), 덱사메타손 (약 1 μM), 아스코르브산 (약 0.25 mM) 및 인산나트륨 (약 2.93 mM)으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL (약 5%, v/v), 덱사메타손 (약 1 μM), 아스코르브산 (약 0.25 mM) 및 인산나트륨 (약 2.93 mM), 페니실린 (약 100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (약 100 μg/mL)으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 암포테리신 B (약 0.1%)를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL (약 5%, v/v), 덱사메타손 (약 1 μM), 아스코르브산 (약 0.25 mM) 및 인산나트륨 (약 2.93 mM)으로 보충된 DMEM으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL (약 5%, v/v), 덱사메타손 (약 1 μM), 아스코르브산 (약 0.25 mM) 및 인산나트륨 (약 2.93 mM), 페니실린 (약 100 U/mL), 스트렙토마이신 (약 100 μg/mL) 및 암포테리신 B (약 0.1%)로 보충된 DMEM을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, ASC는 후기 계대(late passaged)의 지방 유래 줄기세포이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "후기 계대"는 적어도 계대 4 이후 분화된 지방 유래 줄기세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 계대 4는 제4 계대, 즉 세포를 배양 용기의 표면으로부터 분리한 후, 새로운 배지에 이를 재현탁함으로써, 세포를 분할시키는 제4 수행 단계를 지칭한다. 일 실시형태에서, 후기 계대의 지방 유래 줄기세포는 계대 4, 계대 5, 계대 6 이상 후에 분화된다. 바람직한 실시형태에서, ASC는 계대 4 후에 분화된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "용기"는, 예를 들어 플라스크 또는 웰-플레이트(well-plate)와 같은 임의의 세포 배양 표면를 의미한다.
1차 세포의 초기 계대는 계대 0 (P0)으로 지칭되었다. 본 발명에 따르면, 계대 P0는 배양 용기 상에 펠렛화된 기질 혈관 분량 (SVF)으로부터 세포 현탁액의 시딩(seeding)을 지칭한다. 따라서, 계대 P4는 세포를 배양 용기의 표면으로부터 (예를 들어, 트립신으로의 분해에 의해) 4회 (P1, P2, P3 및 P4에서) 분리시키고, 새로운 배지에 재현탁시켰음을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ASC는 증식 배지에서 최대 제4 계대까지 배양된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 ASC는 분화 배지에서 제4 계대 후에 배양된다. 따라서, 일 실시형태에서, 계대 P1, P2 및 P3에서, ASC를 배양 용기의 표면으로부터 분리한 후, 증식 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석시킨다. 이 실시형태에 따르면, 계대 P4에서, ASC를 배양 용기의 표면으로부터 분리한 후, 분화 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석시킨다. 따라서, 이 실시형태에 따르면, P4에서, 본 발명의 ASC를 분화되기 전에 (즉, 분화 배지에서 배양되기 전에) 컨플루언스에 도달할 때까지 증식 배지에 재현탁 및 배양하지 않고, 분화 배지에 직접 재현탁 및 배양한다.
일 실시형태에서, 세포는 적어도 컨플루언스, 바람직하게는 70% 내지 100% 컨플루언스, 더욱 바람직하게는 80% 내지 95% 컨플루언스에 도달할 때까지 골형성 분화 배지 중에 유지된다. 일 실시형태에서, 세포는 골형성 분화 배지에서 적어도 5일, 바람직하게는 적어도 10일, 더욱 바람직하게는 적어도 15일 동안 유지된다. 일 실시형태에서, 세포는 골형성 분화 배지에서 5 내지 30일, 바람직하게는 10 내지 25일, 더욱 바람직하게는 15 내지 20일 동안 유지된다. 일 실시형태에서, 분화 배지는 2일마다 교체한다. 그러나, 당 업계에 공지된 바와 같이, 하나의 공여체와 다른 공여체 간의 세포 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 골형성 분화 지속기간 및 배지 교체 횟수는 공여체마다 상이할 수 있다.
일 실시형태에서, 적어도, 골 조직의 성숙 전에 형성되는 골상, 즉 골 기질의 비무기질화 유기 분량의 형성시까지 세포를 골형성 분화 배지에 유지시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 입자 형태이고, 본 명세서에서 생체적합성 입자로 지칭된다. 일 실시형태에서, 입자는 비드, 분말, 구체, 미소구체 등일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료의 구조는 소정의 3D 형태 또는 스캐폴드, 예컨대 예를 들어 입방체를 형성하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 소정의 형태 또는 스캐폴드를 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 입방체의 형태를 갖지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 유기 기질 예컨대 탈무기질화 골 기질 (DBM), 셀룰로스 등; 중합체 예컨대 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA), 폴리 락트산 (PLA), 폴리 글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리 메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 엘라스틴 등; 또는 세라믹 예컨대 하이드록시아파타이트 (HA), β-인산삼칼슘 (β-TCP), 하이드록시아파타이트/β-인산삼칼슘 (HA/β-TCP), α-인산삼칼슘 (α-TCP), 황산칼슘 등을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 약 50 μm 내지 약 2500 μm, 바람직하게는 약 50 μm 내지 약 1500 μm, 더욱 바람직하게는 약 100 μm 내지 약 1000 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 약 200 μm 내지 약 600 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 약 300 μm 내지 약 700 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 적어도 약 50 μm, 바람직하게는 적어도 약 100 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 150 μm의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 적어도 약 200 μm, 바람직하게는 적어도 약 250 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 300 μm의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 최대 약 2500 μm, 바람직하게는 최대 약 2000 μm, 더욱 바람직하게는 최대 약 1500 μm의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 최대 약 1000 μm, 바람직하게는 최대 약 900 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 최대 약 800 μm, 훨씬 더욱 바람직하게는 최대 약 700 μm의 평균 직경을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 탈무기질화 골 기질 (DBM)이다.
일 실시형태에서, DBM은 동물 유래, 바람직하게는 포유류 유래, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 것이다. 특정 실시형태에서, 인간 DBM은 인간 공여체로부터 피질골을 분쇄함으로써 수득된다.
DBM을 수득하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 우선, 인간 골 조직을 하룻밤 동안 아세톤 (예를 들어, 99%) 조에 의해 탈지시킨 후, 2시간 동안 탈염수로 세척할 수 있다. 탈석회화는 실온에서 교반 하에 3시간 동안 HCL (예를 들어, 0.6 N) (골 그램당 20 mL 용액)에 침지함으로써 수행될 수 있다. 이어서, 탈무기질화 골 분말을 탈염수로 2시간 동안 세정하고, pH를 제어할 수 있다. pH가 강산인 경우, DBM을 교반 하에 포스페이트 용액 (예를 들어, 0.1 M)으로 완충시킬 수 있다. 마지막으로, DBM을 건조하고, 중량을 측정할 수 있다. DBM을 당 업계에 공지된 기술에 따라, 예를 들어 약 25 kGray의 감마선 조사에 의해 멸균시킬 수 있다.
일 실시형태에서, DBM은 동종이계이다. 일 실시형태에서, DBM은 균일하다. 다른 실시형태에서, DBM은 이종성이다.
일 실시형태에서, DBM은 본 명세서에서 탈무기질화 골 기질 입자 또는 DBM 입자로서 지칭되는 입자의 형태이다. 일 실시형태에서, DBM 입자는 약 50 내지 약 2500 μm, 바람직하게는 약 50 μm 내지 약 1500 μm, 더욱 바람직하게는 약 50 μm 내지 약 1000 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 일 실시형태에서, DBM 입자는 약 100 μm 내지 약 1500 μm, 더욱 바람직하게는 약 150 μm 내지 약 1000 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 일 실시형태에서, DBM 입자는 약 200 내지 약 1000 μm, 바람직하게는 약 200 μm 내지 약 800 μm, 더욱 바람직하게는 약 300 μ 내지 약 700 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 적어도 약 50 μm, 바람직하게는 적어도 약 100 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 150 μm의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 적어도 약 200 μm, 바람직하게는 적어도 약 250 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 300 μm의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 최대 약 2500 μm, 바람직하게는 최대 약 2000 μm, 더욱 바람직하게는 최대 약 1500 μm의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 최대 약 1000 μm, 바람직하게는 최대 약 900 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 최대 약 800 μm, 훨씬 더욱 바람직하게는 최대 약 700 μm의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에 따르면, 탈무기질화 골 기질의 정량은 생체재료에 3D 구조를 제공하기에 최적의 것이다. 일 실시형태에서, 탈무기질화 골 기질은 mL 배지당 약 1 내지 약 25 mg의 범위의 농도로 첨가된다. 바람직한 실시형태에서, 탈무기질화 골 기질은 mL 배지당 약 1 내지 약 20 mg, 더욱 바람직하게는 mL 배지당 약 5 내지 약 20 mg의 범위의 농도로 첨가된다.
일 실시형태에서, 탈무기질화 골 기질은 150 cm2 용기당 약 500 mg 내지 약 2000 mg, 바람직하게는 약 750 mg 내지 약 1500 mg, 더욱 바람직하게는 약 1000 mg 내지 약 1250 mg의 범위의 농도로 첨가된다.
일 실시형태에서, 탈무기질화 골 기질은 cm2 배양 용기당 약 3 mg 내지 약 13 mg, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 10 mg, 더욱 바람직하게는 약 6.5 mg 내지 약 8 mg의 범위의 농도로 첨가된다.
일 실시형태에서, 탈무기질화 골 기질은 40세 미만의 연령의 공여체로부터 추출된 것이다. 실시형태에 따르면, 골 기질의 탈무기질화 비율은 약 90 내지 약 99%, 바람직하게는 약 95 내지 약 98%, 및 훨씬 더욱 바람직하게는 약 97%의 범위이다. 일 실시형태에서, 탈무기질화 비율은 유리하게는 3시간 동안 HCl 0.6N을 사용한 과정으로부터의 결과이다. 특정 실시형태에 따르면, 탈무기질화 골 기질은 멸균된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 인산칼슘 (CaP), 탄산칼슘 (CaCO3), 또는 수산화칼슘 (Ca[OH]2)의 입자이다.
인산칼슘 입자의 예는, 다음에 제한되는 것은 아니나, 하이드록시아파타이트 (HA, Ca10(PO4)6(OH)2), 인산삼칼슘 (TCP, Ca3[PO4]2), α-인산삼칼슘 (α-TCP, (α-Ca3(PO4)2), β-인산삼칼슘 (β-TCP, β-Ca3(PO4)2), 테트라칼슘 포스페이트 (TTCP, Ca4(PO4)2O), 옥타칼슘 포스페이트 (Ca8H2(PO4)6.5H2O), 비정질 인산칼슘 (Ca3(PO4) 2), 하이드록시아파타이트/β-인산삼칼슘 (HA/β-TCP), 하이드록시아파타이트/테트라칼슘 포스페이트 (HA/TTCP) 등을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 재료는 하이드록시아파타이트 (HA), 인산삼칼슘 (TCP), 하이드록시아파타이트/β-인산삼칼슘 (HA/β-TCP), 황산칼슘, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 재료는 하이드록시아파타이트 (HA), β-인산삼칼슘 (β-TCP), 하이드록시아파타이트/β-인산삼칼슘 (HA/β-TCP), α-인산삼칼슘 (α-TCP), 황산칼슘, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 하이드록시아파타이트 (HA)의 입자이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 β-인산삼칼슘 (β-TCP)의 입자이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 하이드록시아파타이트/β-인산삼칼슘 (HA/β-TCP)의 입자이다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자는 하이드록시아파타이트 및 β-인산삼칼슘 입자 (이른바 HA/β-TCP 입자)의 혼합물이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자는 하이드록시아파타이트 입자 및 β-인산삼칼슘 입자 (이른바 HA/β-TCP 입자)로 이루어진다.
일 실시형태에서, HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 과립, 분말 또는 비드 형태이다. 일 실시형태에서, HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 다공성 과립, 분말 또는 비드 형태이다. 일 실시형태에서, 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 다공성 세라믹 재료이다. 일 실시형태에서, 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 분말 입자이다. 특정 실시형태에서, HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 다공성 과립의 형태이다. 또 다른 특정 실시형태에서, HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 분말의 형태이다. 일 실시형태에서, HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자의 구조는 예를 들어 입방체와 같은 소정의 3D 형태 또는 스캐폴드를 형성하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 재료는 3D 스캐폴드가 아니다. 일 실시형태에서, 세라믹 재료는 소정의 형태 또는 스캐폴드를 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 재료는 입방체의 형태를 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 스캐폴드가 부재한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 약 50 μm 초과, 바람직하게는 약 100 μm 초과이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 약 50 μm 초과, 바람직하게는 약 100 μm 초과의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 적어도 약 50 μm, 바람직하게는 적어도 약 100 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 150 μm의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 적어도 약 200 μm, 바람직하게는 적어도 약 250 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 300 μm의 평균 직경을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 최대 약 2500 μm, 바람직하게는 최대 약 2000 μm, 더욱 바람직하게는 최대 약 1500 μm의 평균 직경을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 최대 약 1000 μm, 900 μm, 800 μm, 700 μm 또는 600 μm의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 약 50 μm 내지 약 1500 μm, 바람직하게는 약 50 μm 내지 약 1250 μm, 더욱 바람직하게는 약 100 μm 내지 약 1000 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세라믹 입자, 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 약 100 μm 내지 약 800 μm, 바람직하게는 약 150 μm 내지 약 700 μm, 더욱 바람직하게는 약 200 μm 내지 약 600 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, HA/β-TCP 입자는 약 50 μm 내지 약 1500 μm, 바람직하게는 약 50 μm 내지 약 1250 μm, 더욱 바람직하게는 약 100 μm 내지 약 1000 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 일 실시형태에서, HA 및 β-TCP 입자는 약 100 μm 내지 약 800 μm, 바람직하게는 약 150 μm 내지 약 700 μm, 더욱 바람직하게는 약 200 μm 내지 약 600 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 입자 중의 HA 및 β-TCP 사이의 비율 (HA/β-TCP 비율)은 0/100 내지 100/0, 바람직하게는 10/90 내지 90/10, 더욱 바람직하게는 20/80 내지 80/20의 범위이다. 일 실시형태에서, 입자 중의 비율 HA/β-TCP는 30/70 내지 70/30, 35/65 내지 65/35, 또는 40/60 내지 60/40의 범위이다.
일 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 0/100이며, 즉, 입자는 β-인산삼칼슘의 입자이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 100/0이며, 즉, 입자는 하이드록시아파타이트의 입자이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 10/90이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 90/10이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 20/80이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 80/20이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 30/70이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 70/30이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 35/65이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 65/35이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 40/60이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 60/40이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 중 HA/β-TCP 비율은 50/50이다.
일 실시형태에 따르면, HA, TCP 및/또는 HA/β-TCP의 정량은 생체재료에 3D 구조를 제공하기에 최적의 것이다. 일 실시형태에서, HA, TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 150 cm2 용기당 약 0.5 cm3 내지 약 5 cm3 mg, 바람직하게는 약 1 cm3 내지 약 3 cm3, 더욱 바람직하게는 약 1 cm3 내지 약 2 cm3의 범위의 농도로 첨가된다. 바람직한 실시형태에서, HA, TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 150 cm2 용기당 약 1.5 cm3의 농도로 첨가된다.
일 실시형태에서, HA, TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 mL 배지당 약 7.10-3 내지 7.10-2 cm3의 범위의 농도로 첨가된다. 일 실시형태에서, HA, TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 cm2 용기당 약 3.3.10-3 내지 3.3.10-2 cm3의 범위의 농도로 첨가된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 입자는 젤라틴이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴은 돼지 젤라틴이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "돼지 (porcine) 젤라틴"은 "돼지 (pork) 젤라틴" 또는 "돼지 (pig) 젤라틴"으로 교체될 수 있다. 일 실시형태에서, 젤라틴은 돼지 피부 젤라틴이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴은 거대다공성 미세담체이다.
돼지 젤라틴 입자의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, Cultispher® G, Cultispher® S, Spongostan 및 Cutanplast를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴은 Cultispher® G 또는 Cultispher® S이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴은 적어도 약 50 μm, 바람직하게는 적어도 약 75 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 약 130 μm의 평균 직경을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴은 최대 약 1000 μm, 바람직하게는 최대 약 750 μm, 더욱 바람직하게는 최대 약 500 μm의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴은 최대 약 450 μm, 바람직하게는 최대 약 400 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 최대 약 380 μm의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴은 약 50 μm 내지 약 1000 μm, 바람직하게는 약 75 μm 내지 약 750 μm, 더욱 바람직하게는 약 100 μm 내지 약 500 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴은 약 50 μm 내지 약 500 μm, 바람직하게는 약 75 μm 내지 약 450 μm, 더욱 바람직하게는 약 100 μm 내지 약 400 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴은 약 130 μm 내지 약 380 μm의 범위의 평균 직경을 갖는다.
일 실시형태에서, 젤라틴은 150 cm2 용기당 약 0.1 cm3 내지 약 5 cm3, 바람직하게는 약 0.5 cm3 내지 약 4 cm3, 더욱 바람직하게는 약 0.75 cm3 내지 약 3 cm3의 범위의 농도로 첨가된다. 일 실시형태에서, 젤라틴은 150 cm2 용기당 약 1 cm3 내지 약 2 cm3의 범위의 농도로 첨가된다. 일 실시형태에서, 젤라틴은 150 cm2 용기당 약 1 cm3, 1.5 cm3 또는 2 cm3의 농도로 첨가된다.
일 실시형태에서, 젤라틴은 150 cm2 용기당 약 0.1 g 내지 약 5 g, 바람직하게는 약 0.5 g 내지 약 4 g, 더욱 바람직하게는 약 0.75 g 내지 약 3 g의 범위의 농도로 첨가된다. 일 실시형태에서, 젤라틴은 150 cm2 용기당 약 1 g 내지 약 2 g의 범위의 농도로 첨가된다. 일 실시형태에서, 젤라틴은 150 cm2 용기당 약 1 g, 1.5 g 또는 2 g의 농도로 첨가된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴은 세포가 분화 후, 컨플루언스에 도달했을 때 첨가된다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴은 세포가 분화 배지 중 컨플루언스에 도달했을 때 첨가된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴은 P4 후, 적어도 5일, 바람직하게는 10일, 더욱 바람직하게는 15일째에 첨가된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 젤라틴은 P4 후, 5 내지 30일, 바람직하게는 10 내지 25일, 더욱 바람직하게는 15 내지 20일째에 첨가된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM), 인산칼슘 입자, 바람직하게는 HA 및/또는 β-TCP 입자, 또는 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM), HA 입자, βTCP 입자, HA/β-TCP 입자 또는 젤라틴이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM), HA 입자, βTCP 입자, HA/β-TCP 입자 또는 돼지 젤라틴이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료 탈무기질화 골 기질 (DBM), 인산칼슘 입자, 바람직하게는 HA 및/또는 β-TCP 입자, 및 젤라틴, 바람직하게는 돼지 젤라틴을 포함하거나, 이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료 탈무기질화 골 기질 (DBM), HA 입자, βTCP 입자, HA/β-TCP 입자 및 젤라틴을 포함하거나, 이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료 탈무기질화 골 기질 (DBM), HA 입자, βTCP 입자, HA/β-TCP 입자 및 돼지 젤라틴을 포함하거나, 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 세포의 분화 후, 배양 배지에 첨가된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 세포가 서브컨플루언스에 도달했을 때 첨가된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 세포가 과컨플루언스에 도달했을 때 첨가된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 세포가 분화 후, 컨플루언스에 도달했을 때 첨가된다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 세포가 분화 배지 중 컨플루언스에 도달했을 때 첨가된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 P4 후, 적어도 5일, 바람직하게는 10일, 더욱 바람직하게는 15일째에 첨가된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 P4 후, 5 내지 30일, 바람직하게는 10 내지 25일, 더욱 바람직하게는 15 내지 20일째에 첨가된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 생체재료는 2차원이다. 이 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 1 mm 미만의 얇은 막을 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 생체재료는 3차원이다. 이 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 1 mm의 두께를 갖는 두꺼운 막을 형성한다. 생체재료의 크기는 용도에 따라 조정될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 스캐폴드를 포함하지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "스캐폴드"는 인간 및 동물 조직, 예컨대 천연 포유류, 바람직하게는 인간 골 또는 세포외 기질을 포함하여, 천연 포유류 조직의 다공성, 기공 크기 및/또는 기능을 모방한 구조를 의미한다. 이러한 스캐폴드의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 인공골, 콜라겐 스폰지, 하이드로겔, 예컨대 단백질 하이드로겔, 펩타이드 하이드로겔, 중합체 하이드로겔 및 목질 나노셀룰로스 하이드로겔 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 인공골을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체적합성 재료는 인공골이 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 다차원은 천연 세포외 기질 구조를 모방한 스캐폴드로 인한 것이 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 천연 세포외 기질 구조를 모방한 스캐폴드를 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 다차원은 본 발명의 지방 조직 유래 줄기세포에 의한 세포외 기질의 합성으로 인한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 세포외 기질을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질은 ASC로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질은 ASC에 의해 생성된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포외 기질" (ECM)은 비세포성 다차원 거대분자 망을 의미한다. ECM의 기질 성분은 세포 부착 수용체뿐만 아니라, 서로 결합함으로써, 본 발명의 생체재료 또는 조직 내에 세포가 유지되는 복합 망을 형성한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질은 콜라겐, 프로테오글리칸/글리코사미노글리칸, 엘라스틴, 피르보넥틴, 라미닌, 및/또는 다른 당단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질은 콜라겐을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질은 프로테오글리칸을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질은 콜라겐 및 프로테오글리칸을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세포외 기질은 성장 인자, 프로테오글리칸, 분비 인자, 세포외 기질 조절인자, 및 당단백질을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료 내의 ASC는 본 명세서에서 ASC 조직으로 지칭되는 조직을 형성한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료 내의 ASC 및 세라믹 재료, 바람직하게는 세라믹 입자, 더욱 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자는 세포외 기질에 포매(embedding)된다. 일 실시형태에서, 바람직하게는 골세포에서 분화 ASC는 세라믹 재료, 바람직하게는 세라믹 입자, 더욱 바람직하게는 HA, β-TCP 및/또는 HA/β-TCP 입자와 세포외 기질을 갖는 3D 구조를 형성한다. 일 실시형태에서, ASC 조직은 혈관화된 조직이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 혈관화된다.
일 실시형태에서, ASC 조직은 세포화된 상호연결(interconnective) 조직이다. 일 실시형태에서, 생체적합성 재료, 바람직하게는 생체적합성 입자는 세포화된 상호연결 조직에 혼입된다. 일 실시형태에서, 생체적합성 재료, 바람직하게는 생체적합성 입자는 ASC 조직 내에 분산된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료, 바람직하게는 생체적합성 입자 사이에 형성된 상호연결 조직을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료, 바람직하게는 생체적합성 입자를 둘러싼 무기질화를 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 형성된 생체재료의 조직 성질은 조직 반응의 발생에 의해 확인될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 오스테오칼신 발현 및 무기질화 특성을 갖는 실제 골과 유사한 특성을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 골세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 골세포 및 세포외 기질을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 골세포 및 콜라겐을 포함한다. 특정 실시형태에서, 콜라겐은 석회화 및 무기질화된 콜라겐이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 골 기질을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체재료의 세포의 분화가 최종점에 도달하고, 이식되는 경우, 생체재료의 표현형이 변하지 않은 상태로 유지되도록 하는 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 성장 인자를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료에 의한 성장 인자 함량 또는 분비는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주째에 평가된다.
파골세포형성 억제 인자 (OCIF) 또는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리원(superfamily member) 11B (TNFRSF11B)로도 알려진 오스테오프로테게린 (OPG)은 사이토카인 수용체이다. OPG의 과발현 또는 투여는 마우스에서 파골세포형성을 둔화시키는 것으로 나타났다. 유사하게, OPG가 부재하는 동물은 파골세포형성이 가속화되고, 중증 골다공증이 발생한다는 것이 확립되었다. OPG는 RANKL(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리원 11 (TNFSF11), TNF-관련 활성화-유도 사이토카인 (TRANCE), 오스테오프로테게린 리간드 (OPGL), 또는 파골세포 분화 인자 (ODF)로도 공지된 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성제)에 대해 RANK와 경쟁하는 가용성 유인 수용체인 것으로 공지되어 있다. RANK/RANKL/OPG 신호전달 경로는 파골세포 분화 및 활성화를 조절하는 것으로 확인되었다. 따라서, 파골세포형성 자극제 RANKL 및 억제제 OPG의 발현 사이의 잔여량은 재흡수된 골의 양을 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 OPG 함량 및/또는 분비는 바람직하게는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 후에 예를 들어 ELISA와 같이 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 OPG를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 ASC는 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세포 조작 생체재료는 OPG를 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체재료 중 106개의 세포당 적어도 약 250 pg의 OPG, 바람직하게는 적어도 500 pg/106 세포를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 750, 800, 850, 900 또는 950 pg의 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 1000, 1100, 1200, 1300 또는 1400 pg의 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 1000, 1500, 2000, 2500 또는 3000 pg의 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 또는 2500 pg의 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 2550, 2600, 2650 또는 2750 pg의 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 1000 pg의 OPG를 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 2500 pg의 OPG를 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 적어도 약 2750 pg의 OPG를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 약 1000 pg의 OPG를 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 약 2500 pg의 OPG를 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 약 2750 pg의 OPG를 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 약 250 내지 약 10000 pg의 OPG, 바람직하게는 약 500 내지 약 5000 pg/106 세포, 더욱 바람직하게는 약 1000 내지 약 4000 pg/106 세포를 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 106개의 세포당 약 250 내지 약 5000 pg의 OPG, 바람직하게는 약 500 내지 약 4500 pg/106 세포, 더욱 바람직하게는 약 750 내지 약 4000 pg/106 세포를 분비한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 1000 내지 약 3500 pg/106 세포의 범위의 농도의 OPG를 분비한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 1000 또는 1200 pg/106 세포의 농도의 OPG를 분비한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 3000 또는 3500 pg/106 세포의 농도의 OPG를 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 5 ng의 OPG, 바람직하게는 적어도 약 10 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 15 ng/g을 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 20 ng의 OPG, 바람직하게는 적어도 약 25 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30 ng/g을 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 35, 40 또는 45 ng의 OPG를 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 50 ng의 OPG, 바람직하게는 적어도 약 60 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70 ng/g을 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 75 ng의 OPG를 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 g 생체재료당 적어도 약 80, 85, 90, 95 또는 100 ng의 OPG를 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 5 내지 약 200 ng의 OPG, 바람직하게는 약 10 내지 약 175 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 150 ng/g을 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 5 내지 약 150 ng의 OPG, 바람직하게는 약 5 내지 약 140 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 120 ng/g을 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 10 내지 약 150 ng의 OPG, 바람직하게는 약 10 내지 약 140 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 120 ng/g을 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 15 내지 약 150 ng의 OPG, 바람직하게는 약 15 내지 약 140 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 120 ng/g을 분비한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 30 내지 약 150 ng의 OPG, 바람직하게는 약 30 내지 약 140 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 30 내지 약 120 ng/g을 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 5 내지 약 100 ng의 OPG, 약 10 내지 약 100 ng/g, 약 15 내지 약 100 ng/g, 약 20 내지 약 100 ng/g, 약 25 내지 약 100 ng/g, 또는 약 30 내지 약 100 ng/g을 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 5 내지 약 90 ng의 OPG, 약 10 내지 약 90 ng/g, 약 15 내지 약 90 ng/g, 약 20 내지 약 90 ng/g, 약 25 내지 약 90 ng/g 또는 약 30 내지 약 90 ng/g을 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 5 내지 약 85 ng의 OPG, 약 10 내지 약 85 ng/g, 약 15 내지 약 85 ng/g, 약 20 내지 약 85 ng/g, 약 25 내지 약 85 ng/g 또는 약 30 내지 약 85 ng/g을 분비한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 15 내지 약 30 ng/g 생체재료를를 분비한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 15 ng/g 생체재료의 농도의 OPG를 분비한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 30 ng/g 생체재료의 농도의 OPG를 분비한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 75 ng/g 생체재료의 농도의 OPG를 분비한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 85 ng/g 생체재료의 농도의 OPG를 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 OPG를 분비한다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 다차원 유도의 개시 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 OPG를 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 RANKL 함량 및/또는 분비는 바람직하게는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 후에 예를 들어 ELISA와 같이 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료 또는 배지 중의 경우 생체재료의 상청액 중 RANKL의 수준은 검출 불가능하다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 mL당 200 pg 미만의 RANKL, 바람직하게는 156 pg/mL 미만, 바람직하게는 100 pg/mL 미만, 더욱 바람직하게는 78 pg/mL 미만, 훨씬 더욱 바람직하게는 50 pg/mL 미만, 훨씬 더욱 바람직하게는 10 pg/mL 미만, 훨씬 더욱 바람직하게는 7.8 pg/mL 미만을 포함하거나, 생체재료의 ASC는 상기 범위의 RANKL을 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 실질적으로 RANKL을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 ASC는 실질적으로 RANKL을 분비하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 RANKL을 분비한다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 다차원 유도의 개시 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후, 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 RANKL을 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 OPG를 분비하고, RANKL을 분비하지 않거나, 검출 가능한 수준의 RANKL을 분비하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 OPG를 분비하고, 최대 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 RANKL을 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 고 수준의 VEGF를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 VEGF 함량은 바람직하게는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 후에 예를 들어 ELISA와 같이 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 약 10 ng/g 생체재료, 바람직하게는 적어도 약 20 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30 ng/g의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 약 50 ng/g 생체재료, 바람직하게는 적어도 약 60 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70 ng/g의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 약 100 ng/g 생체재료, 바람직하게는 적어도 약 125 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 150 ng/g의 농도의 VEGF를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 10 ng/g 내지 약 250 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 20 ng/g 내지 약 225 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 30 ng/g 내지 약 200 ng/g의 범위의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 10 ng/g 내지 약 50 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 15 ng/g 내지 약 45 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 20 ng/g 내지 약 40 ng/g의 범위의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 50 ng/g 내지 약 150 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 60 ng/g 내지 약 125 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 70 ng/g 내지 약 100 ng/g의 범위의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 100 ng/g 내지 약 250 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 120 ng/g 내지 약 225 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 140 ng/g 내지 약 200 ng/g의 범위의 농도의 VEGF를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 35 ng/g 생체재료의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 75 ng/g 생체재료의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 95 ng/g 생체재료의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 135 ng/g 생체재료의 농도의 VEGF를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 190 ng/g 생체재료의 농도의 VEGF를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 VEGF를 포함한다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 다차원 유도의 개시 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 VEGF를 포함한다.
인슐린형 성장 인자 (IGF-1)는 후속 골절 위험을 감소시키는 골 무기질 밀도의 유지 및 보다 높은 피크 골 질량의 수득과 양성적으로 관련이 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 IGF-1 함량은 바람직하게는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 후에 예를 들어 ELISA와 같이 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 IGF-1을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 고 수준의 IGF-1을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 약 5 ng/g 생체재료, 바람직하게는 적어도 약 10 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 15 ng/g, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 ng/g의 농도의 IGF-1을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 ng/g 생체재료의 농도의 IGF-1을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 약 50 ng/g 생체재료, 바람직하게는 적어도 약 60 ng/g, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70 ng/g, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 약 80 ng/g의 농도의 IGF-1을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 적어도 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 ng/g 생체재료의 농도의 IGF-1을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5 ng/g 내지 약 500 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 10 ng/g 내지 약 400 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 15 ng/g 내지 약 300 ng/g의 범위의 농도의 IGF-1을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5 ng/g 내지 약 200 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 10 ng/g 내지 약 150 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 15 ng/g 내지 약 125 ng/g의 범위의 농도의 IGF-1을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5, 10, 15 또는 20 ng/g 내지 약 150 ng/g 생체재료의 범위의 농도의 IGF-1을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5, 10, 15 또는 20 ng/g 내지 약 125 ng/g 생체재료의 범위의 농도의 IGF-1을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5, 10, 15 또는 20 ng/g 내지 약 100 ng/g 생체재료의 범위의 농도의 IGF-1을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 20 ng/g 내지 약 100 ng/g 생체재료의 범위의 농도의 IGF-1을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 50 ng/g 내지 약 150 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 70 ng/g 내지 약 125 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 80 ng/g 내지 약 110 ng/g, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 85 ng/g 내지 약 100 ng/g 또는 약 90 ng/g 내지 약 100 ng/g의 범위의 농도의 IGF-1을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 20 ng의 IGF-1을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 ng/g 생체재료의 농도의 IGF-1을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 90 ng의 IGF-1을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 95 ng의 IGF-1을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 100 ng의 IGF-1을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 IGF-1을 포함한다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 다차원 유도의 개시 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 IGF-1을 포함한다.
SDF-1α, 또한 이른바 기질세포 유래 인자 1-알파 또는 CXCL12는 파골세포 분화 및 활성화에 자극제로서의 역할을 한다. 파골세포, 특히 파골세포 전구체는 SDF-1α에 대한 고유한 수용체인 CXCR4에 대해 매우 양성적이다. SDF-1α는 파골세포형성을 직접적으로 유도하지만, 최근에 SDF-1α는 RANKL 발현의 상향 조절을 통해 파골세포형성에 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났다. 파골세포 및 그의 전구체에의 RANK의 존재는 기질세포에 존재하는 파골세포-분화 인자가 RANKL일 수 있음을 시사하였다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 SDF-1α 함량은 바람직하게는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 후에 예를 들어 ELISA와 같이 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 SDF-1α를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 저 수준의 SDF-1α를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 1000 ng/g 생체재료, 바람직하게는 최대 약 750 ng/g, 더욱 바람직하게는 최대 약 500 ng/g, 훨씬 더욱 바람직하게는 최대 약 400 ng/g의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 300 ng/g 생체재료, 바람직하게는 최대 약 275 ng/g, 더욱 바람직하게는 최대 약 250 ng/g의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 290, 280, 270, 260 또는 250 ng/g 생체재료의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 240, 230, 220, 210 또는 200 ng/g 생체재료의 농도의 SDF-1α를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 100 ng/g 생체재료, 바람직하게는 최대 약 75 ng/g, 더욱 바람직하게는 최대 약 50 ng/g의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 70, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52 또는 51 ng/g 생체재료의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42 또는 41 ng/g 생체재료의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 40 ng/g 생체재료의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32 또는 31 ng/g 생체재료의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 최대 약 30 ng/g 생체재료의 농도의 SDF-1α를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5 ng/g 내지 약 1000 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 15 ng/g 내지 약 750 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 20 ng/g 내지 약 500 ng/g의 범위의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5 ng/g 내지 약 300 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 15 ng/g 내지 약 275 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 20 ng/g 내지 약 250 ng/g의 범위의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 25 ng/g 내지 약 250 ng/g 생체재료, 더욱 바람직하게는 약 30 ng/g 내지 약 250 ng/g의 범위의 농도의 SDF-1α를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 100 ng/g 내지 약 400 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 150 ng/g 내지 약 350 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 200 ng/g 내지 약 300 ng/g의 범위의 농도의 SDF-1α를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 5 ng/g 내지 약 100 ng/g 생체재료, 바람직하게는 약 15 ng/g 내지 약 75 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 25 ng/g 내지 약 60 ng/g의 범위의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 30 ng/g 생체재료 내지 약 100 ng/g, 바람직하게는 약 30 ng/g 내지 약 75 ng/g, 더욱 바람직하게는 약 30 ng/g 내지 약 50 ng/g의 범위의 농도의 SDF-1α를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 약 30 ng/g 생체재료 내지 약 40 ng/g의 범위의 농도의 SDF-1α를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 250 ng의 SDF-1α를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 30 ng의 SDF-1α를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 40 ng의 SDF-1α를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 그램 생체재료당 약 50 ng의 SDF-1α를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 SDF-1α를 포함한다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 다차원 유도의 개시 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 SDF-1α를 포함한다.
골 형태형성 단백질 2 또는 BMP2는 골의 발달 자극에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 이는 골아세포 분화를 강력하게 유도하는 것으로 나타났다.
골 형태형성 단백질 7 또는 BMP7은 특히 SMAD1 및 SMAD5의 인산화를 유도하여, 결과적으로 다수의 골형성 유전자의 전사를 유도함으로써, 중간엽 세포를 골로 형질전환시키는데 중요한 역할을 한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 BMP2 및 BMP7 함량은 바람직하게는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 후에 예를 들어 ELISA와 같이 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료 또는 배지 중의 경우 생체재료의 상청액 중 BMP2의 수준은 검출 불가능하다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 실질적으로 BMP2를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 ASC는 실질적으로 BMP2를 분비하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 mL당 100 pg 미만의 BMP2 , 바람직하게는 85 pg/mL 미만, 더욱 바람직하게는 75 pg/mL 미만, 훨씬 더욱 바람직하게는 62.5 pg/mL 미만을 포함하거나, 생체재료의 ASC는 상기 범위의 BMP2를 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료 또는 배지 중의 경우 생체재료의 상청액 중 BMP7의 수준은 검출 불가능하다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 실질적으로 BMP7을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 ASC는 실질적으로 BMP7을 분비하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 mL당 50 pg 미만의 BMP7 , 바람직하게는 40 pg/mL 미만, 더욱 바람직하게는 35 pg/mL 미만, 훨씬 더욱 바람직하게는 31.2 pg/mL 미만을 포함하거나, 생체재료의 ASC는 상기 범위의 BMP7을 분비한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 생체적합성 재료의 첨가 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 BMP2 및/또는 BMP7을 포함한다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 다차원 유도의 개시 후, 4, 5, 6, 7 또는 8주 후에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 농도의 BMP2 및/또는 BMP7을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 생체재료는 무기질화된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "무기질화" 또는 "골 조직 무기질 밀도"는 생체재료에 의해 형성된 골 또는 "골-유사" 조직의 제곱 센티미터당 무기질 물질의 양으로서, 또한 백분율로 표시되는 양을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "무기질화" 또는 "골 조직 무기질 밀도"는 백분율로 표시되고, 백분율로 표시되는 생체재료의 제곱 센티미터 당 무기질 물질의 양을 지칭한다.
생체재료의 무기질화 정도를 평가하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 마이크로 컴퓨터 단층촬영 (마이크로-CT) 분석, 영상화 질량분석법, 칼세인 블루 염색, 골 무기질 밀도 분포 (BMDD) 분석 등을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 1% 미만이 아니다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 적어도 약 1%, 바람직하게는 적어도 약 2%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 5%이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 15%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 약 25%이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 적어도 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37% 또는 38%이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 1% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 45%, 더욱 바람직하게는 약 1% 내지 약 40%의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 5% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 45%, 더욱 바람직하게는 약 20% 내지 약 40%의 범위이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 30% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 50%, 더욱 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 35% 내지 약 40%의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 20%, 더욱 바람직하게는 약 1% 내지 약 10%의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 1% 내지 약 5%의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 적어도 1% 또는 1.24%이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 적어도 2%, 2.5% 또는 2.77%이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 1% 또는 1.24%이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 2%, 2.5% 또는 2.77%이다.
특정의 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 2%이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 20%이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 약 38%이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료의 무기질화 정도는 OPG 분비에 비례한다. 일 실시형태에서, 생체재료가 더 많은 양의 OPG를 포함할수록, 더 많은 양의 생체재료가 무기질화된다.
본 발명은 또한 골형성 세포로 분화된 지방 조직 유래 줄기세포 (ASC), 생체적합성 재료 및 세포외 기질을 포함하는 다차원 생체재료를 생산하는 방법에 관한 것이며, 생체재료는 오스테오프로테게린 (OPG)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 생체재료를 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
- 세포 증식 단계,
- 세포 분화 단계, 및
- 다차원 유도 단계.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 생체재료를 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
- ASC 증식 단계,
- ASC 골형성 분화 단계, 및
- 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 생체재료를 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
- 대상체로부터 세포, 바람직하게는 ASC를 단리하는 단계;
- 세포, 바람직하게는 ASC를 증식시키는 단계,
- 증식된 세포, 바람직하게는 ASC를 분화시키는 단계, 및
- 생체적합성 재료의 존재 하에 분화 세포, 바람직하게는 ASC를 배양하는 단계.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료를 생산하는 방법은 세포 증식 단계 전에 수행되는 세포, 바람직하게는 ASC의 단리 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료를 생산하는 방법은 세포 증식 단계 전에 수행되는 세포, 바람직하게는 ASC의 단리 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 증식 단계는 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같이 수행된다. 일 실시형태에서, 증식 단계는 증식 배지 중에서 수행된다. 특정 실시형태에서, 증식 배지는 DMEM이다. 일 실시형태에서, 증식 배지는 Ala-Gln 및/또는 인간 혈소판 용해물(hPL)로 보충된다. 일 실시형태에서, 증식 배지는 추가로 항생제, 예컨대 페니실린 및/또는 스트렙토마이신을 포함한다.
일 실시형태에서, 증식 배지는 Ala-Gln 및 hPL (5%)로 보충된 DMEM을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 증식 배지는 Ala-Gln, hPL (5%, v/v), 페니실린 (100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, 증식 단계는 최대 P8까지 수행된다. 일 실시형태에서, 증식 단계는 최대 P4, P5, P6, P7 또는 P8까지 지속된다. 따라서, 일 실시형태에서, 세포 증식 단계는 적어도 3 계대를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 증식 단계는 최대 7 계대를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 증식 단계는 3 내지 7 계대를 포함한다. 특정의 일 실시형태에서, 증식 단계는 최대 P4까지 수행된다. 따라서, 일 실시형태에서, 세포 증식 단계는 배양 용기의 표면으로부터 세포를 분리시킨 후, 계대 P1, P2 및 P3에 증식 배지 중에 이를 희석시키는 단계를 포함한다. 최대 P6까지의 증식의 실시형태에서, 세포 증식 단계는 배양 용기의 표면으로부터 세포를 분리시킨 후, 계대 P1, P2, P3, P4 및 P5에 증식 배지 중에 이를 희석시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 증식 단계는 세포가 3, 4, 5, 6 또는 7회 계대하는데 필요한 기간 동안 지속된다. 특정 실시형태에서, 증식 단계는 세포가 3회 계대하는데 필요한 기간 동안 지속된다. 일 실시형태에서, 증식 단계는 세포가 최종 계대 후, 컨플루언스, 바람직하게는 70% 내지 100% 컨플루언스, 더욱 바람직하게는 80% 내지 95% 컨플루언스에 도달할 때까지 지속된다. 일 실시형태에서, 증식 단계는 세포가 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 계대 후, 컨플루언스에 도달할 때까지 지속된다.
유리한 실시형태에서, 생체적합성 입자를 첨가하기 전에 분화 배지에서 세포, 바람직하게는 ASC를 배양하는 단계가 본 발명의 방법의 주요 단계이다. 이러한 단계는 ASC를 골형성 세포로 분화시키기 위해 필요하다. 또한, 이 단계는 다차원 구조를 수득하기 위해 필요하다.
일 실시형태에서, 분화 단계는 P4, P5, P6, P7 또는 P8 후에 수행된다. 일 실시형태에서, 분화 단계는 세포가 컨플루언스에 도달하지 않았을 때 수행된다. 특정 실시형태에서, 분화 단계는 세포의 배양물이 컨플루언스에 도달하지 않았을 때 P4, P5, P6, P7 또는 P8 후에 수행된다.
일 실시형태에서, 분화 단계는 P4, P5, P6, P7 또는 P8에 수행된다. 일 실시형태에서, 분화 단계는 세포가 컨플루언스에 도달하지 않았을 때 수행된다. 특정 실시형태에서, 분화 단계는 세포의 배양물이 컨플루언스에 도달하지 않았을 때 P4, P5, P6, P7 또는 P8에 수행된다.
일 실시형태에서, 분화 단계는 세포 분화 배지, 바람직하게는 골형성 분화 배지에서 인큐베이션함으로써 수행된다. 일 실시형태에서, 분화 단계는 배양 용기의 표면으로부터 분리된 세포를 분화 배지, 바람직하게는 골형성 분화 배지에 재현탁시킴으로써 수행된다.
일 실시형태에서, 골형성 분화 배지 중 ASC의 인큐베이션은 적어도 3일, 바람직하게는 적어도 5일, 더욱 바람직하게는 적어도 10일, 더욱 바람직하게는 적어도 15일 동안 수행된다. 일 실시형태에서, 골형성 분화 배지 중 ASC의 인큐베이션은 5 내지 30일, 바람직하게는 10 내지 25일, 더욱 바람직하게는 15 내지 20일 동안 수행된다. 일 실시형태에서, 분화 배지는 2일마다 교체한다.
일 실시형태에서, 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계는 본 명세서의 상기에 규정된 바와 같은 생체적합성 재료를 분화 배지에 첨가함으로써 수행된다. 일 실시형태에서, 세포는 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계 동안 분화 배지에 유지된다.
일 실시형태에서, 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계는 세포가 분화 배지에서 컨플루언스, 바람직하게는 70% 내지 100% 컨플루언스, 더욱 바람직하게는 80% 내지 95% 컨플루언스에 도달하였을 때 수행된다.
다른 실시형태에서, 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계는 예를 들어 결절 사전형성과 같은 형태학적 변화가 나타날 때 수행된다. 일 실시형태에서, 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계는 적어도 하나의 골상 결절이 형성되는 경우, 수행된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "골상(osteoid)"은 골 조직의 성숙 전에 형성되는 골 기질의 비 무기질화 유기 분량을 의미한다.
다른 실시형태에서, 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계는 세포가 컨플루언스에 도달하는 경우, 형태학적 변화가 나타나는 경우 및 적어도 하나의 골상 결절이 형성되는 경우, 수행된다.
일 실시형태에서, 세포 및 본 발명의 생체적합성 재료는 적어도 5일, 바람직하게는 적어도 10일, 더욱 바람직하게는 적어도 15일 동안 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 세포 및 본 발명의 생체적합성 재료는 10일 내지 30일, 바람직하게는 15 내지 25일, 더욱 바람직하게는 20일 동안 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 배지는 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계 동안 2일마다 교체된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능한 다차원 생체재료에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 다차원 생체재료는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된다. 일 실시형태에서, 다차원 생체재료는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득 가능하거나, 수득된 생체재료는 인간 또는 동물 신체에 이식하기 위한 것으로 의도된다. 일 실시형태에서, 이식된 생체재료는 자가유래, 또는 동종이계일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 골 또는 연골 부위에 이식될 수 있다. 일 실시형태에서, 생체재료는 인간 또는 동물 신체의 비정상적인 부위에 이식될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 균일하며, 이는 생체재료의 구조 및/또는 구성이 전체 조직에 걸쳐 유사하다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 생체재료는 자연 질병 영역에서 이식에 필요한 바람직한 취급 및 기계적 특성을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득 가능하거나, 수득되는 생체재료는 파단됨이 없이 수술기구로 유지될 수 있다.
본 발명의 또 다른 대상은 본 발명에 따른 생체재료를 포함하는 의료 장치이다.
또 다른 대상은 본 발명에 따른 생체재료 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 생체재료 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 의료 장치로서 또는 의료 장치에 포함된 또는 약제학적 조성물 중 본 발명의 생체재료의 임의의 사용에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 사용 전에 조작 및 성형될 수 있는 퍼티형 (putty-like) 재료이다.
본 발명은 추가로 이를 필요로하는 대상체에서 골 또는 연골 결손을 치료하는 방법으로서, 본 발명에 따른 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "골 결손"은 골이 정상적으로 존재해야 하거나, 골 조직의 형성이 치료적으로 바람직한 신체 영역에서의 골 조직의 부재를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "연골 결손"은 연골이 정상적으로 존재해야 하거나, 연골 조직의 형성이 치료적으로 바람직한 신체 영역에서의 연골 조직의 부재를 의미한다.
본 발명의 다른 대상은 이를 필요로하는 대상체에서 골 또는 연골 결손의 치료에서의 그 용도를 위한 본 발명에 따른 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물이다. 본 발명의 다른 대상은 이를 필요로하는 대상체에서 골 결손을 치료하기 위한 본 발명에 따른 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물의 용도이다.
골 결손의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 골절, 골 연화, 골 무기질 밀도 손실, 관절염, 가관절증 예컨대 선천성 가관절증, 골다공증, 척추분리증, 척추전방전위증, 골연화증, 골감소증, 골암, 파제트병 (Paget's disease), 경직 장애, 골 침윤 장애, 이분척추, 지연유합, 골형성부전증, 두개골 결손 (예를 들어, 종양 절개 또는 출혈 후), 골괴사 및 대사성 골 손실을 포함한다.
연골 결손의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 신체 영역에서의 연골 손상 또는 연골 부재를 포함한다. 연골 결손의 원인은 외상, 골괴사, 골 연골염 및 기타 병태로 인한 것일 수 있다. 연골 결손은 무릎 관절에서 가장 흔하게 나타나며, 이 부위에서 이는 종종 외상으로 인해 발생하며, 전방 십자 인대 (ACL) 파단과 같은 인대 손상과 관련하여 나타난다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 골절, 골 연화, 골 무기질 밀도 손실, 관절염, 가관절증 예컨대 선천성 가관절증, 골다공증, 척추분리증, 척추전방전위증, 골연화증, 골감소증, 골암, 파제트병, 경직 장애, 골 침윤 장애, 해면 및 피질 골괴사, 이분척추, 지연유합, 골형성부전증, 두개골 결손 (예를 들어, 종양 절개 또는 출혈 후), 골괴사 및 대사성 골 손실을 포함하거나, 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 결손을 치료하거나, 치료에 사용하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 골절, 관절염, 선천성 가관절증, 골다공증, 척추분리증, 척추전방전위증, 골암, 파제트병, 경직 장애 및 대사성 골 손실을 포함하거나, 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 결손을 치료하거나, 치료에 사용하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 척추분리증 및/또는 척추전방전위증을 치료하거나, 치료에 사용하기 위한 것이다. 척추분리증는 척추경의 관절간부의 결손 또는 피로 골절이다. 척추전방전위증 또는 미끄러짐 (slippage)은 인접 척추에 대한 하나의 척추의 병진 변위 또는 비 해부학적 정렬이며, 척추분리증 환자의 약 30%에서 발생한다.
일 실시형태에서, 척추전방전위증은 이형성, 협착성, 퇴행성, 외상성, 병리학적 및/또는 수술후/의원성 척추전방전위증이다. 일 실시형태에서, 척추전방전위증은 5번 요추의 상부 천골면 또는 하부면의 선천성 이상으로부터의 이형성 척추전방전위증 (또한 이른바 1형)이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 관절간부의 결손에 의해 야기되지만, 또한 연장된 상태가 나타날 수 있는 협착성 척추전방전위증 (또한 이른바 2형)이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 후관절염 및 관절 재형성을 야기하는 퇴행성 척추전방전위증 (또한 이른바 3형)이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 보통의 경우 이외에 신경궁의 급성 골절로 인한 외상성 척추전방전위증 (또한 이른바 4형)이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 감염 또는 악성 종양에 의해 유발되는 병리학적 척추전방전위증 (또한 이른바 5형)이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 수술 후 합병증에 의해 유발되는 수술후/의원성 척추전방전위증 (또한 이른바 6형)이다.
일 실시형태에서, 척추전방전위증은 Meyerding 분류에 따라 I 등급, II 등급, III 등급, IV 등급 또는 V 등급이 있다. 일 실시형태에서, 척추전방전위증은 척추체의 폭의 백분율로 측정되는 것으로, 0 내지 25%의 미끄러짐 정도에 해당하는 I 등급이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 25% 내지 50%의 미끄러짐 정도에 해당하는 II 등급이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 50% 내지 75%의 미끄러짐 정도에 해당하는 III 등급이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 75% 내지 100%의 미끄러짐 정도에 해당하는 IV 등급이다. 다른 실시형태에서, 척추전방전위증은 100% 초과의 미끄러짐 정도에 해당하는 V 등급이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 이를 필요로하는 대상체에 이식될 체간 공간 및/또는 융합 케이지(들)를 충전하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 선천성 가관절증을 치료하거나, 치료에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 경골의 선천성 가관절증 (CPT)을 치료하거나, 치료에 사용하기 위한 것이다. CPT는 자발적으로 또는 경미한 외상 후, 발생하는 경골 골절의 비유합을 나타낸다: 경골은 골의 전외측 만곡을 초래하는 분절 이형성 영역을 나타낸다. CPT는 일반적으로 신경섬유종과 관련되며, 유소아 정형외과 수술에 직면하는 가장 까다롭고 두려운 병태 중 하나이다.
일반적으로 이 질병은 소아의 생후 첫 해에 분명하게 나타나지만, 12세까지 발견되지 않을 수 있다.
일 실시형태에서, CPT는 Crawford 분류에 따라 I 유형, II 유형, III 유형 또는 IV 유형이 있다. 일 실시형태에서, CPT는 피질 밀도의 증가 및 좁은 수질을 갖는 전방 만곡에 해당하는 I 유형이다. 다른 실시형태에서, CPT는 좁은 경화성 수질을 갖는 전방 만곡에 해당하는 II 유형이다. 다른 실시형태에서, CPT는 낭종 또는 예비 골절의 징후와 관련된 전방 만곡에 해당하는 III 유형이다. 다른 실시형태에서, CPT는 종종 경골 및 비골과 관련된 가관절증를 갖는 전방 만곡 및 명확한 골절에 해당하는 IV 유형이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 소아 환자에서 경골의 선천성 가관절증을 치료하거나, 치료에 사용하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 경골의 유소아 선천성 가관절증을 치료하거나, 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 정형외과, 특히 악안면 또는 성형 수술에서 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 생체재료는 또한 류머티스학에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 관절, 두개 안면 상악골의 선천성 또는 후천성 이상, 치열 교정 장애, 수술 후 골 또는 관절 장애 (예를 들어, 대체), 외상 또는 다른 선천성 또는 후천성 이상을 치료, 교정 또는 완화시키고, 기타 근골격 이식재, 특히 인공 및 합성 이식재를 지지하기 위한 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 골 재구성에 사용하기 위한 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료는 인간 또는 동물 신체의 골수강을 충전시키는데 사용하기 위한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 재구성 또는 미용 수술에 사용하기 위한 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 재구성 수술에 사용하기 위한 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 미용 수술에 사용하기 위한 본 발명의 생체재료에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 동종이계 이식재 또는 자가 이식재로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 이종 이식재로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 조직 이식에 사용될 수 있다.
본 발명의 생체재료는 혈관형성을 자극하는데 더욱 유리하다. 실제로, 생체재료의 ASC는 새로운 혈관의 성장을 자극하는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 방출한다.
일 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 예를 들어 애완동물, 가축 또는 생산 동물과 같은 동물 대상체이다. 일 실시형태에서, 대상체는 포유류 대상체이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 인간 및/또는 동물에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 인간 및 동물용 의약품에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체는 골 및/또는 연골 결손을 앓고 있다.
특정 실시형태에서, 대상체는 척추분리증 및/또는 척추전방전위증을 앓고 있다. 또 다른 특정 실시형태에서, 대상체는 경골의 선천성 가관절증 (CPT)을 앓고 있다. 특정 실시형태에서, 대상체는 경골의 유소아 선천성 가관절증 (CPT)을 앓고 있다.
일 실시형태에서, 대상체는 이미 골 및/또는 연골 결손을 위해 치료 받은 적이 있다.
특정 실시형태에서, 대상체는 이미 척추분리증 및/또는 척추전방전위증을 위해 치료 받은 적이 있다. 척추분리증 및/또는 척추전방전위증에 대한 다른 치료의 예는, 다음에 제한되는 것은 아니나, 보존적 관리, 예컨대 보강, 활동 제한, 신장 운동, 굴곡 운동 및 심부 복부 강화; 및 척추 융합 및 척추후궁절개술과 같은 수술을 포함한다.
다른 특정 실시형태에서, 대상체는 이미 CPT를 위해 치료 받은 적이 있다. CPT에 대한 다른 치료의 예는, 다음에 제한되는 것은 아니나, 골 이식, 혈관화된 골 전달, Ilizarov 기술, 유도 막 및 다공질 자가 이식편과 관련된 골수내 못고정술과 같은 보강 및 수술을 포함한다.
일 실시형태에서, 대상체는 골 및/또는 연골 결손에 대한 적어도 하나의 다른 치료에 비 반응성이다.
일 실시형태에서, 대상체는 유아 또는 소아이다. 따라서, 일 실시형태에서, 대상체는 유소아 대상체이다. 일 실시형태에서, 대상체는 18세 미만, 바람직하게는 15세, 12세 또는 10세 미만이다.
다른 실시형태에서, 대상체는 성인이다. 따라서, 일 실시형태에서, 대상은 18세 초과이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은, 예를 들어 척추 융합 절차와 같은 골 및/또는 연골 결손 절차 동안 이를 필요로하는 대상체에 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체재료, 의료 장치 또는 약제학적 조성물은 괴사 조직 제거, 하나 또는 2개의 체내 체세포 케이지 (들)의 배치 및 양측 척추경 나사 고정 및/또는 재활과 함께 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 생체재료, 약제학적 조성물 또는 의료 장치 및 적합한 고정 수단을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다. 적합한 고정 수단의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 생체적합성이고 비 독성이며, 선택적으로 생체흡수성인 수술용 접착제, 조직-접착제 또는 외과용의 임의의 접착제 조성물을 포함한다.
도 1은 비처리 세포와 비교하여, DBM과의 간접 접촉시 L929 세포 (5% FBS가 보충된 RPMI 배지에서 배양된 쥣과동물 섬유아세포)의 세포 생존율 (백분율)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 비처리 세포와 비교하여, 3개의 상이한 농도 (1.5, 2.85 및 5.91 cm3)의 HA/β-TCP와 간접 접촉시 hASC의 세포 생존율 (백분율)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 DBM (도 3a), HA/β-TCP (도 3b), HA (도 3c) 또는 β-TCP (도 3d)로 형성된 생체재료의 거시적 모습을 보여주는 일련의 사진이다.
도 4는 DBM (도 4a) 또는 HA/β-TCP (도 4b)로 형성된 생체재료의 현미경 모습을 보여주는 일련의 사진이다.
도 5는 DBM (좌측) 또는 HA/β-TCP (우측)로 형성된 생체재료의 헤마톡실린-에오신 (hematoxylin-eosin) (도 5a), 메이슨 트리크롬 (Masson's trichome) (도 5b), 폰 코사 (Von Kossa) (도 5c) 및 오스테오칼신 (osteocalcin) (도 5d) 염색을 보여주는 일련의 사진이다 (ND: 결정되지 않음).
도 6은 3개의 상이한 크기 (도 6a, 도 6b 및 도 6c)의 DBM (좌측) 또는 HA/β-TCP (우측)로 형성된 생체재료에 대한 마이크로-CT 분석을 보여주는 일련의 사진이다.
도 7은 DBM (좌측) 또는 HA/β-TCP (우측)로 형성된 생체재료의 IGF1 (진회색), VEGF (연회색) 및 SDF-1 (중간 정도의 회색) 함량을 보여주는 막대그래프이다.
도 8은 HA/β-TCP로 형성된 생체재료 및 DBM으로 형성된 생체재료의 MP 배지 및 MD 배지, 및 배양 배지에서의 2D 배양시 ASC에 의한 OPG 분비 (pg/106 세포)를 보여주는 막대그래프이다.
도 9는 HA/β-TCP, HA 및 β-TCP로 형성된 생체재료 및 DBM으로 형성된 생체재료의 MP 배지 및 배양에서의 2D 배양시 ASC에 의한 OPG 분비 (ng/g 재료)를 보여주는 막대그래프이다.
도 10은 NVD-1 (도 10a) 및 NVD-0 (도 10b)의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여주는 2장의 일련의 사진이다.
도 11은 MP (MP) 및 MD (MD) 중 ASC와 비교하여, HA/β-TCP로 형성된 본 발명의 생체재료 (생체재료) 중 유전자 FGFR1 (도 11a), IGFR1 (도 11b), RUNX2 (도 11c), TWIST1 (도 11d), TGFBR1 (도 11e), SMAD2 (도 11f), SMAD4 (도 11g), SMAD5 (도 11h)의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다. *: p<0.05, **:p<0.01, ***:p<0.001.
도 12는 MP (MP) 및 MD (MD) 중 ASC와 비교하여, HA/β-TCP로 형성된 본 발명의 생체재료 (생체재료) 중 유전자 ANG (도 12a), EFNA1 (도 12b), EFNB2 (도 12c), VEGFA (도 12d), FGF1 (도 12e), LEP (도 12f)의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다. *: p<0.05, **:p<0.01.
도 13은 저산소 (1%) 또는 정상산소 (21%)에서 MP (MP) 및 MD (MD)와 비교하여, HA/β-TCP로 형성된 본 발명의 생체재료 (생체재료) 중 VEGF (도 13a) 및 SDF-1α (도 13b) 분비를 보여주는 일련의 막대그래프이다.
도 14는 본 발명의 생체재료로부터 외식편의 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자에 대한 면역염색을 보여주는 사진이다. HA/β-TCP 입자는 기호 *로 표시되고, 혈관은 흑색 화살표로 표시된다.
도 15는 본 발명의 생체재료에서 혈관 영역 (백분율) (도 15a) 및 혈관 수/mm2 (도 15b)를 보여주는 일련의 막대그래프이다.
도 16은 랫트(rat)에서의 이식 후 28일째에 본 발명의 생체재료에서 과산화효소 노출에 의해 갈색으로 면역염색된 HLA/인간 백혈구 항원에 의해 밝혀진 인간 세포의 존재를 보여주는 사진이다 (여기서 흑색 화살표로 표시됨). HA/β-TCP 입자는 기호 *로 표시된다.
도 17은 본 발명의 생체재료 (좌측 상단 및 하단) 및 HA/β-TCP 입자 단독의 경우 (우측 상단 및 하단)의 랫트에서 이식 후 1개월째의 대퇴골의 마이크로 CT 스캔을 보여주는 일련의 사진이다. 하단 사진은 상단 사진이 확대된 것이다. 점선 사각형은 이식 부위를 나타낸다.
도 18은 HA/β-TCP 입자의 이식 후 1개월째에 골 결손의 조직학을 보여주는 일련의 사진이다: 헤마톡실린-에오신 염색, 원 배율 x5 (도 18a); 메이슨 트리크롬 염색, 원 배율(original magnification) x20 (도 18b). 백색 화살표는 산물의 비 혼입 및 주 섬유증을 나타낸다. 흑색 화살표는 천연 골과 HA/β-TCP의 이식재 사이의 경계면에서 결손에 연골내 골화가 부재함을 나타낸다.
도 19는 본 발명의 생체재료 이식 후 1개월째의 골 결손의 조직학을 보여주는 일련의 사진이다: 헤마톡실린-에오신 염색, 원 배율 x5 (도 19a); 메이슨 트리크롬 염색, 원 배율 x20 (도 19b); HLA-I 면역염색, 원 배율 x10 (도 19c). 백색 화살표는 산물 및 골 융합의 혼입을 나타낸다. 흑색 화살표는 골 유합 과정을 나타내는 천연 골과 생체재료 사이의 직접 접촉시 연골내 골화를 나타낸다.
도 20은 골분화 배지 중 배양 2.5주 (도 20a) 및 배양 7.5주 (도 20b)째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G) 및 ASC로 형성된 생체재료의 거시적 모습을 보여주는 일련의 사진이다.
도 21은 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G) 및 ASC로 형성된 생체재료의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여주는 일련의 사진이다. 원 배율 x5 (도 21a), 확대 x10 (도 21b).
도 22는 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G) 및 ASC로 형성된 생체재료의 폰 코사 염색을 보여주는 일련의 사진이다. 원 배율 x5 (도 22a), 확대 x10 (도 22b).
도 23은 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G) 및 ASC로 형성된 생체재료의 오스테오칼신 발현을 보여주는 일련의 사진이다. 원 배율 x5 (도 23a), 확대 x10 (도 23b).
도 24는 MP (MP)의 ASC와 비교하여 골분화 배지 중 ASC 및 Cultipher G (생체재료)로 형성된 본 발명의 생체재료 중 유전자 ANG (도 24a), ANGPT1 (도 24b), EPHB4 (도 24c), EDN1 (도 24d), THBS1 (도 24e), PTGS1 (도 24f), LEP (도 24g), VEGFA (도 24h), VEGFB (도 24i), VEGFC (도 24j), ID1 (도 24k) 및 TIMP1 (도 24l)의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다. *: p <0.05.
도 25는 골분화 배지에서 상이한 성숙 수준의 ASC 및 Cultipher G로 형성된 본 발명의 생체재료를 보여주는 일련의 사진이다: 4주 (도 25a), 8주 (도 25b), 12주 (도 25c) 및 25주 (도 25d). 무기질화는 투명하게 표시된 3D 기질에 황색으로 표시된다.
도 26은 이식 후 29일째에 누드 랫트에서 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체재료의 "이식재 부위"의 방사선 사진이다.
도 27은 이식 후 29일째에 Wistar 랫트에서 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체재료의 "이식재 부위"의 방사선 사진이다.
도 28은 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체재료의 폰 코사 염색을 보여주는 사진이다.
도 29는 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher S) 및 ASC로 형성된 생체재료의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여주는 사진이다.
도 30은 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher S) 및 ASC로 형성된 생체재료의 누드 랫트에 이식한 후 29일째의 폰 코사 염색을 보여주는 사진이다.
도 31은 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체재료 (도 31a) 및 입자 단독의 경우 (도 31b)의 이식 후 29일째에 누드 랫트에서 "이식재 부위"의 방사선 사진을 보여주는 일련의 사진이다.
도 32는 이식의 부재 하 (도 32a), Cultispher S 입자 단독의 경우의 이식 후 (도 32b) 및 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher S) 및 ASC로 형성된 생체재료의 이식 후 (도 32c)의 0일 (D0), 15일 (D15), 23일 (D23) 및 34일 (D34)의 랫트 다리의 상처 치유를 보여주는 일련의 사진이다.
도 33은 100%로 고정된 모의 실험과 비교하여 평가된 것으로, 처리되지 않거나 (모의), Cultispher S 입자 단독 (Cultispher) 또는 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher S) 및 ASC로 형성된 생체재료 (생체재료)로 처리된 비-허혈성 다리의 상처 크기에 대한 곡선하면적 (AUC)을 보여주는 막대그래프이다.
도 34는 Cultispher S 입자 단독 (사각형) 또는 골분화 배지에서 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher S) 및 ASC로 형성된 생체재료 (원)로의 처리 후 또는 처리되지 않은 경우 (모의, 삼각형)의 0 내지 34일째의 상처 영역 (백분율)을 보여주는 그래프이다.
도 35는 Cultispher S 입자 단독 (점 처리 막대그래프) 또는 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (Cultispher S) 및 ASC로 형성된 생체재료 (흑색 막대그래프)의 처리 후 또는 처리되지 않은 경우 (모의, 사선 처리 막대그래프)의 1, 5, 15 및 34째의 비-허혈성 다리의 코어의 표피 점수 (도 35a), 비-허혈성 다리의 주변의 표피 점수 (도 35b), 비-허혈성 다리의 코어의 진피 점수 (도 35c) 및 비 허혈성 다리 주변의 진피 점수 (도 35d)를 보여주는 일련의 막대그래프이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1: 본 발명의 생체재료의 생성
hASC의 단리
정보에 입각한 동의 및 혈청학적 스크리닝 후에 복부 영역에서 Coleman 기술에 따라 지방 흡인함으로써, 인간 피하 지방 조직을 수확하였다.
인간 지방 유래 줄기세포 (hASC)를 유입 지방 조직으로부터 신속하게 단리하였다. 지방흡인물은 +4℃에서 24시간 동안 또는 -80℃에서 더 장기간 동안 저장할 수 있다.
먼저, 품질 제어를 위해 일 분량의 지방흡인물을 단리하고, 지방흡입물의 잔여 부피를 측정하였다. 이어서, 지방흡입물을 HBSS 중 제조된 콜라게나제 용액 (NB 1, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) (최종 농도는 약 8 U/mL임)에 의해 분해시켰다. 분해에 사용된 효소 용액의 부피는 지방 조직 부피의 2배였다. 분해를 37℃ ± 1℃에서 50 내지 70분 동안 수행하였다. 첫 번째 간헐적인 진탕을 15 내지 25분 후에 수행하였고, 두 번째는 35 내지 45분 후에 수행하였다. MP 배지 (증식 배지 또는 성장 배지)를 첨가하여 분해를 중지시켰다. MP 배지는 5% 인간 혈소판 용해물(hPL) (v/v)이 보충된 DMEM 배지 (4.5 g/L 글루코스 및 4 mM Ala-Gln; Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Germany)를 포함하였다. DMEM은 염, 아미노산, 비타민, 피루베이트 및 글루코스를 포함하고, 탄산염 완충액으로 완충되었으며, 생리학적 pH (7.2 내지 7.4)를 갖는 표준 배양 배지이다. 사용된 DMEM은 Ala-Gln을 포함하였다. 인간 혈소판 용해물(hPL)은 중간엽 줄기세포 (예를 들어, hASC)의 시험관내 성장을 자극하는데 사용되는 풍부한 성장 인자 공급원이다.
분해된 지방 조직을 원심분리하고 (500 g, 10분, 실온), 상청액을 제거하였다. 펠렛화된 기질 혈관 분량 (SVF)을 MP 배지에 재현탁시키고, 200 내지 500 μm 메쉬 필터를 통과시켰다. 여과된 세포 현탁액을 두 번째로 원심분리하였다 (500 g, 10분, 20℃). hASC를 포함하는 펠렛을 MP 배지에 재현탁시켰다. 세포 계수를 위해 소 분량의 세포 현탁액을 유지시킬 수 있고, 나머지 모든 세포 현탁액을 사용하여 하나의 75 cm2 T-플라스크에 시딩하였다 (계대 P0로 지칭됨). 시딩된 세포의 수를 추정하기 위해 세포 계수를 수행하였다 (단지 정보용임).
단리 단계 다음 날 (1일), 성장 배지를 75 cm2 T-플라스크로부터 제거하였다. 세포를 인산염 완충액으로 3회 세정한 후, 새로 제조된 MP 배지를 플라스크에 첨가하였다.
인간 지방 유래 줄기세포의 성장 및 확장
증식 단계 동안, 후속 과정 단계를 위해 충분한 양의 세포를 수득하기 위해 hASC를 4회 계대시켰다 (P1, P2, P3 및 P4).
P0와 제4 계대 (P4) 사이에, 세포를 T-플라스크에서 배양하고, 새로운 MP 배지를 공급하였다. 70% 이상 100% 이하의 컨플루언스에 도달했을 때 (표적 컨플루언스: 80 내지 90%), 세포를 계대시켰다. 1 배치 (batch)로부터의 모든 세포 배양 수용체를 동시에 계대시켰다. 각각의 계대에서, 재조합 동물-무함유 세포 해리 효소인 TrypLE (Select 1X; 75 cm2 플라스크의 경우 9 mL 또는 150 cm2 플라스크의 경우 12 mL)를 사용하여 세포를 배양 용기로부터 분리하였다. TrypLe 분해를 37℃ ± 2℃에서 5 내지 15분 동안 수행하고, MP 배지의 첨가에 의해 중지시켰다.
이어서, 세포를 원심분리하고 (500 g, 5분, 실온), MP 배지에 재현탁시켰다. 균일한 세포 현탁액이 되도록 하기 위해 수확된 세포를 풀링 (pooling)하였다. 재현탁 후, 세포를 계수하였다.
그 후, 계대 P1, P2 및 P3에서, 남아있는 세포 현탁액을 MP 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석하고, 더 큰 조직 배양 표면에 시딩하였다. 이 단계에서, 75 cm2 플라스크에 15 mL의 세포 현탁액 부피를 시딩하고, 150 cm2 플라스크에 30 mL의 세포 현탁액 부피를 시딩하였다. 각각의 계대에서, 세포를 0.5x104 내지 0.8x104 세포/cm2로 시딩하였다. 상이한 계대 사이에, 배양 배지를 3 내지 4일마다 교체하였다. 하나의 공여체와 다른 공여체 간에 세포 거동 및 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 두 계대 사이의 지속기간 및 계대 사이의 배지 교체 횟수는 공여체마다 상이할 수 있다.
골형성 분화
계대 P4 (즉, 제4 계대)에서, 세포를 두 번째로 원심분리하고, MD 배지 (분화 배지)에 재현탁시켰다. 재현탁 후, 세포를 두 번째로 계수한 후, MD 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석하고, 70 mL의 세포 현탁액 부피를 150 cm2 플라스크에 시딩하고, 골형성 MD 배지를 공급하였다. 이 방법에 따르면, 제4 계대 후, 세포를 골형성 MD 배지에 직접 배양하였다. 따라서, 세포가 컨플루언스에 도달하지 않은 동안에는 골형성 MD 배지를 첨가하였다.
골형성 MD 배지는 덱사메타손 (1 μM), 아스코르브산 (0.25 mM) 및 인산나트륨 (2.93 mM)이 보충된 증식 배지 (DMEM, Ala-Gln, hPL 5%)로 구성되었다.
하나의 공여체와 다른 공여체 간의 세포 거동 및 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 골형성 분화 단계의 지속기간 및 계대 사이의 배지 교체 횟수는 공여체마다 상이할 수 있다.
세포의 다차원 유도
3D 유도는 세포가 컨플루언스에 도달한 때 및 형태학적 변화가 나타난 경우, 및 플라스크 내에 적어도 하나의 골상 결절 (골 조직의 성숙 전에 형성되는 골 기질의 비무기질화 유기 부분)이 관찰된 경우에 3D 유도를 개시하였다.
골형성 MD 배지에 노출시킨 후, 부착성 골형성 세포의 컨플루언스 단층을 포함하는 배양 용기에 다양한 생체적합성 재료를 서서히 균일하게 분무하였다:
- DBM: 150 cm2 플라스크 (RTI Surgical, United-States)당 1000 내지 1200 mg ± 10%,
- HA/β-TCP 입자: 150 cm2 플라스크 (Teknimed, France)당 1.5 cm3, 65/35의 비율,
- HA 입자: 150 cm2 플라스크 (Biocetis, France)당 1.5 cm3, 또는
- β-TCP 입자: 150 cm2 플라스크 (Biocetis, France)당 1.5 cm3.
세포를 MD 배지에서 유지시켰다. 다차원 유도 동안 3 내지 4일마다 주기적인 배지 교체를 수행하였다. 생체적합성 재료 입자의 제거 및 구조 (들)의 생성을 주의깊게 방지하여, 이러한 배지 교체를 수행하였다.
실시예 2: 생체재료의 특성화
재료 및 방법
세포독성
세포독성을 L929 세포 (5% FBS가 보충된 RPMI 배지에서 배양된 쥣과동물 섬유아세포)에서 평가하였다. 이어서 트랜스웰 (Transwell) 삽입물 절차를 수행하여, 세포독성을 분석하였다.
이 방법의 목적은 간접 세포-재료 접촉의 독성 (배양 배지에서 침출성 화학물질의 확산)을 평가하는 것이었다. 이 방법에서, hASC 및 L929 세포에 8000 세포/cm2 (웰당 15200개의 세포)로 시딩하고, 72시간 동안 2개의 24웰 플레이트에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포가 컨플루언스에 도달했을 때, 배양 배지를 제거하고, 생체적합성 재료를 하부 미세다공성 막을 포함하는 트랜스웰 삽입물에 로딩하고:
- 6.6 mg/cm2의 DBM,
- 3가지의 상이한 양의 HA/β-TCP: 150 cm2 용기당 1.5 cm3, 2.85 cm3 및 5.91 cm3,
- 150 cm2 용기당 1.5 cm3의 HA 입자, 또는
- 150 cm2 용기당 1.5 cm3의 β-TCP 입자,
이어서 각각의 개별 웰에 배치하여, 24시간 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 공급자의 지침에 따라 증식 및 세포독성 분석 (Sigma)에서 생존 세포 수의 정량화를 위해 "CCK-8 키트"를 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. 요약하면, 배양 배지를 제거하고, 100 μL의 CCK-8 용액 부피를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 혼합물을 37℃/5% CO2에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 복합 세포 메커니즘에 의해 안정한 테트라졸륨 염을 가용성 포르마잔 염료로 절단한다. 이 생체환원은 생존 세포에서 주로 NAD(P)H의 해당 과정 생성에 따른다. 따라서, 형성된 포르마잔 염료의 양은 배양물 중 대사 활성 세포의 수와 직접적으로 관련된다. 포르마잔 염료의 양을 분광광도계 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정함으로써 평가한다.
상대 세포 생존율 (%)을 비처리 대조군 세포에 대한 백분율로 표시하였다. 이를 다음과 같이 측정하였다:
(OD - 블랭크)비처리: 음성 대조군 (비처리 세포)의 (OD - 블랭크)의 평균.
생체적합성 재료가 분무되지 않은 세포를 음성 대조군 (비처리 세포)으로 사용하였다. 트리톤 1% 용액으로 처리된 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.
조직학적 분석
생체적합성 입자의 첨가 후, 4주 및 8주째에 MD 배지 내의 구조의 생검을 취하였다.
세포외 기질의 구조/세포충실성/존재
조직의 구조, 세포충실성 및 세포외 기질의 존재를 헤마톡실린-에오신 및 메이슨 트리크롬 염색 후, 평가하였다.
골-분화 및 무기질화
조직의 골 분화 및 무기질화를 오스테오칼신 (오스테오칼신 항체, 희석 1/200, ref ab13418, Abcam) 및 마이크로-CT에서 각각 평가하였다.
Skyscan 1172G (Bruker) (Erwan Plougonven, ULg, Lieege)를 사용하여 수득을 수행하였다. Bruker 마이크로CT 소프트웨어인 NRecon, v.1.6.10.1에서 재구성을 수행하였다. 조정 후, 약 1700x1700x700 복셀(voxel)(3D 픽셀)의 3D 이미지를 재구성하였다. 위에 표시된 해상도에서 복셀의 부피는 985 μm3이다. 감쇠 영역의 평균 부피 및 두께 측정치를 총 부피의 %로 기록하였다. 감쇠 영역을 무기질화된 영역으로 병합시켰다.
성장 인자 함량
형성된 조직의 생체활성을 평가하기 위해, 단백질 추출 및 정량화를 위해 생체적합성 입자를 첨가한 후, 4주 및 8주째에 생검을 수행하였다. 총 단백질 및 성장 인자 함량을 공급자의 지침에 따라 비색계 (BCA 단백질 분석 키트, ThermoFisher Scientific) 및 BMP2, BMP7, VEGF, SDF1α, IGF1에 대한 ELISA (인간 Quantikine ELISA kits, RD Systems)로 정량화하였다.
파골세포 활성
배양물 (MD 배지 또는 MP 배지) 중 ASC 및 다차원 배양물 중 ASC (약 8주 동안 DBM 또는 HA/βTCP의 첨가에 의해 유도됨)로부터의 상청액을 hPL-무함유 조건에서 72시간 배양 후에 수확하고, 추가 정량화를 위해 -20℃에서 직접 저장하였다. 생체적합성 입자 단독의 경우의 단백질을 또한 추출하여, OPG 및 RANKL 수준을 정량화하였다.
OPG 및 RANKL을 공급자의 지침에 따라 ELISA 키트 (인간 TNFSF11/RANKL/TRANCE ELISA 키트; 인간 오스테오프로테게린 ELISA 키트; LS Bio)를 사용하여 정량화하였다.
결과
세포독성
DBM에 대해서는 세포독성이 검출되지 않았다. 트랜스웰 삽입물 절차를 이용하여 DBM으로 세포를 24시간 동안 배양했을 때, 세포 생존율 (백분율)의 증가가 관찰되었다 (최대 170.3%, 도 1).
저농도 (10 mg/cm2)에서, hASC와 HA/β-TCP 입자의 간접적인 접촉은 세포 생존율을 향상시켰다 (세포 단독의 경우와 비교하여 111.1%의 세포 생존율). 이와 달리, 19 및 39.4 mg/cm2의 농도는 각각 10 및 52.3%의 세포 생존율을 감소시켰다 (도 2).
조직학적 분석
생체적합성 입자와의 인큐베이션 4주 또는 8주 후, 구조 간에 유의한 차이가 발견되지 않았다.
세포외 기질의 구조/세포충실성/존재
생체적합성 재료를 첨가하고 수 일 후, 골형성 세포 및 분산된 생체적합성 재료 입자는 점차적으로 세포외 기질의 무기질화에 관여하게 된다.
수 일 후, 골형성 세포 및 생체적합성 재료 입자는 각 배양 용기로부터 분리되는 부분적으로 무기질화된 갈색-황색 성형성 퍼티(putty)의 대형 3차원 패치 (또는 소수의 소형 패치)를 형성하기 시작한다. 약 15일 후, 다차원 생체재료가 발생하여, 플라스크로부터 분리될 수 있다.
골형성 분화 배지에서 hASC 및 임의의 상이한 입자 (DBM, HA/β-TCP, HA 및 β-TCP)의 공동 배양에 의해 3D 구조의 형성이 나타났다. 이 구조는 겸자로 잡을 수 있으며, 기계적 강도에 저항성이다 (도 3).
두 조직에 모두에 대해 세포충실성이 유사한 것으로 나타났다: DBM으로 형성된 생체재료의 경우 253 ± 66 세포/mm2 (n=3) 및 HA/β-TCP로 형성된 생체재료의 경우 262 ± 205 세포/mm2 (n=7). DBM 또는 HA/β-TCP로 형성된 생체재료의 현미경 사진이 도 4 (각각 도 4a 및 도 4b)에 제시되어 있다.
헤마톡실린-에오신 및 메이슨 트리크롬 염색에 의한 조직학적 분석에 의해 세포와 입자 사이에 결합 조직이 존재하고, 입자는 두 조직 모두의 경우 세포화된 상호연결 조직에 혼입되어 있는 것으로 나타났다 (각각 도 5a 및 도 5b).
골-분화/무기질화
오스테오칼신 염색은 두 조직 모두의 세포외 기질에서 양성이었고 (도 5d), 이는 ASC의 골형성 세포로의 적절한 분화를 나타낸다.
마이크로-CT 분석 및 폰 코사 염색에 의해, HA/β-TCP로 형성된 생체재료의 경우 38.2% +/-12.3 (n=5), DBM으로 형성된 생체재료의 경우 1.9%의 무기질화 정도가 나타났다 (각각 도 6 및 도 5c).
성장 인자 함량
생체적합성 입자와의 인큐베이션 4주 또는 8주 후, 구조 간에 유의한 차이가 발견되지 않았다.
결과는 하기 표 1 및 도 7에 제시되어 있다.
본 발명의 생체재료의 성장 인자 함량 (ng/g 생체재료)
VEGF IGF1 SDF-1α
DBM 188 ± 99 19 ± 14 247 ± 209
HA/β-TCP 34 ± 57 94 ± 57 31 ± 24
HA 96.88 99.58 40.63
β-TCP 75.28 89.78 51.70
본 발명의 생체적합성 입자로 형성된 모든 생체재료는 VEGF, IGF1 및 SDF-1α를 포함한다. 그럼에도 불구하고, SDF-1α의 함량은 VEGF 및 IGF1의 함량보다 더 낮다. 모든 조직에서 BMP2 또는 BMP7이 검출되지 않았다.
파골세포 활성
MP/MD 배지 중 hASC, DBM으로 형성된 생체재료, HA/β-TCP로 형성된 생체재료, HA로 형성된 생체재료 및 β-TCP로 형성된 생체재료에서 상청액 중 OPG/RANKL 분비를 정량화하였다.
RANKL이 검출되지 않았다. MP 또는 MD 배지 중 세포의 상청액에서 OPG가 발견되지 않았다.
이와 달리, 모든 3D 구조는 OPG를 분비하는 것으로 나타났다. DBM으로 형성된 생체재료는 약 1160 pg/106 세포를 분비하고, HA/β-TCP로 형성된 생체재료는 약 3010 pg/106 세포를 분비한다 (도 8). 그램 조직당 농도와 관련하여, DBM으로 형성된 생체재료는 약 15.5 ng/g을, HA/β-TCP로 형성된 생체재료는 약 30 ng/g을, HA로 형성된 생체재료는 약 76 ng/g을, β-TCP로 형성된 생체재료는 약 84 ng/g를 분비한다 (도 9).
DBM 단독 및 HA/β-TCP에 의한 OPG 분비를 또한 평가하였으며, 이는 거의 검출할 수 없는 수준으로 나타났다 (도 9).
실시예 3: 본 발명에 따라 형성된 생체재료 및 상이한 프로토콜에 따라 형성된 생체재료의 비교
재료 및 방법
조직 생성
2개의 상이한 공여체로부터 유래된 지방 줄기세포를 사용하여 조직을 제조하였다. 생체적합성 재료로서 DBM에 의해 실시예 1의 프로토콜에 따라 NVD-1을 제조하였다. NVD-0을 NVD-1 생성 프로토콜에 따라 제조하였지만, 다음 두 가지 중요한 수정 사항이 있다: (i) NVD-0의 경우, 배양 배지 (MP 및 MD)에 FBS 10%를 사용하고 (NVD-1의 배지 중 HPL 5% 대신), (ii) NVD-0 생성의 제4 계대에서, 세포를 증식 배지 (MP)에서 컨플루언스에 도달할 때까지 배양한 다음, 골형성 분화 및 DBM 입자의 첨가까지 MD에서 배양하였다 (NVD-1의 생성의 경우, 제4 계대로부터 골형성 분화 및 DBM 입자의 첨가까지 MD 중 세포의 직접 배양 대신).
RTI Surgicals로부터의 DBM 입자를 NVD-1 및 NVD-0의 생성에 사용하였다. DBM 입자를 첨가하고 8주 후까지, 조직을 MD의 배양에 유지시켰으며 (NVD-1의 경우 5% HPL 또는 NVD-0의 경우 10% FBS), 배지를 3 내지 4일마다 교체하였다.
입자의 첨가 8주 후, 조직을 조직학적 분석, 생체활성 평가 및 무기질화 정량화에 의해 특성화하였다. 또한, 하나의 공여체에 대한 단백질 분석을 수행하여, 세포에 의해 분비된 기질의 조성을 특성화하였다.
조직학적 분석
입자의 첨가 후 8주째에 조직 생검을 수행하였다. 생검을 포르몰에 고정시키고, 헤마톡실린-에오신 (당업자에 공지된 방법에 따른 HE 염색)을 위해 제조하였다. 조직을 조직학적으로 분석하고, 특성화하였다: HE 슬라이드상에서의 세포 계수 후, 기질의 세포충실성 및 효능 비율을 결정하였다.
시험관내 생체활성
형성된 조직의 생체활성을 평가하기 위해, 입자의 첨가 후 8주째에 각 조직의 3개의 생검을 채취하고, 중량을 측정하였다. 이들 27개의 생검을 72시간 동안 HPL 또는 FBS 부재 하에 MD에 배치하였다. 그 후, ELISA (BMP2, BMP7, IGF1, SDF1a, VEGF, OPG, RANKL)에 의해 분비된 성장 인자 정량화를 위해 상청액을 수확하였다.
단백질 추출 및 정량화를 위해 생검을 사용하였다. 공급자의 지침에 따라 총 단백질 및 성장 인자 함량을 각각 비색계 (Pierce BCA 단백질 분석 키트, ThermoFisher Scientific) 및 ELISA (VEGF, SDF1a, IGF1, BMP2, BMP7, OPG, RANKL (인간 Quantikine ELISA Systems))에 의해 정량화하였다.
결과
조직학적 분석
조직학적 분석 결과 (n=1)는 NVD-0과 비교하여 NVD-1에서 더 높은 세포충실성을 나타냈다. 조직에서 유사한 비율의 기질이 두 그룹 모두에서 발견되었지만, 표 2 및 도 10에 도시된 바와 같이 NVD-0과 비교하여, NVD-1에 대해 더욱 중요한 기질 밀도가 관찰되었다.
NVD-1 및 NVD-0의 세포충실성
세포충실성
(세포/mm 2 ) 		기질 영역
(%)
NVD-1 267 ± 103 51 ± 10
NVD-0 132 ± 65 56 ± 13
시험관내 생체활성
NVD-1과 NVD-0 사이에 유의한 차이가 발견되었으며, NVD-0과 비교하여 NVD-1에서 더 높은 VEGF 및 SDF1a뿐만 아니라, 더 낮은 IGF1 및 OPG 함량이 나타났다 (표 3). BMP2 및 RANKL은 정량의 하한 미만이었다.
NVD-1 및 NVD-0에서의 성장 인자 함량 (ng/g 생체재료)
VEGF IGF1 SDF-1α OPG RANKL BMP2 BMP7
NVD-1 121.3 ± 27.6 19.3± 4.0 194.8± 122.3 292.3± 104.3 <LOQ <LOQ 9.7± 4.0
NVD-0 48.7 ± 27.2 118.8 ± 41.1 16.85 ± 23.83 876.0± 628.9 <LOQ <LOQ 24.0 ± 12.2
<LOQ: 정량 한계 미만
실시예 4: 골형성 및 혈관형성 가능성
재료 및 방법
증식 배지(MP) 중 ASC(n=4, 4개의 상이한 인간 지방 조직 공여체), 분화 배지 (MD, 입자가 없는 기존의 골형성 배지에서 배양된 세포) 중 ASC (n=4, 4개의 상이한 인간 지방 조직 공여체) 및 1.5 cm3 HA/β-TCP로 형성된 생체재료 (n=4, 4개의 상이한 인간 지방 조직 공여체)로부터 Qiazol 용해 시약 (Qiagen, Hilden, Germany) 및 Precellys 균일화기 (Bertin instruments, Montigny-le-Bretonneux, France)를 사용하여, 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 Rneasy 미니 키트 (Qiagen, Hilden, Germany) 및 컬럼상의 DNase 분해를 추가로 사용하여 RNA를 정제하였다. RNA의 품질 및 양을 분광광도계 (Spectramax 190, Molecular Devices, California, USA)를 사용하여 측정하였다. 상업적으로 이용 가능한 PCR 어레이 (인간 RT2 Profiler Assay -Angiogenesis; 인간 RT2 Profiler Assay -Osteogenesis, Qiagen)를 통해 골형성 및 혈관형성 유전자 발현 프로파일에 대해 RT2 RNA 제1 가닥 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 0.5 μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 증폭 산물의 검출에는 ABI Quantstudio 5 시스템 (Applied Biosystems) 및 SYBR Green ROX Mastermix (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. △△CT 방법에 따라 정량을 수득하였다. 각 샘플의 최종 결과를 3개의 하우스키핑 유전자 (Housekeeping gene) (ACTB, B2M 및 GAPDH)의 발현 수준의 평균으로 정규화하였다.
mRNA 수준에서 골형성 및 혈관형성 유전자의 발현을 실시간 RT-PCR (인간 RT2 Profiler Array, Qiagen)을 사용하여 수행하였다.
결과
시험된 84개의 골형성 유전자 중 골격 발달에 관여하는 11개의 유전자 (ACVR1, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, CSF1, EGFR, FGFR1, IGFR1, RUNX2, TGFBR1, TWIST1), 3 전사 인자 (SMAD2, SMAD4, SMAD5), 2 성장 인자 (VEGFA, VEGFB) 및 3 세포 부착 분자 (ITGA1, ITGB1, ICAM1)가 MP 중 ASC 또는 MD 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 조절된 것으로 나타났다 (도 11).
골형성 관련 유전자의 발현을 촉진하고, 세포주기 진행을 조절하고, 골 미세환경을 개선하며, 연골세포 및 파골세포의 기능에 영향을 미치는 필수 골형성 특이적 전사 인자인 Runt-관련 전사 인자 2 (Runx2) (문헌[Bruderer M et al, Eur Cell Mater, 2014; Xu J et al, Am J Trans Res, 2015])는 MP 또는 MD 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 유의하게 더 높게 발현되었다 (도 11c).
골격 중간엽에서 발현되고, 골격 발달 동안 중간엽 세포 계통 분할의 제어에 중요한 역할을 하는 TWIST-관련 단백질 1 (TWIST1) (문헌[Johnson D et al. Mech Dev. 2000; Rice DP, et al. Mech Dev. 2000])은 MD 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 유의하게 더 높게 발현되었다 (p=0.09) (도 11d).
골형성의 주요 경로는 형질전환 성장 인자-베타/골 형태형성 단백질 (TGF-b/BMP) 경로이다. TGF-b (TGFBR1 활성화를 통함)는 SMAD와 같은 세포내 신호전달 단백질을 활성화시킨다. 이들 인자는 TGF-베타-조절된 유전자의 전사를 조절함으로써, 골형성 유전자 전사를 활성화하여, 골아세포 분화를 촉진시킨다 (문헌[Song B, Cytokine Growth Factor Rev. Author, 2010]). 흥미롭게도, MD 중 ASC와 비교하여, 본 발명의 생체재료에서 TGFBR1 및 SMAD2/5 mRNA의 발현이 더 높은 것으로 나타났다 (도 11e 내지 도 11h).
MP, MD 및 본 발명의 생체재료 중 ASC에 대해 시험된 84개의 혈관형성 유전자 중에서, 6개의 유전자는 성장 인자 (ANG, EFNA1, EFNB2, VEGFA, FGF1, TGFB1)와 관련되었고, 2개의 ECM 분자 (LEP, TIMP1) 및 2개의 세포 부착 분자 (ENG, THBS1)가 조절되었다 (도 12).
MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 안지오포이에틴 (angiopoietin) (ANG) mRNA의 발현이 유의하게 더 높은 것으로 나타났다 (도 12a). 안지오포이에틴 신호전달은 기존 혈관에서 신생 동맥 및 정맥이 형성되는 과정인 혈관형성을 촉진한다 (문헌[Fagiani E et al, Cancer Lett, 2013]).
또한, 배아 발생 및 성인 조직에서 혈관형성을 조절하는 에프린 A1 (Ephrin A1) (EFNA) mRNA (문헌[Pasquale EB. et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2005])는 MP 및 MD 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 높게 발현되는 것으로 나타났다 (도 12b 및 도 12c).
혈관 내피 성장 인자 A mRNA (VEGFA)의 발현은 또한 MP 또는 MD 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료 중 ASC에 대해 유의하게 개선되었다 (도 12d). VEGF는 혈관 발달 및 혈관형성의 조절을 위한 가장 중요한 성장 인자 중 하나이다. 골은 고도로 혈관화되는 기관이기 때문에 (혈관형성에 의해 골형성에 중요한 조절 인자), VEGF는 또한 골격 발달 및 출생 후 골 복원에 긍정적인 영향을 미친다 (문헌[Hu K et al, Bone 2016]).
섬유아세포 성장 인자 1 (FGF1) mRNA, (유력한 혈관형성 촉진 인자, 문헌[Murakami M et al, Curr Opin Hematol 2009]) 및 렙틴 (Leptin) (LEP) mRNA (혈관형성의 주요 증강제 및 VEGF의 발현의 유도제); 문헌[Bouloumie A et al, Circ. Res. 1998; Sierra-Honigmann MR et al, Science (New York, N.Y.) 1998])의 발현이 또한 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 과발현되었다 (각각 도 12e 및 도 12f).
결론적으로, 본 발명의 생체재료는 골 분화 능력 및 이식 후 세포 생착을 위해 혈관형성을 촉진하는 능력을 분자 수준으로 발현하는 세포의 존재 (3D 구조)에 의해 골형성으로 규정될 수 있다.
실시예 5: 이식 후, 섬유성 환경에서 혈관형성 및 골형성 촉진
4.1. 시험관내
조직 손상의 가장 흔한 요소 중 하나는 저산소의 존재이다. 간질 손상은 종종 응고 전달계의 활성화와 관련되어 저산소 영역을 유발한다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 본 발명의 생체재료가 이식 후, 혈관화의 주요 성장 인자인 VEGF를 분비하는 능력을 평가하였다 (문헌[Madrigal M et al., J Transl Med. 2014 Oct 11;12:260]). 다양한 조직에서 산소 장력의 감소는 저산소 유도 인자 (HIF-1α)의 활성화를 유도하여, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (문헌[Ahluwalia A et al., Curr Med Chem. 2012;19(1):90-97; Hawkins KE et al., Regen Med. 2013;8(6):771-782])뿐만 아니라, MSC 화학유인 기질세포 유래 인자 1 (SDF-1α) (문헌[Youn SW et al., Blood. 2011;117:4376-4386. Ceradini DJ et al., Nat Med. 2004;10(8):858-864])과 같은 혈관형성 유전자의 전사를 유도하는 것으로 공지되어 있다.
재료 및 방법
생체재료의 혈관형성 촉진 특성에 대한 저산소 농도의 영향을 평가하기 위해, 3개의 공여체로부터 ASC 및 1.5 cm3 HA/β-TCP로 형성된 생체재료를 PBS로 2회 세척하고, 6 웰-플레이트의 2중 반복실험에서 hPL 부재하 (배지 중 외인성 성장 인자를 방지하기 위함)에 10 mL의 골형성 분화 배지 (MD)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 72시간 동안 저산소 (1% O2) 또는 정상 산소 (21% O2), 5% CO2, 37℃에 배치하였다. 이어서 ELISA에 의해 VEGF 및 SDF-1α 정량화를 위해 상청액을 수확하였다.
또한, 6 웰-플레이트의 2중 반복실험에서 3개의 공여체로부터의 계대 4의 컨플루언스 ASC를 PBS로 2회 세척하고, hPL의 부재하에 72시간 동안 저산소 (1% O2) 또는 정상 산소 (21% O2), 5% CO2, 37℃에서 5 또는 10 mL의 증식 배지 (MP) 또는 골형성 분화 배지 (MD)에 배치하였다. 이어서 ELISA에 의해 SDF-1α뿐만 아니라, VEGF 정량화를 위해 상청액을 수확하였다.
결과
2D (MP 및 MD)에서 세포에 의한 VEGF 분비가 저 산소 장력에서 증가하였으나 (각각 1 vs 21% O2에서 MP 중 242 ± 51 vs 29 ± 27 pg/105 세포 및 MD 중 565 ± 507 vs 182 ± 216 pg/105 세포 (p<0.05)), VEGF 분비에 대한 저산소의 영향이 본 발명의 생체재료의 경우에는 나타나지 않았다 (각각 1 vs 21% O2에서 760 ± 594 vs 806 ± 530 pg/105 세포) (도 13a). 따라서, 저 산소 장력은 본 발명의 생체재료의 사용의 제한 인자가 아니다.
또한, 1 및 21% O2 조건 둘 모두에서 MP 및 MD 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 더 높은 VEGF 분비가 나타났다 (도 13a).
저산소 유발 실험 후, MD 중 ASC에 대해 SDF-1α 분비의 자극이 관찰되었지만 (p=0.009), 21% O2에서 MP 및 MD 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에 의해 유의하게 더 많은 양의 SDF-1α가 방출되었다 (각각 p=0.013 및 0.025) (도 13b).
또한, 1% O2에서 ASC MP 및 본 발명의 생체재료와 비교하여 ASC MD에 대해 더 낮은 분비가 나타났다 (각각 p=0.009 및 0.013) (도 13b).
저 산소 장력 (섬유질 조직에서 나타나는 1% 산소)에 본 발명의 생체재료의 노출에 의해 혈관신생의 주요 효과기를 분비하는 ASC의 능력이 밝혀졌다. 2차원에서 배양된 증식/골형성 배지 중 ASC와 비교하여, 세포외 기질에 의한 3차원의 ASC, 즉 본 발명의 생체재료의 경우, 분비량이 더 많았다 (저산소 및 정상 산소 두 경우 모두).
4.2. 생체내
저산소 조건에서 본 발명의 생체재료의 생체활성을 결정하기 위해, 근육 괴사의 전임상 모델을 수행하였다. 문헌[Schubert et al. (Biomaterials, 2011;32(34):8880-91])에 예시된 변위 모델은 생체재료의 생체활성을 조사하기 위한 금 표준 모델이며, 소작된 척추 주위 근육으로 구성된 주머니 내에 요추 영역 내의 시험 항목 (생체재료)의 이식으로 구성된다.
재료 및 방법
누드 랫트(nude rat)에 대해 2개의 실험을 수행하여, 임의의 이식편 거부를 방지하면서, 본 발명의 생체재료 (인간 유래)을 이식할 수 있었다.
이식 후 1개월째에 조직 재형성에 대한 본 발명의 생체재료의 역할을 평가하기 위해, 제1 실험을 설계하였다. 분자 수준에서 조직 재형성 (이식 후 29일째)을 평가하기 위해, 제2 실험을 설계하였다.
두 실험 모두에서, 생체재료를 10마리의 누드 랫트에 양측으로 이식하였다. 이식된 부피는 대략 0.3 cm3 (500 mg 또는 4.7*106 세포에 해당)의 생체재료이었다.
제1 실험에서, 이식 후 28일째에, 폰 빌레브란트(von Willebrand)에 대한 면역염색 후, 조직 외형 측정에 의해 혈관형성을 정량화하고, 인간 세포의 존재를 HLA에 대한 면역조직화학에 의해 평가하였다.
제2 실험에서, 이식 후 29일째에, 인간 세포의 존재를 HLA에 대한 면역조직화학에 의해 평가하였고, 이식재의 혈관재생을 메이슨 트리크롬 염색에 따른 조직 외형 측정 분석에 의해 평가하였다.
또한, Qiazol 용해 시약 (Qiagen, Hilden, Germany) 및 Precellys 균일화기 (Bertin instrument, Montigny-le-Bretonneux, France)를 사용하여 외식편으로부터 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 Rneasy 미니 키트 (Qiagen, Hilden, Germany) 및 컬럼상의 DNase 분해를 추가로 사용하여 RNA를 정제하였다. RNA의 품질 및 양을 분광광도계 (Spectramax 190, Molecular Devices, California, USA)를 사용하여 결정하였다. 상업적으로 이용 가능한 PCR 어레이 (인간 RT2 Profiler Assay-Angiogenesis; 인간 RT2 Profiler Assay-Osteogenesis, Qiagen)를 통해 골형성 및 혈관형성 유전자 발현 프로파일에 대해 RT2 RNA 제1 가닥 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 0.5 μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 증폭 산물의 검출에는 ABI Quantstudio 5 시스템 (Applied Biosystems) 및 SYBR Green ROX Mastermix (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. △△CT 방법에 따라 정량을 수득하였다. 각 샘플의 최종 결과를 3개의 하우스키핑 유전자 (ACTB, B2M 및 GAPDH)의 발현 수준의 평균으로 정규화하였다.
이식 후 29일째에 본 발명의 생체재료로부터 수득된 외식편 사이에 골형성 유전자 발현을 비교하였다. 이어서, 84개의 골형성 유전자를 외식편에 대해 시험하였다.
결과
제1 실험
이식 후 1개월째에, 생체재료 내부의 혈관 내성장(ingrowth)의 존재가 확인되었다 (도 14).
혈관 표면적 및 혈관의 수/mm2의 결과는 도 15에 제시되어 있다.
본 발명의 생체재료에 인간 세포의 존재에 의해 본 발명의 생체재료 중 인간 ASC가 괴사성 숙주 조직 내에서 생존 (이후 근육 영역/이식 부위의 소작)하는 능력이 입증되었다 (도 16).
제2 실험
이식 후 29일째에, 본 발명의 생체재료 중 인간 세포의 존재가 입증되었다 (데이터 미제시).
생체활성의 제1 실험에서 전술한 바와 같이, 이식 후 29일째에 이식재의 혈관 재생이 확인하였다 (데이터 미제시).
생체내 실험에 의해 산물 내부의 혈관형성을 유도하는 본 발명의 생체재료의 능력이 밝혀졌다.
실시예 6: 골 결손의 치료
골형성에서 본 발명의 생체재료의 효능을 연구하기 위해, 랫트 모델에서 임계 크기의 골 결손을 설계하였다. 이 모델은 문헌에 적절하게 기재되어 있다 (문헌[Saxer et al., Stem Cells 2016 - Manassero et al., Journal of Visualized Experiments 2016]).
재료 및 방법
임의의 T-세포 면역 반응을 방지하기 위해, 수컷 누드 랫트를 본 발명의 인간 생체재료의 수용체로 선택하였다. 간단히 말해, RatFix System® (RISystem - Switzerland)을 사용하여 랫트의 대퇴골에서 임계 크기의 골 결손을 14마리의 누드 랫트 (각각 HA/β-TCP 입자 단독 및 생체재료에 대해 7마리의 수용체의 2개의 그룹)에서 수행하였다. 5 mm의 결손을 생성하고, 나사로 고정된 플레이트를 적용하여 대퇴골의 2개의 절편(segment)을 결합하였다.
골 결손 유도 3주 후, 골 결손의 비가역성을 평가하고, 임의의 자발적인 골 재생을 방지하기 위해 방사선 촬영을 수행하였다.
누드 랫트 수용체 (골 결손 지속 및 임의의 고정 물질 파손 부재)에 HA/β-TCP 입자 (500 mg에 해당하는 총 부피 0.344 cm3) 또는 ASC 및 1.5 cm3의 HA/β-TCP 입자로 형성된 본 발명의 생체재료 (4.7*106개의 세포의 500 mg에 해당하는 0.313 cm3의 총 부피)를 이식하였다.
이식 후 1개월째에, 이식재 혼입 및 골 융합 수준을 평가하기 위해 각 동물에 대해 마이크로CT-스캔 및 조직학 분석을 수행하였다.
결과
이식 후 1개월째에, 본 발명의 생체재료가 대퇴골의 두 절편 사이에 완전히 혼입되어, 이중 피질골 융합 (2개의 대퇴골 피질 구조의 연속)이 수행되고 (도 15, 좌측 상부 및 하부), HA/β-TCP 입자 단독의 경우는 골 결손에 배치되었고, 혼입은 이루어지지 않았다 (도 17, 우측 상부 및 하부). 실제로, 피질골과 HA/β-TCP 입자 사이의 가교는 발견되지 않았으며, 양측 피질 융합 (도 17, 우측 하부에 *로 표시됨) 및 대퇴부 결손 말단의 위축성 양상이 부재하였다.
이들 결과를 조직학에 의해 확인하였다 (도 18 및 도 19). HA/β-TCP 입자 단독의 경우의 이식 후 1개월째에 산물이 혼입되지 않았고, 현저한 섬유증이 관찰되었다 (도 18a, 백색 화살표). 천연 골과 HA/β-TCP의 이식재 사이의 계면의 결손에 연골내 골화는 발견되지 않았다 (도 18b, 흑색 화살표). 본 발명의 생체재료의 이식 후 1개월째에, 산물 및 골 융합의 혼입이 관찰되었다 (도 19a, 백색 화살표). 연골내 골화는 천연 골과 생체재료 사이에 직접 접촉하여 발견되며, 골 융합 과정을 나타낸다 (도 19b, 흑색 화살표). HLA-I 염색은 인간 세포의 존재를 나타낸다 (도 19c).
이러한 생체내 연구에 의해 (i) 저산소 환경에서 골형성을 개선시키는 본 발명의 생체재료의 능력 및 (ii) 임계 크기의 골 결손과 관련하여 골 융합을 수행하는 능력이 입증되었다. 본 발명의 생체재료는 HA/β-TCP 입자 단독의 경우와 비교하여 골형성 및 골 재형성과 관련하여 그 우수성을 입증하였다.
실시예 7: 척추 융합 랫트 모델에서 생체재료의 연구 (연구 CP-2017025-생체분포 아암 (Biodistribution arm))
연구 목적
GLP-준수 연구 (연구 CP-2017025)는 (i) 연구 산물의 의도된 임상 사용과 관련된 조건에 따른 관련 동물 모델에서의 생체재료의 일반적인 독성 (이른바 "CP-2017025-독성학 아암") 및 (ii) 연구 세포의 생체분포 및 이소성 조직의 잠재적인 연속 발달 (이른바 "CP-2017025-생체분포 아암")을 평가하는 2가지 목적을 위해 수행되었다.
면역적격(immunocompetent) 동물에서 예상되는 바와 같이, 인간 세포의 거부 반응을 방지하기 위해 면역 결핍 (누드) 랫트 모델을 선택하였다. 척추 융합 수술 모델은 문헌[Wang et al., J. Bone and Joint Surg. 2003, 85:905-911]에 적절하게 기재되어 있기 때문에 관련 모델로 선택되었으며, 이는 유사한 조직 환경에서 대퇴골 골 결손보다 더 큰 이식 부피를 수용할 수 있다 (문헌[Belill et al., Comp. Med. 2014, 61(3):186-192]). 또한, 척추 융합 외과 수술 절차 동안 생성된 이식 환경은 대퇴골 골 결손과 같은 골 비유합 모델에서 생성된 환경과 비교할 때 매우 유사한 것으로 상정하였다.
연구 설계
"생체분포 연구 아암"의 목적을 위해, 이십 (20) 마리의 건강한 9주령 동형접합 누드 무흉선 랫트 (수컷 10마리 및 암컷 10마리; Hsd: RH-Foxn1 rnu/rnu)를 그룹 1 및 2에 무작위로 배정하였다 (그룹당 수컷 5마리 및 암컷 5마리) (표 4).
연구 (CP-2017025-생체분포 아암) 설계
그룹 랫트의 수 처리 투여량 투여 경로 처리 일정 희생일
1 5마리의 수컷 및 5마리의 암컷 연구 생체재료 1.1x107 척추 주위: 2개의 부위 Q1DX1 D29
2 5마리의 수컷 및 5마리의 암컷 모의 조작 - D29
그룹 1의 동물을 하기 기재된 수술 절차에 따라 생체재료 (임상 배치(clinical batch)와 동일한 과정에 따라 제조된 하나의 배치)로 D0에서 처리하였다. 그룹 2의 동물을 생체재료로 처리하지 않았지만, D0에서 그룹 1의 동물과 동일한 수술 절차를 진행하였다.
Wang 등에 의해 기재된 수술 방법에 따라, 피부 및 근육을 5번 또는 6번 요추를 따라 절단 개방하였다. 등 근육을 나누고, 요추를 볼 수 있도록 분리하였다. L5 요추의 횡단 과정에서 둥근 골 결손이 발생하였다. 결손 직경을 2.0 mm, 1 mm 깊이로 제어하기 위해 일정한 직경의 드릴끝 날을 사용하여 골 결손 크기를 표준화하였다. 요추 양쪽에 결손이 존재하였다. 그룹 1의 동물의 경우, 생체재료 (각 0.56x107개의 세포를 포함하는 0.375 cm3의 2개의 조각)를 생성된 구멍 및 주변 영역에서 척추의 각 측면 (좌 및 우)에 이식하였다. 그 후, 등 근육 및 피부를 봉합하였다. 랫트 체중을 기준으로, 이러한 생체재료의 양은 상대적 안전성 한계 10 (250 g의 랫트 대 30 kg의 환자) 및 23.4 (250 g의 랫트 대 70 kg의 환자)를 나타낸다.
D29에서, 랫트를 희생시키고 부검을 수행하였다. 랫트 조직에서 생체재료 인간 세포의 존재를 검출하고, 정량화하기 위해, 총 게놈 DNA를 투여 부위, 골수, 뇌, 생식선, 심장, 내장, 신장, 간, 폐, 골격근 및 비장으로부터 추출한 후, 인간 Alu 요소 기반 qPCR 방법을 사용하여 분석하였다.
기관을 수집하고, 중량을 측정하고, DNA 추출까지 -80℃에서 유지하였다. 이어서, 기계적 방법을 사용한 후, DNA 추출에 의해 추출 완충액에서 조직을 완전히 균일화시켰다. 시험 랫트 조직 샘플 또는 대조군 랫트 조직 샘플의 게놈 DNA 125 ng에 의해 20 μl에서 qPCR 실험을 수행하였다. 각 샘플을 3중 반복실험으로 시험하였다. 랫트로부터 125 ng의 특정 조직 DNA 기질에 스파이킹 (spiking)된 인간 DNA의 20 fg (모든 기관의 정량의 하한) 또는 70 fg (골격의 정량 하한) 내지 7 ng (정량 상한)의 정량 범위에 대해 Alu 요소-기반 qPCR 방법을 검증하였다.
결과
인간 DNA는 동물 1 및 2의 동물의 골수, 뇌, 생식선, 심장, 내장, 신장, 간, 폐, 골격근 및 그룹 2의 동물의 투여 부위로부터의 샘플에서 정량 한계 이하에서 검출되지 않았다. 그룹 1의 동물의 모든 투여 부위 및 그룹 1의 10마리 동물 중 1마리의 심장에서 인간 DNA가 검출되었다.
생체재료 처리 랫트의 모든 이식 부위 이외에, 생체분포 목적으로 분석된 생체재료 처리 랫트 10마리 중 1마리의 심장에서 인간 DNA가 검출되었다. 설명할 수 없는 경우에도, 이 결과는 분석된 10마리 중 1마리의 동물에서만 관찰되었고, 검출된 DNA의 양이 적기 때문에 (166개의 세포에 해당하는 심장 내의 추정 인간 세포 수), 샘플링 중 오염으로 인한 것일 수 있다. 또한, 10마리의 생체재료 처리 랫트로부터 심장에 이식한 후, 29일째에 조직병리학적 분석을 수행한 경우, 이소성 조직 형성을 시사하는 조직병리학적 관찰 결과가 나타나지 않았다.
실시예 8: 척추 융합 랫트 모델 (CP-2017025-독성학 아암)에서의 생체재료의 연구
생체재료 개발을 위한 비임상 독성학을 2개의 GLP-준수 연구를 포함하는 다음 3개의 동물 연구를 통해 다루었다:
- 척추 융합 랫트 모델에서 생체재료의 단일 투여량 독성 연구 (GLP 연구 CP-2017025-독성학 아암);
- NSG 마우스에서 생체재료의 종양유전성 연구 (GLP 연구 CP-2017026); 및
- 종양 형성 가능성을 조사한 NSG 마우스에서의 생체재료의 국소 내성 연구 (CP-2017073).
상황 및 목적
GLP-준수 연구 (연구 CP-2017025)는 (i) 연구 산물의 의도된 임상 사용과 관련된 조건에 따른 관련 동물 모델에서의 생체재료의 일반적인 독성 (이른바 "CP-2017025-독성학 아암") 및 (ii) 연구 세포의 생체분포 및 이소성 조직의 잠재적인 연속 발달 (이른바 "CP-2017025-생체분포 아암")을 평가하는 2가지 목적을 위해 수행되었다.
"독성학 연구 아암"의 목적은 잠재적 독성, 그의 발병 (급성 또는 지연) 및 임의의 관찰 독성의 해결 가능성을 확인, 특성화 및 정량화하는 것이었다.
면역적격 동물에서 예상되는 바와 같이, 인간 세포의 거부 반응을 방지하기 위해 면역 결핍 (누드) 랫트 모델을 선택하였다. 척추 융합 수술 모델은 문헌[Wang et al. 2003]에 적절하게 기재되어 있기 때문에 관련 모델로 선택되었으며, 이는 유사한 조직 환경에서 대퇴골 골 결손보다 더 큰 이식 부피를 수용할 수 있다 (문헌[Belill et al. 2014]). 또한, 척추 융합 외과 수술 절차 동안 생성된 이식 환경은 대퇴골 골 결손과 같은 골 비유합 모델에서 생성된 환경과 비교할 때 매우 유사한 것으로 상정하였다.
연구 설계
"독성 연구 아암"의 목적을 위해, 사십 (40) 마리의 건강한 9주령 동형접합 누드 무흉선 랫트 (수컷 20마리 및 암컷 20마리; Hsd: RH-Foxn1 rnu/rnu)를 그룹 1 및 2에 무작위로 배정하였다 (그룹당 수컷 10마리 및 암컷 10마리) (표 5).
연구 (CP-2017025-독성학 아암) 설계
그룹 랫트의 수 처리 투여량 투여 경로 처리 일정 희생일
1 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷 연구 생체재료 1.1x107 척추 주위: 2개의 부위 Q1DX1 D29
2 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷 모의 조작 - D29
그룹 1의 동물을 하기 기재된 수술 절차에 따라 생체재료 (임상 배치와 동일한 과정에 따라 제조된 하나의 배치)로 D0에서 처리하였다. 그룹 2의 동물을 생체재료로 처리하지 않았지만, D0에서 그룹 1의 동물과 동일한 수술 절차를 진행하였다.
Wang 등에 의해 기재된 수술 방법에 따라, 피부 및 근육을 5번 또는 6번 요추를 따라 절단 개방하였다. 등 근육을 나누고, 요추를 볼 수 있도록 분리하였다. L5 요추의 횡단 과정에서 둥근 골 결손이 발생하였다. 결손 직경을 2.0 mm, 1 mm 깊이로 제어하기 위해 일정한 직경의 드릴끝 날을 사용하여 골 결손 크기를 표준화하였다. 요추 양쪽에 결손이 존재하였다. 그룹 1의 동물의 경우, 생체재료 (각 0.56x107개의 세포를 포함하는 0.375 cm3의 2개의 조각)를 생성된 구멍 및 주변 영역에서 척추의 각 측면 (좌 및 우)에 이식하였다. 그 후, 등 근육 및 피부를 봉합하였다. 랫트 체중을 기준으로, 이러한 생체재료의 양은 상대적 안전성 한계 10 (250 g의 랫트 대 30 kg의 환자) 및 23.4 (250 g의 랫트 대 70 kg의 환자)를 나타낸다.
마취 후 회복을 위해 수술 후 랫트를 관찰한 후, 상처 치유, 이동성, 이환율, 치사율 및 독성의 명백한 징후에 대해 D29까지 매일 동물을 모니터링하였다.
무작위화 목적 및 D0, 그 후 적어도 일주일에 2회 체중을 측정하였다. 체중 전개를 평가하고, 그룹 1 및 2의 동물 간에 비교하였다.
D3 및 D29에, 그룹 1 및 2의 금식 랫트로부터 혈액을 채혈하여, 혈액학, 응고 및 생화학 파라미터를 측정하였다. D29에, 랫트를 희생시키고 부검을 수행하였다.
독성 목적을 위해, 그룹당 암수당 5마리 동물의 기관을 거시적으로 관찰하고, 수집하였다. 비장, 간, 신장 및 심장의 중량을 측정하였다. 수집된 모든 기관을 실온에서 포르말린 4% 중에 보존하고, 파라핀 포매하고, 슬라이드를 생성하고 (기관당 3개의 슬라이드; 20마리의 동물), 현미경으로 분석하였다.
결과
모니터링 기간 동안 관련 관찰 결과는 보고되지 않았다. 체중과 관련하여, 그룹 1 및 2의 동물 간에 통계적으로 유의한 체중 차이가 관찰되지 않았다. 3일 및 29일째에 채혈한 혈액 샘플에 대한 분석으로부터, 혈액학, 생화학 및 응고 파라미터에 대해 그룹 1 및 2의 동물 간에 관련된 차이가 보고되지 않았다. 거시적으로, 수행된 부검에서 관련성이 보고되지 않았다. 현미경에 의해, 가능하게는 생체재료 이식으로 인한 이물질 육아종이 그룹 1의 모든 동물의 이식 부위에서 관찰되었다. 생체재료 이식에 기인할 수 있는 다른 조직병리학적 전신 변화는 없었다.
결론적으로, 누드 랫트에서 관련 모델을 사용하여 생체재료 이식 후, 독성이 입증되지 않았다.
실시예 9: 세포 형질전환 위험 평가
골육종을 포함하는 다양한 육종의 중간엽 유래를 뒷받침하는 실질적인 증거가 인간에서 이용 가능하다. 그러나, MSC는 장기 배양에서 발생하는 염색체 이상에도 불구하고, 시험관내에서 자발적인 형질전환이 진행되는 것으로 나타나지 않았다 (문헌[Aguilar et al., Stem Cells. 2007, 25(6):1586-1594; Bernardo et al., Cancer Res. 2007, 67(19):9142-9149; Xiao et al., Clin. Sarcoma Res. 2013, 3(1):10]). 이러한 이상은 형질전환 위험 증가와 관련이 없는 시험관내 배양 조건에 자연적으로 적용되는 것으로 기재되고 제안되었다 (문헌[Tarte et al., Blood. 2010, 115(8):1549-1553]).
임상 배치에 제안된 과정에 의해 생성된 생체재료의 3개 초과의 개발 배치의 제조 동안 분자 핵형 분석 (aCGH/SNP 방법)에 의해 생체재료 약물 물질의 세포유전학적 안정성을 연구함으로써, ASC의 자발적 세포 형질전환에 대한 가능성을 시험관내에서 평가하였다. 고밀도 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)과 조합된 어레이 비교 게놈 혼성화 (aCGH)는 잘 확립된 분자 유전자형 분석법으로, 카피 수 변이 및 유사분열 세포의 사전 단리가 요구되지 않는 임상적으로 관련된 염색체 이상 및 장애의 검출을 위한 게놈 전체 스크리닝의 대안적 수단을 제공한다 (문헌[Cooper et al., Nat. Genetics. 2011, 43(9):838-846; Slavotinek. A.M., Hum. Genetics. 2008, 124(1): 1-17]).
결과는 제조 과정 동안 및 생체재료 약물 물질의 방출 시험에 해당하는 계대 수준에서 hASC가 세포 유전적으로 안정한 것으로 나타난다는 것을 시사한다.
NSG 마우스에서 생체재료의 생체내 GLP 종양유전성 연구 (연구 CP-2017026)
상황 및 목적
수득된 결과는 환자에서 종양유전성 위험을 확인하거나 배제하지는 않았으나, MSC-유래 세포 요법 투여의 경우, 인간 환자에서 현재까지 종양 형성이 관찰되지 않았다 (문헌[Barkholt et al., Cytotherapy. 2013, 15(7): 753-759]).
연구 CP-2017026의 목적은 NSG (NOD scid 감마) 면역결핍 마우스에서의 이식 후 최대 6개월 동안 종양유전성 가능성과 관련하여 생체재료에 포함된 인간 지방 유래 MSC의 세포 형질전환 위험을 평가하는 것이었다. 검증된 종양유전성을 위해 선택된 HT-29 세포주를 양성 대조군으로 사용하였다.
연구 설계
삼십 (30) 마리의 건강한 7주령 NSG 암컷 마우스를 본 연구에 포함시켰다. 마우스를 2개의 그룹으로 무작위화하였다 (그룹 1의 경우 20마리 및 그룹 2의 경우 10마리). 그룹 1의 동물에 절개를 통해 피하 공간에 생체재료 (1.5 x 107개의 세포를 포함하는 1 g (± 1 cm3))을 이식하였다 (연구 CP-2017025에서 사용된 것과 동일한 배치, 임상 배치와 동일한 과정에 따라 제조함). 그룹 2의 동물에 HT-29 세포 (200 μl의 NaCl 0.9% 중 107 세포/마우스)를 피하 주사하여 접종하였다.
마우스의 생존율, 거동 및 체중을 실험 종료시까지 일주일에 2회 기록하였다. 투여 부위에서 신생 형성된 결절에 대해 각 동물을 관찰하고, 일주일에 2회 촉진하였다. 신생 형성된 임의의 결절을 측정하였다. 종양 부피가 1000 mm3에 도달할 때까지 또는 괴사가 관찰될 때까지 그룹 1의 마우스 (생체재료로 처리됨)를 6개월까지 관찰하였고, 그룹 2의 마우스 (HT-29 세포로 처리됨)를 모니터링하였다.
부검 동안, 각 동물에 대해 거시적 관찰이 수행하였다. 그룹 1 동물(시험 항목)의 경우, 이식 부위, 간, 비장, 폐, 심장, 신장, 뇌, 사타구니 림프절 (관찰 가능한 곳)에 대해 조직병리학적 검사를 위한 슬라이드를 제조하였다.
결과
그룹 2의 10마리 마우스 (HT-29, 양성 대조군)는 종양이 점진적으로 성장하는 것으로 나타났으며, D27 (첫 번째 희생 일)에 평균 종양 부피 (MTV)는 611.6 ± 335.4 mm3이었다. 종양에 대한 괴사로 인해 하나의 마우스를 희생시켰고, 다른 9마리의 마우스를 1000 mm3 초과의 TV에서 희생시켰다. 그룹 2 마우스의 부검 동안 수행된 기관의 거시적 관찰에서 이상이 나타나지 않았다.
그룹 1의 하나의 마우스는 D0과 D1 사이에 투여 부위의 봉합이 개방됨으로 인해 시험 항목을 상실하였다. 그룹 1의 동물의 경우, 이식 후 (D2), 평균 이식 부위 부피는 1194.6 ± 392.7 mm3 (N=19)였다. 이식 후, 일부 마우스에서 투여 부위 수준에서 치유되지 않는 심각한 상처가 나타났다.
결과적으로, D3과 D27 사이에 투여 부위에 이러한 심각한 피부 상처로 인해 윤리적인 이유로 그룹 1로부터의 20마리 마우스 중 10마리를 치사시켰다. 그룹 1로부터 10마리의 희생된 마우스 중, 5마리의 마우스에서 이식 부위에 건조한 황색 피부가 나타났고, 2마리의 다른 마우스에서는 이식 부위에 괴사가 관찰되었다. 조직병리학적 검사에 의해, 이식 부위에 염증이 나타났고, 괴사된 덩어리가 때때로 존재하였다. 염증 및/또는 궤양이 상부 피부 및 주변 근육 조직에서 관찰되었다.
그룹 1 동물에 대한 연구 종료시 (D180) 평균 이식 부위 부피는 1032.5 ± 245.3 (n=9) mm3이었고, D2에서의 평균 이식 부위 부피와 비교하여 부피 증가가 없는 것으로 나타났다.
그룹 1 마우스의 부검 동안 수행된 기관의 거시적 관찰에 의해서는 이상이 나타나지 않았다. 연구 종료시 (D180) 희생된 그룹 1 마우스에 대해, 현미경 관찰에 의하면 이식 부위에 괴사가 이루어지지 않았고, 일반적으로 조직 근처에 염증을 동반하지 않은 다포성 덩어리가 나타났다. 이식 부위 및 분석된 다른 기관의 조직병리학적 검사 동안 임의의 그룹 1 마우스에서도 종양이 관찰되지 않았다.
그룹 2 (HT-29 세포 처리)의 10마리 동물 중 적어도 9 마리에서 종양이 점진적으로 성장하는 것으로 나타났으므로, 본 연구는 유효하다. 약 1.5x107개의 세포를 포함하는 시험 항목 (1 g의 생체재료)의 단일 피하 이식 후, 임의의 그룹 1 (암컷 NSG) 마우스에서 종양이 관찰되지 않았다.
조직병리학 보고서에는 이 실험의 조건 하에서, "NSG 마우스에서 대략 1 g의 [생체재료]의 피하 이식은 6개월의 관찰 기간 동안 임의의 세포 증식을 유도하지 않았다. 이식 부위에는 시험 항목과 직접 관련된 다포성 덩어리가 존재하였다. 일부 마우스를 국소 염증 반응에 의한 피부 궤양으로 인해 조기에 희생시켰다. 이는 큰 부피의 경질 물질을 피하 이식함으로써 유발되는 기계적 외상과 관련이 있는 것으로 고려되었다"라고 보고되었다.
종양 형성 가능성을 조사한 NSG 마우스에서의 생체재료의 생체내 국소 내성 연구 (연구 CP-2017073)
상황 및 목적
GLP 종양유전성 연구 CP-2017026 동안, 생체재료 이식재의 저조한 국소 내성이 관찰되었고, NSG 면역 결핍 마우스에 큰 부피의 경질 물질을 피하 이식함으로써 유발된 기계적 외상과 관련된 것으로 고려되었다.
연구 CP-2017073은 단일 부위 (연구 CP-2017026에서 수행된 바와 같음) (n=8) 또는 2개의 부위 (부위당 0.5 g) (n=8)에 이식 후, 생체재료 1 g (± 1 cm3)의 국소 내성 (원 계획에 따라 2주간)을 추가로 조사하기 위해 개시하였다.
주목할만한 것은, 연구 CP-2017073 동안 연구 CP-2017026과 달리, 1 g의 생체재료가 이식된 동물은 병변 (예를 들어, 근육 수준에서 부착되지 않은 이식 부위의 황색 피부)이 관찰된 경우에도, 투여 부위에서 심각한 피부 상처로 인해 윤리적인 이유로 희생시켜야 하는 경우는 없었다. 그 후, 연구 CP-2017026에서 이미 생성된 종양유전성 데이터를 보완하기 위해, 원래 계획된 2주 추적 기간보다 더 긴 기간 (최대 6개월) 동안 그룹 1의 동물 (n=8)을 모니터링하기로 결정하였다.
연구 설계
7주령의 열여섯 (16) 마리의 건강한 NSG (NOD scid 감마) 면역결핍 암컷 마우스를 2개의 그룹 (그룹당 8마리)으로 무작위화하였다. 그룹 1의 동물에 우측 옆구리의 피하 공간의 절개를 통해 생체재료 (1.5x107개의 세포를 포함하는 1 g)를 이식하였다. 그룹 2의 동물에 우측 및 좌측 옆구리의 피하 공간의 절개를 통해 생체재료 (각 부위에 0.75x107개의 세포를 포함하는 2x0.5 g)를 이식하였다. 마우스의 생존율, 거동 및 체중을 실험 종료시까지 일주일에 2회 기록하였다. 임상 징후 및 국소 반응에 대해 각 동물을 매일 관찰하였다. 그룹 1의 마우스 (하나의 부위에 시험 항목 처리)를 최대 6개월까지 관찰하였다. 그룹 2의 마우스 (2개 부위에 시험 항목 처리)를 15일 동안 모니터링하였다. 각 동물에 대해 거시적 부검을 수행하였다. 그룹 1 동물 (시험 항목)의 경우, 이식 부위, 간, 비장, 폐, 심장, 신장, 뇌, 사타구니 림프절 (관찰 가능한 곳)에 대해 조직병리학적 검사를 위한 슬라이드를 제조하였다.
결과
각 마우스의 체중은 D79로부터 D85까지 체중이 감소된 그룹 1의 하나의 마우스를 제외하고, 희생될 때까지 D0로부터 점진적으로 증가하였다. 그 마우스는 D89에 치사된 채 발견되었다.
그룹 1의 동물의 경우, D2상의 평균 이식 부위 부피는 1228.3 ± 195.3 mm3 (n=8)이었다. 연구 종료시 (D180), 평균 이식 부위 부피가 945.5 ± 92.7 mm3 (n=7)로 감소하여, 시험 항목의 피하 이식 후, 연구 동안 임의의 이식 부위의 크기 증가가 관찰되지 않은 것으로 나타났다.
모니터링 파라미터 (이동성 및 보행, 태도, 거동, 호흡, 눈, 피부 (이식 부위 외), 털, 점막, 배설, 및 마비 없음)는 그룹 1의 모든 마우스 (하나의 부위) 및 그룹 2 (2개의 부위)에서 정상이었다.
희생시, 그룹 1 마우스 (하나의 부위) 또는 그룹 2 (2개의 부위)에서 수행된 거시적 관찰 결과 비정상 기관이 나타나지 않았다. D180에서 희생된 그룹 1의 마우스에 대해, 조직병리학적 분석에 의하면 임의의 세포 증식이 나타나지 않았다. 이식 부위에 다포성 무기질화가 관찰되었지만, 상부 피부 및 주위 근 조직에는 염증이 존재하지 않았다. 이러한 무기질화 재료는 이식된 시험 항목으로 이해된다.
이 실험의 조건 하에서 다음과 같이 결론 지을 수 있다:
·이식 부위의 황색 피부가 두 그룹 모두에서 관찰되더라도, 하나 또는 2개의 부위에서의 생체재료의 투여는 국소 내성에 유의한 영향을 미치지 않았다. 이 관찰과 관련하여, 이식 부위의 황색 피부의 마지막 관찰 이후 D44에 그룹 1의 동물이 회복된 것으로 나타났다.
·1.5x107개의 세포를 포함하는 생체재료의 단일 피하 이식은 6개월 추적 조사 후, 거시적 조사 및 현미경 조사와 같이 암컷 NSG 마우스에서 종양 형성을 유도하지 않았다.
·조직병리학 기록에 의하면, 1.5x107개의 세포를 포함하는 1 g의 생체재료의 NSG 마우스에의 피하 이식이 6개월 동안 임의의 세포 증식을 유도하지 않은 것으로 나타났다. 이식 부위에는 시험 항목과 직접적으로 관련된 다포성 무기질화가 존재하였다.
실시예 10: 본 발명의 생체재료의 생성
10.1. hASC의 단리
정보에 입각한 동의 및 혈청학적 스크리닝 후에 복부 영역에서 Coleman 기술에 따라 지방 흡인함으로써, 인간 피하 지방 조직을 수확하였다.
인간 지방 유래 줄기세포 (hASC)를 유입 지방 조직으로부터 신속하게 단리하였다. 지방흡인물은 +4℃에서 24시간 동안 또는 -80℃에서 더 장기간 동안 저장할 수 있다.
먼저, 품질 제어 목적으로 일 분량의 지방흡인물을 단리하고, 지방흡인물의 잔여 부피를 측정하였다. 이어서, 지방흡입물을 HBSS 중에 제조된 콜라게나제 용액 (NB 1, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)에 의해 분해시켰다 (최종 농도: 약 8 U/mL). 분해에 사용된 효소 용액의 부피는 지방 조직 부피의 2배였다. 분해는 37℃ ± 1℃에서 50 내지 70분 동안 수행하였다. 15 내지 25분 후에 첫 번째 주기적인 진탕을 수행하고, 35 내지 45분 후에 두 번째로 수행하였다. MP 배지 (증식 배지 또는 성장 배지)를 첨가하여 분해를 중지시켰다. MP 배지는 5% 인간 혈소판 용해물 (hPL) (v/v)이 보충된 DMEM 배지 (4.5 g/L 글루코스 및 4 mM Ala-Gln; Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Germany)를 포함하였다. DMEM은 염, 아미노산, 비타민, 피루베이트 및 글루코스를 포함하고, 탄산염 완충액으로 완충된 표준 배양 배지이며, 생리학적 pH (7.2 내지 7.4)를 갖는다. 사용된 DMEM은 Ala-Gln을 포함하였다. 인간 혈소판 용해물 (hPL)은 중간엽 줄기세포 (예를 들어, hASC)의 시험관내 성장을 자극하는데 사용되는 풍부한 성장 인자 공급원이다.
분해된 지방 조직을 원심분리하고 (500 g, 10분, 실온), 상청액을 제거하였다. 펠렛화된 기질 혈관 분량 (SVF)을 MP 배지에 재현탁시키고, 200 내지 500 μm 메쉬 필터를 통과시켰다. 여과된 세포 현탁액을 두 번째로 원심분리하였다 (500 g, 10분, 20℃). hASC를 포함하는 펠렛을 MP 배지에 재현탁시켰다. 세포 계수를 위해 소 분량의 세포 현탁액을 유지시킬 수 있고, 나머지 모든 세포 현탁액을 사용하여 하나의 75 cm2 T-플라스크에 시딩하였다 (계대 P0로 지칭됨). 시딩된 세포의 수를 추정하기 위해 세포 계수를 수행하였다 (단지 정보용임).
단리 단계 다음 날 (1일), 성장 배지를 75 cm2 T-플라스크로부터 제거하였다. 세포를 인산염 완충액으로 3회 세정한 후, 새로 제조된 MP 배지를 플라스크에 첨가하였다.
10.2. 인간 지방 유래 줄기세포의 성장 및 확장
증식 단계 동안, 후속 과정 단계를 위해 충분한 양의 세포를 수득하기 위해 hASC를 4회 계대시켰다 (P1, P2, P3 및 P4).
P0와 제4 계대 (P4) 사이에, 세포를 T-플라스크에서 배양하고, 새로운 MP 배지를 공급하였다. 70% 이상 100% 이하의 컨플루언스에 도달했을 때 (표적 컨플루언스: 80 내지 90%), 세포를 계대시켰다. 1 배치로부터의 모든 세포 배양 수용체를 동시에 계대시켰다. 각각의 계대에서, 재조합 동물-무함유 세포 해리 효소인 TrypLE (Select 1X; 75 cm2 플라스크의 경우 9 mL 또는 150 cm2 플라스크의 경우 12 mL)를 사용하여 세포를 배양 용기로부터 분리하였다. TrypLe 분해를 37℃ ± 2℃에서 5 내지 15분 동안 수행하고, MP 배지의 첨가에 의해 중지시켰다.
이어서, 세포를 원심분리하고 (500 g, 5분, 실온), MP 배지에 재현탁시켰다. 균일한 세포 현탁액이 되도록 하기 위해 수확된 세포를 풀링하였다. 재현탁 후, 세포를 계수하였다.
그 후, 계대 P1, P2 및 P3에서, 남아있는 세포 현탁액을 MP 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석하고, 더 큰 조직 배양 표면에 시딩하였다. 이 단계에서, 75 cm2 플라스크에 15 mL의 세포 현탁액 부피를 시딩하고, 150 cm2 플라스크에 30 mL의 세포 현탁액 부피를 시딩하였다. 각각의 계대에서, 세포를 0.5x104 내지 0.8x104 세포/cm2로 시딩하였다. 상이한 계대 사이에, 배양 배지를 3 내지 4일마다 교체하였다. 하나의 공여체와 다른 공여체 간에 세포 거동 및 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 두 계대 사이의 지속기간 및 계대 사이의 배지 교체 횟수는 공여체마다 상이할 수 있다.
10.3. 골형성 분화
계대 P4 (즉, 제4 계대)에서, 세포를 두 번째로 원심분리하고, MD 배지 (분화 배지)에 재현탁시켰다. 재현탁 후, 세포를 두 번째로 계수한 후, MD 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석하고, 70 mL의 세포 현탁액 부피를 150 cm2 플라스크에 시딩하고, 골형성 MD 배지를 공급하였다. 이 방법에 따르면, 제4 계대 후, 세포를 골형성 MD 배지에 직접 배양하였다. 따라서, 세포가 컨플루언스에 도달하지 않은 동안에는 골형성 MD 배지를 첨가하였다.
골형성 MD 배지는 덱사메타손 (1 μM), 아스코르브산 (0.25 mM) 및 인산나트륨 (2.93 mM)이 보충된 증식 배지 (DMEM, Ala-Gln, hPL 5%)로 구성되었다.
하나의 공여체와 다른 공여체 간의 세포 거동 및 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 골형성 분화 단계의 지속기간 및 계대 사이의 배지 교체 횟수는 공여체마다 상이할 수 있다.
10.4. 세포의 다차원 유도
3D 유도는 세포가 컨플루언스에 도달한 때 및 형태학적 변화가 나타난 경우, 및 플라스크 내에 적어도 하나의 골상 결절 (골 조직의 성숙 전에 형성되는 골 기질의 비무기질화 유기 부분)이 관찰된 경우에 3D 유도를 개시하였다.
골형성 MD 배지에 노출 후, 부착성 골형성 세포의 컨플루언스 단층을 포함하는 배양 용기에 젤라틴 입자 (Cultispher-G 및 Cultispher-S, Percell Biolytica, Astorp, Sweden)를 150 cm2 용기당 1, 1.5 및 2 cm3의 농도로 서서히 균일하게 분무하였다.
세포를 MD 배지에 유지시켰다. 다차원 유도 동안 3 내지 4일마다 주기적인 배지 교체를 수행하였다. 젤라틴 입자의 제거 및 구조 (들)의 생성을 주의깊게 방지하여, 이러한 배지 교체를 수행하였다.
실시예 11: 생체재료의 특성화
11.1. 재료 및 방법
11.1.1. 구조/조직학
ASC 및 Cultispher G 및 S 입자로부터 수득된 3D 구조의 형성을 시험하였다. 계대 4에 6개의 상이한 공여체로부터의 컨플루언스 ASC 상에 Cultispher의 입자를 첨가하였다. 상이한 부피를 시험하였다: 150 cm2 용기당 1, 1.5, 2 cm3 입자. 세포를 분화 배지 (울트라글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 0.5% 암포테리신 AB + 덱사메타손 (1 μM), 아스코르브산 (0.25 mM) 및 인산나트륨 (2.93 mM)을 갖는 DMEM 4.5g/L 글루코스)에 유지시키고, 3 내지 4일마다 배지를 교체하였다.
MP 및 MD에서의 배양의 비교를 위해, MD 중 3D 구조의 생검을 입자의 첨가 후, 5일, 14일 및 8주째에 수행하였다.
세포충실성의 평가를 위해, Cultispher 입자의 첨가 후, 4주, 8주 및 12주째에 3D 구조의 생검을 수행하였다.
이를 포르몰에 고정시키고, 헤마톡실린-에오신, 메이슨 트리크롬, 오스테오칼신 및 폰 카사 염색을 위해 제조하였다.
조직의 골분화 및 무기질화를 각각 오스테오칼신 및 폰 코사-염색 슬라이드에서 평가하였다. 헤마톡실린-에오신 및 메이슨 트리크롬 염색 후, 조직의 구조, 세포충실성 및 세포외 기질의 존재를 평가하였다.
11.1.2. 생물학적 활성
생체활성의 시험관내 연구를 (i) 최종 산물 중 성장 인자 VEGF, IGF1, SDF-1α의 추출 및 정량화 및 (ii) 저산소 및 고혈당 (예를 들어, 당뇨병성 상처 치유의 병태)에서의 본 발명의 생체재료의 성장 인자 분비/함량의 용량에 의해 평가하였다. 또한, (iii) 본 발명의 생체재료의 생체활성 특성을 qRT-PCR에 의해 분자 수준에서 시험관내에서 특성화하였다.
성장 인자 함량
형성된 조직의 생체활성을 평가하기 위해, 단백질 추출 및 정량화를 위해 젤라틴 (1.5 cm3) 첨가 후 4 및 8주째에 생검을 수행하였다. 총 단백질 및 성장 인자 함량을 공급자의 지침에 따라 비색계 (BCA 단백질 분석 키트, ThermoFisher Scientific) 및 VEGF, SDF1α, IGF1에 대한 ELISA (인간 Quantikine ELISA 키트, RD Systems)에 의해 정량화하였다.
저산소 및 고혈당에서의 배양
본 발명의 생체재료의 생체활성 및 이 3D 구조의 생체활성에 대한 산소 상태 (oxemia) 및 혈당의 영향을 평가하기 위해, 8주째에 3 공여체로부터의 ASC 및 Cultispher G (1.5 cm3)로 형성된 조직의 생검을 PBS로 2회 세정하고, 6웰 플레이트에 HPL의 부재 하에 4.5 g/L (고혈당 상태) 또는 1 g/L (정상 혈당 상태) 글루코스의 10 mL의 MD에 2중 반복 실험으로 배치하였다. 플레이트를 72시간 동안 저산소 (1% O2) 또는 정상 산소 (21% O2), 5% CO2, 37℃에 배치하였다. 이어서, 각각 비색계 (BCA 단백질 분석 키트, ThermoFisher Scientific) 및 ELISA (BMP2, BMP7, VEGF, SDF-1α, IGF1, FGFb (인간 Quantikine ELISA 키트, RD Systems))에 의한 총 단백질 및 성장 인자 정량화를 위해 상청액을 수확하였다. 단백질 추출, 정제 및 총 단백질 및 성장 인자 함량 정량화를 위해 조직을 처리하였다.
qRT-PCR
본 발명의 생체재료의 혈관형성 촉진 가능성을 혈관신생 및 혈관형성에 관여하는 유전자의 발현의 분석에 의해 조사하였다. 상이한 상태의 지방 줄기세포에 의한 유전자 발현을 분석하였다: 증식 배지 (표현형 방향 없음, MP) 중 지방 줄기세포, 무입자의 통상의 골형성 배지 (MD) 중 지방 줄기세포 및 마지막으로 본 발명의 생체재료 (세포외 기질에 의한 3차원 스캐폴드-무함유 구조의 형성을 유도하기 위한 것으로, 1.5 cm3의 입자를 갖는 지방 줄기세포).
Qiazol 용해 시약 (Qiagen, Hilden, Germany) 및 Precellys 균일화기 (Bertin instrument, Montigny-le-Bretonneux, France)를 사용하여 증식 배지 (MP) 중 배양된 2000개 이상의 ASC (n=4 인간 지방 조직의 독립적 공급원)에서 및 본 발명의 생체재료의 약 1 cm2 생검 (n=5)으로부터 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 Rneasy 미니 키트 (Qiagen, Hilden, Germany) 및 컬럼상의 DNase 분해를 추가로 사용하여 RNA를 정제하였다. RNA의 품질 및 양을 분광광도계 (Spectramax 190, Molecular Devices, California, USA)를 사용하여 측정하였다. 상업적으로 이용 가능한 PCR 어레이 (인간 RT2 Profiler Assay -Angiogenesis)를 통해 골형성 및 혈관형성 유전자 발현 프로파일에 대해 RT2 RNA 제1 가닥 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 0.5 μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 증폭 산물의 검출에는 ABI Quantstudio 5 시스템 (Applied Biosystems) 및 SYBR Green ROX Mastermix (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. △△CT 방법에 따라 정량을 수득하였다. 각 샘플의 최종 결과를 3개의 하우스키핑 유전자 (ACTB, B2M 및 GAPDH)의 발현 수준의 평균으로 정규화하였다.
11.1.3. 생체재료의 성숙이 그 특성에 미치는 영향
생체재료 (또한 "조직"으로 지칭됨)의 성숙이 그 특성에 미치는 영향은 무기질화 수준 평가, 조직학적 평가 (세포충실성 결정) 및 생체활성 평가 (성장 인자 VEGF, IGF1, SDF-1α의 추출 및 정량화)에 의해 평가하였다. 생체재료의 성숙은 본 명세서에서 분화 배지에서 Cultispher 입자와 ASC의 배양 지속기간을 의미한다.
Cultispher 입자의 첨가 후, 4주 (1 공여체), 8주 (6 공여체), 12주 (3 공여체) 및 25주 (1 공여체)째에 3D 구조의 생검을 채취하여, 마이크로-CT 스캐너 분석을 위해 포르몰에 고정시켰다. 3D 구조 무기질화를 말초 정량적 CT 기계 (Skyscan 1172G, Bruker 마이크로-CT NV, Konkonh, Belgium)를 사용하여 평가하였다.
또한, 조직 생검 (4주 (n=3), 8주 (n=8), 12주 (n=3) 및 25주 (n=1))을 포르몰에 고정시키고, 헤마톡실린-에오신, 메이슨 트리크롬 및 폰 코사 염색을 위해 제조하였다.
11.2. 결과
11.2.1. 구조/조직학
Cultispher 입자를 증식 배지에서 hASC와 함께 배양하는 경우 3D 구조가 수득되지 않았다. 거시적 3D 구조가 발견되지 않았으므로, 미세 구조는 형성되지 않았다.
증식 배지와 달리, 골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 Cultispher는 시트형 3D 구조의 형성을 나타내었다 (도 20a). 더욱이, 이 구조는 겸자로 잡을 수 있다 (도 20b).
골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 Cultispher의 조직학적 시험에 의해 입자들 사이에 결합된 세포화 조직이 존재하는 것으로 나타났다. 또한, 세포외 기질 및 세포가 입자의 기공에서 존재하였다 (도 21). 폰 코사 염색은 단리된 무기질화 입자의 존재를 보여주었다. 이와 달리, 세포외 기질은 Von Kossa에 의해 염색되지 않았다 (도 22). 마지막으로, 오스테오칼신 발현이 상호연결 조직에 나타났다 (도 23).
11.2.2. 생물학적 활성
성장 인자 함량 및 분비
Cultispher G 및 S 단독의 경우에는 단백질 함량이 존재하지 않았다. 미량의 IGF-1만이 검출되었지만, ELISA 방법의 정량의 하한 미만이었다.
골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 Cultispher의 생검 상청액에서 검출된 IGF-1 및 BMP7 수준은 ELISA 방법의 정량 하한 미만이었고, 미량의 BMP2 및 FGFb가 측정되었다. 이와 달리, VEGF 및 SDF-1α의 유의한 분비가 발견되었다.
성장 인자 분비에 대한 배양 조건의 유의한 영향은 나타나지 않았다 (표 6).
본 발명의 생체재료에 의한 VEGF 및 SDF-1α 분비에 대한 배양 조건의 영향
산소 상태 혈당 분비 (ng/g)
VEGF SDF-1α
21% O2 1 g/L 74 ± 24 19 ± 20
4.5 g/L 50 ± 28 27 ± 27
1% O2 1 g/L 130 ± 51 14 ±10
4.5 g/L 106 ± 60 26 ± 10
골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 Cultispher의 생검으로부터의 단백질 추출물에서 검출된 BMP2, BMP7 및 FGFb의 수준은 ELISA 방법의 정량의 하한 미만이었다. 이와 달리, 유의한 함량의 IGF-1, VEGF 및 SDF-1α가 발견되었다.
VEGF 함량에 대한 배양 조건의 유의한 영향은 발견되지 않았다. 그러나, 다른 그룹과 비교하여, 4.5 g/L 글루코스에서 정상 산소 (21% O2)에서 더 높은 IGF-1 함량이 발견되었다 (p <0.05). 저산소에 대비하여, 정상 산소 및 정상 혈당에서 더 높은 SDF-1α 함량이 발견되었다 (1 및 4.5 g/L 글루코스) (p <0.05) (표 7).
본 발명의 생체재료의 VEGF, SDF-1α 및 IGF1 함량에 대한 배양 조건의 영향
산소 상태 혈당 분비 (ng/g)
VEGF SDF-1α IGF1
21% O2 1 g/L 123 ± 47 117 ± 79** 53 ± 37
4.5 g/L 104 ± 61 139 ± 208 25 ± 22*
1% O2 1 g/L 152 ± 80 36 ± 29 109 ± 85
4.5 g/L 155 ±101 36 ± 44 94 ± 78
*: 다른 그룹과 비교하여 p<0.05
**: 1% O2 (1 및 4.5 g/L)와 비교하여 p<0.05
qRT-PCR 분석
qRT-PCR 분석에 의해 분석된 84개의 혈관형성 촉진 유전자에 걸쳐, 상이한 배양 조건 간에 13개의 mRNA를 조절하였다. 증식 배지 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 10개의 유전자가 상향 조절되었고 (ANG, ANGPT1, EPHB4, EDN1, LEP, THBS1, PTGS1, VEGFA, VEGFB 및 VEGFC), MP의 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 2개의 유전자가 하향 조절되는 것으로 나타났다 (ID1, TIMP1) (도 24).
MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 안지오포이에틴 (ANG 및 ANGPT1) mRNA의 유의하게 더 높은 발현이 발견되었다 (도 24a 및 도 24b). 안지오포이에틴 신호전달은 기존 혈관으로부터 신생 동맥 및 정맥이 형성되는 과정인 혈관형성을 촉진한다 (문헌[Fagiani E et al, Cancer Lett, 2013]).
혈관신생에 필수적인 역할을 하는 막관통 단백질인 EPHB4 (에프린 수용체 B4), 엔도텔린 (Endothelin) (EDN1), 강력한 혈관수축신경 (Wu MH, Nature, 2013), 트롬보스폰딘 1 (THBS1), 혈관확장신경 및 내피 세포를 조절하는 사이클로옥시게나제 1 (Cyclooxigenase 1)(PTGS1/COX-1)은 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 유의하게 상향 조절되었다 (각각 도 24c, 도 24d, 도 24e 및 도 24f).
렙틴 (LEP) mRNA의 발현 (혈관형성의 주요 증강제 및 VEGF의 발현의 유도제; 문헌[Bouloumie A et al, Circ. Res. 1998; Sierra-Honigmann MR et al, Science (New York, N.Y.) 1998])은 또한 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 과발현되었다 (도 24g).
마지막으로, 혈관 내피 성장 인자 A, B 및 C mRNA (VEGFA/B/C)의 발현은 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 ASC에 대해 유의하게 개선되었다 (각각 도 5h, 도 5i 및 도 5j). VEGF는 혈관 발달 및 혈관형성의 조절을 위한 가장 중요한 성장 인자 중 하나이다. 골은 고도로 혈관화된 기관이기 때문에 (골형성에서의 중요한 조절 인자로서의 혈관형성), VEGF는 또한 골격 발달 및 출생 후 골 복원에 긍정적인 영향을 미친다 (문헌[Hu K et al, Bone 2016]).
이와 달리, 생체내 혈관형성 감소와 관련된 DNA-결합 단백질 억제제 (ID1) 및 메탈로펩티다제 (Metallopeptidase) 억제제 1 (TIMP1) (문헌[Reed MJ et al, Microvasc Res 2003])은 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체재료에서 하향 조절되었다 (각각 도 24k 및 도 24l).
종합하면, 이들 분자 분석은 세포가 본 발명의 생체재료에서 3D 기질에 포매되는 경우, ASC의 혈관형성 촉진 가능성이 상향 조절됨을 보여준다.
11.2.3. 생체재료의 성숙이 그 특성에 미치는 영향
무기질화 수준 평가
4주, 8주, 12주 및 25주째에서의 3D 이식편의 매크로 사진은 동일한 거시적 구조를 나타내었고 (도 6, 패널 상부), 이를 마이크로 CT에서 분석하였다. 무기질화 부피의 백분율을 결정하였다: 4주째에 0.07%, 8주째에 0.28% +/- 0.33%, 12주째에 1.24% +/- 0.35% 및 25주째에 2,77% (도 25, 패널 하부).
따라서, 성숙 수준이 더 높을수록 무기질화가 더 높아진다.
조직학적 평가
분석된 상이한 조직에서 유사한 세포충실성이 정량화되었으므로, 조직의 성숙이 세포 함량에 미치는 영향은 발견되지 않았다 (데이터 미제시).
이와 달리, 조직에서의 ECM의 비율은 성숙 수준에 따라 증가하였고, 4주째에 ECM 비율은 유의하게 더 낮았고, 25주째에 ECM의 비율은 더 높았다 (각각 4, 8/12 및 25주째에 28 ± 7 vs 33 ± 11/34 ± 11 vs 56 ± 8%의 ECM (p<0.05)) (표 8).
상이한 성숙 시간에서 본 발명의 생체재료의 조직학적 분석.
세포/mm2 ECM (%)
4주 160 ± 104 28 ± 7*
8주 175 ± 86 33 ± 11
12주 177 ± 70 34 ± 11
25주 191 ± 77 56 ± 8*
*: p<0.05 vs 다른 그룹
보다 현저한 폰 코사 염색에 의해 나타난 바와 같이 성숙 12 및 25주째에 더 높은 무기질화 정도가 나타났다 (데이터 미제시).
생체활성 평가
단백질 추출, 정제 및 ELISA에 의한 성장 인자 (VEGF, IGF1, SDF-1α) 정량화 후, 성숙 4, 8, 12 및 25주째에서의 생체재료의 생체활성을 연구하였다 (표 9).
성숙 4, 8, 12 및 25주째의 조직의 단백질 및 성장 인자 함량
VEGF (ng/ml) IGF (ng/ml) SDF-1α (ng/ml)
4주 117 ± 7 108 ± 17 105 ± 42
8주 102 ± 91 50 ± 83 189 ± 180
12주 181 ± 12 436 ± 18 663 ± 27
25주 128 94 424
실시예 12: 혈관형성 및 골형성 특성의 생체내 연구
12.1. 재료 및 방법
12.1.1. 누드 랫트를 사용한 생체내 실험
본 발명의 생체재료의 10개의 복제물 (실시예 10에 기재된 바와 같이 7.5주 성숙 동안 1.5 cm3의 Cultispher G 또는 S와 함께 배양된 ASC)을 0일째에 누드 랫트의 소작된 요추 근육에 봉합하였다. 이식 29일 후, 생체재료를 수확하여, 이미지 및 조직학으로 분석하였다.
12.1.2. Wistar 랫트를 사용한 생체내 실험
본 발명의 생체재료의 10개의 복제물 (실시예 10에 기재된 바와 같이 7.5주 성숙 동안 1.5 cm3의 Cultispher G 또는 S와 함께 배양된 ASC)을 0일째에 Wistar 랫트의 소작된 요추 근육에 봉합하였다. 이식 29일 후, 생체재료를 수확하여, 이미지 및 조직학으로 분석하였다.
동물의 일반적인 임상 상태를 실험 기간 동안 매일 확인하였다.
소형 동물 영상화 SkyScan1076을 위한 고해상도 X-선 마이크로-CT 시스템을 사용하여 30개 표본의 무기질화 분석을 수행하였다. CTvol 및 CTan 소프트웨어 (Skyscan)를 사용하여 스캔의 3 차원 재구성 및 무기질화된 조직의 분석을 수행하였다.
산물의 생체내 혈관형성 및 골유도 특성을 평가하기 위해 근육 샘플의 조직학적 분석을 수행하였다 (헤마톡실린-에오신, 메이슨 트리크롬, 폰 코사 (조직의 무기질화의 위치를 정밀 측정하기 위함), 인간 조직 마커 Ku80 (동물 조직 내의 세포의 인간 유래를 확인하기 위함) 및 CD3 (조직 내의 CD3+ 면역 세포의 재분리를 기재하기 위함) 염색).
12.2. 결과
12.2.1. 누드 랫트를 사용한 생체내 실험
생체내 실험 동안, 병태 또는 유의한 병변의 징후는 관찰되지 않았으며, 이는 산물이 동물에 부작용을 유발하지 않았음을 나타낸다.
누드 랫트에서, 29일째에 수행된 방사선 사진에서 무기질화를 시사하는 방사선 불투과성 구조의 존재가 관찰되었다 (도 26).
누드 랫트로부터의 샘플에서 인간 세포의 존재가 표시되었다. 존재하는 경우, 인간 세포는 2개의 그룹에서 경계부를 제외하고 이식재 부위의 세포의 평균 절반을 나타냈다. 랫트 및 인간 유래의 세포는 랫트 세포만 존재하는 경계부를 제외하고는 이식재 부위에 균일하게 분포하였다.
12.2.2. Wistar 랫트를 사용한 생체내 실험
Wistar 랫트에서, 29일째에 수행된 방사선 사진에서 무기질화를 시사하는 방사선 불투과성 구조의 존재가 관찰되었다 (도 27).
무기질화의 분석은 각각의 이식재 부위에서 무기질화된 조직의 존재를 시사한다.
폰 코사 염색은 무기질화가 입자 상에 국한됨음을 나타낸다 (도 28).
실시예 13: 생체내 생체활성 연구
13.1. 재료 및 방법
13.1.1. 샘플 제조
10마리의 누드 랫트의 척추 주위 근조직에서의 이식을 위해 약 0.5 g의 생체재료 (실시예 10에 기재된 바와 같이 8주의 성숙 동안 1.5 cm3의 Cultispher S와 함께 배양된 ASC)의 샘플 10개를 제조하였다. 또한, 약 0.5 g의 Cultispher S 입자의 2개의 샘플을 대조군으로 사용하였다.
샘플의 성장 인자 함량을 평가하기 위해, 단백질 추출 및 정량화 (VEGF, IGF1, SDF-1α)를 위해 생체재료 샘플을 제조하였다.
생체재료의 품질을 평가하기 위해, 헤마톡실린-에오신 (HE) 및 폰 코사 (VK) 염색을 위해 하나의 샘플을 포르몰에 고정시켰다. HE 염색 후, 조직의 세포 수를 계수하여 탈세포화 처리 효능의 평가를 확인하였다.
13.1.2. 동물 시설에서의 수용
수의 서비스에 의해 승인된 동물 시설 "Centre Preclinique Atlanthera"에 동물을 수용하고, 현재 현행법 (2013년 2월 1일자의 실험 목적으로 사용되는 동물에 대한 법령 N 2013-118)에 의거하여 모든 실험 절차에 사용하였다. 연구 개시 전 최소 7일 동안 동물을 적응시키고, 연구 동안 일반적인 동물 상태를 매일 추적 조사하였다. 표준 치수의 플라스틱 상자 내 냉난방 시설이 탑재된 동물 사육장에 동물을 수용하였다. 인위적 명/암 광주기를 12시간의 명 및 12시간의 암으로 설정하였다. 모든 동물은 물에 자유롭게 접근할 수 있었고, 시판 사료를 임의 제공하였다. 각 동물을 귀표 (링)로 식별 표지하였다.
13.1.3. 실험 프로토콜
0일째에, 10개의 누드 랫트의 소작된 요추 근육에 생체재료의 복제물을 봉합하고, 1개의 누드 랫트의 요추 근육에 실행된 근육 소작 스톨 (stall)에 입자 단독을 이식하였다. 이식 후 29일째에, 생체재료를 포함하는 근육을 수확하여, 이미지와 조직학에 의해 분석한다.
요추 근육으로의 이식
최상의 조건 하에서 수술을 수행하기 위해 동물을 완전히 마취시켰다. 진통제 절차를 수술하기 대략 30분 전에 부프레노르핀 (Buprenorphine)을 주사하고, 다음날에 또 다시 주사하도록 설정하였다.
수술: 각 동물에, 요추 수준에서 척추를 따라 세로로 피부를 절개하였다. 1마리의 랫트에, 피부 절개의 양쪽에서 근육 스톨을 수득하였다 (즉, 스톨을 요추 근육 내에 수행하였음). 스톨을 소작하였다. 이 스톨 내에 입자 단독을 이식하였다. 10마리의 랫트에, 생체재료를 소작된 요추 근육에 봉합하였다. 수술 절차 후, 피부 상처를 수술용 스테이플 (staple)을 사용하여 봉합하였다.
임상 추적 조사
동물의 일반적인 임상 상태를 실험 기간 동안 매일 확인하였다. 호흡기, 눈, 심혈관, 위장관 징후; 운동 활동 및 거동; 발작 징후; 피부 평가; 이식 부위에서의 염증에 중점을 둔 상세한 임상 추적 조사를 일주일에 2회 수행하였다.
또한, 상세한 임상 추적 조사와 동시에 체중을 주 2회 측정하였다.
최종 절차 및 사후 분석
29일째에, 동물을 방혈에 의해 희생시키고, 거시적 평가를 수행하였다. 부검 동안, 사체의 외부 양상을 관찰하고, 가능한 내부 병변 이상을 나타내는 병리학적 유체 손실이 기록하였다.
심장, 신장, 비장, 간 및 폐에 중점을 두어, 피험체 기관의 임의의 병변 변형을 평가하기 위해 흉부 및 복강을 넓게 개방하였다.
이식재 부위에서의 거시적 평가
근육 이식재 부위를 노출시키고, 국소 조직 반응 및 이식재의 존재 및 국소화에 중점을 둔 상세한 거시적 평가를 수행하였다 (방사선 분석).
근육 이식재 부위를 함께 제거하였다. 외식편을 실온에서 48시간 동안 중성 완충 포르말린 용액에 고정시켰다.
3D 조직 외형 측정 분석
소형 동물 영상화 SkyScan1076을 위한 고해상도 X-선 마이크로-CT 시스템을 사용하여 표본의 무기질화 분석을 수행하였다.
근육 샘플을 다음 파라미터를 사용하여 실온에서 스캔하였다: 공급 전압: 50 kV; 회전 단계: 0.5°; 픽셀 크기: 18 μm; 위치당 1 프레임.
CTvol 및 CTan 소프트웨어 (Skyscan)를 사용하여 스캔의 3차원 재구성 및 무기질화된 조직의 분석을 수행하였다.
각각의 샘플에서, 골 무기질화된 조직과 유사한 신호의 양 (임계값 40/255)을 결정하였다 (골 부피: BV로 확인됨). 사용된 "조직 부피" 값은 제형화된 이식재의 부피이다.
조직병리학 및 2D 조직 외형 측정 분석
산물의 생체내 혈관형성 및 골유도 특성을 평가하기 위해 근육 샘플에 대해 조직학적 분석을 수행하였다.
포르말린 고정 외식편을 EDTA 15%에서 13일 동안 탈석회화시켰다. 이어서, 샘플을 탈수시키고, 파라핀에 포매시켰다. 4 내지 5 μm의 절편을 마이크로톰을 사용하여 절단하고, 슬라이드에 펼쳤다. 150 μm 떨어진 2개의 상이한 수준에서 절편화를 수행하였다.
이들 2개의 절편 영역에서, 헤마톡실린-에오신 (HE), 메이슨 트리크롬 (MT) 및 CD146의 면역조직화학을 수행하였다 (파라핀에 포매되거나 동결된 표본의 절편 사용).
완전히 염색된 절편의 이미지를 디지털 슬라이드 스캐너 (Nanozoomer, Hamamatsu)를 사용하여 수득하였다. 혈관이 차지하는 영역의 정량화 (Trichrome Masson, CD146)를 NDPview2 소프트웨어를 사용하여 수행하였다: 대상 영역을 조직 특징을 기반으로 수동으로 확인하여, 절편의 "이식재 부위" 영역을 규정하였다. 대상 영역에서 혈관이 차지하는 영역을 정량화하기 위해 각 혈관을 수동으로 확인하였다. 혈관에 해당하는 표면 및 혈관의 수를 "이식재 부위"의 총 영역에 대해 기록하였다.
13.2. 결과
13.2.1. 조직학적 분석
조직 내 세포의 수를 HE 염색 후에 측정하였다 (도 29): 146.5 ± 50.4 세포/mm2.
조직의 폰 코사 염색에 의해 입자에 국한된 약한 무기질화가 나타났다 (도 30).
13.2.2. 생체재료의 생체활성에 대한 생체내 연구
병태 또는 유의한 병변의 징후는 관찰되지 않았으며, 이는 산물이 동물에 부작용을 유발하지 않았음을 나타낸다. 실험 과정 동안 기록된 동물의 체중에 의하면, 모든 동물이 2일째에 중량 증가를 나타내지 않았고, 그 후 2일 내지 28일째에 규칙적인 중량 증가가 나타난 것으로 확인된다. 수술 직후 중량 증가의 부재가 종종 관찰되며, 이는 시험된 산물의 임의의 독성 징후로 간주되지 않는다. 2일 내지 28일째에 관찰된 규칙적인 중량 증가는 입자가 동물 대사에 영향을 미치지 않았음을 확인시킨다. 생체내 실험 종료시 부검에 의하면 거시적 기관 병변이 나타나지 않았다.
이식재 부위의 무기질 함량
29일째에 수행된 방사선 사진에서 생체재료가 이식된 모든 부위에서 무기질화를 나타내는 방사선 불투과성 구조의 존재가 관찰되었다 (도 31).
근육 내에 무기질화된 조직의 형성 백분율을 정량화하기 위해, "이식재 부위"의 무기질화 분석을 소형 동물 영상화 SkyScan1076의 고해상도 X-선 마이크로-CT 시스템을 사용하여 수행하였다. 결과는 표 10에 제시되어 있다.
소형 동물 영상화 SkyScan1076의 고해상도 X-선 마이크로-CT 시스템의 결과
샘플 BV 40/255 (mm3) TV (mm3) BV/TV (%)
NG-987 76.7677 514.6821 0.1492
NG-988 22.7560 518.1965 0.0439
NG-989 121.3495 470.9364 0.2577
NG-990 137.0365 724.1618 0.1892
NG-991 44.8830 519.4913 0.0864
NG-992 23.1673 560.8324 0.0413
NG-993 48.1291 496.7399 0.0969
NG-994 21.2821 791.3064 0.0269
NG-995 123.9947 638.3353 0.1942
NG-996 52.9368 561.4798 0.0943
분석에 의하면, 생체재료가 이식된 각각의 부위에서 현저한 함량의 무기질화 조직이 존재하고, 평균 BV/TV는 0.118인 것으로 나타났다.
이식재의 신생혈관형성
신생혈관형성을 기록하기 위해 섬유질 결합 조직에서 모세관의 존재를 검사하였다.
메이슨 트리크롬 염색 후, 이식재 및 근육과 이식재 부위 사이의 접합부에서 혈관의 수/영역 및 혈관 밀도를 정량화하였다.
생체재료에 의한 이식재는 메이슨 트리크롬 염색에 의해 혈관화된 것으로 나타났으며, 수는 40.8 ± 18.5 혈관/mm2이었다.
실시예 14: 고혈당/허혈성 이종 랫트 모델에서의 생체내 효능 연구
14.1. 재료 및 방법
14.1.1 동물
250 내지 300 g의 56마리의 암컷 Wistar 랫트에 스트렙토조토신 (streptozotocin) (50 mg/kg)을 복강내 투여하였다. 스트렙토조토신 투여 후 7일 내지 10일째에, 혈당 수준을 혈당 테스트 스트립에 의해 꼬리 정맥혈로부터 측정하였다. 글루코스 수준이 11.1 mM 초과인 랫트는 고혈당으로 상정하고 연구에 포함시켰다 (n-42마리의 랫트).
문헌[Levigne et al (Biomed Res Int 2013)]에 기재된 바와 같이 각각의 랫트의 좌측 다리에서 허혈을 유도하였다. 털을 제거한 서혜 (inguinal) 부위의 세로 절개를 통해 외부 장골 및 대퇴 동맥을 공통 장골로부터 복재 동맥까지 해부하였다. 허혈 조건을 유발하기 위해, 해부된 동맥을 좌측 다리의 총 장골로부터 절개하고, 우측 다리 동맥을 보존하고, 다리를 비 허혈성으로 상정하였다. 모든 수술 절차는 수술 현미경 (Carl Zeiss, Germany, Jena, Germany) 하에서 수행하였고, 유도의 경우 5%, 마취 유지의 경우 3%의 이소플루란을 흡인시켜 동물을 마취시켰다.
동물을 무작위로 3개의 그룹으로 분류하였다:
- 모의 그룹 (n=10 암컷 Wistar 랫트);
- Cultispher 그룹 (n=10 암컷 Wistar 랫트), 즉, 입자 단독;
- 생체재료 그룹 (n=14 암컷 Wistar 랫트), 즉, 조직을 형성하는 ASC 및 젤라틴 입자.
14.1.2 시험 항목
약 0.5 g의 Cultispher 입자의 14개의 샘플을 제조하고, 감마선을 조사하였다.
약 2 cm2의 생체재료 (실시예 10에 기재된 바와 같이 8주의 성숙 동안 1.5 cm3의 Cultispher S와 함께 배양된 ASC)의 14개의 샘플을 이식을 위해 제조하였다.
샘플의 성장 인자 함량을 평가하기 위해, 단백질 추출 및 정량화 (VEGF, IGF1, SDF-1α)를 위해 하나의 생체재료 샘플을 제조하였다.
생체재료의 품질을 평가하기 위해, 헤마톡실린-에오신 (HE) 착색을 위해 샘플을 포르몰에 고정시켰다. HE 염색 후, 조직의 세포 수를 계수하여, 탈세포화 처리 효능의 평가를 확인하였다.
14.1.3 상처 치유의 거시적 평가
이식 후, 0, 15, 24 및 34일째에 다리 사진을 촬영하였다.
상처 봉합을 정량화하기 위해, 상처 영역을 2개의 독립적인 조작자에 의해 Image J 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석에 의해 측정하였다. 곡선하면적을 D0과 D34 사이의 각 시점에서 측정된 상처 영역에 대해 계산하고, 100%로 고정된 모의 그룹과 비교하여 표시하였다.
14.1.4 상처 치유의 현미경 평가
다리를 절개하여 상처 조직을 제거하고, 이러한 가장 이후의 것을 세로로 배향시키고, 조직의 전체 두께의 조직학적 슬라이드를 제조하였다. 표피 (문헌[op't Veld RC et al, Biomaterials 2018]) 및 피부 점수 (문헌[Yates C et al, Biomaterials 2007])를 위해 5 μm의 조직학적 슬라이드를 제조하고, HE로 염색하였다:
3개의 대표적인 상처 절편 (중추 및 말초)에서의 표피 치유 점수:
- 0: 상피 세포의 이동 없음,
- 1: 일부 이동,
- 2: 케라틴화 부재/일부 케라틴화의 완전 이동
- 3: 완전한 케라틴화의 완전한 이동,
- 4: 진행된 비대.
3개의 대표적인 상처 절편 (중추 및 말초)에서의 진피 치유 점수:
- 0: 치유되지 않음,
- 1: 염증 침윤,
- 2: 과립화 조직 존재-섬유 증식 및 혈관형성
- 3: 과립 조직을 대체하는 콜라겐 침착이 50% 초과임,
- 4: 비대성 섬유증 반응.
또한, 면역 및 염증 반응의 평가를 위해 조직 외형 측정 및 CD3, CD68 면역염색에 의한 혈관 영역의 평가를 위해 메이슨 트리크롬 착색을 수행하였다. 또한, 이식 후, 인간 세포의 존재를 확인하기 위해 KU80 염색을 수행하였다.
14.2. 결과
스트렙토조토신 주사가 제공된 56마리의 랫트에서, 42마리는 고혈당이 발생하였고, 이를 연구를 위해 선택하였고, 14마리는 저혈당을 나타내었고, 외과적 합병증이 발생하였으며, 따라서 이를 연구에서 제외하였다.
14.2.1. 상처 치유의 거시적 평가
상처의 거시적 사진이 도 32에 제시되어 있다. 다른 그룹 (모의 대조군 및 입자 단독)과 비교하여 생체재료 그룹에서 수술 후, 15일 (D15)째부터 더 우수한 상처 치유를 관찰할 수 있다. 이 차이는 허혈성 및 비 허혈성 상처 둘 모두에서 볼 수 있다.
비 허혈성 상처에 대한 곡선하면적의 결과는 도 33에 제시되어 있다. Cultispher 단독의 경우의 이식은 처리되지 않은 동물과 비교하여, 상처 치유가 각각 23% 감소한 것으로 나타났다. 이와 달리, 본 발명의 생체재료로 처리된 그룹에서 더 우수한 상처 치유 (25%)가 나타났다.
D0과 D34 사이의 비 허혈성 상처에 대한 상처 영역의 전개는 도 34에 제시되어 있다. 본 발명의 생체재료로 처리된 상처는 다른 그룹과 비교하여 D21에서 D34까지 더 낮은 비치유성 조직을 나타낸다는 점에 주목한다.
14.2.2. 상처 치유의 현미경 평가
각각의 시점에서 비 허혈성 상처에 대해 평가된 표피 및 진피 점수는 도 35에 제시되어 있다. 다른 그룹과 비교하여 본 발명의 생체재료에 대해 더 빨리 진피 및 표피가 나타났다.

Claims (18)

  1. 인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함하는 골형성 분화 배지 중 골형성 분화 지방 유래 줄기세포 (ASC), 생체적합성 재료 및 세포외 기질(extracellular matrix)을 포함하는 다차원 구조를 갖는 스캐폴드-무함유 생체재료(biomaterial)로서,
    상기 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM)의 입자, 하이드록시아파타이트 (HA) 입자, β-인산삼칼슘(β-TCP) 입자, HA/β-TCP 입자, 또는 젤라틴 입자이며,
    상기 생체재료는 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin) (OPG)을 분비하는, 생체재료.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체재료는 생체재료 g당 적어도 약 5 ng의 OPG를 분비하는, 생체재료.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생체재료는 생체재료 g당 적어도 약 10 ng의 OPG를 분비하는, 생체재료.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM)의 입자인, 생체재료.
  6. 제5항에 있어서, DBM 입자는 약 50 내지 약 2500 μm의 범위의 평균 직경을 갖는, 생체재료.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 재료는 하이드록시아파타이트 (HA) 입자, β-인산삼칼슘(β-TCP) 입자, 또는 HA/β-TCP 입자인, 생체재료.
  8. 제7항에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트 (HA) 입자, β-인산삼칼슘(β-TCP) 입자, 또는 HA/β-TCP 입자는 약 50 μm 내지 약 1500 μm의 범위의 평균 크기를 갖는, 생체재료.
  9. 삭제
  10. 삭제
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  12. 제1항에 있어서, 상기 생체재료는 생체재료 g당 적어도 약 10 ng의 VEGF를 포함하는, 생체재료.
  13. 제1항에 있어서, 상기 생체재료는 3차원 (3D)인, 생체재료.
  14. 제1항에 따른 다차원 생체재료를 포함하는 의료 장치.
  15. 제1항에 따른 다차원 생체재료를 생산하는 방법으로서,
    - 지방 유래 줄기세포 (ASC) 증식 단계,
    - 인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함하는 골형성 분화 배지 중 제4 계대에서의 ASC 골형성 분화 단계, 및
    - 생체적합성 재료의 존재 하에 다차원 유도 단계
    를 포함하며,
    상기 생체적합성 재료는 탈무기질화 골 기질 (DBM)의 입자, 하이드록시아파타이트 (HA) 입자, β-인산삼칼슘(β-TCP) 입자, HA/β-TCP 입자, 또는 젤라틴 입자인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 다차원 유도가 3차원 (3D) 유도인, 방법.
  17. 제15항에 따른 방법에 의해 수득 가능한 다차원 생체재료.
  18. 골 및/또는 연골 결손 치료용으로 사용하기 위한, 제1항에 따르는 생체재료를 포함하는 약제학적 조성물.
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