JP7273418B2 - 脂肪由来幹細胞を含む無足場構造物用生体材料およびその作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞および多次元生体材料の作製へのその使用の分野に関する。具体的には、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を含む生体材料、そのような生体材料を治療用に調製および使用する方法に関する。

骨欠損とは、通常であれば骨であるべき身体領域に骨組織がないことである。骨欠損は様々な外科的方法によって治療することができる。しかし、多くの場合、糖尿病、免疫抑制療法、運動状態の不良および処置を計画する際に考慮に入れる必要のあるその他の因子など、骨治癒の障害となる因子が存在する。

骨欠損を再建する外科的方法としては、特に皮質剥離、切除および固定、海綿骨移植ならびにイリザロフの介在骨輸送法が挙げられる。ただし、患者の歩行障害の期間が長くなり、機能面および審美面からみた結果も最適ものとならないことが多い。

組織工学では、生細胞の使用によって組織の構造または機能を回復させる。一般的工程は、細胞の単離および増殖と、それに続く足場材料を使用する再移植処置とからなる。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、成熟組織の細胞の優れた代替物となり、骨および軟骨の組織再生の細胞供給源として多数の利点がある。

定義によれば、幹細胞は、自己再生することが可能であり、多系列に分化し、最終的に分化細胞を形成することが可能であることを特徴とするものである。理想的には、再生医療に適用する幹細胞は、以下の基準を満たすべきである：（ｉ）大量に（数百万～数十億個の細胞が）存在するべきである；（ｉｉ）低侵襲性の方法によって収集および回収することができる；（ｉｉｉ）再現可能に複数の細胞系列経路に沿って分化することができる；（ｉｖ）自家宿主または同種宿主に安全かつ効率的に移植することができる。

複数の研究で、幹細胞には中胚葉、内胚葉および外胚葉起源の細胞に分化する能力があることが明らかにされている。ＭＳＣの可塑性はほとんどの場合、幹細胞内に保持している、系列の境界を越え、他の組織に固有の細胞の表現型の特性、生化学的特性および機能的特性を取り入れる先天的能力を指す。成体間葉系幹細胞は、例えば骨髄および脂肪組織から単離することができる。

脂肪由来幹細胞は多能性であり、著明な再生能がある。この同じ脂肪組織細胞集団を識別するのに以下の用語：脂肪由来幹細胞／間質細胞（ＡＳＣ）；脂肪由来成体幹（ＡＤＡＳ）細胞、脂肪由来成体間質細胞、脂肪由来間質細胞（ＡＤＳＣ）、脂肪間質細胞（ＡＳＣ）、脂肪間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）、脂肪芽細胞、周皮細胞、脂肪前駆細胞、処理脂肪吸引組織（Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ Ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）（ＰＬＡ）細胞が用いられている。文献にこのように多様な命名法が用いられることにより、大きな混乱を招いた。この問題に対処するため、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆａｔ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｃｉｅｔｙは、単離されており、可塑性のある付着性の多能性細胞集団を識別するのに「脂肪由来幹細胞」（ＡＳＣ）という用語を採用することで意見が一致した。

骨原性分化ＡＳＣは様々な前臨床モデルで、様々な足場、例えばβリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、Ｉ型コラーゲン、ポリ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）およびアルギン酸などに播種すると大きな治癒能を示すことが明らかにされている。国際特許出願第２０１３／０５９０８９号は、幹細胞と、リン酸三カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムセメントの混合物とを含む、骨ペーストに関するものである。米国特許出願公開第２０１１／１０４２３０号には、合成セラミック材料と間葉系幹細胞とシグナル伝達分子とを含む足場材料を含む、骨パッチが開示されている。

しかし、小動物モデルでは有望な結果が得られているものの、足場に搭載したＡＳＣを用いる臨界サイズの骨再建は未だ、骨欠損のサイズが大きいことによる、したがって、設計する移植片の大きさによる制約を受けている。播種細胞の細胞生着についても、酸素および栄養素の拡散不良による制約を受けている。さらに、足場内での細胞の位置が、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの生存率に対する大きな制約となっている。細胞をより均一に分布させる移植片内での細胞遊走、移植片の中心部に酸素および栄養素を送達することによる細胞生存ならびに（流体せん断力による）骨原性細胞分化が改善されるように、足場のフロー灌流を備えたバイオリアクターが設計されている。これらの技術は有望なものではあるが、大型動物モデルでの関連する前臨床および臨床データが少ない。

このように、当該技術分野では依然として、完全に生体に適合し、指定された用途に適した機械的特徴をもたらす、骨組織再生のための組織設計材料が必要とされている。したがって、本発明は、生体適合材料を有する多次元骨原性構造物に分化したＡＳＣから作製される、移植片に関するものである。

本発明は、骨原性分化脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と生体適合材料と細胞外基質とを含む多次元構造を有し、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を分泌する、生体材料に関する。

一実施形態では、生体材料は、ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり約５ｎｇ、好ましくは少なくとも約１０ｎｇ／ｇ分泌する。

一実施形態では、生体適合材料は粒子の形態である。

一実施形態では、生体適合材料は脱灰骨基質（ＤＢＭ）の粒子である。一実施形態では、ＤＢＭ粒子は、約５０～約２５００μｍの範囲の平均径を有する。

一実施形態では、生体適合材料はリン酸カルシウムの粒子である。一実施形態では、リン酸カルシウムの粒子は、約５０μｍ～約１５００μｍの範囲の平均サイズを有する。

一実施形態では、リン酸カルシウムの粒子は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）および／またはβリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）の粒子である。一実施形態では、リン酸カルシウムの粒子は、１０／９０～９０／１０の範囲の比のＨＡ／β－ＴＣＰの粒子である。別の実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰの粒子は２０／８０～８０／２０の比である。別の実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰの粒子は６５／３５の比である。

一実施形態では、生体適合材料はゼラチンの粒子である。好ましい実施形態では、生体適合材料はブタゼラチンの粒子である。

一実施形態では、生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも生体材料１ｇ当たり約１０ｎｇ含む。

一実施形態では、生体材料は三次元のものである。

ある特定の実施形態では、生体材料は成形可能または形成可能なものである。

本発明は、本発明による多次元生体材料を含む、医療装置または医薬組成物にも関する。

本発明のまた別の目的は、本発明による多次元生体材料を作製する方法であって、
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖の段階と、
第４継代でのＡＳＣ骨原性分化の段階と、
多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階と
を含む、方法である。

本発明はさらに、本発明による方法によって得られる多次元生体材料に関する。

本発明のまた別の目的は、骨欠損および／または軟骨欠損の治療に使用する、本発明による生体材料である。

定義
本発明では、以下の用語は以下のような意味を有する：

値の前に記載される「約」という用語は、前記値±１０％の値を意味する。

「脂肪組織」という用語は、任意の脂肪組織を指す。脂肪組織は、皮下、大網／内臓、乳房、性腺またはその他の脂肪組織部位に由来する、褐色脂肪組織または白色脂肪組織であり得る。好ましくは、脂肪組織は皮下白色脂肪組織である。このような細胞は、初代細胞培養物または不死化細胞系列を含み得る。脂肪組織は、脂肪組織を有し、生存している、または死亡した任意の生物体に由来するものであり得る。好ましくは、脂肪組織は動物、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくは、脂肪組織はヒトである。脂肪組織の便利な供給源として脂肪吸引術由来のものがあるが、脂肪組織の供給源も脂肪組織単離の方法も本発明にとって重要なものではない。

本明細書で使用される「脂肪由来幹細胞」（「脂肪組織由来幹細胞」とも呼ばれる）という用語は、脂肪組織の「非脂肪細胞」分画を指す。細胞は、新鮮なものであっても、培養したものであってもよい。「脂肪由来幹細胞」（ＡＳＣ）は、脂肪組織に由来し、様々な異なる細胞型、例えば、特に限定されないが、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などへの前駆体としての役割を果たし得る、間質細胞を指す。

本明細書で使用される「セラミック材料」という用語は、無機非金属固体材料を指す。セラミック材料は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、硫酸カルシウム、水酸化カルシウム（Ｃａ［ＯＨ］２）またはその組合せの粒子であり得る。セラミック材料は粒子の形態であり得る。セラミック材料は、粉末、ビーズまたは顆粒の形態であり得る。セラミック材料は多孔性であり得る。

「再生」または「組織再生」という用語は、特に限定されないが、本開示のＡＳＣからの新たな細胞型または組織の成長、発生または再建を含む。一実施形態では、細胞型または組織としては、特に限定されないが、骨原性細胞（例えば、骨芽細胞）、軟骨細胞、内皮細胞、心筋細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神経細胞および筋管が挙げられる。特定の実施形態では、「再生」または「組織再生」という用語は、本開示のＡＳＣからの骨原性細胞（例えば、骨芽細胞）の発生または再建を指す。

本明細書で使用される「成長因子」という用語は、組織成長、細胞増殖、血管新生などを促進する分子のことである。特定の実施形態では、「成長因子」という用語は、骨組織形成を促進する分子を含む。

本明細書で使用される「培養された」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの環境で細胞分裂の過程にある、または細胞分裂の過程にない１つまたは複数の細胞を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するのに適した当該技術分野で公知の任意の培地、例えば、適切な液体培地または寒天などであり得る。細胞培養に適したｉｎ ｖｉｔｒｏの環境の具体例が、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），１９９４，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｅｌｌｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（ｖｏｌ．１），１９９８，Ｄ．Ｌ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｒ．Ｄ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｌ．Ａ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａ，１９９４，Ｄ．Ｃ．Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．に記載されている。

「コンフルエンシー」という用語は、細胞培養表面（培養皿またはフラスコなど）の付着細胞の数、すなわち、細胞によって覆われている表面の割合を指す。１００％のコンフルエンシーは、表面が細胞によって完全に覆われていることを意味する。一実施形態では、「細胞がコンフルエンスに達する」または「細胞がコンフルエントである」という表現は、細胞が表面の８０～１００％を覆ったことを意味する。一実施形態では、「細胞がサブコンフルエントである」という表現は、細胞が表面の６０～８０％を覆っていることを意味する。一実施形態では、「細胞がオーバーコンフルエントである」という表現は、細胞が少なくとも表面の１００％を覆っている、かつ／または数時間または数日以来、１００％のコンフルエントであることを意味する。

「冷蔵すること」または「冷蔵」という用語は、対象の正常な生理的温度未満の温度にする処理を指す。例えば、長期間にわたって、例えば、少なくとも約１時間、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約４週間、少なくとも約６か月などにわたって、約－１９６℃～約＋３２℃の範囲内で選択される１つまたは複数の温度で。一実施形態では、「冷蔵すること」または「冷蔵」は、０℃未満の温度にする処理を指す。冷蔵することは、手作業で実施しても、好ましくは、冷蔵プログラムを実行することが可能な特別の装置を用いて実施してもよい。一実施形態では、「冷蔵」という用語は、当該技術分野で「凍結すること」および「凍結保存」として知られる方法を含む。当業者には、冷蔵方法が、冷蔵目的で試薬を添加することを含めた他の段階を含み得ることが理解されよう。

本明細書で使用される「非胚細胞」という用語は、胚から単離されるものではない細胞を指す。非胚細胞は、分化したものであっても未分化のものであってもよい。非胚細胞は、ほぼあらゆる体細胞、例えば子宮外の動物から単離した細胞などを指し得る。一実施形態では、非胚細胞は生殖細胞を含む。これらの例は、限定することを意図するものではない。

本明細書で使用される「分化細胞」という用語は、特殊化していない表現型から特殊化した表現型に発生した前駆細胞を指す。例えば、脂肪由来幹細胞は骨原性細胞に分化し得る。

本明細書で使用される「分化培地」という用語は、分化細胞を作製するのに本発明の培養系で使用する化合物の集合物の１つを指す。化合物の作用機序に関しては、いかなる限定も意図されない。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導または補助する、特定の表現型を有する細胞の増殖を促進する、または他の細胞の増殖を遅らせることによって、分化過程を補助するものであり得る。薬剤は、培地中に存在するか、細胞集団によって合成され、望ましくない細胞型への経路に沿って分化を指令する可能性のある他の因子に対して、阻害剤として作用し得るものであってもよい。

「治療」、「治療すること」または「軽減」という用語は、目的を骨欠損を予防すること、または速度を低下させる（減少させる）こととする、治療的処置を指す。治療を必要とする者には、既に障害を有する者および障害を発症しやすい者または骨欠損を予防するべき者が含まれる。治療量の本発明の方法による生体材料を入れた後、患者に、骨欠損の軽減および／または骨欠損による１つもしくは複数の症状のある程度の緩和；罹病率および死亡率の低下ならびに生活の質の改善のうち１つまたは複数のものについて観察可能かつ／または測定可能な軽減または不在がみられる場合、対象の骨欠損が良好に「治療された」ことになる。疾患の良好な治療および改善を評価するための上記パラメータは、医師がよく知るルーチンの方法によって容易に測定可能なものである。

本開示の生体材料の治療的使用に関連して、「同種」療法では、ドナーとレシピエントが同じ種に属する異なる個体であるのに対して、「自家」療法では、ドナーとレシピエントが同じ個体であり、「異種」療法では、ドナーは、レシピエントと異なる種に属する動物に由来するものである。

「有効量」という用語は、臨床結果を含めた有益な結果または所望の結果を得るのに十分な量を指す。有効量を１回または複数回の投与で投与することができる。

「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。対象の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、ウシおよびそのトランスジェニック種が挙げられる。一実施形態では、対象は「患者」、すなわち、医療を受けるのを待っているか受けている、または医療処置の対象であった／である／となる、または疾患の発症を監視している温血動物、より好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は成体（例えば、１８歳超のヒト対象）である。別の実施形態では、対象は子供（例えば、１８歳未満のヒト対象）である。一実施形態では、対象は雄である。別の実施形態では、対象は雌である。

「生体適合性」という用語は、細胞、細胞培養物、組織または生物体などの生体系に適合する、無毒性材料を指す。

「脱灰骨基質」または「ＤＢＭ」という用語は、脱細胞化し脱灰した骨の断片を指す。一実施形態では、当該分野の成功事例に従ってＤＢＭを調製する。一実施形態では、ヒト死体同種移植骨を一定の大きさに粉砕した後、ミネラル化相を弱い鉱酸で抽出することによってＤＢＭを調製する。

「多次元」という用語は、２以上の次元、例えば二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ）を指す。一実施形態では、多次元構造を有する生体材料は、２Ｄまたは３Ｄ構造を有する生体材料を指す。

（詳細な説明）
本発明は、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）と生体適合材料と細胞外基質とを含む多次元構造を有し、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を含む、生体材料に関する。

本明細書で使用される「多次元構造を有する生体材料」という用語は、本発明全体を通して「多次元生体材料」という用語に置き換えられ得る。

一実施形態では、細胞は、脂肪組織から単離されるものであり、以降、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と呼ぶ。

一実施形態では、ＡＳＣ組織は動物起源、好ましくは哺乳動物起源、より好ましくはヒト起源のものである。したがって、一実施形態では、ＡＳＣは動物ＡＳＣ、好ましくは哺乳動物ＡＳＣ、より好ましくはヒトＡＳＣである。好ましい実施形態では、ＡＳＣはヒトＡＳＣである。

脂肪組織から幹細胞を単離する方法は当該技術分野で公知であり、例えばＺｕｋら（Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００１，７：２１１－２２８）に開示されている。一実施形態では、脂肪吸引術によって脂肪組織からＡＳＣを単離する。

例として、針生検または脂肪吸引術による吸引によって脂肪組織を収集し得る。最初に、任意選択で抗生物質、例えば１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で組織試料を徹底的に洗浄することによって、脂肪組織からＡＳＣを単離し得る。次いで、試料を組織消化用のコラゲナーゼ（例えば、２％Ｐ／Ｓを含有するＰＢＳで調製したＩ型コラゲナーゼ）とともに無菌組織培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートし得る。培地（例えば、１０％血清を含有するＤＭＥＭ）を添加することによってコラゲナーゼ活性を中和し得る。崩壊後、試料をチューブに移し得る。試料を（例えば、２０００ｒｐｍで５分間）遠心分離することによって、ＡＳＣが含まれる間質血管細胞群（ＳＶＦ）が得られる。間質細胞と初代脂肪細胞との分離を完了させるため、試料を激しく振盪して、ペレットを徹底的に破壊し、細胞をかき混ぜ得る。遠心分離段階を反復し得る。遠心分離しコラゲナーゼ溶液を吸引した後、ペレットを溶解緩衝液に再懸濁させ、氷上で（例えば１０分間）インキュベートし、（例えばＰＢＳ／２％Ｐ／Ｓで）洗浄し、（例えば、２０００ｒｐｍで５分間）遠心分離し得る。次いで、上清を吸引し、細胞ペレットを培地（例えば、間質培地、すなわち、２０％ＦＢＳ、１％Ｌ－グルタミンおよび１％Ｐ／Ｓを添加したα－ＭＥＭ）に再懸濁させ、細胞懸濁液を（例えば７０μｍのセルストレーナーで）ろ過し得る。最後に、細胞が含まれる試料を培養プレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし得る。

一実施形態では、脂肪組織の間質血管細胞群から本発明のＡＳＣを単離する。一実施形態では、脂肪吸引組織を使用前に室温で数時間もしくは＋４℃で２４時間、または長期保存に０℃未満、例えば－１８℃で保持し得る。

一実施形態では、ＡＳＣは、新鮮なＡＳＣまたは冷蔵したＡＳＣであり得る。新鮮なＡＳＣとは、冷蔵処理を実施していない単離ＡＳＣのことである。冷蔵したＡＳＣとは、冷蔵処理を実施した単離ＡＳＣのことである。一実施形態では、冷蔵処理は、０℃未満の任意の処理を意味する。一実施形態では、冷蔵処理を約－１８℃、－８０℃または－１８０℃で実施し得る。特定の実施形態では、冷蔵処理は凍結保存であり得る。

冷蔵処理の例として、ＡＳＣを８０～９０％のコンフルエンスで回収し得る。洗浄および皿からの剥離の段階の後、細胞を冷蔵保存培地とともに室温でペレット化し、バイアルに入れ得る。一実施形態では、冷蔵保存培地は、８０％ウシ胎児血清またはヒト血清、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および１０％ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２を含む。次いで、バイアルを－８０℃で一晩保管し得る。例えば、バイアルを－８０℃に達するまで毎分約１℃で徐々に冷却するアルコール凍結容器に入れ得る。最後に、凍結したバイアルを長期保存用の液体窒素容器に移し得る。

一実施形態では、ＡＳＣは分化ＡＳＣである。好ましい実施形態では、ＡＳＣは骨原性分化ＡＣＳである。換言すれば、好ましい実施形態では、ＡＳＣを骨原性細胞に分化させる。特定の実施形態では、ＡＳＣを骨芽細胞に分化させる。

骨原性分化を制御および評価する方法は当該技術分野で公知である。例えば、オステオカルシンおよび／または（例えばフォン・コッサで）リン酸塩を染色することによって；（例えばアリザリンレッドで）リン酸カルシウムを染色することによって；磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって；ミネラル化基質形成の測定によって；あるいはアルカリホスファターゼ活性の測定によって、本発明の細胞または組織の骨分化を評価し得る。

一実施形態では、ＡＳＣを骨原性分化培地（ＭＤ）で培養することによって、ＡＳＣの骨原性分化を実施する。

一実施形態では、骨原性分化培地はヒト血清を含む。特定の実施形態では、骨原性分化培地はヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含む。一実施形態では、骨原性分化培地は他のいかなる動物血清も含まず、好ましくは、骨原性分化培地はヒト血清以外の血清を含まない。

一実施形態では、骨原性分化培地は、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびリン酸ナトリウムを添加した増殖培地を含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよび／またはアンホテリシンＢなどの抗生物質をさらに含む。一実施形態では、いずれの培地も動物タンパク質を含まない。

一実施形態では、増殖培地は、細胞の成長を補助するよう考案された当業者に公知の任意の培地であり得る。本明細書で使用される増殖培地は、「成長培地」とも呼ぶ。成長培地の例としては、特に限定されないが、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＦＧＭもしくはＦＧＭ－２、１９９／１０９培地、ＨａｍＦ１０／ＨａｍＦ１２またはＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａが挙げられる。好ましい実施形態では、増殖培地はＤＭＥＭである。

一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ａｌａ－Ｇｌｎ、「Ｇｌｕｔａｍａｘ（登録商標）」または「Ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ（登録商標）」とも呼ばれる）、ｈＰＬ、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびリン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびリン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンＢを添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。

一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）、ペニシリン（約１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（約１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地はアンホテリシンＢ（約０．１％）をさらに含む。

一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）を添加したＤＭＥＭよりなる。一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）、ペニシリン（約１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（約１００μｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（約０．１％）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。

一実施形態では、ＡＳＣは後期継代脂肪由来幹細胞である。本明細書で使用される「後期継代」という用語は、少なくとも継代４以降に分化した脂肪由来幹細胞を意味する。本明細書で使用される継代４は第４継代、すなわち、細胞を培養容器の表面から剥離することによって分けた後、新鮮培地に再懸濁させる４回目の行為を指す。一実施形態では、後期継代脂肪由来幹細胞を継代４、継代５、継代６またはそれ以降に分化させる。好ましい実施形態では、ＡＳＣを継代４以降に分化させる。

本明細書で使用される「容器」という用語は、任意の細胞培養表面、例えばフラスコまたはウェルプレートなどを意味する。

初代細胞の初期継代は継代０（Ｐ０）と呼ばれた。本発明では、継代Ｐ０は、ペレット化した間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞懸濁液を培養容器に播種することを指す。したがって、継代Ｐ４は、細胞を培養容器の表面から（例えば、トリプシンでの消化によって）４回（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４に）剥離し、新鮮培地に再懸濁させたことを意味する。

一実施形態では、本発明のＡＳＣを第４継代まで増殖培地で培養する。一実施形態では、本発明のＡＳＣを第４継代以降、分化培地で培養する。したがって、一実施形態では、継代Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で、ＡＳＣを培養容器の表面から剥離し、次いで、増殖培地で適切な細胞密度まで希釈する。さらにこの実施形態では、継代Ｐ４でＡＳＣを培養容器の表面から剥離し、次いで、分化培地で適切な細胞密度まで希釈する。したがって、この実施形態では、Ｐ４で、本発明のＡＳＣを分化させる（すなわち、分化培地で培養する）前に、これを増殖培地に再懸濁させ、コンフルエンスに達するまで培養するのではなく、分化培地に直接再懸濁させ、培養する。

一実施形態では、細胞を少なくともコンフルエンス、好ましくは７０％～１００％のコンフルエンス、より好ましくは８０％～９５％のコンフルエンスに達するまで骨原性分化培地で維持する。一実施形態では、細胞を少なくとも５日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１５日間、骨原性分化培地で維持する。一実施形態では、細胞を５～３０日間、好ましくは１０～２５日間、より好ましくは１５～２０日間、骨原性分化培地で維持する。一実施形態では、分化培地を２日毎に交換する。ただし、当該技術分野で公知のように、細胞成長速度はドナーによってわずかに異なる可能性がある。したがって、骨原性分化の継続期間および培地交換の回数は、ドナーによって異なりものとなり得る。

一実施形態では、細胞を少なくとも類骨、すなわち、骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分の形成まで、骨原性分化培地で維持する。

一実施形態では、本発明の生体適合材料は、本明細書で生体適合性粒子と呼ぶ粒子の形態である。一実施形態では、粒子は、ビーズ、粉末、球状物、マイクロスフェアなどであり得る。

一実施形態では、本発明の生体適合材料は、予め定められた３Ｄの形状または足場、例えば立方体などを形成するよう構築されていない。一実施形態では、本発明の生体適合材料は、予め定められた形状でも足場でもない。一実施形態では、本発明の生体適合材料は立方体の形状ではない。

一実施形態では、本発明の生体適合材料は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、セルロースなどの有機基質；ポリマー、例えばゼラチン、コラーゲン、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）、エラスチンなど；またはセラミック、例えばヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、βリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）、αリン酸三カルシウム（α－ＴＣＰ）、硫酸カルシウムなどを含み得る。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、約５０μｍ～約２５００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１５００μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約１０００μｍの範囲の平均径を有する。一実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、約２００μｍ～約６００μｍの範囲の平均径を有する。別の実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、約３００μｍ～約７００μｍの範囲の平均径を有する。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、少なくとも約５０μｍ、好ましくは少なくとも約１００μｍ、より好ましくは少なくとも約１５０μｍの平均径を有する。別の実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、少なくとも約２００μｍ、好ましくは少なくとも約２５０μｍ、より好ましくは少なくとも約３００μｍの平均径を有する。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、最大約２５００μｍ、好ましくは最大約２０００μｍ、より好ましくは最大約１５００μｍの平均径を有する。別の実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、最大約１０００μｍ、好ましくは最大約９００μｍ、より好ましくは少なくとも最も約８００μｍ、さらにより好ましくは最大約７００μｍの平均径を有する。

特定の実施形態では、本発明の生体適合性粒子は脱灰骨基質（ＤＢＭ）である。

一実施形態では、ＤＢＭは動物起源、好ましくは哺乳動物起源、より好ましくはヒト起源のものである。特定の実施形態では、ヒトドナーの皮質骨を粉砕することによってヒトＤＢＭを得る。

ＤＢＭを得る方法は当該技術分野で公知である。例えば、最初に、一晩にわたる（例えば９９％の）アセトン浴、次いで、２時間にわたる脱塩水での洗浄によって、ヒト骨組織を脱脂し得る。（例えば０．６Ｎの）ＨＣＬに室温で攪拌しながら３時間浸漬する（骨１グラム当たり２０ｍＬの溶液）ことによって、脱灰を実施し得る。次いで、脱灰した骨の粉末を脱塩水で２時間すすぎ得、ｐＨを調整する。ｐＨが酸性に傾きすぎる場合、攪拌しながらＤＢＭを（例えば０．１Ｍの）リン酸塩溶液で緩衝し得る。最後に、ＤＢＭを乾燥させ、重量を測定し得る。ＤＢＭを当該分野で公知の技術に従い、例えば約２５キログレイのガンマ線照射によって滅菌し得る。

一実施形態では、ＤＢＭは同種異系のものである。一実施形態では、ＤＢＭは同種のものである。別の実施形態では、ＤＢＭは異種のものである。

一実施形態では、ＤＢＭは、本明細書で脱灰骨基質粒子またはＤＢＭ粒子と呼ぶ粒子の形態である。一実施形態では、ＤＢＭ粒子は、約５０～約２５００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１５００μｍ、より好ましくは約５０μｍ～約１０００μｍの範囲の平均径を有する。一実施形態では、ＤＢＭ粒子は、約１００μｍ～約１５００μｍ、より好ましくは約１５０μｍ～約１０００μｍの範囲の平均径を有する。一実施形態では、ＤＢＭ粒子は、約２００～約１０００μｍ、好ましくは約２００μｍ～約８００μｍ、より好ましくは約３００μ～約７００μｍの範囲の平均径を有する。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、少なくとも約５０μｍ、好ましくは少なくとも約１００μｍ、より好ましくは少なくとも約１５０μｍの平均径を有する。別の実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、少なくとも約２００μｍ、好ましくは少なくとも約２５０μｍ、より好ましくは少なくとも約３００μｍの平均径を有する。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、最大約２５００μｍ、好ましくは最大約２０００μｍ、より好ましくは最大約１５００μｍの平均径を有する。別の実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、最大約１０００μｍ、好ましくは最大約９００μｍ、より好ましくは少なくとも最も約８００μｍ、さらにより好ましくは最大約７００μｍの平均径を有する。

一実施形態では、脱灰骨基質の量は、生体材料に３Ｄ構造を与えるのに最適なものである。一実施形態では、脱灰骨基質を培地１ｍＬ当たり約１～約２５ｍｇの範囲の濃度で加える。好ましい実施形態では、脱灰骨基質を培地１ｍＬ当たり約１～約２０ｍｇ、より好ましくは培地１ｍＬ当たり約５～約２０ｍｇの範囲の濃度で加える。

一実施形態では、脱灰骨基質を１５０ｃｍ^２の容器に対して約５００ｍｇ～約２０００ｍｇ、好ましくは約７５０ｍｇ～約１５００ｍｇ、より好ましくは約１０００ｍｇ～約１２５０ｍｇの範囲の濃度で加える。

一実施形態では、脱灰骨基質を培養容器１ｃｍ^２当たり約３ｍｇ～約１３ｍｇ、好ましくは約５ｍｇ～約１０ｍｇ、より好ましくは約６．５ｍｇ～約８ｍｇの範囲の濃度で加える。

一実施形態では、脱灰骨基質は年齢４０歳未満のドナーに由来するものである。ある実施形態では、骨基質の脱灰率は、約９０～約９９％、好ましくは約９５～約９８％の範囲内、さらにより好ましくは約９７％である。一実施形態では、脱灰率は、０．６ＮのＨＣｌを３時間にわたって用いる工程によって得られるものであるのが有利である。ある特定の実施形態では、脱灰骨基質を滅菌する。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）または水酸化カルシウム（Ｃａ［ＯＨ］２）の粒子である。

リン酸カルシウム粒子の例としては、特に限定されないが、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ、Ｃａ３［ＰＯ４］２）、αリン酸三カルシウム（α－ＴＣＰ、（α－Ｃａ３（ＰＯ４）２）、βリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ、β－Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ、Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ）、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６．５Ｈ２Ｏ）、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、ヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト／リン酸四カルシウム（ＨＡ／ＴＴＣＰ）などが挙げられる。

一実施形態では、本発明のセラミック材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）、硫酸カルシウムまたはその組合せを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、本発明のセラミック材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、βリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）、αリン酸三カルシウム（α－ＴＣＰ）、硫酸カルシウムまたはその組合せを含むか、これよりなるものである。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子はヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の粒子である。別の実施形態では、本発明の生体適合性粒子はβリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）の粒子である。別の実施形態では、本発明の生体適合性粒子はヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）の粒子である。換言すれば、一実施形態では、本発明のセラミック粒子は、ヒドロキシアパタイト粒子とβリン酸三カルシウム粒子の混合物（ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子と呼ぶ）である。一実施形態では、本発明のセラミック粒子は、ヒドロキシアパタイト粒子とβリン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子と呼ぶ）よりなる。

一実施形態では、ＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、顆粒、粉末またはビーズの形態である。一実施形態では、ＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、多孔性の顆粒、粉末またはビーズの形態である。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、多孔性セラミック材料である。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、粉末粒子である。特定の実施形態では、ＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、多孔性顆粒の形態である。別の特定の実施形態では、ＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、粉末の形態である。一実施形態では、ＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、予め定められた３Ｄの形状または足場、例えば立方体などを形成するよう構築されていない。一実施形態では、本発明のセラミック材料は、３Ｄ足場ではない。一実施形態では、セラミック材料は予め定められた形状でも足場でもない。一実施形態では、本発明のセラミック材料は立方体の形状ではない。一実施形態では、本発明の生体材料は足場がない。

一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍより大きく、好ましくは約１００μｍより大きい。一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍより大きい、好ましくは約１００μｍより大きい平均径を有する。

一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、少なくとも約５０μｍ、好ましくは少なくとも約１００μｍ、より好ましくは少なくとも約１５０μｍの平均径を有する。別の実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、少なくとも約２００μｍ、好ましくは少なくとも約２５０μｍ、より好ましくは少なくとも約３００μｍの平均径を有する。

別の実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、最大約２５００μｍ、好ましくは最大約２０００μｍ、より好ましくは最大約１５００μｍの平均径を有する。一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、最大約１０００μｍ、９００μｍ、８００μｍ、７００μｍまたは６００μｍの平均径を有する。

一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍ～約１５００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１２５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約１０００μｍの範囲の平均径を有する。一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約１００μｍ～約８００μｍ、好ましくは約１５０μｍ～約７００μｍ、より好ましくは約２００μｍ～約６００μｍの範囲の平均径を有する。

一実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍ～約１５００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１２５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約１０００μｍの範囲の平均径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子およびβ－ＴＣＰ粒子は、約１００μｍ～約８００μｍ、好ましくは約１５０μｍ～約７００μｍ、より好ましくは約２００μｍ～約６００μｍの範囲の平均径を有する。

一実施形態では、粒子中のＨＡとβ－ＴＣＰの比（ＨＡ／β－ＴＣＰ比）は、０／１００～１００／０、好ましくは１０／９０～９０／１０、より好ましくは２０／８０～８０／２０の範囲内にある。一実施形態では、粒子中の比ＨＡ／β－ＴＣＰは、３０／７０～７０／３０、３５／６５～６５／３５または４０／６０～６０／４０の範囲内にある。

一実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は０／１００である、すなわち、粒子はβリン酸三カルシウムの粒子である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は１００／０である、すなわち、粒子はヒドロキシアパタイトの粒子である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は１０／９０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は９０／１０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は２０／８０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は８０／２０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は３０／７０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は７０／３０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は３５／６５である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は６５／３５である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は４０／６０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は６０／４０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は５０／５０である。

一実施形態では、ＨＡ、ＴＣＰおよび／またはＨＡ／β－ＴＣＰの量は、生体材料に３Ｄ構造を与えるのに最適なものである。一実施形態では、ＨＡ粒子、ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を１５０ｃｍ^２の容器に対して約０．５ｃｍ^３～約５ｃｍ^３ｍｇ、好ましくは約１ｃｍ^３～約３ｃｍ^３、より好ましくは約１ｃｍ^３～約２ｃｍ^３の範囲の濃度で加える。好ましい実施形態では、ＨＡ粒子、ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を１５０ｃｍ^２の容器に対して約１．５ｃｍ^３の濃度で加える。

一実施形態では、ＨＡ粒子、ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を培地１ｍＬ当たり約７×１０^－３～７×１０^－２ｃｍ^３の範囲の濃度で加える。一実施形態では、ＨＡ粒子、ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を容器１ｃｍ^２当たり約３．３×１０^－３～３．３×１０^－２ｃｍ^３の範囲の濃度で加える。

一実施形態では、本発明の生体適合性粒子はゼラチンである。一実施形態では、本発明のゼラチンはブタゼラチン（ｐｏｒｃｉｎｅ ｇｅｌａｔｉｎ）である。本明細書で使用される「ブタゼラチン（ｐｏｒｃｉｎｅ ｇｅｌａｔｉｎ）」という用語は、「ブタゼラチン（ｐｏｒｋ ｇｅｌａｔｉｎ）」または「ブタゼラチン（ｐｉｇ ｇｅｌａｔｉｎ）」で置き換えられ得る。一実施形態では、ゼラチンはブタ皮膚ゼラチンである。

一実施形態では、本発明のゼラチンはマクロ多孔性微小担体である。

ブタゼラチン粒子の例としては、特に限定されないが、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（登録商標）Ｇ、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（登録商標）Ｓ、ＳｐｏｎｇｏｓｔａｎおよびＣｕｔａｎｐｌａｓｔが挙げられる。一実施形態では、本発明のゼラチンはＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（登録商標）ＧまたはＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ（登録商標）Ｓである。

一実施形態では、本発明のゼラチン、好ましくはブタゼラチンは、少なくとも約５０μｍ、好ましくは少なくとも約７５μｍ、より好ましくは少なくとも約１００μｍ、より好ましくは少なくとも約１３０μｍの平均径を有する。一実施形態では、本発明のゼラチン、好ましくはブタゼラチンは、最大約１０００μｍ、好ましくは最大約７５０μｍ、より好ましくは最大約５００μｍの平均径を有する。別の実施形態では、本発明のゼラチン、好ましくはブタゼラチンは、最大約４５０μｍ、好ましくは最大約４００μｍ、より好ましくは少なくとも最も約３８０μｍの平均径を有する。

一実施形態では、本発明のゼラチン、好ましくはブタゼラチンは、約５０μｍ～約１０００μｍ、好ましくは約７５μｍ～約７５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約５００μｍの範囲の平均径を有する。別の実施形態では、本発明のゼラチン、好ましくはブタゼラチンは、約５０μｍ～約５００μｍ、好ましくは約７５μｍ～約４５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約４００μｍの範囲の平均径を有する。別の実施形態では、本発明のゼラチン、好ましくはブタゼラチンは、約１３０μｍ～約３８０μｍの範囲の平均径を有する。

一実施形態では、ゼラチンを１５０ｃｍ^２の容器に対して約０．１ｃｍ^３～約５ｃｍ^３、好ましくは約０．５ｃｍ^３～約４ｃｍ^３、より好ましくは約０．７５ｃｍ^３～約３ｃｍ^３の範囲の濃度で加える。一実施形態では、ゼラチンを１５０ｃｍ^２の容器に対して約１ｃｍ^３～約２ｃｍ^３の範囲の濃度で加える。一実施形態では、ゼラチンを１５０ｃｍ^２の容器に対して約１ｃｍ^３、１．５ｃｍ^３または２ｃｍ^３の濃度で加える。

一実施形態では、ゼラチンを１５０ｃｍ^２の容器に対して約０．１ｇ～約５ｇ、好ましくは約０．５ｇ～約４ｇ、より好ましくは約０．７５ｇ～約３ｇの範囲の濃度で加える。一実施形態では、ゼラチンを１５０ｃｍ^２の容器に対して約１ｇ～約２ｇの範囲の濃度で加える。一実施形態では、ゼラチンを１５０ｃｍ^２の容器に対して約１ｇ、１．５ｇまたは２ｇの濃度で加える。

一実施形態では、細胞が分化後にコンフルエンスに達したとき、本発明のゼラチンを加える。換言すれば、一実施形態では、細胞が分化培地中でコンフルエンスに達したとき、本発明のゼラチンを加える。一実施形態では、Ｐ４の少なくとも５日後、好ましくは１０日後、より好ましくは１５日後に本発明のゼラチンを加える。一実施形態では、Ｐ４の５～３０日後、好ましくは１０～２５日後、より好ましくは１５～２０日後に本発明のゼラチンを加える。

一実施形態では、本発明の生体適合材料は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、リン酸カルシウム粒子、好ましくはＨＡ粒子および／またはβ－ＴＣＰ粒子あるいはゼラチン、好ましくはブタゼラチンである。一実施形態では、本発明の生体適合材料は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、ＨＡ粒子、βＴＣＰ粒子、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子またはゼラチンである。一実施形態では、本発明の生体適合材料は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、ＨＡ粒子、βＴＣＰ粒子、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子またはブタゼラチンである。

一実施形態では、本発明の生体適合材料は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、リン酸カルシウム粒子、好ましくはＨＡ粒子および／またはβ－ＴＣＰ粒子ならびにゼラチン、好ましくはブタゼラチンを含むか、これよりなる群から選択される。一実施形態では、本発明の生体適合材料は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、ＨＡ粒子、βＴＣＰ粒子、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子およびゼラチンを含むか、これよりなる群から選択される。一実施形態では、本発明の生体適合材料は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、ＨＡ粒子、βＴＣＰ粒子、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子およびブタゼラチンを含むか、これよりなる群から選択される。

一実施形態では、細胞の分化後に本発明の生体適合材料を培地に加える。一実施形態では、細胞がサブコンフルエントであるときに本発明の生体適合材料を加える。一実施形態では、細胞がオーバーコンフルエントであるときに本発明の生体適合材料を加える。一実施形態では、細胞が分化後にコンフルエンスに達したとき、本発明の生体適合材料を加える。換言すれば、一実施形態では、細胞が分化培地中でコンフルエンスに達したとき、本発明の生体適合材料を加える。一実施形態では、Ｐ４の少なくとも５日後、好ましくは１０日後、より好ましくは１５日後に本発明の生体適合材料を加える。一実施形態では、Ｐ４の５～３０日後、好ましくは１０～２５日後、より好ましくは１５～２０日後に本発明の生体適合材料を加える。

一実施形態では、本発明による生体材料は二次元のものである。この実施形態では、本発明の生体材料は、１ｍｍ未満の薄膜を形成し得る。

別の実施形態では、本発明による生体材料は三次元のものである。この実施形態では、本発明の生体材料は、厚さが少なくとも１ｍｍの厚膜を形成し得る。生体材料の大きさを使用に適合させ得る。

一実施形態では、本発明の生体材料は足場を含まない。本明細書で使用される「足場」という用語は、ヒトおよび動物の組織を含めた天然の哺乳動物組織、例えば天然の哺乳動物、好ましくはヒトの骨または細胞外基質などの多孔性、孔径および／または機能を模倣する構造を意味する。このような足場の例としては、特に限定されないが、人工骨、コラーゲンスポンジ、ヒドロゲル、例えばタンパク質ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、ポリマーヒドロゲルおよび木材系ナノセルロースヒドロゲルなどが挙げられる。一実施形態では、本発明の生体材料は人工骨を含まない。一実施形態では、本発明の生体適合材料は人工骨ではない。

一実施形態では、本発明の生体材料の多次元性は、天然の細胞外基質構造を模倣する足場によるものではない。一実施形態では、本発明の生体材料は、天然の細胞外基質構造を模倣する足場を含まない。

一実施形態では、本発明の生体材料の多次元性は、本発明の脂肪組織由来幹細胞による細胞外基質の合成によるものである。

一実施形態では、本発明の生体材料は細胞外基質を含む。一実施形態では、本発明の細胞外基質は、ＡＳＣに由来するものである。一実施形態では、本発明の細胞外基質は、ＡＳＣによって産生されるものである。

本明細書で使用される「細胞外基質」（ＥＣＭ）という用語は、非細胞多次元高分子ネットワークを意味する。ＥＣＭの基質成分が互いに結合するとともに細胞接着受容体とも結合し、それにより複雑な複合体ネットワークを形成し、その中で細胞が組織または本発明の生体材料中に存在する。

一実施形態では、本発明の細胞外基質は、コラーゲン、プロテオグリカン／グリコサミノグリカン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンおよび／またはその他の糖タンパク質を含む。特定の実施形態では、本発明の細胞外基質はコラーゲンを含む。別の特定の実施形態では、本発明の細胞外基質はプロテオグリカンを含む。別の特定の実施形態では、本発明の細胞外基質は、コラーゲンとプロテオグリカンとを含む。一実施形態では、本発明の細胞外基質は、成長因子、プロテオグリカン、分泌因子、細胞外基質調節因子および糖タンパク質を含む。

一実施形態では、本発明の生体材料の中にあるＡＳＣが、本明細書でＡＳＣ組織と呼ぶ組織を形成する。一実施形態では、本発明の生体材料の中にあるＡＳＣならびにセラミック材料、好ましくはセラミック粒子、より好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子が細胞外基質中の包埋されている。一実施形態では、好ましくは骨細胞に分化したＡＳＣが、セラミック材料、好ましくはセラミック粒子、より好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子とともに、細胞外基質を有する３Ｄ構造を形成する。一実施形態では、ＡＳＣ組織は血管新生した組織である。一実施形態では、本発明の生体材料は血管新生したものである。

一実施形態では、ＡＳＣ組織は細胞化された相互結合組織である。一実施形態では、細胞化された相互結合組織に生体適合材料、好ましくは生体適合性粒子が組み込まれている。一実施形態では、ＡＳＣ組織内に生体適合材料、好ましくは生体適合性粒子が分散している。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料、好ましくは生体適合性粒子の間で形成される、相互結合組織を特徴とする。一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料、好ましくは生体適合性粒子周囲でのミネラル化を特徴とする。一実施形態では、形成された生体材料の組織としての性質を組織退縮によって確認し得る。

一実施形態では、本発明の生体材料は、オステオカルシン発現およびミネラル化特性に関して実骨と類似した特性を有する。一実施形態では、本発明の生体材料は骨細胞を含む。一実施形態では、本発明の生体材料は骨細胞と細胞外基質とを含む。一実施形態では、本発明の生体材料は骨細胞とコラーゲンとを含む。特定の実施形態では、コラーゲンは、石灰化しミネラル化したコラーゲンである。一実施形態では、本発明の生体材料は骨基質を含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体材料の細胞の分化が終点に達したものであり、生体材料の表現型は、移植しても変化しないままである。

一実施形態では、本発明の生体材料は成長因子を含む。

一実施形態では、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料による成長因子の含有量または分泌を評価する。

破骨細胞形成阻害因子（ＯＣＩＦ）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）としても知られるオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）は、サイトカイン受容体の１つである。マウスでは、ＯＰＧの過剰発現または投与によって破骨細胞形成が鈍化することがわかっている。同様に、ＯＰＧが欠如した動物では破骨細胞形成が促進され、重度の骨粗鬆症が発現することが確認されている。ＯＰＧは現在、ＲＡＮＫＬ（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、オステオプロテジェリンリガンド（ＯＰＧＬ）または破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）としても知られる核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子）に関してＲＡＮＫと競合する可溶性デコイ受容体であることが知られている。ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧシグナル伝達経路は、破骨細胞の分化および活性化を調節することが明らかにされている。したがって、破骨細胞形成の刺激因子であるＲＡＮＫＬの発現と阻害剤であるＯＰＧの発現のバランスが、再吸収される骨の量を決定する。

一実施形態では、好ましくは生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＯＰＧの含有量および／または分泌を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。

一実施形態では、本発明の生体材料はＯＰＧを含む。一実施形態では、本発明の生体材料はＯＰＧを分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣはＯＰＧを分泌する。一実施形態では、本発明の細胞設計生体材料はＯＰＧを分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを少なくとも生体材料中の細胞１０^６個当たり約２５０ｐｇ、好ましくは少なくとも５００ｐｇ／１０^６個分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約７５０ｐｇ、８００ｐｇ、８５０ｐｇ、９００ｐｇまたは９５０ｐｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約１０００ｐｇ、１１００ｐｇ、１２００ｐｇ、１３００ｐｇまたは１４００ｐｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約１０００ｐｇ、１５００ｐｇ、２０００ｐｇ、２５００ｐｇまたは３０００ｐｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約２０００ｐｇ、２１００ｐｇ、２２００ｐｇ、２３００ｐｇ、２４００ｐｇまたは２５００ｐｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約２５５０ｐｇ、２６００ｐｇ、２６５０ｐｇまたは２７５０ｐｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約１０００ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約２５００ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり少なくとも約２７５０ｐｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり約１０００ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり約２５００ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり約２７５０ｐｇ分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり約２５０～約１００００ｐｇ、好ましくは約５００～約５０００ｐｇ／１０^６個、より好ましくは約１０００～約４０００ｐｇ／１０^６個分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０^６個当たり約２５０～約５０００ｐｇ、好ましくは約５００～約４５００ｐｇ／１０^６個、より好ましくは約７５０～約４０００ｐｇ／１０^６個分泌する。好ましい実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約１０００～約３５００ｐｇ／１０^６個の範囲の濃度で分泌する。特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約１０００または１２００ｐｇ／１０^６個の濃度で分泌する。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約３０００または３５００ｐｇ／１０^６個の濃度で分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約５ｎｇ、好ましくは少なくとも約１０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約１５ｎｇ／ｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約２０ｎｇ、好ましくは少なくとも約２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約３０ｎｇ／ｇ分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約３５ｎｇ、４０ｎｇまたは４５ｎｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約５０ｎｇ、好ましくは少なくとも約６０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約７０ｎｇ／ｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約７５ｎｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ、９５ｎｇまたは１００ｎｇ分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約５～約２００ｎｇ、好ましくは約１０～約１７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１５～約１５０ｎｇ／ｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約５～約１５０ｎｇ、好ましくは約５～約１４０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約５～約１２０ｎｇ／ｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約１０～約１５０ｎｇ、好ましくは約１０～約１４０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１０～約１２０ｎｇ／ｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約１５～約１５０ｎｇ、好ましくは約１５～約１４０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１５～約１２０ｎｇ／ｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約３０～約１５０ｎｇ、好ましくは約３０～約１４０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約３０～約１２０ｎｇ／ｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約５～約１００ｎｇ、約１０～約１００ｎｇ／ｇ、約１５～約１００ｎｇ／ｇ、約２０～約１００ｎｇ／ｇ、約２５～約１００ｎｇ／ｇまたは約３０～約１００ｎｇ／ｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約５～約９０ｎｇ、約１０～約９０ｎｇ／ｇ、約１５～約９０ｎｇ／ｇ、約２０～約９０ｎｇ／ｇ、約２５～約９０ｎｇ／ｇまたは約３０～約９０ｎｇ／ｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約５～約８５ｎｇ、約１０～約８５ｎｇ／ｇ、約１５～約８５ｎｇ／ｇ、約２０～約８５ｎｇ／ｇ、約２５～約８５ｎｇ／ｇまたは約３０～約８５ｎｇ／ｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、約１５～約３０ｎｇ／ｇ生体材料、分泌する。

特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約１５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で分泌する。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約３０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で分泌する。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約７５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で分泌する。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約８５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＯＰＧを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＯＰＧを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。

一実施形態では、好ましくは生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＲＡＮＫＬの含有量および／または分泌を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。

一実施形態では、培地中での本発明の生体材料中または生体材料の上清中のＲＡＮＫＬのレベルは検出不可能なものである。一実施形態では、本発明の生体材料が１ｍＬ当たり２００ｐｇ未満、好ましくは１５６ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ未満、より好ましくは７８ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは７．８ｐｇ／ｍＬ未満のＲＡＮＫＬを含むか、生体材料のＡＳＣがこれを分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は実質的にＲＡＮＫＬを含まない。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣは実質的にＲＡＮＫＬを分泌しない。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＲＡＮＫＬを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＲＡＮＫＬを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを分泌し、かつＲＡＮＫＬを分泌しないか、検出可能なレベルのＲＡＮＫＬを分泌しない。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを少なくとも本明細書で上に記載した濃度で分泌し、かつＲＡＮＫＬを最大でも本明細書で上に記載した濃度で分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は高レベルのＶＥＧＦを含む。

一実施形態では、好ましくは生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＶＥＧＦ含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも約１０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは少なくとも約２０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約３０ｎｇ／ｇの濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも約５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは少なくとも約６０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約７０ｎｇ／ｇの濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも約１００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは少なくとも約１２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約１５０ｎｇ／ｇの濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約１０ｎｇ／ｇ～約２５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約２０ｎｇ／ｇ～約２２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｇ～約２００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約１０ｎｇ／ｇ～約５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１５ｎｇ／ｇ～約４５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｇ～約４０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約５０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約６０ｎｇ／ｇ～約１２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約７０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約１００ｎｇ／ｇ～約２５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１２０ｎｇ／ｇ～約２２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１４０ｎｇ／ｇ～約２００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約３５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約７５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約９５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約１３５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約１９０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＶＥＧＦを本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＶＥＧＦを本明細書で上に記載した濃度で含む。

インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）は、骨ミネラル密度の維持およびのちの骨折リスクを低下させる高いピーク骨量の獲得と正の相関がある。

一実施形態では、好ましくは生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＩＧＦ－１含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。

一実施形態では、本発明の生体材料はＩＧＦ－１を含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は高レベルのＩＧＦ－１を含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を少なくとも約５ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは少なくとも約１０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約１５ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは少なくとも約２０ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を少なくとも約１０ｎｇ／ｇ生体材料、１１ｎｇ／ｇ生体材料、１２ｎｇ／ｇ生体材料、１３ｎｇ／ｇ生体材料、１４ｎｇ／ｇ生体材料、１５ｎｇ／ｇ生体材料、１６ｎｇ／ｇ生体材料、１７ｎｇ／ｇ生体材料、１８ｎｇ／ｇ生体材料、１９ｎｇ／ｇ生体材料または２０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を少なくとも約５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは少なくとも約６０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約７０ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは少なくとも約８０ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を少なくとも約９０ｎｇ／ｇ生体材料、９１ｎｇ／ｇ生体材料、９２ｎｇ／ｇ生体材料、９３ｎｇ／ｇ生体材料、９４ｎｇ／ｇ生体材料、９５ｎｇ／ｇ生体材料、９６ｎｇ／ｇ生体材料、９７ｎｇ／ｇ生体材料、９８ｎｇ／ｇ生体材料、９９ｎｇ／ｇ生体材料または１００ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約５ｎｇ／ｇ～約５００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１０ｎｇ／ｇ～約４００ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｇ～約３００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約５ｎｇ／ｇ～約２００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｇ～約１２５ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約５ｎｇ／ｇ、１０ｎｇ／ｇ、１５ｎｇ／ｇまたは２０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約５ｎｇ／ｇ、１０ｎｇ／ｇ、１５ｎｇ／ｇまたは２０ｎｇ／ｇ～約１２５ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約５ｎｇ／ｇ、１０ｎｇ／ｇ、１５ｎｇ／ｇまたは２０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約２０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。

別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約５０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約７０ｎｇ／ｇ～約１２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約８０ｎｇ／ｇ～約１１０ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは約８５ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇまたは約９０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を生体材料１ｇ当たり約２０ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約９０ｎｇ／ｇ生体材料、９１ｎｇ／ｇ生体材料、９２ｎｇ／ｇ生体材料、９３ｎｇ／ｇ生体材料、９４ｎｇ／ｇ生体材料、９５ｎｇ／ｇ生体材料、９６ｎｇ／ｇ生体材料、９７ｎｇ／ｇ生体材料、９８ｎｇ／ｇ生体材料、９９ｎｇ／ｇ生体材料または１００ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を生体材料１ｇ当たり約９０ｎｇ含む。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を生体材料１ｇ当たり約９５ｎｇ含む。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を生体材料１ｇ当たり約１００ｎｇ含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＩＧＦ－１を本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＩＧＦ－１を本明細書で上に記載した濃度で含む。

間質細胞由来因子１アルファまたはＣＸＣＬ１２とも呼ばれるＳＤＦ－１αは、破骨細胞の分化および活性化を刺激する役割を果たす。破骨細胞、特に破骨細胞前駆体は、ＳＤＦ－１αに対する固有の受容体であるＣＸＣＲ４に対して強い陽性を示す。ＳＤＦ－１αは破骨細胞形成を直接誘導するが、最近、ＳＤＦ－１αがＲＡＮＫＬ発現のアップレギュレーションを介して間接的に破骨細胞形成に影響を及ぼし得ることがわかった。破骨細胞およびその前駆体上にＲＡＮＫが存在することから、間質細胞上に存在する破骨細胞分化因子がＲＡＮＫＬである可能性が示唆された。

一実施形態では、好ましくは生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＳＤＦ－１α含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。

一実施形態では、本発明の生体材料はＳＤＦ－１αを含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は低レベルのＳＤＦ－１αを含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約１０００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは最大約７５０ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約５００ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは最大約４００ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約３００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは最大約２７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約２５０ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約２９０ｎｇ／ｇ生体材料、２８０ｎｇ／ｇ生体材料、２７０ｎｇ／ｇ生体材料、２６０ｎｇ／ｇ生体材料または２５０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約２４０ｎｇ／ｇ生体材料、２３０ｎｇ／ｇ生体材料、２２０ｎｇ／ｇ生体材料、２１０ｎｇ／ｇ生体材料または２００ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約１００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは最大約７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約５０ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約７０ｎｇ／ｇ生体材料、６５ｎｇ／ｇ生体材料、６０ｎｇ／ｇ生体材料、５９ｎｇ／ｇ生体材料、５８ｎｇ／ｇ生体材料、５７ｎｇ／ｇ生体材料、５６ｎｇ／ｇ生体材料、５５ｎｇ／ｇ生体材料、５４ｎｇ／ｇ生体材料、５３ｎｇ／ｇ生体材料、５２ｎｇ／ｇ生体材料または５１ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約４９ｎｇ／ｇ生体材料、４８ｎｇ／ｇ生体材料、４７ｎｇ／ｇ生体材料、４６ｎｇ／ｇ生体材料、４５ｎｇ／ｇ生体材料、４４ｎｇ／ｇ生体材料、４３ｎｇ／ｇ生体材料、４２ｎｇ／ｇ生体材料または４１ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約４０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約３９ｎｇ／ｇ生体材料、３８ｎｇ／ｇ生体材料、３７ｎｇ／ｇ生体材料、３６ｎｇ／ｇ生体材料、３５ｎｇ／ｇ生体材料、３４ｎｇ／ｇ生体材料、３３ｎｇ／ｇ生体材料、３２ｎｇ／ｇ生体材料または３１ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約３０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約５ｎｇ／ｇ～約１０００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１５ｎｇ／ｇ～約７５０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｇ～約５００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約５ｎｇ／ｇ～約３００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１５ｎｇ／ｇ～約２７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｇ～約２５０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約２５ｎｇ／ｇ～約２５０ｎｇ／ｇ生体材料、より好ましくは約３０ｎｇ／ｇ～約２５０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約１００ｎｇ／ｇ～約４００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１５０ｎｇ／ｇ～約３５０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２００ｎｇ／ｇ～約３００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約５ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１５ｎｇ／ｇ～約７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２５ｎｇ／ｇ～約６０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約３０ｎｇ／ｇ生体材料～約１００ｎｇ／ｇ、好ましくは約３０ｎｇ／ｇ～約７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｇ～約５０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約３０ｎｇ／ｇ生体材料～約４０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり約２５０ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり約３０ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり約４０ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり約５０ｎｇ含む。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＳＤＦ－１αを本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＳＤＦ－１αを本明細書で上に記載した濃度で含む。

骨形成タンパク質２またはＢＭＰ２は、骨の発達の刺激に重要な役割を果たす。例えば、ＢＭＰ２は骨芽細胞分化を強力に誘導することが示されている。

骨形成タンパク質７またはＢＭＰ７は、具体的には、次に多数の骨原性遺伝子の発現を誘導するＳＭＡＤ１およびＳＭＡＤ５のリン酸化を誘導することによって、間葉細胞の骨へ転換に鍵となる役割を果たす。

一実施形態では、好ましくは生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＢＭＰ２およびＢＭＰ７の含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。

一実施形態では、培地中での本発明の生体材料中または生体材料の上清中のＢＭＰ２のレベルは検出不可能なものである。一実施形態では、本発明の生体材料は実質的にＢＭＰ２を含まない。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣは実質的にＢＭＰ２を分泌しない。

一実施形態では、本発明の生体材料が１ｍＬ当たり１００ｐｇ未満、好ましくは８５ｐｇ／ｍＬ未満、より好ましくは７５ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは６２．５ｐｇ／ｍＬ未満のＢＭＰ２を含むか、生体材料のＡＳＣがこれを分泌する。

一実施形態では、培地中の本発明の生体材料中または生体材料の上清中のＢＭＰ７のレベルは検出不可能なものである。一実施形態では、本発明の生体材料は実質的にＢＭＰ７を含まない。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣは実質的にＢＭＰ７を分泌しない。

一実施形態では、本発明の生体材料が１ｍＬ当たり５０ｐｇ未満、好ましくは４０ｐｇ／ｍＬ未満、より好ましくは３５ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは３１．２ｐｇ／ｍＬ未満のＢＭＰ７を含むか、生体材料のＡＳＣがこれを分泌する。

一実施形態では、本発明の生体材料は、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ７を本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ７を本明細書で上に記載した濃度で含む。

一実施形態では、本発明による生体材料はミネラル化されている。本明細書で使用される「ミネラル化」または「骨組織ミネラル密度」という用語は、生体材料によって形成された骨または「骨様」組織の１平方センチメートル当たりのミネラル物質の量を指し、百分率で表されることもある。したがって、本明細書で使用される「ミネラル化」または「骨組織ミネラル密度」という用語は、生体材料の１平方センチメートル当たりのミネラル物質の量を指し、百分率で表されることもある。

生体材料のミネラル化度を評価する方法は当該技術分野で公知である。このような方法の例としては、特に限定されないが、マイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）解析、イメージング質量分析、カルセインブルー染色、骨ミネラル密度分布（ＢＭＤＤ）解析などが挙げられる。

一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は約１％以上である。

別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約２％、より好ましくは少なくとも約５％である。

別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、さらにより好ましくは少なくとも約２５％である。一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％または３８％である。

一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約１％～約５０％、好ましくは約１％～約４５％、より好ましくは約１％～約４０％の範囲内にある。別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約５％～約５０％、好ましくは約１０％～約４５％、より好ましくは約２０％～約４０％の範囲内にある。一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約３０％～約５０％、好ましくは約３５％～約５０％、より好ましくは約３５％～約４５％、さらにより好ましくは約３５％～約４０％の範囲内にある。

別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約１％～約３０％、好ましくは約１％～約２０％、より好ましくは約１％～約１０％の範囲内にある。別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約１％～約５％の範囲内にある。

別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも１％または１．２４％である。別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも２％、２．５％または２．７７％である。別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約１％または１．２４％である。別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約２％、２．５％または２．７７％である。

１つの特定の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は約２％である。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は約２０％である。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は約３８％である。

一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度はＯＰＧ分泌に比例する。一実施形態では、生体材料がＯＰＧを多く含むほど、生体材料がミネラル化されている。

本発明は、骨原性細胞に分化した脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）と、生体適合材料と、細胞外基質とを含み、生体材料がオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を含む、多次元生体材料を作製する方法にも関する。

一実施形態では、本発明による生体材料を作製する方法は、
細胞増殖の段階と、
細胞分化の段階と、
多次元誘導の段階と
を含む。

一実施形態では、本発明による生体材料を作製する方法は、
ＡＳＣ増殖の段階と、
ＡＳＣの骨原性分化の段階と、
多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階と
を含む。

一実施形態では、本発明による生体材料を作製する方法は、
対象から細胞、好ましくはＡＳＣを単離する段階と、
細胞、好ましくはＡＳＣを増殖させる段階と、
増殖した細胞、好ましくは増殖したＡＳＣを分化させる段階と、
分化細胞、好ましくは分化したＡＳＣを生体適合材料の存在下で培養する段階と
を含む。

一実施形態では、本発明の生体材料を作製する方法は、細胞増殖の段階の前に実施する、細胞、好ましくはＡＳＣの単離の段階をさらに含む。一実施形態では、本発明の生体材料を作製する方法は、細胞増殖の段階の前に実施する、細胞、好ましくはＡＳＣを単離する段階をさらに含む。

一実施形態では、増殖の段階を本明細書で上に記載した通りに実施する。一実施形態では、増殖の段階を増殖培地で実施する。特定の実施形態では、増殖培地はＤＭＥＭである。一実施形態では、増殖培地にＡｌａ－Ｇｌｎおよび／またはヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を添加する。一実施形態では、増殖培地は、ペニシリンおよび／またはストレプトマイシンなどの抗生物質をさらに含む。

一実施形態では、増殖培地は、Ａｌａ－ＧｌｎおよびｈＰＬ（５％）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、増殖培地は、Ａｌａ－Ｇｌｎ、ｈＰＬ（５％、ｖ／ｖ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。

一実施形態では、増殖の段階をＰ８まで実施する。一実施形態では、増殖の段階がＰ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８まで継続する。したがって、一実施形態では、細胞増殖の段階は少なくとも３継代を含む。一実施形態では、細胞増殖の段階は最大７継代を含む。一実施形態では、細胞増殖の段階は３～７継代を含む。１つの特定の実施形態では、増殖の段階をＰ４まで実施する。したがって、一実施形態では、細胞増殖の段階は、継代Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で、培養容器の表面から細胞を剥離し、次いで、それを増殖培地で希釈することを含む。Ｐ６までの増殖の一実施形態では、細胞増殖の段階は、継代Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５で、培養容器の表面から細胞を剥離し、次いで、それを増殖培地で希釈することを含む。

一実施形態では、増殖の段階は、細胞を３回、４回、５回、６回または７回継代するのに必要な長さだけ継続する。特定の実施形態では、増殖の段階は、細胞を３回継代するのに必要な長さだけ継続する。一実施形態では、増殖の段階は、最後の継代後に細胞がコンフルエンス、好ましくは７０％～１００％のコンフルエンス、より好ましくは８０％～９５％のコンフルエンスに達するまで継続する。一実施形態では、増殖の段階は、第３継代、第４継代、第５継代、第６継代または第７継代後に細胞がコンフルエンスに達するまで継続する。

有利な実施形態では、生体適合性粒子を加える前に、細胞、好ましくはＡＳＣを分化培地で培養することが、本発明の方法の鍵となる段階である。このような段階は、ＡＳＣを骨原性細胞に分化させるのに必要なものである。さらに、この段階は、多次元構造を得るのに必要なものである。

一実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８の後に分化の段階を実施する。一実施形態では、細胞がコンフルエンスでないときに分化の段階を実施する。特定の実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８の後、細胞をコンフルエンスまで培養せずに分化の段階を実施する。

一実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８で分化の段階を実施する。一実施形態では、細胞がコンフルエンスでないときに分化の段階を実施する。特定の実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８で、細胞をコンフルエンスまで培養せずに分化の段階を実施する。

一実施形態では、細胞を分化培地、好ましくは骨原性分化培地でインキュベートすることによって、分化の段階を実施する。一実施形態では、培養容器の表面から剥離した細胞を分化培地、好ましくは骨原性分化培地に再懸濁させることによって、分化の段階を実施する。

一実施形態では、骨原性分化培地でのＡＳＣのインキュベーションを少なくとも３日間、好ましくは少なくとも５日間、より好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１５日間実施する。一実施形態では、骨原性分化培地でのＡＳＣのインキュベーションを５～３０日間、好ましくは１０～２５日間、より好ましくは１５～２０日間実施する。一実施形態では、分化培地を２日毎に交換する。

一実施形態では、本明細書で上に明記した生体適合材料を分化培地に加えることによって、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。一実施形態では、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階において、細胞を分化培地で維持する。

一実施形態では、細胞が分化培地でコンフルエンス、好ましくは７０％～１００％のコンフルエンス、より好ましくは８０％～９５％のコンフルエンスに達したとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。

別の実施形態では、形態学的変化、例えば小結節の前形成などがみられたとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。一実施形態では、類骨小結節が少なくとも１つ形成されたとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。本明細書で使用される「類骨」という用語は、骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分を意味する。

別の実施形態では、細胞がコンフルエンスに達したとき、形態学的変化がみられたとき、および類骨小結節が少なくとも１つ形成されたとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。

一実施形態では、本発明の細胞および生体適合材料を少なくとも５日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１５日間インキュベートする。一実施形態では、本発明の細胞および生体適合材料を１０日間～３０日間、好ましくは１５～２５日間、より好ましくは２０日間インキュベートする。一実施形態では、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階において、培地を２日毎に交換する。

本発明は、本発明による方法によって入手可能な多次元生体材料にも関する。一実施形態では、多次元生体材料を本発明による方法によって得る。一実施形態では、多次元生体材料を本発明による方法によって作製する。一実施形態では、本発明の方法によって入手可能な、または得られる生体材料は、ヒトまたは動物の体内に移植することを意図するものである。一実施形態では、移植する生体材料は、自家起源または同種異系のものであり得る。一実施形態では、本発明の生体材料を骨または軟骨の領域に移植し得る。一実施形態では、この生体材料をヒトまたは動物身体の不規則な形の領域に移植し得る。

一実施形態では、本発明の生体材料は均質なものであり、このことは、生体材料の構造および／または構成が組織全体を通じてほぼ同じであることを意味する。一実施形態では、生体材料は、天然の疾患領域への移植に必要な望ましい取扱適性および機械的特性を有する。一実施形態では、本発明の方法によって入手可能な、または得られる生体材料は、裂けることなく手術器具で持つことができるものである。

本発明の別の目的は、本発明による生体材料を含む医療装置である。

また別の目的は、本発明による生体材料と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。

本発明は、薬物として使用する、本発明による生体材料または医薬組成物にも関する。

本発明は、本発明の生体材料の医療装置としての、または医療装置もしくは医薬組成物に含める、任意の使用に関する。ある特定の実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、使用前に操作および成形し得るパテ様材料である。

本発明はさらに、必要とする対象の骨欠損または軟骨欠損を治療する方法であって、対象に治療有効量の本発明による生体材料、医療装置または医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

本明細書で使用される「骨欠損」という用語は、通常であれば骨であるべきである身体領域または骨組織の形成が治療上望まれる身体領域に骨組織がないことを意味する。

本明細書で使用される「軟骨欠損」という用語は、通常であれば軟骨であるべきである身体領域または軟骨組織の形成が治療上望まれる身体領域に軟骨組織がないことを意味する。

本発明の別の目的は、必要とする対象の骨欠損または軟骨欠損の治療に使用する、本発明による生体材料、医療装置または医薬組成物である。本発明のまた別の目的は、必要とする対象の骨欠損の治療への本発明による生体材料、医療装置または医薬組成物の使用である。

骨欠損の例としては、特に限定されないが、骨折、骨脆弱、骨ミネラル密度の低下、関節炎、先天性偽関節などの偽関節、骨粗鬆症、脊椎分離症、脊椎すべり症、骨軟化症、骨減少症、骨癌、パジェット病、硬化性病変、骨の浸潤性障害、二分脊椎症、遷延治癒、骨形成不全症、（例えば、腫瘍切除または出血後の）頭蓋欠損、骨壊死および代謝性骨喪失が挙げられる。

軟骨欠損の例としては、特に限定されないが、身体領域内の軟骨損傷または軟骨欠損が挙げられる。軟骨欠損の原因は、外傷、骨壊死、骨軟骨炎およびその他の病態によるものであり得る。軟骨欠損は、膝関節にもっともよくみられ、その場合、外傷を原因とし、前十字靭帯（ＡＣＬ）断裂などの靭帯損傷に付随してみられることが多い。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、骨折、骨脆弱、骨ミネラル密度の低下、関節炎、先天性偽関節などの偽関節、骨粗鬆症、脊椎分離症、脊椎すべり症、骨軟化症、骨減少症、骨癌、パジェット病、硬化性病変、骨の浸潤性障害、海綿骨および皮質骨の壊死、二分脊椎症、遷延治癒、骨形成不全症、（例えば、腫瘍切除または出血後の）頭蓋欠損、骨壊死および代謝性骨喪失を含むか、これよりなる群から選択される骨欠損を治療する、またはその治療に使用するものである。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、骨折、関節炎、先天性偽関節、骨粗鬆症、脊椎分離症、脊椎すべり症、骨癌、パジェット病、硬化性病変および代謝性骨喪失を含むか、これよりなる群から選択される骨欠損を治療する、またはその治療に使用するものである。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、脊椎分離症および／または脊椎すべり症を治療する、またはその治療に使用するものである。脊椎分離症とは、椎弓の関節突起間部にみられる欠損または疲労骨折のことである。脊椎すべり症またはすべり症は、１つの椎骨が隣接する椎骨に対して並進移動する、または非解剖学的に整列することであり、脊椎分離症のある患者の約３０％に認められる。

一実施形態では、脊椎すべり症は、異形成性、分離性、変性、外傷性、病的および／または術後／医原性脊椎すべり症である。一実施形態では、脊椎すべり症は、第５腰椎の上方仙骨椎間関節または下方椎間関節の先天性異常による異形成性脊椎すべり症（１型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、関節突起間部の欠損を原因とする分離性脊椎すべり症（２型とも呼ばれる）であるが、伸長部とともにみられることもある。別の実施形態では、脊椎すべり症は、椎間関節炎および関節再構築によって起こる変性脊椎すべり症（３型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、上記の部以外の神経弓の急性骨折によって起こる外傷性脊椎すべり症（４型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、感染症または悪性腫瘍を原因とする病的脊椎すべり症（５型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、術後合併症を原因とする術後／医原性脊椎すべり症（６型とも呼ばれる）である。

一実施形態では、脊椎すべり症は、マイヤーディング分類によるグレードＩ、グレードＩＩ、グレードＩＩＩ、グレードＩＶまたはグレードＶのものである。一実施形態では、脊椎すべり症は、椎体の幅に対する割合として測定されるすべり度０～２５％に対応する、グレードＩのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度２５％～５０％に対応するグレードＩＩのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度５０％～７５％に対応するグレードＩＩＩのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度７５％～１００％に対応するグレードＩＶのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度１００％超に対応するグレードＶのものである。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、必要とする対象の椎体間隙および／または移植する固定ケージ（１つまたは複数）を充填するものである。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、先天性偽関節を治療する、またはその治療に使用するものである。特定の実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、先天性脛骨偽関節症（ＣＰＴ）を治療する、またはその治療に使用するものである。ＣＰＴは、自発的に、または軽度の外傷の後に発症する脛骨骨折による偽関節を指し、脛骨には、骨の前外側湾曲を生じる部分的異形成の領域がみられる。ＣＰＴは通常、神経線維腫症を伴い、未だ小児整形外科が直面する最も厄介で恐ろしい病態の１つである。

この疾患は通常、生後１年以内の幼年期に明らかになるが、１２歳まで発見されないこともある。

一実施形態では、ＣＰＴは、クロフォード分類によるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型のものである。一実施形態では、ＣＰＴは、皮質密度の増大および髄質の狭小化を伴う前弯に対応するＩ型のものである。別の実施形態では、ＣＰＴは、髄質が狭小化し硬化した前弯に対応するＩＩ型のものである。別の実施形態では、ＣＰＴは、嚢胞または骨折の前兆を伴う前弯に対応するＩＩＩ型のものである。別の実施形態では、ＣＰＴは、脛骨と腓骨を結ぶことが多い偽関節を伴う前弯および明白な骨折に対応する、ＩＶ型のものである。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、小児患者の先天性脛骨偽関節症を治療する、またはその治療に使用するものである。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、小児先天性脛骨偽関節症を治療する、またはその治療に使用するものである。

本発明は、整形外科、特に顎顔面外科手術または形成外科手術への本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物の使用にも関する。本発明の生体材料は、リウマチ学でも使用し得る。

本発明はさらに、先天性もしくは後天性の関節、頭蓋顔面顎骨の異常、歯科矯正障害、外科手術後の骨もしくは関節骨の障害（例えば、置換）、外傷またはその他の先天性もしくは後天性の異常を治療、是正または軽減するために、ならびに他の筋骨格移植片、具体的には人工移植片および合成移植片を補助するために、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を使用する方法に関する。

別の態様では、本発明は、骨再建に使用する、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ヒトまたは動物の身体に対して骨空洞を充填するのに使用するものである。

さらに別の態様では、本発明は、再建手術または美容外科手術に使用する、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物に関する。

一実施形態では、本発明は、再建手術に使用する、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、美容外科手術に使用する、本発明の生体材料に関する。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を同種異系移植片または自家移植片として使用し得る。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を異種移植片として使用し得る。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を組織移植に使用し得る。

本発明の生体材料はさらに、血管新生を刺激するのに有利である。実際、生体材料のＡＳＣは、新たな血管の成長を刺激する血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を放出する。

一実施形態では、対象はヒト対象である。別の実施形態では、対象は動物対象、例えば、ペット、家畜または生産動物などである。一実施形態では、対象は哺乳動物対象である。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物をヒトおよび／または動物に使用し得る。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物をヒト医学および獣医学で使用し得る。

一実施形態では、対象は骨欠損および／または軟骨欠損に罹患している。

特定の実施形態では、対象は脊椎分離症および／または脊椎すべり症に罹患している。別の特定の実施形態では、対象は先天性脛骨偽関節症（ＣＰＴ）に罹患している。特定の実施形態では、対象は小児先天性脛骨偽関節症（ＣＰＴ）に罹患している。

一実施形態では、対象は、既に骨欠損および／または軟骨欠損の治療を受けている。

特定の実施形態では、対象は、既に脊椎分離症および／または脊椎すべり症の治療を受けている。脊椎分離症および／または脊椎すべり症の他の治療法の例としては、特に限定されないが、保存的治療、例えば固定具装着、活動制限、伸展運動、屈曲運動および深腹部強化など；ならびに外科手術、例えば脊椎固定および椎弓切除などが挙げられる。

別の特定の実施形態では、対象は、既にＣＰＴの治療を受けている。ＣＰＴの他の治療の例としては、特に限定されないが、固定具装着および外科手術、例えば骨移植を伴う髄内釘固定、血管柄付き骨移植、イリザロフ法、誘導膜および海綿自家移植などが挙げられる。

一実施形態では、対象は、少なくとも１つの他の骨欠損および／または軟骨欠損治療に不応である。

一実施形態では、対象は乳児または小児である。したがって、一実施形態では、対象は小児対象である。一実施形態では、対象は１８歳未満、好ましくは１５歳未満、１２歳未満または１０歳未満である。

別の実施形態では、対象は成人である。したがって、一実施形態では、対象は１８歳以上である。

一実施形態では、必要とする対象に骨欠損および／または軟骨欠損の処置、例えば脊椎固定処置などの過程で、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を投与する。

一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を創面清掃、１つもしくは２つの椎体間ケージの設置および両側椎弓根スクリュー固定ならびに／あるいはリハビリテーションとともに使用する。

本発明は、本発明による生体材料、医薬組成物または医療装置と、適切な固定手段とを含む、キットにも関する。適切な固定手段の例としては、特に限定されないが、外科用接着剤、組織接着剤または外科手術に使用し、生体適合性、無毒性であり、任意選択で生体吸収性である、任意の接着組成物が挙げられる。

ＤＢＭと間接的に接触させたＬ９２９細胞（５％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地で培養したマウス線維芽細胞）の細胞生存率を未処理細胞と比較した百分率で示すヒストグラムである。 ３種類の異なる濃度（１．５ｃｍ^３、２．８５ｃｍ^３および５．９１ｃｍ^３）のＨＡ／β－ＴＣＰと間接的に接触させたｈＡＳＣの細胞生存率を未処理細胞と比較した百分率で示すヒストグラムである。 ＤＢＭ（Ａ）、ＨＡ／β－ＴＣＰ（Ｂ）、ＨＡ（Ｃ）またはβ－ＴＣＰ（Ｄ）を用いて形成した生体材料を肉眼的に見たものを示す一連の写真である。 ＤＢＭ（Ａ）またはＨＡ／β－ＴＣＰ（Ｂ）を用いて形成した生体材料の顕微鏡像を示す一連の写真である。 ＤＢＭ（左）またはＨＡ／β－ＴＣＰ（右）を用いて形成した生体材料のヘマトキシリン－エオシン染色（Ａ）、マッソンのトリクロム染色（Ｂ）、フォン・コッサ染色（Ｃ）およびオステオカルシン染色（Ｄ）を示す一連の写真である（ＮＤ：未決定）。 ＤＢＭ（左）またはＨＡ／β－ＴＣＰ（右）を用いて形成した生体材料に関するマイクロＣＴ解析を３種類の異なる縮尺（Ａ、ＢおよびＣ）で示す一連の写真である。 ＤＢＭ（左）またはＨＡ／β－ＴＣＰ（右）を用いて形成した生体材料のＩＧＦ１（暗灰色）、ＶＥＧＦ（明灰色）およびＳＤＦ－１（中灰色）の含有量を示すヒストグラムである。 ＭＰ培地およびＭＤ培地の２Ｄ培養物中ならびにＤＢＭを用いて形成した生体材料の培養液中およびＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料中でのＡＳＣによるＯＰＧ分泌を細胞１０^６個当たりのｐｇ数で示すヒストグラムである。 ２Ｄ培養ＭＤ培地中ならびにＤＢＭを用いて形成した生体材料ならびにＨＡ／β－ＴＣＰ、ＨＡおよびβ－ＴＣＰを用いて形成した生体材料の培養物中でのＡＳＣによるＯＰＧ分泌を材料１ｇ当たりｎｇ数で示すヒストグラムである。 ＮＶＤ－１（Ａ）およびＮＶＤ－０（Ｂ）のヘマトキシリン－エオシン染色を示す一連の写真である。 ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した本発明の生体材料（生体材料）での遺伝子ＦＧＦＲ１（Ａ）、ＩＧＦＲ１（Ｂ）、ＲＵＮＸ２（Ｃ）、ＴＷＩＳＴ１（Ｄ）、ＴＧＦＢＲ１（Ｅ）、ＳＭＡＤ２（Ｆ）、ＳＭＡＤ４（Ｇ）、ＳＭＡＤ５（Ｈ）の発現をＭＰ（ＭＰ）中およびＭＤ（ＭＤ）中のＡＳＣと比較して示す一連のグラフである。^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。 ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した本発明の生体材料（生体材料）での遺伝子ＡＮＧ（Ａ）、ＥＦＮＡ１（Ｂ）、ＥＦＮＢ２（Ｃ）、ＶＥＧＦＡ（Ｄ）、ＦＧＦ１（Ｅ）、ＬＥＰ（Ｆ）の発現をＭＰ（ＭＰ）中およびＭＤ（ＭＤ）中のＡＳＣと比較して示す一連のグラフである。^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１。 ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した本発明の生体材料（生体材料）の低酸素状態（１％）または酸素正常状態（２１％）でのＶＥＧＦ（Ａ）およびＳＤＦ－１α（Ｂ）分泌をＭＰ（ＭＰ）中およびＭＤ（ＭＤ）中のＡＳＣと比較して示す一連のヒストグラムである。 本発明の生体材料の外植片のフォン・ヴィルブランド因子に対する免疫染色を示す写真である。ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子が記号^＊によって示されており、血管が黒矢印によって示されている。 本発明の生体材料の血管面積の百分率（Ａ）および血管数／ｍｍ^２（Ｂ）を示す一連のヒストグラムである。 ラットに移植後第２８日の本発明の生体材料におけるＨＬＡ／ヒト白血球抗原免疫染色のペルオキシダーゼ顕色によって褐色で示されたヒト細胞の存在（図中、黒矢印によって示されている）を示す写真である。ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子が記号^＊によって示されている。 本発明の生体材料（左上および左下）およびＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独（右上および右下）をラットに移植してから１か月後の大腿骨のマイクロＣＴスキャンを示す一連の写真である。下の写真は上の写真を拡大したものである。点線の四角形は移植部位を示している。 ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子の移植から１か月後の骨欠損の組織学的検査を示す一連の写真である：ヘマトキシリン－エオシン染色、元の倍率５倍（Ａ）；マッソン・トリクロム染色、元の倍率２０倍（Ｂ）。白矢印は、製品が統合されておらず、重大な線維症があることを示している。黒矢印は、天然の骨とＨＡ／β－ＴＣＰの移植片との間の境界にある欠損に軟骨内骨化がみられないことを示している。 本発明の生体材料の移植から１か月後の骨欠損の組織学的検査を示す一連の写真である：ヘマトキシリン－エオシン染色、元の倍率５倍（Ａ）；マッソン・トリクロム染色、元の倍率２０倍（Ｂ）；ＨＬＡ－Ｉ免疫染色、元の倍率１０倍（Ｃ）。白矢印は、製品の統合および骨融合を示している。黒矢印は、骨統合過程を示す、天然の骨と生体材料との間に直接接する軟骨内骨化を示している。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ）とＡＳＣで形成された培養２．５週間後（Ａ）および培養７．５週間後（Ｂ）の生体材料を肉眼的に見たものを示す一連の写真である。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料のヘマトキシリン－エオシン染色を示す一連の写真である。元の倍率５倍（Ａ）、拡大１０倍（Ｂ）。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料のフォン・コッサ染色を示す一連の写真である。元の倍率５倍（Ａ）、拡大１０倍（Ｂ）。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料のオステオカルシン発現を示す一連の写真である。元の倍率５倍（Ａ）、拡大１０倍（Ｂ）。 骨分化培地中でＡＳＣとＣｕｌｔｉｐｈｅｒ Ｇで形成された本発明の生体材料（生体材料）での遺伝子ＡＮＧ（Ａ）、ＡＮＧＰＴ１（Ｂ）、ＥＰＨＢ４（Ｃ）、ＥＤＮ１（Ｄ）、ＴＨＢＳ１（Ｅ）、ＰＴＧＳ１（Ｆ）、ＬＥＰ（Ｇ）、ＶＥＧＦＡ（Ｈ）、ＶＥＧＦＢ（Ｉ）、ＶＥＧＦＣ（Ｊ）、ＩＤ１（Ｋ）およびＴＩＭＰ１（Ｌ）の発現をＭＰ（ＭＰ）中のＡＳＣと比較して示す一連の写真である。^＊：ｐ＜０．０５。 骨分化培地中でＡＳＣとＣｕｌｔｉｐｈｅｒ Ｇで形成された様々な成熟レベル、すなわち、４週間（Ａ）、８週間（Ｂ）、１２週間（Ｃ）および２５週間（Ｄ）の本発明の生体材料を示す一連の写真である。透明で示される３Ｄ基質の中にミネラル化が黄色で示されている。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧまたはＳ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料のヌードラットに移植後第２９日の「移植片部位」のＸ線撮影の写真である。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧまたはＳ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料のＷｉｓｔａｒラット移植後第２９日の「移植片部位」のＸ線撮影の写真である。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧまたはＳ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料のフォン・コッサ染色を示す写真である。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料のヘマトキシリン－エオシン染色を示す写真である。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料をヌードラットに移植してから２９日後のフォン・コッサ染色を示す写真である。 骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧまたはＳ）とＡＳＣで形成された培養７．５週間後の生体材料（Ａ）および粒子単独で形成された生体材料（Ｂ）のヌードラットに移植後第２９日の「移植片部位」のＸ線撮影を示す一連の写真である。 移植を実施していないラット（Ａ）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ粒子単独を移植した後のラット（Ｂ）および骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ）とＡＳＣで形成された培養８週間後の生体材料を移植したラット（Ｃ）の第０日（Ｄ０）、第１５日（Ｄ１５）、第２３日（Ｄ２３）および第３４日（Ｄ３４）の下肢の創傷治癒を示す一連の写真である。 未治療（偽治療）の非虚血性下肢またはＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ粒子単独（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ）もしくは骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ）とＡＳＣで形成された培養８週間後の生体材料（生体材料）で治療した非虚血性下肢の創傷サイズの曲線下面積（ＡＵＣ）を、１００％に固定した偽治療と比較して評価したものを示す、ヒストグラムである。 Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ粒子単独（四角）もしくは骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ）とＡＳＣで形成された培養８週間後の生体材料（丸）で治療した後または未治療（偽治療、三角）の第０～第３４日の創傷面積を百分率で示すグラフである。 Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ粒子単独（点付きのヒストグラム）もしくは骨分化培地中でブタゼラチン（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ）とＡＳＣで形成された培養８週間後の生体材料で治療した後（黒いヒストグラム）または未治療（偽治療、縞模様のヒストグラム）の第１日、第５日、第１５日および第３４日の非虚血性下肢の中心部の上皮スコア（Ａ）、非虚血性下肢の辺縁部の上皮スコア（Ｂ）、非虚血性下肢の中心部の真皮スコア（Ｃ）および非虚血性下肢の辺縁部の真皮スコア（Ｄ）を示す一連のヒストグラムである。

（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１：本発明の生体材料の作製
ｈＡＳＣの単離
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニングの後、コールマン法による腹部領域の脂肪吸引によってヒト皮下脂肪組織を回収した。

入ってくる脂肪組織から迅速にヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）を単離した。脂肪吸引組織は、＋４℃で２４時間、または－８０℃でさらに長期間保管することができる。

最初に、品質管理の目的で脂肪吸引組織の一部を単離し、残りの脂肪吸引組織の体積を測定した。次いで、脂肪吸引組織をＨＢＳＳで（最終濃度約８Ｕ／ｍＬに）調製したコラゲナーゼ溶液（ＮＢ １、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社、ハイデルベルク、ドイツ）により消化した。消化に使用した酵素溶液の体積は、脂肪組織の体積の２倍とした。消化を３７℃±１℃で５０～７０分間にわたって実施した。１５～２５分後、１回目の断続的振盪を実施し、３５～４５分後、２回目の断続的振盪を実施した。ＭＰ培地（増殖培地または成長培地）の添加により消化を停止させた。ＭＰ培地は、５％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）（ｖ／ｖ）を添加したＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／Ｌグルコースおよび４ｍＭ Ａｌａ－Ｇｌｎ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ゲッティンゲン、ドイツ）を含むものとした。ＤＭＥＭは、塩、アミノ酸、ビタミン、ピルビン酸塩およびグルコースを含有し、炭酸塩緩衝剤で緩衝した標準培地であり、生理的ｐＨ（７．２～７．４）を示す。使用したＤＭＥＭは、Ａｌａ－Ｇｌｎを含有するものとした。ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）は、間葉系幹細胞（ｈＡＳＣなど）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長を刺激するのに用いる成長因子の豊富な供給源となる。

消化した脂肪組織を遠心分離（５００ｇ、１０分、室温）し、上清を除去した。ペレット化した間質血管細胞群（ＳＶＦ）をＭＰ培地中に再懸濁させ、２００～５００μｍメッシュのフィルターに通した。ろ過した細胞懸濁液をもう一度遠心分離した（５００ｇ、１０分、２０℃）。ｈＡＳＣを含有するペレットをＭＰ培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液のごく一部を細胞カウント用に取っておくことができ、残りの細胞懸濁液を全部用いて１つの７５ｃｍ^２Ｔフラスコに播種した（継代Ｐ０と呼ぶ）。播種した細胞の数を推定するため、（情報のみを目的として）細胞カウントを実施した。

単離段階の翌日（第１日）、７５ｃｍ^２Ｔフラスコから成長培地を除去した。細胞をリン酸塩緩衝液で３回すすぎ、次いで、新たに調製したＭＰ培地をフラスコに加えた。

ヒト脂肪由来幹細胞の成長および拡大
工程ののちの諸段階に十分な量の細胞を得るため、増殖期にｈＡＳＣを４回継代した（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４）。

Ｐ０から第４継代（Ｐ４）までの間、細胞をＴフラスコで培養し、新鮮なＭＰ培地を供給した。７０％以上１００％以下のコンフルエンス（目標コンフルエンス：８０～９０％）に達したとき、細胞を継代した。１つのバッチの全細胞培養レシピエントを同時に継代した。継代毎に、細胞を組換え動物不含細胞解離酵素であるＴｒｙｐＬＥ（Ｓｅｌｅｃｔ １Ｘ；７５ｃｍ^２フラスコに９ｍＬまたは１５０ｃｍ^２フラスコに１２ｍＬ）で培養容器から剥離した。ＴｒｙｐＬｅ消化は３７℃±２℃で５～１５分間実施し、ＭＰ培地の添加により停止させた。

次いで、細胞を遠心分離（５００ｇ、５分、室温）し、ＭＰ培地に再懸濁させた。均一な細胞懸濁液を確保するため、回収した細胞をプールした。再懸濁後、細胞をカウントした。

次いで、継代Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で、残りの細胞懸濁液を適切な細胞密度までＭＰ培地で希釈し、さらに大きい組織培養表面に播種した。これらの段階で、７５ｃｍ^２フラスコには体積１５ｍＬの細胞懸濁液を播種し、１５０ｃｍ^２フラスコには体積３０ｍＬの細胞懸濁液を播種した。各継代で、細胞を０．５×１０^４～０．８×１０^４細胞／ｃｍ^２で播種した。異なる継代間で、培地を３～４日毎に交換した。細胞の挙動および成長速度はドナーによってわずかに異なる可能性がある。このため、２継代間の期間および継代間の培地交換の回数はドナーによって異なるものとなり得る。

骨原性分化
継代Ｐ４（すなわち、第４継代）で、細胞をもう一度遠心分離し、ＭＤ培地（分化培地）に再懸濁させた。再懸濁後、細胞をもう一度カウントした後、適切な細胞密度までＭＤ培地で希釈し、１５０ｃｍ^２フラスコに体積７０ｍＬの細胞懸濁液を播種し、骨原性ＭＤ培地を供給した。第４継代の後は、この方法に従い、細胞を直接、骨原性ＭＤ培地で培養した。したがって、細胞がコンフルエンスに達していないうちに骨原性ＭＤ培地を加えた。

骨原性ＭＤ培地は、デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸（０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（２．９３ｍＭ）を添加した増殖培地（ＤＭＥＭ、Ａｌａ－Ｇｌｎ、ｈＰＬ５％）からなるものとした。

細胞の挙動および成長速度がドナーによってわずかに異なる可能性がある。このため、骨原性分化段階の期間および継代間の培地交換の回数がドナーによって異なるものとなり得る。

細胞の多次元誘導
細胞がコンフルエンスに達したとき、形態学的変化がみられ、フラスコ内に類骨小結節（骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分）が少なくとも１つ観察された場合に３Ｄ誘導を開始した。

骨原性ＭＤ培地に曝露した後、付着骨原性細胞のコンフルエントな単層が含まれる培養容器に様々な生体適合材料：
ＤＢＭ：１５０ｃｍ^２フラスコに１０００～１２００ｍｇ±１０％（ＲＴＩ Ｓｕｒｇｉｃａｌ社、米国）、
ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子：１５０ｃｍ^２フラスコに６５／３５の比で１．５ｃｍ^３（Ｔｅｋｎｉｍｅｄ社、フランス）、
ＨＡ粒子：１５０ｃｍ^２フラスコに１．５ｃｍ^３（Ｂｉｏｃｅｔｉｓ社、フランス）または
β－ＴＣＰ粒子：１５０ｃｍ^２フラスコに１．５ｃｍ^３（Ｂｉｏｃｅｔｉｓ社、フランス）
をゆっくりと均一に撒いた。

細胞をＭＤ培地で維持した。多次元誘導の間、３～４日毎に定期的な培地交換を実施した。この培地交換は、生体適合材料粒子および発達中の構造物（１つまたは複数）が除去されないようにして慎重に実施した。

実施例２：生体材料の特徴付け
材料および方法
細胞毒性
Ｌ９２９細胞（マウス線維芽細胞、５％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地で培養）で細胞毒性を評価した。次いで、トランスウェルインサート法を実施して細胞毒性を解析した。

この方法の目的は、細胞－材料間の間接的な接触（培地中での滲出可能な化学物質の拡散）の毒性を評価することであった。この方法では、ｈＡＳＣ細胞およびＬ９２９細胞を２つの２４ウェルプレートに８０００細胞／ｃｍ^２（１ウェル当たり１５２００個）で播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、細胞がコンフルエンスに達したとき、培地を除去し、底部微小孔膜を含むトランスウェルインサートに生体適合材料：
６．６ｍｇ／ｃｍ^２のＤＢＭ、
１５０ｃｍ^２の容器に３種類の異なる量、すなわち、１．５ｃｍ^３、２．８５ｃｍ^３および５．９１ｃｍ^３のＨＡ／β－ＴＣＰ、
１５０ｃｍ^２の容器に１．５ｃｍ^３のＨＡ粒子または
１５０ｃｍ^２の容器に１．５ｃｍ^３のβ－ＴＣＰ粒子
に負荷し、次いで個々のウェルに入れ、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。

インキュベーション後、増殖および細胞傷害性アッセイで生細胞数を定量化する「ＣＣＫ－８キット」（Ｓｉｇｍａ社）を供給業者の指示通りに用いて、細胞生存率を評価した。簡潔に述べれば、培地を除去し、プレートの各ウェルに体積１００μＬのＣＣＫ－８溶液を加えた。混合物を３７℃／５％ＣＯ２で２～４時間インキュベートした。複雑な細胞機序により、安定なテトラゾリウム塩が可溶性ホルマザン色素に切断される。この生体内還元は、生細胞内での解糖によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成に大きく依存する。したがって、形成されるホルマザン色素の量は、培養物中の代謝活性のある細胞の数と直接相関する。ホルマザン色素の量は、分光光度計プレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を測定することにより評価する。

相対細胞生存率（％）を未処理対照細胞に対する百分率で表した。この値は以下のように求めた：
相対細胞生存率＝（ＯＤ－ブランク）_処理／（ＯＤ－ブランク）_未処理×１００
（ＯＤ－ブランク）_未処理：陰性対照（未処理細胞）の（ＯＤ－ブランク）の平均値。

生体適合材料を撒いていない細胞を陰性対照（未処理細胞）として用いた。Ｔｒｉｔｏｎ １％溶液で処理した細胞を陽性対照として用いた。

組織学的解析
生体適合性粒子の添加から４週間後および８週間後、ＭＤ培地中の構造物の生検試料を採取した。

構造／細胞充実度／細胞外基質の存在
ヘマトキシリン－エオシン染色およびマッソン・トリクロム染色を実施した後、組織の構造、細胞充実度および細胞外基質の存在を評価した。

骨分化およびミネラル化
組織の骨分化およびミネラル化をそれぞれオステオカルシン（１／２００希釈のオステオカルシン抗体、参照ａｂ１３４１８、Ａｂｃａｍ社）およびマイクロＣＴで評価した。

Ｓｋｙｓｃａｎ １１７２Ｇ（Ｂｒｕｋｅｒ社）（Ｅｒｗａｎ Ｐｌｏｕｇｏｎｖｅｎ、ＵＬｇ、リエージュ）を用いて取得を実施した。Ｂｒｕｋｅｒ社のマイクロＣＴソフトウェアであるＮＲｅｃｏｎ、ｖ．１．６．１０．１で再構築を実施した。調整後、約１７００×１７００×７００ボクセル（３Ｄピクセル）の３Ｄ画像を再構築した。上記の解像度で、１ボクセルの体積は９８５μｍ^３であった。減衰領域の体積および厚さの平均測定値を総体積の％で記録した。減衰領域はミネラル化領域と一致した。

成長因子含有量
形成された組織の生物活性を評価するため、生体適合性粒子の添加から４週間後および８週間後、タンパク質の抽出および定量化に生検試料を採取した。比色分析（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１α、ＩＧＦ１に関するＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により、供給業者の指示通りに総タンパク質および成長因子含有量を定量化した。

破骨細胞活性
無ｈＰＬ条件で７２時間培養した後、（ＭＤ培地またはＭＰ培地での）培養物のＡＳＣおよび（ＤＢＭまたはＨＡ／βＴＣＰの添加により約８週間にわたって誘導した）多次元培養物のＡＳＣの上清を回収し、のちの定量化にそのまま－２０℃で直接保管した。生体適合性粒子単独のタンパク質も抽出して、ＯＰＧおよびＲＡＮＫＬのレベルを定量化した。

ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ ＥＬＩＳＡキット；Ｈｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ ＥＬＩＳＡキット；ＬＳ Ｂｉｏ社）を供給業者の指示通りに用いてＯＰＧおよびＲＡＮＫＬを定量化した。

結果
細胞毒性
ＤＢＭに細胞毒性は検出されなかった。トランスウェルインサート法を用いて細胞をＤＢＭと２４時間培養したところ、細胞生存率の百分率の増加さえ認められた（１７０．３％まで、図１）。

低濃度（１０ｍｇ／ｃｍ^２）では、ｈＡＳＣとＨＡ／β－ＴＣＰ粒子との間接的な接触によって細胞生存率が改善した（細胞単独と比較して１１１．１％の細胞生存率）。これとは対照的に、１９ｍｇ／ｃｍ^２および３９．４ｍｇ／ｃｍ^２の濃度では、細胞生存率がそれぞれ１０％および５２．３％に低下した（図２）。

組織学的解析
生体適合性粒子との４週間または８週間のインキュベーション後、構造物間に有意差は認められなかった。

構造／細胞充実度／細胞外基質の存在
生体適合材料添加の数日後、骨原性細胞および分散した生体適合材料粒子がミネラル化細胞外基質の中に徐々に閉じ込められていった。

数日後、骨原性細胞および生体適合材料粒子が、一部ミネラル化した黄褐色の成形可能なパテの大きな三次元パッチ（または少数のこれより小さいパッチ）を形成し、各培養容器から剥離し始めた。約１５日後には、多次元生体材料が発達し、フラスコから剥離し得る。

ｈＡＳＣと様々な粒子（ＤＢＭ、ＨＡ／β－ＴＣＰ、ＨＡおよびβ－ＴＣＰ）のいずれかとを骨原性分化培地で共培養したところ、３Ｄ構造の形成がみられた。この構造物は鉗子でつまむことができ、機械的強度に耐性を示すものであった（図３）。

両組織の細胞充実度は同程度であり、ＤＢＭを用いて形成した生体材料が２５３±６６細胞／ｍｍ^２（ｎ＝３）、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料が２６２±２０５細胞／ｍｍ^２（ｎ＝７）であった。ＤＢＭまたはＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料の顕微鏡像を図４に示す（それぞれＡおよびＢ）。

ヘマトキシリン－エオシンおよびマッソンのトリクロム染色による組織学的解析では、両組織とも、細胞および粒子の間に相互結合組織が存在し、細胞化された相互結合組織に粒子が組み込まれていることが明らかになった（それぞれ図５Ａおよび５Ｂ）。

骨分化／ミネラル化
両組織とも細胞外基質のオステオカルシン染色が陽性であり（図５Ｄ）、ＡＳＣが適切に骨原性細胞に分化したことが示された。

マイクロＣＴ解析およびフォン・コッサ染色では、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料のミネラル化度が３８．２％±１２．３（ｎ＝５）、ＤＢＭを用いて形成した生体材料のミネラル化度が１．９％であることが明らかになった（それぞれ図６および図５Ｃ）。

成長因子含有量
生体適合性粒子との４週間または８週間のインキュベーション後、構造物間に有意差は認められなかった。

結果を下の表１および図７に示す。

本発明の生体材料の成長因子含有量（ｎｇ／ｇ生体材料）

本発明の生体適合性粒子を用いて形成した生体材料はいずれも、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１およびＳＤＦ－１αを含む。それでも、ＳＤＦ－１αの含有量はＶＥＧＦおよびＩＧＦ１のものよりも少ない。全組織にＢＭＰ２もＢＭＰ７も検出されなかった。

破骨細胞活性
ＭＰ／ＭＤ培地、ＤＢＭを用いて形成した生体材料、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料、ＨＡを用いて形成した生体材料およびβ－ＴＣＰを用いて形成した生体材料中のｈＡＳＣの上清のＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ分泌を定量化した。

ＲＡＮＫＬは検出されなかった。ＭＰ培地またはＭＤ培地中の細胞の上清にＯＰＧはみられなかった。

これとは対照的に、３Ｄ構造物はいずれもＯＰＧを分泌することがわかった。ＤＢＭを用いて形成した生体材料は約１１６０ｐｇ／１０^６細胞を分泌し、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料は約３０１０ｐｇ／１０^６細胞を分泌する（図８）。組織１グラム当たりの濃度では、ＤＢＭを用いて形成した生体材料は約１５．５ｎｇ／ｇ分泌し、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料は約３０ｎｇ／ｇ分泌し、ＨＡを用いて形成した生体材料は約７６ｎｇ／ｇ分泌し、β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料は約８４ｎｇ／ｇ分泌する（図９）。

ＤＢＭ単独およびＨＡ／β－ＴＣＰによるＯＰＧ分泌も評価し、ほぼ検出不可能なレベルであることがわかった（図９）。

実施例３：本発明に従って形成した生体材料と異なるプロトコルに従って形成した生体材料との比較
材料および方法
組織作製
２つの異なるドナーに由来する脂質幹細胞を用いて組織を製造した。実施例１のプロトコルに従い、生体適合材料にＤＢＭを用いてＮＶＤ－１を作製した。ＮＶＤ－１の作製プロトコルに従ってＮＶＤ－０を作製したが、以下の２つの重要な修正を加えた：（ｉ）ＮＶＤ－０の培地（ＭＰおよびＭＤ）には（ＮＶＤ－１の培地の５％ＨＰＬの代わりに）１０％ＦＢＳを用い、（ｉｉ）ＮＶＤ－０作製の第４継代では、（ＮＶＤ－１作製で第４継代から骨原性分化およびＤＢＭ粒子添加まで細胞を直接ＭＤで培養したのに代えて）細胞を増殖培地（ＭＰ）でコンフルエンシーまで培養し、次いで、ＭＤで骨原性分化およびＤＢＭ粒子添加まで培養した。

ＮＶＤ－１およびＮＶＤ－０の作製にはＲＴＩ Ｓｕｒｇｉｃａｌｓ社のＤＢＭ粒子を用いた。ＤＢＭ粒子添加の８週間後まで、組織をＭＤ（ＮＶＤ－１では５％ＨＰＬ、またはＮＶＤ－０では１０％ＦＢＳを添加）で培養して維持し、３～４日毎に培地を交換した。

粒子添加の８週間後、組織学的解析、生物活性の評価およびミネラル化の定量化により組織の特徴を明らかにした。さらに、１つのドナーに関してプロテオーム解析を実施して、細胞によって分泌される基質の組成の特徴を明らかにした。

組織学的解析
粒子添加の８週間後、組織の生検試料を採取した。生検試料をホルモールで固定し、ヘマトキシリン－エオシン（当業者に公知の方法によるＨＥ染色）用に調製した。組織を組織学的に解析し、特徴を明らかにした、すなわち、ＨＥスライドで細胞をカウントした後、基質の細胞充実度および効力比を求めた。

ｉｎ ｖｉｔｒｏの生物活性
形成された組織の生物活性を評価するため、粒子添加の８週間後、各組織につき３例の生検試料を採取し、重量を測定した。この２７例の生検試料をＨＰＬもＦＢＳも含まないＭＤ中に７２時間置いた。次いで、分泌された成長因子のＥＬＩＳＡ（ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＩＧＦ１、ＳＤＦ１ａ、ＶＥＧＦ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬ）による定量化に上清を回収した。

生検試料をタンパク質の抽出および定量化に用いた。比色分析（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＥＬＩＳＡ（ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１ａ、ＩＧＦ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬ（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社））によって、それぞれ供給業者の指示通りに総タンパク質および成長因子含有量を定量化した。

結果
組織学的解析
組織学的解析の結果（ｎ＝１）から、ＮＶＤ－１の方がＮＶＤ－０よりも細胞充実度が高いことが明らかになった。表２および図１０に示すように、両群とも組織中の基質の割合は同程度であったが、ＮＶＤ－１の方がＮＶＤ－０よりも重要な基質密度がみられた。

ＮＶＤ－１およびＮＶＤ－０の細胞充実度

ｉｎ ｖｉｔｒｏの生物活性
ＮＶＤ－１とＮＶＤ－０との間に意味のある差がみられ、ＮＶＤ－１の方がＮＶＤ－０よりもＶＥＧＦおよびＳＤＦ１ａの含有量が高く、ＩＧＦ１およびＯＰＧの含有量が低いことが示された（表３）。ＢＭＰ２およびＲＡＮＫＬは定量化の下限未満であった。

＜ＬＯＱ：定量化の限界未満
ＮＶＤ－１およびＮＶＤ－０の成長因子含有量（ｎｇ／ｇ生体材料）

実施例４：骨形成能および血管新生能
材料および方法
Ｑｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）およびＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）を用いて、増殖培地（ＭＰ）のＡＳＣ（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）、分化培地のＡＳＣ（ＭＤ、粒子を含まない古典的な骨原性培地で培養した細胞）（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）および１．５ｃｍ^３のＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）から全ＲＮＡを抽出した。Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を追加のオンカラムＤＮアーゼ消化とともに製造業者の指示通りに用いて、ＲＮＡを精製した。分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、ＲＮＡの性質および量を明らかにした。市販のＰＣＲアレイ（Ｈｕｍａｎ ＲＴ^２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－血管新生；Ｈｕｍａｎ ＲＴ^２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－骨形成、Ｑｉａｇｅｎ社）による骨原性および血管新生の遺伝子発現プロファイルには、ＲＴ^２ＲＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡ０．５μｇからｃＤＮＡを合成した。増幅産物の検出にはＡＢＩ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ５システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いた。ΔΔＣＴ法に従って定量化を実施した。各試料の最終結果を３種類のハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨ）の発現レベルの平均値に対して正規化した。

リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ｍＲＮＡレベルでの骨原性遺伝子および血管新生遺伝子の発現を実施した。

結果
本発明の生体材料では、８４種類の被験骨原性遺伝子のうち骨格発生に関与する１１種類の遺伝子（ＡＣＶＲ１、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＣＳＦ１、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦＲ１、ＲＵＮＸ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＷＩＳＴ１）、３種類の転写因子（ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）、２種類の成長因子（ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ）および３種類の細胞接着分子（ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ１、ＩＣＡＭ１）がＭＰのＡＳＣまたはＭＤのＡＳＣと比較して調節されることがわかった（図１１）。

本発明の生体材料にはＭＰまたはＭＤのＡＳＣと比較して、軟骨細胞および破骨細胞の骨形成関連遺伝子の発現を促進し、細胞周期進行を調節し、骨微小環境を改善し、機能に影響を及ぼす不可欠な骨形成特異的転写因子（Ｂｒｕｄｅｒｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅｒ，２０１４；Ｘｕ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓ Ｒｅｓ，２０１５）であるＲｕｎｔ関連転写因子２（Ｒｕｎｘ２）が有意に高く発現した（図１１Ｃ）。

本発明の生体材料にはＭＤのＡＳＣと比較して、骨格間葉に発現し、骨格発生の過程で間葉細胞系列の配分の制御に鍵となる役割を果たすＴＷＩＳＴ関連タンパク質１（ＴＷＩＳＴ１）（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ．２０００；Ｒｉｃｅ ＤＰ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ．２０００）も有意に高く発現した（ｐ＝０．０９）（図１１Ｄ）。

骨形成に重要な経路の１つにトランスフォーミング成長因子ベータ／骨形成タンパク質（ＴＧＦ－ｂ／ＢＭＰ）経路がある。ＴＧＦ－ｂは（ＴＧＦＢＲ１活性化を介して）ＳＭＡＤなどの細胞内シグナル伝達タンパク質を活性化する。これらの因子は、ＴＧＦベータ制御遺伝子の転写を調節し、それにより骨原性遺伝子転写を活性化、造骨分化を促進する（Ｓｏｎｇ Ｂ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．Ａｕｔｈｏｒ，２０１０）。興味深いことに、本発明の生体材料にはＭＤのＡＳＣと比較して、ＴＧＦＢＲ１およびＳＭＡＤ２／５ ｍＲＮＡが高く発現することがわかった（図１１Ｅ～１１Ｈ）。

ＭＰのＡＳＣ、ＭＤのＡＳＣおよび本発明の生体材料で試験した８４種類の血管新生遺伝子のうち、６種類の遺伝子が成長因子に関連するものであり（ＡＮＧ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＢ２、ＶＥＧＦＡ、ＦＧＦ１、ＴＧＦＢ１）、２種類のＥＣＭ分子（ＬＥＰ、ＴＩＭＰ１）および２種類の細胞接着分子（ＥＮＧ、ＴＨＢＳ１）が調節された（図１２）。

本発明の生体材料にはＭＰのＡＳＣと比較して、アンジオポエチン（ＡＮＧ）ｍＲＮＡが有意に高く発現することがわかった（図１２Ａ）。アンジオポエチンシグナル伝達は、既存の血管から新たな動脈および静脈を形成する過程である血管新生を促進する（Ｆａｇｉａｎｉ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２０１３）。

さらに、本発明の生体材料にはＭＰおよびＭＤのＡＳＣと比較して、胚発生および成体組織での血管新生を調節するエフリンＡ１（ＥＦＮＡ）ｍＲＮＡ（Ｐａｓｑｕａｌｅ ＥＢ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００５）が高く発現することがわかった（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。

本発明の生体材料中のＡＳＣではＭＰまたはＭＤのＡＳＣと比較して、血管内皮成長因子ＡのｍＲＮＡ（ＶＥＧＦＡ）の発現も有意に改善された（図１２Ｄ）。ＶＥＧＦは、血管発生および血管新生の調節に最も重要な成長因子の１つである。骨は極めて血管が発達した器官である（同時に、血管新生が骨形成の重要な調節因子となっている）ため、ＶＥＧＦも骨格発生および出生後の骨修復に正に影響を及ぼす（Ｈｕ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｏｎｅ ２０１６）。

本発明の生体材料にはＭＰのＡＳＣと比較して、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）ｍＲＮＡ（強力な血管新生促進因子、Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２００９）およびレプチン（ＬＥＰ）ｍＲＮＡ（重要な血管新生のエンハンサーおよびＶＥＧＦ発現のインデューサー；Ｂｏｕｌｏｕｍｉｅ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９９８；Ｓｉｅｒｒａ－Ｈｏｎｉｇｍａｎｎ ＭＲ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）１９９８）の過剰発現もみられた（それぞれ図１２Ｅおよび１２Ｆ）。

結論として、本発明の生体材料は、移植後、骨分化能とともに細胞生着のために血管新生を促進する能力を分子レベルで発現する細胞が（３Ｄ構造内に）存在することによって、骨原性であると定義され得る。

実施例５：移植後の線維性環境内での血管新生および骨形成の促進
４．１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ
組織傷害に最もよくみられる要素の１つが低酸素状態の存在である。間質が損傷すると多くの場合、凝固カスケードが活性化し、低酸素状態の領域が生じる。このことに関連して、本発明の生体材料が、移植後の血管新生の鍵となる成長因子であるＶＥＧＦ（Ｍａｄｒｉｇａｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４ Ｏｃｔ １１；１２：２６０）を分泌する能力を評価した。様々な組織で酸素圧が低下すると、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生遺伝子の転写を誘導する低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１α）（Ａｈｌｕｗａｌｉａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１２；１９（１）：９０－９７；Ｈａｗｋｉｎｓ ＫＥ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２０１３；８（６）：７７１－７８２）のほかにもＭＳＣ化学誘引間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１α）（Ｙｏｕｎ ＳＷ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７：４３７６－４３８６．Ｃｅｒａｄｉｎｉ ＤＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４；１０（８）：８５８－８６４）の活性化が起こることが知られている。

材料および方法
低酸素濃度が生体材料の血管新生促進特性に及ぼす影響を評価するため、３例のドナー由来のＡＳＣと１．５ｃｍ^３ＨＡ／β－ＴＣＰとから形成した生体材料をＰＢＳで２回洗浄し、（培地中に外因性成長因子が存在しないよう）ｈＰＬを含まない骨原性分化培地（ＭＤ）１０ｍＬが入った６ウェルプレートで、二重反復でインキュベートした。プレートを５％ＣＯ２、３７℃で７２時間、低酸素状態（１％Ｏ２）または酸素正常状態（２１％Ｏ２）に置いた。次いで、ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１αの定量化に上清を回収した。

さらに、６ウェルプレートに二重反復で入っている３例のドナーに由来する継代４のコンフルエントなＡＳＣをＰＢＳで２回洗浄し、ｈＰＬを含まない５ｍＬまたは１０ｍＬの増殖培地（ＭＰ）または骨原性分化培地（ＭＤ）に５％ＣＯ_２、３７℃で７２時間、低酸素状態（１％Ｏ_２）または酸素正常状態（２１％Ｏ_２）で入れた。次いで、ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１αの定量化に上清を回収した。

結果
低酸素圧では２Ｄ（ＭＰおよびＭＤ）での細胞によるＶＥＧＦ分泌が増大した（１％Ｏ_２対２１％Ｏ_２で、ＭＰがそれぞれ２４２±５１ｐｇ／１０^５細胞対２９±２７ｐｇ／１０^５細胞、ＭＤがそれぞれ５６５±５０７ｐｇ／１０^５細胞対１８２±２１６ｐｇ／１０^５細胞（ｐ＜０．０５））が、低酸素状態が本発明の生体材料のＶＥＧＦ分泌に及ぼす影響はみられなかった（１％Ｏ_２対２１％Ｏ_２でそれぞれ、７６０±５９４ｐｇ／１０^５細胞対８０６±５３０ｐｇ／１０^５細胞）（図１３Ａ）。したがって、低酸素圧が本発明の生体材料の使用に対する限定要因となることはない。

さらに、１％Ｏ_２条件でも２１％Ｏ_２条件下でも、本発明の生体材料にＭＰおよびＭＤのＡＳＣより高いＶＥＧＦ分泌がみられた（図１３Ａ）。

低酸素刺激後、ＭＤのＡＳＣにＳＤＦ－１α分泌の刺激が観察され（ｐ＝０．００９）、２１％Ｏ_２では、本発明の生体材料によって、ＭＰおよびＭＤのＡＳＣよりも有意に高い量のＳＤＦ－１αが放出された（それぞれ、ｐ＝０．０１３および０．０２５）（図１３Ｂ）。

さらに、１％Ｏ_２では、ＭＤのＡＳＣの方がＭＰのＡＳＣおよび本発明の生体材料よりも分泌が低いことが明らかになった（それぞれ、ｐ＝０．００９および０．０１３）（図１３Ｂ）。

本発明の生体材料を低酸素圧（線維性組織にみられる１％酸素）に曝露することにより、ＡＳＣには脈管形成の鍵となるエフェクターを分泌する能力があることが明らかになった。これらの分泌は、細胞外基質を有する三次元中、すなわち、本発明の生体材料中のＡＳＣの方が、二次元で培養した増殖／骨原性培地のＡＳＣよりも（低酸素状態および酸素正常状態で）優れていた。

４．２．ｉｎ ｖｉｖｏ
低酸素条件下での本発明の生体材料の生物活性を明らかにする目的で、筋壊死の前臨床モデルを実施した。Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１１；３２（３４）：８８８０－９１）によって示された異所性モデルは、生体材料の生物活性を検討するゴールドスタンダードモデルであり、腰部領域内の焼灼脊椎傍筋によって形成されたポケットに被験品（生体材料）を移植することにある。

材料および方法
ヌードラットに、いかなる移植片拒絶反応も起こらないよう本発明の生体材料（ヒト起源）を移植する、２つの実験を実施した。

第一の実験は、移植の１か月後に組織リモデリングに本発明の生体材料が果たす役割を評価するようデザインしたものである。第二の実験は、（移植後第２９日に）組織リモデリングを分子レベルで評価するようデザインしたものである。

両実験とも、生体材料を１０個体のヌードラットに両側移植した。移植した生体材料の体積は約０．３ｃｍ^３（５００ｍｇまたは４．７×１０^６細胞に相当する）であった。

第一の実験では、移植後第２８日、フォン・ヴィルブランド病に対する免疫染色後に血管新生を組織形態計測によって定量化し、ＨＬＡに対する免疫組織化学によってヒト細胞の存在を評価した。

第二の実験では、移植後第２９日、ＨＬＡに対する免疫組織化学によってヒト細胞の存在を評価し、マッソン・トリクロム染色後、組織形態計測解析によって移植片の血管再生を評価した。

さらに、Ｑｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）およびＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）を用いて、外植片から全ＲＮＡを抽出した。Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を追加のオンカラムＤＮアーゼ消化とともに製造業者の指示通りに用いて、ＲＮＡを精製した。分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、ＲＮＡの性質および量を求めた。市販のＰＣＲアレイ（Ｈｕｍａｎ ＲＴ^２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－血管新生；Ｈｕｍａｎ ＲＴ^２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－骨形成、Ｑｉａｇｅｎ社）による骨原性および血管新生の遺伝子発現プロファイルには、ＲＴ^２ ＲＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡ０．５μｇからｃＤＮＡを合成した。増幅産物の検出にはＡＢＩ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ５システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いた。ΔΔＣＴ法に従って定量化を実施した。各試料の最終結果を３種類のハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨ）の発現レベルの平均値に対して正規化した。

移植後第２９日、本発明の生体材料から得た外植片の間で骨原性遺伝子の発現を比較した。次いで、外植片について８４種類の骨原性遺伝子を試験した。

結果
第一の実験
移植から１か月後、生体材料の内部に血管内部成長の存在が確認された（図１４）。

血管表面積および血管数／ｍｍ^２の結果を図１５に示す。

本発明の生体材料内のヒト細胞の存在により、本発明の生体材料中のヒトＡＳＣが（筋肉領域／移植部位の焼灼の後に）壊死宿主組織内で生き延びることが可能であることが明らかになった（図１６）。

第二の実験
移植後第２９日、本発明の生体材料中にヒト細胞が存在することが明らかになった（データ不掲載）。

既に記載したように、第一の生物活性に関する実験では、移植後第２９日に移植片の血管再生が確認された（データ不掲載）。

ｉｎ ｖｉｖｏ実験から、本発明の生体材料が製品内で血管新生を誘導することが可能であることが明らかになった。

実施例６：骨欠損の治療
骨形成における本発明の生体材料の効果を試験するため、ラットモデルの臨界寸法の骨欠損をデザインした。このモデルについては文献（Ｓａｘｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１６－Ｍａｎａｓｓｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ２０１６）に十分に記載されている。

材料および方法
本発明のヒト生体材料のレシピエントには、いかなるＴ細胞免疫反応も起こらないよう雄ヌードラットを選択した。簡潔に述べれば、ヌードラット１４個体（ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独および生体材料それぞれのレシピエント７個体からなる２つのグループ）にＲａｔＦｉｘ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＲＩＳｙｓｔｅｍ社、スイス）を用いることによって、ラット大腿骨に臨界寸法の骨欠損を実施した。５ｍｍの欠損を生じさせ、スクリューで固定したプレートを用いることにより、大腿骨の２つのセグメントを連結した。

骨欠損誘導から３週間後、Ｘ線撮影を実施して、骨欠損の不可逆性を評価し、いかなる自発的骨再生も起こらないようにした。

（骨欠損が持続し、いかなる固定材料破損もみられない）ヌードラットレシピエントにＨＡ／β－ＴＣＰ粒子（５００ｍｇに相当する総体積０．３４４ｃｍ^３）またはＡＳＣと１．５ｃｍ^３のＨＡ／β－ＴＣＰ粒子と（５００ｍｇに相当する総体積０．３１３ｃｍ^３および４．７×１０^６個の細胞）を用いて形成した本発明の生体材料を移植した。

移植から１か月後、移植片統合および骨融合のレベルを評価する目的で、各個体にマイクロＣＴスキャンおよび組織学的検査を実施した。

結果
移植から１か月後、本発明の生体材料は大腿骨の両セグメントの間に完全に統合されて、二皮質骨融合（２つの大腿皮質構造物の連続性）が起こっていた（図１５、左上および左下）が、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独のものは骨欠損内に位置し、全く統合されていなかった（図１７、右上および右下）。実際、皮質骨とＨＡ／β－ＴＣＰ粒子との間に架橋はみられず、両側皮質融合（図１７右下の記号^＊で示される）および大腿骨欠損端の萎縮様相もみられなかった。

以上の結果を組織学的検査により確認した（図１８および１９）。ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独の移植から１か月後、製品は統合されておらず、重大な線維症が観察された（図１８Ａ、白矢印）。天然の骨とＨＡ／β－ＴＣＰの移植片との間の境界にある欠損には、軟骨内骨化がみられなかった（図１８Ｂ、黒矢印）。本発明の生体材料の移植から１か月後、製品の統合および骨融合が観察された（図１９Ａ、白矢印）。天然の骨と生体材料との間に直接接する形で軟骨内骨化がみられ、骨統合過程が示された（図１９Ｂ、黒矢印）。ＨＬＡ－Ｉ染色では、ヒト細胞が存在することがわかる（図１９Ｃ）。

以上のｉｎ ｖｉｖｏの試験から、（ｉ）本発明の生体材料が低酸素環境中で骨形成を改善することが可能であること、および（ｉｉ）臨界寸法の骨欠損において骨融合を起こすことが可能であることが明らかになった。本発明の生体材料は、骨形成および骨再建の点でＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独よりも優れていることが明らかになった。

実施例７：脊椎固定ラットモデルを用いた生体材料に関する試験（試験ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群）
試験の目的
ＧＬＰ準拠試験（試験ＣＰ－２０１７０２５）を実施して、（ｉ）治験製品が目的とする臨床使用に関連する条件に従った関連動物モデルでの生体材料の全般的毒性（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群」）および（ｉｉ）治験細胞の生体内分布および異所性組織の継続的発達能（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群」）を評価するという２つの目的を遂行した。

免疫適格動物に予想されるヒト細胞拒絶反応が起こらないよう免疫不全（ヌード）ラットモデルを選択した。脊椎固定手術モデルは、文献（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．２００３，８５：９０５－９１１）に十分に記載されており、同じ組織環境中で大腿骨欠損よりも移植体積を大きくすることができる（Ｂｅｌｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．２０１４，６１（３）：１８６－１９２）ため、同モデルを関連モデルに選択した。さらに、脊椎固定外科処置で生じる移植環境は、大腿骨欠損などの骨非統合モデルで生じる環境と比較して極めて類似していると考えられている。

試験デザイン
「生体内分布試験群」の目的には、健常な９週齢ホモ接合ヌード胸腺欠損ラット２０個体（雄１０個体および雌１０個体；Ｈｓｄ：ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕ）をグループ１および２（１グループ当たり雄５個体および雌５個体）に無作為に割り付けた（表４）。

試験（ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群）デザイン

Ｄ０に、グループ１の個体を下に記載する外科的処置により生体材料（臨床バッチと同じ工程に従って製造した１つのバッチ）で治療した。グループ２の個体には生体材料による治療を実施しなかったが、Ｄ０にグループ１の個体と同じ外科的処置を実施した。

Ｗａｎｇらによって記載されている外科手術法に従い、第５または第６腰椎に沿って皮膚および筋肉を切開した。背部の筋肉を分けて離し、腰椎が見えるようにした。Ｌ５腰椎の横突起に円形の骨欠損を生じさせた。直径が一定のドリルビットを使用することにより骨欠損の大きさを統一して、欠損を直径２．０ｍｍ、深さ１ｍｍに制御した。腰椎の両側を欠損させた。グループ１の個体には、腰椎の両側（左および右）に生じさせた穴およびその周囲の領域に生体材料（それぞれ０．５６×１０^７個の細胞を含む０．３７５ｃｍ^３のものを２片）を移植した。次いで、背部の筋肉および皮膚を縫合した。ラットの体重に基づけば、この生体材料の量は１０（２５０ｇのラット対３０ｋｇの患者）～２３．４（２５０ｇのラット対７０ｋｇの患者）の相対安全域に相当する。

Ｄ２９に、ラットを屠殺し、剖検を実施した。ラット組織内の生体材料ヒト細胞の存在を検出および定量化する目的で、投与部位、骨髄、脳、生殖腺、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、骨格筋および脾臓から全ゲノムＤＮＡを抽出した後、ヒトＡｌｕエレメントベースのｑＰＣＲ法を用いて解析した。

器官を採取し、重量を測定し、ＤＮＡ抽出まで－８０℃で保管した。次いで、機械的方法を用いることによって組織を抽出緩衝液中で完全にホモジナイズした後、ＤＮＡ抽出を実施した。被験ラット組織試料または対照ラット組織試料のゲノムＤＮＡを１２５ｎｇ用いて、ｑＰＣＲ実験を２０μｌで実施した。各試料を３回反復で試験した。ラットの特定の組織ＤＮＡ基質１２５ｎｇに添加したヒトＤＮＡの２０ｆｇ（全器官の定量化の下限値）または７０ｆｇ（骨格筋の定量化の下限値）～７ｎｇ（定量化の上限値）の範囲の定量化について、ＡｌｕエレメントベースのｑＰＣＲ法の妥当性を検証した。

結果
グループ１および２の個体の骨髄、脳、生殖腺、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、骨格筋および脾臓ならびにグループ２の個体の投与部位の試料に定量化の限界値以下のヒトＤＮＡが検出されることはなかった。グループ１の個体の全投与部位およびグループ１の１０個体のうち１個体の心臓にヒトＤＮＡが検出された。

生体材料治療ラットの全移植部位に加えて、生体内分布を目的に解析した生体材料治療ラット１０個体のうち１個体の心臓にヒトＤＮＡが検出された。原因は明らかでないが、この結果は、それが解析した１０個体のうち１個体だけに観察されたものであること、また、検出されたＤＮＡの量が少なかった（心臓中のヒト細胞１６６個に相当する推定数）ことから、試料採取時の汚染によるものであると思われる。さらに、生体材料治療ラット１０個体の心臓に移植してから２９日後に実施した組織病理学的解析では、異所性組織形成を思わせる組織病理学的観察結果は認められなかった。

実施例８：脊椎固定ラットモデルを用いた生体材料に関する試験（ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）
ＧＬＰ準拠試験２件を含めた以下の動物試験３件により、生体材料開発のための非臨床毒性試験を実施した：
－脊椎固定ラットモデルを用いた生体材料に関する単回投与毒性試験（ＧＬＰ試験ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）；
－ＮＳＧマウスを用いた生体材料に関する腫瘍形成能試験（ＧＬＰ試験ＣＰ－２０１７０２６）；および
－ＮＳＧマウスを用いて腫瘍形成能を検討した生体材料に関する局所耐容性試験（ＣＰ－２０１７０７３）。

背景および目的
ＧＬＰ準拠試験（試験ＣＰ－２０１７０２５）を実施して、（ｉ）治験製品が目的とする臨床使用に関連する条件に従った関連動物モデルでの生体材料の全般的毒性（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群」）および（ｉｉ）治験細胞の生体内分布および異所性組織の継続的発達能（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群」）を評価するという２つの目的を遂行した。

「毒性試験群」の目的は、潜在的毒性、その発現（急性または遅延）および観察された毒性が消失する可能性を確認し、特徴付け、定量化することであった。

免疫適格動物に予想されるヒト細胞拒絶反応が起こらないよう免疫不全（ヌード）ラットモデルを選択した。脊椎固定手術モデルは、文献（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３）に十分に記載されており、同じ組織環境中で大腿骨欠損よりも移植体積を大きくすることができる（Ｂｅｌｉｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１４）ため、同モデルを関連モデルに選択した。さらに、脊椎固定外科処置で生じる移植環境は、大腿骨欠損などの骨非統合モデルで生じる環境と比較して極めて類似していると考えられている。

試験デザイン
「毒性試験群」の目的には、健常な９週齢ホモ接合ヌード胸腺欠損ラット４０個体（雄２０個体および雌２０個体；Ｈｓｄ：ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕ）をグループ１および２（１グループ当たり雄１０個体および雌１０個体）に無作為に割り付けた（表５）。

試験（ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）デザイン

Ｄ０に、グループ１の個体を下に記載する外科的処置により生体材料（臨床バッチと同じ工程に従って製造した１つのバッチ）で治療した。グループ２の個体には生体材料による治療を実施しなかったが、Ｄ０にグループ１の個体と同じ外科的処置を実施した。

Ｗａｎｇらによって記載されている外科手術法に従い、第５または第６腰椎に沿って皮膚および筋肉を切開した。背部の筋肉を分けて離し、腰椎が見えるようにした。Ｌ５腰椎の横突起に円形の骨欠損を生じさせた。直径が一定のドリルビットを用い骨欠損の大きさを統一して、欠損を直径２．０ｍｍ、深さ１ｍｍに制御した。腰椎の両側を欠損させた。グループ１の個体には、腰椎の両側（左および右）に生じさせた穴およびその周囲の領域に生体材料（それぞれ０．５６×１０^７個の細胞を含む０．３７５ｃｍ^３のものを２片）を移植した。次いで、背部の筋肉および皮膚を縫合した。ラットの体重に基づけば、この生体材料の量は１０（２５０ｇのラット対３０ｋｇの患者）～２３．４（２５０ｇのラット対７０ｋｇの患者）の相対安全域に相当する。

外科手術後、ラットの麻酔後の回復を観察し、次いで、Ｄ２９まで個体の創傷治癒、運動、罹病率、死亡率および明白な毒性の徴候を毎日モニターした。

Ｄ０に、次いで少なくとも週２回、無作為化を目的に体重を測定した。体重変化を評価し、グループ１と２の個体の間で比較した。

Ｄ３およびＤ２９に、絶食させたグループ１および２のラットから血液を採取して、血液学的パラメータ、凝固パラメータおよび生化学的パラメータを測定した。Ｄ２９に、ラットを屠殺し、剖検を実施した。

毒性検査を目的に、１グループ当たり雌雄それぞれ５個体の器官を肉眼で観察し、採取した。脾臓、肝臓、腎臓および心臓の重量を測定した。採取した器官はいずれも、４％のホルマリンに入れて室温で保存し、パラフィンで包埋し、スライドを作製し（１器官当たり３枚；２０個体）、顕微鏡で解析した。

結果
モニタリング期間中、重要な観察結果は報告されなかった。体重に関して、グループ１と２の個体間に体重の統計的有意差は観察されなかった。第３日および第２９日に採取した血液試料に関して実施した解析から、血液学的パラメータ、生化学的パラメータおよび凝固パラメータに関してグループ１と２の個体間に重要な差は報告されなかった。肉眼的には、実施した剖検から重要な事柄は報告されなかった。顕微鏡的には、グループ１の全個体の移植部位に生体材料移植によるものと考えられる異物肉芽腫が観察された。これ以外に生体材料移植に起因すると考えられる組織病理学的な全身変化は観察されなかった。

結論として、ヌードラットの関連するモデルを用いた生体材料移植後に毒性は認められなかった。

実施例９：細胞形質転換リスクの評価
ヒトでは、骨肉腫を含めた様々な肉腫が間葉起源であることを裏付ける証拠が相当量得られている。一方、ＭＳＣについては、長期培養で染色体異常が発現するものの、ｉｎ ｖｉｔｒｏで自然形質転換が起こることは示されていない（Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００７，２５（６）：１５８６－１５９４；Ｂｅｒｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７，６７（１９）：９１４２－９１４９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓａｒｃｏｍａ Ｒｅｓ．２０１３，３（１）：１０）。このような奇形はこれまでに記載されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養条件に対する自然な適応であって、形質転換リスクが高いこととは関係ないことが示唆されている（Ｔａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１０，１１５（８）：１５４９－１５５３）。

臨床バッチに提案される工程で作製した生体材料の開発バッチを３つ以上製造する過程で、生体材料の原薬の細胞遺伝学的安定性を分子核型分析（ａＣＧＨ／ＳＮＰ法）により試験することによって、ＡＳＣの自発的細胞形質転換の可能性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）と高密度一塩基多型（ＳＮＰ）の組合せは、負担となる事前の有糸分裂細胞単離を必要とせずに、ゲノム全域にわたってコピー数変化をスクリーニングし、臨床的に重要な染色体異常および染色体障害を検出する代替手段となるのに十分に確立された分子ジェノタイピング法である（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１，４３（９）：８３８－８４６；Ｓｌａｖｏｔｉｎｅｋ．Ａ．Ｍ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００８，１２４（１）：１－１７）。

結果から、製造工程でも生体材料の原薬の放出試験に相当する継代レベルでも、ｈＡＳＣが細胞遺伝学的に安定であるものと思われることがわかる。

ＮＳＧマウスを用いた生体材料に関するｉｎ ｖｉｖｏのＧＬＰ腫瘍形成能試験（試験ＣＰ－２０１７０２６）
背景および目的
ＭＳＣ由来細胞療法を実施する場合、これまでにヒト患者に腫瘍形成が観察されたことはないが、こうして得られた結果は、患者に対する腫瘍形成能のリスクを確認するものでも排除するものでもない（Ｂａｒｋｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１３，１５（７）：７５３－７５９）。

研究ＣＰ－２０１７０２６の目的は、ＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）免疫不全マウスに移植したのち最大６か月にわたって、生体材料に含まれるヒト脂肪由来ＭＳＣの細胞形質転換のリスクを腫瘍形成能の点から評価することであった。腫瘍形成能が確認されていることで選択したＨＴ－２９細胞系を陽性対照に用いた。

試験デザイン
この試験には、健常な７週齢のＮＳＧ雌マウス３０個体を含めた。マウスを２つのグループ（グループ１には２０個体、グループ２には１０個体）に無作為に割り付けた。グループ１の個体には、生体材料（１．５×１０^７個の細胞を含む１ｇ（±１ｃｍ^３））を切開により皮下空隙に移植した（臨床バッチと同じ工程に従って製造し、研究ＣＰ－２０１７０２５に使用したものと同じバッチ）。グループ２の個体には、ＨＴ－２９細胞を皮下注射により接種した（０．９％ＮａＣｌ ２００μｌで１０^７個／個体）。

マウスの生存率、行動および体重を実験終了まで週２回記録した。各個体を週２回観察し、投与部位に新たに形成された小結節を触診した。新たに形成された小結節があれば測定した。グループ１のマウス（生体材料で治療）は最大６か月間観察し、グループ２のマウス（ＨＴ－２９細胞で治療）は、腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に達するか、壊死が観察されるまでモニターした。

剖検時、各個体の肉眼観察を実施した。グループ１の個体（被験品）については、組織病理学的検査用に移植部位、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、脳、鼠経リンパ節（目に見える場合）のスライドを作製した。

結果
グループ２（ＨＴ－２９、陽性対照）のマウス１０個体に進行性の腫瘍成長がみられ、Ｄ２７（最初の屠殺の日）の平均腫瘍体積（ＭＴＶ）が６１１．６±３３５．４ｍｍ^３であった。１個体のマウスを腫瘍の壊死により屠殺し、他の９個体のマウスはＴＶ＞１０００ｍｍ^３のため屠殺した。グループ２のマウスの剖検時に実施した器官の肉眼観察で異常はみられなかった。

グループ１のマウスのうち１個体については、投与部位の縫合が開いたことによりＤ０～Ｄ１に被験品が喪失した。グループ１の個体は、移植後（Ｄ２）の移植部位の平均体積が１１９４．６±３９２．７ｍｍ^３（Ｎ＝１９）であった。移植後、一部のマウスに投与部位のレベルで治癒しない重度の創傷がみられた。

その結果、グループ１のマウス２０個体のうち１０個体を上記の投与部位における重度の皮膚創傷のため、Ｄ３～Ｄ２７に倫理上の理由で屠殺した。屠殺したグループ１のマウス１０個体のうち、５個体では移植部位に乾燥した黄色の皮膚がみられ、他の２個体では移植部位に壊死が観察された。組織病理学的検査では、移植部位に炎症がみられ、腫瘤が壊死性のものもみられた。上を覆う皮膚および周囲の筋組織には炎症および／または潰瘍が観察された。

グループ１の個体は、移植部位の平均体積が試験終了時点（Ｄ１８０）で１０３２．５±２４５．３（ｎ＝９）ｍｍ^３であり、Ｄ２の移植部位の平均体積と比較して体積増大はみられなかった。

グループ１のマウスの剖検時に実施した器官の肉眼観察で異常はみられなかった。試験終了時（Ｄ１８０）に屠殺したグループ１のマウスについては、顕微鏡観察で移植部位に多房性腫瘤がみられ、壊死はなく、全般的には組織付近に炎症を伴うものではなかった。解析した移植部位およびその他の器官の組織病理学的検査では、グループ１のいずれのマウスにも腫瘍は観察されなかった。

グループ２（ＨＴ－２９細胞で治療）の１０個体のうち少なくとも９個体に進行性に成長する腫瘍がみられたことから、この試験は妥当なものである。約１．５×１０^７個の細胞が含まれる被験品（生体材料１ｇ）の単回皮下移植後、グループ１の（雌ＮＳＧ）いずれのマウスにも腫瘍は観察されなかった。

組織病理検査報告書には、この実験の条件下で、「ＮＳＧマウスに約１ｇ［生体材料］を皮下移植しても、６か月の観察期間にわたって細胞増殖は一切誘導されなかった。移植部位には、被験品と直接関係のある多房性腫瘤がみられた。それにより、一部のマウスについては局所炎症性反応を伴う皮膚潰瘍のため早期に屠殺した。このことは、固い材料を大量に皮下移植したことを原因とする機械的外傷と関係があるものと考えられた。」と記載されていた。

ＮＳＧマウスを用いた生体材料に関するｉｎ ｖｉｖｏの局所耐容性試験および腫瘍形成能の検討（試験ＣＰ－２０１７０７３）
背景および目的
ＧＬＰ腫瘍形成能試験ＣＰ－２０１７０２６では、生体材料移植片の局所耐容性が低いことが観察され、このことは、ＮＳＧ免疫不全マウスに固い材料を大量に皮下移植したことを原因とする機械的外傷と関係があるものと考えられた。

生体材料１ｇ（±１ｃｍ^３）の（試験ＣＰ－２０１７０２６で実施した通り）単一部位（ｎ＝８）または２つの部位（１部位当たり０．５ｇ）（ｎ＝８）への移植後の局所耐容性を（元の計画の通り２週間の期間で）さらに検討するため、試験ＣＰ－２０１７０７３を開始した。

注目すべきことに、試験ＣＰ－２０１７０７３では、試験ＣＰ－２０１７０２６とは対照的に、病変（例えば、筋レベルで融合していない移植部位の黄色皮膚）が観察された場合でも、生体材料１ｇを移植した個体のうち、投与部位の重度の皮膚創傷により倫理上の理由で屠殺しなければならない個体はみられなかった。次いで、既に試験ＣＰ－２０１７０２６で得た腫瘍形成能に関するデータを補完するため、最初に定めた２週間の追跡期間を超える期間（最大６か月）にわたってグループ１の個体（ｎ＝８）をモニターすることにした。

試験デザイン
７週齢の健常なＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）免疫不全雌マウス１６個体を２つのグループ（１グループ当たり８個体）に無作為に割り付けた。グループ１の個体には、生体材料（１．５×１０^７個の細胞を含む１ｇ）を切開により右側腹部の皮下空隙に移植した。グループ２の個体には、生体材料（各部位に０．７５×１０^７個の細胞を含む２×０．５ｇ）を切開により右側腹部および左側腹部の皮下空隙に移植した。マウスの生存率、行動および体重を実験終了まで週２回記録した。各個体について毎日、臨床徴候および局所反応を観察した。グループ１のマウス（１部位を被験品で治療）は最大６か月間観察した。グループ２のマウス（２部位を被験品で治療）は１５日間にわたってモニターした。各個体について肉眼剖検を実施した。グループ１の個体（被験品）については、組織病理学的検査用に移植部位、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、脳、鼠経リンパ節（目に見える場合）のスライドを作製した。

結果
グループ１のマウスのうち、Ｄ７９からＤ８５まで体重減少がみられた１個体を除いて、各マウスの体重はＤ０から屠殺まで徐々に増加した。前者のマウスはＤ８９に死亡していた。

グループ１の個体は、Ｄ２の移植部位の平均体積が１２２８．３±１９５．３ｍｍ^３（ｎ＝８）であった。試験終了時（Ｄ１８０）には、移植部位の平均体積が９４５．５±９２．７ｍｍ^３（ｎ＝７）に減少し、被験品の皮下移植後、いずれの移植部位にも試験期間中に大きさの増大は観察されないことが示された。

グループ１（１部位）およびグループ２（２部位）のマウスは全個体とも、モニタリングパラメータ（運動および歩行、身のこなし、行動、呼吸、眼球、皮膚（移植部位以外）、体毛、粘膜、排泄および無麻痺）が正常であった。

屠殺時、グループ１のマウス（１部位）またはグループ２（２部位）に実施した肉眼観察で異常な器官はみられなかった。Ｄ１８０に屠殺したグループ１のマウスには、組織病理学的解析で細胞増殖は一切認められなかった。移植部位に多房性のミネラル化が観察されたが、上を覆う皮膚および付近の筋組織に炎症はみられなかった。このミネラル化した材料は、移植した被験品であると解釈される。

この実験下では、以下のような結論を導くことができる：
・生体材料を１つまたは２つの部位に投与したところ、両群とも、移植部位に黄色の皮膚が観察される場合でも局所耐容性に何ら有意な影響を及ぼすことはなかった。この観察結果に関して、グループ１の個体には、Ｄ４４に移植部位に最後に黄色の皮膚が観察されて以降、回復がみられた。
・雌ＮＳＧマウスに１．５×１０^７個の細胞を含む生体材料を単回皮下移植し、６か月間の追跡後に肉眼および顕微鏡で検討したところ、腫瘍形成の誘導はみられなかった。
・組織病理検査報告書には、１．５×１０^７個の細胞を含む生体材料１ｇをＮＳＧマウスに皮下移植しても、６か月間にわたって細胞増殖の誘導はみられないことが記載されていた。移植部位には、被験品と直接関係のある多房性のミネラル化がみられた。

実施例１０：本発明の生体材料の作製
１０．１．ｈＡＳＣの単離
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニングの後、コールマン法による腹部領域の脂肪吸引によってヒト皮下脂肪組織を回収した。

入ってくる脂肪組織から迅速にヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）を単離した。脂肪吸引組織は、＋４℃で２４時間、または－８０℃でさらに長期間保管することができる。

最初に、品質管理の目的で脂肪吸引組織の一部を単離し、残りの脂肪吸引組織の体積を測定した。次いで、脂肪吸引組織をＨＢＳＳで（最終濃度約８Ｕ／ｍＬに）調製したコラゲナーゼ溶液（ＮＢ １、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社、ハイデルベルク、ドイツ）により消化した。消化に使用した酵素溶液の体積は、脂肪組織の体積の２倍とした。消化を３７℃±１℃で５０～７０分間にわたって実施した。１５～２５分後、１回目の断続的振盪を実施し、３５～４５分後、２回目の断続的振盪を実施した。ＭＰ培地（増殖培地または成長培地）の添加により消化を停止させた。ＭＰ培地は、５％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）（ｖ／ｖ）を添加したＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／Ｌグルコースおよび４ｍＭ Ａｌａ－Ｇｌｎ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ゲッティンゲン、ドイツ）を含むものとした。ＤＭＥＭは、塩、アミノ酸、ビタミン、ピルビン酸塩およびグルコースを含有し、炭酸塩緩衝剤で緩衝した標準培地であり、生理的ｐＨ（７．２～７．４）を示す。使用したＤＭＥＭは、Ａｌａ－Ｇｌｎを含有するものとした。ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）は、間葉系幹細胞（ｈＡＳＣなど）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長を刺激するのに用いる成長因子の豊富な供給源となる。

消化した脂肪組織を遠心分離（５００ｇ、１０分、室温）し、上清を除去した。ペレット化した間質血管細胞群（ＳＶＦ）をＭＰ培地中に再懸濁させ、２００～５００μｍメッシュのフィルターに通した。ろ過した細胞懸濁液をもう一度遠心分離した（５００ｇ、１０分、２０℃）。ｈＡＳＣを含有するペレットをＭＰ培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液のごく一部を細胞カウント用に取っておくことができ、残りの細胞懸濁液を全部用いて１つの７５ｃｍ^２Ｔフラスコに播種した（継代Ｐ０と呼ぶ）。播種した細胞の数を推定するため、（情報のみを目的として）細胞カウントを実施した。

単離段階の翌日（第１日）、７５ｃｍ^２Ｔフラスコから成長培地を除去した。細胞をリン酸塩緩衝液で３回すすぎ、次いで、新たに調製したＭＰ培地をフラスコに加えた。

１０．２．ヒト脂肪由来幹細胞の成長および拡大
工程ののちの諸段階に十分な量の細胞を得るため、増殖期にｈＡＳＣを４回継代した（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４）。

Ｐ０から第４継代（Ｐ４）までの間、細胞をＴフラスコで培養し、新鮮なＭＰ培地を供給した。７０％以上１００％以下のコンフルエンス（目標コンフルエンス：８０～９０％）に達したとき、細胞を継代した。１つのバッチの全細胞培養レシピエントを同時に継代した。継代毎に、細胞を組換え動物不含細胞解離酵素であるＴｒｙｐＬＥ（Ｓｅｌｅｃｔ １Ｘ；７５ｃｍ^２フラスコに９ｍＬまたは１５０ｃｍ^２フラスコに１２ｍＬ）で培養容器から剥離した。ＴｒｙｐＬｅ消化は３７℃±２℃で５～１５分間実施し、ＭＰ培地の添加により停止させた。

次いで、細胞を遠心分離（５００ｇ、５分、室温）し、ＭＰ培地に再懸濁させた。均一な細胞懸濁液を確保するため、回収した細胞をプールした。再懸濁後、細胞をカウントした。

次いで、継代Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で、残りの細胞懸濁液を適切な細胞密度までＭＰ培地で希釈し、さらに大きい組織培養表面に播種した。これらの段階で、７５ｃｍ^２フラスコには体積１５ｍＬの細胞懸濁液を播種し、１５０ｃｍ^２フラスコには体積３０ｍＬの細胞懸濁液を播種した。各継代で、細胞を０．５×１０^４～０．８×１０^４細胞／ｃｍ^２で播種した。異なる継代間で、培地を３～４日毎に交換した。細胞の挙動および成長速度はドナーによってわずかに異なる可能性がある。このため、２継代間の期間および継代間の培地交換の回数はドナーによって異なるものとなり得る。

１０．３．骨原性分化
継代Ｐ４（すなわち、第４継代）で、細胞をもう一度遠心分離し、ＭＤ培地（分化培地）に再懸濁させた。再懸濁後、細胞をもう一度カウントした後、適切な細胞密度までＭＤ培地で希釈し、１５０ｃｍ^２フラスコに体積７０ｍＬの細胞懸濁液を播種し、骨原性ＭＤ培地を供給した。第４継代の後は、この方法に従い、細胞を直接、骨原性ＭＤ培地で培養した。したがって、細胞がコンフルエンスに達していないうちに骨原性ＭＤ培地を加えた。

骨原性ＭＤ培地は、デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸（０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（２．９３ｍＭ）を添加した増殖培地（ＤＭＥＭ、Ａｌａ－Ｇｌｎ、ｈＰＬ５％）からなるものとした。

細胞の挙動および成長速度がドナーによってわずかに異なる可能性がある。このため、骨原性分化段階の期間および継代間の培地交換の回数がドナーによって異なるものとなり得る。

１０．４．細胞の多次元誘導
細胞がコンフルエンスに達したとき、形態学的変化がみられ、フラスコ内に類骨小結節（骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分）が少なくとも１つ観察された場合に３Ｄ誘導を開始した。

骨原性ＭＤ培地に曝露した後、付着骨原性細胞のコンフルエントな単層が含まれる培養容器に、ゼラチン粒子（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ－ＧおよびＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ－Ｓ、Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ社、オーストルプ、スウェーデン）を１５０ｃｍ^２の容器に対して１ｃｍ^３、１．５ｃｍ^３および２ｃｍ^３の濃度でゆっくりと均一に撒いた。

細胞をＭＤ培地で維持した。多次元誘導の間、３～４日毎に定期的な培地交換を実施した。この培地交換は、ゼラチン粒子および発達中の構造物（１つまたは複数）が除去されないようにして慎重に実施した。

実施例１１：生体材料の特徴付け
１１．１．材料および方法
１１．１．１．構造／組織学的検査
ＡＳＣとＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧおよびＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ粒子とから得られる３Ｄ構造物の形成を試験した。６例の異なるドナーに由来する継代４のコンフルエントなＡＳＣにＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒの粒子を加えた。様々な体積、すなわち、１５０ｃｍ^２の容器当たり１ｃｍ^３、１．５ｃｍ^３、２ｃｍ^３の粒子を試験した。細胞を分化培地（ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ＬグルコースとＵｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋０．５％アンホテリシンＡＢ＋デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸（０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（２．９３ｍＭ））で維持し、３～４日毎に培地を交換した。

ＭＰとＭＤの培養を比較するため、粒子の添加から５日後、１４日後および８週間後にＭＤ中の３Ｄ構造物の生検試料を採取した。

細胞充実度を評価するため、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ粒子の添加から４週間後、８週間後および１２週間後に３Ｄ構造物の生検試料を採取した。

これらをホルモールで固定し、ヘマトキシリン－エオシン染色、マッソン・トリクロム染色、オステオカルシン染色およびフォン・コッサ染色用に調製した。

組織の骨分化およびミネラル化をそれぞれオステオカルシン染色およびフォン・コッサ染色のスライドで評価した。ヘマトキシリン－エオシン染色およびマッソン・トリクロム染色後に組織の構造、細胞充実度および細胞外基質の存在を評価した。

１１．１．２．生物活性
生物活性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を、（ｉ）最終産物中の成長因子ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＳＤＦ－１αの抽出および定量化ならびに（ｉｉ）低酸素状態および高血糖状態（例えば、糖尿病性創傷治癒の条件）での本発明の生体材料の成長因子の分泌／含有能により評価した。さらに、（ｉｉｉ）本発明の生体材料の生物活性特性をｑＲＴ－ＰＣＲにより分子レベルでｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴付けた。

成長因子含有量
形成された組織の生物活性を評価するため、ゼラチン（１．５ｃｍ^３）の添加から４週間後および８週間後、タンパク質の抽出および定量化に生検試料を採取した。比色分析（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＶＥＧＦ、ＳＤＦ１α、ＩＧＦ１に関するＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により、供給業者の指示通りに総タンパク質および成長因子含有量を定量化した。

低酸素状態および高血糖状態での培養
本発明の生体材料の生物活性ならびにこの３Ｄ構造物の生物活性に対する酸素状態および血糖状態の影響を評価するため、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ（１．５ｃｍ^３）と３例のドナー由来のＡＳＣとで形成された８週間後の組織の生検試料をＰＢＳで２回すすぎ、ＨＰＬを含まない４．５ｇ／Ｌ（高血糖条件）または１ｇ／Ｌ（正常血糖条件）グルコースのＭＤ １０ｍＬが入った６ウェルプレートに二つ組で入れた。プレートを低酸素状態（１％Ｏ２）または酸素正常状態（２１％Ｏ２）に５％ＣＯ_２、３７℃で７２時間置いた。次いで、比色分析（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＥＬＩＳＡ（ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ－１α、ＩＧＦ１、ＦＧＦｂ（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）による総タンパク質および成長因子定量化にそれぞれ上清を回収した。タンパク質の抽出、精製ならびに総タンパク質および成長因子含有量の定量化に組織を処理した。

ｑＲＴ－ＰＣＲ
脈管形成および血管新生に関与する遺伝子の発現の解析により、本発明の生体材料の血管新生促進能を検討した。様々な状態にある脂肪幹細胞、すなわち、増殖培地中の脂肪幹細胞（表現型の方向付けがない、ＭＰ）、粒子を含まない古典的な骨原性培地（ＭＤ）中の脂肪幹細胞および最後に本発明の生体材料（脂肪幹細胞および細胞外基質による三次元無足場構造物の形成を誘導することを目的とする１．５ｃｍ^３の粒子）による遺伝子発現を解析した。

Ｑｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）およびＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）を用いて、増殖培地（ＭＰ）で培養した２０００個以上のＡＳＣ（ｎ＝４、独立したヒト脂肪組織の供給源）および本発明の生体材料の約１ｃｍ^２の生検試料（ｎ＝５）から全ＲＮＡを抽出した。Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を追加のオンカラムＤＮアーゼ消化とともに製造業者の指示通りに用いて、ＲＮＡを精製した。分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、ＲＮＡの品質および量を明らかにした。市販のＰＣＲアレイによる（Ｈｕｍａｎ ＲＴ^２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－血管新生）骨原性および血管新生の遺伝子発現プロファイルには、ＲＴ^２ ＲＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡ０．５μｇからｃＤＮＡを合成した。増幅産物の検出にはＡＢＩ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ５システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いた。ΔΔＣＴ法に従って定量化を実施した。各試料の最終結果を３種類のハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨ）の発現レベルの平均値に対して正規化した。

１１．１．３．生体材料の成熟がその特性に及ぼす影響
生体材料（「組織」とも呼ぶ）の成熟がその特性に及ぼす影響をミネラル化レベルの評価、組織学的評価（細胞充実度の決定）および生物活性の評価（成長因子ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＳＤＦ－１αの抽出および定量化）によって評価した。本明細書では、生体材料の成熟は、ＡＳＣを分化培地中でＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ粒子とともに培養する期間を意味する。

Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ粒子の添加から４週間後（ドナー１例）、８週間後（ドナー６例）、１２週間後（ドナー３例）および２５週間後（ドナー１例）、３Ｄ構造物の生検試料を採取し、マイクロＣＴスキャナ解析用にホルモールで固定した。末梢定量ＣＴ機器（Ｓｋｙｓｃａｎ １１７２Ｇ、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏ－ＣＴ ＮＶ社、コンティフ、ベルギー）を用いて３Ｄ構造物のミネラル化を評価した。

さらに、組織の生検試料（４週間（ｎ＝３）、８週間（ｎ＝８）、１２週間（ｎ＝３）および２５週間（ｎ＝１））をホルモールで固定し、ヘマトキシリン－エオシン染色、マッソン・トリクロム染色およびフォン・コッサ染色用に調製した。

１１．２．結果
１１．２．１．構造／組織学的検査
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ粒子をｈＡＳＣとともに増殖培地で培養した場合、３Ｄ構造物は得られなかった。肉眼レベルの３Ｄ構造物がみられなかったのと同じように、顕微鏡レベルの構造物も形成されなかった。

増殖培地とは対照的に、ＡＳＣとともに骨原性分化培地で培養したＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒでは、シート様の３Ｄ構造物の形成がみられた（図２０Ａ）。さらに、この構造物は、鉗子でつまめるものであった（図２０Ｂ）。

ＡＳＣとともに骨原性分化培地で培養したＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒの組織学的検査では、粒子間に細胞化された相互結合組織が存在することが明らかになった。さらに、粒子の細孔内に細胞外基質および細胞がみられた（図２１）。フォン・コッサ染色では、単離したミネラル化粒子が存在することがわかった。これとは対照的に、細胞外基質はフォン・コッサで染色されなかった（図２２）。最後に、相互結合組織にオステオカルシンの発現がみられた（図２３）。

１１．２．２．生物活性
成長因子の含有および分泌
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧおよびＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ単独ではタンパク質含有はみられなかった。ＩＧＦ－１がごくわずかに検出されたが、ＥＬＩＳＡ法の定量化下限値未満であった。

ＡＳＣとともに骨原性分化培地で培養したＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒの生検試料の上清中に検出されたＩＧＦ－１およびＢＭＰ７のレベルは、ＥＬＩＳＡ法の定量化下限値未満であり、ＢＭＰ２およびＦＧＦｂは微量に検出された。これとは対照的に、ＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１αの有意な分泌はみられなかった。

培養条件が成長因子分泌に及ぼす有意な影響はみられなかった（表６）。

培養条件が本発明の生体材料によるＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１α分泌に及ぼす影響

ＡＳＣとともに骨原性分化培地で培養したＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒの生検試料のタンパク質抽出物中に検出されたＢＭＰ２、ＢＭＰ７およびＦＧＦｂのレベルは、ＥＬＩＳＡ法の定量化下限値未満であった。これとは対照的に、ＩＧＦ－１、ＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１αの有意な含有量がみられた。

ＶＥＧＦ含有量に対する培養条件の有意な影響はみられなかった。一方、４．５ｇ／Ｌグルコースで酸素正常状態（２１％Ｏ２）でのＩＧＦ－１含有量は他のグループより高かった（ｐ＜０．０５）。酸素正常状態および正常血糖状態の方が低酸素状態（１ｇ／Ｌおよび４．５ｇ／Ｌグルコース）よりＳＤＦ－１α含有量が高かった（ｐ＜０．０５）（表７）。

培養条件が本発明の生体材料のＶＥＧＦ、ＳＤＦ－１αおよびＩＧＦ１含有量に及ぼす影響

ｑＲＴ－ＰＣＲ解析
ｑＲＴ－ＰＣＲ解析によって解析した８４種類の血管新生促進遺伝子のうち１３種類のｍＲＮＡが、異なる培養条件間で調節されていた。１０種類の遺伝子が本発明の生体材料で増殖培地のＡＳＣよりもアップレギュレートされ（ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ１、ＥＰＨＢ４、ＥＤＮ１、ＬＥＰ、ＴＨＢＳ１、ＰＴＧＳ１、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢおよびＶＥＧＦＣ）、２種類の遺伝子が本発明の生体材料でＭＰのＡＳＣよりもダウンレギュレートされていた（ＩＤ１、ＴＩＭＰ１）（図２４）。

本発明の生体材料にはＭＰのＡＳＣと比較して、アンジオポエチン（ＡＮＧおよびＡＮＧＰＴ１）ｍＲＮＡが有意に高く発現することがわかった（図２４Ａおよび２４Ｂ）。アンジオポエチンシグナル伝達は、既存の血管から新たな動脈および静脈を形成する過程である血管新生を促進する（Ｆａｇｉａｎｉ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２０１３）。

本発明の生体材料ではＭＰのＡＳＣと比較して、脈管形成に不可欠な役割を果たす膜貫通タンパク質であるＥＰＨＢ４（エフリン受容体Ｂ４）、強力な血管収縮剤であるエンドセリン（ＥＤＮ１）（Ｗｕ ＭＨ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１３）、血管拡張剤であるトロンボスポンジン１（ＴＨＢＳ１）および内皮細胞を調節するシクロオキシゲナーゼ１（ＰＴＧＳ１／ＣＯＸ－１）が有意にアップレギュレートされていた（それぞれ図２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅおよび２４Ｆ）。

本発明の生体材料にはＭＰのＡＳＣと比較して、レプチン（ＬＥＰ）ｍＲＮＡ（重要な血管新生のエンハンサーおよびＶＥＧＦ発現のインデューサー；Ｂｏｕｌｏｕｍｉｅ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９９８；Ｓｉｅｒｒａ－Ｈｏｎｉｇｍａｎｎ ＭＲ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）１９９８）の過剰発現もみられた（図２４Ｇ）。

最後に、本発明の生体材料中のＡＳＣではＭＰのＡＳＣと比較して、血管内皮成長因子Ａ、ＢおよびＣのｍＲＮＡ（ＶＥＧＦＡ／Ｂ／Ｃ）の発現も有意に改善された（それぞれ図５Ｈ、５Ｉおよび５Ｊ）。ＶＥＧＦは、血管発生および血管新生の調節に最も重要な成長因子の１つである。骨は極めて血管が発達した器官である（同時に、血管新生が骨形成の重要な調節因子となっている）ため、ＶＥＧＦも骨格発生および出生後の骨修復に正に影響を及ぼす（Ｈｕ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｏｎｅ ２０１６）。

これとは対照的に、本発明の生体材料ではＭＰのＡＳＣと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏの血管新生減少と関係のあるＤＮＡ結合タンパク質阻害剤（ＩＤ１）およびメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）（Ｒｅｅｄ ＭＪ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２００３）がダウンレギュレートされていた（それぞれ図２４Ｋおよび２４Ｌ）。

全体として、以上の分子解析から、細胞が本発明の生体材料中の３Ｄ基質に埋め込まれているとき、ＡＳＣの血管新生促進能がアップレギュレートされることがわかる。

１１．２．３．生体材料の成熟がその特性に及ぼす影響
ミネラル化レベルの評価
４週間後、８週間後、１２週間後および２５週間後の３Ｄ移植片の拡大写真では同じ肉眼レベルの構造（図６、上パネル）が明らかになり、マイクロＣＴで解析した。ミネラル化体積の百分率を求めたところ、４週間後が０．０７％、８週間後が０．２８％±０．３３％であり、１２週間後が１．２４％±０．３５％であり、２５週間後が２，７７％であった（図２５、下パネル）。

したがって、成熟レベルが高いほどミネラル化が高い。

組織学的評価
解析した異なる組織で同程度の細胞充実度が定量化されたことから、組織の成熟が細胞含有量に及ぼす影響はみられなかった（データ不掲載）。

これとは対照的に、組織中のＥＣＭの割合は成熟レベルとともに増大し、４週間後のＥＣＭの割合が有意に低く、２５週間後のＥＣＭの割合が有意に高かった（４週間後、８／１２週間後および２５週間後のＥＣＭはそれぞれ２８±７％対３３±１１／３４±１１％対５６±８％（ｐ＜０．０５））（表８）。

様々な成熟時点の本発明の生体材料に関する組織形態学的解析。

著明なフォン・コッサ染色によって示されるように、１２週間および２５週間の成熟の時点でミネラル化度が高いことがわかった（データ不掲載）。

生物活性の評価
４週間、８週間、１２週間および２５週間の成熟の時点での生体材料の生物活性をタンパク質抽出、精製およびＥＬＩＳＡによる成長因子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＳＤＦ－１α）の定量化の後に検討した（表９）。

４週間、８週間、１２週間および２５週間の成熟の時点での組織中のタンパク質および成長因子の含有量

実施例１２：血管新生および骨原性特性に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験
１２．１．材料および方法
１２．１．１．ヌードラットを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験
第０日、１０個の本発明の生体材料（７．５週間の成熟期間にわたって、１．５ｃｍ^３のＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧまたはＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓとともに実施例１０に記載した通りに培養したＡＳＣ）の複製物をヌードラットの焼灼腰部筋に縫合した。移植の２９日後、生体材料を回収して画像および組織学的検査により解析した。

１２．１．２．Ｗｉｓｔａｒラットを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験
第０日、１０個の本発明の生体材料（７．５週間の成熟期間にわたって、１．５ｃｍ^３のＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ ＧまたはＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓとともに実施例１０に記載した通りに培養したＡＳＣ）の複製物をＷｉｓｔａｒラットの焼灼腰部筋に縫合した。移植の２９日後、生体材料を回収して画像および組織学的検査により解析した。

実験期間を通して毎日、個体の全般的臨床状態を確認した。

小動物イメージング用の高解像度Ｘ線マイクロＣＴシステム、ＳｋｙＳｃａｎ１０７６を用いて、３０例の標本にミネラル化の解析を実施した。ＣＴｖｏｌおよびＣＴａｎソフトウェア（Ｓｋｙｓｃａｎ）を用いて、スキャンの三次元再構築およびミネラル化組織の解析を実施した。

製品のｉｎ ｖｉｖｏの血管新生および骨誘導特性を評価するため、筋肉試料の組織学的解析を実施した（ヘマトキシリン－エオシン染色、マッソン・トリクロム染色、フォン・コッサ染色（組織中のミネラル化の位置を正確に特定する）、ヒト組織マーカーＫｕ８０染色（動物組織中のヒト起源細胞を確認する）およびＣＤ３染色（組織中のＣＤ３＋免疫細胞の配分を明らかにする））。

１２．２．結果
１２．２．１．ヌードラットを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験
ｉｎ ｖｉｖｏ実験中、苦痛の徴候も著明な病変の徴候もみられず、この製品が動物に有害作用を引き起こさないことが示された。

ヌードラットでは、第２９日に実施したＸ線写真にミネラル化を示唆する放射線不透過性の構造物の存在が観察された（図２６）。

ヌードラットの試料ではヒト細胞の存在が際立っていた。２つのグループで、ヒト細胞が存在する場合、辺縁部を除き、移植片部位の細胞のうちヒト細胞が平均して半分を占めていた。移植片部位には、ラット細胞のみが存在する辺縁部以外は、ラット起源の細胞とヒト起源の細胞が均等に分布していた。

１２．２．２．Ｗｉｓｔａｒラットを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験
Ｗｉｓｔａｒラットでは、第２９日に実施したＸ線写真にミネラル化を示唆する放射線不透過性の構造物の存在が観察された（図２７）。

ミネラル化の解析から、各移植片部位にミネラル化組織が存在することが示唆される。

フォン・コッサ染色から、ミネラル化が粒子上に局在していることがわかる（図２８）。

実施例１３：ｉｎ ｖｉｖｏ生物活性試験
１３．１．材料および方法
１３．１．１．試料の調製
約０．５ｇの生体材料（８週間の成熟期間にわたって、１．５ｃｍ^３のＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓとともに実施例１０に記載した通りに培養したＡＳＣ）の試料１０個をヌードラット１０個体の脊椎傍筋に移植するために調製した。さらに、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓ粒子の約０．５ｇの試料２個を対照として用いた。

試料の成長因子含有量を評価するため、生体材料の試料をタンパク質の抽出および定量化用に調製した（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＳＤＦ－１α）。

生体材料の品質を評価するため、試料１個をヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色およびフォン・コッサ染色（ＶＫ）用にホルモールで固定した。ＨＥ染色後、組織中の細胞数をカウントすることによって、脱細胞化処理の効果を評価した。

１３．１．２．動物施設での飼育
動物は、獣医療組織による承認を受けている動物施設「Ｃｅｎｔｒｅ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｑｕｅ Ａｔｌａｎｔｈｅｒａ」で飼育し、現時点での法律（実験目的で用いる動物に関する２０１３年２月１日の法令番号２０１３－１１８）に従ったあらゆる実験手順で用いた。試験開始前、動物を最低７日間順化させ、その間、動物の全般的状態を毎日追跡した。動物は、空調管理された動物舎で標準寸法のプラスチック製の箱の中に入れて飼育した。人工的な昼／夜の光周期を明期１２時間と暗期１２時間に設定した。全個体は、水を自由摂取させ、市販の固形飼料を自由摂取させた。耳標（リング）により各個体を識別した。

１３．１．３．実験プロトコル
第０日、ヌードラット１０個体の焼灼腰部筋に生体材料の複製物を縫合し、ヌードラット１個体の腰部筋に生じさせた筋焼灼区画内に粒子を単独で移植した。移植の２９日後、生体材料が含まれている筋肉を回収して、画像および組織学的検査により解析した。

腰部筋内への移植
ラットに完全に麻酔をかけて、最良の条件下で外科手術を実施した。外科手術のほぼ３０分前、ブプレノルフィン注射で無痛処置を開始した後、翌日、もう１度注射を実施した。

外科手術：各個体に、腰部の位置にある脊柱に沿って縦方向に皮膚切開を実施した。１個体のラットには、皮膚切開の両側に筋肉の区画を生じさせた（すなわち、腰部筋内に区画を生じさせた）。区画を焼灼した。この区画内に粒子を単独で移植した。１０個体のラットには、生体材料を焼灼腰部筋に縫合した。外科処置後、外科用ステープルを用いて皮膚創傷を縫合した。

臨床経過観察
実験期間を通して毎日、個体の全般的臨床状態を確認した。週２回、呼吸器、眼球、心血管、胃腸管の徴候；運動活動および行動；発作の徴候；皮膚の評価；移植部位の炎症に重点を置いて詳細な臨床経過観察を実施した。

さらに、週２回、詳細な臨床経過観察と同時に体重測定を実施した。

終末処置および死後解析
第２９日、ラットを放血により屠殺し、肉眼的評価を実施した。剖検では、死体の外観を観察し、内部の病変異常の可能性を示す病的体液喪失があれば記録した。

心臓、腎臓、脾臓、肝臓および肺に重点を置いて内臓の病変による変化を評価するため、胸腔および腹腔を大きく切開した。

移植片部位の肉眼的評価
筋肉の移植片部位を露出させ、局所組織反応ならびに移植片の存在および局在に重点を置いて詳細な肉眼的評価を実施した（Ｘ線撮影解析）。

筋肉の移植片部位を取り出した。中性に緩衝したホルマリン溶液で外植片を室温で４８時間固定した。

３Ｄ組織形態計測解析
小動物イメージング用の高解像度Ｘ線マイクロＣＴシステム、ＳｋｙＳｃａｎ１０７６を用いて、標本にミネラル化の解析を実施した。

以下のパラメータ、すなわち、電源電圧：５０ｋＶ；回転ステップ：０．５°；ピクセルサイズ：１８μｍ；１つの位置につき１フレームを用いて、筋肉試料を室温でスキャンした。

ＣＴｖｏｌおよびＣＴａｎソフトウェア（Ｓｋｙｓｃａｎ）を用いて、スキャンの三次元再構築およびミネラル化組織の解析を実施した。

各試料について、骨ミネラル化組織のシグナルと同じシグナルの量（閾値４０／２５５）を求めた（骨体積：ＢＶとする）。用いた「組織体積」の値は、形成した移植片の体積である。

病理組織学的解析および２Ｄ組織形態計測解析
製品のｉｎ ｖｉｖｏの血管新生および骨誘導特性を評価するため、筋肉試料の組織学的解析を実施した。

ホルマリン固定した外植片を１５％ＥＤＴＡ中で１３日間脱灰した。次いで、試料を脱水し、パラフィンに包埋した。ミクロトームを用いて４～５μｍの切片を切り出し、スライド上で伸ばした。１５０μｍ離れた２つの異なる位置で薄切を実施した。

この２つの薄切領域で（パラフィン包埋または凍結した標本の切片を用いて）ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）、マッソン・トリクロム（ＭＴ）およびＣＤ１４６の免疫組織化学を実施した。

デジタルスライドスキャナ（Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）を用いて、染色した切片全体の画像を取得した。ＮＤＰｖｉｅｗ２ソフトウェアを用いて、血管が占める面積の定量化（トリクロムマッソン、ＣＤ１４６）を以下の通りに実施した。組織の特徴に基づき、目的とする領域の輪郭を手動で描いて、切片上の「移植片部位」の面積を画定した。各血管の輪郭を手動で描いて、目的とする領域内で血管が占める面積を定量化した。血管に対応する表面および血管の数を「移植片部位」の総面積に対して報告した。

１３．２．結果
１３．２．１．組織学的解析
ＨＥ染色後、組織中の細胞数を求めた（図２９）：１４６．５±５０．４個／ｍｍ^２。

組織のフォン・コッサ染色から、粒子上に局在するミネラル化がわずかにみられた（図３０）。

１３．２．２．生体材料の生物活性に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験
苦痛の徴候も著明な病変の徴候もみられず、この製品が動物に有害作用を引き起こさないことが示された。実験を通して記録したラットの体重から、いずれの個体も、第２日に体重の増加はみられず、次いで、第２日～第２８日に規則的な体重増加がみられることがわかった。多くの場合、外科手術直後に体重増加がみられなくなることが観察され、これは被験製品のいかなる毒性も示すものではないと考えられる。第２日～第２８日に観察された規則的な体重増加は、粒子がラットの代謝に影響を及ぼさなかったことを裏付けるものである。ｉｎ ｖｉｖｏ実験終了時の剖検では、肉眼レベルで際立った器官の病変は一切みられなかった。

移植片部位のミネラル含有量
第２９日に実施したＸ線写真では、生体材料を移植した全部位にミネラル化を示唆する放射線不透過性の構造物の存在が観察された（図３１）。

筋肉内へのミネラル化組織形成の百分率を定量化するため、小動物イメージング用の高解像度Ｘ線マイクロＣＴシステム、ＳｋｙＳｃａｎ１０７６を用いて、「移植片部位」のミネラル化の解析を実施した。その結果を表１０に示す。

小動物イメージング用の高解像度Ｘ線マイクロＣＴシステム、ＳｋｙＳｃａｎ１０７６の結果

この解析から、生体材料を移植した各部位のミネラル化組織の含有量が顕著であることが示唆され、ＢＶ／ＴＶの平均値は０．１１８である。

移植片の血管新生
血管新生を明らかするため、線維性結合組織中の毛細血管の存在を検討した。

マッソンのトリクロム染色の後、移植片中および筋肉と移植片部位の間の接合部における血管の数／面積および血管密度を定量化した。

マッソンのトリクロム染色により、生体材料を用いた移植片には血管が新生されていることが明らかになり、その数値は４０．８±１８．５血管／ｍｍ^２であった。

実施例１４：高血糖／虚血異種間ラットモデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ効果に関する試験
１４．１．材料および方法
１４．１．１．動物
２５０～３００ｇの雌Ｗｉｓｔａｒラット５６個体にストレプトゾトシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。ストレプトゾトシン投与の７～１０日後、血糖レベルを尾静脈血から血糖検査ストリップにより測定した。グルコースレベルが１１．１ｍＭを超えたラットを高血糖であるとし、試験に含めた（ｎ－４２匹）。

Ｌｅｖｉｇｎｅら（Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１３）に記載されている通りに各ラットの左肢に虚血を誘発した。剃毛した鼠経領域を縦方向に切開することにより、外腸骨動脈および大腿動脈を共通の腸骨動脈－伏在動脈から剥離した。虚血状態を誘起するため、左肢は剥離した動脈を共通の腸骨動脈から切除し、右肢は動脈を温存して、肢を非虚血性であるとした。いずれの外科処置も手術用顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、イェーナ、ドイツ）下で実施し、麻酔の導入に５％イソフルランの吸入、維持に３％イソフルランの吸入を用いてラットに麻酔をかけた。

ラットを無作為に３つのグループ：
－偽治療群（ｎ＝１０、雌Ｗｉｓｔａｒラット）；
－Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ群（ｎ＝１０、雌Ｗｉｓｔａｒラット）、すなわち、粒子単独；
－生体材料群（ｎ＝１４、雌Ｗｉｓｔａｒラット）、すなわち、ＡＳＣと組織を形成するゼラチン粒子
に分けた。

１４．１．２．被験品
約０．５ｇのＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ粒子の試料を１４例調製し、ガンマ線を照射した。

移植には約２ｃｍ^２の生体材料（８週間の成熟期間にわたって、１．５ｃｍ^３のＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｓとともに実施例１０に記載した通りに培養したＡＳＣ）の試料を１４例調製した。

試料の成長因子含有量を評価するため、生体材料の試料１例をタンパク質の抽出および定量化用に調製した（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＳＤＦ－１α）。

生体材料の品質を評価するため、試料をヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色用にホルモールで固定した。ＨＥ染色後、組織中の細胞数をカウントすることによって、脱細胞化処理の効果を評価した。

１４．１．３．創傷治癒の肉眼的評価
移植後第０日、第１５日、第２４日および第３４日、下肢の写真を撮影した。

創傷閉鎖を定量化するため、２名の異なる操作者がＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて画像解析することにより、創傷面積を測定した。Ｄ０～Ｄ３４の各時点で測定した創傷面積に関して曲線下面積を算出し、１００％に固定した偽治療群と比較して表した。

１４．１．４．創傷治癒の顕微鏡的評価
下肢を切開して創傷組織を取り出し、この最後のものを横方向に向けて、組織の厚さ全体にわたる組織学スライドを得た。５μｍの組織学スライドを作製し、上皮（ｏｐ ‘ｔ Ｖｅｌｄ ＲＣ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１８）および真皮のスコアリング（Ｙａｔｅｓ Ｃ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００７）にＨＥで染色した：
創傷（中心部および辺縁部）の代表的な切片３枚の上皮治癒のスコア：
－０：上皮細胞の移動がみられない、
－１：部分的な移動、
－２：角化を伴わない／部分的角化を伴う全面的移動、
－３：全面的角化を伴う全面的移動、
－４：肥厚の進行。

創傷（中心部および辺縁部）の代表的な切片３枚の真皮治癒のスコア：
－０：治癒がみられない、
－１：炎症性浸潤、
－２：肉芽組織の存在－線維増殖および血管新生、
－３：肉芽組織に代わるコラーゲン沈着が５０％超、
－４：肥厚性線維化応答。

さらに、組織形態計測による血管面積の評価にマッソンのトリクロム染色を実施し、免疫応答および炎症性応答の評価にＣＤ３、ＣＤ６８免疫染色を実施した。さらに、ＫＵ８０染色を実施して移植後のヒト細胞の存在を確認した。

１４．２．結果
ストレプトゾトシン注射を実施したラット５６個体のうち、４２個体に高血糖症が認められ、試験に選択し、１４個体に低血糖症が認められ、外科合併症が認められたため、試験から除外した。

１４．２．１．創傷治癒の肉眼的評価
創傷の肉眼写真を図３２に示す。生体材料群には、外科手術後第１５日（Ｄ１５）に他のグループ（偽治療対照および粒子単独）よりも良好な創傷治癒が見られる。この差は、虚血性創傷、非虚血性創傷ともに目で確認できるものである。

非虚血性創傷の曲線下面積の結果を図３３に示す。Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ単独の移植では、創傷治癒が未治療個体と比較してそれぞれ２３％低かった。これとは対照的に、本発明の生体材料で治療したグループには良好な創傷治癒（２５％）がみられた。

非虚血性創傷のＤ０～Ｄ３４の創傷面積の変化を図３４に示す。本発明の生体材料で治療した創傷は、Ｄ２１～Ｄ３４の未治癒組織が他のグループと比較して少ないことに注目されたい。

１４．２．２．創傷治癒の顕微鏡的評価
各時点で非虚血性創傷に関して評価した上皮および真皮のスコアを図３５に示す。本発明の生体材料では、真皮も表皮も他のグループと比較して迅速であった。

Claims (16)

1. ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含む骨原性分化培地において脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）から分化させた骨原性細胞と粒子の形態である生体適合材料と細胞外基質とを含む多次元構造を有する無足場構造物用生体材料であって、
   前記生体適合材料の前記多次元構造が、前記骨原性細胞による前記細胞外基質の合成に起因し、
   前記無足場構造物用生体材料が、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）と、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）と、間質細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ－１α）と、を分泌する、無足場構造物用生体材料。
2. 前記無足場構造物用生体材料がＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり５ｎｇ分泌する、請求項１に記載の無足場構造物用生体材料。
3. 前記無足場構造物用生体材料がＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり１０ｎｇ分泌する、請求項１に記載の無足場構造物用生体材料。
4. 前記生体適合材料が脱灰骨基質（ＤＢＭ）の粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料。
5. 前記ＤＢＭ粒子が、５０～２５００μｍの範囲の平均径を有する、請求項４に記載の無足場構造物用生体材料。
6. 前記生体適合材料がリン酸カルシウムの粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料。
7. 前記リン酸カルシウムの粒子が、５０μｍ～１５００μｍの範囲の平均サイズを有する、請求項６に記載の無足場構造物用生体材料。
8. 前記リン酸カルシウムの粒子が、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）および／またはβリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）の粒子である、請求項６または７に記載の無足場構造物用生体材料。
9. 前記リン酸カルシウムの粒子が、１０／９０～９０／１０の範囲の比のＨＡ／β－ＴＣＰの粒子である、請求項６～８のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料。
10. 前記リン酸カルシウムの粒子が、２０／８０～８０／２０の範囲の比のＨＡ／β－ＴＣＰの粒子である、請求項６～８のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料。
11. 前記無足場構造物用生体材料がＶＥＧＦを少なくとも生体材料１ｇ当たり１０ｎｇ含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料。
12. 無足場構造物用生体材料が三次元のものである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料。
13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料を含む、医療装置。
14. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料を作製する方法であって、
    脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖の段階と、
    第４継代のＡＳＣを骨原性細胞に分化させる段階と、
    前記骨原性細胞に生体適合性粒子を加え、多次元誘導させる段階と
    を含む、方法。
15. 前記多次元誘導が３Ｄ誘導である、請求項１４に記載の方法。
16. 骨欠損および／または軟骨欠損の治療に使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の無足場構造物用生体材料を含む医薬組成物。
    

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