KR102671785B1 - 백신 벡터로서 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 - Google Patents

백신 벡터로서 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 Download PDF

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Abstract

본 출원은 그들의 게놈에서 그들의 개방 해독 프레임("ORF")의 재배열을 가진 피친드 바이러스에 관한 것이다. 구체적으로, 본 명세서는 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 바이러스 ORF를 보유하도록 피친드 바이러스 게놈 세그먼트가 조작되는, 변형된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 개시한다. 또한 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 개시된다. 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스는 백신 및/또는 질병의 치료 및/또는 면역요법에서의 사용을 위해 적합할 수 있다.

Description

백신 벡터로서 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스
본 출원은 2016년 5월 18일에 출원된 미국 가출원 62/338,400호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2017년 5월 16일에 생성되고 크기가 61,423바이트이며 명칭이 "Sequence_Listing_13194-020-228.TXT"인 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참고로 포함한다.
1. 서론
본 출원은 그들의 게놈에서 그들의 개방 해독 프레임("ORF")의 재배열을 가진 피친드 바이러스(Pichinde virus)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 변형 피친드 바이러스 게놈 세그먼트(segment)를 개시하며, 상기 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 ORF의 야생형 위치 외의 다른 위치에서 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된다. 본 발명은 또한 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진(tri-segmented) 피친드 바이러스 입자를 개시한다. 본 발명에서 개시된 피친드 바이러스는 백신 및/또는 질병의 치료 및/또는 면역요법에서의 사용을 위해 적합할 수 있다.
2. 배경기술
2.1 피친드 바이러스 일반 배경기술 및 게놈 조직
피친드 바이러스는 콜럼비아에서 오리조미스 알비구라리스(Oryzomys albigularis)(쌀 쥐)로부터 분리된 아레나바이러스이다(McLay et al, 2014, Journal of General Virology, 95: 1-15에서 리뷰됨). 피친드 바이러스는 비병원성이며 일반적으로 인간에서 질병을 야기하는 것으로 알려져 있지 않다. 혈청학적 증거는 지역 인구에서조차도 매우 낮은 혈청유병률(seroprevalence)을 제안한다(Trapido et al, 1971, Am J Trop Med Hyg, 20: 631-641). 아레나바이러스(Arenaviridae)과는 두 그룹으로 분류된다: 구세계(Old World)(OW) 아레나바이러스, 예를 들어, 랏사열 바이러스(Lassa fever virus)(LASV) 및 림프구성 맥락수막염 바이러스(Lymphocytic Choriomeningitis Virus)(LCMV), 및 신세계(New World)(NW) 아레나바이러스, 예를 들어, 피친드 바이러스 및 주닌 바이러스(Junin virus)(Buchmeier et al, 2001, Arenaviridae: The Viruses and Their Replication, Fields Virology Vol 2, 1635-1668). 아레나바이러스는 외피를 가진 RNA 바이러스이다. 그들의 게놈은 네가티브 센스(negative sense)의 단일쇄 RNA의 두 세그먼트로 이루어진다(도 1a)(McLay et al, 2014, Journal of General Virology, 95: 1-15). 각 세그먼트는 반대 배향으로 두 바이러스 유전자를 인코딩한다. 짧은 세그먼트(S 세그먼트)는 바이러스 당단백질(GP)과 핵단백질(NP)을 인코딩한다. 긴 세그먼트(L 세그먼트)는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RdRp; L 단백질) 및 매트릭스 단백질 Z(단백질 Z), RING 핑거 단백질(finger protein)을 발현한다. 각 세그먼트 상의 두 유전자는 비-코딩 유전자간 영역(IRG)에 의해 분리되고 5' 및 3' 비번역 영역(UTR)에 의해 인접된다. IGR은 안정한 헤어핀 구조를 형성하며 바이러스 mRNA 전사의 구조-의존성 종결에서 관련되는 것으로 나타났다(Pinschewer et al., 2005, J Virol 79(7): 4519-4526). UTR의 말단 뉴클레오티드는 고도의 상보성을 나타내어, 이차 구조의 형성을 야기하는 것으로 생각된다. 이들 팬손잡이(panhandle) 구조는 전사 및 복제를 위한 바이러스 프로모터로서 작용하는 것으로 알려져 있으며, 부위-지시된 돌연변이유발에 의한 그들의 분석은 심지어 사소한 서열 변화도 용인하지 않는, 서열- 및 구조-의존성을 밝혀내었다(Perez and de la Torre, 2003, Virol 77(2): 1184-1194).
2.2 역 유전적 시스템(Reverse Genetic System)
피친드 바이러스와 같은 네가티브-쇄 바이러스의 분리되고 정제된 RNA는 직접적으로 mRNA로서 작용할 수 없으며, 즉, 세포내로 도입될 경우 번역될 수 없다. 결과적으로, 바이러스 RNA를 이용한 세포의 형질감염은 감염성 바이러스 입자의 생산을 유도하지 않는다. 배양된 허용 세포에서 cDNA로부터 네가티브-쇄 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 생성하기 위하여, 바이러스 RNA 세그먼트(들)는 전사 및 복제를 위해 요구되는 최소 인자로 트랜스-보완되어야(trans-complemented) 한다. 몇년 전에 간행된 미니게놈 시스템의 도움으로, 전사, 복제 및 바이러스 입자의 형성에 관여하는 바이러스 시스-작용성 요소 및 트랜스작용성 인자가 마침내 분석될 수 있었다(Lee et al., 2000, J Virol 74(8): 3470-3477; Lee et al., 2002, J Virol 76(12): 6393-6397; Perez and de la Torre 2003, J Virol 77(2): 1184-1194; Pinschewer et al., 2003, J Virol 77(6): 3882-3887; Pinschewer et al., 2005, J Virol 79(7): 4519-4526.). 그러한 역 유전적 시스템은 피친드 바이러스 구조(rescue)를 성공적으로 입증하도록 개발되었다(예를 들어, Liang et al, 2009, Ann N Y Acad Sci, 1171: E65-E74; Lan et al, 2009, Journal of Virology, 83 (13): 6357-6362 참고).
2.3 관심 유전자를 발현하는 재조합 피친드
관심 외래 유전자를 발현하는 재조합 네가티브-쇄 RNA 바이러스의 생성이 오랫동안 추구되어 왔다. 다른 바이러스를 위하여 상이한 전략이 공개되었다(Garcia-Sastre et al., 1994, J Virol 68(10): 6254-6261; Percy et al., 1994, J Virol 68(7): 4486-4492; Flick and Hobom, 1999, Virology 262(1): 93-103; Machado et al., 2003, Virology 313(1): 235-249). 생 피친드 바이러스계 벡터가 공개되었다(Dhanwani et al., 2015, Journal of Virology 90:2551-2560; 국제 특허 출원 공개 WO2016/048949호). 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스가 공개되었다(Dhanwani et al., 2015, Journal of Virology 90:2551-2560; 국제 특허 출원 공개 WO 2016/048949호). Dhanwani 2015에 의해 공개된 3개의 세그먼트를 가진 바이러스에서는, NP와 GP 둘 모두가 S 세그먼트내의 그들의 각각의 천연 위치에서 유지되었으며 따라서 인접(flanking) UTR 내의 그들의 천연 프로모터하에서 발현되었다.
2.4 복제-결핍 아레나바이러스
감염성 아레나바이러스 입자는 감염된 세포에서 그의 유전 물질을 증폭시키고 발현하는 능력을 가진 게놈을 함유하도록 조작될 수 있으나 정상의 유전적으로 조작되지 않은 세포에서는 추가의 후손을 생산할 수 없는 것으로 나타났다(즉, 감염성의, 복제-결핍 아레나바이러스 입자)(국제 공개 WO2009/083210호 A1 및 국제 공개 WO2014/140301호 A1).
3. 발명의 개요
본 출원은 그들의 게놈에서 그들의 ORF의 재배열을 가진 피친드 바이러스에 관한 것이다. 구체적으로, 본 출원은 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트에 관한 것이다. 본 출원은 또한 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로 재조합되지 않는, 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 본 출원은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 유전적 안정성을 개선하고 지속적인 트랜스유전자 발현을 보장하도록 조작될 수 있음을 보여준다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 바이러스 벡터는 감염성이며, 즉, 숙주 세포내로 들어가거나 숙주 세포내로 그의 유전 물질을 주입할 수 있다. 일부 보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 바이러스 벡터는 감염성이며, 즉, 숙주 세포내로 들어가거나 숙주 세포내로 그의 유전 물질을 주입하고 이어서 숙주 세포내에서 그의 유전 정보의 증폭 및 발현이 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 감염된 세포에서 그의 유전 정보를 증폭하고 발현하는 능력을 가진 게놈을 함유하도록 조작되지만 정상적인 유전자 조작되지 않은 세포에서는 추가의 감염성 후손 입자를 생산할 수 없는 감염성의 복제-결핍 피친드 바이러스 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 감염성 피친드 바이러스 바이러스 벡터는 복제-가능하고 정상의 유전자 조작되지 않은 세포에서 추가의 감염성 후손 입자를 생산할 수 있다. 일부 보다 구체적인 실시양태에서, 그러한 복제-가능 바이러스 벡터는 복제-가능 바이러스 벡터가 유래되는 야생형 바이러스에 비하여 약독화된다.
3.1 비-천연 개방 해독 프레임
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 게놈 세그먼트는 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(ii) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(iii) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(iv) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(v) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(vi) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(vii) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(viii) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(ix) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(x) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(xi) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트; 및
(xii) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 3' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 피친드 바이러스 L 세그먼트의 3' UTR이다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 5' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 피친드 바이러스 L 세그먼트의 5' UTR이다.
또한, 본 발명은 본 발명에서 제공되는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 분리된 cDNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 포함하는 DNA 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA, 또는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 피친드 바이러스 입자가 S 세그먼트 및 L 세그먼트를 포함하도록 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 및 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 포함하는 피친드 바이러스 입자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 감염성이고 복제 가능하다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 약독화된다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 감염성이지만 비-보완성 세포(non-complementing cell)에서 추가의 감염성 후손을 생산할 수 없다.
일부 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개의 ORF 중 적어도 하나가 제거되거나 기능적으로 불활성화된다.
일부 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질 및 L 단백질을 인코딩하는 4개의 ORF 중 적어도 하나는 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질 및 L 단백질을 인코딩하는 4개의 ORF 중 단지 하나만이 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 보다 구체적인 실시양태에서, GP를 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 실시양태에서, NP를 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 일부 실시양태에서, Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 실시양태에서, L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 리포터 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 인코딩한다. 다른 실시양태에서, 항원을 인코딩하는 이종성 ORF는 인간 면역결핍 바이러스 항원, C형 간염 바이러스 항원, B형 간염 표면 항원, 수두대상포진바이러스 항원, 거대세포바이러스 항원, 결핵균 항원, 종양 연관 항원, 및 종양 특이적 항원(예를 들어, 종양 신생항원 및 종양 신생에피토프)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자의 성장 또는 감염성은 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF에 의해 영향받지 않는다.
본 발명은 또한 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 전사하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법은 하기를 포함한다:
(i) 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 숙주 세포내로 형질감염시키고;
(ii) 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 숙주 세포내로 형질감염시키고;
(iii) 바이러스 형성을 위해 적합한 조건하에서 숙주 세포를 유지하고;
(iv) 피친드 바이러스 입자를 수확하기.
일부 실시양태에서, L 세그먼트 및 S 세그먼트의 전사는 양방향성 프로모터를 이용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 피친드 바이러스 폴리머라제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 숙주 세포내로 형질감염시키는 것을 추가로 포함한다. 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, 폴리머라제는 L 단백질이다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 NP를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 숙주 세포내로 형질감염시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, L 세그먼트, 및 S 세그먼트의 전사는 각각 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 프로모터의 제어하에 있다:
(i) RNA 폴리머라제 I 프로모터;
(ii) RNA 폴리머라제 II 프로모터; 및
(iii) T7 프로모터.
다른 실시양태에서, 본 발명은 GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개 ORF 중 적어도 하나가 제거되거나 기능적으로 불활성화되거나; 또는 GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 ORF가 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환되거나; 또는 GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개 ORF 중 하나만이 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된 피친드 바이러스 입자를 포함하는 백신을 제공한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 백신은 추가로 약학적 허용 담체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개 ORF 중 적어도 하나가 제거되거나 기능적으로 불활성화되거나; 또는 GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 ORF가 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환되거나; 또는 GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개 ORF 중 하나만이 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된 피친드 바이러스 입자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 약학적 허용 담체는 추가로 약학적 허용 담체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 피친드 바이러스 입자는 매우 악성이며 고-계대배양된 균주 문치크(Munchique) CoAn4763 분리물 P18, 또는 저 계대배양된 P2 균주로부터 유래되거나, 또는 트라피도(Trapido) 및 동료들에 의해 개시된(Trapido et al, 1971, Am J Trop Med Hyg, 20: 631-641) 여러 분리물 중 임의의 것으로부터 유래된다.
3.2 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스
일 양태에서, 본 발명은 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은, I 형 인터페론 수용체, II 형 인터페론 수용체 및 재조합 활성화 유전자 1(RAG1)이 결핍되고 104 PFU의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로 감염된 마우스에서 70일의 지속 감염 후에 복제-가능하고 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 생성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 2개의 분리된 세그먼트 대신 단지 하나상에 두 피친드 바이러스 ORF를 결합하는, 두 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 바이러스 프로모터 활성을 폐지한다.
다른 양태에서, 본 발명은 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은, I 형 인터페론 수용체, II 형 인터페론 수용체 및 재조합 활성화 유전자 1(RAG1)이 결핍되고 104 PFU의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로 감염된 마우스에서 70일의 지속 감염 후에 복제-가능하고 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 생성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 2개의 분리된 세그먼트 대신 단지 하나상에 두 피친드 바이러스 ORF를 결합하는, 두 L 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 바이러스 프로모터 활성을 폐지한다.
일부 실시양태에서, 두 S 세그먼트 중 하나는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(ii) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(iii) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(iv) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트;
(v) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트; 및
(vi) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 S 세그먼트.
일부 실시양태에서, 두 L 세그먼트 중 하나는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(ii) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(iii) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(iv) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(v) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트; 및
(vi) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 3' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 피친드 바이러스 L 세그먼트의 3' UTR이다. 다른 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 5' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 피친드 바이러스 L 세그먼트의 5' UTR이다.
일부 실시양태에서, 2개의 S 세그먼트는 (i) 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF 하나 또는 둘; 또는 (ii) 하나 또는 둘의 복사된(duplicated) 피친드 바이러스 ORF; 또는 (iii) 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF 하나 및 하나의 복사된 피친드 바이러스 ORF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트는 (i) 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF 하나 또는 둘; 또는 (ii) 하나 또는 둘의 복사된 피친드 바이러스 ORF; 또는 (iii) 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF 하나 및 하나의 복사된 피친드 바이러스 ORF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 인코딩한다. 다른 실시양태에서, 항원을 인코딩하는 이종성 ORF는 인간 면역결핍 바이러스 항원, C형 간염 바이러스 항원, B형 간염 표면 항원, 수두대상포진바이러스 항원, 거대세포바이러스 항원, 결핵균 항원, 종양 연관 항원, 및 종양 특이적 항원(예를 들어, 종양 신생항원 및 종양 신생에피토프)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 이종성 ORF는 형광 단백질을 인코딩한다. 다른 실시양태에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)이다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 모든 4개의 피친드 바이러스 ORF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성이고 복제 가능하다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 4개의 피친드 바이러스 ORF 중 하나 이상이 결핍된다. 다른 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성이지만 비-보완성 세포에서 추가의 감염성 후손을 생산할 수 없다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 4개의 피친드 바이러스 ORF 중 하나가 결핍되며, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성이지만 비-보완성 세포에서 추가의 감염성 후손을 생산할 수 없다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 GP ORF가 결핍된다.
추가 양태에서, 본 발명은 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 S 세그먼트는 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하의 위치에서 GP를 인코딩하는 ORF 및 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하의 위치에서 제1 관심 유전자를 인코딩하는 ORF를 보유하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제2 S 세그먼트는 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하의 위치에서 NP를 인코딩하는 ORF 및 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하의 위치에서 제2 관심 유전자를 인코딩하는 ORF를 보유하도록 조작된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 S 세그먼트는 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하의 위치에서 GP를 인코딩하는 ORF 및 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하의 위치에서 제1 관심 유전자를 인코딩하는 ORF를 보유하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제2 S 세그먼트는 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하의 위치에서 NP를 인코딩하는 ORF 및 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하의 위치에서 제2 관심 유전자를 인코딩하는 ORF를 보유하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 인코딩한다. 다른 실시양태에서, 관심 유전자는 인간 면역결핍 바이러스 항원, C형 간염 바이러스 항원, B형 간염 표면 항원, 수두대상포진바이러스 항원, 거대세포바이러스 항원, 결핵균 항원, 종양 연관 항원, 및 종양 특이적 항원(예를 들어, 종양 신생항원 및 종양 신생에피토프)으로부터 선택된 항원을 인코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 관심 유전자는 형광 단백질을 인코딩한다. 구체적 실시양태에서, 형광 단백질은 GFP 또는 RFP이다.
본 발명은 또한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈의 분리된 cDNA를 제공한다. 본 발명은 또한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈의 cDNA를 포함하는 DNA 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스의 cDNA를 개별적으로 또는 그 전체를 포함하는 하나 이상의 DNA 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA, 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈의 cDNA를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 약독화된다.
본 발명은 또한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법은 하기를 포함한다:
(i) 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트의 cDNA 하나 이상을 숙주 세포내로 형질감염시키고;
(ii) 바이러스 형성을 위해 적합한 조건하에서 숙주 세포를 유지하고;
(iii) 피친드 바이러스 입자를 수확하기.
본 발명은 또한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법은 하기를 포함한다:
(i) 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트의 cDNA 하나 이상을 숙주 세포내로 형질감염시키고;
(ii) 바이러스 형성을 위해 적합한 조건하에서 숙주 세포를 유지하고;
(iii) 피친드 바이러스 입자를 수확하기.
일부 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트의 전사는 양방향성 프로모터를 이용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트의 전사는 양방향성 프로모터를 이용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 피친드 바이러스 폴리머라제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 숙주 세포내로 형질감염시키는 것을 추가로 포함한다. 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, 폴리머라제는 L 단백질이다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 NP 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 숙주 세포내로 형질감염시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트의 전사는 각각 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어하에 있다:
(i) RNA 폴리머라제 I 프로모터;
(ii) RNA 폴리머라제 II 프로모터; 및
(iii) T7 프로모터.
일부 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트의 전사는 각각 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어하에 있다:
(i) RNA 폴리머라제 I 프로모터;
(ii) RNA 폴리머라제 II 프로모터; 및
(iii) T7 프로모터.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 2개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자와 동일한 향성(tropism)을 가진다. 다른 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 복제 결핍성이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 약학적 허용 담체를 포함하는 백신을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 피친드 바이러스 입자는 매우 악성이며 고-계대배양된 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18, 또는 저 계대배양된 P2 균주로부터 유래되거나, 또는 트라피도 및 동료들에 의해 개시된(Trapido et al, 1971, Am J Trop Med Hyg, 20: 631-641) 여러 분리물 중 임의의 것으로부터 유래된다.
1.3 약속 및 약어
도 1a-1d: 2- 및 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스의 게놈 조직의 도식적 표시. 야생형 피친드 바이러스의 2개의 세그먼트를 가진 게놈은 GP와 NP를 인코딩하는 하나의 S 세그먼트 및 Z 단백질과 L 단백질을 인코딩하는 하나의 L 세그먼트로 이루어진다. 두 세그먼트는 모두 각각 5' 및 3' UTR에 의해 인접된다. (도 1a) 각 cDNA에서 BsmBI 및 BbsI 부위를 폐지하기 위하여 도입된 침묵 돌연변이에 의해 변형된 그의 천연 게놈 세그먼트 S(서열 번호 16) 및 L(서열 번호 2)을 가진 cDNA-유래된 야생형 피친드 바이러스인 rPICwt 피친드 바이러스 게놈의 도식적 설명. (도 1b-1d) 재조합 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스(r3PIC)의 게놈은 각각 하나의 S 세그먼트내로 관심 유전자(여기서는 GFP/sP1AGM 융합 단백질)를 삽입하기 위한 하나의 위치를 가진 2개의 S 세그먼트 및 하나의 L 세그먼트로 이루어진다. (도 1b) 인위적 조직을 가진 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 벡터 게놈의 도식적 설명. 복사된 S 세그먼트 중 하나에서, 당단백질(GP) ORF는 천연 S 세그먼트에서의 핵단백질(NP) ORF 대신에, 즉, 3'UTR과 IGR 사이에 위치된다. (도 1c) r3PIC-GFPart는 인위적으로 3' UTR에 병치되고 그 제어하에서 발현되는 GP ORF를 제외하고는, 그들의 천연 위치의 모든 바이러스 유전자로 이루어진다(S-GP/GFPart; 서열 번호 13). (도 1d) 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스-계 sP1AGM-발현 r3PIC-sP1AGMart 벡터 게놈의 도식적 설명.
도 2: 3개의 세그먼트를 가진 r3PIC-GFPart는 그의 2 세그먼트를 가진 야생형 모 바이러스에 비교할 때 약독화되었다. 0.01의 감염 다중도(moi)로 감염된 BHK-21 세포에서 표시된 바이러스의 성장 동력학(야생형 피친드 바이러스: 흑색 사각형; r3PIC-GFPart: 흑색 원). 감염 후 표시된 시점에 상등액을 취하여 바이러스 역가를 병소 형성 분석에 의해 결정하였다.
도 3: 도 2 및 4에 개시된 실험을 위해 사용된 플라스미드의 발현 카세트의 도식적 설명.
도 4: r3PIC-GFPart를 이용하여 세포에서 cDNA로부터 감염성 GFP-발현 바이러스의 재구성. 하기와 같은 플라스미드 조합으로 BHK-21 세포의 형질감염 후 48 또는 168 시간에 포착된 GFP 발현의 형광 이미지:
S 세그먼트 미니게놈: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-miniS-GFP;
L 세그먼트 미니게놈: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-L-GFP-Bsm;
r3PIC-GFPart: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-L, pol-I-PIC-NP-GFP, pol-I-PIC-GP-GFP;
rPICwt: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-L, pol-I-PIC-S
도 5a-5b: 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스계 바이러스 벡터는 매우 면역원성이다. BALB/c 마우스를 10e5 FFU의 r3PIC-sP1AGMart로 정맥내로 감염시켰다. 대조군 마우스는 면역시키지 않고 두었다. 8일 후, 말초 혈액에서 P1A-특이적 CD8+ T 세포 빈도를 MHC 클래스 I 사량체 염색에 의해 결정하였다. 예시적인 FACS 플롯(도 5a) 및 말초 혈액에서 CD8+ T 세포 내의 사량체-결합 세포의 빈도(도 5b)가 나타난다. b에서의 기호는 개별 마우스를 나타낸다.
도 6: 인위적으로 복사된 S 세그먼트- S-GP/GFPnat(서열 번호 15) 및 S-NP/GFP(PIC-NP-GFP로도 알려짐; 서열 번호 11)의 맥락에서 그의 당단백질(GP) 및 핵단백질(NP) 유전자를 각각 5' 및 3' UTR 프로모터의 제어하에서, 즉, 그들의 각 "천연" 위치에서, 발현하도록 설계된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 벡터 게놈의 도식적 설명. 게놈은 S 세그먼트의 각각의 하나내로 관심 유전자(여기서는 GFP 단백질)를 삽입하기 위한 하나의 위치를 가진 2개의 S 세그먼트 및 하나의 L 세그먼트로 이루어진다.
도 7: 3개의 세그먼트를 가진 r3PIC-GFPnat 및 r3PIC-GFPart의 조기 계대물은 그들의 2 세그먼트를 가진 야생형 모 바이러스에 비하여 약독화되었다. 0.01의 감염 다중도(moi)로 감염된, 배양중인 BHK-21 세포에서 표시된 바이러스의 성장 동력학. 감염 후 48시간에 상등액을 취하여 병소 형성 분석에 의해 바이러스 역가를 결정하였다. 기호는 개별 병행 세포 배양 웰로부터의 역가를 보여준다; 오차 막대는 평균 +/-SD를 나타낸다.
도 8: 안정하게 약독화된 r3PIC-GFPart와 달리, r3PIC-GFPnat는 마우스의 지속적인 감염동안 rPICwt의 범위내의 역가에 도달하였다. AGR 마우스(RAG1 뿐만 아니라 I 형 및 II 형 인터페론 수용체에서의 삼중-결핍 마우스)를 도면에 나타난 대로 10e5 FFU의 바이러스로 정맥내로 감염시켰다(야생형 피친드 바이러스 - rPICwt: 회색 삼각형; r3PIC-GFPart: 흑색 원; r3PIC-GFPnat: 백색 사각형). 혈액을 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제56일, 제77일, 제98일, 제120일 및 제147일에 수집하고 바이러스 감염성은 피친드 바이러스 핵단백질을 검출하는 병소 형성 분석(NP FFU)에서 결정하였다.
도 9: 안정하게 약독화된 r3PIC-GFPart와 달리, r3PIC-GFPnat는 마우스의 지속 감염동안 rPICwt의 범위내의 역가에 도달한다. AGR 마우스(RAG1 뿐만 아니라 I 형 및 II 형 인터페론 수용체에서의 삼중-결핍 마우스)를 도면에 나타난 대로 10e5 FFU의 바이러스로 정맥내로 감염시켰다(야생형 피친드 바이러스 - rPICwt: 회색 삼각형; r3PIC-GFPart: 흑색 원; r3PIC-GFPnat: 백색 사각형). 혈액을 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제56일, 제77일, 제98일, 제120일 및 제147일에 수집하고 바이러스 감염성은 r3PIC-GFPnat 및 r3PIC-GFPart(GFP FFU)에서 바이러스 GFP 트랜스유전자를 검출하는 병소 형성 분석에서 결정하였다.
도 10: 인위적인 게놈을 가진 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스계 바이러스 벡터는 매우 면역원성이다. AGR 마우스(RAG1 뿐만 아니라 I 형 및 II 형 인터페론 수용체에서의 삼중-결핍 마우스)를 도면에 나타난 대로 10e5 FFU의 바이러스로 정맥내로 감염시켰다(r3PIC-GFPart: 흑색 원; r3PIC-GFPnat: 백색 사각형). 혈액을 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제56일, 제77일, 제98일, 제120일 및 제147일에 수집하고 바이러스 감염성은 도 9 및 도 10에 나타난 대로 병소 형성 분석에 의해 결정하였다. 수득한 값을 이용하여 각 동물 및 시점을 위한 NP : GFP FFU 비를 계산하였다.
도 11: r3PIC-GFPart 감염 후 147일에 수집된 마우스 혈청 내의 바이러스는 세포 배양에서 직접 계대될 경우 약독화된 성장을 나타낸 반면, r3PIC-GFPnat-감염된 마우스로부터 성장한 바이러스는 rPICwt에 견줄만한 역가에 도달하였다. BHK-21 세포에서의 감염 후 제147일에 수집된 혈청을 계대시키고 바이러스 감염성을 48시간 후에 NP FFU 분석에 의해 결정하였다. 기호는 개별 마우스 혈청-유래 바이러스의 역가를 보여주며; 오차 막대는 평균 +/-SD를 나타낸다.
도 12: r3PIC-GFPart 감염 후 147일에 수집된 마우스 혈청으로부터 분리되고 증식된 바이러스는 세포 배양에서 직접적으로 계대될 때 약독화된 성장을 나타낸 반면, r3PIC-GFPnat-감염된 마우스로부터 분리되고 증식된 바이러스는 rPICwt에 견줄만한 역가에 도달하였다. BHK-21 세포를 감염 후 제147일에 수집된 혈청으로부터 수득되고 이전에 48시간 동안 계대된 바이러스로 표준화된 감염 다중도 = 0.01로 감염시켰다. 48시간 후에 바이러스 역가를 결정하였다. 기호는 개별 마우스 혈청-유래된 바이러스로부터의 역가를 보여주며; 오차 막대는 평균+/-SD를 나타낸다.
도 13: r3PIC-GFPart는 마우스에서 147일 기간의 지속적 감염동안 그의 2개의 S 세그먼트를 재조합하지 못한 반면, NP와 GP 서열 둘 모두를 함유한 S 세그먼트 RNA 종은 147일동안 r3PIC-GFPnat로 지속적으로 감염된 마우스의 혈청에서 검출되었다. 피친드 바이러스 NP 및 GP에 각각 결합하도록 설계되고, 그들이 rPICwt 게놈 주형에서 357 염기쌍의 PCR 앰플리콘을 생성할 것으로 예측되도록 피친드 바이러스 S 세그먼트의 유전자간 영역(IGR)에 걸친 프라이머를 이용하여, 바이러스 감염 후 제147일에 수집된 혈청 샘플에서 RT-PCR을 수행하였다. 각 레인은 도 8-10에서 나타난 실험에서 하나의 개별 마우스로부터의 RT-PCR 산물을 나타낸다.
4.1 비-천연 위치에서 개방 해독 프레임을 가진 피친드 바이러스
본 발명은 그들의 ORF가 재배열된 피친드 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 그러한 피친드 바이러스는 복제 가능하고 감염성이다. 그러한 피친드 바이러스의 게놈 서열이 본 발명에서 제공된다. 일 양태에서, 본 발명은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 제공하며, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 각 유전자가 ORF의 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18(7. 서열 목록에서 서열 번호 1 및 2 참고)과 같은 야생형으로부터 분리된 바이러스에서 발견되는 위치(여기서는 "야생형 위치"로 불림) 외의 다른 위치(즉, 비-천연 위치)에서 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된다.
야생형 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 및 ORF는 당업계에서 알려져 있다. 구체적으로, 피친드 바이러스 게놈은 S 세그먼트와 L 세그먼트로 이루어진다. S 세그먼트는 GP와 NP를 인코딩하는 ORF를 보유한다. L 세그먼트는 L 단백질 및 Z 단백질을 인코딩한다. 두 세그먼트 모두가 각각의 5' 및 3' UTR에 의해 인접된다(도 1a 참고). 예시적인 야생형 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 서열 번호 1과 2에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 야생형 위치 외의 다른 위치에서 둘 이상의 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 2개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 3개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 4개의 피친드 바이러스 ORF를 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 보유하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는
(i) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(ii) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(iii) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(iv) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(v) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(vi) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(vii) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 L 세그먼트;
(viii) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 L 세그먼트;
(ix) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 L 세그먼트;
(x) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 L 세그먼트;
(xi) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 L 세그먼트; 및
(xii) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 L 세그먼트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 비-천연 위치에 있는 ORF는 피친드 바이러스 3' UTR 또는 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있을 수 있다. 보다 구체적 실시양태에서, 피친드 바이러스 3' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트의 3' UTR이다. 다른 구체적 실시양태에서, 피친드 바이러스 3' UTR은 피친드 바이러스 L 세그먼트의 3' UTR이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 피친드 바이러스 5' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트의 5' UTR이다. 다른 구체적 실시양태에서, 5' UTR은 L 세그먼트의 5' UTR이다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 비-천연 위치에 있는 ORF는 아레나바이러스 보존 말단 서열 요소(5'- 및 3'-말단 19-21-nt 영역)의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Perez & de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194 참고).
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 비-천연 위치에 있는 ORF는 5' UTR의 프로모터 요소의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4 참고). 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 비-천연 위치에 있는 ORF는 3' UTR의 프로모터 요소의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4 참고). 더욱 구체적인 실시양태에서, 5' UTR의 프로모터 요소는 S 세그먼트 또는 L 세그먼트의 5' UTR 프로모터 요소이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 3' UTR의 프로모터 요소는 S 세그먼트 또는 L 세그먼트의 3' UTR 프로모터 요소이다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 비-천연 위치에 있는 ORF는 절단된(truncated) 피친드 바이러스 3' UTR 또는 절단된 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Perez & de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4 참고). 더욱 구체적인 실시양태에서, 절단된 3' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트의 3' UTR이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 절단된 5' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트의 5' UTR이다.
본 발명은 또한 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 제1 게놈 세그먼트 및 피친드 바이러스 입자가 S 세그먼트 및 L 세그먼트를 포함하도록 하는 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 포함하는 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 구체적 실시양태에서, ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치의 ORF는 피친드 바이러스 ORF 중 하나이다.
일부 구체적 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 모든 4개의 피친드 바이러스 ORF의 전체 수(full complement)를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되었다. 다른 구체적 실시양태에서, 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 야생형 게놈 세그먼트일 수 있다(즉, 야생형 위치에서 세그먼트 상의 ORF를 포함한다).
일부 실시양태에서, 제1 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 L 세그먼트이고 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 S 세그먼트이다. 다른 실시양태에서, 제1 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 S 세그먼트이고 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 L 세그먼트이다.
ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 가진 게놈 세그먼트 및 제2 게놈 세그먼트를 포함하는 피친드 바이러스 입자의 비제한적인 예가 표 1에 예시된다.
[표 1]
피친드 바이러스 입자
*위치 1은 피친드 바이러스 S 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 2는 피친드 바이러스 S 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 3은 피친드 바이러스 L 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 4는 피친드 바이러스 L 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있다.
본 발명은 또한 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 제공한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 개시된 피친드 바이러스 게놈의 cDNA 또는 cDNA의 세트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 핵산은 본 명세서에 개시된 핵산에 적어도 소정의 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 핵산은 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 서열 또는 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성의 핵산 서열을 갖거나, 또는 동일하다. 하이브리드화 조건은 본 명세서에 개시된 것과 같은, 당업자에게 잘 알려진 매우 엄격한, 중간 정도로 엄격한 또는 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생성하는데 사용될 수 있는 핵산은 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 서열 또는 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산과 소정의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생성하는데 사용되는 핵산은 본 명세서에 개시된 핵산 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖거나, 또는 동일할 수 있다.
서열 동일성(상동성 또는 유사성으로도 알려짐)은 두 핵산 분자 간 또는 두 폴리펩티드 간의 서열 유사성을 말한다. 동일성은 비교의 목적을 위하여 배열될 수 있는, 각 서열내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열내의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 차지되면, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 서열간의 동일성 정도는 서열에 의해 공유된 매칭되거나 상동성인 위치의 수의 함수이다. 그들의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 두 서열의 배열은 예를 들어, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에 개시된 것과 같은, 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램을 이용하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 배열을 위하여 디폴트 파라미터가 이용된다. 사용될 수 있는 당업계에 잘 알려진 하나의 배열 프로그램은 디폴트 파라미터로 설정된 BLAST이다. 구체적으로, 프로그램은 하기의 디폴트 파라미터를 이용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 쇄 = 둘 모두; 컷오프(cutoff) = 60; 기대(expect) = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술(Descriptions) = 50 서열; 높은 점수에 의해 분류(sort by = HIGH SCORE); 데이터베이스 = 비-복사성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss Protein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세사항은 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)에서 찾을 수 있다.
엄격한 하이브리드화는 하이드리드화된 폴리뉴클레오티드가 안정한 조건을 말한다. 당업자에게 알려진 대로, 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드의 안정성은 하이브리드의 용융 온도(Tm)에서 반영된다. 일반적으로, 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드의 안정성은 염 농도, 예를 들어, 소듐 이온 농도 및 온도의 함수이다. 하이브리드화 반응은 더 낮은 엄격도의 조건하에서 수행된 후, 다양한 그러나 더 높은 엄격도의 세척이 이어질 수 있다. 하이브리드화 엄격도에 대한 언급은 그러한 세척 조건에 관련된다. 매우 엄격한 하이브리드화는 65℃에서 0.018M NaCl에서 안정한 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 핵산 서열만의 하이브리드화를 허용하는 조건을 포함하며, 예를 들어, 만일 하이브리드가 65℃에서 0.018M NaCl에서 안정하지 않다면, 그것은 본 명세서에서 고려되는 대로, 높은 엄격도 조건하에서 안정하지 않을 것이다. 높은 엄격도 조건은 예를 들어, 42℃에서 50% 포름아미드, 5X 덴하트 용액(Denhart's solution), 5X SSPE, 0.2% SDS에서의 하이브리드화, 및 이어서 65℃에서 0.1X SSPE, 및 0.1% SDS에서의 세척에 의해 제공될 수 있다. 매우 엄격한 하이브리드화 조건 외의 다른 하이브리드화 조건은 또한 본 명세서에 개시된 핵산 서열을 설명하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 중간정도로 엄격한 하이브리드화라는 어구는 42℃에서 50% 포름아미드, 5X 덴하트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS에서의 하이브리드화, 및 이어서 42℃에서 0.2X SSPE, 0.2% SDS에서의 세척과 동등한 조건을 말한다. 낮은 엄격도 하이브리드화라는 어구는 22℃에서 10% 포름아미드, 5X 덴하트 용액, 6X SSPE, 0.2% SDS에서의 하이브리드화, 및 이어서 37℃에서 1X SSPE, 0.2% SDS에서의 세척과 동등한 조건을 말한다. 덴하트 용액은 1% 피콜(Ficoll), 1% 폴리비닐피롤리돈 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한다. 20X SSPE(소듐 클로라이드, 소듐 포스페이트, 에틸렌 디아미드 테트라아세트산(EDTA))는 3M 소듐 클로라이드, 0.2M 소듐 포스페이트, 및 0.025 M(EDTA)를 함유한다. 다른 적합한 낮은, 중간정도의 그리고 높은 엄격도 하이브리드화 버퍼 및 조건이 당업자에게 잘 알려져 있으며 예를 들어, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에서 개시된다.
일부 실시양태에서, ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA는 DNA 발현 벡터의 일부이거나 그 안으로 통합된다. 구체적 실시양태에서, ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA는 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 생산을 촉진하는 DNA 발현 벡터의 일부이거나 그 안으로 통합된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 cDNA는 플라스미드내로 통합될 수 있다. cDNA 또는 핵산 및 발현 시스템의 보다 상세한 설명은 섹션 4.5.1에서 제공된다. cDNA의 생산을 위한 기술은 분자생물학 및 DNA 조작과 생산의 일상적이고 통상적인 기술이다. 당업자에게 알려진 임의의 클로닝 기술이 이용될 수 있다. 그러한 기술은 잘 알려져 있으며 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)과 같은 실험 매뉴얼에서 당업자가 이용가능하다.
일부 실시양태에서, ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA는 숙주 세포내로 도입된다(예를 들어, 형질감염된다). 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA(즉, 게놈 세그먼트의 cDNA)를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 cDNA는 DNA 발현 벡터의 일부이거나 그안으로 통합될 수 있으며 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은 벡터내로 통합된 본 명세서에 개시된 cDNA를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 숙주 세포내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생산하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 전사시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 폴리머라제 단백질은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 전사동안 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 전사는 양방향성 프로모터를 이용하여 수행된다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 전사는 양방향성 발현 카세트를 이용하여 수행된다(예를 들어, Ortiz- et al., 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188 참고). 더욱 구체적인 실시양태에서 양방향성 발현 카세트는 삽입된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 두 말단으로 각각 반대 측으로부터 해독하는 폴리머라제 I 및 폴리머라제 II 프로모터 둘 모두를 포함한다. 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, pol-I 및 pol-II 프로모터를 가진 양방향성 발현 카세트는 반대 측으로부터 L 세그먼트 및 S 세그먼트로 해독한다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA의 전사는 프로모터를 포함한다. 프로모터의 구체적 예는 RNA 폴리머라제 I 프로모터, RNA 폴리머라제 II 프로모터, RNA 폴리머라제 III 프로모터, T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 T3 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생산하는 방법은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 숙주 세포내로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생산하는 방법은 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 생산을 위한 모든 다른 성분을 발현하는 숙주 세포내로 도입하고; 숙주 세포의 상등액으로부터 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 세포주, 배양물 및 본 발명에서 제공되는 핵산, 벡터 및 조성물로 감염된 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 핵산, 벡터 시스템 및 세포주의 보다 상세한 설명은 섹션 4.5에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자는 감염성이며 복제 가능한 피친드 바이러스 입자를 야기한다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자는 약독화된다. 구체적 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 바이러스가 적어도 부분적으로, 생체내에서 확산하고 복제할 수 있으나 비병원성인 무증상 수준의 감염을 야기하는 낮은 바이러스 로드(load)를 생성할 수 있도록 약독화된다. 그러한 약독화된 바이러스는 면역원성 조성물로서 사용될 수 있다. 본 발명은 섹션 4.7에 개시된 비-천연 위치에서 ORF를 가진 피친드 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
4.1.1 비-천연 위치에 개방 해독 프레임을 가진 복제-결핍성 피친드 바이러스 입자
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) ORF가 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에 있으며; (ii) GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되었거나 기능적으로 불활성화되어 생성되는 바이러스가 추가의 감염성 후손 바이러스 입자를 생산할 수 없는 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 하나 이상의 ORF가 결실되었거나 기능적으로 불활성화된 유전적 변형 게놈을 포함하는 피친드 바이러스 입자는 보완성 세포(즉, 결실되었거나 기능적으로 불활성화된 피친드 바이러스 ORF를 발현하는 세포)에서 생산될 수 있다. 생성되는 피친드 바이러스 입자의 유전 물질은 숙주 세포의 감염시에 숙주 세포 내로 전달될 수 있으며, 유전 물질이 발현되고 증폭될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 유전적 변형 피친드 바이러스 입자의 게놈은 피친드 바이러스 입자 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF를 인코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개 ORF 중 적어도 하나가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질 및 L 단백질을 인코딩하는 적어도 1개 ORF, 적어도 2개 ORF, 적어도 3개 ORF, 또는 적어도 4개 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환될 수 있다. 구체적 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개 ORF 중 단지 하나만이 제거되고 피친드 바이러스 입자 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 GP를 인코딩하는 ORF가 제거된다. 다른 구체적 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 NP를 인코딩하는 ORF가 제거된다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 피친드 바이러스 입자는 (i) 비-천연 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되고; (ii) GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고; (iii) 제거되는 ORF가 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환되는 게놈 세그먼트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 8 내지 100 뉴클레오티드 길이, 15 내지 100 뉴클레오티드 길이, 25 내지 100 뉴클레오티드 길이, 50 내지 200 뉴클레오티드 길이, 50 내지 400 뉴클레오티드 길이, 200 내지 500 뉴클레오티드 길이, 또는 400 내지 600 뉴클레오티드 길이, 500 내지 800 뉴클레오티드 길이이다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 750 내지 900 뉴클레오티드 길이, 800 내지 100 뉴클레오티드 길이, 850 내지 1000 뉴클레오티드 길이, 900 내지 1200 뉴클레오티드 길이, 1000 내지 1200 뉴클레오티드 길이, 1000 내지 1500 뉴클레오티드 또는 10 내지 1500 뉴클레오티드 길이, 1500 내지 2000 뉴클레오티드 길이, 1700 내지 2000 뉴클레오티드 길이, 2000 내지 2300 뉴클레오티드 길이, 2200 내지 2500 뉴클레오티드 길이, 2500 내지 3000 뉴클레오티드 길이, 3000 내지 3200 뉴클레오티드 길이, 3000 내지 3500 뉴클레오티드 길이, 3200 내지 3600 뉴클레오티드 길이, 3300 내지 3800 뉴클레오티드 길이, 4000 뉴클레오티드 내지 4400 뉴클레오티드 길이, 4200 내지 4700 뉴클레오티드 길이, 4800 내지 5000 뉴클레오티드 길이, 5000 내지 5200 뉴클레오티드 길이, 5200 내지 5500 뉴클레오티드 길이, 5500 내지 5800 뉴클레오티드 길이, 5800 내지 6000 뉴클레오티드 길이, 6000 내지 6400 뉴클레오티드 길이, 6200 내지 6800 뉴클레오티드 길이, 6600 내지 7000 뉴클레오티드 길이, 7000 내지 7200 뉴클레오티드 길이, 7200 내지 7500 뉴클레오티드 길이, 또는 7500 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 5 내지 10 아미노산 길이, 10 내지 25 아미노산 길이, 25 내지 50 아미노산 길이, 50 내지 100 아미노산 길이, 100 내지 150 아미노산 길이, 150 내지 200 아미노산 길이, 200 내지 250 아미노산 길이, 250 내지 300 아미노산 길이, 300 내지 400 아미노산 길이, 400 내지 500 아미노산 길이, 500 내지 750 아미노산 길이, 750 내지 1000 아미노산 길이, 1000 내지 1250 아미노산 길이, 1250 내지 1500 아미노산 길이, 1500 내지 1750 아미노산 길이, 1750 내지 2000 아미노산 길이, 2000 내지 2500 아미노산 길이, 또는 2500 초과 또는 더 많은 아미노산 길이인 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 2500 아미노산 길이를 초과하지 않는 폴리펩티드를 인코딩한다. 구체적 실시양태에서, 이종성 ORF는 중지 코돈을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 조성, 뉴클레오티드 쌍 조성 또는 둘 모두가 최적화될 수 있다. 그러한 최적화를 위한 기술은 당업계에 알려져 있으며 이종성 ORF를 최적화하기 위해 적용될 수 있다.
피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 임의의 이종성 ORF가 피친드 바이러스 게놈 세그먼트에 포함될 수 있다. 일 실시양태에서, 이종성 ORF는 리포터 단백질을 인코딩한다. 리포터 단백질의 보다 상세한 설명은 섹션 4.3에서 개시된다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 감염성 병원균을 위한 항원 또는 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 질병과 연관된 항원을 인코딩한다. 구체적 실시양태에서, 항원은 감염성 유기체, 종양(즉, 암), 또는 알러젠으로부터 유래된다. 이종성 ORF에 대한 보다 상세한 설명은 섹션 4.3에 개시된다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자의 성장과 감염성은 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF에 의해 영향을 받지 않는다.
당업자에게 알려진 기술은 야생형 위치 외의 다른 위치에서 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 포함하는 피친드 바이러스 입자를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 역 유전학 기술이 그러한 피친드 바이러스 입자를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 복제-결핍성 피친드 바이러스 입자(즉, GP, NP, Z 단백질, L 단백질을 인코딩하는 ORF가 결실되었으며, 야생형 위치 외의 다른 위치에서 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트)는 보완성 세포에서 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 백신으로 사용하기 적합한 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 및 백신접종 및 예를 들어, 감염 또는 암의 치료 또는 예방에서 그러한 피친드 바이러스 입자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자를 이용하는 방법의 보다 상세한 설명은 섹션 4.6에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 cDNA를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 키트는 하나 또는 둘 이상의 용기에 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 피친드 바이러스 입자를 포함한다. 키트는 추가로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 피친드 바이러스 입자의 구조를 위해 적합한 숙주 세포, 숙주 세포내로 플라스미드 cDNA를 형질감염시키기에 적합한 시약, 헬퍼 바이러스, 바이러스 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및/또는 변형된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 피친드 바이러스 입자 또는 그의 cDNA에 대해 특이적인 하나 이상의 프라이머.
일부 실시양태에서, 본 출원은 약학 조성물로서 사용하기에 적합한 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 및 백신접종 및 예를 들어, 감염 및 암의 치료 또는 예방에서 그러한 피친드 바이러스 입자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자를 이용하는 방법의 보다 상세한 설명은 섹션 4.7에서 제공된다.
4.2 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
본 발명은 그들의 ORF가 재배열된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 복제 가능한 2개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로 재조합되지 않는다. 더욱 구체적으로, 일부 실시양태에서, 게놈 세그먼트 중 둘(예를 들어, 각각 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트)은 2개의 모 세그먼트를 대신할 수 있는 단일 바이러스 세그먼트를 생성하는 방식으로 재조합될 수 없다. 구체적 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 모든 4개의 피친드 바이러스 ORF를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 복제 가능하고 감염성이다. 다른 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 4개의 피친드 바이러스 ORF 중 하나가 결핍된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성이지만 비-보완성 세포에서 추가의 감염성 후손을 생산할 수 없다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF는 피친드 바이러스 3' UTR 또는 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있을 수 있다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 3' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트(들)의 3' UTR이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 3' UTR은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 L 세그먼트(들)의 3' UTR이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 5' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트(들)의 5' UTR이다. 다른 구체적 실시양태에서, 5' UTR은 L 세그먼트(들)의 5' UTR이다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF는 아레나바이러스 보존 말단 서열 요소(5'- 및 3'-말단 19-21-nt 영역)의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Perez & de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194 참고).
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF는 5' UTR의 프로모터 요소의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4 참고). 다른 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 GP, NP, Z 단백질, L 단백질을 인코딩하는 ORF는 3' UTR의 프로모터 요소의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4 참고). 더욱 구체적인 실시양태에서, 5' UTR의 프로모터 요소는 S 세그먼트(들) 또는 L 세그먼트(들)의 5' UTR 프로모터 요소이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 3' UTR의 프로모터 요소는 S 세그먼트(들) 또는 L 세그먼트(들)의 3' UTR 프로모터 요소이다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 GP, NP, Z 단백질 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF는 절단된 피친드 바이러스 3' UTR 또는 절단된 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있을 수 있다(예를 들어, Perez & de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4 참고). 더욱 구체적인 실시양태에서, 절단된 3' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트의 3' UTR이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 절단된 5' UTR은 피친드 바이러스 S 세그먼트(들) 또는 L 세그먼트(들)의 5' UTR이다.
본 발명은 또한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA를 제공한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 표 2 또는 표 3에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 인코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열 또는 DNA 뉴클레오티드 서열의 세트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 핵산은 본 명세서에 개시된 핵산에 적어도 소정의 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 핵산은 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 서열 또는 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성의 핵산 서열을 갖거나, 또는 동일하다. 하이브리드화 조건은 본 명세서에 개시된 것과 같은, 당업자에게 잘 알려진 매우 엄격한, 중간정도로 엄격한, 또는 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생성하는데 사용될 수 있는 핵산은 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 또는 서열 번호에 의해 본 명세서에 개시된 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산과 소정의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 생성하는데 사용되는 핵산은 본 명세서에 개시된 핵산 서열과 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖거나, 동일할 수 있다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈을 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 DNA 발현 벡터의 일부이거나 그안으로 통합될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈을 인코딩하는 핵산은 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 생산을 촉진하는 하나 이상의 DNA 발현 벡터의 일부이거나 그안으로 통합된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 cDNA는 플라스미드내로 통합될 수 있다. cDNA 및 발현 시스템의 보다 상세한 설명은 섹션 4.5.1에 제공된다. cDNA의 생산을 위한 기술은 분자생물학 및 DNA 조작과 생산의 일상적이고 통상적인 기술이다. 당업자에게 알려진 임의의 클로닝 기술이 이용될 수 있다. 그러한 기술은 잘 알려져 있으며 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)과 같은 실험 매뉴얼에서 당업자가 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스의 cDNA는 숙주 세포내로 도입된다(예를 들어, 형질감염된다). 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA(즉, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈 세그먼트의 cDNA)를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 cDNA는 DNA 발현 벡터의 일부이거나 그안으로 통합될 수 있으며 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은 벡터내로 통합된 본 명세서에 개시된 cDNA를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈 세그먼트(즉, L 세그먼트 및/또는 S 세그먼트 또는 세그먼트들)는 숙주 세포내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생산하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA를 전사시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 폴리머라제 단백질은 시험관내 또는 생체내에서 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 전사동안 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 전사는 양방향성 프로모터를 이용하여 수행된다.
다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 전사는 양방향성 발현 카세트를 이용하여 수행된다(예를 들어, Ortiz-Riano et al., 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188 참고). 더욱 구체적인 실시양태에서, 양방향성 발현 카세트는 삽입된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 두 말단으로 각각 반대 측으로부터 해독하는 폴리머라제 I 및 폴리머라제 II 프로모터 둘 모두를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA의 전사는 프로모터를 포함한다. 프로모터의 구체적 예는 RNA 폴리머라제 I 프로모터, RNA 폴리머라제 II 프로모터, RNA 폴리머라제 III 프로모터, T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 T3 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생산하는 방법은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA를 숙주 세포내로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생산하는 방법은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA를 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 생산을 위한 모든 다른 성분을 발현하는 숙주 세포내로 도입하고; 숙주 세포의 상등액으로부터 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 세포주, 배양물 및 본 발명에서 제공되는 핵산, 벡터, 및 조성물로 감염된 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 핵산, 벡터 시스템 및 세포주의 보다 상세한 설명은 섹션 4.5에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성이며 복제 가능한 피친드 바이러스 입자를 야기한다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자는 약독화된다. 구체적 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는, 바이러스가 적어도 부분적으로, 복제-가능하며 생체내에서 복제할 수 있으나, 비병원성인 무증상 수준의 감염을 야기하는 낮은 바이러스 로드를 생성할 수 있도록, 약독화된다. 그러한 약독화된 바이러스는 면역원성 조성물로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 2개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자와 동일한 향성을 가진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 하나 이상의 cDNA를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 키트는 하나 또는 둘 이상의 용기에 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함한다. 키트는 추가로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 구조를 위해 적합한 숙주 세포, 숙주 세포내로 플라스미드 cDNA를 형질감염시키기에 적합한 시약, 헬퍼 바이러스, 바이러스 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및/또는 변형된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 피친드 바이러스 입자 또는 그를 인코딩하는 핵산에 대해 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머.
본 발명은 또한 섹션 4.6과 4.7에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
4.2.1 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
일 양태에서, 본 발명은 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는다. 구체적 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은, I 형 인터페론 수용체, II 형 인터페론 수용체 및 재조합 활성화 유전자 1(RAG1)이 결핍되고 104 PFU의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로 감염된 마우스에서 적어도 10 일, 적어도 20 일, 적어도 30 일, 적어도 40 일, 적어도 50 일, 적어도 60 일, 적어도 70 일, 적어도 80 일, 적어도 90 일, 또는 적어도 100 일의 지속 감염 후에 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는다(섹션 4.8.13 참고). 다른 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은 적어도 10 계대, 적어도 20 계대, 적어도 30 계대, 적어도 40 계대, 또는 적어도 50 계대 후 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는다.
일부 실시양태에서, 2개의 분리된 세그먼트 대신 하나상에 2개의 아레나바이러스 ORF를 결합하는, 본 발명에서 제공되는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 두 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 비-기능성 프로모터를 야기하며(즉, 5' UTR-----------5' UTR 또는 3' UTR------------3' UTR 구조의 게놈 세그먼트), 게놈의 한 단부를 형성하는 각 UTR은 동일 게놈의 다른 단부의 역위된 반복 서열이다.
일부 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 피친드 바이러스 ORF를 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 보유하도록 조작되었다. 다른 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 2개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 3개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 4개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 5개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 6개의 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작되었다. 구체적 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 모든 4개의 피친드 바이러스 ORF 전체 수를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성이고 복제 가능한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자이다. 구체적 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 2개의 S 세그먼트는 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 그들의 ORF 중 하나를 보유하도록 조작되었다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 2개의 S 세그먼트는 S 세그먼트 ORF 전체 수를 포함한다. 일부 구체적 실시양태에서, L 세그먼트는 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되었거나 L 세그먼트는 야생형 게놈 세그먼트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 2개의 S 세그먼트 중 하나는:
(i) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(ii) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(iii) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(iv) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트;
(v) L을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트; 및
(vi) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 피친드 바이러스 S 세그먼트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 복사 ORF(즉, 2개의 야생형 S 세그먼트 ORF, 예를 들어, GP 또는 NP)를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 하나의 복사 ORF(예를 들어, (GP, GP)) 또는 2개의 복사 ORF(예를 들어, (GP, GP) 및 (NP, NP))를 포함할 수 있다.
하기의 표 2A는 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈 조직의 예시이며, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈에서 두 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않으며 아레나바이러스 프로모터 활성을 폐지한다(즉, 생성되는 재조합된 S 세그먼트는 3' UTR과 5' UTR 대신 2개의 3' UTR로 이루어짐).
[표 2A]
하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
위치 1은 피친드 바이러스 S 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 2는 피친드 바이러스 S 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 3은 피친드 바이러스 S 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 4는 피친드 바이러스 S 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 5는 피친드 바이러스 L 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 6은 피친드 바이러스 L 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있다.
*ORF는 이종성 ORF가 삽입되었음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 위치 1과 위치 2사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 위치 1과 위치 2 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 조합 또한 가능하다. 예를 들어, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하며, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈에서 두 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않으며 아레나바이러스 프로모터 활성을 폐지한다(즉, 생성되는 재조합된 S 세그먼트는 3' UTR과 5' UTR 대신 2개의 5' UTR로 이루어짐).
일부 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자에서 S 세그먼트와 L 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 2개의 별도의 세그먼트 대신 단지 하나의 세그먼트상에 두 가지 바이러스 유전자를 가진 기능성 세그먼트를 복구한다. 다른 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자에서 S 세그먼트와 L 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는다.
하기의 표 2B는 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈 조직의 예시이며, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈에서 S 세그먼트와 L 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않으며 아레나바이러스 프로모터 활성을 폐지한다(즉, 생성되는 재조합된 S 세그먼트는 3' UTR과 5' UTR 대신 2개의 3' UTR로 이루어짐).
[표 2B]
하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
위치 1은 피친드 바이러스 S 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 2는 피친드 바이러스 S 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 3은 피친드 바이러스 S 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 4는 피친드 바이러스 S 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 5는 피친드 바이러스 L 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 6은 피친드 바이러스 L 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있다.
*ORF는 이종성 ORF가 삽입되었음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 위치 1과 위치 2 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 위치 1과 위치 2 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 조합 또한 가능하다. 예를 들어, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하며, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈에서 두 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않으며 아레나바이러스 프로모터 활성을 폐지한다(즉, 생성되는 재조합된 S 세그먼트는 3' UTR과 5' UTR 대신 2개의 5' UTR로 이루어짐).
일부 실시양태에서, 당업자는 표 2A 또는 2B에 예시되고 본 명세서에 개시된 조직을 가진 피친드 바이러스 게놈을 제작할 수 있으며, 이어서 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 유전적으로 안정한지, 즉, 본 명세서에 토의된 대로 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 생성하지 않는지를 결정하기 위하여 섹션 4.8에 개시된 분석을 이용할 수 있다.
4.2.2 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
일 양태에서, 본 발명은 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 생성하지 않는다. 구체적 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은, I 형 인터페론 수용체, II 형 인터페론 수용체 및 재조합 활성화 유전자 1(RAG1)이 결핍되고 104 PFU의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로 감염된 마우스에서(섹션 4.8.13 참고) 적어도 10 일, 적어도 20 일, 적어도 30 일, 적어도 40 일, 적어도 50 일, 적어도 60 일, 적어도 70 일, 적어도 80 일, 적어도 90 일, 적어도 100 일의 지속 감염 후에 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는다. 다른 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 증식은 적어도 10 계대, 20 계대, 30 계대, 40 계대, 또는 50 계대 후 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는다.
일부 실시양태에서, 2개의 분리된 세그먼트 대신 하나상에 2개의 피친드 바이러스 ORF를 결합하는, 본 발명에서 제공되는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 두 L 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 비기능성 프로모터를 야기하며(즉, 5' UTR-----------5' UTR 또는 3' UTR------------3' UTR 구조의 게놈 세그먼트), 게놈의 한 단부를 형성하는 각 UTR은 동일 게놈의 다른 단부의 역위된 반복 서열이다.
일부 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 피친드 바이러스 ORF를 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 보유하도록 조작되었다. 다른 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 2개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 3개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 4개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 5개의 피친드 바이러스 ORF, 또는 6개의 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작되었다. 구체적 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 모든 4개의 피친드 바이러스 ORF 전체 수를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성이고 복제 가능한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자이다. 구체적 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 2개의 L 세그먼트는 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 그들의 ORF 중 하나를 보유하도록 조작되었다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트는 L 세그먼트 ORF 전체 수를 포함한다. 일부 구체적 실시양태에서, S 세그먼트는 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 그들의 ORF 중 하나를 보유하도록 조작되었거나 S 세그먼트는 야생형 게놈 세그먼트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 중 하나는:
(i) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(ii) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(iii) L 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 5' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(iv) GP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트;
(v) NP를 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트; 및
(vi) Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 피친드 바이러스 3' UTR의 제어하에 있는 L 세그먼트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 복사 ORF(즉, 2개의 야생형 L 세그먼트 ORF, 예를 들어, Z 단백질 또는 L 단백질)를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 하나의 복사 ORF(예를 들어, (Z 단백질, Z 단백질)) 또는 2개의 복사 ORF(예를 들어, (Z 단백질, Z 단백질) 및 (L 단백질, L 단백질))를 포함할 수 있다.
하기의 표 3은 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈 조직의 예시이며, 이때 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈에서 두 L 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않으며 아레나바이러스 프로모터 활성을 폐지한다(즉, 추정적으로 생성되는 재조합된 L 세그먼트는 3' UTR과 5' UTR 대신 2개의 3' UTR 또는 2개의 5' UTR로 이루어질 것임). 표 3에 기초하여, 3' UTR 및 5' UTR 대신 2개의 5' UTR로 이루어진 피친드 바이러스 입자를 생성하기 위해 유사한 조합이 예상될 수 있다
[표 3]
2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
*위치 1은 피친드 바이러스 L 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 2는 피친드 바이러스 L 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 3은 피친드 바이러스 L 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 4는 피친드 바이러스 L 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 5는 피친드 바이러스 S 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 6은 피친드 바이러스 S 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있다.
*ORF는 이종성 ORF가 삽입되었음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 위치 1과 위치 2 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 위치 1과 위치 2 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 IGR일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 조합 또한 가능하다.
일부 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로부터의 L 세그먼트와 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 2개의 별도의 세그먼트 대신 단지 하나의 세그먼트상에 두 가지 바이러스 유전자를 가진 기능성 세그먼트를 복구한다. 다른 실시양태에서, 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자에서 L 세그먼트와 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는다.
하기의 표 3B는 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈 조직의 예시이며, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 게놈에서 L 세그먼트와 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합은 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않으며 아레나바이러스 프로모터 활성을 폐지한다(즉, 생성되는 재조합된 S 세그먼트는 3' UTR과 5' UTR 대신 2개의 3' UTR로 이루어짐).
[표 3B]
2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
*위치 1은 피친드 바이러스 L 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 2는 피친드 바이러스 L 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 3은 피친드 바이러스 L 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 4는 피친드 바이러스 L 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있으며; 위치 5는 피친드 바이러스 S 세그먼트 5' UTR의 제어하에 있으며; 위치 6은 피친드 바이러스 S 세그먼트 3' UTR의 제어하에 있다.
*ORF는 이종성 ORF가 삽입되었음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 위치 1과 위치 2사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 L 세그먼트 IGR일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 위치 1과 위치 2 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 2와 3 사이의 IGR은 피친드 바이러스 L 세그먼트 IGR일 수 있으며; 위치 5와 6 사이의 IGR은 피친드 바이러스 S 세그먼트 IGR일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 조합 또한 가능하다.
일부 실시양태에서, 당업자는 표 3A 또는 3B에 예시되고 본 명세서에 개시된 조직을 가진 피친드 바이러스 게놈을 제작할 수 있으며, 이어서 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 유전적으로 안정한지, 즉, 본 명세서에 토의된 대로 복제-가능한 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 생성하지 않는지를 결정하기 위하여 섹션 4.8에 개시된 분석을 이용할 수 있다.
4.2.3 복제-결핍성 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) ORF가 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에 있으며; (ii) GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되었거나 기능적으로 불활성화되어 생성되는 바이러스가 추가의 감염성 후손 바이러스 입자를 생산할 수 없는(즉, 복제 결핍성임) 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제3 피친드 바이러스 세그먼트는 S 세그먼트일 수 있다. 다른 실시양태에서, 제3 피친드 바이러스 세그먼트는 L 세그먼트일 수 있다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 제3 피친드 바이러스 세그먼트는 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작될 수 있거나 제3 피친드 바이러스 세그먼트는 야생형 피친드 바이러스 게놈 세그먼트일 수 있다. 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, 제3 피친드 바이러스 세그먼트는 GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 피친드 바이러스 ORF가 결핍된다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 게놈 세그먼트는 S 또는 L 세그먼트 하이브리드(즉, S 세그먼트와 L 세그먼트의 조합일 수 있는 게놈 세그먼트)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 하이브리드 세그먼트는 L 세그먼트 IGR을 포함하는 S 세그먼트이다. 다른 실시양태에서, 하이브리드 세그먼트는 S 세그먼트 IGR을 포함하는 L 세그먼트이다. 다른 실시양태에서, 하이브리드 세그먼트는 L 세그먼트 IGR을 가진 S 세그먼트 UTR이다. 다른 실시양태에서, 하이브리드 세그먼트는 S 세그먼트 IGR을 가진 L 세그먼트 UTR이다. 구체적 실시양태에서, 하이브리드 세그먼트는 L 세그먼트 IGR을 가진 S 세그먼트 5' UTR 또는 L 세그먼트 IGR을 가진 S 세그먼트 3' UTR이다. 다른 구체적 실시양태에서, 하이브리드 세그먼트는 S 세그먼트 IGR을 가진 L 세그먼트 5' UTR 또는 S 세그먼트 IGR을 가진 L 세그먼트 3' UTR이다.
하나 이상의 ORF가 결실되었거나 기능적으로 불활성화된 유전적으로 변형된 게놈을 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 보완성 세포(즉, 결실되었거나 기능적으로 불활성화된 피친드 바이러스 ORF를 발현하는 세포)에서 생산될 수 있다. 생성되는 피친드 바이러스 입자의 유전 물질은 숙주 세포의 감염시에 숙주 세포내로 전달될 수 있으며, 유전 물질은 발현되고 증폭될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 유전적으로 변형된 피친드 바이러스 입자의 게놈은 피친드 바이러스 입자 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF를 인코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개의 ORF 중 적어도 하나는 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질 및 L 단백질을 인코딩하는 적어도 1개 ORF, 적어도 2개 ORF, 적어도 3개 ORF, 또는 적어도 4개 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환될 수 있다. 구체적 실시양태에서, GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 4개 ORF 중 단지 하나만이 제거되고 피친드 바이러스 입자 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 GP를 인코딩하는 ORF가 제거된다. 다른 구체적 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 NP를 인코딩하는 ORF가 제거된다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) ORF가 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에 있으며; (ii) GP 또는 NP를 인코딩하는 ORF가 제거되었거나 기능적으로 불활성화되어 생성되는 바이러스가 복제-결핍성이며 감염성이 아닌, 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 하나의 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 구체적 실시양태에서, 2개의 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 구체적 실시양태에서, 3개의 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 구체적 실시양태에서, GP를 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 구체적 실시양태에서, NP를 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, NP를 인코딩하는 ORF와 GP를 인코딩하는 OFR가 제거되고 피친드 바이러스 입자 외의 다른 유기체로부터의 하나 또는 2개의 이종성 ORF로 치환된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 (i) 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트; (ii) ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에 있는 ORF; (iii) 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 하나 이상의 이종성 ORF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) ORF가 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에 있으며; (ii) Z 단백질 및/또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되었거나 기능적으로 불활성화되어 생성되는 바이러스가 복제-결핍성이며 감염성이 아닌, 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 하나의 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 구체적 실시양태에서, 2개의 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 구체적 실시양태에서, Z 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 구체적 실시양태에서, L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, Z 단백질을 인코딩하는 ORF와 L 단백질을 인코딩하는 OFR가 제거되고 피친드 바이러스 입자 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 (i) 2개의 L 세그먼트 및 하나의 S 세그먼트; (ii) ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에 있는 ORF; (iii) 피친드 바이러스외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 i) 비-천연 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되며; ii) GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고; iii) 제거되는 ORF가 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 하나 이상의 이종성 ORF로 치환되는, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자(즉, 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 8 내지 100 뉴클레오티드 길이, 15 내지 100 뉴클레오티드 길이, 25 내지 100 뉴클레오티드 길이, 50 내지 200 뉴클레오티드 길이, 50 내지 400 뉴클레오티드 길이, 200 내지 500 뉴클레오티드 길이, 또는 400 내지 600 뉴클레오티드 길이, 500 내지 800 뉴클레오티드 길이다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 750 내지 900 뉴클레오티드 길이, 800 내지 100 뉴클레오티드 길이, 850 내지 1000 뉴클레오티드 길이, 900 내지 1200 뉴클레오티드 길이, 1000 내지 1200 뉴클레오티드 길이, 1000 내지 1500 뉴클레오티드 또는 10 내지 1500 뉴클레오티드 길이, 1500 내지 2000 뉴클레오티드 길이, 1700 내지 2000 뉴클레오티드 길이, 2000 내지 2300 뉴클레오티드 길이, 2200 내지 2500 뉴클레오티드 길이, 2500 내지 3000 뉴클레오티드 길이, 3000 내지 3200 뉴클레오티드 길이, 3000 내지 3500 뉴클레오티드 길이, 3200 내지 3600 뉴클레오티드 길이, 3300 내지 3800 뉴클레오티드 길이, 4000 뉴클레오티드 내지 4400 뉴클레오티드 길이, 4200 내지 4700 뉴클레오티드 길이, 4800 내지 5000 뉴클레오티드 길이, 5000 내지 5200 뉴클레오티드 길이, 5200 내지 5500 뉴클레오티드 길이, 5500 내지 5800 뉴클레오티드 길이, 5800 내지 6000 뉴클레오티드 길이, 6000 내지 6400 뉴클레오티드 길이, 6200 내지 6800 뉴클레오티드 길이, 6600 내지 7000 뉴클레오티드 길이, 7000 내지 7200 뉴클레오티드 길이, 7200 내지 7500 뉴클레오티드 길이, 또는 7500 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 5 내지 10 아미노산 길이, 10 내지 25 아미노산 길이, 25 내지 50 아미노산 길이, 50 내지 100 아미노산 길이, 100 내지 150 아미노산 길이, 150 내지 200 아미노산 길이, 200 내지 250 아미노산 길이, 250 내지 300 아미노산 길이, 300 내지 400 아미노산 길이, 400 내지 500 아미노산 길이, 500 내지 750 아미노산 길이, 750 내지 1000 아미노산 길이, 1000 내지 1250 아미노산 길이, 1250 내지 1500 아미노산 길이, 1500 내지 1750 아미노산 길이, 1750 내지 2000 아미노산 길이, 2000 내지 2500 아미노산 길이, 또는 2500 초과 또는 더 많은 아미노산 길이인 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 2500 아미노산 길이를 초과하지 않는 폴리펩티드를 인코딩한다. 구체적 실시양태에서, 이종성 ORF는 중지 코돈을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 조성, 뉴클레오티드 쌍 조성 또는 둘 모두가 최적화될 수 있다. 그러한 최적화를 위한 기술은 당업계에 알려져 있으며 이종성 ORF를 최적화하기 위해 적용될 수 있다.
피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 임의의 이종성 ORF가 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자에 포함될 수 있다. 일 실시양태에서, 이종성 ORF는 리포터 단백질을 인코딩한다. 리포터 단백질의 보다 상세한 설명은 섹션 4.3에서 개시된다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 감염성 병원균을 위한 항원 또는 임의의 질병과 연관된 항원을 인코딩하며 항원은 면역 반응을 유발할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항원은 감염성 유기체, 종양(즉, 암), 또는 알러젠으로부터 유래된다. 이종성 ORF에 대한 보다 상세한 설명은 섹션 4.3에 개시된다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자의 성장과 감염성은 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF에 의해 영향을 받지 않는다.
당업자에게 알려진 기술은 야생형 위치 외의 다른 위치에서 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 포함하는 피친드 바이러스 입자를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 역 유전학 기술이 그러한 피친드 바이러스 입자를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 복제-결핍성 피친드 바이러스 입자(즉, GP, NP, Z 단백질, L 단백질을 인코딩하는 ORF가 결실되었으며, 야생형 위치 외의 다른 위치에서 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트)는 보완성 세포에서 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 백신으로 사용하기 적합한 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 및 백신접종 및 예를 들어, 감염 및 암의 치료 또는 예방에서 그러한 피친드 바이러스 입자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자를 이용하는 방법의 보다 상세한 설명은 섹션 4.6에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 약학 조성물로 사용하기 적합한 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 및 백신접종 및 예를 들어, 감염 또는 암의 치료 또는 예방에서 그러한 피친드 바이러스 입자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자를 이용하는 방법의 보다 상세한 설명은 섹션 4.6에서 제공된다.
4.3 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 및 각각의 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 이종성 ORF를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 및 각각의 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 관심 유전자를 포함할 수 있다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 이종성 ORF 또는 관심 유전자는 항원을 인코딩한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 이종성 ORF 또는 관심 유전자는 리포터 단백질 또는 형광 단백질을 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 하나 이상의 이종성 ORF 또는 하나 이상의 관심 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 적어도 하나의 이종성 ORF, 적어도 2개의 이종성 ORF, 적어도 3개의 이종성 ORF, 또는 더 많은 이종성 ORF를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 적어도 하나의 관심 유전자, 적어도 2개의 관심 유전자, 적어도 3개의 관심 유전자, 또는 더 많은 관심 유전자를 포함한다.
매우 다양한 항원이 본 출원의 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자에 의해 발현될 수 있다. 일 실시양태에서, 이종성 ORF는 감염성 병원균의 항원 또는 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 질병과 연관된 항원을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 바이러스, 세균, 진균, 기생충으로부터 유래된 항원을 인코딩할 수 있거나, 또는 종양 또는 종양 연관 질병(즉, 암), 자가면역 질병, 퇴행성 질병, 유전 질병, 물질 의존성, 비만, 또는 알러지성 질병에서 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 바이러스 항원을 인코딩한다. 바이러스 항원의 비제한적인 예는 아데노바이러스과(예를 들어, 포유류아데노바이러스(mastadenovirus) 및 조류아데노바이러스(aviadenovirus)), 헤르페스바이러스과(예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 1, 헤르페스 심플렉스 바이러스 2, 헤르페스 심플렉스 바이러스 5, 헤르페스 심플렉스 바이러스 6, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, HHV6-HHV8 및 거대세포바이러스), 레비바이러스과(leviviridae)(예를 들어, 레비바이러스, 장내세균 단계 MS2, 알로레바이러스(allolevirus)), 폭스바이러스과(예를 들어, 코르도폭시리내(chordopoxyirinae), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(leporiipoxvirus), 수이폭스바이러스(suipoxvirus), 몰루시폭스바이러스(molluscipoxvirus), 및 엔토모폭시리내(and entomopoxyirinae)), 파포바바이러스과(예를 들어, 폴리오마바이러스(polyomavirus) 및 파필로마바이러스(papillomavirus)), 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae)(예를 들어, 파라믹소바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1, 모빌리바이러스(mobillivirus)(예를 들어, 홍역 바이러스), 루부라바이러스(rubulavirus)(예를 들어, 이하선염 바이러스), 뉴모노비리내(pneumonovirinae)(예를 들어, 폐렴 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스(human respiratory syncytial virus)), 호흡기세포융합 바이러스 및 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)(예를 들어, 조류 뉴모바이러스(avian pneumovirus) 및 인간 메타뉴모바이러스), 피코르나바이러스과(picornaviridae)(예를 들어, 장내바이러스(enterovirus), 라이노바이러스(rhinovirus), 헤파토바이러스(hepatovirus)(예를 들어, 인간 A형 간염 바이러스), 카디오바이러스(cardiovirus), 및 앱토바이러스(apthovirus)), 레오바이러스과(reoviridae)(예를 들어, 오르토레오바이러스(orthoreovirus), 오르비바이러스(orbivirus), 로타바이러스(rotavirus), 사이포바이러스(cypovirus), 피지바이러스(fijivirus), 피토레오바이러스(phytoreovirus), 및 오리자바이러스(oryzavirus)), 레트로바이러스과(retroviridae)(예를 들어, 포유류 타입 B 레트로바이러스, 포유류 타입 C 레트로바이러스, 조류 타입 C 레트로바이러스, 타입 D 레트로바이러스 그룹, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스(lentivirus)(예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1 및 HIV-2(예를 들어, HIV gp160), 스푸마바이러스(spumavirus)), 플라비바이러스과(flaviviridae)(예를 들어, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)), 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae)(예를 들어, B형 간염 바이러스), 토가바이러스과(togaviridae)(예를 들어, 알파바이러스(alphavirus)(예를 들어, 신드비스 바이러스(sindbis virus)) 및 루비바이러스(rubivirus)(예를 들어, 루벨라 바이러스)), 랍도바이러스과(rhabdoviridae)(예를 들어, 수포성바이러스(vesiculovirus), 리사바이러스(lyssavirus), 에페메로바이러스(ephemerovirus), 시토랍도바이러스(cytorhabdovirus), 및 네클레오랍도바이러스(necleorhabdovirus)), 아레나바이러스과(arenaviridae)(예를 들어, 아레나바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 이피 바이러스(Ippy virus), 및 랏사 바이러스(lassa virus)), 및 코로나바이러스과(coronaviridae)(예를 들어, 코로나바이러스 및 토로바이러스)로부터의 항원을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 바이러스 항원은 HIV gp120, gp41, HIV Nef, RSV F 당단백질, RSV G 당단백질, HTLV tax, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질(예를 들어, gB, gC, gD, 및 gE) 또는 B형 간염 표면 항원, C형 간염 바이러스 E 단백질 또는 코로나바이러스 스파이크(spike) 단백질이다. 일 실시양태에서, 바이러스 항원은 HIV 항원이 아니다.
다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 세균 항원(예를 들어, 세균 외피 단백질)을 인코딩한다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 기생충 항원(예를 들어, 원생동물 항원)을 인코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 진균 항원을 인코딩한다.
세균 항원의 비-제한적인 예는 아쿠아스피릴룸 과(Aquaspirillum family), 아조스피릴룸 과(Azospirillum family), 아조토박테라세 과(Azotobacteraceae family), 박테리오다세 과(Bacteroidaceae family), 바르토넬라 종(Bartonella species), 브델로비브리오 과(Bdellovibrio family), 캄필로박터(Campylobacter) 종, 클라미디아(Chlamydia) 종(예를 들어, 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)), 클로스트리듐(clostridium), 장내세균 과(Enterobacteriaceae family)(예를 들어, 시트로박터(Citrobacter) 종, 에드왈드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 엔비니아(Envinia) 종, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 하프니아(Hafnia) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 모르가넬라(Morganella) 종, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라(Salmonella) 종, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)), 가르디넬라 과(Gardinella family), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 할로박테리아세 과(Halobacteriaceae family), 헬리코박터 과(Helicobacter family), 레지오넬라세 과(Legionallaceae family), 리스테리아(Listeria) 종, 메틸로코카세 과(Methylococcaceae family), 마이코박테리아(mycobacteria)(예를 들어, 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 나이세리아세 과(Neisseriaceae family), 오세아노스피릴룸 과(Oceanospirillum family), 파스퇴레라세 과(Pasteurellaceae family), 뉴모코커스(Pneumococcus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 리조비아세 과(Rhizobiaceae family), 스피릴룸 과(Spirillum family), 스피로소마세 과(Spirosomaceae family), 스타필로코커스(Staphylococcus)(예를 들어, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스타필로코커스 피로제네스(Staphylococcus pyrogenes)), 스트렙토코커스(Streptococcus)(예를 들어, 스트렙토코커스 엔테리티디스(Streptococcus enteritidis), 스트렙토코커스 파시애(Streptococcus fasciae), 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)), 밤피로비브르 헬리코박터 과(Vampirovibr Helicobacter family), 예르시니아 과(Yersinia family), 바실러스 안트라시스(Bacillus antracis) 및 밤피로비브리오 과(Vampirovibrio family)의 세균으로부터의 항원을 포함한다.
기생충 항원의 비-제한적인 예는 아메바, 말라리아 기생충, 플라스모듐(Plasmodium), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)와 같은 기생충으로부터의 항원을 포함한다. 진균 항원의 비-제한적인 예는 앱시디아(Absidia) 종(예를 들어, 앱시디아 코림비페라(Absidia corymbifera) 및 앱시디아 라모사(Absidia ramosa)), 아스퍼질러스(Aspergillus) 종(예를 들어, 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger), 및 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)), 바시디오보루스 라나룸(Basidiobolus ranarum), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다(Candida) 종(예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 케른(Candida kern), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파랍시로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 퀼레르몬디(Candida quillermondii), 칸디다 루고사(Candida rugosa), 칸디다 스텔라토이대(Candida stellatoidea), 및 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)), 콕시디오이드 임미티스(Coccidioides immitis), 코니디오보루스(Conidiobolus) 종, 크립토코커스 네오폼스(Cryptococcus neoforms), 컨닝하멜라(Cunninghamella) 종, 데르마토피테스(dermatophytes), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 마이크로스포룸 집세움(Microsporum gypseum), 무코르 푸실루스(Mucor pusillus), 파라콕시디오이드 브라시리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 슈달레스체리아 보이디(Pseudallescheria boydii), 리노스포리디움 시베리(Rhinosporidium seeberi), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 리조푸스(Rhizopus) 종(예를 들어, 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae), 및 리조푸스 마이크로스포루스(Rhizopus microsporus)), 사카로마이세스(Saccharomyces) 종, 스포로트릭스 스첸키(Sporothrix schenckii), 자이고마이세테스(zygomycetes), 및 접합균류, 자낭균, 담자균류, 불완전균류, 및 난균류와 같은 클래스로부터의 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 종양 항원 또는 종양 연관 항원을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 종양 항원 또는 종양 연관 항원은 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질암종, 소아 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 카포시 육종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양, 기질-세포 암종, 간외 담관암(bile duct cancer, extrahepatic)(담관암종 참고), 방광암, 뼈 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 교종, 뇌암, 뇌 종양, 소뇌 성상세포종, 뇌 성상세포종/악성 신경교종 뇌 종양, 상의세포종, 수모세포종, 천막상 원시신경외배엽성 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 시각 경로 및 시상하부 교종(visual pathway and hypothalamic glioma), 유방암, 기관지 선종/카르시노이드(carcinoid), 버킷 림프종(burkitt's lymphoma), 카르시노이드 종양, 카르시노이드 위장 종양, 원발부위 불명암, 중추신경계 림프종, 원발 소뇌 성상세포종(primary, cerebellar astrocytoma), 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 자궁경부암, 소아암, 만성 기관지염, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환(chronic myeloproliferative disorder), 결장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직성 소원형 세포 종양(desmoplastic small round cell tumor), 폐기종, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 종양의 유잉 패밀리 내의 유잉 육종(ewing's sarcoma), 두개외 생식세포 종양(extracranial germ cell tumor), 생식선외 생식 세포 종양(extragonadal germ cell tumor), 간외담관 암(extrahepatic bile duct cancer), 안내 흑색종(intraocular melanoma), 망막모세포종, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양, 생식 세포 종양: 두개외, 고환외, 또는 난소 임신 융모 종양(ovarian gestational trophoblastic tumor), 뇌간의 신경교종, 신경교종, 소아 뇌 성상세포종, 소아 시각경로 및 시상하부, 위 카르시노이드, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포(간)암, 호킨스 림프종(hodgkin lymphoma), 하인두암, 시상하부 및 시각경로 신경교종, 안내 흑색종, 섬세포 암종(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암(신장세포 암), 후두암, 급성 림프모구 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 입술 및 구강 암, 지방육종, 간암(원발성), 비-소세포 또는 소세포 폐암, AIDS-관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호킨스 림프종, 비-호킨스 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 마크로글로불린혈증, 발덴스트롬(), 남성 유방암, 뼈의 악성 섬유성 조직구증/골육종, 수모세포종, 안내(눈) 흑색종, 메르켈 세포 암, 성인 악성 중피종, 중피종, 잠재성 원발성 구강암을 가진 전이성 편평 목 암, 다발성 내분비샘종양 증후군, 다발성 골수종/형질세포 종양, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질병, 만성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 소아 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종(골수의 암), 만성 골수증식성 질환, 비강 및 부비강 암, 비인두암, 신경아세포종, 비-소세포 폐암, 핍지교종, 구강암, 구인두암, 골육종/뼈의 악성 섬유성 조직구증, 난소암, 난소 상피암(표면 상피-기질 종양), 난소 생식 세포 종양, 난소 저 악성 잠재성 종양(ovarian low malignant potential tumor), 도세포 췌장암, 부비강 및 비강 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배아세포종, 송과체모세포종 및 천막상 원시신경외배엽종양, 뇌하수체 선종, 형질세포 종양/다발성 골수종, 흉막폐모세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장세포 암종(신장암), 신우뇨관(renal pelvis and ureter) 이행 세포 암(transitional cell cancer), 망막모세포종, 소아 횡문근육종, 침샘암, 육종, 종양의 유잉 패밀리(Ewing family of tumors), 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁 육종, 시자리 병(), 피부암(비-흑색종), 피부암(흑색종), 메르켈 세포 피부 암종, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종 - 피부암(비-흑색종) 참고, 잠재적 원발성 전이성 위암을 가진 편평 목암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 피부 T-세포 림프종 - 균상 식육종 및 시자리병 참고, 고환암, 식도암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 소아 신우뇨관의 이행성 세포 암(childhood transitional cell cancer of the renal pelvis and ureter), 원발 부위 미지의 임신 융모 종양, 성인 원발 부위 미지의 암종, 소아의 암, 신우뇨관 이행 세포 암, 요도암, 자궁암, 자궁내막 자궁 육종, 기관지 종양, 중추 신경계 배아성 종양; 소아 척색종, 결장직장암, 두개인두종, 상의아종, 랑게르한스 세포 조직구증, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(성인/소아), 소세포 폐암, 수질상피종, 구강암, 유두종증, 중간 분화의 송과체 실질 종양(pineal parenchymal tumors of intermediate differentiation), 뇌하수체 종양, 염색체 15상의 NUT 유전자에 관련된 기도 암종, 척수 종양, 흉선종, 갑상선암, 질암; 외음부암, 및 윌름 종양(Wilms Tumor)을 비롯한 종양 연관 질병으로부터의 항원을 포함한다.
종양 또는 종양 연관 항원의 비-제한적인 예는 아디포필린(Adipophilin), AIM-2, ALDH1A1, BCLX(L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, 사이클린(cyclin) D1, DKK1, ENAH(hMena), EpCAM, EphA3, EZH2, FGF5, 글리피칸(glypican)-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, 장 카르복실 에스테라제(Intestinal carboxyl esterase), 알파-태아단백질, 칼리크레인(Kallikrein) 4, KIF20A, 렝신(Lengsin), M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53, PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, 세세르닌(secernin) 1, SOX10, STEAP1, 설비빈(survivinn), 텔로머라제(Telomerase), VEGF, 또는 WT1, EGF-R, CEA, CD52, gp 100 단백질, MELANA/MART1, NY-ESO-1, p53 MAGE1, MAGE3 및 CDK4, 알파-액티닌-4, ARTC1, BCR-ABL 융합 단백질(b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, 베타-카테닌(beta-catenin), Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, dek-can 융합 단백질, EFTUD2, 연장 인자 2, ETV6-AML1 융합 단백질, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, LDLR-푸코실트랜스퍼라제AS 융합 단백질, NFYC, OGT, OS-9, pml-RAR알파 융합 단백질, PRDX5, PTPRK, K-ras, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SYT-SSX1 또는 -SSX2 융합 단백질, TGF-betaRII, 트리오스포스페이트 이소머라제, 렝신, M-CSF, MCSP, 또는 mdm-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 호흡기 병원균 항원을 인코딩한다. 구체적 실시양태에서, 호흡기 병원균은 바이러스, 예를 들어, RSV, 코로나바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 헨드라 바이러스(hendra virus), 니파 바이러스(nipah virus), 아데노바이러스, 라이노바이러스, 또는 PRRSV이다. 호흡기 바이러스 항원의 비제한적인 예는 호흡기 세포융합 바이러스 F, G 및 M2 단백질, 코로나바이러스(SARS, HuCoV) 스파이크 단백질(S), 인간 메타뉴모바이러스 융합 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 융합 및 헤마글루티닌 단백질(F, HN), 헨드라 바이러스(HeV) 및 니파 바이러스(NiV) 부착 당단백질(G 및 F), 아데노바이러스 캡시드 단백질, 라이노바이러스 단백질, 및 PRRSV 야생형 또는 변형된 GP5 및 M 단백질을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 호흡기 병원균은 세균, 예를 들어, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 마이코박테리움 튜버큘로시스, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 스트렙토코커스 뉴모니애(streptococcus pneumoniae), 예르시니아 페스티스(yersinia pestis), 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus), 프란시셀라 투라렌시스(Francisella tularensis), 레지오넬라 뉴모필라(legionella pneumophila), 클라미디아 뉴모니애(chlamydia pneumoniae), 슈도모나스 아에루기노사(pseudomonas aeruginosa), 나이세리아 메닌지티드(Neiseria meningitides), 및 해모필루스 인플루엔자(haemophilus influenzae)이다. 호흡기 세균 항원의 비-제한적인 예는 바실러스 안트라시스 보호 항원 PA, 마이코박테리움 튜버큘로시스 마이코박테리아 항원 85A 및 열 충격 단백질(Hsp65), 보르데텔라 페르투시스 페르투시스 독소(PT) 및 필라멘트성 헤마글루티닌(FHA), 스트렙토코커스 뉴모니애 소르타제(sortase) A 및 표면 부착 A(PsaA), 예르시니아 페스티스 F1 및 V 서브유닛, 및 스타필로코커스 아우레우스, 프란시셀라 투라렌시스, 레지오넬라 뉴모필라, 클라미디아 뉴모니애, 휴도모나스 아에루기노사, 나이세리아 메닌지티드, 및 해모필루스 인플루엔자로부터의 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF는 T-세포 에피토프를 인코딩한다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 사이토카인 또는 성장 인자를 인코딩한다.
다른 실시양태에서, 이종성 ORF는 자가면역 질병에서 발현된 항원을 인코딩한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 자가면역 질병은 I 형 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 홍반 루푸스, 및 건선일 수 있다. 자가면역 질병 항원의 비-제한적인 예는 Ro60, dsDNA, 또는 RNP를 포함한다.
다른 실시양태에서, ORF는 알러지성 질병에서 발현된 항원을 인코딩한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 알러지성 질병은 계절성 및 지속성 비결막염, 천식, 및 습진을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 알러지 항원의 비-제한적인 예는 Bet v 1 및 Fel d 1을 포함한다.
다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 추가로 리포터 단백질을 포함한다. 리포터 단백질은 본 명세서에 개시된 항원과 동시에 발현될 수 있다. 이상적으로는, 발현은 정상 광 또는 다른 파장의 광에서 가시적이다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질에 의해 생성된 효과의 강도는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 직접적으로 측정하고 모니터하기 위해 이용될 수 있다.
리포터 유전자는 당업자가 쉽게 인식할 것이다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 형광 단백질이다. 다른 실시양태에서, 리포터 유전자는 GFP이다. GFP는 UV 또는 청색 등에 노출될 경우 밝은 녹색광을 방출한다.
리포터 단백질의 비-제한적인 예는 다양한 효소, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는 β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 루시퍼라제 또는 RFP를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 백신접종을 위한 벡터로서 사용하기에 바람직한 특성을 가진다(예를 들어, 섹션 4.6 참고). 다른 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 숙주(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 당나귀, 인간)에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 선천적 면역 반응을 유도한다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 적응 면역 반응을 유도한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 선천적 및 적응 면역 반응 둘 모두를 유도한다.
다른 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 T 세포 반응을 유도한다. 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 CD8+T 세포 반응을 유도한다. 다른 실시양태에서, 관심 외래 유전자를 보유한 피친드 바이러스 입자는 높은 빈도와 기능성의 강력한 CD8+ T 세포 반응을 유도한다. 다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 상응하는 관심 외래 유전자의 하나 또는 다수의 에피토프에 특이적인 CD8+ T 세포를 유도한다.
일부 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 CD4+ T 세포의 T 헬퍼 1 분화, 기억 형성을 유도하고/하거나 지속적인 항체 반응을 유발할 수 있다. 이들 항체는 종양 세포를 중화시키거나, 옵소닌화하거나, 독성이거나 또는 다른 유리한 생물학적 특징을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 이종성 ORF를 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 수지상 세포에 대해 강한 향성을 가지며 감염시에 그들을 활성화시킨다. 이것은 항원 제시 세포에 의한 항원의 제시를 강화한다.
일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 피친드 바이러스에 대한 낮거나 검출불가능한 중화 항체 역가 및 각 외래 트랜스유전자에 대한 높은 보호성 중화 항체 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 형성하는 피친드 바이러스 백본은 피친드 바이러스 백본 성분에 대한 면역을 유도하는 능력이 낮다.
4.4 피친드 바이러스 입자 및 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 생성
일반적으로, 피친드 바이러스 입자는 LCMV, 다른 아레나바이러스를 위해 기술된 표준 역 유전적 기술에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다(Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668; Sanchez et al., 2006, Virology 350:370; Ortiz-Riano et al., 2013, J Gen Virol. 94:1175-88를 참고하며, 본원에 참고로 포함된다). 본 발명에서 제공되는 피친드 바이러스 입자를 생성하기 위하여, 이들 기술은 후술하는 대로 적용될 수 있다. 바이러스의 게놈은 각각 섹션 4.1 및 섹션 4.2에 개시된 대로 변형될 수 있다.
4.4.1 비-천연 위치 개방 해독 프레임
ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 바이러스 ORF를 보유하도록 조작된 게놈 세그먼트를 포함하는 피친드 바이러스 입자의 생성은 당업자에게 알려진 임의의 역 유전적 기술에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다.
(i) 감염성이고 복제 가능한 피친드 바이러스 입자
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법은 (i) 제1 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 숙주 세포내로 형질감염시키고; (ii) 제2 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 숙주 세포내로 형질감염시키고; (iii) 피친드 바이러스의 최소 트랜스-작용성 인자 NP 및 L을 발현하는 플라스미드를 숙주 세포내로 형질감염시키고; (iv) 바이러스 형성에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 유지하고; (v) 피친드 바이러스 입자를 수확하는 것을 포함한다. 일부 더욱 구체적인 실시양태에서, cDNA는 플라스미드에 포함된다.
cDNA로부터 생성되면, 피친드 바이러스 입자(즉, 감염성이고 복제 가능함)는 증식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 본 명세서에 개시된 대로 바이러스의 사용을 허용하는 역가로 바이러스가 성장하도록 하는 임의의 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 피친드 바이러스 입자가 상응하는 야생형을 위해 결정된 것에 견줄만한 역가로 성장하도록 한다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 사용될 수 있는 숙주 세포의 구체적인 예는 BHK-21, HEK 293, VERO 또는 기타를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자는 세포주에서 증식될 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 배양에서 유지되고 하나 이상의 플라스미드(들)로 형질감염된다. 플라스미드(들)는 예를 들어, 폴리머라제 I 프로모터 및 터미네이터로 이루어지는, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 적합한 하나 이상의 발현 카세트의 제어하에서 생성될 피친드 바이러스 게놈 세그먼트(들)를 발현한다.
피친드 바이러스 입자의 생성을 위해 이용될 수 있는 플라스미드는 i) S 게놈 세그먼트, 예를 들어, pol-I S를 인코딩하는 플라스미드, ii) L 게놈 세그먼트, 예를 들어, pol-I L을 인코딩하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 L 및 S 세그먼트의 세포내 합성을 지시하는 피친드 바이러스 폴리머라제를 인코딩하는 플라스미드가 형질감염 혼합물내로 포함될 수 있다. 예를 들어, L 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및/또는 NP를 인코딩하는 플라스미드(각각 pC-L 및 pC-NP)가 존재할 수 있다. L 단백질 및 NP는 바이러스 RNA 전사 및 복제를 위해 필요한 최소의 트랜스-작용성 인자이다. 대안으로서, NP 및 L 단백질과 함께 바이러스 L 및 S 세그먼트의 세포내 합성은 각각 두 개의 별도의 플라스미드의 L 및 S 세그먼트 cDNA로 반대측으로부터 해독하는 pol-I 및 pol-II 프로모터를 가진 발현 카세트를 이용하여 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 프로모터의 제어하에 있다. 전형적으로, RNA 폴리머라제 I-추진 발현 카세트, RNA 폴리머라제 II-추진 카세트 또는 T7 박테리오파아지 RNA 폴리머라제 추진 카세트가 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 플라스미드(들)는 동일할 수 있으며, 즉, 게놈 서열과 트랜스작용 인자가 하나의 플라스미드로부터의 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 프로모터의 구체적인 예는 RNA 폴리머라제 I 프로모터, RNA 폴리머라제 II 프로모터, RNA 폴리머라제 III 프로모터, T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 T3 프로모터를 포함한다.
또한, 플라스미드(들)는 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 위해 적합한 발현 카세트, 예를 들어, 상술한 폴리머라제 II 발현 카세트의 제어하의 포유동물 선택 마커, 예를 들어, 퓨로마이신 내성을 특징으로 할 수 있거나, 또는 바이러스 유전자 전사물(들)에 뇌심근염 바이러스의 것과 같은 내부 리보좀 진입 부위가 이어지고, 그에 이어 포유동물 내성 마커가 뒤따른다. 이. 콜라이(E. coli)에서의 생산을 위해서는, 플라스미드는 부가적으로 앰피실린 내성 카세트와 같은 세균 선택 마커를 특징으로 한다.
플라스미드(들)를 이용한 숙주 세포의 형질감염은 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 일반적으로 사용되는 전략 중 어느 것을 이용하여 수행될 수 있다. 며칠 후 적합한 선택 제제, 예를 들어, 퓨로마이신이 적정된 농도로 첨가된다. 생존하는 클론이 표준 절차를 따라 분리되고 서브클로닝되며, 고-발현 클론은 관심 바이러스 단백질(들)에 대해 유도된 항체를 이용한 웨스턴 블롯 또는 유세포분석 절차를 이용하여 확인된다.
본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자를 회수하기 위하여, 하기 절차가 예상된다. 제1일: 전형적으로 M6-웰 플레이트에서 80% 컨플루언트인 세포를 상술한 대로 플라스미드의 혼합물로 형질감염시킨다. 이를 위하여, 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 임의의 일반적으로 이용되는 전략을 이용할 수 있다.
3-5일 후: 배양된 상등액(피친드 바이러스 벡터 제제)을 수확하고, 분취하고 피친드 바이러스 벡터가 사용전에 얼마나 오랫동안 저장되어야 하는지에 따라 4℃, -20℃, 또는 -80℃에서 저장한다. 피친드 바이러스 벡터 제제의 감염성 역가는 면역초점 분석에 의해 평가된다. 대안적으로, 형질감염된 세포와 상등액이 형질감염 후 제3-5일에 더 큰 용기(예를 들어, T75 조직 배양 플라스크)로 계대될 수 있으며, 배양 상등액은 계대 후 최대 5일에 수확된다.
본 출원은 추가로 이종성 ORF의 발현에 관련되며, 게놈 세그먼트를 인코딩하는 플라스미드는 이종성 ORF를 통합하도록 변형된다. 이종성 ORF는 제한 효소를 이용하여 플라스미드내로 통합될 수 있다.
(ii) 감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스 입자
감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스 입자는 상술한 대로 구조될 수 있다. 하지만, 일단 cDNA로부터 생성되면, 본 발명에서 제공되는 감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스는 보완성 세포에서 증식될 수 있다. 보완성 세포는 그의 게놈의 변형에 의해 복제-결핍성 피친드 바이러스로부터 제거된 기능성을 제공하는 세포이다(예를 들어, 만일 GP 단백질을 인코딩하는 ORF가 결실되거나 기능적으로 불활성화되면, 보완성 세포는 GP 단백질을 제공한다).
피친드 바이러스 벡터에서 ORF 중 하나 이상의 제거 또는 기능적 불활성화(여기서는 당단백질 GP의 결실을 예로 들것이다)로 인하여, 피친드 바이러스 벡터는 결실된 바이러스 유전자(들), 예를 들어, 본 예에서는 GP를 트랜스로(in trans) 제공하는 세포에서 생성되고 증식될 수 있다. 이후로 C-세포로 불리는, 그러한 보완성 세포주는 관심 바이러스 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 플라스미드(들)(C-플라스미드로 불리는 보완 플라스미드)로 BHK-21, HEK 293, VERO 또는 기타와 같은 세포주를 형질감염시킴으로써 생성된다. C-플라스미드(들)는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 적합한 하나 이상의 발현 카세트, 예를 들어, 포유동물 폴리머라제 II 프로모터, 예를 들어, 폴리아데닐화 시그널을 가진 EF1alpha 프로모터의 제어하에서 생성될 피친드 바이러스 벡터에서 결실된 바이러스 유전자(들)를 발현한다. 또한, 보완 플라스미드는 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 위해 적합한 발현 카세트, 예를 들어, 상술한 폴리머라제 II 발현 카세트의 제어하의 포유동물 선택 마커, 예를 들어, 퓨로마이신 내성을 특징으로 하거나, 또는 바이러스 유전자 전사물(들)에 뇌심근염 바이러스의 것과 같은 내부 리보좀 진입 부위가 이어지고, 그에 이어 포유동물 내성 마커가 뒤따른다. 이. 콜라이에서의 생산을 위해서는, 플라스미드는 부가적으로 앰피실린 내성 카세트와 같은 세균 선택 마커를 특징으로 한다.
사용될 수 있는 세포, 예를 들어, BHK-21, HEK 293, MC57G 또는 다른 것은 배양에서 유지되고 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 일반적으로 사용되는 전략 중 어느 것을 이용하여 보완 플라스미드(들)로 형질감염된다. 며칠 후 적합한 선택 제제, 예를 들어, 퓨로마이신이 적정된 농도로 첨가된다. 생존하는 클론이 표준 절차를 따라 분리되고 서브클로닝되며, 고-발현 C-세포 클론은 관심 바이러스 단백질(들)에 대해 유도된 항체를 이용한 웨스턴 블롯 또는 유세포분석 절차를 이용하여 확인된다. 안정하게 형질감염된 C-세포의 사용에 대한 대안으로서 정상 세포의 일시적 형질감염이 C-세포가 사용될 하기 단계의 각각에서 없어진 바이러스 유전자(들)를 보완할 수 있다. 또한, 헬퍼 바이러스가 없어진 기능성을 트랜스로 제공하기 위하여 이용될 수 있다.
플라스미드는 두 가지 타입일 수 있다: i) 예를 들어, 본 예에서 피친드 바이러스의 NP 및 L 단백질로부터 유래되는 피친드 바이러스의 최소 트랜스작용 인자를 C-세포에서 세포내로 발현하기 위한 TF-플라스미드로 불리는 두 플라스미드; 및 ii) C-세포에서 피친드 바이러스 벡터 게놈 세그먼트, 예를 들어, 설계된 변형을 가진 세그먼트를 세포내로 발현하기 위한, GS-플라스미드로 불리는, 플라스미드. TF-플라스미드는 포유동물 세포에서의 단백질 발현을 위해 적합한 발현 카세트, 전형적으로 예를 들어, 그들 중 하나는 우선적으로 폴리아데닐화 시그널과 조합되는 CMV 또는 EF1alpha 프로모터와 같은 포유동물 폴리머라제 II 프로모터의 제어하에 각 피친드 바이러스 벡터의 NP 및 L 단백질을 발현한다. GS-플라스미드는 벡터의 작은(S) 및 큰(L) 게놈 세그먼트를 발현한다. 전형적으로, 폴리머라제 I-추진 발현 카세트 또는 T7 박테리오파아지 RNA 폴리머라제(T7-) 추진 발현 카세트가 이용될 수 있으며, 후자는 우선적으로 정확한 단부를 생성하기 위하여 일차 전사물의 프로세싱을 위한 3'-말단 리보자임을 가진다. T7-계 시스템을 이용하는 경우에는, C-세포에서 T7의 발현은 회수 과정에서 TF-플라스미드와 유사하게 제작된 추가의 발현 플라스미드를 포함시켜 T7을 제공함으로서 제공되어야 하거나, 또는 C-세포가 안정한 방식으로 T7을 추가적으로 발현하도록 제작된다. 일부 실시양태에서, TF 및 GS 플라스미드는 동일할 수 있으며, 즉, 게놈 서열과 트랜스작용 인자는 하나의 플라스미드로부터 T7, polI 및 polII 프로모터에 의해 전사될 수 있다.
피친드 바이러스 벡터의 회수를 위하여, 하기 절차가 이용될 수 있다. 제1일: M6-웰 플레이트에서 전형적으로 80% 컨플루언트인 C-세포가 2개의 TF-플라스미드 + 2개의 GS-플라스미드의 혼합물로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, TF 및 GS 플라스미드는 동일할 수 있으며, 즉, 게놈 서열과 트랜스작용 인자가 하나의 플라스미드로부터 T7, polI 및 polII 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 이를 위하여, 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 임의의 일반적으로 이용되는 전략을 이용할 수 있다.
3-5일 후: 배양 상등액(피친드 바이러스 벡터 제제)을 수확하고, 분취하고 피친드 바이러스 벡터가 사용전에 얼마나 오랫동안 저장되어야 하는지에 따라 4℃, -20℃ 또는 -80℃에서 저장한다. 그 후, 피친드 바이러스 벡터 제제의 감염성 역가는 C-세포에서의 면역초점 분석에 의해 평가된다. 대안적으로, 형질감염된 세포와 상등액이 형질감염 후 제3-5일에 더 큰 용기(예를 들어, T75 조직 배양 플라스크)로 계대될 수 있으며, 배양 상등액은 계대 후 최대 5일에 수확된다.
본 발명은 추가로 항원을 발현하는 감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스로 감염되는 세포 배양물에서 항원의 발현에 관련된다. 배양된 세포에서 항원의 발현을 위해 이용될 경우, 하기 두 절차가 이용될 수 있다:
i) 관심 세포 타입이 1 또는 더 많은, 예를 들어, 2, 3 또는 4의 감염 다중도(MOI)로 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 벡터 제제로 감염되어, 감염 후 곧 이미 모든 세포에서 항원의 생산을 야기한다.
ii) 대안적으로, 더 낮은 MOI가 사용될 수 있으며 개별 세포 클론이 바이러스로 추진된 항원 발현의 그들의 수준에 대해 선택될 수 있다. 후속하여 개별 클론은 피친드 바이러스 벡터의 비-세포용해 특성으로 인하여 무제한 증식될 수 있다. 접근법에 관계없이, 항원은 생산된 항원의 특성에 따라, 후속하여 배양 상등액으로부터 또는 세포 자체로부터 수집(및 정제)될 수 있다. 하지만, 본 발명은 이들 두 전략에 제한되지 않으며, 벡터로서 감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스를 이용하여 항원의 발현을 추진하는 다른 방식이 고려될 수 있다.
4.4.2 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 생성
3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 예를 들어, 참고로 본원에 포함되는 Emonet et al., 2008, PNAS, 106(9):3473-3478; Popkin et al., 2011, J. Virol., 85 (15):7928-7932; Dhanwani et al., 2015, Journal of Virology, doi:10.1128/JVI.02705-15에 의해 개시된 대로, 당업계에 알려진 역 유전적 기술에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 생성은 섹션 4.2에 개시된 대로 변형될 수 있다.
(i) 감염성이고 복제 가능한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법은 (i) 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트의 cDNA를 숙주 세포내로 형질감염시키고; (ii) 피친드 바이러스의 최소 트랜스-작용 인자 NP 및 L을 발현하는 플라스미드를 숙주 세포내로 형질감염시키고; (iii) 숙주 세포를 바이러스 형성을 위해 적합한 조건하에서 유지하고; (iv) 피친드 바이러스 입자를 수확하는 것을 포함한다.
일단 cDNA로부터 생성되면, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자(즉, 감염성이고 복제 가능)는 증식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 본 명세서에 개시된 대로 바이러스의 사용을 허용하는 역가로 바이러스가 성장하도록 하는 임의의 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 상응하는 야생형을 위해 결정된 것에 견줄만한 역가로 성장하도록 한다.
일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 사용될 수 있는 숙주 세포의 구체적인 예는 BHK-21, HEK 293 또는 기타를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 세포주에서 증식될 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 배양에서 유지되고 하나 이상의 플라스미드(들)로 형질감염된다. 플라스미드(들)는 예를 들어, 폴리머라제 I 프로모터 및 터미네이터로 이루어지는, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 적합한 하나 이상의 발현 카세트의 제어하에서 생성될 피친드 바이러스 게놈 세그먼트(들)를 발현한다.
구체적 실시양태에서, 숙주 세포는 배양에서 유지되고 하나 이상의 플라스미드(들)로 형질감염된다. 플라스미드(들)는 예를 들어, 폴리머라제 I 프로모터 및 터미네이터로 이루어지는, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 적합한 하나 이상의 발현 카세트의 제어하에서 생성될 바이러스 유전자(들)를 발현한다.
하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스의 생성을 위해 이용될 수 있는 플라스미드는 i) 각각 S 게놈 세그먼트, 예를 들어, pol-I-PIC-S를 인코딩하는 2개의 플라스미드, ii) L 게놈 세그먼트, 예를 들어, pol-I-PIC-L을 인코딩하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 포함하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스를 위해 필요한 플라스미드는 i) 각각 L 게놈 세그먼트, 예를 들어, pol-I-PIC-L을 인코딩하는 2개의 플라스미드, ii) S 게놈 세그먼트, 예를 들어, pol-I-PIC-S를 인코딩하는 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 L 및 S 세그먼트의 세포내 합성을 지시하는 피친드 바이러스 폴리머라제를 인코딩하는 플라스미드는 형질감염 혼합물내로 포함될 수 있다. 예를 들어, L 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및 NP를 인코딩하는 플라스미드(각각 pC-PIC-L 및 pC-PIC-NP). L 단백질 및 NP는 바이러스 RNA 전사 및 복제를 위해 필요한 최소의 트랜스-작용성 인자이다. 대안으로서, NP 및 L 단백질과 함께 바이러스 L 및 S 세그먼트의 세포내 합성이 각각 두 개의 별도의 플라스미드의 L 및 S 세그먼트 cDNA로 반대측으로부터 해독하는 pol-I 및 pol-II 프로모터를 가진 발현 카세트를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 플라스미드(들)는 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 위해 적합한 발현 카세트, 예를 들어, 상술한 폴리머라제 II 발현 카세트의 제어하의 포유동물 선택 마커, 예를 들어, 퓨로마이신 내성을 특징으로 하거나, 또는 바이러스 유전자 전사물(들)에 뇌심근염 바이러스의 것과 같은 내부 리보좀 진입 부위가 이어지고, 그에 이어 포유동물 내성 마커가 뒤따른다. 이. 콜라이에서의 생산을 위해서는, 플라스미드는 부가적으로 앰피실린 내성 카세트와 같은 세균 선택 마커를 특징으로 한다.
BHK-21 세포를 플라스미드(들)로 형질감염시키는 것은 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 일반적으로 사용되는 전략 중 어느 것을 이용하여 수행될 수 있다. 며칠 후 적합한 선택 제제, 예를 들어, 퓨로마이신이 적정된 농도로 첨가된다. 생존하는 클론이 표준 절차를 따라 분리되고 서브클로닝되며, 고-발현 클론은 관심 바이러스 단백질(들)에 대해 유도된 항체를 이용한 웨스턴 블롯 또는 유세포분석 절차를 이용하여 확인된다.
전형적으로, RNA 폴리머라제 I-추진 발현 카세트, RNA 폴리머라제 II-추진 카세트 또는 T7 박테리오파아지 RNA 폴리머라제 추진 카세트가 사용될 수 있으며, 후자는 우선적으로 정확한 단부를 생성하기 위하여 일차 전사물의 프로세싱을 위한 3'-말단 리보자임을 가진다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 플라스미드는 동일할 수 있으며, 즉, 게놈 서열과 트랜스작용 인자는 하나의 플라스미드로부터 T7, polI 및 polII 프로모터에 의해 전사될 수 있다.
피친드 바이러스 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 벡터를 회수하기 위하여, 하기 절차가 예상된다. 제1일: 전형적으로 M6-웰 플레이트에서 80% 컨플루언트인 세포를 상술한 대로 플라스미드의 혼합물로 형질감염시킨다. 이를 위하여, 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 임의의 일반적으로 이용되는 전략을 이용할 수 있다.
3-5일 후: 배양된 상등액(피친드 바이러스 벡터 제제)을 수확하고, 분취하고 피친드 바이러스 벡터가 사용전에 얼마나 오랫동안 저장되어야 하는지에 따라 4℃, -20℃, 또는 -80℃에서 저장한다. 피친드 바이러스 벡터 제제의 감염성 역가는 면역초점 분석에 의해 평가된다. 대안적으로, 형질감염된 세포와 상등액이 형질감염 후 제3-5일에 더 큰 용기(예를 들어, T75 조직 배양 플라스크)로 계대될 수 있으며, 배양 상등액은 계대 후 최대 5일에 수확된다.
본 출원은 이종성 ORF 및/또는 관심 유전자의 발현에 관련되며, 이때 게놈 세그먼트를 인코딩하는 플라스미드는 이종성 ORF 및/또는 관심 유전자를 포함하도록 변형된다. 이종성 ORF 및/또는 관심 유전자는 제한 효소를 이용하여 플라스미드내로 통합될 수 있다.
(ii) 감염성이고 복제-결핍성인 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
감염성이고 복제-결핍성인 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 상술한 대로 구조될 수 있다. 하지만, 일단 cDNA로부터 생성되면, 본 발명에서 제공되는 감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스는 보완성 세포에서 증식될 수 있다. 보완성 세포는 그의 게놈의 변형에 의해 복제-결핍성 피친드 바이러스로부터 제거된 기능성을 제공하는 세포이다(예를 들어, 만일 GP 단백질을 인코딩하는 ORF가 결실되거나 기능적으로 불활성화되면, 보완성 세포는 GP 단백질을 제공한다).
피친드 바이러스 벡터에서 ORF 중 하나 이상의 제거 또는 기능적 불활성화(여기서는 당단백질 GP의 결실을 예로 들것이다)로 인하여, 피친드 바이러스 벡터는 결실된 바이러스 유전자(들), 예를 들어, 본 예에서는 GP를 트랜스로 제공하는 세포에서 생성되고 증식될 수 있다. 이후로 C-세포로 불리는, 그러한 보완성 세포주는 관심 바이러스 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 플라스미드(들)(C-플라스미드로 불리는 보완 플라스미드)로 BHK-21, HEK 293, VERO 또는 기타와 같은 포유동물 세포주(여기서는 BHK-21을 예로 듬)를 형질감염시킴으로써 생성된다. C-플라스미드(들)는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 적합한 하나 이상의 발현 카세트, 예를 들어, 포유동물 폴리머라제 II 프로모터, 예를 들어, 폴리아데닐화 시그널을 가진 CMV 또는 EF1alpha 프로모터의 제어하에서 생성될 피친드 바이러스 벡터에서 결실된 바이러스 유전자(들)를 발현한다. 또한, 보완 플라스미드는 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 위해 적합한 발현 카세트, 예를 들어, 상술한 폴리머라제 II 발현 카세트의 제어하의 포유동물 선택 마커, 예를 들어, 퓨로마이신 내성을 특징으로 하거나, 또는 바이러스 유전자 전사물(들)에 뇌심근염 바이러스의 것과 같은 내부 리보좀 진입 부위가 이어지고, 그에 이어 포유동물 내성 마커가 뒤따른다. 이. 콜라이에서의 생산을 위해서는, 플라스미드는 부가적으로 앰피실린 내성 카세트와 같은 세균 선택 마커를 특징으로 한다.
사용될 수 있는 세포, 예를 들어, BHK-21, HEK 293, MC57G 또는 기타는 배양에서 유지되며 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 일반적으로 사용되는 전략 중 어느 것을 이용하여 보완 플라스미드(들)로 형질감염된다. 며칠 후 적합한 선택 제제, 예를 들어, 퓨로마이신이 적정된 농도로 첨가된다. 생존하는 클론이 표준 절차를 따라 분리되고 서브클로닝되며, 고-발현 C-세포 클론은 관심 바이러스 단백질(들)에 대해 유도된 항체를 이용한 웨스턴 블롯 또는 유세포분석 절차를 이용하여 확인된다. 안정하게 형질감염된 C-세포의 사용에 대한 대안으로서 정상 세포의 일시적 형질감염이 C-세포가 사용될 하기 단계의 각각에서 없어진 바이러스 유전자(들)를 보완할 수 있다. 또한, 헬퍼 바이러스는 없어진 기능성을 트랜스로 제공하기 위하여 이용될 수 있다.
두 가지 타입의 플라스미드가 사용될 수 있다: i) 예를 들어, 본 예에서 피친드 바이러스의 NP 및 L 단백질로부터 유래되는 피친드 바이러스의 최소 트랜스작용 인자를 C-세포에서 세포내로 발현하기 위한 TF-플라스미드로 불리는 두 플라스미드; 및 ii) C-세포에서 피친드 바이러스 벡터 게놈 세그먼트, 예를 들어, 설계된 변형을 가진 세그먼트를 세포내로 발현하기 위한, GS-플라스미드로 불리는, 플라스미드. TF-플라스미드는 포유동물 세포에서의 단백질 발현을 위해 적합한 발현 카세트, 전형적으로 예를 들어, 그들 중 하나는 우선적으로 폴리아데닐화 시그널과 조합되는 CMV 또는 EF1alpha 프로모터와 같은 포유동물 폴리머라제 II 프로모터의 제어하에 각 피친드 바이러스 벡터의 NP 및 L 단백질을 발현한다. GS-플라스미드는 벡터의 작은(S) 및 큰(L) 게놈 세그먼트를 발현한다. 전형적으로, 폴리머라제 I-추진 발현 카세트 또는 T7 박테리오파아지 RNA 폴리머라제(T7-) 추진 발현 카세트가 이용될 수 있으며, 후자는 정확한 단부를 생성하기 위하여 일차 전사물의 프로세싱을 위한 3'-말단 리보자임을 우선적으로 가진다. T7-계 시스템을 이용하는 경우에는, C-세포에서 T7의 발현은 회수 과정에서 TF-플라스미드와 유사하게 제작된 추가의 발현 플라스미드를 포함시켜 T7을 제공함으로서 제공되어야 하거나, 또는 C-세포가 안정한 방식으로 T7을 추가적으로 발현하도록 제작된다. 일부 실시양태에서, TF 및 GS 플라스미드는 동일할 수 있으며, 즉, 게놈 서열과 트랜스작용 인자가 하나의 플라스미드로부터 T7, polI 및 polII 프로모터에 의해 전사될 수 있다.
피친드 바이러스 벡터를 회수하기 위하여, 하기 절차가 이용될 수 있다. 제1일: 전형적으로 M6-웰 플레이트에서 80% 컨플루언트인 C-세포를 2개의 TF-플라스미드 + 2개의 GS-플라스미드의 혼합물로 형질감염시킨다. 일부 실시양태에서, TF 및 GS 플라스미드는 동일할 수 있으며, 즉, 게놈 서열과 트랜스작용 인자가 하나의 플라스미드로부터 T7, polI 및 polII 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 이를 위하여, 칼슘-포스페이트, 리포좀계 프로토콜 또는 전기천공과 같은 임의의 일반적으로 이용되는 전략을 이용할 수 있다.
3-5일 후: 배양 상등액(피친드 바이러스 벡터 제제)을 수확하고, 분취하고 피친드 바이러스 벡터가 사용전에 얼마나 오랫동안 저장되어야 하는지에 따라 4℃, -20℃ 또는 -80℃에서 저장한다. 그 후, 피친드 바이러스 벡터 제제의 감염성 역가는 C-세포에서의 면역초점 분석에 의해 평가된다. 대안적으로, 형질감염된 세포와 상등액이 형질감염 후 제3-5일에 더 큰 용기(예를 들어, T75 조직 배양 플라스크)로 계대될 수 있으며, 배양 상등액은 계대 후 최대 5일에 수확된다.
본 발명은 추가로 항원을 발현하는 감염성이고 복제-결핍성인 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스로 감염되는 세포 배양물에서 항원의 발현에 관련된다. 배양된 세포에서 CMV 항원의 발현을 위해 사용될 경우, 하기 두 절차가 이용될 수 있다:
i) 관심 세포 타입이 1 또는 더 많은, 예를 들어, 2, 3 또는 4의 감염 다중도(MOI)로 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 벡터 제제로 감염되어, 감염 후 곧 이미 모든 세포에서 항원의 생산을 야기한다.
ii) 대안적으로, 더 낮은 MOI가 사용될 수 있으며 개별 세포 클론이 바이러스로 추진된 항원 발현의 그들의 수준에 대해 선택될 수 있다. 후속하여 개별 클론은 피친드 바이러스 벡터의 비-세포용해 특성으로 인하여 무제한 증식될 수 있다. 접근법에 관계없이, 항원은 생산된 항원의 특성에 따라, 후속하여 배양 상등액으로부터 또는 세포 자체로부터 수집(및 정제)될 수 있다. 하지만, 본 발명은 이들 두 전략에 제한되지 않으며, 벡터로서 감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스를 이용하여 CMV 항원의 발현을 추진하는 다른 방식이 고려될 수 있다.
4.5 핵산, 벡터 시스템 및 세포주
일부 실시양태에서, 본 발명은 각각 섹션 4.1 및 섹션 4.2에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함하거나 이로 이루어지는 cDNA를 제공한다.
4.5.1 비-천연 위치 개방 해독 프레임
일 실시양태에서, 본 발명은 섹션 4.1에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 개시된 DNA 뉴클레오티드 서열 또는 DNA 뉴클레오티드 서열 세트를 제공한다. 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포 또한 섹션 4.1에서 제공된다.
구체적 실시양태에서, ORF의 야생형 위치 외의 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA가 본 발명에서 제공되며, 피친드 바이러스 게놈 세그먼트는 섹션 4.1에 개시된 이종성 ORF를 인코딩한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 ORF의 야생형 위치 외의 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트를 인코딩하는 DNA 발현 벡터 시스템을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 벡터가 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자의 2개의 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 즉, L 세그먼트 및 S 세그먼트를 인코딩하는 DNA 발현 벡터 시스템을 제공한다. 그러한 벡터 시스템은 (하나 이상의 분리된 DNA 분자를) 인코딩할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 DNA 발현 시스템의 일부이거나 그안에 통합되는, 야생형 위치 외의 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 S 세그먼트의 cDNA를 제공한다. 다른 실시양태에서, 야생형 위치 외의 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 L 세그먼트의 cDNA는 DNA 발현 시스템의 일부이거나 그안에 통합된다. 일부 실시양태에서, (i) ORF의 야생형 위치 외의 다른 위치의 ORF를 보유하도록 조작되었고; 및 (ii) GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스가 아닌 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 cDNA는 피친드 바이러스의 특정 균주로부터 유래될 수 있다. 피친드 바이러스의 균주는 문치크 CoAn4763 분리물 P18 및 그들의 유도체, P2 및 그들의 유도체를 포함하거나, 또는 트라피도와 동료들에 의해 개시된 여러 분리물 중 임의의 것으로부터 유래된다(Trapido et al, 1971, Am J Trop Med Hyg, 20: 631-641). 구체적 실시양태에서, cDNA는 피친드 바이러스 문치크 CoAn4763 분리물 P18 균주로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 인코딩하기 위해 생성된 벡터는 피친드 바이러스의 특정 균주에 기초할 수 있다. 피친드 바이러스의 균주는 문치크 CoAn4763 분리물 P18 및 그들의 유도체, P2 및 그들의 유도체를 포함하거나, 또는 트라피도와 동료들에 의해 개시된 여러 분리물 중 임의의 것으로부터 유래된다(Trapido et al, 1971, Am J Trop Med Hyg, 20: 631-641). 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 피친드 바이러스 문치크 CoAn4763 분리물 P18 균주에 기초할 수 있다. 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18의 S 세그먼트의 서열은 서열 번호 1로서 열거된다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18의 S 세그먼트의 서열은 서열 번호 1에 개시된 서열이다. 피친드 바이러스의 L 세그먼트의 서열은 서열 번호 2로서 열거된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 섹션에서 상술한 cDNA 또는 벡터 시스템을 포함하는 세포를 제공한다. 그러한 세포로부터 유래된 세포주, 그러한 세포를 포함하는 배양물, 감염된 그러한 세포를 배양하는 방법 또한 본 발명에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트의 cDNA를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 S 세그먼트 및/또는 L 세그먼트를 포함한다.
4.5.2 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자
일 실시양태에서, 본 발명은 섹션 4.2에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, 표 2 또는 표 3에 개시된 DNA 뉴클레오티드 서열 또는 DNA 뉴클레오티드 서열 세트를 제공한다. 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포 또한 섹션 4.2에서 제공된다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA로 이루어지는 cDNA를 제공한다. 다른 실시양태에서, (i) ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 피친드 바이러스 ORF를 보유하도록 조작되었고; (ii) 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 섹션 4.2에 개시된 이종성 ORF를 인코딩하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 함께 인코딩하는 DNA 발현 벡터 시스템을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 벡터가 본 명세서에 개시된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 3개의 피친드 바이러스 게놈 세그먼트, 즉, 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트 또는 2개의 L 세그먼트와 하나의 S 세그먼트를 인코딩하는 DNA 발현 벡터 시스템을 제공한다. 그러한 벡터 시스템은 (하나 이상의 분리된 DNA 분자)를 인코딩할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작되었고 DNA 발현 시스템의 일부이거나 그안에 통합되는 피친드 바이러스 S 세그먼트(들)의 cDNA를 제공한다. 다른 실시양태에서, 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 L 세그먼트(들)의 cDNA는 DNA 발현 시스템의 일부이거나 그안에 통합된다. 일부 실시양태에서, (i) ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치의 ORF를 보유하도록 조작되었으며; 및 (ii) GP, NP, Z 단백질, 또는 L 단백질을 인코딩하는 ORF가 제거되고 피친드 바이러스 외의 다른 유기체로부터의 이종성 ORF로 치환된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 cDNA는 피친드 바이러스의 특정 균주로부터 유래될 수 있다. 피친드 바이러스의 균주는 문치크 CoAn4763 분리물 P18 및 그들의 유도체, P2 및 그들의 유도체를 포함하거나, 또는 트라피도와 동료들에 의해 개시된 여러 분리물 중 임의의 것으로부터 유래된다(Trapido et al, 1971, Am J Trop Med Hyg, 20: 631-641). 구체적 실시양태에서, cDNA는 피친드 바이러스 문치크 CoAn4763 분리물 P18 균주로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 인코딩하기 위해 생성된 벡터는 피친드 바이러스의 특정 균주에 기초할 수 있다. 피친드 바이러스의 균주는 문치크 CoAn4763 분리물 P18 및 그들의 유도체, P2 및 그들의 유도체를 포함하거나, 또는 트라피도와 동료들에 의해 개시된 여러 분리물 중 임의의 것으로부터 유래된다(Trapido et al, 1971, Am J Trop Med Hyg, 20: 631-641). 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 피친드 바이러스 문치크 CoAn4763 분리물 P18 균주에 기초할 수 있다. 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18의 S 세그먼트의 서열은 서열 번호 1로서 열거된다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18의 S 세그먼트의 서열은 서열 번호 1에 개시된 서열이다. 피친드 바이러스의 L 세그먼트의 서열은 서열 번호 2로서 열거된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 섹션에서 상술한 cDNA 또는 벡터 시스템을 포함하는 세포를 제공한다. 그러한 세포로부터 유래된 세포주, 그러한 세포를 포함하는 배양물, 감염된 그러한 세포를 배양하는 방법 또한 본 발명에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 cDNA를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 S 세그먼트 및/또는 L 세그먼트를 포함한다.
4.6 사용 방법
백신은 폴리오 바이러스 및 홍역을 위한 것과 같이, 전염성 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 성공적이었다. 하지만, 만성 감염 및 암 둘 모두를 비롯한 확립된 만성 질병의 상황에서 치료적 면역은 덜 성공적이었다. 피친드 바이러스 입자 및/또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 능력은 새로운 백신 전략을 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된, 한가지 이상 타입의 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 감염 및/또는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염 및/또는 암을 치료하는 방법은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 대상은 포유동물, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는 인간, 마우스, 래트, 기니피그, 가축동물, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 고양이, 개, 햄스터, 당나귀일 수 있다. 구체적 실시양태에서, 대상은 인간이다. 인간 대상은 남성, 여성, 성인, 소아, 노인(65세 이상), 및 다수 질병을 가진 사람들(즉, 다수병을 가진 대상)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상은 화학요법, 방사선요법, 수술 및/또는 생물 제제를 이용한 치료 후 병이 진행된 사람들이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠 으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물이 투여되는 대상은 감염, 암 발생 또는 알러지를 갖거나 그에 민감하거나 또는 그 위험이 있거나, 또는 전암 조직 병변을 나타낸다. 다른 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물이 투여되는 대상은 감염, 암, 전암 조직 병변, 또는 알러지로 감염되거나, 그에 민감하거나, 그 위험이 있거나, 또는 그로 진단된다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠 으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물이 투여되는 대상은 다른 것중에서도 폐기관계, 중추신경계, 림프계, 위장관계, 또는 순환계에서 감염, 암, 전암 병변, 또는 알러지를 앓고 있거나, 그에 민감하거나, 또는 그 위험이 있다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물이 투여되는 대상은 뇌, 간, 폐, 눈, 귀, 장, 식도, 자궁, 비인두 또는 침샘을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신체의 하나 이상의 장기에서 감염, 암 또는 알러지를 앓고 있거나, 그에 민감하거나, 또는 그 위험이 있다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물이 투여되는 대상은 열, 식은 땀, 피곤함, 불쾌감, 거북함, 인후염, 임파선염(swollen glands), 연골 통증, 근육통, 식욕부진, 체중 감소, 설사, 위장 궤양, 위장 출혈, 숨이 참, 결핵, 구강염, 시력 이상, 간염, 황달, 뇌염, 발작, 혼수상태, 가려움증, 홍반, 과색소침착, 림프절 변화, 또는 청각 상실을 포함하지만 이에 제한되지 않는 증상을 앓고 있는 대상이다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 감염, 암 또는 알러지를 앓거나, 그에 민감하거나, 그 위험이 있는 임의의 연령군의 대상에게 투여된다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 손상된 면역계를 가진 대상, 임신한 대상, 장기 또는 골수 이식중인 대상, 면역억제 약물을 섭취하고 있는 대상, 혈액투석을 진행중인 대상, 암에 걸린 대상, 또는 감염, 암 또는 알러지를 앓고 있거나, 그에 민감하거나, 또는 그 위험이 있는 대상에게 투여된다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 감염, 암 또는 알러지를 앓고 있거나, 그에 민감하거나, 또는 그 위험이 있는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 또는 17세의 아동인 대상에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 감염, 암 또는 알러지를 앓고 있거나, 그에 민감하거나, 또는 그 위험이 있는 유아인 대상에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 감염, 암 또는 알러지를 앓고 있거나, 그에 민감하거나, 또는 그 위험이 있는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 연령의 유아인 대상에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 감염, 암 또는 알러지를 앓고 있거나, 그에 민감하거나, 또는 그 위험이 있는 노인 대상에게 투여된다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 또는 90세 연령의 고령자 대상인 대상에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 파종성 감염(disseminated infection), 암, 또는 알러지의 위험이 높아진 대상에게 투여된다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 신생아이며 따라서 미성숙 면역계를 가진 신생아기의 대상에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 휴면기 감염, 암 또는 알러지를 가진 대상에게 투여된다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 면역계 손상시에 재활성화할 수 있는 휴면기 감염, 휴면기 암, 또는 휴면기 알러지를 가진 대상에게 투여된다. 따라서, 본 발명은 감염, 암 또는 알러지의 재활성화를 예방하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 재발 감염, 암 또는 알러지를 가진 대상에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 감염, 암 또는 알러지에 대한 유전적 소인을 가진 대상에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 대상에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 위험 인자를 가진 대상에게 투여된다. 예시적인 위험 인자는 노화, 담배, 태앙광 노출, 방사선 노출, 화학적 노출, 가족력, 알콜, 빈약한 식사, 신체 활동의 부족, 또는 과체중을 포함한다.
다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 투여는 증상을 보이는 감염, 암 또는 알러지를 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 투여는 무증상 감염, 암 또는 알러지를 감소시킨다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 인플루엔자 바이러스, 전염성 F낭병 바이러스, 로타바이러스, 전염성 기관지염 바이러스, 전염성 후두기관염 바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 마렉 병(Marek's disease) 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 아데노바이러스, 또는 조류 폐렴바이러스, SARS-야기 바이러스, 인간 호흡기세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 인간 파라인플루엔자 3 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 웨스트 나일병 바이러스(West Nile disease virus), 일본 뇌염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 한타바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스(Rift Valley fever virus), 랏사 열 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 황열 바이러스 중 하나 이상의 균주로 감염된 대상 또는 동물에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 암으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 한가지 이상의 타입의 암을 앓고 있는 대상에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 백신을 이용한 치료에 민감한 임의의 타입의 암이 타겟이 될 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 암으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 예를 들어, 흑색종, 전립선 암종, 유방 암종, 폐 암종, 신경모세포종, 간세포 암종, 자궁경부 암종, 및 위 암종, 버킷 림프종; 비호킨스 림프종; 호킨스 림프종; 비인두 암종(코 뒤의 인후의 상부의 암), 백혈병, 점막-연관 림프 조직 림프종을 앓고 있는 대상에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 하나 이상의 알러지를 앓고 있는 대상에게 투여된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 예를 들어, 계절성 알러지, 지속성 알러지, 비결막염, 천식, 습진, 음식 알러지를 앓고 있는 대상에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물을 대상에게 투여하는 것은 감염, 암, 또는 알러젠에 대한 세포-매개 면역(CMI)을 부여한다. 이론에 구애됨없이, 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물은 주요 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I과 II에 대한 항원의 직접적인 제시를 위해 숙주의 항원 제시 세포(APC)(예를 들어, 대식세포, 수지상 세포, 또는 B 세포)에서 관심 항원을 감염시키고 발현한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물을 대상에게 투여하는 것은 감염, 암 또는 알러지를 치료하거나 예방하기 위하여 다기능성 세포용해 및 높은 규모의 IFN-γ 및 TNF-α 동시-생산 CMV-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도한다.
다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물을 투여하는 것은, 그러한 치료의 부재하에서 감염, 암 또는 알러지를 일으킬 위험에 비하여, 개인이 감염, 암, 알러지를 일으킬 위험을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 더 많이 감소시킨다.
다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물을 투여하는 것은, 그러한 치료의 부재하에서 감염, 암, 알러지의 증상의 징후에 비하여, 감염, 암 또는 알러지의 증상을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 더 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 바람직하게는 여러번의 주사로(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50회 주사) 또는 다수 부위에서(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 14 부위) 연속 주입에 의해(예를 들어, 펌프를 이용하여) 투여된다. 일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 6-개월 기간, 12-개월 기간, 24-개월 기간, 또는 48-개월 기간에 걸쳐서 2회 이상의 별도의 주사로 투여된다. 일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 선택된 날짜에 제1 용량, 제1 용량 후 적어도 2개월에 제2 용량, 그리고 제1 용량 후 6개월에 제3 용량으로 투여된다.
일 예에서, 피부 주사는 국소 피부 반응의 정도를 감소시키기 위하여 다수의 신체 부위에서 수행된다. 주어진 백신접종일에, 환자는 용량(예를 들어, 적어도 0.4 ml, 0.2 ml, 또는 0.1 ml)의 3 내지 5회의 분리된 피내 주사로 하나의 시린지로부터 투여되는 할당된 총 세포 용량이 주어지며 각 주사는 가장 가까운 인접 주사로부터의 바늘 진입에서 적어도 약 5 cm(예를 들어, 적어도 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 그 이상 cm) 간격을 가진 손발에서 주어진다. 후속 백신접종일에, 주사 부위는 시계방향 또는 반시계방향으로 상이한 사지로 회전된다.
다른 실시양태에서, 신생아 그리고 따라서 면역계를 가진 대상에서 CMV 항원을 발현하는 감염성의 복제-결핍성 피친드 바이러스 또는 그 조성물을 투여하는 것은, 그러한 치료의 부재하에서의 감염, 암 또는 알러지에 대한 CMI 반응을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 더 많이 초과하는, 감염, 암 또는 알러지에 대한 세포-매개 면역(CMI) 반응을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 대상에게 투여하는 것은 최소 적어도 4주동안 검출가능한 항체 역가를 유도한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 대상에게 투여하는 것은 항체 역가를 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 일차 항원 노출은 감염-면역 인간 대상으로부터의 평균 대조 혈청의 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000%의 기능성이고 (중화하는) 최소 항체 역가를 유발한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 일차 중화 기하 평균 항체 역가는 면역 후 적어도 4주 이내에 적어도 1:50, 적어도 1:100, 적어도 1:200, 또는 적어도 1:1000의 피크 값까지 상승한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 이용한 면역은 백신의 단일 투여 후 또는 2회 이상의 순차적 면역 후에 면역후 적어도 4 주, 적어도 8 주, 적어도 12 주, 적어도 6 개월, 적어도 12 개월, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 또는 적어도 5 년동안 지속되는 높은 항체 역가를 생산한다.
또 다른 실시양태에서, 이차 항원 노출은 항체 역가를 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% 증가시킨다. 다른 실시양태에서, 이차 항원 노출은 감염-면역 인간 대상으로부터의 평균 대조 혈청의 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000%의 기능성이고 (중화하는) 최소 항체 역가를 유발한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 이차 중화 기하 평균 항체 역가는 면역 후 적어도 4주 이내에 적어도 1:50, 적어도 1:100, 적어도 1:200, 또는 적어도 1:1000의 피크 값까지 증가한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 이용한 이차 면역은 면역후 적어도 4 주, 적어도 8 주, 적어도 12 주, 적어도 6 개월, 적어도 12 개월, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 또는 적어도 5 년동안 지속되는 높은 항체 역가를 생산한다.
또 다른 실시양태에서, 삼차 증강(boosting) 면역은 항체 역가를 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% 증가시킨다. 다른 실시양태에서, 증강 면역은 감염-면역 인간 대상으로부터의 평균 대조 혈청의 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000%의 기능성이고 (중화하는) 최소 항체 역가를 유발한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 삼차 증강 면역은 감염-면역 인간 대상으로부터의 평균 대조 혈청의 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000%의 기능성이고 (중화하는) 최소 항체 역가를 유발한다. 다른 실시양태에서, 삼차 증강 면역은 면역 후 적어도 4 주, 적어도 8 주, 적어도 12 주, 적어도 6 개월, 적어도 12 개월, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 또는 적어도 5 년까지 항체 역가를 연장한다.
일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 T 세포 독립적 또는 T 세포 의존성 반응을 유발한다. 다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 T 세포 반응을 유발한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 T 헬퍼 반응을 유발한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 Th1-지향된 반응(Th1-oriented response) 또는 Th2-지향된 반응을 유발한다.
더욱 구체적인 실시양태에서, Th1-지향된 반응은 IgG1에 비하여 IgG2 항체 의 우위에 의해 나타내진다. 다른 실시양태에서, IgG2:IgG1의 비는 1:1 초과, 2:1 초과, 3:1 초과, 또는 4:1 초과이다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 감염성 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 또는 IgE 항체의 우위에 의해 나타내진다.
일부 실시양태에서, CMV 항원 또는 그 단편을 발현하는 감염성이고 복제-결핍성인 피친드 바이러스는 CD8+ T 세포 반응을 유발한다. 다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 항체와 조합되거나 조합되지 않고, CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응 둘 모두를 유발한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 높은 역가의 중화 항체를 유발한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 단백질 복합체 성분의 개별적 발현보다 더 높은 역가의 중화 항체를 유발한다.
다른 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러지로부터 유래된 1, 2, 3, 4, 5가지, 또는 더 많은 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 하나의 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자보다 더 높은 역가의 중화 항체를 유발한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자와 적어도 하나의 추가 치료법의 공동-투여를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-투여는 동시이다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 추가 치료법의 투여 전에 투여된다. 다른 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 추가 치료법의 투여 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자와 추가 치료법의 투여는 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 또는 약 12 시간이다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자와 상기 추가 치료법의 투여 사이의 간격은 약 1 일, 1 주, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주이다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자와 추가 치료법의 투여 사이의 간격은 약 1 개월, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월, 또는 약 6 개월이다.
일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물의 투여는 환자 혈액 샘플 또는 혈청 샘플에서 검출되는 항체의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물의 투여는 소변, 타액, 혈액, 눈물, 정액, 박리 세포 샘플 또는 모유에서 검출되는 감염성 유기체, 암 또는 알러지의 양을 감소시킨다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 조성물은 리포터 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 리포터 단백질 또는 조성물은 감염, 암 또는 알러지를 치료 및/또는 예방하기 위하여 대상에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 리포터 단백질은 유전자 발현, 단백질 국소화, 및 백신 전달의 모니터링을 위하여 생체내, 제자리(in situ) 및 실시간으로 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 조성물은 형광 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 리포터 단백질 또는 조성물은 감염, 암 또는 알러지를 치료 및/또는 예방하기 위하여 대상에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 형광 단백질은 유전자 발현, 단백질 국소화, 및 백신 전달의 모니터링을 위하여 생체내, 제자리 및 실시간으로 사용될 수 있는 리포터 단백질일 수 있다.
감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물을 대상에서 투여함으로써 유도된 감염, 암 또는 알러지에 대한 CMI 반응 기능에서의 변화는 유세포분석(예를 들어, Perfetto S.P. et al., 2004, Nat Rev Immun., 4(8):648-55 참고), 림프구 증식 분석(예를 들어, Bonilla F.A. et al., 2008, Ann Allergy Asthma Immunol, 101:101-4; 및 Hicks M.J. et al., 1983, Am J Clin Pathol., 80:159-63 참고), T 림프구의 사이토카인의 측정의 활성화 후 표면 마커 발현에서의 변화를 결정하는 것을 포함하는 림프구 활성화 측정 분석(예를 들어, Caruso A. et al., Cytometry. 1997;27:71-6 참고), ELISPOT 분석(예를 들어, Czerkinsky C.C. et al., 1983, J Immunol Methods, 65:109-121; 및 Hutchings P.R. et al., 1989, J Immunol Methods, 120:1-8 참고), 또는 천연 킬러 세포 세포독성 분석(예를 들어, Bonilla F.A. et al., 2006, Ann Allergy Asthma Immunol., 94(5 Suppl 1):S1-63 참고)를 포함하며 이에 제한되지 않는 당업자에게 알려진 임의의 분석에 의해 측정될 수 있다.
암 환자의 성공적인 치료는 예상 생존의 연장, 항-종양 면역 반응의 유도, 또는 암의 구체적 특징의 개선으로서 평가될 수 있다. 개선될 수 있는 암의 특징의 예는 종양 크기(예를 들어, T0, T is, 또는 T1-4), 전이의 상태(예를 들어, M0, M1), 관찰가능한 종양의 수, 결절 관련(예를 들어, N0, N1-4, Nx), 등급(즉, 등급 1, 2, 3, 또는 4), 단계(예를 들어, 0, I, II, III, 또는 IV), 세포상의 또는 체액내의 소정의 마커의 존재 또는 농도(예를 들어, AFP, B2M, beta-HCG, BTA, CA 15-3, CA 27.29, CA 125, CA 72.4, CA 19-9, 칼시토닌, CEA, 크롬그래이닌(chromgrainin) A, EGFR, 호르몬 수용체, HER2, HCG, 면역글로불린, NSE, NMP22, PSA, PAP, PSMA, S-100, TA-90, 및 티로글로불린), 및/또는 연관된 병리학(예를 들어, 복수 또는 부종) 또는 증상(예를 들어, 악액질, 열, 식욕부진 또는 통증)을 포함한다. 만일 퍼센트에 의해 측정가능하다면, 개선은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90%(예를 들어, 생존, 또는 종양의 부피 또는 선형 치수)일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 감염성 유기체, 암 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 발현하는 피친드 바이러스 입자를 이용하는 방법이 본 명세서에서 개시되며, GP, NP, Z 단백질, 및 L 단백질을 인코딩하는 ORF 중 적어도 하나는 감염성 유기체, 암, 알러젠으로부터 유래된 항원 또는 그의 항원성 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환된다.
4.7 조성물, 투여 및 투여량
본 출원은 또한 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함하는 백신, 면역원성 조성물(예를 들어, 백신 제형) 및 약학 조성물에 관한 것이다. 그러한 백신, 면역원성 조성물 및 약학 조성물은 당업계의 표준 절차에 따라 조제될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법과 응용에 대한 적합한 변형과 적응이 명백할 수 있으며 본 발명의 범위 또는 임의의 그의 실시양태를 벗어나지 않고 만들어질 수 있음이 관련 분야의 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 질병의 치료와 예방 방법에서 사용될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 감염되거나 감염에 민감한 대상의 치료에서 이용된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 암 또는 종양발생에 민감하거나 암 또는 종양발생의 특징적인 증상을 나타내거나 암으로 진단된 대상의 치료에서 이용된다. 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 면역원성 조성물은 조성물이 투여되는 숙주에서 면역 반응을 유도하기 위하여 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물은 백신으로 이용될 수 있으며 따라서 약학 조성물로서 조제될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물은 대상(예를 들어, 인간 대상)의 감염 또는 암의 예방에서 사용된다. 다른 실시양태에서, 백신, 면역원성 조성물 또는 약학 조성물은 수의과 및/또는 인간 투여를 위해 적합하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 그러한 면역원성 조성물은 추가로 약학적 허용 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 그러한 면역원성 조성물은 아쥬반트를 추가로 포함한다. 본 명세서에 개시된 조성물과 조합하여 투여하기 위한 아쥬반트는 상기 조성물의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "아쥬반트"는 본 명세서에 개시된 조성물과 함께 또는 그 일부로서 투여될 경우 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 가장 중요하게는 그것이 벡터화하는 유전자 산물에 대한 면역 반응을 증대, 향상 및/또는 증강시키지만, 그 화합물이 단독으로 투여될 경우에는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 후자에 의해 벡터화된 유전자 산물에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 말한다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 후자에 의해 벡터화된 유전자 산물에 대한 면역 반응을 생성하며 알러지 또는 다른 부작용을 생산하지 않는다. 아쥬반트는 예를 들어, 림프구 모집, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포 또는 수지상 세포의 자극을 비롯한 여러 기전에 의해 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물이 아쥬반트를 포함하거나 하나 이상의 아쥬반트와 함께 투여될 경우, 사용될 수 있는 아쥬반트는 무기염 아쥬반트 또는 무기염 젤 아쥬반트, 미립자 아쥬반트, 미세미립자(microparticulate) 아쥬반트, 점막 아쥬반트 및 면역자극성 아쥬반트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아쥬반트의 예는 알루미늄염(백반)(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 및 알루미늄 설페이트), 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL)(GB 2220211호 참고), MF59(노바티스(Novartis)), AS03(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), AS04 (글락소스미스클라인), 폴리소르베이트 80(Tween 80; 아이씨엘 아메리카스, 인크(ICL Americas, Inc.)), 이미다조피리딘 화합물(국제 공개 WO2007/109812호로 공개된 국제 특허 출원 PCT/US2007/064857호 참고), 이미다조퀴녹살린 화합물(국제 공개 WO2007/109813호로 공개된 국제 특허 출원 PCT/US2007/064858호 참고) 및 사포닌, 예를 들어, QS21(Kensil et al., 1995, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY); 미국 특허 5,057,540호 참고)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트는 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant)(완전 또는 불완전)이다. 다른 아쥬반트는 선택적으로 모노포스포릴 지질 A와 같은 면역 자극제와 조합된, 수중유 에멀젼(예를 들어, 스쿠알렌 또는 땅콩유)이다(Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 참고).
조성물은 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 단독으로 또는 약학적 허용 담체와 함께 포함한다. 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 현탁액 또는 분산액, 특히 등장성 수성 현탁액 또는 분산액이 이용될 수 있다. 약학 조성물은 멸균되고/되거나 부형제, 예를 들어, 방부제, 안정화제, 습윤제 및/또는 유화제, 가용화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 버퍼를 포함할 수 있으며 예를 들어, 통상적인 분산 및 현탁 과정에 의해서와 같은 알려진 방식으로 제조된다. 일부 실시양태에서, 그러한 분산액 또는 현탁액은 점도-조절 제제를 포함할 수 있다. 현탁액 또는 분산액은 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 유지되거나, 또는 우선적으로 장기 저장을 위하여 동결되고 사용직전에 해동되거나, 또는 대안적으로 저장을 위하여 동결건조될 수 있다. 주사의 경우, 백신 또는 면역원성 제제가 수용액에서, 바람직하게는 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액 또는 생리학적 염수 버퍼와 같은 생리학적 양립성 버퍼에서 조제될 수 있다. 용액은 현탁화, 안정화 및/또는 분산화 제제와 같은 조제용 제제를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 부가적으로 방부제, 예를 들어, 수은 유도체 티메로살을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 약학 조성물은 0.001% 내지 0.01% 티메로살을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 약학 조성물은 방부제를 포함하지 않는다.
약학 조성물은 약 103 내지 약 1011 병소 형성 단위의 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함한다.
일 실시양태에서, 약학 조성물의 투여는 비경구 투여이다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다. 따라서, 비경구 투여를 위한 단위 용량 형태는 예를 들어, 앰퓰 또는 바이알, 예를 들어, 약 103 내지 1010 병소 형성 단위 또는 105 내지 1015 물리적 입자의 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 함유하는 바이알이다. 일부 실시양태에서, 용어 "10eX"는 10의 X승을 의미한다.
다른 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 백신 또는 면역원성 조성물은 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 국소, 피하, 경피, 비내 및 흡입 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법에 의해, 그리고 난절법(예를 들어, 두갈래 바늘을 이용하여 피부의 최상층을 긁음)을 통해 대상에게 투여된다. 구체적으로, 피하 또는 정맥내 경로가 이용될 수 있다.
비내로 또는 흡입에 의해 투여할 경우, 본 발명에 따른 사용을 위한 제제는 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 카본 디옥사이드 또는 다른 적합한 가스를 이용하여, 가압된 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이 제공의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에는 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하여 조제될 수 있다.
활성 성분의 투여량은 백신접종의 타입 및 대상, 그리고 그들의 연령, 체중, 개별 병태, 개인 약동학적 데이터 및 투여 방식에 의존한다. 일부 실시양태에서, 시험관내 분석은 적절한 투여량 범위를 확인하기 위해 이용된다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량 응답 곡선으로부터 추정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함하는 백신, 면역원성 조성물 또는 약학 조성물은 생 백신접종으로서 이용될 수 있다. 생 피친드 바이러스 입자를 위한 예시적인 용량은 10-100, 또는 더 많은 PFU의 생 바이러스/용량으로 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 적합한 투여량은 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011 또는 1012 pfu이며, 필요한 대로 자주 간격을 가지고 1회, 2회, 3회 또는 더 많이 대상에게 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 생 피친드 바이러스는 0.2-mL 용량이 106.5-107.5 형광 병소 단위의 생 피친드 바이러스 입자를 함유하도록 조제된다. 다른 실시양태에서, 불활성화 백신은 백신이 약 15 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 75 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 또는 약 15 ㎍ 내지 약 30 ㎍의 피친드 바이러스를 함유하도록 조제된다.
일부 실시양태에서, 소아에게의 투여의 경우, 적어도 1개월 간격으로 주어지는, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물의 2 용량이 아동에게 투여된다. 구체적 실시양태에서, 성인에게의 투여를 위해서는 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물의 단일 용량이 주어진다. 다른 실시양태에서, 적어도 1개월 간격으로 주어지는, 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물의 2 용량이 성인에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 어린 소아(6 개월 내지 9세)는 1개월 간격으로 주어지는 2 용량으로 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 또는 그 조성물이 처음 투여될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 그들의 백신접종 첫해에 1 용량만이 주어진 소아는 다음 해에 2 용량이 주어져야 한다. 일부 실시양태에서, 4주 간격으로 투여된 2 용량이, 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물이 처음으로 투여되는 2-8세의 소아를 위해 바람직하다. 일부 실시양태에서, 6-35 개월 연령의 소아의 경우, 3세 이상의 대상을 위해 바람직할 수 있는 0.5 ml과 대조적으로, 절반 용량(0.25 ml)이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 치료적 유효량을 포함하는 단일 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자는 치료적 유효량의 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 각각 치료적 유효량의 하나 이상의 약학 조성물을 포함하는 단일 용량으로 환자에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 단일 용량으로서 환자에게 투여되고 이어서 3 내지 6주 후에 두번째 용량이 투여된다. 이들 실시양태에 따라, 부스터 접종이 두번째 접종 후 6 내지 12개월 간격으로 대상에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부스터 접종은 상이한 피친드 바이러스 또는 그 조성물을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 동일한 조성물의 투여는 반복되고 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 10 일, 15 일, 30 일, 45 일, 2 개월, 75 일, 3 개월, 또는 적어도 6 개월만큼 분리될 수 있다.
본 발명은 또한 활성 성분으로서 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함하는 약학 제제의 형태로 백신을 제조하기 위한 과정 및 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 용도를 제공한다. 본 출원의 약학 조성물은 자체가 알려진 방식으로, 예를 들어, 통상적인 혼합 및/또는 분산 과정의 수단에 의해 제조된다.
4.8 분석
4.8.1 피친드 바이러스 검출 분석
당업자는 당업계에 알려진 기술을 이용하여 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 검출할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR은 ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 ORF를 보유하도록 조작된 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 검출하고 정량하기 위하여 피친드 바이러스에 특이적인 프라이머를 가지고 이용될 수 있다. 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 면역침전, 면역세포화학 또는 FACS와 함께인 면역세포화학이 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 유전자 산물을 정량하기 위하여 이용될 수 있다.
4.8.2 감염성을 측정하기 위한 분석
당업자에게 알려진 임의의 분석이 피친드 바이러스 벡터 제제의 감염성을 측정하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스/벡터 역가의 결정은 "병소 형성 단위 분석"(FFU 분석)에 의해 이루어질 수 있다. 요약하면, 보완성 세포, 예를 들어, MC57 세포가 도말되고 상이한 희석률의 바이러스/벡터 샘플로 접종된다. 세포가 단일층을 형성하고 바이러스가 세포에 부착하도록 하기 위한 항온처리 기간 후, 단일층이 메틸셀룰로스로 덮인다. 플레이트가 추가로 항온처리되면, 원래의 감염된 세포는 바이러스 후손을 방출한다. 메틸셀룰로스 오버레이(overlay)로 인하여 새로운 바이러스의 확산은 이웃 세포로 제한된다. 결과적으로, 각각의 감염성 입자는 병소로 불리는 감염된 세포의 원형 구역을 생산한다. 그러한 병소는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자에 의해 발현된 피친드 바이러스- NP 또는 다른 단백질에 대한 항체 및 HRP-계 색상 반응을 이용하여 가시적이 될 수 있으며 그에 의해 계수가능하다. 바이러스/벡터의 역가는 병소-형성 단위/밀리리터(FFU/mL)로 계산될 수 있다.
4.8.3 피친드 바이러스 입자의 성장
본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자의 성장은 당업계에 알려지거나 본 명세서에 개시된 임의의 방법(예를 들어, 세포 배양)에 의해 평가될 수 있다. 바이러스 성장은 본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자의 연속 희석물을 세포 배양물(예를 들어, BHK-21 세포) 내로 접종함으로써 결정될 수 있다. 특정 시간동안 바이러스의 항온처리 후, 바이러스는 표준 방법을 이용하여 분리된다.
4.8.4 혈청 ELISA
동물(예를 들어, 마우스, 기니피그)의 백신접종시에 체액성 면역 반응의 결정은 항원-특이적 혈청 ELISA(효소-연결 면역흡착 분석)에 의해 이루어질 수 있다. 요약하면, 플레이트가 항원(예를 들어, 재조합 단백질)으로 코팅되고, 항체의 비특이적 결합을 피하기 위하여 차단되고 혈청의 연속 희석물과 항온처리된다. 항온처리 후, 결합된 혈청-항체는 예를 들어, 효소-결합 항-종(예를 들어, 마우스, 기니 피그)-특이적 항체(전체 IgG 또는 IgG 서브클래스를 검출) 및 후속 색상 반응을 이용하여 검출될 수 있다. 항체 역가는 예를 들어, 종점 기하 평균 역가로서 결정될 수 있다.
4.8.5 유도된 항체의 중화 활성을 측정하기 위한 분석
혈청 내의 중화 항체의 결정은 ATCC로부터의 ARPE-19 세포 및 GFP-태그를 가진 바이러스를 이용하는 하기 세포 분석으로 수행된다. 또한, 외인성 보체의 공급원으로서 보충적 기니피그 혈청이 이용된다. 분석은 중화를 위해 이용하기 전 1일 또는 2일에 384 웰 플레이트에서 6.5x103 세포/웰(50㎕/웰)의 접종으로 시작된다. 중화는 37℃에서 1h 동안 세포없이 96-웰 멸균 조직 배양 플레이트에서 이루어진다. 중화 항온처리 단계 후, 혼합물이 세포에 첨가되고 플레이트 판독기를 이용한 GFP-검출을 위하여 추가 4일동안 항온처리된다. 양성 중화 인간 혈청이 모든 결과의 신뢰성을 체크하기 위하여 각 플레이트에서 분석 양성 대조군으로서 이용된다. 역가(EC50)는 4 파라미터 로지스틱 곡선 피팅을 이용하여 결정된다. 추가적인 시험으로서 웰은 형광 현미경으로 체크된다.
4.8.6 플라크 감소 분석
요약하면, 피친드 바이러스를 위한 플라크 감소(중화) 분석은 녹색 형광 단백질 태그를 가진 복제-가능 또는 -결핍성 피친드 바이러스를 이용하여 수행될 수 있으며, 5% 토끼 혈청은 외인성 보체의 공급원으로서 사용될 수 있으며, 플라크는 형광 현미경에 의해 계수될 수 있다. 중화 역가는 대조군(면역-전) 혈청 샘플에서의 것에 비하여, 플라크에서 50%, 75%, 90% 또는 95% 감소를 야기하는 혈청의 최고 희석으로서 정의될 수 있다.
qPCR: 피친드 바이러스 RNA 게놈은 제조사에 의해 제공되는 프로토콜에 따라 퀴아앰프 바이러스 RNA 미니 키트(QIAamp Viral RNA mini Kit)(퀴아젠(QIAGEN))를 이용하여 분리된다. 피친드 바이러스 RNA 게놈 등가물은 수퍼스크립트(SuperScript)® III 플래티늄(Platinum)® 원-스텝(One-Step) qRT-PCR 키트(인비트로겐(Invitrogen)) 및 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 피친드 NP 코딩 영역 또는 다른 게놈 스트레치의 부분에 대해 특이적인 프라이머와 프로브(FAM 리포터 및 NFQ-MGB 켄처(Quencher))를 이용하여 스텝원플러스(StepOnePlus) 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에서 수행되는 정량적 PCR에 의해 검출된다. 반응의 온도 프로파일은 60℃에서 30분, 95℃에서 2분, 및 이어서 95℃에서 15 s, 56℃에서 30 s의 45 사이클일 수 있다. RNA는 NP 코딩 서열 또는 프라이머와 프로브 결합 부위를 함유하는 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 다른 게놈 스트레치의 단편에 해당하는, 분광학적으로 정량된 시험관내-전사 RNA 단편의 log10 희석 시리즈로부터 준비된 표준 곡선에 샘플 결과를 비교함으로써 정량될 수 있다.
4.8.7 웨스턴 블롯팅
조직 배양 플라스크에서 또는 현탁액에서 성장한 감염된 세포는 RIPA 버퍼(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 이용하여 감염 후 지시된 시점에 용해되거나, 세포 용해없이 직접 사용된다. 샘플은 환원제 및 누페이지(NuPage) LDS 샘플 버퍼(노벡스(NOVEX))와 10분 동안 99℃로 가열되고 전기영동을 위해 4-12% SDS-젤상에 로딩되기 전에 실온으로 냉각된다. 단백질은 인비트로겐(Invitrogens) 아이블롯(iBlot) 젤 이전 장치를 이용하여 막위에 블롯팅되고 폰소(Ponceau) 염색에 의해 가시화된다. 마지막으로, 제제는 관심 단백질에 대해 유도된 일차 항체 및 알카라인 포스파타제 접합된 이차 항체로 탐침되고 이어서 1-스텝 NBT/BCIP 용액(인비트로겐)으로 염색된다.
4.8.8 항원-특이적 CD8+ T-세포 증식의 검출을 위한 MHC-펩티드 다량체 염색 분석
당업자에게 알려진 임의의 분석은 항원-특이적 CD8+ T-세포 반응을 시험하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, MHC-펩티드 사량체 염색 분석이 이용될 수 있다(예를 들어, Altman J.D. et al., Science. 1996; 274:94-96; 및 Murali-Krishna K. et al., Immunity. 1998; 8:177-187 참고). 요약하면, 분석은 하기 단계를 포함하며, 사량체 분석은 항원 특이적 T-세포의 존재를 검출하기 위하여 이용된다. T-세포가 그것이 특이적인 펩티드를 검출하기 위하여, T-세포는 정의된 항원 특이성 및 T-세포의 MHC 하플로타입에 대해 맞춤 제조된 MHC 분자의 사량체(전형적으로 형광 라벨링됨) 및 펩티드 둘 모두를 인식해야 한다. 그 후 사량체는 형광 라벨을 통해 유세포분석에 의해 검출된다.
4.8.9 항원-특이적 CD4+ T-세포 증식의 검출을 위한 ELISPOT 분석.
항원-특이적 CD4+ T-세포 반응을 시험하기 위하여 당업자에게 알려진 임의의 분석이 이용될 수 있다. 예를 들어, ELISPOT 분석이 이용될 수 있다(예를 들어, Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65:109-121; 및 Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120:1-8 참고). 요약하면, 분석은 하기 단계를 포함한다: 면역스팟 플레이트가 항-사이토카인 항체로 코팅된다. 세포가 면역스팟 플레이트에서 항온처리된다. 세포는 사이토카인을 분비하며 그 후 세척된다. 그 후 플레이트는 2차 비오틴화된-항사이토카인 항체로 코팅되고 아비딘-HRP 시스템으로 가시화된다.
4.8.10 CD8+ 및 CD4+ T-세포 반응의 기능성의 검출을 위한 세포내 사이토카인 분석.
CD8+ 및 CD4+ T-세포 반응의 기능성을 시험하기 위하여 당업자에게 알려진 임의의 분석이 이용될 수 있다. 예를 들어, 유세포분석과 조합된 세포내 사이토카인 분석이 이용될 수 있다(예를 들어, Suni M.A. et al., J Immunol Methods. 1998; 212:89-98; Nomura L.E. et al., Cytometry. 2000; 40:60-68; 및 Ghanekar S.A. et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8:628-63 참고). 요약하면, 분석은 하기 단계를 포함한다: 특이적 펩티드 또는 단백질을 통한 세포의 활성화, 단백질 수송의 억제(예를 들어, 브레펠딘(brefeldin) A)가 세포내에 사이토카인을 보유시키기 위해 첨가된다. 소정의 기간, 전형적으로 5 시간의 항온처리 후, 세척 단계가 이어지며, 다른 세포 마커에 대한 항체가 세포에 첨가될 수 있다. 그 후 세포는 고정되고 투과성이 된다. 형광색소-접합된 항-사이토카인 항체가 첨가되고 세포가 유세포분석에 의해 분석될 수 있다.
4.8.11 바이러스 벡터의 복제-결핍을 확인하기 위한 분석
감염성이고 복제-가능한 바이러스 입자의 농도를 결정하는 당업자에게 알려진 임의의 분석이 또한 샘플 내의 복제-결핍성 바이러스 입자를 측정하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들어, 비-보완성 세포를 이용한 FFU 분석이 이 목적을 위해 이용될 수 있다.
또한, 플라크계 분석이 바이러스 샘플에서 플라크 형성 단위(PFU)의 면에서 바이러스 농도를 결정하기 위해 사용되는 표준 방법이다. 구체적으로, 비-보완성 숙주 세포의 컨플루언트 단일층이 변하는 희석률의 바이러스로 감염되고 바이러스 감염이 구별없이 확산되는 것을 방지하기 위하여 반-고체 배지, 예를 들어, 한천으로 덮인다. 바이러스 플라크는 바이러스가 고정된 세포 단일층 내의 세포를 성공적으로 감염시키고 자신을 복제하고, 주위 세포로 확산할 때 형성된다(예를 들어, Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol.32:Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0-12-521532-0 참고). 플라크 형성은 분석되는 바이러스에 따라 2 - 14 일이 걸릴 수 있다. 플라크는 일반적으로 수동으로 계수되며, 결과는 플레이트를 준비하기 위하여 사용된 희석 인자와 조합되어, 샘플 단위 부피 당 플라크 형성 단위의 수(PFU/mL)를 계산하기 위해 이용된다. PFU/mL 결과는 샘플 내의 감염성 복제-가능 입자의 수를 나타낸다. C-세포가 이용될 경우, 복제-결핍성 피친드 바이러스 입자 또는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 적정하기 위해 동일한 분석이 사용될 수 있다.
4.8.12 바이러스 항원의 발현을 위한 분석
바이러스 항원의 발현을 측정하기 위하여 당업자에게 알려진 임의의 분석이 이용될 수 있다. 예를 들어, FFU 분석이 수행될 수 있다. 검출의 경우, 각 바이러스 항원에 대한 단일- 또는 다중클론 항체 제제(들)가 사용된다(트랜스유전자-특이적 FFU).
4.8.13 동물 모델
본 명세서에 개시된 피친드 바이러스 입자의 재조합 및 감염성을 조사하기 위하여 생체내 동물 모델이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 재조합 및 감염성을 조사하기 위하여 사용될 수 있는 동물 모델은 마우스, 기니 피그, 토끼 및 원숭이를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 피친드 바이러스의 재조합 및 감염성을 조사하기 위하여 사용될 수 있는 동물 모델은 마우스를 포함한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 피친드 바이러스 입자의 재조합 및 감염성을 조사하기 위하여 이용될 수 있는 마우스는 I 형 인터페론 수용체, II 형 인터페론 수용체 및 재조합 활성화 유전자 1(RAG1)에 대해 삼중-결핍성이다.
일부 실시양태에서, 동물 모델은 피친드 바이러스 감염성 및 트랜스유전자 안정성을 결정하기 위하여 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 RNA는 동물 모델의 혈청으로부터 분리될 수 있다. 기술은 당업자에게 쉽게 알려진다. 바이러스 RNA는 역전사될 수 있으며 피친드 바이러스 ORF를 보유한 cDNA는 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 PCR-증폭될 수 있다. 유세포분석은 또한 피친드 바이러스 감염성 및 트랜스유전자 안정성을 조사하기 위하여 이용될 수 있다.
5. 실시예
이들 실시예는 피친드 바이러스-계 벡터 기술이 (1) ORF의 야생형 위치가 아닌 다른 위치에서 바이러스 ORF를 가진 피친드 바이러스 게놈 세그먼트 및 (2) 복제 가능 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 야기하지 않는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 성공적으로 개발하기 위해 이용될 수 있음을 입증한다.
5.1 재료 및 방법
5.1.1 세포
10% 열-불활성화 태아 소 혈청(FCS; 바이오크롬(Biochrom)), 10 mM HEPES(깁코(Gibco)), 1 mM 소듐 피루베이트(깁코) 및 1x 트립토스 포스페이트 브로스로 보충된 고-글루코스 둘베코 이글 배지(Dulbecco's Eagle medium)(DMEM; 시그마(Sigma))에서 BHK-21 세포를 배양하였다. 세포를 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 293-T 세포를 10% 열-불활성화 태아 소 혈청(FCS)이 보충된 둘베코 이글 배지(DMEM, 글루타맥스(Glutamax) 함유함; 시그마)에서 배양하였다.
5.1.2 트랜스유전자
(1) 녹색 형광 단백질(GFP)은 무솔기 클로닝(seamless cloning)을 위한 인접 BsmBI 부위를 가진 GFP-Bsm(서열 번호 9)으로서 합성하였다. (2) i) 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSVG) 시그널 펩티드, ii) P815 마우스 비만세포종 종양 세포주의 P1A 항원, iii) GSG 링커, iv) 엔테로바이러스 2A 펩티드 및 v) 마우스 GM-CSF로 이루어지는 융합 단백질. 이 융합 단백질은 sP1AGM으로 불릴 것이다. 본 발명자들은 무솔기 클로닝을 위해 sP1AGM-Bsm(서열 번호 10)으로서 인접 BsmBI 부위를 가진 이 융합 단백질을 합성하였다. (3) 야생형 피친드 바이러스 S 세그먼트 발현 플라스미드(BbsI 부위가 없는 S 세그먼트)를 재구성하기 위한 무솔기 클로닝을 위해 인접 BsmBI 부위를 가진 피친드 바이러스 GP(서열 번호 8).
5.1.3 플라스미드
본 발명자들은 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18(젠뱅크 기탁 번호 EF529747.1)의 L ORF의 변형된 cDNA를 합성하였으며, BsmBI 제한 부위를 결실시키기 위하여 비-코딩 돌연변이가 도입되었다. 적합하게 인접하는 BsmBI 및 EcoRI와 NheI 제한 부위를 가진 이 합성 ORF(L△BsmBI; 서열 번호 3)를 폴리머라제-II(pol-II) 발현 벡터 pCAGGS 내로 도입하여, 진핵 세포에서의 피친드 L 단백질의 발현을 위한 pC-PIC-L-Bsm(도 3)을 생성하였다.
본 발명자들은 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18(젠뱅크 기탁 번호 EF529747.1)의 변형된 L 세그먼트(PIC-L-GFP-Bsm; 서열 번호 4)를 합성하였으며, L ORF는 결실되고 각 측상에 인접 BsmBI 부위를 가진 GFP ORF에 의해 치환되었다. 이 합성 cDNA는 마우스 폴리머라제 I(pol-I) 발현 카세트내로 도입되어(Pinschewer et al. J Virol. 2003 Mar;77(6):3882-7), pol-I-PIC-L-GFP-Bsm(도 3)을 생성하였다.
본 발명자들은 동일하게 분해된 pol-I-PIC-L-GFP-Bsm 백본내로 BsmBI-돌연변이된 L ORF를 삽입시키기 위하여 BsmBI로 PIC-L-Bsm을 분해하여, GFP ORF를 L ORF로 치환하여, 클로닝 목적을 위한 모든 제한 부위가 제거된 피친드 바이러스 L 세그먼트 cDNA를 무솔기로 재구성하였다. 생성된 pol-I-PIC-L 플라스미드(도 3)는 진핵 세포에서 전길이 피친드 바이러스 L 세그먼트(PIC-L-seg; 서열 번호 2)의 세포내 발현을 위해 설계되었다.
본 발명자들은 PIC-miniS-GFP(서열 번호 5)로 불리는, 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18(젠뱅크 기탁 번호: EF529746.1)의 변형된 S 세그먼트 cDNA를 합성하였으며, GP ORF는 2개의 BsmBI 제한 부위에 의해 치환되고 NP ORF는 2개의 인접 BbsI 제한 부위를 가진 GFP에 의해 치환되었다. 이 합성 cDNA는 마우스 폴리머라제 I(pol-I) 발현 카세트내로 도입되어(Pinschewer et al. J Virol. 2003 Mar;77(6):3882-7), pol-I-PIC-L-miniS-GFP(도 3)를 생성하였다.
본 발명자들은 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18(젠뱅크 기탁 번호: EF529747.1)의 NP ORF의 변형된 cDNA를 합성하였으며, 두 BsmBI 제한 부위를 결실시키기 위하여 비-코딩 돌연변이가 도입되었다. 적합하게 인접하는 BbsI 및 EcoRI와 NheI 제한 부위를 가진 이 합성 ORF(NP△BbsI; 서열 번호 6)를 폴리머라제-II(pol-II) 발현 벡터 pCAGGS내로 도입하여, 진핵 세포에서 피친드 NP 단백질의 발현을 위한 pC-PIC-NP-Bbs(도 3)를 생성하였다.
본 발명자들은 동일하게 분해된 pol-I-PIC-miniS-GFP 백본내로 BbsI-돌연변이된 NP ORF를 삽입시키기 위하여 BbsI으로 NP△BbsI을 분해하여, GFP ORF를 NP ORF로 치환하여, 클로닝 목적을 위한 모든 제한 부위가 제거된, 피친드 바이러스 S 세그먼트 cDNA의 3'UTR - NP - IGR 부분을 무솔기로 재구성하였다. pol-I의 제어하에서 PIC-NP-Bsm(서열 번호 7)을 발현하는 생성된 pol-I-PIC-NP-Bsm 플라스미드(도 3)는 생성된 재조합 피친드 바이러스 S 세그먼트의 진핵 세포에서의 발현을 위해, BsmBI 부위를 무솔기로 치환함으로써, 5'UTR과 IGR 사이에 삽입될 관심 트랜스유전자를 수용하도록 설계되었다.
본 발명자들은 피친드 바이러스 균주 문치크 CoAn4763 분리물 P18(젠뱅크 기탁 번호: EF529747.1)의 GP ORF의 변형된 cDNA를 합성하였으며, 두 BbsI 제한 부위를 결실시키기 위하여 비-코딩 돌연변이가 도입되었다. NP△BbsI과 유사하게, 이 합성 ORF는 pol-I-PIC-miniS-GFP 백본 내로 도입되어, 클로닝 목적을 위한 모든 제한 부위가 제거된, 피친드 바이러스 S 세그먼트 cDNA의 3'UTR - GP - IGR 부분을 무솔기로 재구성하기 위하여 GFP ORF를 GP ORF로 치환시켰다. PIC-GP-Bsm(서열 번호 8)을 발현하는, 생성되는 pol-I-PIC-GP-Bsm 플라스미드(도 3)는, 진핵 세포에서 재조합 피친드 바이러스 S 세그먼트의 발현을 위해, BsmBI 부위를 무솔기로 치환함으로써, 5'UTR과 IGR 사이에 삽입될 관심 트랜스유전자를 수용하도록 설계되었다.
그 후, 본 발명자들은 하기의 유전자 및 트랜스유전자를 pol-I-PIC-NP-Bsm내로 삽입하였다: 1. GFP, 2. sP1AGM, 및 3. 인접 BsmBI 부위를 가진 피친드 GP 전부. 생성되는 플라스미드는 pol-I-PIC-NP-GFP(PIC-NP-GFP를 발현함, S-NP/GFP로도 알려짐; 서열 번호 11) 및 pol-I-PIC-NP-sP1AGM(PIC-NP-sP1AGM 발현; 서열 번호 12) 및 pol-I-PIC-S(PIC-S 발현, 서열 번호 1)로 명명되었다. 유사하게, 본 발명자들은 GFP 또는 sP1AGM을 pol-I-PIC-GP-Bsm내로 삽입하여, pol-I-PIC-GP-GFP(PIC-GP-GFP를 발현함, S-GP/GFPart로도 알려짐; 서열 번호 13) 및 pol-I-PIC-GP-sP1AGM(PIC-GP-sP1AGM을 발현함; 서열 번호 14)를 생성하였다.
5.1.4 세포의 DNA 형질감염 및 재조합 바이러스의 구조
림프구성 맥락수막염 바이러스의 당단백질을 발현하기 위해 안정하게 형질감염된 BHK-21 세포(BHK-GP 세포, Flatz et al. Nat Med. 2010 Mar;16(3):339-45)를 5x105 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트내로 접종하고 24 시간 후에 제조사의 설명서에 따라 리포펙타민(대략 3 ㎕/㎍ DNA; 인비트로겐)을 이용하여 상이한 양의 DNA로 형질감염시켰다. 전적으로 플라스미드 DNA로부터 재조합 2개의 세그먼트를 가진 바이러스의 구조를 위하여, 2개의 최소 바이러스 트랜스-작용 인자 NP 및 L을 pol-II 추진 플라스미드(0.8 ㎍ pC-PIC-NP-Bbs, 1.4㎍ pC-PIC-L-Bsm)로부터 전달시키고 1 ㎍의 pol-I-PIC-L 및 0.8㎍의 pol-I-PIC-S로 공동형질감염시켰다. 하나의 L 및 2개의 S 세그먼트로 이루어진 3개의 세그먼트를 가진 r3PIC의 구조의 경우, 0.8 ㎍의 두 pol-I 추진 S 세그먼트가 형질감염 혼합물내에 포함되었다. 형질감염 후 72 시간에 세포 및 상등액을 75 cm2 조직 배양 플라스크로 옮기고, 다시 48-96 시간 후에 상등액을 수확하였다. 병소 형성 분석에서 바이러스 감염성을 결정하고 추가 증폭을 위하여 정상 BHK-21 세포에서 48시간 동안 바이러스를 계대시켰다(48 시간을 위하여 감염 다중도 = 0.01). 그렇게 수득한 바이러스 스톡에서의 바이러스 역가를 다시 병소 형성 분석에 의해 결정하였다.
5.1.5 바이러스 및 바이러스의 성장 동력학
야생형 및 재조합 바이러스의 스톡은 0.01의 감염 다중도(moi)로 BHK-21 또는 293-T 세포를 감염시켜 생산하였으며, 감염 후 48 시간에 상등액을 수집하였다. 바이러스의 성장 곡선은 T75 세포 배양 플라스크 포맷에서 시험관내에서 이루어졌다. BHK021 세포를 5x106 세포/플라스크의 밀도로 접종하고 37℃ 및 5% CO2에서 로커 플레이트에서 90분 동안 0.01의 moi로 바이러스 접종물 5 ml과 함께 세포를 항온처리함으로써 24시간 후에 감염시켰다. 신선한 배지를 추가하고 세포를 37℃/5% CO2에서 항온처리하였다. 주어진 시점에(보통 24, 48, 72 시간) 상등액을 취하여 병소 형성 분석에 의해 바이러스 역가를 분석하였다.
5.1.6 병소 형성 분석
다음으로, 피친드 바이러스의 역가는 병소 형성 분석에 의해 결정된다. 달리 명시되지 않으면 293-T 세포 또는 3T3 세포를 병소 형성 분석을 위해 이용하였다. 96-웰 플레이트에서 세포를 3x104 세포/웰의 밀도로 접종하였으며 MEM/2% FCS에서 준비된 바이러스의 3.17-배 연속 희석물 100 ㎕와 혼합하였다. 37℃에서 2-4 시간의 항온처리 후, 80 ㎕의 점성 배지(2x 보충된 DMEM내의 2% 메틸셀룰로스)를 웰마다 첨가하여 바이러스 입자가 이웃 세포로만 확산되도록 하였다. 37℃에서 48시간 후, 상등액을 털어내고 실온에서 20분동안 100 ㎕의 메탄올을 첨가하여 세포를 고정시켰다(모든 다음 단계는 실온에서 수행된다). 20분동안 100 ㎕/웰의 BSS/1% Triton X-100(머크 밀리포어(Merck Millipore))으로 세포를 투과화시키고 이어서 60분동안 PBS/5% FCS로 차단시켰다. 항-NP 염색을 위하여, 래트 항-피친드-NP 단클론 항체를 PBS/2.5% FCS에서 희석된, 일차 염색 항체로서 60분 동안 이용하였다. 수돗물로 플레이트를 3회 세척하고 이차 HRP-염소-항-래트-IgG를 PBS/2.5% FCS에서의 1:100 희석으로 첨가하고 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 수돗물로 3회 세척하였다. 색상 반응물(0.5 g/l DAB(시그마 D-5637), 0.5 g/l PBS중의 암모늄 니켈 설페이트/0.015% H2O2)을 첨가하고 10분 후 수돗물로 반응을 중단시켰다. 염색된 병소를 계수하고 희석에 따라 최종 역가를 계산하였다.
5.1.7 마우스
BALB/c 마우스를 찰스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories)로부터 구매하고 실험을 위하여 특정 무병원균(SPF) 조건하에서 보관하였다. 모든 동물 실험은 동물 보호에 대한 스위스법에 따라 그리고 각 책임 주 기관의 허가에 따라 바젤대학에서 수행하였다. 마우스의 감염은 1Х105 FFU/마우스의 용량으로 정맥내로 이루어졌다.
5.1.8 유세포분석
항-CD8a 및 항-B220 항체와 조합하여, 면역우성 P1A-유래 H-2Ld-제한 에피토프(restricted epitope) LPYLGWLVF(Aa35-43)로 로딩된 MHC 클래스 I 사량체로 혈액을 염색하고, 에피토프-특이적 CD8+ T 세포 빈도를 BD LSRFortessa 유세포분석기에서 결정하였으며 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타(Tree Star), 오레곤주 애쉬랜드)를 이용하여 처리하였다.
5.1.9 통계적 분석
통계적 유의성은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어(버젼 6.0d)를 이용하여 투-테일드 언페어드 t 테스트(two-tailed unpaired t test)에 의해 결정하였다.
5.2. 결과
5.2.1 인위적 게놈 조직을 가진 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스-계 벡터의 설계
야생형 피친드 바이러스의 게놈은 네가티브 극성의 2개의 단일쇄 RNA 세그먼트(하나의 L, 하나의 S 세그먼트)로 이루어진다(도 1a). 본 발명자들은 5' 비번역 영역(5'UTR)과 복사 S 세그먼트의 유전자간 영역(IGR) 사이에 선택된 트랜스유전자의 무솔기 삽입을 허용하는 카세트 시스템에 기초하여, 인위적 게놈 조직을 가진 복제-가능한 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 벡터를 위한 폴리머라제-I/II-추진 cDNA 구조 시스템을 설계하였다(r3PIC-art, 도 1b, 1c 및 1d). 트랜스유전자 삽입시에 완전히 제거되며 따라서 생성되는 재조합 바이러스에 존재하지 않는 BsmBI 부위를 이용하여 아레나바이러스 S 세그먼트내로 트랜스유전자를 무솔기 삽입(즉, 분자 클로닝으로부터 유래된 잔여 뉴클레오티드 스트레치가 없으며 따라서 추가의 제한 효소 인식 부위가 없음)하기 위한 분자 클로닝 전략은 Pinschewer et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jun 24;100(13):7895-900의 보조 도면(Supporting Fig.) 4에 의해 상세히 개시되었다. BbsI 효소를 Flick et al. J Virol. 2001 Feb;75(4):1643-55에 개시된 대로, 유사하게 무솔기 클로닝을 위해 이용하였다. 이들 피친드 바이러스-계 r3PIC-art 게놈은 3'UTR의 제어하에, 즉, 3'UTR과 IGR 사이에 핵단백질(NP) 또는 당단백질(GP)을 보유하도록 설계된 인위적으로 복사된 S 세그먼트와 함께 야생형 피친드 바이러스 L 세그먼트로 이루어졌다. 이것은 각 S 세그먼트에서 트랜스유전자의 삽입을 위한 하나의 위치를 남겼으며, 즉, 하나의 트랜스유전자 각각은 2개의 S 세그먼트의 각각의 5'UTR과 IGR 사이에 각각 삽입될 수 있었다.
5.2.2 인위적 게놈 조직을 가진 3개의 세그먼트를 가진 재조합 바이러스 벡터로부터 구조된 감염성 GFP-발현 바이러스
3개의 세그먼트를 가진 재조합 피친드 바이러스를 생성하기 위하여, 본 발명자들은 섹션 5.1.3에 개시된 대로 다수의 플라스미드를 합성하였다. 본 발명자들은 하기와 같은 플라스미드 조합으로 BHK-21 세포를 형질감염시켰다:
(A) S 세그먼트 미니게놈: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-miniS-GFP;
(B) L 세그먼트 미니게놈: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-L-GFP-Bsm;
(C) r3PIC-GFPart: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-L, pol-I-PIC-NP-GFP, pol-I-PIC-GP-GFP;
(D) rPICwt: pC-PIC-L-Bsm, pC-PIC-NP-Bbs, pol-I-PIC-L, pol-I-PIC-S
본 발명자들은 S 및 L 세그먼트 미니게놈의 형질감염 후 48시간에 GFP 발현을 발견하여(도 4, 상기에 개시한 대로 플라스미드 조합 A와 B), 기능성 피친드 바이러스 S와 L 세그먼트 유사체의 리보핵단백질(RNP)로서의 세포내 재구성을 기록하였으며, 이들은 유전자 발현에서 활성이었다. 유사하게, r3PIC-GFPart 를 생성하는 것을 목표로 한 형질감염 C는 형질감염 후 48 시간에 GFP-양성 세포를 입증한 반면, rPICwt를 생성하기 위한 플라스미드 조합 D는 예상한 대로, 녹색 형광을 입증하지 못했다. 형질감염 후 168 시간에, GFP-양성 세포는 대부분 S 및 L 세그먼트 미니게놈 형질감염에서 사라졌으나, r3PIC-GFPart를 가진 세포에서는 풍부하여, 감염성의, GFP-발현 바이러스가 cDNA로부터 재구성되어 세포 배양에서 확산되었음을 나타낸다.
5.2.3 재조합 3개의 세그먼트를 가진 바이러스는 야생형 피친드 바이러스보다 낮은 역가로 자란다
rPICwt 및 r3PIC-GFPart로 수득한 바이러스로 비교 성장 곡선을 수행하였다(도 2). 섹션 5.2.2로부터의 형질감염 C와 D로부터의 상등액을 수집하고 BHK-21 세포에서 병행하여 계대시켰다(감염 다중도 = 0.01, 도 2). 두 바이러스 모두에 대해, 피크 감염성은 48 시간 후에 도달하였으나, r3PIC-GFPart의 경우가 rPICwt에 대해서보다 상당히 더 낮았다. 이것은 3개의 세그먼트를 가진 r3PIC-GFPart가 그것의 2 세그먼트를 가진 야생형 모 바이러스에 비하여 약독화되었음을 나타냈다.
5.2.4 sP1AGM을 발현하는 재조합 r3PIC는 신속하고, 강하며 다기능성인 P1A-특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도한다.
백신접종 목적을 위한 r3PICart 벡터 전달 기술의 유용성을 시험하기 위하여 본 발명자들은 r3PIC-GFPart(도 1c)와 유사한 게놈 조직을 가진 r3PIC-sP1AGMart 백신 벡터(도 1d)를 생성하였다. 본 발명자들은 r3PIC-GFPart를 위해 상술한 절차와 유사한 절차에 의해, 하지만 각각 pol-I-PIC-NP-GFP와 pol-I-PIC-GP-GFP 대신 플라스미드 pol-I-PIC-NP-sP1AGM 및 pol-I-PIC-GP-sP1AGM을 이용하여, sP1AGM을 발현하는 바이러스(r3PIC-sP1AGMart)를 생성하였다. 본 발명자들은 10e5 병소 형성 단위(FFU) r3PIC-sP1AGMart i.v.로 정맥내로 BALB/c 마우스를 면역시키고 8일 후 MHC 클래스 I 사량체를 이용하는 유세포분석에 의해 면역우성 P1A-유래 H-2Ld-제한 에피토프 LPYLGWLVF(Aa35-43)에 대한 CD8+ T 세포 반응을 측정하였다. r3PIC-sP1AGMart-면역된 마우스는 말초 혈액에서 매우 상당한 P1A35-43-특이적 CD8 T 세포 집단을 나타냈으며, 이것은 비면역 마우스의 혈액에는 존재하지 않았다(도 5a 및 5b). 이들 관찰은 r3PIC-art-계 바이러스 벡터가 매우 면역원성이어서, 그들이 면역요법 및 백신접종을 위한 전망있는 도구가 되게 함을 입증하였다.
5.2.5 cDNA로부터의 구조 후 초기 계대에서 실험된 경우, 그들의 각 천연 위치에서 그의 당단백질과 핵단백질 유전자를 발현하도록 설계된 재조합 3개의 세그먼트를 가진 바이러스 및 그의 3' 비번역 영역(UTR) 프로모터의 제어하에서 그의 당단백질을 발현하도록 인위적으로 설계된 재조합 3개의 세그먼트를 가진 바이러스 둘 모두가 야생형 피친드 바이러스보다 낮은 역가로 성장한다.
본 발명자들은 S-GP/GFPnat(서열 번호 15) 및 S-NP/GFP(PIC-NP-GFP로도 알려짐; 서열 번호 11)로 이루어진 인위적으로 복사된 S 세그먼트의 맥락에서 그의 당단백질(GP)과 핵단백질(NP) 유전자를 각각 5' 및 3' UTR 프로모터의 제어하에서, 즉, 그들의 각 "천연" 위치에서 발현하는 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스를 생성하였다(도 6). 이 r3PIC-GFPnat 바이러스는 3개의 세그먼트를 가진 r3PIC-GFPart 바이러스를 위해 상기에서 개시된 것과 유사한 절차에 의해 생성하였다. r3PIC-GFPnat는 도 6에 도식적으로 개시된 대로 GFP를 발현하였다. 배양중인 BHK-21 세포에서 성장될 때(감염 다중도 = 0.01, 48 시간에 수집됨), r3PIC-GFPnat는 rPICwt 보다 상당히 더 낮은 역가에 도달하였으며, 이 역가는 r3PIC-GFPart에 대해 관찰된 것과 유사하게 낮았다(도 7; 기호는 개별 병행 세포 배양 웰로부터의 역가를 보여주며; 오차 막대는 평균 +/-SD를 나타낸다). 이것은 3개의 세그먼트를 가진 r3PIC-GFPnat가 그것의 2 세그먼트를 가진 야생형 모 바이러스에 비하여 약독화되었음을 나타냈다.
5.2.6 면역결핍 마우스의 지속적 감염 동안, 인위적 게놈 조직을 가진 재조합 3개의 세그먼트를 가진 바이러스(r3PIC-GFP art )는 트랜스제닉 GFP 발현을 보유하며 야생형 피친드 바이러스(rPIC wt )보다 더 낮은 혈액내 바이러스 역가로 일관되게 남아 있는 반면, 그들의 각 천연 위치에서 그의 당단백질과 핵단백질 유전자를 발현하도록 설계된 3개의 세그먼트를 가진 바이러스(r3PIC-GFP nat )는 결국에는 GFP 발현을 상실하고 rPIC wt 로 감염된 동물과 동등한 혈액내의 바이러스 로드에 도달한다.
본 발명자들은 I 형 및 II 형 인터페론 수용체 및 RAG1에서 삼중-결핍성인 마우스(AGR 마우스; Grob et al, 1999, Role of the individual interferon systems and specific immunity in mice in controlling systemic dissemination of attenuated pseudorabies virus infection. J Virol, 4748-54)를 10e5 병소-형성 단위("FFU")의 r3PIC-GFPart, r3PIC-GFPnat, 또는 rPICwt 바이러스 중 하나로 정맥내로(i.v.) 제0일에 감염시켰다. 본 발명자들은 제7, 14, 21, 28, 35, 42, 56, 77, 98, 120 및 147일에 혈액을 수집하고 FFU 분석에 의해 바이러스 감염성을 결정하였다. 이들 분석에서 본 발명자들은 피친드 바이러스 핵단백질(NP FFU; 도 8) 또는 바이러스 GFP 트랜스유전자를 r3PIC-GFPnat 및 r3PIC-GFPart(GFP FFU; 도 9)에서 검출하였다. 이들 값으로부터 본 발명자들은 각 동물에 대해 그리고 시점에서 NP : GFP FFU 비를 계산하였다(도 10).
감염 후 처음 21 일동안, r3PIC-GFPnat 및 r3PIC-GFPart 총 감염성(NP FFU 분석에 의해 결정됨)은 AGR 마우스의 혈액에서 유사한 수준에서 지속되었으며 rPICwt-감염된 대조군에서보다 대략 10배 더 낮았다(도 8). 하지만, 제28일부터 계속, NP FFU 분석에 의해 결정할 때 r3PIC-GFPnat 감염성은 rPICwt로부터 구별되지 않는 수준에 도달하였다. 역으로, r3PIC-GFPart NP FFU 역가는 147일의 관찰 기간에 걸쳐서 rPICwt의 것보다 대략 10배 더 낮은 수준에서 남아 있었다(도 8).
총 바이러스 감염성을 결정하기 위하여 바이러스 구조 단백질 NP를 검출하는 것 외에(도 8), 본 발명자들은 또한 r3PIC-GFPnat- 및 r3PIC-GFPart-감염된 AGR 마우스의 혈액에서 GFP-발현 트랜스유전자-발현 감염성을 평가하기 위하여 FFU 분석을 수행하였다(GFP FFU, 도 9). NP FFU 역가(도 8)와 매우 대조적으로, r3PIC-GFPnat-감염된 AGR 마우스에서 GFP FFU 역가는 제28일부터 계속 하락하였으며 제120일부터 그 이후에는 검출할 수 없었다(도 9). 이것은 r3PIC-GFPart-감염된 마우스의 혈액에서의 대부분 일정한 GFP FFU 역가(도 9)와 대조되었다. "NP : GFP FFU 비"를 계산함으로써(도 10), 본 발명자들은 r3PIC-GFPart-감염된 마우스에서, 사실상 모든 감염성(NP FFU)이 또한 GFP 트랜스유전자를 발현한 것으로 결정하였다. 이것은 147 일의 관찰 기간에 걸친 1의 범위내의 "NP:GFP FFU 비"에서 나타났다(도 10). 매우 대조적으로, r3PIC-GFPnat-감염된 마우스의 혈액에서 "NP : GFP FFU 비"는 또한 약 1로 시작하였으나 제28일부터 계속 수백 이상에 도달하였다(도 10). 이것은 제28일 및 그 후에 r3PIC-GFPnat-감염 마우스의 혈액에서 순환하는 비리온 집단내에서 단지 약 100분의 1 이하만이 여전히 GFP 트랜스유전자를 발현하였으며, 그리고 GFP-발현 감염성이 결국에는 검출가능한 수준 아래로 떨어졌음을 나타냈다. 따라서, r3PIC-GFPart는 AGR 마우스에서의 147일의 지속적인 감염에 걸쳐서 GFP 트랜스유전자 발현을 보유하였다.
5.2.7 r3PIC-GFP art -감염된 마우스의 혈청으로부터 회수된 바이러스는 r3PIC wt -감염된 동물로부터 분리된 바이러스와 유사한 역가에 도달한 r3PIC-GFP nat -감염된 동물로부터의 것들에 비하여 약독화되어 남아 있었다.
지속적으로 감염된 AGR 마우스의 혈청에서 순환하는 바이러스의 성장 특성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 BHK-21 세포상에서의 감염 후 제147일에 수집된 바이러스혈증 혈청을 계대시키고 48 시간 후에 NP FFU 분석에 의해 바이러스 감염성을 결정하였다. r3PIC-GFPnat-감염된 마우스의 혈청으로부터 성장한 바이러스는 rPICwt 바이러스-감염된 동물로부터의 것보다 유사하거나 더 높은 IFF 역가에 도달하였다(도 11; 기호는 개별 마우스 혈청-유래된 바이러스의 역가를 보여주며; 오차 막대는 평균 +/-SD를 나타냄). 역으로, r3PIC-GFPart-감염된 마우스로부터의 혈청의 계대 후 수득된 바이러스 역가는 전술한 그룹 중 어느 하나보다 상당히 더 낮았다(도 11).
48 시간 동안 계대된 이들 바이러스로부터, 본 발명자들은 세포 배양 성장의 추가 분석을 위하여 각 그룹으로부터 무작위로 4개를 선택하였다. 도 11에 나타난 실험(혈청으로부터 감염성의 직접 계대)과 달리, 이 실험(도 12)은 투입 감염성에 대해 정규화되었으며, 배양에서 도달된 바이러스 역가의 평가에서 잠재적 교란요인으로서 차등적 양의 투입 감염성을 제외하였다. 따라서, 본 발명자들은 표준화된 감염 다중도 = 0.01로 BHK-21 세포를 감염시키고 48 시간 후에 바이러스 역가를 결정하였다(도 12; 기호는 개별 마우스 혈청-유래 바이러스로부터의 역가를 나타내며; 오차 막대는 평균 +/-SD를 나타낸다). 혈청으로부터 직접적 생체외(ex vivo) 계대 후 발견된 역가에서의 차이와 유사하게, r3PIC-GFPnat-유래 바이러스는 rPICwt-유래 바이러스의 역가에 적어도 동등한 역가에 도달하였다. 역으로, 생체내 계대된 r3PIC-GFPart로부터 유래된 바이러스에 의해 도달된 역가는 전술한 두 그룹의 역가보다 상당히 더 낮았다.
이것은 r3PIC-GFPnat-감염된 동물의 혈청으로부터 회수된 바이러스는 더 이상 약독화되지 않은 반면, r3PIC-GFPart-감염된 마우스의 혈액에서 순환하는 바이러스는 여전히 rPICwt-유래 바이러스에 비하여 명백하게 약독화되었음을 제안하였다. 따라서, AGR 마우스에서의 실험에 걸쳐서 rPICwt 바이러스혈증보다 더 낮은 r3PIC-GFPart 바이러스혈증으로부터(섹션 5.2.6 참고), 그리고 또한 세포 배양에서 혈액으로부터 재증폭될 경우 rPICwt 역가보다 낮은 r3PIC-GFPart 역가로부터 판단할 때, r3PIC-GFPart는 마우스에서 생체내 복제의 147일 기간에 걸쳐 그의 약독화를 유지하였다.
5.2.8 r3PIC-GFP nat 와 달리, 인위적 게놈 조직을 가진 재조합 3개의 세그먼트를 가진 바이러스(r3PIC-GFP art )는 그의 두 S 세그먼트를 재조합하지 않았으며 그의 트랜스유전자를 보유하였다
본 발명자들은 AGR 마우스에서의 지속적 감염 과정에서 r3PIC-GFPnat가 단일 RNA 세그먼트상에서 NP 및 GP 유전자를 재결합하기 위하여 그의 두 S 세그먼트를 재조합하여 GFP 트랜스유전자를 제거했을 지를 결정하기 원하였다. 이 가능성을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 바이러스 감염 후 제147일에 각 동물로부터 수집된 혈청 샘플로부터 바이러스 RNA를 추출하였다. 본 발명자들은 각각 피친드 바이러스 NP 및 GP에 결합하도록 설계되었으며 피친드 바이러스 S 세그먼트의 유전자간 영역("IGR")에 걸쳐서 그들이 rPICwt 게놈 주형상에서 357 염기쌍의 PCR 앰플리콘을 생성할 것으로 예상되는 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 그러한 앰플리콘은 사실상 rPICwt 또는 r3PIC-GFPnat으로 감염된 동물로부터의 바이러스 RNA를 이용할 때 수득되었으나, r3PIC-GFPart-감염 마우스의 혈액으로부터의 바이러스 RNA를 이용할 때는 수득되지 않았다(도 13; 각 레인은 도 8-10에 나타난 실험에서 하나의 개별 마우스로부터의 RT-PCR 산물을 나타낸다).
모두 함께, 이들 데이터는 AGR 마우스의 지속적 감염의 과정에서, r3PIC-GFPnat가 RNA의 하나의 단일 세그먼트에서 NP 및 GP 개방 해독 프레임을 재결합하기 위하여 그의 두 S 세그먼트(S-GP/GFPnat, S-NP/GFP)를 재조합하였음을 나타냈다. 그렇게 함으로써 이것은 GFP 트랜스유전자의 발현을 상실하였으며 그의 성장 능력을 rPICwt의 능력으로 증대시켰으며, 두 가지 모두가 마우스에서는 혈액으로부터의 수확 및 세포 배양에서의 재증식시에 나타난 대로 바이러스혈증의 수준에서 그리고 세포 배양에서 명백하다. 역으로, r3PIC-GFPart는 NP 및 GP 유전자에 걸친 RT-PCR 앰플리콘의 결핍에서 명백한 것처럼 그의 두 S 세그먼트를 재조합하지 못했다.
6. 균등물
본 명세서에 개시된 바이러스, 핵산, 방법, 숙주 세포 및 조성물은 본 명세서에 개시된 구체적 실시양태에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 사실상, 개시된 것에 더하여 바이러스, 핵산, 방법, 숙주 세포 및 조성물의 다양한 변형이 전술한 설명과 첨부의 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 첨부의 청구범위의 범위내에 속한다.
다양한 간행물, 특허 및 특허출원이 본 명세서에서 인용되며, 그 내용은 그 전체가 참고로 포함된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허출원이 본 명세서에서 인용되며, 그 내용은 그 전체가 참고로 포함된다.
7. 서열 목록
SEQUENCE LISTING <110> Hookipa Biotech AG <120> TRI-SEGMENTED PICHINDE VIRUSES AS VACCINE VECTORS <130> 13194-020-228 <140> TBA <141> On even date herewith <150> US 62/338,400 <151> 2016-05-18 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pichinde virus strain Munchique CoAn4763 isolate P18 (Genbank accession number EF529746.1) segment S, complete sequence <400> 1 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatgggaca 60 agttgtgact ttgatccagt ctatacccga agtcctgcag gaggtcttca atgtcgcctt 120 aatcattgtc tcaaccctat gcatcatcaa aggatttgtc aatctgatga gatgtggcct 180 attccaactc atcaccttcc tcattttggc tggcagaagt tgtgatggca tgatgattga 240 taggaggcac aatctcaccc acgttgagtt caacctcaca agaatgtttg acaacttgcc 300 acaatcatgt agcaagaaca acacacatca ttactacaaa ggaccatcta acacaacatg 360 gggaattgaa ctcactttga caaacacatc cattgcaaat gaaactactg gaaacttttc 420 caacatcaga agccttgcat atggtaacat tagtaattgt gataagacag aagaagcagg 480 tcacacatta 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taaaagaata tgaagaaaga caaggtaaga ctccactagc 1380 attgacagac atttgcttct ggtctttggt gttttacacc atcacagtgt ttctccactt 1440 agttggaata cccactcata ggcacatcat tggtgatggc tgtccgaagc cacataggat 1500 tactaggaac tctctttgca gctgtgggta ttataaaatc ccaaagaaac cctacaaatg 1560 ggtgagactg ggtaaataag ccctagcctc gacatgggcc tcgacgtcac tccccaatag 1620 gggagtgacg tcgaggcctc tgaggacttg agctcagagg ttgatcagat ctgtgttgtt 1680 cctgtacagc gtgtcaatag gcaagcatct catcggcttc tggtccctaa cccagcctgt 1740 cactgttgca tcaaacatga tggtatcaag caatgcacag tgaggattcg cagtggtttg 1800 tgcagccccc ttcttcttct tctttatgac caaaccttta tgtttggtgc agagtagatt 1860 gtatctctcc cagatctcat cctcaaaggt gcgtgcttgc tcggcactga gtttcacgtc 1920 aagcactttt aagtctcttc tcccatgcat ttcgaacaaa ctgattatat catctgaacc 1980 ttgagcagtg aaaaccatgt tttgaggtaa atgtctgatg attgaggaaa tcaggcctgg 2040 ttgggcatca gccaagtcct ttaaaagaag accatgtgag tacttgcttt gctctttgaa 2100 ggacttctca tcgtggggaa atctgtaaca atgtatgtag ttgcccgtgt caggctggta 2160 gatggccatt tccaccggat catttggtgt tccttcaatg tcaatccatg tggtagcttt 2220 tgaatcaagc atctgaattg aggacacaac agtgtcttct ttctccttag ggatttgttt 2280 aaggtccggt gatcctccgt ttcttactgg tggctggata gcactcggct tcgaatctaa 2340 atctacagtg gtgttatccc aagccctccc ttgaacttga gaccttgagc caatgtaagg 2400 ccaaccatcc cctgaaagac aaatcttgta tagtaaattt tcataaggat ttctctgtcc 2460 gggtgtagtg ctcacaaaca taccttcacg attctttatt tgcaatagac tctttatgag 2520 agtactaaac atagaaggct tcacctggat ggtctcaagc atattgccac catcaatcat 2580 gcaagcagct gctttgactg ctgcagacaa actgagattg taccctgaga tgtttatggc 2640 tgatggctca ttactaatga tttttagggc actgtgttgc tgtgtgagtt tctctagatc 2700 tgtcatgttc gggaacttga cagtgtagag caaaccaagt gcactcagcg cttggacaac 2760 atcattaagt tgttcacccc cttgctcagt catacaagcg atggttaagg ctggcattga 2820 tccaaattga ttgatcaaca atgtattatc cttgatgtcc cagatcttca caaccccatc 2880 tctgttgcct gtgggtctag cattagcgaa ccccattgag cgaaggattt cggctctttg 2940 ttccaactga gtgtttgtga gattgccccc ataaacacca ggctgagaca aactctcagt 3000 tctagtgact ttctttctta acttgtccaa atcagatgca agctccatta gctcctcttt 3060 ggctaagcct cccaccttaa gcacattgtc cctctggatt gatctcatat tcatcagagc 3120 atcaacctct ttgttcatgt ctcttaactt ggtcagatca gaatcagtcc ttttatcttt 3180 gcgcatcatt ctttgaactt gagcaacttt gtgaaagtca agagcagata acagtgctct 3240 tgtgtccgac aacacatcag ccttcacagg atgggtccag ttggatagac ccctcctaag 3300 ggactgtacc cagcggaatg atgggatgtt gtcagacatt ttggggttgt ttgcacttcc 3360 tccgagtcag tgaagaagtg aacgtacagc gtgatctaga atcgcctagg atccactgtg 3420 cg 3422 <210> 2 <211> 7058 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIC-L-seg: Pichinde virus strain Munchique CoAn4763 isolate P18 (Genbank accession number EF529747.1) segment L, complete sequence with non-coding mutations introduced to delete BsmBI restriction sites <400> 2 gcgcaccggg gatcctaggc atctttgggt cacgcttcaa atttgtccaa tttgaaccca 60 gctcaagtcc tggtcaaaac ttgggatggg actcagatat agcaaagagg tcaggaagag 120 acatggcgac gaagatgtgg tgggaagggt ccccatgacc ctcaatctac cacagggcct 180 gtatggcagg ttcaactgca 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agtatgtggt tgatgcccac cttgtcctca 1920 agctcagaat gtgtgcttgg ttttattggc cagaagtgat tgggattgtt taggtgagtg 1980 actatcttgg gtacttcagc tttttgaaac acccagttac ccaactcgca agcattggtt 2040 aacacaagag caaaataatc ccaaattaag ggtctggagt actcacttac ttcaccaagt 2100 gctgctttac aataaacacc tttgcgctga ttacaaaagt gacaatcacg gtgtaagata 2160 atcttgcttg taatatccct gatatactta aatcctcctt tcccatctct tacacatttt 2220 gagcccatac ttttgcaaac tcctatgaat cctgatgcta tgctgctctg aaaagctgat 2280 ttgttgatag catcagccaa aatcttctta gcccctctga catagttctt tgataatttg 2340 gactgtacgg atttgacaag actgggtatt tcttctcgct gcacagttct tgttgtgctc 2400 attaacttag tacgaagcac caatctgaga tcaccatgaa cccttaaatt taaccaccta 2460 atattaagag catcctcaat agcctcagtc tcgacatcac aagtctctaa taactgtttt 2520 aagcagtcat ccggtgattg ctgaagagtt gttacaatat aactttcttc cagggctcca 2580 gactgtattt tgtaaaatat tttcctgcat gcctttctga ttattgaaag tagcagatca 2640 tcaggaaata gtgtctcaat tgatcgctga agtctgtacc ctctcgaccc attaacccaa 2700 tcgagtacat ccatttcttc caggcacaaa 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ttttttattt ggatcaatga tgacaacctc 4440 ttcagaatct tgaaatttac ctcctttgga tctaacttgt atttaccctt agttttgaaa 4500 tgttcaatca tttccacaac aacagcagac acaatggaag agtaatcata ttcagtgatg 4560 acctcaccaa cttcattgag ttttggaacc accacacttt tgttgctgga catatccaag 4620 gctgtacttg tgaaggaggg agtcataggg tcacaaggaa gcaggggttt cacttccaat 4680 gagctactgt taaatagtga tagacaaaca ctaagtacat ccttattcaa ccccggcctt 4740 ccctcacatt tggattccag ctttttacca agtagtctct ctatatcatg caccatcttc 4800 tcttcttcct cagtaggaag ttccatacta ttagaagggt tgaccaagac tgaatcaaac 4860 tttaactttg gttccaagaa cttctcaaaa catttgattt gatcagttaa tctatcaggg 4920 gtttctttgg ttataaaatg gcataaatag gagacattca aaacaaactt aaagatctta 4980 gccatatctt cctctctgga gttgctgagt accagaagta tcaaatcatc aataagcatt 5040 gctgtctgcc attctgaagg tgttagcata acgactttca atttctcaaa caattcttta 5100 aaatgaactt catttacaaa ggccataatg taatatctaa agccttgcaa gtaaacttga 5160 atacgcttgg aaggggtgca cagtatgcag agaataagtc gtctgagtaa atcagaaaca 5220 gaatccaaga ggggttggga cataaagtcc 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acttgtgcaa gaacgttgtt tttctgttca 6960 gatagctctt cccattcggg aacccatttt ctgactatgt ctttaagttc gaaaacgtat 7020 tcctccatga tcaagaaatg cctaggatcc tcggtgcg 7058 <210> 3 <211> 6619 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-delat-BsmBI: Modified Representative cDNA of the L ORF of Pichinde virus strain Munchique CoAn4763 isolate P18 (Genbank accession number EF529747.1) <400> 3 gaattccgtc tctgatcatg gaggaatacg ttttcgaact taaagacata gtcagaaaat 60 gggttcccga atgggaagag ctatctgaac agaaaaacaa cgttcttgca caagtcaaag 120 atagggccat cacgatagag ggcctgaagc ttttgtccat gctagtggaa gtggattcat 180 gcaagaaaca ctcctgcaaa cacaacacaa agatgactgt caatgctatc cttagggagt 240 tgagagtaac atgtcctaca ttgccggatg ttacaccaga tggttactgt atggttggag 300 atgtcctcat tcttttggaa gtgtttgtga ggaccagtca agaagcattt gagaagaaat 360 acaaccagga ctttttgaag ctgttgcagc ttagttctga tctcaagaga cagaacataa 420 ccttagtacc tgttattgac ggtagatcca gttattatgt agaatttgtt cctgattggg 480 tggtagagag acttcggtgg ttgcttttaa aactcatgga tggattaagg 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cDNA of a modified S segment cDNA of Pichinde virus strain Munchique CoAn4763 isolate P18 (Genbank accession number: EF529746.1) <400> 5 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agagagacga 60 ggcctcgtct ctgccctagc ctcgacatgg gcctcgacgt cactccccaa taggggagtg 120 acgtcgaggc ctctgaggac ttgagcatgt cttcttactt gtacagctcg tccatgccga 180 gagtgatccc ggcggcggtc acgaactcca gcaggaccat gtgatcgcgc ttctcgttgg 240 ggtctttgct cagggcggac tgggtgctca ggtagtggtt gtcgggcagc agcacggggc 300 cgtcgccgat gggggtgttc tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg ccgtcctcga 360 tgttgtggcg ggtcttgaag ttcaccttga tgccgttctt ctgcttgtcg gcggtgatat 420 agaccttgtg gctgttgtag ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg ccgtcctcct 480 tgaagtcgat gcccttcagc tcgatgcggt tcaccagggt gtcgccctcg aacttcacct 540 cggcgcgggt cttgtagttg ccgtcgtcct tgaagaagat ggtgcgctcc tggacgtagc 600 cttcgggcat ggcggacttg aagaagtcgt gctgcttcat gtggtcgggg tagcggacga 660 agcactgcac gccgtaggtc aaggtggtca cgagggtggg ccagggcacg ggcagcttgc 720 cggtggtgca gatgaacttc agggtcagct tgccgtaggt ggcatcgccc tcgccctcgc 780 cggacacgct gaacttgtgg ccgtttacgt cgccgtccag ctcgaccagg atgggcacca 840 ccccggtgaa cagctcctcg cccttgctca ccatgaagac attttggggt tgtttgcact 900 tcctccgagt cagtgaagaa gtgaacgtac agcgtgatct agaatcgcct aggatccact 960 gtgcg 965 <210> 6 <211> 1722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-delta-BbsI : Modified Representative cDNA of a modified NP ORF of Pichinde virus strain Munchique CoAn4763 isolate P18 (Genbank accession number EF529747.1) <400> 6 gaattcgaag acatcaaaat gtctgacaac atcccatcat tccgctgggt acagtccctt 60 aggaggggtc tatccaactg gacccatcct gtgaaggctg atgtgttgtc ggacacaaga 120 gcactgttat ctgctcttga ctttcacaaa gttgctcaag ttcaaagaat gatgcgcaaa 180 gataaaagga ctgattctga tctgaccaag ttaagagaca tgaacaaaga ggttgatgct 240 ctgatgaata tgagatcaat ccagagggac aatgtgctta aggtgggagg cttagccaaa 300 gaggagctaa tggagcttgc atctgatttg gacaagttaa gaaagaaagt cactagaact 360 gagagtttgt ctcagcctgg tgtttatggg ggcaatctca caaacactca gttggaacaa 420 agagccgaaa tccttcgctc aatggggttc gctaatgcta gacccacagg caacagagat 480 ggggttgtga agatctggga catcaaggat aatacattgt tgatcaatca atttggatca 540 atgccagcct taaccatcgc ttgtatgact gagcaagggg gtgaacaact taatgatgtt 600 gtccaagcgc tgagtgcact tggtttgctc tacactgtca agttcccgaa catgacagat 660 ctagagaaac tcacacagca acacagtgcc ctaaaaatca ttagtaatga gccatcagcc 720 ataaacatct cagggtacaa tctcagtttg tctgcagcag tcaaagcagc tgcttgcatg 780 attgatggtg gcaatatgct tgagaccatc caggtgaagc cttctatgtt tagtactctc 840 ataaagagtc tattgcaaat aaagaatcgt gaaggtatgt ttgtgagcac tacacccgga 900 cagagaaatc cttatgaaaa tttactatac aagatttgtc tttcagggga tggttggcct 960 tacattggct caaggtctca agttcaaggg agggcttggg ataacaccac tgtagattta 1020 gattcgaagc cgagtgctat ccagccacca gtaagaaacg gaggatcacc ggaccttaaa 1080 caaatcccta aggagaaaga agatactgtt gtgtcctcaa ttcagatgct tgattcaaaa 1140 gctaccacat ggattgacat tgaaggaaca ccaaatgatc cggtggaaat ggccatctac 1200 cagcctgaca cgggcaacta catacattgt tacagatttc cccacgatga gaagtccttc 1260 aaagagcaaa gcaagtactc acatggtctc cttttaaagg acttggctga tgcccaacca 1320 ggcctgattt cctcaatcat cagacattta cctcaaaaca tggttttcac tgctcaaggt 1380 tcagatgata taatcagttt gttcgaaatg catgggagaa gagacttaaa agtgcttgac 1440 gtgaaactca gtgccgagca agcacgcacc tttgaggatg agatctggga gagatacaat 1500 ctactctgca ccaaacataa aggtttggtc ataaagaaga agaagaaggg ggctgcacaa 1560 accactgcga atcctcactg tgcattgctt gataccatca tgtttgatgc aacagtgaca 1620 ggctgggtta gggaccagaa gccgatgaga tgcttgccta ttgacacgct gtacaggaac 1680 aacacagatc tgatcaacct ctgagctcat gtcttcgcta gc 1722 <210> 7 <211> 1915 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIC-NP-Bsm : Representative cDNA obtained when NP-delta-BbsI was digested with BbsI to insert the BbsI-mutated NP ORF into the equally digested pol-I-PIC-miniS-GFP backbone, thereby replacing the GFP ORF with the NP ORF <400> 7 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agagagacga 60 ggcctcgtct ctgccctagc ctcgacatgg gcctcgacgt cactccccaa taggggagtg 120 acgtcgaggc ctctgaggac ttgagctcag aggttgatca gatctgtgtt gttcctgtac 180 agcgtgtcaa taggcaagca tctcatcggc ttctggtccc taacccagcc tgtcactgtt 240 gcatcaaaca tgatggtatc aagcaatgca cagtgaggat tcgcagtggt ttgtgcagcc 300 cccttcttct tcttctttat gaccaaacct ttatgtttgg tgcagagtag attgtatctc 360 tcccagatct catcctcaaa ggtgcgtgct tgctcggcac tgagtttcac gtcaagcact 420 tttaagtctc ttctcccatg catttcgaac aaactgatta tatcatctga accttgagca 480 gtgaaaacca tgttttgagg taaatgtctg atgattgagg aaatcaggcc tggttgggca 540 tcagccaagt cctttaaaag gagaccatgt gagtacttgc tttgctcttt gaaggacttc 600 tcatcgtggg gaaatctgta acaatgtatg tagttgcccg tgtcaggctg gtagatggcc 660 atttccaccg gatcatttgg tgttccttca atgtcaatcc atgtggtagc ttttgaatca 720 agcatctgaa ttgaggacac aacagtatct tctttctcct tagggatttg tttaaggtcc 780 ggtgatcctc cgtttcttac tggtggctgg atagcactcg gcttcgaatc taaatctaca 840 gtggtgttat cccaagccct cccttgaact tgagaccttg agccaatgta aggccaacca 900 tcccctgaaa gacaaatctt gtatagtaaa ttttcataag gatttctctg tccgggtgta 960 gtgctcacaa acataccttc acgattcttt atttgcaata gactctttat gagagtacta 1020 aacatagaag gcttcacctg gatggtctca agcatattgc caccatcaat catgcaagca 1080 gctgctttga ctgctgcaga caaactgaga ttgtaccctg agatgtttat ggctgatggc 1140 tcattactaa tgatttttag ggcactgtgt tgctgtgtga gtttctctag atctgtcatg 1200 ttcgggaact tgacagtgta gagcaaacca agtgcactca gcgcttggac aacatcatta 1260 agttgttcac ccccttgctc agtcatacaa gcgatggtta aggctggcat tgatccaaat 1320 tgattgatca acaatgtatt atccttgatg tcccagatct tcacaacccc atctctgttg 1380 cctgtgggtc tagcattagc gaaccccatt gagcgaagga tttcggctct ttgttccaac 1440 tgagtgtttg tgagattgcc cccataaaca ccaggctgag acaaactctc agttctagtg 1500 actttctttc ttaacttgtc caaatcagat gcaagctcca ttagctcctc tttggctaag 1560 cctcccacct taagcacatt gtccctctgg attgatctca tattcatcag agcatcaacc 1620 tctttgttca tgtctcttaa cttggtcaga tcagaatcag tccttttatc tttgcgcatc 1680 attctttgaa cttgagcaac tttgtgaaag tcaagagcag ataacagtgc tcttgtgtcc 1740 gacaacacat cagccttcac aggatgggtc cagttggata gacccctcct aagggactgt 1800 acccagcgga atgatgggat gttgtcagac attttggggt tgtttgcact tcctccgagt 1860 cagtgaagaa gtgaacgtac agcgtgatct agaatcgcct aggatccact gtgcg 1915 <210> 8 <211> 1756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIC-GP-Bsm: Representative cDNA obtained when GP-delta-BbsI was digested with BbsI to insert the BbsI-mutated GP ORF into the equally digested pol-I-PIC-miniS-GFP backbone, thereby replacing the GFP ORF with the GP ORF. <400> 8 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agagagacga 60 ggcctcgtct ctgccctagc ctcgacatgg gcctcgacgt cactccccaa taggggagtg 120 acgtcgaggc ctctgaggac ttgagcttat ttacccagtc tcacccattt gtagggtttc 180 tttgggattt tataataccc acagctgcaa agagagttcc tagtaatcct atgtggcttc 240 ggacagccat caccaatgat gtgcctatga gtgggtattc caactaagtg gagaaacact 300 gtgatggtgt aaaacaccaa agaccagaag caaatgtctg tcaatgctag tggagtctta 360 ccttgtcttt cttcatattc ttttatcagc atttcattgt acagattctg gctctcccac 420 aaccaatcat tcttaaaatg cgtttcattg aggtacgagc cattgtgaac taaccaacac 480 tgcggtaaag aatgtctccc tgtgatggta tcattgatgt accaaaattt tgtatagttg 540 caataaggga ttttggcaag ctgtttgaga ctgtttctaa tcacaagtga gtcagaaata 600 agtccgttga tagtcttttt aaagagattc aacgaattct caacattaag ttgtaaggtt 660 ttgatagcat tctgattgaa atcaaataac ctcatcgtat cgcaaaattc ttcattgtga 720 tctttgttgc attttgccat cacagtgtta tcaaaacatt ttattccagc ccaaacaata 780 gcccattgct ccaaacagta accacctggg acatgttgcc cagtagagtc actcaagtcc 840 caagtgaaaa agccaaggag tttcctgctc acagaactat aagcagtttt ttggagagcc 900 atccttattg ttgccattgg agtatatgta cagtgatttt cccatgtggt gttctgtatg 960 atcaggaaat tgtaatgtgt cccaccttca cagtttgtta gtctgcaaga ccctccacta 1020 cagttattga aacattttcc aacccacgca atttttgggt ccccaatgat ttgagcaagc 1080 gacgcaataa gatgtctgcc aacctcacct cctctatccc caactgtcaa gttgtactgg 1140 atcaacaccc cagcaccctc aactgttttg catctggcac ctacatgacg agtgacatgg 1200 agcacattga agtgtaactc attaagcaac cattttaatg tgtgacctgc ttcttctgtc 1260 ttatcacaat tactaatgtt accatatgca aggcttctga tgttggaaaa gtttccagta 1320 gtttcatttg caatggatgt gtttgtcaaa gtgagttcaa ttccccatgt tgtgttagat 1380 ggtcctttgt agtaatgatg tgtgttgttc ttgctacatg attgtggcaa gttgtcaaac 1440 attcttgtga ggttgaactc aacgtgggtg agattgtgcc tcctatcaat catcatgcca 1500 tcacaacttc tgccagccaa aatgaggaag gtgatgagtt ggaataggcc acatctcatc 1560 agattgacaa atcctttgat gatgcatagg gttgagacaa tgattaaggc gacattgaac 1620 acctcctgca ggacttcggg tatagactgg atcaaagtca caacttgtcc cattttgggg 1680 ttgtttgcac ttcctccgag tcagtgaaga agtgaacgta cagcgtgatc tagaatcgcc 1740 taggatccac tgtgcg 1756 <210> 9 <211> 742 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-Bsm: Green fluorescent protein(GFP) synthesized with flanking BsmBI sites <400> 9 cgtctctaaa gatggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 60 tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 120 atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 180 cctggcccac cctcgtgacc accttgacct acggcgtgca gtgcttcgtc cgctaccccg 240 accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 300 gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 360 gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 420 tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa ggtctatatc accgccgaca 480 agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agacccgcca caacatcgag gacggcagcg 540 tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 600 ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 660 atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 720 tgtacaagta agcccagaga cg 742 <210> 10 <211> 1261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sP1AGM-Bsm: Fusion protein consisting of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) signal peptide; the P1A antigen of the P815 mouse mastocytoma tumor cell line, a GSG linker, an enterovirus 2A peptide and mouse GM-CSF synthesized with flanking BsmBI sites <400> 10 cgtctctaag gatgaaatgc ctcctctacc ttgcatttct cttcattgga gtcaactgca 60 tgagtgacaa caagaagcct gacaaggccc actctggcag tggaggagat ggtgatggca 120 acagatgcaa cctgctgcac agatacagcc tggaagagat cctgccctac ctgggctggc 180 tggtgtttgc tgtggtgaca acaagcttcc tggccctgca gatgttcatt gatgccctgt 240 atgaggaaca gtatgagagg gatgtggcct ggattgccag acagagcaag agaatgagca 300 gtgtggatga ggatgaggat gatgaggatg atgaagatga ctactatgat gatgaggatg 360 atgatgatga tgccttctat gatgatgagg atgatgaaga ggaagaactg gaaaacctga 420 tggatgatga gtctgaggat gaggctgagg aagagatgag tgtggaaatg ggggctgggg 480 cagaagagat gggagcaggt gccaactgtg cttgtgtgcc aggacaccac ctgagaaaga 540 atgaagtgaa gtgcaggatg atctacttct tccatgaccc caactttctg gtgtccatcc 600 ctgtgaaccc caaagaacag atggaatgca gatgtgagaa tgcagatgaa gaggtggcca 660 tggaagaaga agaggaagag gaagaagaag aagaagagga agaaatgggc aacccagatg 720 gcttcagccc tggaagtggt caccatcacc accatcatgg cagtggggca accaacttca 780 gcctgctgaa acaggctggg gatgtggaag aaaatcctgg ccccatgtgg ctccagaatc 840 tgctttttct gggcattgtg gtttacagcc tgagtgcacc cacaagatct cccatcacag 900 tgacaagacc ttggaagcat gtggaagcaa tcaaagaggc cctgaatctg cttgatgaca 960 tgccagtgac cctgaatgaa gaagtggaag tggtgtcaaa tgagttcagc ttcaaaaaac 1020 tgacctgtgt gcagaccagg ctgaaaattt ttgaacaggg cctgagagga aacttcacaa 1080 agctgaaggg agctctgaac atgactgcca gctactacca gacctactgc ccccccaccc 1140 cagagacaga ttgtgagaca caagtgacca cctatgctga cttcattgac agcctgaaaa 1200 ccttcctgac tgacatcccc tttgagtgca agaaacctgt gcagaagtga agaaagagac 1260 g 1261 <210> 11 <211> 2615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIC-NP-GFP <400> 11 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatggtgag 60 caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 120 aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 180 gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 240 caccttgacc tacggcgtgc agtgcttcgt ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 300 cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 360 cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 420 catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 480 gtacaactac aacagccaca aggtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 540 ggtgaacttc aagacccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 600 ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 660 cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 720 gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagccctagc 780 ctcgacatgg gcctcgacgt cactccccaa taggggagtg acgtcgaggc ctctgaggac 840 ttgagctcag aggttgatca gatctgtgtt gttcctgtac agcgtgtcaa taggcaagca 900 tctcatcggc ttctggtccc taacccagcc tgtcactgtt gcatcaaaca tgatggtatc 960 aagcaatgca cagtgaggat tcgcagtggt ttgtgcagcc cccttcttct tcttctttat 1020 gaccaaacct ttatgtttgg tgcagagtag attgtatctc tcccagatct catcctcaaa 1080 ggtgcgtgct tgctcggcac tgagtttcac gtcaagcact tttaagtctc ttctcccatg 1140 catttcgaac aaactgatta tatcatctga accttgagca gtgaaaacca tgttttgagg 1200 taaatgtctg atgattgagg aaatcaggcc tggttgggca tcagccaagt cctttaaaag 1260 gagaccatgt gagtacttgc tttgctcttt gaaggacttc tcatcgtggg gaaatctgta 1320 acaatgtatg tagttgcccg tgtcaggctg gtagatggcc atttccaccg gatcatttgg 1380 tgttccttca atgtcaatcc atgtggtagc ttttgaatca agcatctgaa ttgaggacac 1440 aacagtatct tctttctcct tagggatttg tttaaggtcc ggtgatcctc cgtttcttac 1500 tggtggctgg atagcactcg gcttcgaatc taaatctaca gtggtgttat cccaagccct 1560 cccttgaact tgagaccttg agccaatgta aggccaacca tcccctgaaa gacaaatctt 1620 gtatagtaaa ttttcataag gatttctctg tccgggtgta gtgctcacaa acataccttc 1680 acgattcttt atttgcaata gactctttat gagagtacta aacatagaag gcttcacctg 1740 gatggtctca agcatattgc caccatcaat catgcaagca gctgctttga ctgctgcaga 1800 caaactgaga ttgtaccctg agatgtttat ggctgatggc tcattactaa tgatttttag 1860 ggcactgtgt tgctgtgtga gtttctctag atctgtcatg ttcgggaact tgacagtgta 1920 gagcaaacca agtgcactca gcgcttggac aacatcatta agttgttcac ccccttgctc 1980 agtcatacaa gcgatggtta aggctggcat tgatccaaat tgattgatca acaatgtatt 2040 atccttgatg tcccagatct tcacaacccc atctctgttg cctgtgggtc tagcattagc 2100 gaaccccatt gagcgaagga tttcggctct ttgttccaac tgagtgtttg tgagattgcc 2160 cccataaaca ccaggctgag acaaactctc agttctagtg actttctttc ttaacttgtc 2220 caaatcagat gcaagctcca ttagctcctc tttggctaag cctcccacct taagcacatt 2280 gtccctctgg attgatctca tattcatcag agcatcaacc tctttgttca tgtctcttaa 2340 cttggtcaga tcagaatcag tccttttatc tttgcgcatc attctttgaa cttgagcaac 2400 tttgtgaaag tcaagagcag ataacagtgc tcttgtgtcc gacaacacat cagccttcac 2460 aggatgggtc cagttggata gacccctcct aagggactgt acccagcgga atgatgggat 2520 gttgtcagac attttggggt tgtttgcact tcctccgagt cagtgaagaa gtgaacgtac 2580 agcgtgatct agaatcgcct aggatccact gtgcg 2615 <210> 12 <211> 3131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIC-NP-sP1AGM <400> 12 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatgaaatg 60 cctcctctac cttgcatttc tcttcattgg agtcaactgc atgagtgaca acaagaagcc 120 tgacaaggcc cactctggca gtggaggaga tggtgatggc aacagatgca acctgctgca 180 cagatacagc ctggaagaga tcctgcccta cctgggctgg ctggtgtttg ctgtggtgac 240 aacaagcttc ctggccctgc agatgttcat tgatgccctg tatgaggaac agtatgagag 300 ggatgtggcc tggattgcca gacagagcaa gagaatgagc agtgtggatg aggatgagga 360 tgatgaggat gatgaagatg actactatga tgatgaggat gatgatgatg atgccttcta 420 tgatgatgag gatgatgaag aggaagaact ggaaaacctg atggatgatg agtctgagga 480 tgaggctgag gaagagatga gtgtggaaat gggggctggg gcagaagaga tgggagcagg 540 tgccaactgt gcttgtgtgc caggacacca cctgagaaag aatgaagtga agtgcaggat 600 gatctacttc ttccatgacc ccaactttct ggtgtccatc cctgtgaacc ccaaagaaca 660 gatggaatgc agatgtgaga atgcagatga agaggtggcc atggaagaag aagaggaaga 720 ggaagaagaa gaagaagagg aagaaatggg caacccagat ggcttcagcc ctggaagtgg 780 tcaccatcac caccatcatg gcagtggggc aaccaacttc agcctgctga aacaggctgg 840 ggatgtggaa gaaaatcctg gcccctggct ccagaatctg ctttttctgg gcattgtggt 900 ttacagcctg agtgcaccca caagatctcc catcacagtg acaagacctt ggaagcatgt 960 ggaagcaatc aaagaggccc tgaatctgct tgatgacatg ccagtgaccc tgaatgaaga 1020 agtggaagtg gtgtcaaatg agttcagctt caaaaaactg acctgtgtgc agaccaggct 1080 gaaaattttt gaacagggcc tgagaggaaa cttcacaaag ctgaagggag ctctgaacat 1140 gactgccagc tactaccaga cctactgccc ccccacccca gagacagatt gtgagacaca 1200 agtgaccacc tatgctgact tcattgacag cctgaaaacc ttcctgactg acatcccctt 1260 tgagtgcaag aaacctgtgc agaagtgagc cctagcctcg acatgggcct cgacgtcact 1320 ccccaatagg ggagtgacgt cgaggcctct gaggacttga gctcagaggt tgatcagatc 1380 tgtgttgttc ctgtacagcg tgtcaatagg caagcatctc atcggcttct ggtccctaac 1440 ccagcctgtc actgttgcat caaacatgat ggtatcaagc aatgcacagt gaggattcgc 1500 agtggtttgt gcagccccct tcttcttctt ctttatgacc aaacctttat gtttggtgca 1560 gagtagattg tatctctccc agatctcatc ctcaaaggtg cgtgcttgct cggcactgag 1620 tttcacgtca agcactttta agtctcttct cccatgcatt tcgaacaaac tgattatatc 1680 atctgaacct tgagcagtga aaaccatgtt ttgaggtaaa tgtctgatga ttgaggaaat 1740 caggcctggt tgggcatcag ccaagtcctt taaaaggaga ccatgtgagt acttgctttg 1800 ctctttgaag gacttctcat cgtggggaaa tctgtaacaa tgtatgtagt tgcccgtgtc 1860 aggctggtag atggccattt ccaccggatc atttggtgtt ccttcaatgt caatccatgt 1920 ggtagctttt gaatcaagca tctgaattga ggacacaaca gtatcttctt tctccttagg 1980 gatttgttta aggtccggtg atcctccgtt tcttactggt ggctggatag cactcggctt 2040 cgaatctaaa tctacagtgg tgttatccca agccctccct tgaacttgag accttgagcc 2100 aatgtaaggc caaccatccc ctgaaagaca aatcttgtat agtaaatttt cataaggatt 2160 tctctgtccg ggtgtagtgc tcacaaacat accttcacga ttctttattt gcaatagact 2220 ctttatgaga gtactaaaca tagaaggctt cacctggatg gtctcaagca tattgccacc 2280 atcaatcatg caagcagctg ctttgactgc tgcagacaaa ctgagattgt accctgagat 2340 gtttatggct gatggctcat tactaatgat ttttagggca ctgtgttgct gtgtgagttt 2400 ctctagatct gtcatgttcg ggaacttgac agtgtagagc aaaccaagtg cactcagcgc 2460 ttggacaaca tcattaagtt gttcaccccc ttgctcagtc atacaagcga tggttaaggc 2520 tggcattgat ccaaattgat tgatcaacaa tgtattatcc ttgatgtccc agatcttcac 2580 aaccccatct ctgttgcctg tgggtctagc attagcgaac cccattgagc gaaggatttc 2640 ggctctttgt tccaactgag tgtttgtgag attgccccca taaacaccag gctgagacaa 2700 actctcagtt ctagtgactt tctttcttaa cttgtccaaa tcagatgcaa gctccattag 2760 ctcctctttg gctaagcctc ccaccttaag cacattgtcc ctctggattg atctcatatt 2820 catcagagca tcaacctctt tgttcatgtc tcttaacttg gtcagatcag aatcagtcct 2880 tttatctttg cgcatcattc tttgaacttg agcaactttg tgaaagtcaa gagcagataa 2940 cagtgctctt gtgtccgaca acacatcagc cttcacagga tgggtccagt tggatagacc 3000 cctcctaagg gactgtaccc agcggaatga tgggatgttg tcagacattt tggggttgtt 3060 tgcacttcct ccgagtcagt gaagaagtga acgtacagcg tgatctagaa tcgcctagga 3120 tccactgtgc g 3131 <210> 13 <211> 2456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIC-GP-GFP <400> 13 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatggtgag 60 caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 120 aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 180 gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 240 caccttgacc tacggcgtgc agtgcttcgt ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 300 cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 360 cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 420 catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 480 gtacaactac aacagccaca aggtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 540 ggtgaacttc aagacccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 600 ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 660 cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 720 gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagccctagc 780 ctcgacatgg gcctcgacgt cactccccaa taggggagtg acgtcgaggc ctctgaggac 840 ttgagcttat ttacccagtc tcacccattt gtagggtttc tttgggattt tataataccc 900 acagctgcaa agagagttcc tagtaatcct atgtggcttc ggacagccat caccaatgat 960 gtgcctatga gtgggtattc caactaagtg gagaaacact gtgatggtgt aaaacaccaa 1020 agaccagaag caaatgtctg tcaatgctag tggagtctta ccttgtcttt cttcatattc 1080 ttttatcagc atttcattgt acagattctg gctctcccac aaccaatcat tcttaaaatg 1140 cgtttcattg aggtacgagc cattgtgaac taaccaacac tgcggtaaag aatgtctccc 1200 tgtgatggta tcattgatgt accaaaattt tgtatagttg caataaggga ttttggcaag 1260 ctgtttgaga ctgtttctaa tcacaagtga gtcagaaata agtccgttga tagtcttttt 1320 aaagagattc aacgaattct caacattaag ttgtaaggtt ttgatagcat tctgattgaa 1380 atcaaataac ctcatcgtat cgcaaaattc ttcattgtga tctttgttgc attttgccat 1440 cacagtgtta tcaaaacatt ttattccagc ccaaacaata gcccattgct ccaaacagta 1500 accacctggg acatgttgcc cagtagagtc actcaagtcc caagtgaaaa agccaaggag 1560 tttcctgctc acagaactat aagcagtttt ttggagagcc atccttattg ttgccattgg 1620 agtatatgta cagtgatttt cccatgtggt gttctgtatg atcaggaaat tgtaatgtgt 1680 cccaccttca cagtttgtta gtctgcaaga ccctccacta cagttattga aacattttcc 1740 aacccacgca atttttgggt ccccaatgat ttgagcaagc gacgcaataa gatgtctgcc 1800 aacctcacct cctctatccc caactgtcaa gttgtactgg atcaacaccc cagcaccctc 1860 aactgttttg catctggcac ctacatgacg agtgacatgg agcacattga agtgtaactc 1920 attaagcaac cattttaatg tgtgacctgc ttcttctgtc ttatcacaat tactaatgtt 1980 accatatgca aggcttctga tgttggaaaa gtttccagta gtttcatttg caatggatgt 2040 gtttgtcaaa gtgagttcaa ttccccatgt tgtgttagat ggtcctttgt agtaatgatg 2100 tgtgttgttc ttgctacatg attgtggcaa gttgtcaaac attcttgtga ggttgaactc 2160 aacgtgggtg agattgtgcc tcctatcaat catcatgcca tcacaacttc tgccagccaa 2220 aatgaggaag gtgatgagtt ggaataggcc acatctcatc agattgacaa atcctttgat 2280 gatgcatagg gttgagacaa tgattaaggc gacattgaac acctcctgca ggacttcggg 2340 tatagactgg atcaaagtca caacttgtcc cattttgggg ttgtttgcac ttcctccgag 2400 tcagtgaaga agtgaacgta cagcgtgatc tagaatcgcc taggatccac tgtgcg 2456 <210> 14 <211> 2972 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIC-GP-sP1AGM <400> 14 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatgaaatg 60 cctcctctac cttgcatttc tcttcattgg agtcaactgc atgagtgaca acaagaagcc 120 tgacaaggcc cactctggca gtggaggaga tggtgatggc aacagatgca acctgctgca 180 cagatacagc ctggaagaga tcctgcccta cctgggctgg ctggtgtttg ctgtggtgac 240 aacaagcttc ctggccctgc agatgttcat tgatgccctg tatgaggaac agtatgagag 300 ggatgtggcc tggattgcca gacagagcaa gagaatgagc agtgtggatg aggatgagga 360 tgatgaggat gatgaagatg actactatga tgatgaggat gatgatgatg atgccttcta 420 tgatgatgag gatgatgaag aggaagaact ggaaaacctg atggatgatg agtctgagga 480 tgaggctgag gaagagatga gtgtggaaat gggggctggg gcagaagaga tgggagcagg 540 tgccaactgt gcttgtgtgc caggacacca cctgagaaag aatgaagtga agtgcaggat 600 gatctacttc ttccatgacc ccaactttct ggtgtccatc cctgtgaacc ccaaagaaca 660 gatggaatgc agatgtgaga atgcagatga agaggtggcc atggaagaag aagaggaaga 720 ggaagaagaa gaagaagagg aagaaatggg caacccagat ggcttcagcc ctggaagtgg 780 tcaccatcac caccatcatg gcagtggggc aaccaacttc agcctgctga aacaggctgg 840 ggatgtggaa gaaaatcctg gcccctggct ccagaatctg ctttttctgg gcattgtggt 900 ttacagcctg agtgcaccca caagatctcc catcacagtg acaagacctt ggaagcatgt 960 ggaagcaatc aaagaggccc tgaatctgct tgatgacatg ccagtgaccc tgaatgaaga 1020 agtggaagtg gtgtcaaatg agttcagctt caaaaaactg acctgtgtgc agaccaggct 1080 gaaaattttt gaacagggcc tgagaggaaa cttcacaaag ctgaagggag ctctgaacat 1140 gactgccagc tactaccaga cctactgccc ccccacccca gagacagatt gtgagacaca 1200 agtgaccacc tatgctgact tcattgacag cctgaaaacc ttcctgactg acatcccctt 1260 tgagtgcaag aaacctgtgc agaagtgagc cctagcctcg acatgggcct cgacgtcact 1320 ccccaatagg ggagtgacgt cgaggcctct gaggacttga gcttatttac ccagtctcac 1380 ccatttgtag ggtttctttg ggattttata atacccacag ctgcaaagag agttcctagt 1440 aatcctatgt ggcttcggac agccatcacc aatgatgtgc ctatgagtgg gtattccaac 1500 taagtggaga aacactgtga tggtgtaaaa caccaaagac cagaagcaaa tgtctgtcaa 1560 tgctagtgga gtcttacctt gtctttcttc atattctttt atcagcattt cattgtacag 1620 attctggctc tcccacaacc aatcattctt aaaatgcgtt tcattgaggt acgagccatt 1680 gtgaactaac caacactgcg gtaaagaatg tctccctgtg atggtatcat tgatgtacca 1740 aaattttgta tagttgcaat aagggatttt ggcaagctgt ttgagactgt ttctaatcac 1800 aagtgagtca gaaataagtc cgttgatagt ctttttaaag agattcaacg aattctcaac 1860 attaagttgt aaggttttga tagcattctg attgaaatca aataacctca tcgtatcgca 1920 aaattcttca ttgtgatctt tgttgcattt tgccatcaca gtgttatcaa aacattttat 1980 tccagcccaa acaatagccc attgctccaa acagtaacca cctgggacat gttgcccagt 2040 agagtcactc aagtcccaag tgaaaaagcc aaggagtttc ctgctcacag aactataagc 2100 agttttttgg agagccatcc ttattgttgc cattggagta tatgtacagt gattttccca 2160 tgtggtgttc tgtatgatca ggaaattgta atgtgtccca ccttcacagt ttgttagtct 2220 gcaagaccct ccactacagt tattgaaaca ttttccaacc cacgcaattt ttgggtcccc 2280 aatgatttga gcaagcgacg caataagatg tctgccaacc tcacctcctc tatccccaac 2340 tgtcaagttg tactggatca acaccccagc accctcaact gttttgcatc tggcacctac 2400 atgacgagtg acatggagca cattgaagtg taactcatta agcaaccatt ttaatgtgtg 2460 acctgcttct tctgtcttat cacaattact aatgttacca tatgcaaggc ttctgatgtt 2520 ggaaaagttt ccagtagttt catttgcaat ggatgtgttt gtcaaagtga gttcaattcc 2580 ccatgttgtg ttagatggtc ctttgtagta atgatgtgtg ttgttcttgc tacatgattg 2640 tggcaagttg tcaaacattc ttgtgaggtt gaactcaacg tgggtgagat tgtgcctcct 2700 atcaatcatc atgccatcac aacttctgcc agccaaaatg aggaaggtga tgagttggaa 2760 taggccacat ctcatcagat tgacaaatcc tttgatgatg catagggttg agacaatgat 2820 taaggcgaca ttgaacacct cctgcaggac ttcgggtata gactggatca aagtcacaac 2880 ttgtcccatt ttggggttgt ttgcacttcc tccgagtcag tgaagaagtg aacgtacagc 2940 gtgatctaga atcgcctagg atccactgtg cg 2972 <210> 15 <211> 2472 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-GP/GFPnat <400> 15 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatgggaca 60 agttgtgact ttgatccagt ctatacccga agtcctgcag gaggtgttca atgtcgcctt 120 aatcattgtc tcaaccctat gcatcatcaa aggatttgtc aatctgatga gatgtggcct 180 attccaactc atcaccttcc tcattttggc tggcagaagt tgtgatggca tgatgattga 240 taggaggcac aatctcaccc acgttgagtt caacctcaca agaatgtttg acaacttgcc 300 acaatcatgt agcaagaaca acacacatca ttactacaaa ggaccatcta acacaacatg 360 gggaattgaa ctcactttga caaacacatc cattgcaaat gaaactactg gaaacttttc 420 caacatcaga agccttgcat atggtaacat tagtaattgt gataagacag aagaagcagg 480 tcacacatta aaatggttgc ttaatgagtt acacttcaat gtgctccatg tcactcgtca 540 tgtaggtgcc agatgcaaaa cagttgaggg tgctggggtg ttgatccagt acaacttgac 600 agttggggat agaggaggtg aggttggcag acatcttatt gcgtcgcttg ctcaaatcat 660 tggggaccca aaaattgcgt gggttggaaa atgtttcaat aactgtagtg gagggtcttg 720 cagactaaca aactgtgaag gtgggacaca ttacaatttc ctgatcatac agaacaccac 780 atgggaaaat cactgtacat atactccaat ggcaacaata aggatggctc tccaaaaaac 840 tgcttatagt tctgtgagca ggaaactcct tggctttttc acttgggact tgagtgactc 900 tactgggcaa catgtcccag gtggttactg tttggagcaa tgggctattg tttgggctgg 960 aataaaatgt tttgataaca ctgtgatggc aaaatgcaac aaagatcaca atgaagaatt 1020 ttgcgatacg atgaggttat ttgatttcaa tcagaatgct atcaaaacct tacaacttaa 1080 tgttgagaat tcgttgaatc tctttaaaaa gactatcaac ggacttattt ctgactcact 1140 tgtgattaga aacagtctca aacagcttgc caaaatccct tattgcaact atacaaaatt 1200 ttggtacatc aatgatacca tcacagggag acattcttta ccgcagtgtt ggttagttca 1260 caatggctcg tacctcaatg aaacgcattt taagaatgat tggttgtggg agagccagaa 1320 tctgtacaat gaaatgctga taaaagaata tgaagaaaga caaggtaaga ctccactagc 1380 attgacagac atttgcttct ggtctttggt gttttacacc atcacagtgt ttctccactt 1440 agttggaata cccactcata ggcacatcat tggtgatggc tgtccgaagc cacataggat 1500 tactaggaac tctctttgca gctgtgggta ttataaaatc ccaaagaaac cctacaaatg 1560 ggtgagactg ggtaaataag ccctagcctc gacatgggcc tcgacgtcac tccccaatag 1620 gggagtgacg tcgaggcctc tgaggacttg agcatgtctt cttacttgta cagctcgtcc 1680 atgccgagag tgatcccggc ggcggtcacg aactccagca ggaccatgtg atcgcgcttc 1740 tcgttggggt ctttgctcag ggcggactgg gtgctcaggt agtggttgtc gggcagcagc 1800 acggggccgt cgccgatggg ggtgttctgc tggtagtggt cggcgagctg cacgctgccg 1860 tcctcgatgt tgtggcgggt cttgaagttc accttgatgc cgttcttctg cttgtcggcg 1920 gtgatataga ccttgtggct gttgtagttg tactccagct tgtgccccag gatgttgccg 1980 tcctccttga agtcgatgcc cttcagctcg atgcggttca ccagggtgtc gccctcgaac 2040 ttcacctcgg cgcgggtctt gtagttgccg tcgtccttga agaagatggt gcgctcctgg 2100 acgtagcctt cgggcatggc ggacttgaag aagtcgtgct gcttcatgtg gtcggggtag 2160 cggacgaagc actgcacgcc gtaggtcaag gtggtcacga gggtgggcca gggcacgggc 2220 agcttgccgg tggtgcagat gaacttcagg gtcagcttgc cgtaggtggc atcgccctcg 2280 ccctcgccgg acacgctgaa cttgtggccg tttacgtcgc cgtccagctc gaccaggatg 2340 ggcaccaccc cggtgaacag ctcctcgccc ttgctcacca tgaagacatt ttggggttgt 2400 ttgcacttcc tccgagtcag tgaagaagtg aacgtacagc gtgatctaga atcgcctagg 2460 atccactgtg cg 2472 <210> 16 <211> 3422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified S-delta-BbsI-Pichinde virus strain Munchique CoAn4763 isolate P18 (Genbank accession number EF529746.1) segment S <400> 16 gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatgggaca 60 agttgtgact ttgatccagt ctatacccga agtcctgcag gaggtgttca atgtcgcctt 120 aatcattgtc tcaaccctat gcatcatcaa aggatttgtc aatctgatga gatgtggcct 180 attccaactc atcaccttcc tcattttggc tggcagaagt tgtgatggca tgatgattga 240 taggaggcac aatctcaccc acgttgagtt caacctcaca agaatgtttg acaacttgcc 300 acaatcatgt agcaagaaca acacacatca ttactacaaa ggaccatcta acacaacatg 360 gggaattgaa ctcactttga caaacacatc cattgcaaat gaaactactg gaaacttttc 420 caacatcaga agccttgcat atggtaacat tagtaattgt gataagacag aagaagcagg 480 tcacacatta aaatggttgc ttaatgagtt acacttcaat gtgctccatg tcactcgtca 540 tgtaggtgcc agatgcaaaa cagttgaggg tgctggggtg ttgatccagt acaacttgac 600 agttggggat agaggaggtg aggttggcag acatcttatt gcgtcgcttg ctcaaatcat 660 tggggaccca aaaattgcgt gggttggaaa atgtttcaat aactgtagtg gagggtcttg 720 cagactaaca aactgtgaag gtgggacaca ttacaatttc ctgatcatac agaacaccac 780 atgggaaaat cactgtacat atactccaat ggcaacaata aggatggctc tccaaaaaac 840 tgcttatagt tctgtgagca ggaaactcct tggctttttc acttgggact tgagtgactc 900 tactgggcaa catgtcccag gtggttactg tttggagcaa tgggctattg tttgggctgg 960 aataaaatgt tttgataaca ctgtgatggc aaaatgcaac aaagatcaca atgaagaatt 1020 ttgcgatacg atgaggttat ttgatttcaa tcagaatgct atcaaaacct tacaacttaa 1080 tgttgagaat tcgttgaatc tctttaaaaa gactatcaac ggacttattt ctgactcact 1140 tgtgattaga aacagtctca aacagcttgc caaaatccct tattgcaact atacaaaatt 1200 ttggtacatc aatgatacca tcacagggag acattcttta ccgcagtgtt ggttagttca 1260 caatggctcg tacctcaatg aaacgcattt taagaatgat tggttgtggg agagccagaa 1320 tctgtacaat gaaatgctga taaaagaata tgaagaaaga caaggtaaga ctccactagc 1380 attgacagac atttgcttct ggtctttggt gttttacacc atcacagtgt ttctccactt 1440 agttggaata cccactcata ggcacatcat tggtgatggc tgtccgaagc cacataggat 1500 tactaggaac tctctttgca gctgtgggta ttataaaatc ccaaagaaac cctacaaatg 1560 ggtgagactg ggtaaataag ccctagcctc gacatgggcc tcgacgtcac tccccaatag 1620 gggagtgacg tcgaggcctc tgaggacttg agctcagagg ttgatcagat ctgtgttgtt 1680 cctgtacagc gtgtcaatag gcaagcatct catcggcttc tggtccctaa cccagcctgt 1740 cactgttgca tcaaacatga tggtatcaag caatgcacag tgaggattcg cagtggtttg 1800 tgcagccccc ttcttcttct tctttatgac caaaccttta tgtttggtgc agagtagatt 1860 gtatctctcc cagatctcat cctcaaaggt gcgtgcttgc tcggcactga gtttcacgtc 1920 aagcactttt aagtctcttc tcccatgcat ttcgaacaaa ctgattatat catctgaacc 1980 ttgagcagtg aaaaccatgt tttgaggtaa atgtctgatg attgaggaaa tcaggcctgg 2040 ttgggcatca gccaagtcct ttaaaaggag accatgtgag tacttgcttt gctctttgaa 2100 ggacttctca tcgtggggaa atctgtaaca atgtatgtag ttgcccgtgt caggctggta 2160 gatggccatt tccaccggat catttggtgt tccttcaatg tcaatccatg tggtagcttt 2220 tgaatcaagc atctgaattg aggacacaac agtatcttct ttctccttag ggatttgttt 2280 aaggtccggt gatcctccgt ttcttactgg tggctggata gcactcggct tcgaatctaa 2340 atctacagtg gtgttatccc aagccctccc ttgaacttga gaccttgagc caatgtaagg 2400 ccaaccatcc cctgaaagac aaatcttgta tagtaaattt tcataaggat ttctctgtcc 2460 gggtgtagtg ctcacaaaca taccttcacg attctttatt tgcaatagac tctttatgag 2520 agtactaaac atagaaggct tcacctggat ggtctcaagc atattgccac catcaatcat 2580 gcaagcagct gctttgactg ctgcagacaa actgagattg taccctgaga tgtttatggc 2640 tgatggctca ttactaatga tttttagggc actgtgttgc tgtgtgagtt tctctagatc 2700 tgtcatgttc gggaacttga cagtgtagag caaaccaagt gcactcagcg cttggacaac 2760 atcattaagt tgttcacccc cttgctcagt catacaagcg atggttaagg ctggcattga 2820 tccaaattga ttgatcaaca atgtattatc cttgatgtcc cagatcttca caaccccatc 2880 tctgttgcct gtgggtctag cattagcgaa ccccattgag cgaaggattt cggctctttg 2940 ttccaactga gtgtttgtga gattgccccc ataaacacca ggctgagaca aactctcagt 3000 tctagtgact ttctttctta acttgtccaa atcagatgca agctccatta gctcctcttt 3060 ggctaagcct cccaccttaa gcacattgtc cctctggatt gatctcatat tcatcagagc 3120 atcaacctct ttgttcatgt ctcttaactt ggtcagatca gaatcagtcc ttttatcttt 3180 gcgcatcatt ctttgaactt gagcaacttt gtgaaagtca agagcagata acagtgctct 3240 tgtgtccgac aacacatcag ccttcacagg atgggtccag ttggatagac ccctcctaag 3300 ggactgtacc cagcggaatg atgggatgtt gtcagacatt ttggggttgt ttgcacttcc 3360 tccgagtcag tgaagaagtg aacgtacagc gtgatctaga atcgcctagg atccactgtg 3420 cg 3422

Claims (71)

  1. 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트를 포함하고,
    제1 S 세그먼트가 피친드(Pichinde) 바이러스 게놈 3' 비번역 영역("UTR")의 제어하의 위치에서 피친드 바이러스 당단백질("GP")을 인코딩하는 개방 해독 프레임("ORF") 및 피친드 바이러스 게놈 5' UTR의 제어하의 위치에서 제1 관심 유전자를 인코딩하는 ORF를 포함하고,
    제2 S 세그먼트가 피친드 바이러스 게놈 3' UTR의 제어하의 위치에서 피친드 바이러스 핵단백질 ("NP")를 인코딩하는 ORF 및 피친드 바이러스 게놈 5' UTR의 제어하의 위치에서 제2 관심 유전자를 인코딩하는 ORF를 포함하며,
    L 세그먼트가 피친드 바이러스 게놈 3' UTR의 제어하의 위치에서 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 L("L 단백질")을 인코딩하는 ORF 및 피친드 바이러스 게놈 5' UTR의 제어하의 위치에서 매트릭스 단백질 Z("Z 단백질")를 인코딩하는 ORF를 포함하는,
    3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 증식하는 것은, I 형 인터페론 수용체, II 형 인터페론 수용체 및 재조합 활성화 유전자 1(RAG1)이 결핍되고 104 PFU의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자로 감염된 마우스에서 70일의 지속 감염 후에, 복제-가능하면서 2개의 세그먼트를 가진 바이러스 입자를 생성하지 않는,
    3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  3. 제1항에 있어서,
    2개의 개별적인 세그먼트 대신 단지 하나상에 2개의 피친드 바이러스 ORF를 결합하는(uniting), 2개의 S 세그먼트의 세그먼트간 재조합이 바이러스 프로모터 활성을 저지하는, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  4. 제1항에 있어서,
    피친드 바이러스 게놈 3' UTR이 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 피친드 바이러스 L 세그먼트의 3' UTR이며, 피친드 바이러스 게놈 5' UTR이 피친드 바이러스 S 세그먼트 또는 피친드 바이러스 L 세그먼트의 5' UTR인, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  5. 제1항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 관심 유전자가 감염성 유기체, 종양, 또는 알러젠으로부터 유래된 항원을 인코딩하는, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  6. 제5항에 있어서,
    항원이 인간 면역결핍 바이러스 항원, 파필로마바이러스 항원, C형 간염 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원, 수두대상포진바이러스 항원, 거대세포바이러스 항원, 결핵균 항원, 종양 연관 항원, 및 종양 특이적 항원으로부터 선택된 항원이고, 이 때 종양 특이적 항원은 종양 신생항원 및 종양 신생에피토프를 포함하는, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  7. 제1항에 있어서,
    3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 감염성이고 복제 가능한, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  8. 제1항에 있어서,
    3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 약독화되는, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  9. 제1항에 있어서,
    3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자가 균주 문치크 (Munchique) CoAn4763 분리물 P18, 또는 P2 균주로부터 유래된 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자의 게놈 세그먼트 또는 세그먼트를 인코딩하는, cDNA 또는 cDNA 세트.
  11. 제10항의 cDNA 또는 cDNA 세트를 포함하는, DNA 발현 벡터 또는 DNA 발현 벡터 세트.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 포함하는 숙주 세포.
  13. 제10항의 cDNA 또는 cDNA 세트를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제11항의 DNA 발현 벡터 또는 DNA 발현 벡터 세트를 포함하는 숙주 세포.
  15. (i) 하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트의 cDNA 하나 이상을 단리된 숙주 세포내로 형질감염시키고;
    (ii) 바이러스 형성을 위해 적합한 조건하에서 단리된 숙주 세포를 유지하고;
    (iii) 피친드 바이러스 입자를 수확하는 것
    을 포함하는,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 하나의 L 세그먼트 및 2개의 S 세그먼트의 전사가 양방향성 프로모터를 이용하여 수행되는, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    하나의 L 세그먼트와 2개의 S 세그먼트의 전사가 각각 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어하에 있는, 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자를 생성하는 방법:
    (i) RNA 폴리머라제 I 프로모터;
    (ii) RNA 폴리머라제 II 프로모터; 및
    (iii) T7 프로모터.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 암, 전염성 질병 또는 알러지성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 3개의 세그먼트를 가진 피친드 바이러스 입자 및 약학적 허용 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
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